JP2001507027A

JP2001507027A - General chemical bond

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Publication number: JP2001507027A
Application number: JP52871798A
Authority: JP
Inventors: スティーヴンビーエイチケント; トムダブリューミュアー; フィリップイードーソン; スティーヴンジェイバーク; リンカンヌ
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-12-24
Filing date: 1996-12-24
Publication date: 2001-05-29
Anticipated expiration: 2016-12-24
Also published as: WO1998028434A1; JP4358307B2; CA2273071C; CA2273071A1

Abstract

(57)【要約】オリゴペプチドを結合し、結合ペプチド生成物を形成する。第一工程において、２つの出発オリゴペプチドを結合し、アミノチオエステル結合を有する中間体を形成する。第二工程において、アミノチオエステル結合は転位を受け、Ｎ置換アミド結合を有するペプチドを形成する。任意の第三工程において、アミド結合を化学的に除去し、天然ペプチド結合を形成する。 (57) [Summary] The oligopeptides are linked to form a linked peptide product. In a first step, the two starting oligopeptides are combined to form an intermediate having an aminothioester linkage. In the second step, the aminothioester bond undergoes rearrangement to form a peptide with an N-substituted amide bond. In an optional third step, the amide bond is chemically removed to form a natural peptide bond.

Description

【発明の詳細な説明】一般的化学結合発明の属する技術分野本発明は、オリゴペプチドを化学的に結合する方法に関する。より詳細には本発明は、ペプチド結合を使用してオリゴペプチドの末端と末端を化学的に結合する方法に関する。政府の権利本発明は、アメリカ国立衛生研究所より与えられた助成番号Ｒ０１ＧＭ４８８９７及びＰ０１ＧＭ４８８７０の下、政府の支援を受けてなされた。アメリカ合衆国政府は本発明について一定の権利を有する。背景技術従来の段階的固相方法論によるペプチド合成は、長いペプチドを合成するとき、低収率により制限される(Merrifield et al．J．Am．Chem．Soc．1963，85，2 149-2154;Kent et al．Ann．Rev．Biochem．1988，57，957-989)。この制限を克服するために、化学結合により小さい合成ペプチドを別のペプチドへ結合して、長いペプチドを製造するだろう。 al.，Science 1992，256，221-225;Rose et al．J．Am．Chem．Soc．1994，116 ，30-34; Liu et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1994，91，6584-6588)。Sch onolzerにより開示された方法論は、非保護ペプチドセグメントの化学選択的反応により、結合部位に非天然バックボーン構造を有する生成物を与えることに関するものである。この方法論は、標準的ペプチド合成法により得られるものよりもサイズの大きいペプチドの合成を可能にする(Canne et al．J．Am．Chem．Soc ．1995，117，2998-3007;Baca et al．J．Am．Chem．Soc．1995，117，1881-188 7;Williams et al．J．Am．Chem．Soc．1994，116，10797-10798)。更にこの方法論は、異常な構造及びトポロジーを有するペプチドの合成を可能にする(D awson et al．J．Am．Chem．Soc．1993，115，7263-7266; Rose et al．J．Am． Chem．Soc．1994，116，30-34;Muir et al．Biochemistry 1994，33，7701-7708 ;Canne et al．J．Am．Chem．Soc．1995，117，2998-3007)。従来の段階的固相ペプチド合成と化学結合とを組み合わせた使用は、化学者が６０アミノ酸残基までの非保護ペプチドを良好な収率及び純度で日常的に製造することを可能にすら２つの方法論の組み合わせを使用して、タンパク質の全化学合成が達成されるかもしれない。天然のバックボーン構造を有するタンパク質製造のための別の化学結合技術が報告されている(Dawson et al．Science 1994，266，776-779)。この様式の化学結合は「天然結合(native ligation)」と名づけられている。この技術においては、Ｃ末端α−チオエステルを有する非保護合成ペプチドを、化学選択的態様で、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含む非保護ペプチドと反応させる。チオール交換反応は初期のチオエステル結合中間体を与え、これは自発的に転位（rearrange）し、２つのペプチドセグメントが結合している結合部位において天然のアミド結合を与え、この過程においてＣｙｓ側鎖チオールを再生する。この天然結合の変形は、アミノ酸の反応についてWielandにより最初に記載された化学反応を使用する(Wi eland et al．Liebigs Ann．Chem．1953，583，129-149)。最初に記載されているように、ネイティブ結合は、Ｘ−Ｃｙｓ結合におけるペプチドセグメントの結合に制限される(Dawson et al．Science 1994，266，776-779)。必要とされるのは、Ｃ末端α−チオエステルペプチドセグメントをＮ末端アミノ酸ペプチドセグメントに結合する一般的方法であって、Ｎ末端アミノ酸ペプチドセグメントがＮ末端システインを有することを必要としない方法である。発明の要約本発明は、非保護オリゴペプチドを化学的に結合し、全てのペプチド結合を有する生成物を形成する方法に向けられる。第一工程において、２つのオリゴペプチドを結合し、アミノチオエステル結合を有する結合生成物を形成する。第二工程において、アミノチオエステル結合を転位し、Ｎ置換アミド結合を有する生成物を形成する。任意の第三工程において、アミド結合上の置換基を、酸性媒体中Ｚｎを用いた容易な処理により取り除き、結合部位に天然のペプチド結合を与える。本発明の方法は、２つの出発オリゴペプチド、すなわち第一の出発オリゴペプチド及び第二の出発オリゴペプチドを使用する。第一のオリゴペプチドはチオエステル部分を有するＣ末端補助基（auxiliary group）を有している。すなわち、［ペプチド₁］^αＣＯＳＲ（式中、Ｒは３−カルボキシ、４−ニトロフェニル及びベンジルからなる群より選ばれる。）である。第二のオリゴペプチドは非酸化スルフヒドリル部分を有する補助官能基(auxiliary functional group)を有する。すなわち、ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂（Ｏ）−Ｎ^α［ペプチド₂］である。第一及び第二の出発オリゴペプチドを、チオエステル交換を促進する条件下で混合したとき、両ペプチドは互いに縮合し中間体オリゴペプチド生成物を形成する。ここで、第一及び第二のオリゴペプチドはアミノチオエステル結合を介して結合している。アミノチオエステル結合は分子内で自発的に転位し、Ｎ置換アミド結合により結合している結合生成物を形成する。分子内転位の間、Ｎ末端補助官能基のアミノ基はチオエステルを攻撃し、置換スルフヒドリル部分を含む結合したＮ結合補助官能基を有するアミド基を形成する。置換スルフヒドリル部分を含むＮ結合補助官能基を、化学的手段により適宜取り除き、全ての天然ペプチド結合を有する生成物を形成してもよい。本発明の１つの態様は、オリゴペプチド生成物を製造するために第一のオリゴペプチドと第二のオリゴペプチドとを末端と末端で結合する方法に向けられる。より詳細には、本発明の方法は２つの工程及び任意の第三工程を含んでいる。第一工程は、第一及び第二のオリゴペプチドがδ又はγアミノチオエステル結合で結合している中間体オリゴペプチドを製造するために、第一のペプチドのＣ末端チオエステルと第二のオリゴペプチドの非酸化スルフヒドリル部分とを縮合させることを含んでいる。第一のオリゴペプチドはＣ末端残基上にＣ末端チオエステルを含み、第二のオリゴペプチドは非酸化スルフヒドリル部分を有するＮ末端残基上にＮ末端補助官能基を含んでいる。第一のオリゴペプチドのＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチドのＮ末端残基はグリシンである。第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。但し、非グリシン残基は、非β分岐アミノ酸である。第二工程により、中間体オリゴペプチドのδ又はγ−アミノチオエステル結合が、δ又はγ−アミノ基のチオエステル部分への分子内攻撃により、転位し、チオエステル部分由来の副生物としてスルフヒドリル部分を置換する。これにより、第一及び第二のオリゴペプチドがアミド結合で結合しているオリゴペプチド生成物を製造する。アミド結合の窒素は、置換スルフヒドリル部分を有する補助官能基を含んでいる。任意の第三工程は、天然ペプチド結合を生成するための、還元剤を用いた、アミド窒素上の補助官能基のオリゴペプチド生成物からの除去を含んでいる。アミド窒素補助官能基は、Ｎ−α−Ｏ−（ＣＨ₂）_n−ＳＨ（式中、１≦ｎ≦２である。）である。還元剤は亜鉛（下線の窒素は結合アミド窒素を表す。）である。本発明の別の態様には、Ｃ末端チオエステルを含む第一のオリゴペプチドセグメント、非酸化スルフヒドリル部分を有するＮ末端補助官能基を含む第二のオリゴペプチドセグメント、並びに、Ｃ末端チオエステル及び補助官能基のスルフヒドリル基を結合するアミノチオエステル結合単位を含むオリゴペプチド中間体が含まれる。図面の簡単な説明図１は、非保護ペプチドセグメント（式中、Ｒはβ分岐アミノ酸残基である。ただし、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基はグリシンであり、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。）の一般化天然化学結合を示している。Ｒ’は、３−カルボキシ、４−ニトロフェニル及びベンジルからなる群より選ばれる。図２は、Ｎ^α（置換）ペプチドセグメント２ａ及び２ｂの化学合成を示す。図３は、化合物８ｂの化学合成を示す。図４は、実施例＃１〜５についてのモデル結合の要約に関する表を示す。上付き文字は以下に示す通りである。（ａ）チオエステルペプチド(式中、−ＳＮＢ＝３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、−Ｓｂｚｌ＝ベンジルチオエステルである)。（ｂ）Ｎ^α（置換）ペプチド(式中、ｅｔｓｈ＝Ｎ^α(エタンチオール)、ｏｅｔｓｈ＝Ｎ^α（オキシエタンチオール）である)。（ｃ）ペプチド２を基礎とする。分析用逆相ＨＰＬＣ(ピーク領域)及びＥＳＭＳより推定。（ｄ）ｐＨ７．５で示された時間経過後、ｐＨ４．５に調節。図５Ａ〜５Ｃは、モデル結合を示している。実施例＃２(後述)。アミド−Ｇｌｙ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）Ｇｌｙ−化合物４ｂを、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５で形成。（Ａ）〜（Ｃ）は以下の通り、ＨＰＬＣプロットを示す。（Ａ）ｔ＝０における分析用ＨＰＬＣ(１０〜５０％Ｂで３０分間)、ピークａ、チオエステルペプチド、１、ＬＹＲＡＧ−^αＣＯＳＣ₆Ｈ₃(３−ＣＯ₂Ｈ−４−ＮＯ₂)。ピークｂ、Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド、２ｂ、［ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ］−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂。（Ｂ）ｔ＝１時間における分析用ＨＰＬＣ(１０〜５０％Ｂで３０分間 )、ピークｃ、非ペプチド不純物、ピークｄ、ＬＹＲＡＧ−^αＣＯＳＣ₆Ｈ₅、チオフェノールを用いて１のトランスチオエステル化による。ピークｅ、中間体結合生成物、４ｂ、ＬＹＲＡＧＧ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）ＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂及び少量の未反応［ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ］−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂(２ｂ)、エレクトロスプレーイオン化ＭＳにより測定。（Ｃ）ＨＰＬＣ−精製及び酸性ＨＰＬＣ溶媒中でのＺｎを用いた一晩の処理後のピークｅの分析用ＨＰＬＣ(１５〜４０％Ｂで３０分間)、ピークｆ、最終結合生成物、５ｂ、ＬＹＲＡＧＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＨＮＨ₂、ピークｇ、非ペプチド不純物。図６Ａ〜６Ｃは、モデル結合を示している。実施例＃３(後述)。−Ｐｈｅ（Ｎ^α −ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）Ｇｌｙ−結合生成物４ｂ。結合及び転位は３７℃で行った。（Ａ）〜（Ｃ）は以下の通り、ＨＰＬＣプロットを示す。（Ａ）６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５中で１１．５時間後における分析用ＨＰＬＣ(２０〜４０％Ｂで３０分間)、ピークａ、Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド、２ｂ、［ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ］−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂、ピークｂ、非転位中間体結合生成物、４ｂ、ＬＹＲＡＦＧ( Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ)ＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂、ピークｄ、チオエステルペプチド、１、ＬＹＲＡＦ−^αＣＯＳＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅。（Ｂ）６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１ＭＮａＣＨ₃ＣＯ₂、ｐＨ４．５中で１１．５時間後における分析用ＨＰＬＣ（０〜６７％Ｂで３０分間）。（Ｃ）酸性ＨＰＬＣ溶媒中でのＺｎを用いた一晩の処理後のＨＰＬＣ精製ピークｃの分析用ＨＰＬＣ (２０〜４０％Ｂで３０分間)、ピークｆ、最終結合生成物、５ｂ、ＬＹＲＡＦＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂。発明の詳細な説明本発明は、２つの別のペプチド断片を化学的に結合するための２工程からなる方法に向けられる。より詳細には、本発明は、非保護ペプチドセグメントを天然（アミド形成）化学結合し、天然ペプチド結合を精製するための一般的方法論に関する第一工程は、第一のペプチドのＣ末端チオエステルと、第二のオリゴペプチドの非酸化スルフヒドリル部分とを縮合し、第一のオリゴペプチドと第二のオリゴペプチドがδ−又はγ−アミノチオエステル結合で結合している中間体オリゴペプチドを生成することを含んでいる。第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基はグリシンである。第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。ただし、非グリシン残基は非β分岐アミノ酸である。第二工程は、δ又はγ−アミノ基のチオエステル部分への分子内攻撃による中間体オリゴペプチドのδ又はγ−アミノチオエステル結合の転位、これによる、チオエステル部分に由来する副生物としてのスルフヒドリル部分の置換、及び、第一のオリゴペプチド及び第二のオリゴペプチドが天然アミド結合で結合しているオリゴペプチド生成物の生成を含んでいる。しかしながら、アミド結合上の窒素は置換スルフヒドリル部分を有する補助官能基を含んでいる。任意の第三工程は、還元剤を用いてアミド窒素上の補助官能基を、オリゴペプチド生成物から除去し、天然ペプチド結合を生成することを含んでいる。アミド窒素補助官能基は、Ｎ−α−Ｏ−（ＣＨ₂）Ｎ−ＳＨ（式中、１≦ｎ≦２である）であり、還元剤は亜鉛である(下線を引いた窒素は結合したアミド窒素を表す) 。）である。本発明の方法は、天然又は修飾されたバックボーン構造のいずれかを有するペプチド及びタンパク質の合成を許容する。図１は手順を要約している。ペプチド α―カルボキシチオエステル（１）を、チオール交換を経て、Ｎ^α（エタンチオール）ペプチド（２ａ）又はＮ_α（オキシエタンチオール）ペプチド（２ｂ）のいずれかと反応させ、結合生成物３を生成する。このチオエステル結合中間体は、５又は６員環を含む有利な幾何転位を経て転位し、４ａにおいては二級アミドを含むアミド結合生成物４又は４ｂにおいては類似体Ｎ−オキシアルキル化合物を含むアミド結合生成物４を与える。得られたＮ−^α（置換）アミドも有利な溶解特性を潜在的に有している(Quibell et al．J．Am．Chem．Soc．1995，117，1 1656-11668)。得られたＮ−^α（Ｏ−アルキル）アミド結合生成物は、更に、ＨＦ切断条件に対し安定であるという利点を有し、穏やかな条件下で簡単に除去される。４ｂの場合、亜鉛粉末を酸性溶離剤中の逆相ＨＰＬＣ精製ペプチドへ直接添加し、Ｏ−アルコキシヒドロキサメートのＮ−Ｏ結合を還元し、結合生成物５ｂの天然バックボーン構造を得ることができる。すべてのペプチドセグメントは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学についての原位置中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）活性化プロトコルを使用した確立された固相法により、段階的に合成し、分離用逆相ＨＰＬＣにより精製し、エレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ＥＳ 40，180-193)。ペプチド−α−チオエステル（１）は、対応のペプチド−α−チオ酸より生成し、次に、Canne et al．Tetrahedron Lett．1995，36，1217-1220 に記載されているようにしてチオエステル樹脂上で合成した。ペプチド−α −チオ酸を、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０〜６．５中、１．５当量の５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との反応により対応の３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルに転換するか、又は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中、１０当量の臭化ベンジルを使用して対応のベンジルエステルに転換した(Dawso n et al．Science 1994，266，776-779)。両方のチオエステルは、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルを有する結合反応用の十分な脱離基を提供する。これは、対応のベンジルチオエステルよりもやや速い反応速度を示す(Daw son et al．Science 1994，266，776-779)。Ｎ^α（エタンチオール）(２ａ)及びＮ^α（オキシエタンチオール）(２ｂ)の合成を図２に示す。適切なα−ブロモカルボン酸（対称性無水物として活性化(ジクロロメタン中の０．５当量の１，３−ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ) )）(Robey et al．Anal．Biochem．1989，177，373-377)を、ペプチド−樹脂６の脱保護Ｎ−末端アミノ酸と結合し、ブロモアシル−ペプチド−樹脂７を得た。臭化物を、ＤＭＳＯ中の８ａ又は８ｂのアミン基により、立体化学転換的に置換し、ペプチド−樹脂９を得た。無水ＨＦ中における脱保護及び樹脂からの切断により、２ｂを直接得るか、又は、２ａをジスルフィド形態で得、これを遊離のチオールへ還元する。アミノエタンチオール誘導体８ａは、水中の８０％アセトニトリル中、２−アミノエタンチオール及び５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）の反応より、１工程で合成した。アミノオキシエタンチオール誘導体８ｂの合成も含まれ、これを図３に示す。臭化物１１を、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１０）と大過剰量の１，２−ジブロモエタンとの反応より生成した(Bauer J．Org．Chem ．1963，28，1604-1608)。臭化物１１を、塩基１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で４−メチルベンジルメルカプタンを用いて保護アミノオキシエタンチオール誘導体１２に転換した。１２のフタルイミド基を２工程方法で除去した(Osby et al．Tetrahedron Lett．1984，25 ，2093-2096)。この方法にはＮａＢＨ₄を用いた還元、続く酢酸を用いた処理による所望のアミノオキシエタンチオール誘導体８ｂを得る工程が含まれる。Ｘ−Ｃｙｓ部位におけるオリジナルの天然化学結合と比較して(Dawson et al ．Science 1994，266，776−779)、本発明の結合化学のもっとも注目すべき特徴は、最初のチオエステル結合生成物の遅い転位である。この例における６員環中間体を経たα−ＮＨ（Ｏ−アルキル）基による分子内攻撃は、Ｘ−Ｃｙｓ結合における非置換α−ＮＨ₂の容易な５員環媒介攻撃（Dawson et al．Science 1994 ，266，776-779）よりもかなり好まれにくい(Mandolini et al．J．Am．Chem．S oc．1978，100，550-554)。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を除いて、ゆっくりと転位させたのみである本発明のチオエステル−結合初期結合生成物を単離することができる(図４)。注目すべきことに、両方の結合部位上のＣ^α置換アミノ酸について、アミド結合への転位は見ることができない。すなわち、チオエステル結合中間体は、反応条件下では無制限に安定であった。これらの遅い転位は、既報の（Ｎ置換）アミド形成結合化学において見られたものと類似している(Liu et al．Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1994，91，6584-6588)。本発明における、アミド形成性結合における一時的補助官能基の使用は、Kemp により提案された「チオールキャプチャー」戦略（Dawson et al．Science 1994 ，266，776-779Dawson et al．Science 1994，266，776-779）の回想である。天然化学結合及びチオールキャプチャー法は、定められたゴールとして、長鎖ポリペプチド鎖の合成を達成するための、セグメント縮合戦略における非保護ペプチドの使用を有している。天然化学結合アプローチの鍵は、初期チオエステル結合中間体生成物のチオール部分交換を促進する条件下での、両セグメントにその他のＣｙｓ残基の存在していてもＮ末端Ｃｙｓにおける位置選択的結合を与える反応である(Dawson et al．Science 1994，266，776-779)。対照的に、「チオールキャプチャー」戦略及び関連する方法（Liu et al．Tetrahedron Lett．1996，3 7，933-936）においては、結合反応前のＣｙｓ側鎖官能基の位置特異的保護が必要である(Kemp et al．Peptides:Proceedings of the 11th American Peptide S ymposium Rivier，J.E.;Marshall，G.R.，Eds，ESCOM:Lieden，1990; pp920-92 2)。したがって、これの元の意図を妨げる。同様に、本発明における、カルボニル活性化α−チオカルボキシル基（すなわちα−ＣＯＳＲ）の使用は、ペプチドセグメント縮合に使用する従来の化学（Bl ake et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1981，78，4055-4058; Yamashiro et al．Int．J．Pept．Protein Res．1988，31，322-334; Hojo et al．Peptide C hemistry Okada，Y.，Ed，Protein Research Foundation: Osaka，1994;pp 9-1 2）の回想である。しかしながら、これらの合成法は、Ａｇ⁺活性化ペプチド−^α ＣＯＳＲ上の第二のセグメントのαアミン求核原子による慣習的非化学選択的攻撃に基づいている。したがって、両セグメントにおけるすべての他のα−及びε −アミン官能基の位置特異的（再）保護を必要とする。対照的に、チオエステル媒介アミド形成結合化学は、チオールを含む天然に見出されるすべての側鎖官能基を有するまったく保護されていないペプチドセグメントの使用と適合する(Baca et al．J．Am．Chem．Soc．1995，117，1881-1887; Dawson et al．Science 1994，266，776−779)。この理由により、天然化学結合は、簡単、実用的であり、タンパク質が適当な結合部位を含んでいるならばそのタンパク質の全化学合成に対する一般的アプローチになる。本発明は、結合部位として使用可能なジペプチド配列の数を拡張することにより、Dawsonら（Dawson et al．Science 1994，266，776-779）により報告されている天然化学結合法の有用性を増大させる。その方法論のＸ−Ｃｙｓ結合部位に加えて、本明細書には、Ｘ−Ｇｌｙ及びＧｌｙ−Ｘ結合部位（すなわち、Ｎ末端残基が非グリシンである場合のＣ末端残基のグリシン、Ｃ末端残基が非グリシンである場合のＮ末端残基のグリシン）をどのように使用するか開示している。好ましい態様において、Ｘはすべての非β分岐アミノ酸である。しかしながら、本発明者らの過去の研究は、Ｘは、β分岐アミノ酸例えばＶａｌを含むすべてのアミノ酸であることができることを示した(Dawson et al．Science 1994，266，77 6-779)。本発明は、潜在的に、３つだけの天然化学結合に適切な部位の数を、タンパク質に見出される４００のジペプチド配列のなかの５０より多くへ拡張する。グリシン残基を含む標的配列における結合部位の選択においてかなりの許容度があるので、この拡張された適用性は、ほとんどのポリペプチドを天然化学結合により利用しやすくする。オリジナルの形態（Dawson et al．Science 1994，266，776-779）又は本明細書に記載される形態の天然化学結合は、典型的な大きさのタンパク質ドメインの zer et al．Science 1992，256，221-225; Rose et al．Am．Chem．Soc．1994， 116，30-34; Liu et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1994，91，6584-6588）を使用して、モジュール様式で合成ドメインを結合し、大きな(すなわち＞２０キロダルトン)、完全機能性合成タンパク質を製造することができる(Canne et a l．J．Am．Chem．Soc．1995，117，2998-3007; Baca et al．J．Am．Chem．Soc ．1995，117，1881-1887)。すべての適切な化学反応を組み込むほぼ一般的な形態（Dawson et al．Science 1994，266，776-779）において、化学結合アプローチは、ポリペプチドの化学合成法の進化において次世代に相当し、再生可能、かつ実用的なタンパク質の全化学合成を提供する。結合例１〜４結合例の結果を図４に要約する。全ての結合は、８Ｍ尿素、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０又は６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５中、各ペプチド４ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で行った。ペプチドセグメントの（solvation）直後、２〜５％ベンジルメルカプタン（結合例＃１）又はチオフェノール（結合例＃２〜５），容量の結合用緩衝液を添加し、チオール基を還元形態に維持した。これは、もとのペプチド−^αチオエステル（１）の有意量をペプチド−^αチオベンジルエステル又はペプチド−^αチオフェニルエステル（共に、所望の態様でペプチド２と反応する能力を有している）へ交換する追加の重要性を有していた。結合反応に続いて、分析用逆相ＨＰＬＣを行い、生成物をＥＳＭＳにより同定した。以下に示す実施例において、結合に関連するアミノ酸残基に下線を引いた。実施例１ペプチド-^αチオ（３−カルボキシ−４−ニトロ）フェニルエステル１は、配列L YRAG-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）(配列番号１)（実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ）を有していた。５−チオ-２−（ニトロ安息香酸）ジスルフィドとして保護されているＮ^α（エタンチオール）ペプチド２ａは、配列[(3-CO₂H-4-NO₂)- C₆H₃-S-SCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂（配列番号２）(実測質量８００Ｄａ、計算値８００Ｄａ)（この配列は結合混合物中で[HSCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂（配列番号２）(実測質量６０３Ｄａ、計算値６０３Ｄａ)に還元される）を有していた。１時間後、結合生成物４ａ[LYRAGG(N^α-CH₂CH₂SH)AGPAGD-^αCONH₂（配列番号３）(実測質量１１６３±１Ｄａ、計算値１１６３Ｄａ)］が有意な程度生成した。逆相ＨＰＬＣによる結合生成物の精製後、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）と６Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ６．０中で１時間処理し予想される−Ｓ−ニトロ安息香酸ジスルフィド生成物、LYRAGG[N^α-CH₂CH₂S-SC₆H₃（3- CO₂H-4-NO₂）]AGPAGD-^αCONH₂（配列番号３）(実測質量１３６０±１Ｄａ、計算値１３６０Ｄａ)を得た。これにより３ａの転位により４ａが形成することを確認した。なぜなら、３ａは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）に対して不活性であるからである。結果を図４に要約する。実施例２図５Ａ〜５Ｃは結合例＃２の過程を示している。ペプチド−^αチオエステルセグメント１（ピークａ）は、配列LYRAG-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H,4-NO₂）(配列番号１) （実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ、を有していた。Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークｂ）は、配列[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^α CONH₂（配列番号４）(実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値1828Ｄａ)から構成されていた。添加したチオフェノールの存在下、室温で１時間の反応後、結合生成物LYRAGG（N-OCH₂CH₂SH）RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号５）(４ｂ、実測質量２３８８±１Ｄａ、計算値２３８９Ｄａ)が有意な程度生成し、これは未反応のＮ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークｅ）と共に共溶出した。更に一晩、室温下で反応させた後、結合生成物をＨＰＬＣにより精製し、亜鉛粉末をＨＰＬＣ溶離剤中に集めたペプチドへ直接添加し、室温下で一晩攪拌した。これらの条件下、亜鉛はＮ−Ｏ結合を効率的に還元した。このタイプの還元は、種種の試薬により可能である(Kecketal.TetrahedronLett.1995,36,7419-7922)。得られたペプチド（ピークｆ）はＮ−Ｏ結合の還元により生成した LYRAGGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(配列番号５)（５ｂ、実測質量２３１３±１Ｄａ、計算値２３１３Ｄａ）と一致した質量を与えた。これにより、図１に示すように３ｂから４ｂへの転位を確認した。なぜなら、未転位３ｂにおけるＮ−Ｏ結合の切断は有意に低い質量の２つの異なるペプチドの形成を引き起こすからである。実施例３図６Ａ〜６Ｃは結合例＃３の過程を示している。ペプチド−^αチオエステルセグメント１（ピークｄ）は、Ｃ末端フェニルアラニンチオエステル[LYRAF-^αCOS CH₂C₆H₅（配列番号６）(実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ)］を有するペプチドから構成されていた。したがって、前記の場合（結合例＃１及び＃２）( Ｃ末端グリシンチオエステルを含む)よりも立体障害を提供する。Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークａ）は、[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^α CONH₂(配列番号７)（実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値１８２８Ｄａ）から構成されていた。より立体障害を受けたチオエステルの存在は、障害を受けていないモデルと比較して反応を低下させた。しかしながら、３７℃での加熱は初期結合速度を促進することを見出した。図６Ａは、３７℃で１１．５時間後の結合反応を示している。３ｂから４ｂへの転位速度は、未転位生成物３ｂ、LYRAF-[^α COSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(配列番号８)（ピークｂ、実測質量２４７８±１Ｄａ、計算値２４７８Ｄａ）を観察するのに十分なほど遅く、転位生成物４ｂ、LYRAFG(N^α-OCH₂CH₂SH)RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(配列番号９)（ピークｃ、実測質量２４７８±１Ｄａ、計算値２４７８Ｄａ）のわずか前に溶離した。同一の質量を有する、未転位及び転位生成物３ｂ及び４ｂを、亜鉛還元生成物により同定した。中間体３ｂ、ピークｂは、亜鉛還元時に、それぞれペプチド配列LYRAF-^αCOOH（チオエステル加水分解）及びGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂に対応する６６９Ｄａ及び１７５３Ｄａの質量を有する２つのペプチドを与えた。次いで粗反応混合物を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ4.0 で（容量の５倍まで）希釈して初期結合後のｐＨを４．５に低下させることにより、転位速度が加速したことを測定した。図６Ｂは、初期結合生成物３ｂから４ｂ（ピークｃ）への転位が、ｐＨ４．５、３７℃で１０時間後に完了したことを示している。このピークのＨＰＬＣ精製及び続く亜鉛還元により、予想される質量を有するペプチド（ピークｆ）LYRAFGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(配列番号９)（５ｂ、実測質量２４０３±１Ｄａ、計算値２４０４Ｄａ）を得た。実施例４ LYRAG-^αCOSCH₂C₆H₅１（配列番号１）(実測質量６８５Ｄａ、計算値６８５Ｄａ)を、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH２ｂ（配列番号１０）(実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ)へ、ｐＨ７．５で結合した。本実施例は、結合例＃３の結合部位とは反対側のAla残基形態の立体障害を提供した。反応速度は実施例３と同様であり、未障害例（結合例＃１及び＃２）よりも有意に遅い速度であるが、３７℃での加熱により加速した。未転位（３ｂ、LYRAG-^α[COSCH₂ CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH）(配列番号１１)及び転位（４ｂ、LYRAGA（N^α-O CH₂CH₂SH）ARHTVHQRHLHG-^αCOOH）(配列番号１２)結合生成物が形成し、実測質量（未転位及び転位ともに）２１５６±１Ｄａ、計算値２１５７Ｄａであった。しかしながら、結合例＃３と異なり、アミドへの成功した還元に示されるようにｐＨにかかわらず３７℃で２日後に転位はほぼ完了したが、転位速度は、初期結合後にｐＨを４．５に低下させても加速しなかった。最終結合生成物５ｂ（LYRAGAARHTVHQRHLHG-^αCOOH(配列番号１２)、実測質量２０８０±１Ｄａ、計算値２０８０Ｄａ）における有意数のヒスチジンの存在により、ペプチドの亜鉛への結合が起こったことに注目すべきである。Ｎ−Ｏ結合の還元後、ＥＤＴＡをＨＰＬＣ緩衝液／Ｚｎ混合物に添加して、ペプチドを亜鉛から遊離させる必要がある。この結果を図４に要約する。実施例５実施例５は、結合部位の両側に立体的バルク（steric bulk）を有する例を提供する。LYRAF-^αCOSCH₂C₆H₅１（配列番号６）(実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ)を、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH２ｂ（配列番号１３）(実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ)にｐＨ７．５で結合した。初期（すなわち未転位）結合生成物３ｂが観察されたが、LYRAF-^α[COSCH₂CH₂O]- A ARHTVHQRHLHG-^αCOOH（配列番号１４）(実測質量２２４６±１Ｄａ、計算値２２４７Ｄａ)、低ｐＨ下であっても、時間内に転位の証拠は存在しなかった。結合部位の両側の側鎖の存在は、明らかに立体障害を与えたため、使用した条件下では６員環中間体を経た転位は起こらなかった。結果を図４に要約する。前記の例は、本発明者らのオリジナルの天然結合化学(Dawson et al．Science 1994，266，776-779)の驚くべき能力を強調する。これは、最近モデル結合研究（Tametal．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1995，92，12485-12489）において本質的に同一の形態で独立して繰り返された。本発明者らは、このオリジナルの天然ペプチド結合-形成結合反応を、完全な生物学的活性を有するいくつかのタンパク質の化学合成に使用した。これらには、ケモカインＩＬ−８(Dawson et al ．Science 1994，266，776-779)、酵素ＨＩＶ−１プロテアーゼ及びバーナーゼ( barnase)、セリンプロテアーゼ阻害剤シチメンチョウオボムコイド第三ドメイン及びエグリン（eglin）Ｃ及びａｂ／ＨＬＨ転写因子が含まれる。この結合反応は、MaxBrenner（Brenner M．peptides，Proceedings of the Eighth Europeanp eptide Symposium Beyerman，H.C.，Ed.，NorthHolland: Amsterdam,1976;pp1-7 ）により公表された原理に基づくものであり、Wieland（Wieland et al．Liebig s Ann．Chem．1953，583，129-149）により最初に記載された化学を使用している。実験プロトコル概略機械補助固相ペプチド合成を、カスタム修正（custom-modified）したアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａペプチド合成機中で行った(Schnolzer et al．Int．J．Pept．Protein Res．1992，40，180-193)。逆相ＨＰＬＣを、バイダック（Vydac）Ｃ−１８計算用カラム（５μｍ、０．４６× １５ｃｍ）及び準分離用（10μｍ、１．０×２５ｃｍ）カラムを使用したライニン（Rainin）ＨＰＬＣシステムで２１４ｎｍのＵＶ検出を用いて行った。クロマトグラフィー分離は、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ（Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝９０％CH₃CN／０．０９％ＴＦＡ含有１０％水）の直線勾配を３０〜６０分間、１ｍｌ／分（計算値）又は３ｍｌ／分（準分離用）で使用して達成した。全てのペプチドセグメントのマススペクトルは、SciexAPI-IIIエレクトロスプレー四極マススペクトロメーターを用いて得た。実測質量は、プログラムマックスペック（MacSpec）(サイエックス(Sciex))を使用しての、分子種についての全ての観察されたプロトン化状態についての実験ｍ／ｚ値に由来した。計算質量は、平均アイソトープ組成物に基づき、かつプログラムマックプロマス（MacP roMass）(テリー・リー・アンド・サニル・ベムリ)(Terry Lee and Sunil Vemur i)、ベックマン・リサーチ・インスティテュート(Beckman Research Institut e)、デュアルテ、カリフォルニア)の使用に由来した。その他すべてのマススペクトロメトリーは、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュートのマススペクトロメトリー施設で行った。¹ＨＮＭＲスペクトルは、ブルッカー（Bruker ）２５０ＭＨｚスペクトロフォトメーターに記録し、化学シフトは、Ｍｅ₄Ｓｉ由来の低磁場百万分率で報告した。微量分析は、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテユートのＸ腺結晶学施設で行い、これは計算値±０．４％で一致した。Ｂｏｃ−Ｌ−アミノ酸及びＨＢＴＵは、ノババイオケム(Novabiochem)（ラジョラ、カリフォルニア）より購入した。４−ヒドロメチルフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）は、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)（フォスターシティ、カリフォルニア）より入手し、メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）はペニーシュラ・ラボラトリーズ(Peninsula Laboratories，Inc)（サンカルロス、カリフォルニア）より入手した。合成用ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はベーカー(Bak er)より入手し、AR用CH₂Cl₂及びＨＰＬＣ用CH₃CNはフィッシャー(Fisher)より入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はハロカーボン(Halocarbon)（ニュージャージー）より入手した。ＨＦはマセソンガス（Matheson Gas）より購入した。４ −メチルベンジルメルカプタンはランカスター（Lancaster）より入手した。その他全ての試薬はＡｒ用又はそれより良く、アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）又はフィッシャーより入手した。ペプチドセグメント合成鎖の組立てペプチドを、Ｂｏｃ化学についての原位置中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用した確立された固相法により段階的に合成した(Schnolzer et al．Int．J． Pept．Protein Res．1992，40，180-193)。側鎖の保護は以下に示すとおりであった。Boc-Arg（p-トルエンスルホニル）-OH、Boc-Asn（キサンチル）-OH、Boc- Asp（O−シクロヘキシル）-OH、Boc-His（ジニトロフェニル）-OH、Boc-Thr（ベンジル）-OH及びBoc-Tyr（2-ブロモベンジルオキシカルボニル）-OH。Boc-Gln-O H及びBoc-Met-OHは側鎖の保護なしに使用した。カップリング反応を、定量的ニンヒドリンアッセイによりモニターし(Sarinetal，Anal．Biochem.，1981，117 ，147-157)、典型的には＞９９％であった。鎖の組立が完了した後、ペプチドを脱保護し、同時に、ＨＦ含有５％ｐ−クレゾールを用いた０℃で５時間の処理により樹脂から切断し、ペプチド-^αCOSH、-^αCONH₂又は-^αCO₂Hを得た。減圧下でＨＦを除去した後、粗ペプチドを無水Ｅｔ₂Ｏ（ジエチルエーテル）中に沈殿させ、ＨＰＬＣ緩衝液（４０〜５０％Ｂ）中に溶解し、凍結乾燥した。図１に示すペプチド-^αチオエステル（1）の合成チオ酸ペプチドは、［4-[α-(N-t-Boc-アミノアシル-S)ベンジル]フェノキシ］酢酸、DCHA塩（Canne et al．Tetrahedron Lett．1995，36，1217-1220），（２．０当量）及びアミノメチル−樹脂（１当量、ＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡ（アルドリッチ）で洗浄）を、活性化剤として添加したＨＢＴＵ（１．６当量、アルドリッチ）及びＤＩＥＡ（１当量、アルドリッチ）を用いて、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中でカップリングすることにより、適切なＢｏｃ−アミノアシル− Ｓ−樹脂上で合成した。ペプチド-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）チオエステルは、粗ペプチド-^αCOSH（１５〜２０ｍｇ）を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０〜６．５に溶解することにより生成し、これに１．５当量の５，５’−ジチオ-ビス（２−ニトロ安息香酸）を添加した(Dawson et al ．Science 1994，266，776-779)。混合物を簡単にボルテックスし、１０分後生成した。ペプチド-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）エステルの同一性は、正確なエレクトロスプレー質量測定により明確に確認し、これはLiuら（Tetrahedron Lett ． 1996，37，933-936）と一致した。ペプチド-^αCOSCH₂C₆H₅チオエステルは、粗ペプチド-^αCOSH（１５〜２０ｍｇ）を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に溶解し、これに１０当量の臭化ベンジルを添加することにより生成した(Dawson et al．Science 1994，266，776-779)。混合物を簡単にボルテックスし、１時間後精製した。LYRAG-^αCOSC₆H₃(3-CO₂H-4-NO₂)（実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ）を、準分離用ＨＰＬＣ(２０〜６０％Ｂで４０分間)により精製し、２０〜３０％の収率を得た。LYRAG-^αCOSCH₂C₆H₅( 実測質量６８５Ｄａ、計算値６８５Ｄａ)を準分離用ＨＰＬＣ（１５〜４５％Ｂで６０分間）精製し、２５〜３０％の収率を得た。LYRAF-^αCOSCH₂C₆H₅（実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ）を準分離用ＨＰＬＣ（３０〜６０％Ｂで６０分間）により精製し、２５〜３０％の収率を得た。収率の損失のほとんどは、単にＨＰＬＣ回収によるものであった。図２に示すＮ^α（エタンチオール）及びＮ^α（オキシエタンチオール）ペプチド（２）の合成これらのペプチドを、ＭＢＨＡ（シグマ(Sigma)）又は適切なBoc-アミノアシル-OCH₂-PAM-樹脂（シグマ）のいずれかにおいて合成した。鎖の組立を完了し、Ｎ^αＢｏｃ基を純粋ＴＦＡで除去し(１分間の処理２回)、ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡ中和（１分間の処理２回）後、ペプチドをRobeyの方法（Robey et al．Anal ．Biochem．1989，177，373-377）によりブロモアセチル化した。ブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）をCH₂Cl₂（２ｍｌ）に溶解し、これにＤＩＣ（１ｍｍｏｌ、２ −ジメチルアミノイソプロピルクロリド又はヒドロクロリド、アルドリッチ又はシグマ）を添加した。１０〜１５分間活性化し、対称性無水物を形成した後、混合物をＤＭＦ（２ｍｌ）で希釈し、ペプチド−樹脂に添加し、３０分間カップリングした。次いで樹脂をＤＭＳＯで洗浄し、８ａ（ＤＭＳＯ中２Ｍ）又は８ｂ（ＤＭＳＯ中の１Ｍ）を添加し、ブロモアセチル化ペプチド−樹脂と８〜２３時間反応させた。ペプチドを、樹脂からの除去後、修飾なしに精製した。[（3-CO₂H- 4-NO₂）-C₆H₃-S-SCH₂CH₂]-AGPAGD-^αCONH₂（２ａ）(実測質量８００Ｄａ、計算値８００Ｄａ)を、準分離用ＨＰＬＣ（０〜６７％Ｂで６０分間）により精製し、〜２４％を得た。[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（２ｂ）(実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値１８２８Ｄａ)を準分離用ＨＰＬＣ（１５〜４０％Ｂで６０分間）により精製し、〜２５％の収率を得た。[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRH LHG-^αCOOH（２ｂ）を、ブロモ酢酸の代わりに２−ブロモプロピオン酸のラセミ化合物を使用し前記の方法により合成した。得られた粗凍結乾燥生成物は、所望のペプチド及びブロモプロピオン酸塩化ペプチド（CH₂=CHCO-ARHTVHQRHLHG-^αCO OH、実測質量１５０２±１Ｄａ、計算値１５０２Ｄａ）からのＨＢｒの除去により生じたペプチドの混合物であった。混合物を準分離用ＨＰＬＣ（１０〜４０％Ｂで６０分間）により精製し、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH（実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ）を〜１０％の収率で得た。図２に示すＳ−[（３−カルボキシ−４−ニトロ）フェニルチオ]２−アミノエタンチオール（８ａ）の合成２−アミノエタンチオール（１．０ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）及び５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）(１．７５ｇ、４．４ｍｍｏｌ)を、アセトニトリル（１００ｍｌ）及び水（２５ｍｌ）と組み合わせ、室温で１４時間攪拌した。反応混合物を水（４５０ｍｌ）で希釈し、ウォーターズ・デルタ・プレップ（Waters Delta Prep）４０００（バイダック５．０×２．５ｃｍ分離用Ｃ− １８カラムを有する）中の分離用逆相ＨＰＬＣで精製し、８ａ(１．０ｇ、４０％)を得た。図３に示すＮ−（２−ブロモエトキシ）フタルイミド（１１）の合成Ｎ−(２−ブロモエトキシ)フタルイミド(１１)を、Bauer及びSureshl(Bauer e t al．J．Org．Chem．1963，28，1604-1608)の手順の修飾により合成した。Ｎ −ヒドロキシフタルイミド(１６．０ｇ、９８ｍｍｏｌ、アルドリッチ)、トリエチルアミン（３０ｍｌ、２１５ｍｍｏｌ）及び１，２−ジブロモエタン（３５ｍｌ、４０６ｍｍｏｌ、アルドリッチ）をＤＭＦ（１１５ｍｌ）で組み合わせ、室温下で一晩攪拌した。固体をろ過し、ＤＭＦで洗浄した。ろ液を水（８００ｍｌ）で希釈し、得られた沈殿物をろ過し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中に希釈し、１ＮＨＣｌ(２×５０ｍｌ)，水(１×５０ｍｌ)、飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた固体を９５％ＥｔＯＨより再結晶化し、１１を白色固体として得た(１６．６ｇ、６３％)。図３に示すＮ−[２−[Ｓ−（４−メチルベンジル）]メルカプト]エトキシ]フタルイミド（１２）の合成臭化物１１(１６．６、６２ｍｍｏｌ)、４−メチルベンジルメルカプタン（８．５ｍｌ、６３ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（９．５ｍｌ、６４ｍｍｏｌ、１，８−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−７−エン、アルドリッチ）をベンゼン（１５０ｍｌ）中で組み合わせ、室温下で８時間撹拌した。固体をろ過し、ベンゼンで洗浄し、ろ液を１ＮＨＣｌ(２×３５ｍｌ)、水(１×３５ｍｌ)、飽和ＮａＣｌ（１×３５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化し、１２を白色固体として得た(１４．８ｇ、７４％)。図３に示すＳ−（4-メチルベンジル）−２−アミノオキシエタンチオール（８ｂの合成Ｓ−(４−メチルベンジル)−２−アミノオキシエタンチオールを、Osby(Osby et al．Tetrahedron Lett．1984，25，2093-2096)の方法により合成した。Ｎ− 置換フタルイミド１２（７．４ｇ、２３ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（２０３ｍｌ）及び水（３５ｍｌ）中に懸濁し、これにＮａＢＨ₄（３．５ｇ、９２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温下で一晩撹拌した。酢酸（２５ｍｌ）を泡立ちが停止するまでゆっくりと添加し、フラスコに栓をし、５０℃で２〜３時間加熱した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた溶液を１ＮＮａＯＨで希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせたＥｔＯＡＣ抽出物を飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた油をフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製し、８ｂを透明かつ無色（３．２ｇ、７２％）の油として得た。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION General chemical bondTechnical field to which the invention belongs The present invention relates to a method for chemically binding oligopeptides. More specifically the book The invention uses peptide bonds to chemically link the ends of the oligopeptide How to do.Government rights The present invention is based on the grant number R01 GM 4 awarded by the National Institutes of Health. It was made with government support under 8897 and P01 GM 48870. A The United States Government has certain rights in the invention.Background art Traditional step-wise solid-phase peptide synthesis is often used to synthesize long peptides. , Low yield (Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2). 149-2154; Kent et al. Ann. Rev. Biochem. 1988, 57, 957-989). Overcome this limitation To submit a smaller synthetic peptide to another peptide in a chemical bond, Will produce long peptides. al., Science 1992, 256, 221-225; Rose et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116 , 30-34; Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584-6588). Sch The methodology disclosed by onolzer relies on the chemoselective reaction of unprotected peptide segments. The reaction provides a product having a non-natural backbone structure at the binding site. Is what you do. This methodology is better than that obtained by standard peptide synthesis methods. Also allow the synthesis of large peptides (Canne et al. J. Am. Chem. Soc. . 1995, 117, 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995,117,1881-188 7; Williams et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10797-10798). More Method allows the synthesis of peptides with unusual structures and topologies (D awson et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7263-7266; Rose et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-34; Muir et al. Biochemistry 1994, 33, 7701-7708 ; Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007). Conventional stepwise solid phase The combined use of peptide synthesis and chemical bonding has led chemists to use up to 60 amino acid residues. Can be routinely produced in good yields and purity of unprotected peptides at Using a combination of these two methodologies, total chemical synthesis of proteins is achieved Maybe. Another chemical bonding technology for the production of proteins with natural backbone structures It has been reported (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). This style of chemistry The linkage has been termed "native ligation". In this technology Converts unprotected synthetic peptides with C-terminal α-thioesters in a chemoselective manner. , With an unprotected peptide containing an N-terminal Cys residue. First thiol exchange reaction Thioester-linked intermediate, which rearranges spontaneously, Provides a natural amide bond at the binding site where two peptide segments bind In this process, the Cys side chain thiol is regenerated. This natural bond variant is Use the chemistry first described by Wieland for the reaction of amino acids (Wi eland et al. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149). First listed As such, the native linkage is the linkage of the peptide segments in the X-Cys linkage. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). What is needed is a C-terminal α-thioester peptide segment with an N-terminal amino acid. A general method of coupling to a peptide peptide comprising an N-terminal amino acid peptide This is a method that does not require that the do segment has an N-terminal cysteine.Summary of the Invention The present invention chemically binds unprotected oligopeptides and has all peptide bonds. Directed to a method of forming a product. In the first step, two oligo peptides The tide is linked to form a linkage product having an aminothioester linkage. Second construction In which the aminothioester bond is rearranged to form an N-substituted amide bond Form an object. In an optional third step, the substituent on the amide bond is removed in an acidic medium. Removed by easy treatment with Zn to give a natural peptide bond at the binding site You. The method of the present invention comprises two starting oligopeptides, a first starting oligopeptide. A tide and a second starting oligopeptide are used. The first oligopeptide is thioe It has a C-terminal auxiliary group with a steal moiety. Ie ,[peptide₁]^αCOSR (where R is 3-carboxy, 4-nitrophenyl And benzyl. ). The second oligopeptide is non-acid Has an auxiliary functional group with a sulfhydryl moiety You. That is, HSCH_TwoCH_Two(O) -N^α[peptide_Two]. First and second When the two starting oligopeptides are mixed under conditions that promote thioester exchange , Both peptides condense with each other to form an intermediate oligopeptide product. here, First and second oligopeptides are linked via an aminothioester bond . The aminothioester bond is spontaneously rearranged in the molecule, and is linked by an N-substituted amide bond. Form a binding product that is bound. During the intramolecular rearrangement, the amine of the N-terminal auxiliary functional group Ano groups attack thioesters and provide a bound N-linked complement containing a substituted sulfhydryl moiety. An amide group having an auxiliary functional group is formed. N-linked complement containing substituted sulfhydryl moieties Auxiliary functional groups are removed as appropriate by chemical means and have all natural peptide bonds A product may be formed. One aspect of the present invention is a method for producing an oligopeptide product comprising the steps of: It is directed to a method of joining a peptide and a second oligopeptide end to end. More specifically, the method of the present invention comprises two steps and an optional third step. In the first step, the first and second oligopeptides are linked to a δ or γ aminothioester. In order to produce an intermediate oligopeptide linked together, the C Condensation of terminal thioester with non-oxidized sulfhydryl moiety of second oligopeptide Includes making The first oligopeptide has a C-terminal thioe on the C-terminal residue. And the second oligopeptide comprises an N-terminal having a non-oxidized sulfhydryl moiety. Contains an N-terminal auxiliary function on the terminal residue. C-terminal residue of the first oligopeptide Is non-glycine, the N-terminal residue of the second oligopeptide is glycine . If the N-terminal residue on the second oligopeptide is non-glycine, the first oligo The C-terminal residue on the peptide is glycine. However, non-glycine residues are non-β-branched Amino acids. In the second step, the δ- or γ-aminothioester bond of the intermediate oligopeptide Is rearranged by intramolecular attack on the thioester moiety of the δ or γ-amino group, Displace the sulfhydryl moiety as a by-product from the olester moiety. This An oligopeptide in which the first and second oligopeptides are linked by an amide bond Produce a product. The nitrogen of the amide bond is an auxiliary with a substituted sulfhydryl moiety Contains functional groups. An optional third step involves using a reducing agent to generate a natural peptide bond. Includes removal of auxiliary functional groups on the mid nitrogen from the oligopeptide product. Ami The nitrogen assisting functional group is N-α-O- (CH_Two)_n-SH (where 1 ≦ n ≦ 2 . ). The reducing agent is zinc (the underlined nitrogen represents the bound amide nitrogen). In another aspect of the invention, there is provided a first oligopeptide seg comprising a C-terminal thioester. A second orientation containing an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety. Gopeptide segments and sulfhydryls of C-terminal thioesters and auxiliary functional groups Oligopeptide intermediates containing an aminothioester linking unit linking the drill group included.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows an unprotected peptide segment (where R is a β-branched amino acid residue). However, if the C-terminal residue on the first oligopeptide is non-glycine, the second The N-terminal residue on the oligopeptide is glycine, and the N-terminal residue on the second oligopeptide is If the terminal residue is non-glycine, the C-terminal residue on the first oligopeptide is Shin. 3) shows a generalized natural chemical bond of the present invention. R 'is 3-carboxy, It is selected from the group consisting of 4-nitrophenyl and benzyl. FIG.^α2 shows the chemical synthesis of (substituted) peptide segments 2a and 2b. FIG. 3 shows the chemical synthesis of compound 8b. FIG. 4 shows a table for a summary of model combinations for Examples # 1-5. Superscript The characters are as shown below. (A) thioester peptide (wherein, -SNB = 3-carboxy-4-nitrophenylthioester, -Sbzl = benzylthio Oester). (B) N^α(Substituted) peptide (where etsh = N^α(Eta Thiol), oetsh = N^α(Oxyethanethiol)). (C) Pep Based on Pide 2. Estimated by analytical reverse phase HPLC (peak area) and ESMS. (D) After the time indicated by pH 7.5, the pH was adjusted to 4.5. 5A to 5C show model combinations. Example # 2 (described below). Amide-Gl y (N^α-OCH_TwoCH_TwoSH) Gly-compound 4b is converted to 6M guanidine.HCl , 0.1 M Na_TwoHPO_FourFormed at pH 7.5. (A) to (C) are as follows: 3 shows an HPLC plot. (A) Analytical HPLC at t = 0 (10-50% B for 30 minutes), peak a, thioester peptide, 1, LYRAG−^αCOS C₆H_Three(3-CO_TwoH-4-NO_Two). Peak b, N^α(Oxyethanethiol) Peptide, 2b, [HSCH_TwoCH_TwoO]-GRNATTIMMQRGGNFR-^αC ONH_Two. (B) Analytical HPLC at t = 1 hour (10-50% B for 30 minutes ), Peak c, non-peptide impurity, peak d, LYRAG-^αCOSC₆H_Five, By transthioesterification of 1 with ophenol. Peak e, intermediate formation Synthetic product, 4b, LYRAGG(N^α-OCH_TwoCH_TwoSH) RNTATIMMQ RGNFR-^αCONH_TwoAnd a small amount of unreacted [HSCH_TwoCH_TwoO]-GRNTA TIMMQRGNFR-^αCONH_Two(2b), electrospray ionization MS Measured by (C) HPLC-purification and use of Zn in acidic HPLC solvents. Analytical HPLC of peak e after overnight treatment (30 minutes at 15-40% B), peak f , Final conjugation product, 5b, LYRAGGRNATTIMMQRGGNFR-^αCH NH_Two, Peak g, non-peptide impurity. 6A to 6C show model combinations. Example # 3 (described below). −Phe (N^α -OCH_TwoCH_TwoSH) Gly-linked product 4b. Binding and rearrangement are performed at 37 ° C. Was. (A)-(C) show HPLC plots as follows. (A) 6M guani Gin / HCl, 0.1M Na_TwoHPO_FourAfter 11.5 hours in pH 7.5 To Analytical HPLC (20-40% B for 30 minutes), peak a, N^α(Oxyethane All) peptide, 2b, [HSCH_TwoCH_TwoO]-GRNATTIMMQRGN FR-^αCONH_Two, Peak b, non-rearranged intermediate binding product, 4b, LYRAFG( N^α-OCH_TwoCH_TwoSH) RNTATIMMQRGGNFR-^αCONH_Two,peak d, thioester peptide, 1, LYRAF−^αCOSCH_TwoC₆H_Five. (B) 6 M guanidine · HCl, 0.1M NaCH_ThreeCO_Two11.5 hours in pH 4.5 Analytical HPLC after (30 min at 0-67% B). (C) Acidic HPLC Analytical HPLC of HPLC purified peak c after overnight treatment with Zn in solvent (20-40% B for 30 min), peak f, final bound product, 5b, LYRAFG RNATTIMMQRGGNFR-^αCONH_Two.Detailed description of the invention The invention consists of two steps for chemically linking two separate peptide fragments Aimed at the way. More particularly, the present invention relates to a method for converting unprotected peptide segments to native (Amide formation) A general methodology for chemically bonding and purifying natural peptide bonds Concerning The first step involves the C-terminal thioester of the first peptide and the second oligopeptide Of the first oligopeptide and the second oligopeptide Intermediate oligopeppe in which peptides are linked by δ- or γ-aminothioester bonds Generating the peptide. The C-terminal residue on the first oligopeptide is non- When glycine, the N-terminal residue on the second oligopeptide is glycine. If the N-terminal residue on the second oligopeptide is non-glycine, The C-terminal residue on the peptide is glycine. However, non-glycine residues are non-β-branched Amino acids. The second step involves the intramolecular attack of the δ or γ-amino group on the thioester moiety. Rearrangement of the δ or γ-aminothioester bond of the interstitial oligopeptide, thereby Substitution of the sulfhydryl moiety as a by-product derived from the thioester moiety, and The first oligopeptide and the second oligopeptide are linked by a natural amide bond The formation of an oligopeptide product. However, nitrogen on the amide bond The element contains an auxiliary functional group having a substituted sulfhydryl moiety. An optional third step involves reducing the auxiliary functional group on the amide nitrogen with a reducing agent to form the oligopeptide. Removing from the tide product to produce a natural peptide bond. Amide The nitrogen assisting functional group is N-α-O- (CH_Two) N-SH (where 1 ≦ n ≦ 2) ) And the reducing agent is zinc (the underlined nitrogen represents the attached amide nitrogen) . ). The method of the present invention provides a method for penetrating either natural or modified backbone structures. Allows synthesis of peptides and proteins. FIG. 1 summarizes the procedure. peptide The α-carboxythioester (1) is converted into N^α(Ethanthio )) Peptide (2a) or N_αOf the (oxyethanethiol) peptide (2b) React with any of them to produce a coupled product 3. This thioester linked intermediate is Rearrangement via an advantageous geometric rearrangement involving a 5- or 6-membered ring; An analogous N-oxyalkyl compound in the amide bond product 4 or 4b containing To give an amide bond product 4 containing The obtained N-^α(Substituted) amides are also advantageous Potentially having solution properties (Quibell et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1). 1656-11668). The obtained N-^αThe (O-alkyl) amide bond product further comprises H F has the advantage of being stable to cutting conditions and is easily removed under mild conditions. It is. In the case of 4b, zinc powder was directly applied to reverse phase HPLC purified peptide in acidic eluent To reduce the N—O bond of the O-alkoxyhydroxamate to give the bond product 5 The natural backbone structure of b can be obtained. All peptide segments are tert-butoxycarbonyl (Boc) ylated In situ neutralization for chemistry / 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1, 1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Stepwise synthesis and separation by established solid-phase method using activation protocol Purified by reverse phase HPLC, electrospray mass spectrometry (ES 40, 180-193). Peptide-α-thioester (1) is the corresponding peptide-α-thio From acid, and then Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220 Synthesized on thioester resin as described in. Peptide-α -Thioic acid was prepared using 6M guanidine-HCl, 0.1M sodium acetate, pH 5.0 -6.5 with 1.5 equivalents of 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) Conversion to the corresponding 3-carboxy-4-nitrophenylthioester by reaction Or in 6 M guanidine-HCl, 0.1 M sodium acetate, pH 4.0 Converted to the corresponding benzyl ester using 10 equivalents of benzyl bromide (Dawso n et al. Science 1994, 266, 776-779). Both thioesters are 3-carboxy Provides sufficient leaving groups for conjugation reactions with c-4-nitrophenylthioesters I do. This shows a slightly faster reaction rate than the corresponding benzylthioester (Daw son et al. Science 1994, 266, 776-779). N^α(Ethanethiol) (2a) and N^α(Oxyethanethiol) (2b) The result is shown in FIG. Suitable α-bromocarboxylic acids (activated as symmetrical anhydrides (di- 0.5 equivalent of 1,3-diisopropylcarbodiimide (DIC) in chloromethane )) (Robey et al. Anal. Biochem. 1989, 177, 373-377). And bromoacyl-peptide-resin 7 was obtained. The bromide is stereochemically displaced by the amine group 8a or 8b in DMSO. Thus, peptide-resin 9 was obtained. For deprotection and cleavage from resin in anhydrous HF Thus, 2b is obtained directly, or 2a is obtained in disulfide form, which is Reduce to oars. The aminoethanethiol derivative 8a was prepared from 2-A in 80% acetonitrile in water. Reaction of minoethanethiol and 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) The synthesis was performed in one step. Also includes synthesis of aminooxyethanethiol derivative 8b This is shown in FIG. Bromide 11 is combined with N-hydroxyphthalimide (10) Produced from reaction with a large excess of 1,2-dibromoethane (Bauer J. Org. Chem. . 1963, 28, 1604-1608). The bromide 11 is converted to the base 1,8-diazabicyclo [5.4 . 0] 4-Methylbenzylmercapta in the presence of undec-7-ene (DBU) To a protected aminooxyethanethiol derivative 12. 12 lids The imide group was removed in a two step process (Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25). , 2093-2096). This method uses NaBH_FourReduction using acetic acid, followed by treatment with acetic acid To obtain the desired aminooxyethanethiol derivative 8b. Compared to the original natural chemical bond at the X-Cys site (Dawson et al. . Science 1994, 266, 776-779), the most noteworthy feature of the coupling chemistry of the present invention. Is a slow rearrangement of the first thioester bond product. In the six-membered ring in this example The intramolecular attack by the α-NH (O-alkyl) group via the interstitial forms X-Cys bond. Α-NH_TwoFive-member ring mediated attack (Dawson et al. Science 1994) , 266, 776-779) (Mandolini et al. J. Am. Chem. S. oc. 1978, 100, 550-554). With the exception of the Gly-Gly bond, Only the thioester-linked initial bond product of the present invention can be isolated. (FIG. 4). Notably, C on both binding sites^αFor the substituted amino acids, No rearrangement to the amide bond can be seen. That is, a thioester-bonded intermediate Was indefinitely stable under the reaction conditions. These slow dislocations have been reported (N ) Similar to those found in amide-forming linkage chemistry (Liu et al. Proc. . Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584-6588). In the present invention, the use of a temporary auxiliary function in the amide-forming linkage is described by Kemp "Thiol capture" strategy proposed by Dawson et al. Science 1994 266, 776-779 Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). Heaven Naturally, chemical bonding and thiol capture methods have long- Unprotected peptides in a segment condensation strategy to achieve peptide chain synthesis Have the use of The key to the natural chemical bonding approach is the initial thioester bond Other segments in both segments under conditions that promote thiol partial exchange of intermediate products Giving a regioselective bond at the N-terminal Cys even when the Cys residue of (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). In contrast, "thiol Capture strategy and related methods (Liu et al. Tetrahedron Lett. 1996, 3 7,933-936), the regiospecific protection of the Cys side chain functional group before the binding reaction is necessary. (Kemp et al. Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide S ymposium Rivier, J.E .; Marshall, G.R., Eds, ESCOM: Lieden, 1990; pp920-92 2). Therefore, it hinders its original intention. Similarly, in the present invention, a carbonyl-activated α-thiocarboxyl group (ie, The use of α-COSR is based on the conventional chemistry (Bl ake et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 4055-4058; Yamashiro et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1988, 31, 322-334; Hojo et al. Peptide C hemistry Okada, Y., Ed, Protein Research Foundation: Osaka, 1994; pp 9-1 It is a recollection of 2). However, these synthetic methods involve the use of Ag⁺Activating peptide-^α Conventional non-chemoselective attack by α-amine nucleophile of the second segment on COSR Based on the fire. Therefore, all other α- and ε in both segments Requires regiospecific (re) protection of the amine function. In contrast, thioester-mediated amide-forming conjugation chemistry is not naturally occurring, including thiols. No unprotected peptide segment with all issued side chain functional groups (Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887; Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). For this reason, natural chemical bonds Is simple and practical, if the protein contains a suitable binding site It becomes a general approach to total chemical synthesis of proteins. The present invention extends the number of dipeptide sequences that can be used as binding sites. And reported by Dawson et al. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). Increase the usefulness of certain natural chemical bonding methods. In the X-Cys binding site of the methodology In addition, as used herein, X-Gly and Gly-X binding sites (ie, N-terminal Glycine at the C-terminal residue when the residue is non-glycine, non-glycine at the C-terminal residue Glycine at the N-terminal residue) is disclosed. Good In a preferred embodiment, X is any non-β-branched amino acid. However, the book Our previous work has shown that X can be any amino acid containing a β-branched amino acid such as Val. Have been shown to be amino acids (Dawson et al. Science 1994, 266, 77). 6-779). The present invention potentially reduces the number of sites appropriate for only three natural chemical bonds to proteins. Extends to more than 50 of the 400 dipeptide sequences found in quality. Guri Considerable latitude in selecting binding sites in target sequences containing syn residues Therefore, this extended applicability allows most polypeptides to be Make it easier to use. Original form (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779) or this specification The natural chemical bonds in the form described in this document are of typical size for protein domains. zer et al. Science 1992, 256, 221-225; Rose et al. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-34; Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584-6588) Are used to join synthetic domains in a modular fashion and produce large (ie> 20) Kilodaltons) to produce fully functional synthetic proteins (Canne et a l. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc . 1995, 117, 1881-1887). Almost common form that incorporates all appropriate chemical reactions (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779) Is the next generation in the evolution of chemical synthesis of polypeptides and is renewable. To provide one practical total chemical synthesis of proteins.Combination examples 1-4 The results of the combined example are summarized in FIG. All linkages are 8 M urea, 0.1 M Na_TwoH PO_Four, PH 7.0 or 6 M guanidine.HCl, 0.1 M Na_TwoHPO_Four, PH In 7.5, the concentration range was 4 mg / ml to 8 mg / ml for each peptide. Pepti Immediately after (solvation) of the dosegment, 2-5% benzyl mercaptan (bonding example # 1) Add thiophenol (binding examples # 2 to 5) and a volume of binding buffer. All groups were kept in reduced form. This is the original peptide-^αThioester (1 ) Is a significant amount of peptide-^αThiobenzyl ester or peptide-^αThiophenyl Exchange for esters (both having the ability to react with peptide 2 in the desired manner) Had additional significance. Following the coupling reaction, analytical reverse-phase HPLC was performed. The product was identified by ESMS. In the examples described below, Amino acid residues are underlined.Example 1 peptide-^αThio (3-carboxy-4-nitro) phenyl ester 1 has the sequence L YRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO_TwoH-4-NO_Two) (SEQ ID NO: 1) (actual mass 760 Da, calculated value 7) 60 Da). 5-thio-2- (nitrobenzoic acid) disulfide hand Protected N^αThe (ethanethiol) peptide 2a has the sequence [(3-CO_TwoH-4-NO_Two)- C₆H_Three-S-SCH_TwoCH_Two]-GAGPAGD-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 2) (actual mass 800 Da, calculated value 800 Da) (this sequence is [HSCH_TwoCH_Two]-GAGPAGD-^αCONH_Two(Array number No. 2) (reduced to measured mass 603 Da, calculated 603 Da). One hour later, the coupled product 4a [LYRAGG(N^α-CH_TwoCH_TwoSH) AGPAGD-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 3 ) (Actual mass 1163 ± 1 Da, calculated 1163 Da)]. After purification of the coupled product by reverse phase HPLC, the 5,5'-dithio-bis (2-nitro (Benzoic acid) and 6 M urea, 0.1 M phosphate, pH 6.0 -S-nitrobenzoic acid disulfide product, LYRAGG[N^α-CH_TwoCH_TwoS-SC₆H_Three(3- CO_TwoH-4-NO_Two)] AGPAGD-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 3) (actual mass 1360 ± 1 Da, calculated 1360 Da). This confirms that 4a is formed by dislocation of 3a. I accepted. Because 3a is compatible with 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). This is because they are inactive. The results are summarized in FIG.Example 2 5A to 5C show a process of connection example # 2. Peptide-^αThioester seg Mention 1 (peak a) is the sequence LYRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO_TwoH, 4-NO_Two) (SEQ ID NO: 1) (It had an actual mass of 760 Da and a calculated value of 760 Da. N^α(Oxyethane Thiol) peptide 2b (peak b) has the sequence [HSCH_TwoCH_TwoO]-GRNTATIMMQRGNFR-^α CONH_Two(SEQ ID NO: 4) (measured mass: 1827 ± 1 Da, calculated value: 1828 Da) Had been. After 1 hour reaction at room temperature in the presence of added thiophenol, bond formation LYRAGG (N-OCH_TwoCH_TwoSH) RNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 5) (4b, actual measurement) 2388 ± 1 Da, calculated value 2389 Da), which is significant N^αCo-eluted with (oxyethanethiol) peptide 2b (peak e). After further reacting at room temperature overnight, the bound product was purified by HPLC and zinc powder The powder was added directly to the peptide collected in the HPLC eluent and stirred overnight at room temperature. Under these conditions, zinc effectively reduced the NO bond. This type of reduction This is possible with various reagents (Kecketal. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 7419-7922). The resulting peptide (peak f) was produced by reduction of the NO bond. LYRAGGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 5) (5b, observed mass 2313 ± 1 Da , Calculated 2313 Da). Thereby, as shown in FIG. In addition, dislocation from 3b to 4b was confirmed. The reason is that the N—O bond in the untransposed 3b Cleavage causes the formation of two distinct peptides of significantly lower mass .Example 3 6A to 6C show a process of connection example # 3. Peptide-^αThioesterse Fragment 1 (peak d) is a C-terminal phenylalanine thioester [LYRAF-^αCOS CH_TwoC₆H_Five(SEQ ID NO: 6) (actual mass 775 Da, calculated value 775 Da)] It was composed of peptides. Therefore, in the above case (combination examples # 1 and # 2) ( (Including C-terminal glycine thioesters). N^α(Oxy (Ethanethiol) peptide 2b (peak a)_TwoCH_TwoO]-GRNTATIMMQRGNFR-^α CONH_Two(SEQ ID NO: 7) (actual mass 1827 ± 1 Da, calculated value 1828 Da) Was composed. The presence of more sterically hindered thioesters Reduced response compared to no model. However, heating at 37 ° C It has been found that it promotes the binding rate. FIG. 6A shows binding after 11.5 hours at 37 ° C. The reaction is shown. The rate of rearrangement from 3b to 4b is determined by the untransposed product 3b, LYRAF- [^α COSCH_TwoCH_TwoO]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 8) (peak b, measured mass 2 478 ± 1 Da, calculated 2478 Da) slow enough to observe Adult 4b, LYRAFG(N^α-OCH_TwoCH_TwoSH) RNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 9) (P C, eluted slightly before observed mass 2478 ± 1 Da, calculated 2478 Da) . The unrearranged and rearranged products 3b and 4b having the same mass are converted to zinc reduction products. Identified by Intermediate 3b and peak b show the peptide arrangement at the time of zinc reduction, respectively. Column LYRAF-^αCOOH (thioester hydrolysis) andGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH_TwoCompatible with Two peptides with masses of 669 Da and 1753 Da were obtained. Next The crude reaction mixture with 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 4.0 (5 times the volume) to reduce the pH after initial binding to 4.5. It was measured that the dislocation velocity was accelerated. FIG. 6B shows the initial binding products 3b-4 that the rearrangement to b (peak c) was completed after 10 hours at pH 4.5 and 37 ° C. Is shown. HPLC purification of this peak, followed by zinc reduction, resulted in a pellet with the expected mass. Peptide (peak f) LYRAFGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(SEQ ID NO: 9) (5b, actual measurement) 2403 ± 1 Da, calculated 2404 Da).Example 4 LYRAG-^αCOSCH_TwoC₆H_Five1 (SEQ ID NO: 1) (actual mass 685 Da, calculated value 685 D a) to [HSCH_TwoCH_TwoO]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH2b (SEQ ID NO: 10) (actual mass 15 95 ± 1 Da, calculated 1596 Da) at pH 7.5. In this embodiment, It provided steric hindrance in the form of an Ala residue on the opposite side of the binding site of Binding Example # 3. Reaction speed The degree is the same as in Example 3, and is significantly slower than the non-failed cases (combined examples # 1 and # 2). The speed was accelerated by heating at 37 ° C. Undislocated (3b, LYRAG-^α[COSCH_Two CH_TwoO]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH) (SEQ ID NO: 11) and rearrangement (4b, LYRAGA(N^α-O CH_TwoCH_TwoSH) ARHTVHQRHLHG-^αCOOH) (SEQ ID NO: 12) binding product formed, The amount (both undislocation and dislocation) was 2156 ± 1 Da, and the calculated value was 2157 Da. However, unlike Conjugation Example # 3, as shown by the successful reduction to the amide Dislocation was almost complete after 2 days at 37 ° C regardless of pH, but the dislocation rate was The pH was not accelerated when the pH was reduced to 4.5 after the combination. Final coupled product 5b (LYRAGAARHTVHQRHLHG-^αCOOH (SEQ ID NO: 12), measured mass 2080 ± 1 Da, calculated value 2080 Da) due to the presence of a significant number of histidines Rather, it should be noted that binding of the peptide to zinc has occurred. N-O bond After reduction of the peptide, EDTA was added to the HPLC buffer / Zn mixture to convert the peptide to zinc. Must be released from The results are summarized in FIG.Example 5 Example 5 provides an example having a steric bulk on both sides of the binding site. Offer. LYRAF-^αCOSCH_TwoC₆H_Five1 (SEQ ID NO: 6) (actual mass 775 Da, calculated 7) 75Da) to [HSCH_TwoCH_TwoO]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH2b (SEQ ID NO: 13) (actual quality measurement) An amount of 1595 ± 1 Da, calculated 1596 Da) was bound at pH 7.5. Early (Ie, untransposed) bonded product 3b was observed, but LYRAF-^α[COSCH_TwoCH_TwoO]- A ARHTVHQRHLHG-^αCOOH (SEQ ID NO: 14) (actual mass 2246 ± 1 Da, calculated value 2) 247 Da), even at low pH, there was no evidence of rearrangement in time. Conclusion The presence of the side chains on both sides of the joint site apparently hindered Did not cause rearrangement via the six-membered ring intermediate. The results are summarized in FIG. The above example illustrates our original natural binding chemistry (Dawson et al. Science). (1994, 266, 776-779). This is a recent model binding study (Tametal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12485-12489) It was repeated independently in qualitatively identical form. We believe that this original sky Naturally, the peptide bond-formation reaction is carried out by several tandems with full biological activity. Used for chemical synthesis of protein. These include the chemokines IL-8 (Dawson et al. . Science 1994, 266, 776-779), the enzymes HIV-1 protease and burnase ( barnase), a serine protease inhibitor turkey ovomucoid third domain And eglin C and ab / HLH transcription factors. This binding reaction Is based on MaxBrenner (Brenner M. peptides, Proceedings of the Eighth Europeanp eptide Symposium Beyerman, H.C., Ed., North Holland: Amsterdam, 1976; pp1-7 ) And based on the principles published by Wieland (Wieland et al. Liebig). s Ann. Chem. 1953, 583, 129-149). You. Experimental protocol Outline Machine-assisted solid-phase peptide synthesis with custom-modified Performed in Applied Biosystems 430A peptide synthesizer (Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180-193). Reversed phase HPLC was performed on a Vydac C-18 calculation column (5 μm, 0.46 × 15 cm) and a liner using a semi-separation (10 μm, 1.0 × 25 cm) column. Performed on a Rainin HPLC system with UV detection at 214 nm. Chroma The chromatographic separation was performed using buffer B in buffer A (A = 0.1% TFA in water, B = 90% CH_ThreeThe linear gradient of CN / 10% water containing 0.09% TFA) was 30 Achieved using 1 ml / min (calculated) or 3 ml / min (for semi-separation) for ~ 60 min did. Mass spectra of all peptide segments were obtained from SciexAPI-III Obtained using a spray quadrupole mass spectrometer. The measured mass is About molecular species using MacSpec (Sciex) From experimental m / z values for all observed protonation states. Computational quality The amounts are based on the average isotope composition and are based on the program Mac Promass (MacP roMass) (Terry Lee and Sunil Vemur) i), Beckman Research Institute e), Dualte, CA). All other mass specs Spectrometry is a member of The Scripps Research Institute's Massus Performed at a spectrometry facility.¹1 H NMR spectra were obtained from Bruker ) Recorded on 250 MHz spectrophotometer, chemical shifts were Me_FourSi Sources reported in parts per million low field. Microanalysis is available at The Scripps Research Performed at the institute's X-ray crystallography facility, which is consistent with a calculated value of ± 0.4%. Was. Boc-L-amino acids and HBTU were obtained from Novabiochem (La Jora, California). 4-hydromethylphenylacetami Methyl (PAM) resin and diisopropylethylamine (DIEA) Applied Biosystems (Foster City, Calif) Moltenbenzhydrylamine (MBHA) was obtained from Peniche La Laboratories (Peninsula Laboratories, Inc) (San Carlos, California Lunia). Dimethylformamide (DMF) for synthesis is available from Baker er)_TwoCl_TwoAnd CH for HPLC_ThreeCN enters from Fisher I did it. Trifluoroacetic acid (TFA) is a halocarbon (New J -Gee). HF was purchased from Matheson Gas. 4 -Methylbenzyl mercaptan was obtained from Lancaster. So All other reagents for Ar or better are Aldrich Chemical Chemical) or from Fisher.Assembly of synthetic peptide segment chains Peptides were subjected to in situ neutralization / HBTU activation protocol for Boc chemistry. It was synthesized stepwise by the established solid phase method used (Schnolzer et al. Int. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180-193). The protection of the side chains is shown below. Was. Boc-Arg (p-toluenesulfonyl) -OH, Boc-Asn (xanthyl) -OH, Boc- Asp (O-cyclohexyl) -OH, Boc-His (dinitrophenyl) -OH, Boc-Thr Benzyl) -OH and Boc-Tyr (2-bromobenzyloxycarbonyl) -OH. Boc-Gln-O H and Boc-Met-OH were used without side chain protection. The coupling reaction is quantitatively Monitoring by the hydrin assay (Sarinetal, Anal. Biochem., 1981, 117). , 147-157), typically> 99%. After chain assembly is complete, the peptide is Deprotection and at the same time treatment with 5% p-cresol containing HF at 0 ° C. for 5 hours Cleavage from the resin, peptide-^αCOSH,-^αCONH_TwoOr-^αCO_TwoGot H. Under reduced pressure After removal of HF, the crude peptide was_TwoPrecipitated in O (diethyl ether) And dissolved in HPLC buffer (40-50% B) and lyophilized.Synthesis of peptide- ^α thioester (1) shown in FIG. Thioacid peptide is [4- [α- (N-t-Boc-aminoacyl-S) benzyl] phenoxy Acetic acid, DCHA salt (Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220), ( 2.0 equivalents) and aminomethyl-resin (1 equivalent, 10% DIEA in DMF (Al Wash) with HBTU (1.6 eq. Rich) and DIEA (1 equivalent, Aldrich), using DMF (dimethylphos). Loc) in the appropriate Boc-aminoacyl- Synthesized on S-resin. peptide-^αCOSC₆H_Three(3-CO_TwoH-4-NO_Two) The thioester is Crude peptide-^αCOSH (15-20mg) with 6M guanidine.HCl, 0.1M vinegar Sodium acid, produced by dissolution in pH 5.0-6.5, to which 1.5 An equivalent amount of 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) was added (Dawson et al. . Science 1994, 266, 776-779). Vortex the mixture briefly and grow 10 minutes later Done. peptide-^αCOSC₆H_Three(3-CO_TwoH-4-NO_Two) The identity of the ester is It was clearly confirmed by mass spectrometry, which was confirmed by Liu et al. (Tetrahedron Lett. . 1996, 37, 933-936). peptide-^αCOSCH_TwoC₆H_FiveThe thioester is Petit-^αCOSH (15-20 mg) was added to 6 M guanidine.HCl, 0.1 M sodium acetate. Dissolve in thorium, pH 4.0, and add 10 equivalents of benzyl bromide. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). The mixture Vortex briefly and purify after 1 hour. LYRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO_TwoH-4-NO_Two) ( The measured mass 760 Da, the calculated value 760 Da) was converted to semi-separated HPLC (20-60%). B for 40 minutes) to give a yield of 20-30%. LYRAG-^αCOSCH_TwoC₆H_Five( The measured mass 685 Da, the calculated value 685 Da) was analyzed by semi-separation HPLC (15-45% B For 60 minutes) to give a yield of 25-30%. LYRAF-^αCOSCH_TwoC₆H_Five(Actual survey 775 Da, calculated 775 Da) by semi-preparative HPLC (60 at 30-60% B). Min) to give a yield of 25-30%. Most of the yield loss is Was due to HPLC recovery.N ^α (ethanethiol) and N ^α (oxyethanethiol) peptides shown in FIG. Synthesis of (2) These peptides were purchased from MBHA (Sigma) or the appropriate Boc-aminoacid. Le-OCH_TwoSynthesized on any of -PAM-resin (Sigma). Complete the assembly of the chain, N^αThe Boc group was removed with pure TFA (two 1 minute treatments) and 10% DI in DMF After EA neutralization (2 treatments for 1 minute), the peptide was purified by the method of Robey (Robey et al. Anal. . Biochem. 1989, 177, 373-377). Bromoacetic acid ( 2.0 mmol) CH_TwoCl_Two(2 ml), and DIC (1 mmol, 2 mmol) -Dimethylaminoisopropyl chloride or hydrochloride, Aldrich or Sigma) was added. Activate for 10-15 minutes to form symmetrical anhydride, then mix The mixture was diluted with DMF (2 ml), added to the peptide-resin, and coupled for 30 minutes. I did. The resin is then washed with DMSO and 8a (2M in DMSO) or 8b ( 1M in DMSO) and add bromoacetylated peptide-resin for 8-23 hours Reacted. The peptide was purified without modification after removal from the resin. [(3-CO_TwoH- 4-NO_Two) -C₆H_Three-S-SCH_TwoCH_Two] -AGPAGD-^αCONH_Two(2a) (actual mass 800 Da, calculated Value 800 Da) was purified by semi-preparative HPLC (0-67% B for 60 min). To give ２４24%. [HSCH_TwoCH_TwoO]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH_Two(2b) (actual survey Amount 1827 ± 1 Da, calculated value 1828 Da) by HPLC for semi-separation (15-40% B for 60 minutes) to give a yield of ２５25%. [HSCH_TwoCH_TwoO]-AARHTVHQRH LHG-^αCOOH (2b) is replaced with racemic 2-bromopropionic acid in place of bromoacetic acid. The compound was synthesized by the above method using the compound. The resulting crude freeze-dried product is Peptide and bromopropionated peptide (CH_Two= CHCO-ARHTVHQRHLHG-^αCO OH, measured mass 1502 ± 1 Da, calculated by removing HBr from 1502 Da). This was a mixture of the resulting peptides. The mixture was purified by semi-preparative HPLC (10-40% B for 60 minutes), [HSCH_TwoCH_TwoO]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH (actual mass 1 595 ± 1 Da, calculated 1596 Da) in a yield of ％ 10%.S-[(3-carboxy-4-nitro) phenylthio] 2-aminoeta shown in FIG. Synthesis of thiol (8a) 2-aminoethanethiol (1.0 g, 13.0 mmol) and 5,5'-di Thio-bis (2-nitrobenzoic acid) (1.75 g, 4.4 mmol) was added to acetonitrile. Combine with Tril (100 ml) and water (25 ml) and stir at room temperature for 14 hours Was. Dilute the reaction mixture with water (450 ml) and add Waters Delta Prep (Waters Delta Prep) 4000 (Vydac 5.0 × 2.5cm separation C- 18a (1.0 g, 40 g). %). Synthesis of N- (2-bromoethoxy) phthalimide (11) shown in FIG. N- (2-bromoethoxy) phthalimide (11) was prepared using Bauer and Sureshl (Bauer e). t al. J. Org. Chem. 1963, 28, 1604-1608). N -Hydroxyphthalimide (16.0 g, 98 mmol, Aldrich), trie Tylamine (30 ml, 215 mmol) and 1,2-dibromoethane (35 m 1,406 mmol, Aldrich) in DMF (115 ml) Stirred overnight at warm. The solid was filtered and washed with DMF. Filtrate with water (800m 1), filter the resulting precipitate, dilute in EtOAc (200 ml) 1N HCl (2 × 50 ml), water (1 × 50 ml), saturated NaCl (1 × 50 ml) ) And washed with MgSO_FourAnd dried. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting solid Was recrystallized from 95% EtOH to give 11 as a white solid (16.6 g, 6 3%). N- [2- [S- (4-methylbenzyl)] mercapto] ethoxy] lid shown in FIG. Synthesis of Luimide (12) Bromide 11 (16.6, 62 mmol), 4-methylbenzylmercaptan (8 . 5 ml, 63 mmol) and DBU (9.5 ml, 64 mmol, 1,8-di) Azabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, Aldrich was converted to benzene (150 ml) and stirred at room temperature for 8 hours. Filter the solid and wash with benzene The filtrate was washed with 1N HCl (2 × 35 ml), water (1 × 35 ml), saturated NaCl ( 1 × 35 ml), and washed with MgSO_FourAnd dried. Volatiles are removed under reduced pressure, The resulting solid was recrystallized from EtOAc / hexane to give 12 as a white solid (14.8 g, 74%). S- (4-methylbenzyl) -2-aminooxyethanethiol (8b) shown in FIG. Synthesis of S- (4-methylbenzyl) -2-aminooxyethanethiol was converted to Osby (Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096). N- Substituted phthalimide 12 (7.4 g, 23 mmol) was added to isopropanol (203 ml) and water (35 ml)._Four(3.5 g, 92 mmol) was added. The mixture was stirred overnight at room temperature. Acetic acid (25 ml) foam Add slowly until standing stops, stopper the flask, and leave at 50 ° C. for 2-3 hours. Heated. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting solution was diluted with 1 N NaOH , Extracted with EtOAc (4 x 50 ml). Saturate the combined EtOAC extract Wash with NaCl (1 × 50 ml) and MgSO 4_FourAnd dried. Decompress volatiles And the resulting oil was flash chromatographed (1: 1 hexane: E tOAc) to give 8b as a clear and colorless (3.2 g, 72%) oil Obtained.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ミュアートムダブリューアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021 ニューヨークイーストシックスティサードストリート 500 アパートメント 15ビー (72)発明者ドーソンフィリップイーアメリカ合衆国カリフォルニア州 91030 サウスパサディナリンドンストリート 1302―＃11 (72)発明者バークスティーヴンジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 サンディエゴカミニトディア 7944―＃１ (72)発明者カンヌリンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94044 パシフィカクレスピドライヴ 1103────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Muir Tom W United States of America New York 10021 New York East Sixty Third Street 500 Apartment To 15 Be (72) Inventor Dawson Philip E United States California 91030 South Pasadena Lyndon Street 1302-# 11 (72) Inventor Burke Steven Jay United States California 92037 San Diego Caminito Di Oh 7944-# 1 (72) Inventor Cannes Lin United States California 94044 Pacifica Crespi Drive 1103

Claims

[Claims] 1. A method for producing an oligopeptide product by linking a first oligopeptide and a second oligopeptide end-to-end, wherein step A: the first and second oligopeptides comprise a catalytic thiol Mixing in a reaction solution, wherein the first oligopeptide includes a C-terminal residue having a C-terminal thioester and the second oligopeptide has an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety. If the N-terminal residue is not glycine, the C-terminal residue is glycine; if the C-terminal residue is not glycine, the N-terminal residue is glycine. Step B: N-terminal auxiliary functional group To produce an intermediate oligopeptide in which the first and second oligopeptides are linked by an aminothioester bond And C) transposing the aminothioester bond of the intermediate oligopeptide of step B to produce an oligopeptide product in which the first and second oligopeptides are linked by an N-linked auxiliary functional group. A method comprising: 2. The method of claim 1, wherein the catalytic thiol is selected from the group consisting of benzyl mercaptan and thiophenol. 3. N-terminal auxiliary functional group _{N-α- (CH 2) N} -SH ( wherein a 1 ≦ n ≦ 3) a method according to claim 2. 4. 3. The additional step of claim 2, comprising: step D: removing the N-terminal auxiliary functional group from the oligopeptide product of step C using a reducing agent to form a natural peptide bond. Method. 5. N-terminal auxiliary functional group _{N-α-O- (CH 2} ) N-SH ( wherein 1 is ≦ n ≦ 2) is a method of claim 4. 6. The method of claim 5, wherein the reducing agent is zinc. 7. A first oligopeptide segment comprising a C-terminal thioester, a second oligopeptide segment comprising an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety, and combining the C-terminal thioester with a non-oxidized sulfhydryl group of the auxiliary functional group An oligopeptide intermediate comprising an aminothioester linkage, wherein the aminothioester linkage unit spontaneously translocates to form an amide linkage that connects the first and second oligopeptide segments end-to-end. An intermediate, characterized in that: 8. A linking unit linking two peptide sequences, for example, an amino-terminal peptide sequence and a carboxyl-terminal sequence, comprising a first amino acid residue (aa ₁ ), a second amino acid residue (aa ₂ ) and a first amino acid residue (aa ₂ ). A first amino acid residue having a backbone carbonyl group, such as (aa ₁ -CO-); and a second amino acid residue having a backbone carbonyl group. amino groups, for example (-NR-aa ₂₎ (wherein, R is a _{α-O- (CH 2) n} -SH and _{α- (CH 2) n-SH} ( wherein, 1 ≦ n ≦ 2 Wherein the carbonyl group in the first amino acid residue binds the second amino acid residue to the first amino acid with a sulfhydryl group of an auxiliary part of the second amino acid. Between the first and second amino acid residues Decomposition binding, the following _{formula: (aa 1 -CO) -S- (} CH 2) N-X- (N-aa 2) ( wherein a 1 ≦ n ≦ 2, X is oxygen and methylene The first amino acid residue (aa ₁ ) of the dipeptide can be used to form a peptide bond having an amino-terminal peptide sequence, and the second amino acid residue (aa aa ₂ ) is a bonding unit which can be used for forming a peptide bond having a carboxyl-terminal peptide sequence, and thereby bonds the amino-terminal peptide sequence and the carboxyl-terminal peptide sequence with a decomposed bond.