JP4358307B2 - General chemical bond - Google Patents

Description

らにより開示されている

Schonolzerにより開示された方法論は、非保護ペプチドセグメントの化学選択的反応により、結合部位に非天然バックボーン構造を有する生成物を与えることに関するものである。この方法論は、標準的ペプチド合成法により得られるものよりもサイズの大きいペプチドの合成を可能にする（Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887; Williams et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10797-10798）。更にこの方法論は、異常な構造及びトポロジーを有するペプチドの合成を可能にする（Dawson et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7263-7266; Rose et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-34; Muir et al. Biochemistry 1994, 33, 7701-7708; Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007）。従来の段階的固相ペプチド合成と化学結合とを組み合わせた使用は、化学者が６０アミノ酸残基までの非保護ペプチドを良好な収率及び純度で日常的に製造することを可能にする

これら２つの方法論の組み合わせを使用して、タンパク質の全化学合成が達成されるかもしれない。
天然のバックボーン構造を有するタンパク質製造のための別の化学結合技術が報告されている（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。この様式の化学結合は「天然結合（native ligation）」と名づけられている。この技術においては、Ｃ末端α−チオエステルを有する非保護合成ペプチドを、化学選択的態様で、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含む非保護ペプチドと反応させる。チオール交換反応は初期のチオエステル結合中間体を与え、これは自発的に転位（rearrange）し、２つのペプチドセグメントが結合している結合部位において天然のアミド結合を与え、この過程においてＣｙｓ側鎖チオールを再生する。この天然結合の変形は、アミノ酸の反応についてWielandにより最初に記載された化学反応を使用する（Wieland et al. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149）。最初に記載されているように、ネイティブ結合は、Ｘ−Ｃｙｓ結合におけるペプチドセグメントの結合に制限される（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。
必要とされるのは、Ｃ末端α−チオエステルペプチドセグメントをＮ末端アミノ酸ペプチドセグメントに結合する一般的方法であって、Ｎ末端アミノ酸ペプチドセグメントがＮ末端システインを有することを必要としない方法である。
発明の要約
本発明は、非保護オリゴペプチドを化学的に結合し、全てのペプチド結合を有する生成物を形成する方法に向けられる。第一工程において、２つのオリゴペプチドを結合し、アミノチオエステル結合を有する結合生成物を形成する。第二工程において、アミノチオエステル結合を転位し、Ｎ置換アミド結合を有する生成物を形成する。任意の第三工程において、アミド結合上の置換基を、酸性媒体中Ｚｎを用いた容易な処理により取り除き、結合部位に天然のペプチド結合を与える。
本発明の方法は、２つの出発オリゴペプチド、すなわち第一の出発オリゴペプチド及び第二の出発オリゴペプチドを使用する。第一のオリゴペプチドはチオエステル部分を有するＣ末端補助基（auxiliary group）を有している。すなわち、[ペプチド₁]^αＣＯＳＲ（式中、Ｒは３−カルボキシ、４−ニトロフェニル及びベンジルからなる群より選ばれる。）である。第二のオリゴペプチドは非酸化スルフヒドリル部分を有する補助官能基（auxiliary functional group）を有する。すなわち、ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂（Ｏ）−Ｎ^α[ペプチド₂]である。第一及び第二の出発オリゴペプチドを、チオエステル交換を促進する条件下で混合したとき、両ペプチドは互いに縮合し中間体オリゴペプチド生成物を形成する。ここで、第一及び第二のオリゴペプチドはアミノチオエステル結合を介して結合している。アミノチオエステル結合は分子内で自発的に転位し、Ｎ置換アミド結合により結合している結合生成物を形成する。分子内転位の間、Ｎ末端補助官能基のアミノ基はチオエステルを攻撃し、置換スルフヒドリル部分を含む結合したＮ結合補助官能基を有するアミド基を形成する。置換スルフヒドリル部分を含むＮ結合補助官能基を、化学的手段により適宜取り除き、全ての天然ペプチド結合を有する生成物を形成してもよい。
本発明の１つの態様は、オリゴペプチド生成物を製造するために第一のオリゴペプチドと第二のオリゴペプチドとを末端と末端で結合する方法に向けられる。より詳細には、本発明の方法は２つの工程及び任意の第三工程を含んでいる。
第一工程は、第一及び第二のオリゴペプチドがδ又はγアミノチオエステル結合で結合している中間体オリゴペプチドを製造するために、第一のペプチドのＣ末端チオエステルと第二のオリゴペプチドの非酸化スルフヒドリル部分とを縮合させることを含んでいる。第一のオリゴペプチドはＣ末端残基上にＣ末端チオエステルを含み、第二のオリゴペプチドは非酸化スルフヒドリル部分を有するＮ末端残基上にＮ末端補助官能基を含んでいる。第一のオリゴペプチドのＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチドのＮ末端残基はグリシンである。第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。但し、非グリシン残基は、非β分岐アミノ酸である。
第二工程により、中間体オリゴペプチドのδ又はγ−アミノチオエステル結合が、δ又はγ−アミノ基のチオエステル部分への分子内攻撃により、転位し、チオエステル部分由来の副生物としてスルフヒドリル部分を置換する。これにより、第一及び第二のオリゴペプチドがアミド結合で結合しているオリゴペプチド生成物を製造する。アミド結合の窒素は、置換スルフヒドリル部分を有する補助官能基を含んでいる。
任意の第三工程は、天然ペプチド結合を生成するための、還元剤を用いた、アミド窒素上の補助官能基のオリゴペプチド生成物からの除去を含んでいる。アミド窒素補助官能基は、Ｎ−α−Ｏ−（ＣＨ₂）_n−ＳＨ（式中、１≦ｎ≦２である。）である。還元剤は亜鉛（下線の窒素は結合アミド窒素を表す。）である。
本発明の別の態様には、Ｃ末端チオエステルを含む第一のオリゴペプチドセグメント、非酸化スルフヒドリル部分を有するＮ末端補助官能基を含む第二のオリゴペプチドセグメント、並びに、Ｃ末端チオエステル及び補助官能基のスルフヒドリル基を結合するアミノチオエステル結合単位を含むオリゴペプチド中間体が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、非保護ペプチドセグメント（式中、Ｒはβ分岐アミノ酸残基である。ただし、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基はグリシンであり、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。）の一般化天然化学結合を示している。Ｒ’は、３−カルボキシ、４−ニトロフェニル及びベンジルからなる群より選ばれる。
図２は、Ｎ^α（置換）ペプチドセグメント２ａ及び２ｂの化学合成を示す。
図３は、化合物８ｂの化学合成を示す。
図４は、実施例＃１〜５についてのモデル結合の要約に関する表を示す。上付き文字は以下に示す通りである。（ａ）チオエステルペプチド（式中、−ＳＮＢ＝３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、−Ｓｂｚｌ＝ベンジルチオエステルである）。（ｂ）Ｎ^α（置換）ペプチド（式中、ｅｔｓｈ＝Ｎ^α（エタンチオール）、ｏｅｔｓｈ＝Ｎ^α（オキシエタンチオール）である）。（ｃ）ペプチド２を基礎とする。分析用逆相ＨＰＬＣ（ピーク領域）及びＥＳＭＳより推定。（ｄ）ｐＨ７．５で示された時間経過後、ｐＨ４．５に調節。
図５Ａ〜５Ｃは、モデル結合を示している。実施例＃２（後述）。アミド−Ｇｌｙ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）Ｇｌｙ−化合物４ｂを、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５で形成。（Ａ）〜（Ｃ）は以下の通り、ＨＰＬＣプロットを示す。（Ａ）ｔ＝０における分析用ＨＰＬＣ（１０〜５０％Ｂで３０分間）、ピークａ、チオエステルペプチド、１、ＬＹＲＡＧ−^αＣＯＳＣ₆Ｈ₃（３−ＣＯ₂Ｈ−４−ＮＯ₂）。ピークｂ、Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド、２ｂ、[ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ]−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂。（Ｂ）ｔ＝１時間における分析用ＨＰＬＣ（１０〜５０％Ｂで３０分間）、ピークｃ、非ペプチド不純物、ピークｄ、ＬＹＲＡＧ−^αＣＯＳＣ₆Ｈ₅、チオフェノールを用いて１のトランスチオエステル化による。ピークｅ、中間体結合生成物、４ｂ、ＬＹＲＡＧＧ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）ＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂及び少量の未反応[ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ]−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂（２ｂ）、エレクトロスプレーイオン化ＭＳにより測定。（Ｃ）ＨＰＬＣ−精製及び酸性ＨＰＬＣ溶媒中でのＺｎを用いた一晩の処理後のピークｅの分析用ＨＰＬＣ（１５〜４０％Ｂで３０分間）、ピークｆ、最終結合生成物、５ｂ、ＬＹＲＡＧＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＨＮＨ₂、ピークｇ、非ペプチド不純物。
図６Ａ〜６Ｃは、モデル結合を示している。実施例＃３（後述）。−Ｐｈｅ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）Ｇｌｙ−結合生成物４ｂ。結合及び転位は３７℃で行った。（Ａ）〜（Ｃ）は以下の通り、ＨＰＬＣプロットを示す。（Ａ）６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５中で１１．５時間後における分析用ＨＰＬＣ（２０〜４０％Ｂで３０分間）、ピークａ、Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド、２ｂ、[ＨＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ]−ＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂、ピークｂ、非転位中間体結合生成物、４ｂ、ＬＹＲＡＦＧ（Ｎ^α−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＳＨ）ＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂、ピークｄ、チオエステルペプチド、１、ＬＹＲＡＦ−^αＣＯＳＣＨ₂Ｃ⁶Ｈ₅。（Ｂ）６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣＨ₃ＣＯ₂、ｐＨ４．５中で１１．５時間後における分析用ＨＰＬＣ（０〜６７％Ｂで３０分間）。（Ｃ）酸性ＨＰＬＣ溶媒中でのＺｎを用いた一晩の処理後のＨＰＬＣ精製ピークｃの分析用ＨＰＬＣ（２０〜４０％Ｂで３０分間）、ピークｆ、最終結合生成物、５ｂ、ＬＹＲＡＦＧＲＮＴＡＴＩＭＭＱＲＧＮＦＲ−^αＣＯＮＨ₂。
発明の詳細な説明
本発明は、２つの別のペプチド断片を化学的に結合するための２工程からなる方法に向けられる。より詳細には、本発明は、非保護ペプチドセグメントを天然（アミド形成）化学結合し、天然ペプチド結合を精製するための一般的方法論に関する
第一工程は、第一のペプチドのＣ末端チオエステルと、第二のオリゴペプチドの非酸化スルフヒドリル部分とを縮合し、第一のオリゴペプチドと第二のオリゴペプチドがδ−又はγ−アミノチオエステル結合で結合している中間体オリゴペプチドを生成することを含んでいる。第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基が非グリシンである場合、第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基はグリシンである。第二のオリゴペプチド上のＮ末端残基が非グリシンである場合、第一のオリゴペプチド上のＣ末端残基はグリシンである。ただし、非グリシン残基は非β分岐アミノ酸である。
第二工程は、δ又はγ―アミノ基のチオエステル部分への分子内攻撃による中間体オリゴペプチドのδ又はγ−アミノチオエステル結合の転位、これによる、チオエステル部分に由来する副生物としてのスルフヒドリル部分の置換、及び、第一のオリゴペプチド及び第ニのオリゴペプチドが天然アミド結合で結合しているオリゴペプチド生成物の生成を含んでいる。しかしながら、アミド結合上の窒素は置換スルフヒドリル部分を有する補助官能基を含んでいる。
任意の第三工程は、還元剤を用いてアミド窒素上の補助官能基を、オリゴペプチド生成物から除去し、天然ペプチド結合を生成することを含んでいる。アミド窒素補助官能基は、Ｎ−α−Ｏ−（ＣＨ₂）Ｎ−ＳＨ（式中、１≦ｎ≦２である）であり、還元剤は亜鉛である（下線を引いた窒素は結合したアミド窒素を表す）。）である。
本発明の方法は、天然又は修飾されたバックボーン構造のいずれかを有するペプチド及びタンパク質の合成を許容する。図１は手順を要約している。ペプチドα−カルボキシチオエステル（１）を、チオール交換を経て、Ｎ^α（エタンチオール）ペプチド（２ａ）又はＮ_α（オキシエタンチオール）ペプチド（２ｂ）のいずれかと反応させ、結合生成物３を生成する。このチオエステル結合中間体は、５又は６員環を含む有利な幾何転位を経て転位し、４ａにおいては二級アミドを含むアミド結合生成物４又は４ｂにおいては類似体Ｎ−オキシアルキル化合物を含むアミド結合生成物４を与える。得られたＮ−^α（置換）アミドも有利な溶解特性を潜在的に有している（Quibell et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 11656-11668）。得られたＮ−^α（Ｏ−アルキル）アミド結合生成物は、更に、ＨＦ切断条件に対し安定であるという利点を有し、穏やかな条件下で簡単に除去される。４ｂの場合、亜鉛粉末を酸性溶離剤中の逆相ＨＰＬＣ精製ペプチドへ直接添加し、Ｏ−アルコキシヒドロキサメートのＮ−Ｏ結合を還元し、結合生成物５ｂの天然バックボーン構造を得ることができる。
すべてのペプチドセグメントは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学についての原位置中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）活性化プロトコルを使用した確立された固相法により、段階的に合成し、分離用逆相ＨＰＬＣにより精製し、エレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ＥＳＭＳ）により特徴付けた

ペプチド−α−チオエステル（１）は、対応のペプチド−α−チオ酸より生成し、次に、Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220に記載されているようにしてチオエステル樹脂上で合成した。ペプチド−α−チオ酸を、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０〜６．５中、１．５当量の５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）との反応により対応の３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルに転換するか、又は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中、１０当量の臭化ベンジルを使用して対応のベンジルエステルに転換した（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。両方のチオエステルは、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルを有する結合反応用の十分な脱離基を提供する。これは、対応のベンジルチオエステルよりもやや速い反応速度を示す（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。
Ｎ^α（エタンチオール）（２ａ）及びＮ^α（オキシエタンチオール）（２ｂ）の合成を図２に示す。適切なα−ブロモカルボン酸（対称性無水物として活性化（ジクロロメタン中の０．５当量の１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）））（Robey et al. Anal. Biochem. 1989, 177, 373-377）を、ペプチド−樹脂６の脱保護Ｎ−末端アミノ酸と結合し、ブロモアシル−ペプチド−樹脂７を得た。臭化物を、ＤＭＳＯ中の８ａ又は８ｂのアミン基により、立体化学転換的に置換し、ペプチド−樹脂９を得た。無水ＨＦ中における脱保護及び樹脂からの切断により、２ｂを直接得るか、又は、２ａをジスルフィド形態で得、これを遊離のチオールへ還元する。
アミノエタンチオール誘導体８ａは、水中の８０％アセトニトリル中、２−アミノエタンチオール及び５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）の反応より、１工程で合成した。アミノオキシエタンチオール誘導体８ｂの合成も含まれ、これを図３に示す。臭化物１１を、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１０）と大過剰量の１，２−ジブロモエタンとの反応より生成した（Bauer J. Org. Chem. 1963, 28, 1604-1608）。臭化物１１を、塩基１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で４−メチルベンジルメルカプタンを用いて保護アミノオキシエタンチオール誘導体１２に転換した。１２のフタルイミド基を２工程方法で除去した（Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096）。この方法にはＮａＢＨ₄を用いた還元、続く酢酸を用いた処理による所望のアミノオキシエタンチオール誘導体８ｂを得る工程が含まれる。
Ｘ−Ｃｙｓ部位におけるオリジナルの天然化学結合と比較して（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）、本発明の結合化学のもっとも注目すべき特徴は、最初のチオエステル結合生成物の遅い転位である。この例における６員環中間体を経たα−ＮＨ（Ｏ−アルキル）基による分子内攻撃は、Ｘ−Ｃｙｓ結合における非置換α−ＮＨ₂の容易な５員環媒介攻撃（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）よりもかなり好まれにくい（Mandolini et al. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 550-554）。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を除いて、ゆっくりと転位させたのみである本発明のチオエステル−結合初期結合生成物を単離することができる（図４）。注目すべきことに、両方の結合部位上のＣ^α置換アミノ酸について、アミド結合への転位は見ることができない。すなわち、チオエステル結合中間体は、反応条件下では無制限に安定であった。これらの遅い転位は、既報の（Ｎ置換）アミド形成結合化学において見られたものと類似している（Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584-6588）。
本発明における、アミド形成性結合における一時的補助官能基の使用は、Kempにより提案された「チオールキャプチャー」戦略（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）の回想である。天然化学結合及びチオールキャプチャー法は、定められたゴールとして、長鎖ポリペプチド鎖の合成を達成するための、セグメント縮合戦略における非保護ペプチドの使用を有している。天然化学結合アプローチの鍵は、初期チオエステル結合中間体生成物のチオール部分交換を促進する条件下での、両セグメントにその他のＣｙｓ残基の存在していてもＮ末端Ｃｙｓにおける位置選択的結合を与える反応である（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。対照的に、「チオールキャプチャー」戦略及び関連する方法（Liu et al. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 933-936）においては、結合反応前のＣｙｓ側鎖官能基の位置特異的保護が必要である（Kemp et al. Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium Rivier, J.E.; Marshall, G.R., Eds, ESCOM: Lieden, 1990; pp 920-922）。したがって、これの元の意図を妨げる。
同様に、本発明における、カルボニル活性化α−チオカルボキシル基（すなわちα−ＣＯＳＲ）の使用は、ペプチドセグメント縮合に使用する従来の化学（Blake et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 4055-4058; Yamashiro et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1988, 31, 322-334; Hojo et al. Peptide Chemistry Okada, Y., Ed, Protein Research Foundation: Osaka, 1994; pp 9-12）の回想である。しかしながら、これらの合成法は、Ａｇ⁺活性化ペプチド−^αＣＯＳＲ上の第二のセグメントのαアミン求核原子による慣習的非化学選択的攻撃に基づいている。したがって、両セグメントにおけるすべての他のα−及びε−アミン官能基の位置特異的（再）保護を必要とする。
対照的に、チオエステル媒介アミド形成結合化学は、チオールを含む天然に見出されるすべての側鎖官能基を有するまったく保護されていないペプチドセグメントの使用と適合する（Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887; Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。この理由により、天然化学結合は、簡単、実用的であり、タンパク質が適当な結合部位を含んでいるならばそのタンパク質の全化学合成に対する一般的アプローチになる。
本発明は、結合部位として使用可能なジペプチド配列の数を拡張することにより、Dawsonら（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）により報告されている天然化学結合法の有用性を増大させる。その方法論のＸ−Ｃｙｓ結合部位に加えて、本明細書には、Ｘ−Ｇｌｙ及びＧｌｙ−Ｘ結合部位（すなわち、Ｎ末端残基が非グリシンである場合のＣ末端残基のグリシン、Ｃ末端残基が非グリシンである場合のＮ末端残基のグリシン）をどのように使用するか開示している。好ましい態様において、Ｘはすべての非β分岐アミノ酸である。しかしながら、本発明者らの過去の研究は、Ｘは、β分岐アミノ酸例えばＶａｌを含むすべてのアミノ酸であることができることを示した（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。
本発明は、潜在的に、３つだけの天然化学結合に適切な部位の数を、タンパク質に見出される４００のジペプチド配列のなかの５０より多くへ拡張する。グリシン残基を含む標的配列における結合部位の選択においてかなりの許容度があるので、この拡張された適用性は、ほとんどのポリペプチドを天然化学結合により利用しやすくする。
オリジナルの形態（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）又は本明細書に記載される形態の天然化学結合は、典型的な大きさのタンパク質ドメインのポリペプチド側鎖への直接合成アクセスを提供する。その他の結合化学

を使用して、モジュール様式で合成ドメインを結合し、大きな（すなわち＞２０キロダルトン）、完全機能性合成タンパク質を製造することができる（Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887）。すべての適切な化学反応を組み込むほぼ一般的な形態（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）において、化学結合アプローチは、ポリペプチドの化学合成法の進化において次世代に相当し、再生可能、かつ実用的なタンパク質の全化学合成を提供する。
結合例１〜４
結合例の結果を図４に要約する。全ての結合は、８Ｍ尿素、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０又は６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．５中、各ペプチド４ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で行った。ペプチドセグメントの（solvation）直後、２〜５％ベンジルメルカプタン（結合例＃１）又はチオフェノール（結合例＃２〜５），容量の結合用緩衝液を添加し、チオール基を還元形態に維持した。これは、もとのペプチド−^αチオエステル（１）の有意量をペプチド−^αチオベンジルエステル又はペプチド−^αチオフェニルエステル（共に、所望の態様でペプチド２と反応する能力を有している）へ交換する追加の重要性を有していた。結合反応に続いて、分析用逆相ＨＰＬＣを行い、生成物をＥＳＭＳにより同定した。以下に示す実施例において、結合に関連するアミノ酸残基に下線を引いた。
実施例１
ペプチド-^αチオ（３−カルボキシ−４−ニトロ）フェニルエステル１は、配列LYRAG-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）（配列番号１）（実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ）を有していた。５−チオ-２−（ニトロ安息香酸）ジスルフィドとして保護されているＮ^α（エタンチオール）ペプチド２ａは、配列[（3-CO₂H-4-NO₂）-C₆H₃-S-SCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂（配列番号２）（実測質量８００Ｄａ、計算値８００Ｄａ）（この配列は結合混合物中で[HSCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂（配列番号２）（実測質量６０３Ｄａ、計算値６０３Ｄａ）に還元される）を有していた。１時間後、結合生成物４ａ[LYRAGG（N^α-CH₂CH₂SH）AGPAGD-^αCONH₂（配列番号３）（実測質量１１６３±１Ｄａ、計算値１１６３Ｄａ）]が有意な程度生成した。逆相ＨＰＬＣによる結合生成物の精製後、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）と６Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ６．０中で１時間処理し予想される−Ｓ−ニトロ安息香酸ジスルフィド生成物、LYRAGG[N^α-CH₂CH₂S-SC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）]AGPAGD-^αCONH₂（配列番号３）（実測質量１３６０±１Ｄａ、計算値１３６０Ｄａ）を得た。これにより３ａの転位により４ａが形成することを確認した。なぜなら、３ａは５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）に対して不活性であるからである。結果を図４に要約する。
実施例２
図５Ａ〜５Ｃは結合例＃２の過程を示している。ペプチド−^αチオエステルセグメント１（ピークａ）は、配列LYRAG-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H,4-NO₂）（配列番号１）（実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ）を有していた。Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークb）は、配列[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号４）（実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値1828Ｄａ）から構成されていた。添加したチオフェノールの存在下、室温で１時間の反応後、結合生成物LYRAGG（N-OCH₂CH₂SH）RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号５）（４ｂ、実測質量２３８８±１Ｄａ、計算値２３８９Ｄａ）が有意な程度生成し、これは未反応のＮ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークｅ）と共に共溶出した。更に一晩、室温下で反応させた後、結合生成物をＨＰＬＣにより精製し、亜鉛粉末をＨＰＬＣ溶離剤中に集めたペプチドへ直接添加し、室温下で一晩攪拌した。これらの条件下、亜鉛はＮ−Ｏ結合を効率的に還元した。このタイプの還元は、種種の試薬により可能である（Kecketal.TetrahedronLett.1995,36,7419-7922）。得られたペプチド（ピークｆ）はＮ−Ｏ結合の還元により生成したLYRAGGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号５）（５ｂ、実測質量２３１３±１Ｄａ、計算値２３１３Ｄａ）と一致した質量を与えた。これにより、図１に示すように３ｂから４ｂへの転位を確認した。なぜなら、未転位３ｂにおけるＮ−Ｏ結合の切断は有意に低い質量の２つの異なるペプチドの形成を引き起こすからである。
実施例３
図６Ａ〜６Ｃは結合例＃３の過程を示している。ベプチド−^αチオエステルセグメント１（ピークｄ）は、Ｃ末端フェニルアラニンチオエステル[LYRAF-^αCOSCH₂C₆H₅（配列番号６）（実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ）]を有するペプチドから構成されていた。したがって、前記の場合（結合例＃１及び＃２）（Ｃ末端グリシンチオエステルを含む）よりも立体障害を提供する。Ｎ^α（オキシエタンチオール）ペプチド２ｂ（ピークａ）は、[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号７）（実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値１８２８Ｄａ）から構成されていた。より立体障害を受けたチオエステルの存在は、障害を受けていないモデルと比較して反応を低下させた。しかしながら、３７℃での加熱は初期結合速度を促進することを見出した。図６Ａは、３７℃で１１．５時間後の結合反応を示している。３ｂから４ｂへの転位速度は、未転位生成物３ｂ、LYRAF-[^αCOSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号８）（ピークｂ、実測質量２４７８±１Ｄａ、計算値２４７８Ｄａ）を観察するのに十分なほど遅く、転位生成物４ｂ、LYRAFG（N^α-OCH₂CH₂SH）RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号９）（ピークｃ、実測質量２４７８±１Ｄａ、計算値２４７８Ｄａ）のわずか前に溶離した。同一の質量を有する、未転位及び転位生成物３ｂ及び４ｂを、亜鉛還元生成物により同定した。中間体３ｂ、ピークｂは、亜鉛還元時に、それぞれペプチド配列LYRAF-^αCOOH（チオエステル加水分解）及びGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂に対応する６６９Ｄａ及び１７５３Ｄａの質量を有する２つのペプチドを与えた。次いで粗反応混合物を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ4.0で（容量の５倍まで）希釈して初期結合後のｐＨを４．５に低下させることにより、転位速度が加速したことを測定した。図６Ｂは、初期結合生成物３ｂから４ｂ（ピークｃ）への転位が、ｐＨ４．５、３７℃で１０時間後に完了したことを示している。このピークのＨＰＬＣ精製及び続く亜鉛還元により、予想される質量を有するペプチド（ピークｆ）LYRAFGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（配列番号９）（５ｂ、実測質量２４０３±１Ｄａ、計算値２４０４Ｄａ）を得た。
実施例４
LYRAG-^αCOSCH₂C₆H₅１（配列番号１）（実測質量６８５Ｄａ、計算値６８５Ｄａ）を、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH２ｂ（配列番号１０）（実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ）へ、ｐＨ７．５で結合した。本実施例は、結合例＃３の結合部位とは反対側のAla残基形態の立体障害を提供した。反応速度は実施例３と同様であり、未障害例（結合例＃１及び＃２）よりも有意に遅い速度であるが、３７℃での加熱により加速した。未転位（３ｂ、LYRAG-^α[COSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH）（配列番号１１）及び転位（４ｂ、LYRAGA（N^α-OCH₂CH₂SH）ARHTVHQRHLHG-^αCOOH）（配列番号１２）結合生成物が形成し、実測質量（未転位及び転位ともに）２１５６±１Ｄａ、計算値２１５７Ｄａであった。しかしながら、結合例＃３と異なり、アミドへの成功した還元に示されるようにｐＨにかかわらず３７℃で２日後に転位はほぼ完了したが、転位速度は、初期結合後にｐＨを４．５に低下させても加速しなかった。
最終結合生成物５ｂ（LYRAGAARHTVHQRHLHG-^αCOOH（配列番号１２）、実測質量２０８０±１Ｄａ、計算値２０８０Ｄａ）における有意数のヒスチジンの存在により、ペプチドの亜鉛への結合が起こったことに注目すべきである。Ｎ−Ｏ結合の還元後、ＥＤＴＡをＨＰＬＣ緩衝液／Ｚｎ混合物に添加して、ペプチドを亜鉛から遊離させる必要がある。この結果を図４に要約する。
実施例５
実施例５は、結合部位の両側に立体的バルク（steric bulk）を有する例を提供する。LYRAF-^αCOSCH₂C₆H₅１（配列番号６）（実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ）を、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH２ｂ（配列番号１３）（実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ）にｐＨ７．５で結合した。初期（すなわち未転位）結合生成物３ｂが観察されたが、LYRAF-^α[COSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH（配列番号１４）（実測質量２２４６±１Ｄａ、計算値２２４７Ｄａ）、低ｐＨ下であっても、時間内に転位の証拠は存在しなかった。結合部位の両側の側鎖の存在は、明らかに立体障害を与えたため、使用した条件下では６員環中間体を経た転位は起こらなかった。結果を図４に要約する。
前記の例は、本発明者らのオリジナルの天然結合化学（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）の驚くべき能力を強調する。これは、最近モデル結合研究（Tametal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12485-12489）において本質的に同一の形態で独立して繰り返された。本発明者らは、このオリジナルの天然ペプチド結合-形成結合反応を、完全な生物学的活性を有するいくつかのタンパク質の化学合成に使用した。これらには、ケモカインＩＬ−８（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）、酵素ＨＩＶ−１プロテアーゼ及びバーナーゼ（barnase）、セリンプロテアーゼ阻害剤シチメンチョウオボムコイド第三ドメイン及びエグリン（eglin）Ｃ及びａｂ／ＨＬＨ転写因子が含まれる。この結合反応は、MaxBrenner（Brenner M. peptides, Proceedings of the Eighth European peptide Symposium Beyerman, H.C., Ed., NorthHolland: Amsterdam,1976; pp1-7）により公表された原理に基づくものであり、Wieland（Wieland et al. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149）により最初に記載された化学を使用している。
実験プロトコル
概略
機械補助固相ペプチド合成を、カスタム修正（custom-modified）したアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）４３０Ａペプチド合成機中で行った（Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180-193）。逆相ＨＰＬＣを、バイダック（Vydac）Ｃ−１８計算用カラム（５μｍ、０．４６×１５ｃｍ）及び準分離用（10μｍ、１．０×２５ｃｍ）カラムを使用したライニン（Rainin）ＨＰＬＣシステムで２１４ｎｍのＵＶ検出を用いて行った。クロマトグラフィー分離は、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ（Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝９０％CH₃CN／０．０９％ＴＦＡ含有１０％水）の直線勾配を３０〜６０分間、1ｍｌ／分（計算値）又は３ｍｌ／分（準分離用）で使用して達成した。全てのペプチドセグメントのマススペクトルは、SciexAPI-IIIエレクトロスプレー四極マススペクトロメーターを用いて得た。実測質量は、プログラムマックスペック（MacSpec）（サイエックス（Sciex））を使用しての、分子種についての全ての観察されたプロトン化状態についての実験ｍ／ｚ値に由来した。計算質量は、平均アイソトープ組成物に基づき、かつプログラムマックプロマス（MacProMass）（テリー・リー・アンド・サニル・ベムリ）（Terry Lee and Sunil Vemuri）、ベックマン・リサーチ・インスティテュート（Beckman Research Institute）、デュアルテ、カリフォルニア）の使用に由来した。その他すべてのマススペクトロメトリーは、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュートのマススペクトロメトリー施設で行った。¹ＨＮＭＲスペクトルは、ブルッカー（Bruker）２５０ＭＨｚスペクトロフォトメーターに記録し、化学シフトは、Ｍｅ₄Ｓｉ由来の低磁場百万分率で報告した。微量分析は、ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュートのＸ腺結晶学施設で行い、これは計算値±０．４％で一致した。Ｂｏｃ−Ｌ−アミノ酸及びＨＢＴＵは、ノババイオケム（Novabiochem）（ラジョラ、カリフォルニア）より購入した。４−ヒドロメチルフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティ、カリフォルニア）より入手し、メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）はペニーシュラ・ラボラトリーズ（Peninsula Laboratories, Inc）（サンカルロス、カリフォルニア）より入手した。合成用ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はベーカー（Baker）より入手し、AR用CH₂Cl₂及びＨＰＬＣ用CH₃CNはフィッシャー（Fisher）より入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はハロカーボン（Halocarbon）（ニュージャージー）より入手した。ＨＦはマセソンガス（Matheson Gas）より購入した。４−メチルベンジルメルカプタンはランカスター（Lancaster）より入手した。その他全ての試薬はＡｒ用又はそれより良く、アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）又はフィッシャーより入手した。
ペプチドセグメント合成鎖の組立て
ペプチドを、Ｂｏｃ化学についての原位置中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用した確立された固相法により段階的に合成した（Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180-193）。側鎖の保護は以下に示すとおりであった。Boc-Arg（p-トルエンスルホニル）-OH、Boc-Asn（キサンチル）-OH、Boc-Asp（O-シクロヘキシル）-OH、Boc-His（ジニトロフェニル）-OH、Boc-Thr（ベンジル）-OH及びBoc-Tyr（2-ブロモベンジルオキシカルボニル）-OH。Boc-Gln-OH及びBoc-Met-OHは側鎖の保護なしに使用した。カップリング反応を、定量的ニンヒドリンアッセイによりモニターし（Sarinetal, Anal. Biochem., 1981, 117, 147-157）、典型的には＞９９％であった。鎖の組立が完了した後、ペプチドを脱保護し、同時に、ＨＦ含有５％ｐ−クレゾールを用いた０℃で５時間の処理により樹脂から切断し、ペプチド-^αCOSH、-^αCONH₂又は-^αCO₂Hを得た。減圧下でＨＦを除去した後、粗ペプチドを無水Ｅｔ₂Ｏ（ジエチルエーテル）中に沈殿させ、ＨＰＬＣ緩衝液（４０〜５０％Ｂ）中に溶解し、凍結乾燥した。
図１に示すペプチド- ^α チオエステル（1）の合成
チオ酸ペプチドは、[4-[α-（N-t-Boc-アミノアシル-S）ベンジル]フェノキシ]酢酸、DCHA塩（Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220）, （２．０当量）及びアミノメチル−樹脂（１当量、ＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡ（アルドリッチ）で洗浄）を、活性化剤として添加したＨＢＴＵ（１．６当量、アルドリッチ）及びＤＩＥＡ（１当量、アルドリッチ）を用いて、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中でカップリングすることにより、適切なＢｏｃ−アミノアシル−Ｓ−樹脂上で合成した。ペプチド-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）チオエステルは、粗ペプチド-^αCOSH（１５〜２０ｍｇ）を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０〜６．５に溶解することにより生成し、これに１．５当量の５，５’−ジチオ-ビス（２−ニトロ安息香酸）を添加した（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。混合物を簡単にボルテックスし、１０分後生成した。ペプチド-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）エステルの同一性は、正確なエレクトロスプレー質量測定により明確に確認し、これはLiuら（Tetrahedron Lett. 1996, 37, 933-936）と一致した。ペプチド-^αCOSCH₂C₆H₅チオエステルは、粗ペプチド-^αCOSH（１５〜２０ｍｇ）を６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に溶解し、これに１０当量の臭化ベンジルを添加することにより生成した（Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779）。混合物を簡単にボルテックスし、１時間後精製した。LYRAG-^αCOSC₆H₃（3-CO₂H-4-NO₂）（実測質量７６０Ｄａ、計算値７６０Ｄａ）を、準分離用ＨＰＬＣ（２０〜６０％Ｂで４０分間）により精製し、２０〜３０％の収率を得た。LYRAG-^αCOSCH₂C₆H₅（実測質量６８５Ｄａ、計算値６８５Ｄａ）を準分離用ＨＰＬＣ（１５〜４５％Ｂで６０分間）精製し、２５〜３０％の収率を得た。LYRAF-^αCOSCH₂C₆H₅（実測質量７７５Ｄａ、計算値７７５Ｄａ）を準分離用ＨＰＬＣ（３０〜６０％Ｂで６０分間）により精製し、２５〜３０％の収率を得た。収率の損失のほとんどは、単にＨＰＬＣ回収によるものであった。
図２に示すＮ ^α （エタンチオール）及びＮ ^α （オキシエタンチオール）ペプチド（２）の合成
これらのペプチドを、ＭＢＨＡ（シグマ（Sigma））又は適切なBoc-アミノアシル-OCH₂-PAM-樹脂（シグマ）のいずれかにおいて合成した。鎖の組立を完了し、Ｎ^αＢｏｃ基を純粋ＴＦＡで除去し（１分間の処理２回）、ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡ中和（１分間の処理２回）後、ペプチドをRobeyの方法（Robey et al. Anal. Biochem. 1989, 177, 373-377）によりブロモアセチル化した。ブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）をCH₂Cl₂（２ｍｌ）に溶解し、これにＤＩＣ（１ｍｍｏｌ、２−ジメチルアミノイソプロピルクロリド又はヒドロクロリド、アルドリッチ又はシグマ）を添加した。１０〜１５分間活性化し、対称性無水物を形成した後、混合物をＤＭＦ（２ｍｌ）で希釈し、ペプチド−樹脂に添加し、３０分間カップリングした。次いで樹脂をＤＭＳＯで洗浄し、８ａ（ＤＭＳＯ中２Ｍ）又は８ｂ（ＤＭＳＯ中の１Ｍ）を添加し、ブロモアセチル化ペプチド−樹脂と８〜２３時間反応させた。ペプチドを、樹脂からの除去後、修飾なしに精製した。[（3-CO₂H-4-NO₂）-C₆H₃-S-SCH₂CH₂]-AGPAGD-^αCONH₂（２ａ）（実測質量８００Ｄａ、計算値８００Ｄａ）を、準分離用ＨＰＬＣ（０〜６７％Ｂで６０分間）により精製し、〜２４％を得た。[HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂（２ｂ）（実測質量１８２７±１Ｄａ、計算値１８２８Ｄａ）を準分離用ＨＰＬＣ（１５〜４０％Ｂで６０分間）により精製し、〜２５％の収率を得た。[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH（２ｂ）を、ブロモ酢酸の代わりに２−ブロモプロピオン酸のラセミ化合物を使用し前記の方法により合成した。得られた粗凍結乾燥生成物は、所望のペプチド及びブロモプロピオン酸塩化ペプチド（CH₂=CHCO-ARHTVHQRHLHG-^αCOOH、実測質量１５０２±１Ｄａ、計算値１５０２Ｄａ）からのＨＢｒの除去により生じたペプチドの混合物であった。混合物を準分離用ＨＰＬＣ（１０〜４０％Ｂで６０分間）により精製し、[HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH（実測質量１５９５±１Ｄａ、計算値１５９６Ｄａ）を〜１０％の収率で得た。
図２に示すＳ−[（３−カルボキシ−４−ニトロ）フェニルチオ]−２−アミノエタンチオール（８ａ）の合成
２−アミノエタンチオール（１．０ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）及び５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（１．７５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１００ｍｌ）及び水（２５ｍｌ）と組み合わせ、室温で１４時間攪拌した。反応混合物を水（４５０ｍｌ）で希釈し、ウォーターズ・デルタ・プレップ（Waters Delta Prep）４０００（バイダック５．０×２．５ｃｍ分離用Ｃ−１８カラムを有する）中の分離用逆相ＨＰＬＣで精製し、８ａ（１．０ｇ、４０％）を得た。¹HNMR（D₂O）:δ7.95（d,1H,J=8.7Hz）,7.61（dd,1H,J=8.7,2.2Hz）,7.58（d,1H,J=2.2Hz）,3.18（t,2H,J=6.5Hz）,2.92（t,2H,J=6.7Hz）。
図３に示すＮ−（２−ブロモエトキシ）フタルイミド（１１）の合成
Ｎ−（２−ブロモエトキシ）フタルイミド（１１）を、Bauer及びSureshl（Bauer et al. J. Org. Chem. 1963, 28, 1604-1608）の手順の修飾により合成した。Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１６．０ｇ、９８ｍｍｏｌ、アルドリッチ）、トリエチルアミン（３０ｍｌ、２１５ｍｍｏｌ）及び１，２−ジブロモエタン（３５ｍｌ、４０６ｍｍｏｌ、アルドリッチ）をＤＭＦ（１１５ｍｌ）で組み合わせ、室温下で一晩攪拌した。固体をろ過し、ＤＭＦで洗浄した。ろ液を水（８００ｍｌ）で希釈し、得られた沈殿物をろ過し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中に希釈し、１ＮＨＣｌ（２×５０ｍｌ）、水（１×５０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた固体を９５％ＥｔＯＨより再結晶化し、１１を白色固体として得た（１６．６ｇ、６３％）。¹HNMR（CDCl3）:δ7.82（m,4H）,4.49（t,2H,J=6.9Hz）,3.65（t,2H,J=6.9Hz）;FABMS（ナトリウムイオン）:[C₁₀H₈BrNO₃,H⁺]についての計算値291.9585、実測値291.9579。
図３に示すＮ−[２−[Ｓ−（４−メチルベンジル）]メルカプト]エトキシ]フタルイミド（１２）の合成
臭化物１１（１６．６、６２ｍｍｏｌ）、４−メチルベンジルメルカプタン（８．５ｍｌ、６３ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（９．５ｍｌ、６４ｍｍｏｌ、１，８−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−７−エン、アルドリッチ）をベンゼン（１５０ｍｌ）中で組み合わせ、室温下で８時間攪拌した。固体をろ過し、ベンゼンで洗浄し、ろ液を１Ｎ ＨＣｌ（２×３５ｍｌ）、水（１×３５ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１×３５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化し、１２を白色固体として得た（１４．８ｇ、７４％）。¹HNMR（CDCl3）:δ7.80（m,4H）,7.18（d,2H,J=8.0Hz）,7.04（d,2H,J=8.0Hz）,4.22（t,2H,J=7.4Hz）,3.75（s,2H）,2.79（t,2H,J=7.4Hz）,2.27（s,3H）;FABMS:[C₁₈H₁₇NO₃S,H⁺]についての計算値328.1007,実測値328.1016.計算値.C₁₈H₁₇NO₃Sについての計算値C,66.03;H,5.23;N,4.28;S,9.79.実測値C,66.04;H,4.95;N,4.30;S,9.58。
図３に示すＳ−（４−メチルベンジル）−２−アミノオキシエタンチオール（８ｂ）の合成
Ｓ−（４−メチルベンジル）−２−アミノオキシエタンチオールを、Osby（Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096）の方法により合成した。Ｎ−置換フタルイミド１２（７．４ｇ、２３ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（２０３ｍｌ）及び水（３５ｍｌ）中に懸濁し、これにＮａＢＨ₄（３．５ｇ、９２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温下で一晩攪拌した。酢酸（２５ｍｌ）を泡立ちが停止するまでゆっくりと添加し、フラスコに栓をし、５０℃で２〜３時間加熱した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた溶液を１Ｎ ＮａＯＨで希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせたＥｔＯＡｃ抽出物を飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。揮発物質を減圧下で除去し、得られた油をフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製し、８ｂを透明かつ無色（３．２ｇ、７２％）の油として得た。¹HNMR（CDCl₃）:δ7.21（d,2H,J=8.0Hz）,7.12（d,2H,J=8.0Hz）,5.40（brs,2H,D₂O ex.）,3.77（t,2H,J=6.5Hz）,3.71（s,2H）,2.64（t,2H,J=6.5Hz）,2.33（s,3H）;FABMS:[C₁₀H₁₅NOS,H⁺]についての計算値198.0953,実測値198.0958.計算値.C₁₀H₁₅NOSについての計算値C,60.88;H,7.66;N,7.10;S,16.25.実測値C,60.79;H,7.88;N,7.03;S,16.11。 TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for chemically conjugating oligopeptides. More particularly, the present invention relates to a method for chemically linking oligopeptide ends to end using peptide bonds.
Government rights
This invention was made with government support under grant numbers R01 GM 48897 and P01 GM 48870 awarded by the National Institutes of Health. The United States government has certain rights in this invention.
Background art
Peptide synthesis by conventional stepwise solid phase methodology is limited by low yields when synthesizing long peptides (Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154; Kent et al Ann. Rev. Biochem. 1988, 57, 957-989). To overcome this limitation, a smaller synthetic peptide for chemical bonding will be conjugated to another peptide to produce a longer peptide.
The chemical bond method of peptides is

Disclosed by

The methodology disclosed by Schonolzer relates to providing a product having a non-natural backbone structure at the binding site by chemoselective reaction of unprotected peptide segments. This methodology allows the synthesis of peptides that are larger in size than those obtained by standard peptide synthesis methods (Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887; Williams et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10797-10798). In addition, this methodology allows the synthesis of peptides with unusual structures and topologies (Dawson et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7263-7266; Rose et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-34; Muir et al. Biochemistry 1994, 33, 7701-7708; Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2998-3007). The combined use of traditional stepwise solid phase peptide synthesis and chemical coupling allows chemists to routinely produce unprotected peptides up to 60 amino acid residues in good yield and purity.

Using a combination of these two methodologies, a total chemical synthesis of the protein may be achieved.
Another chemical coupling technique has been reported for the production of proteins with a natural backbone structure (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). This type of chemical bond is termed "native ligation". In this technique, an unprotected synthetic peptide having a C-terminal α-thioester is reacted in a chemoselective manner with an unprotected peptide containing an N-terminal Cys residue. The thiol exchange reaction provides an initial thioester bond intermediate that spontaneously rearranges to give a natural amide bond at the binding site where the two peptide segments are bound, in this process the Cys side chain thiol. Play. This natural bond modification uses the chemical reaction first described by Wieland for amino acid reactions (Wieland et al. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149). As first described, native binding is restricted to binding of peptide segments in X-Cys binding (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779).
What is needed is a general method for joining a C-terminal α-thioester peptide segment to an N-terminal amino acid peptide segment, which does not require the N-terminal amino acid peptide segment to have an N-terminal cysteine.
Summary of invention
The present invention is directed to a method of chemically conjugating unprotected oligopeptides to form a product having all peptide bonds. In the first step, two oligopeptides are coupled to form a coupled product having an aminothioester bond. In the second step, the aminothioester bond is rearranged to form a product having an N-substituted amide bond. In an optional third step, substituents on the amide bond are removed by easy treatment with Zn in acidic medium to give a natural peptide bond at the binding site.
The method of the invention uses two starting oligopeptides, a first starting oligopeptide and a second starting oligopeptide. The first oligopeptide has a C-terminal auxiliary group with a thioester moiety. That is, [peptide₁]^αCOSR (wherein R is selected from the group consisting of 3-carboxy, 4-nitrophenyl and benzyl). The second oligopeptide has an auxiliary functional group with a non-oxidized sulfhydryl moiety. That is, HSCH₂CH₂(O) -N^α[peptide₂]. When the first and second starting oligopeptides are mixed under conditions that promote thioester exchange, both peptides condense with each other to form an intermediate oligopeptide product. Here, the first and second oligopeptides are linked via an aminothioester bond. The aminothioester bond spontaneously rearranges within the molecule to form a linked product linked by N-substituted amide bonds. During the intramolecular rearrangement, the amino group of the N-terminal auxiliary functional group attacks the thioester, forming an amide group with an attached N-linked auxiliary functional group containing a substituted sulfhydryl moiety. N-linked auxiliary functional groups containing a substituted sulfhydryl moiety may be optionally removed by chemical means to form a product with all natural peptide bonds.
One aspect of the present invention is directed to a method for joining a first oligopeptide and a second oligopeptide end to end to produce an oligopeptide product. More particularly, the method of the present invention comprises two steps and an optional third step.
The first step consists of the C-terminal thioester of the first peptide and the second oligopeptide to produce an intermediate oligopeptide in which the first and second oligopeptides are linked by δ or γ aminothioester bonds. Condensing with non-oxidized sulfhydryl moieties. The first oligopeptide contains a C-terminal thioester on the C-terminal residue and the second oligopeptide contains an N-terminal auxiliary functional group on the N-terminal residue with a non-oxidized sulfhydryl moiety. If the C-terminal residue of the first oligopeptide is non-glycine, the N-terminal residue of the second oligopeptide is glycine. If the N-terminal residue on the second oligopeptide is non-glycine, the C-terminal residue on the first oligopeptide is glycine. However, the non-glycine residue is a non-β branched amino acid.
The second step rearranges the δ or γ-aminothioester bond of the intermediate oligopeptide by intramolecular attack on the thioester moiety of the δ or γ-amino group, replacing the sulfhydryl moiety as a by-product from the thioester moiety. . This produces an oligopeptide product in which the first and second oligopeptides are linked by amide bonds. The nitrogen of the amide bond contains an auxiliary functional group having a substituted sulfhydryl moiety.
An optional third step involves the removal of auxiliary functional groups on the amide nitrogen from the oligopeptide product using a reducing agent to generate natural peptide bonds. The amide nitrogen auxiliary functional group is N-α-O- (CH₂)_n-SH (wherein 1≤n≤2). The reducing agent is zinc (underlined nitrogen represents bound amide nitrogen).
Another aspect of the invention includes a first oligopeptide segment comprising a C-terminal thioester, a second oligopeptide segment comprising an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety, and a C-terminal thioester and auxiliary functional group. Oligopeptide intermediates containing aminothioester linkage units that bind the sulfhydryl groups of
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an unprotected peptide segment, where R is a β-branched amino acid residue, provided that if the C-terminal residue on the first oligopeptide is non-glycine, N on the second oligopeptide The terminal residue is glycine, and if the N-terminal residue on the second oligopeptide is non-glycine, the C-terminal residue on the first oligopeptide is glycine.) Show. R 'is selected from the group consisting of 3-carboxy, 4-nitrophenyl and benzyl.
FIG. 2 shows N^α(Substitution) Chemical synthesis of peptide segments 2a and 2b.
FIG. 3 shows the chemical synthesis of compound 8b.
FIG. 4 shows a table for model combination summaries for Examples # 1-5. Superscript characters are as shown below. (A) Thioester peptide (wherein, -SNB = 3-carboxy-4-nitrophenylthioester, -Sbzl = benzylthioester). (B) N^α(Substitution) peptide (in the formula, etsh = N^α(Ethanethiol), oetsh = N^α(Oxyethanethiol)). (C) Based on peptide 2. Estimated from analytical reverse phase HPLC (peak area) and ESMS. (D) Adjust to pH 4.5 after the time indicated at pH 7.5.
5A-5C illustrate model coupling. Example # 2 (described later). Amido-Gly (N^α-OCH₂CH₂SH) Gly-compound 4b was converted to 6M guanidine.HCl, 0.1M Na₂HPO_Four, Formed at pH 7.5. (A)-(C) show an HPLC plot as follows. (A) Analytical HPLC at t = 0 (10-50% B for 30 minutes), peak a, thioester peptide, 1, LYRAG−^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂). Peak b, N^α(Oxyethanethiol) peptide, 2b, [HSCH₂CH₂O] −GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂. (B) Analytical HPLC at t = 1 hour (10-50% B for 30 minutes), peak c, non-peptide impurity, peak d, LYRAG-^αCOSC₆H_FiveBy transthioesterification of 1 with thiophenol. Peak e, intermediate bound product, 4b, LYRAGG(N^α-OCH₂CH₂SH) RNTITIMMQRGNFR-^αCONH₂And a small amount of unreacted [HSCH₂CH₂O] −GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(2b), measured by electrospray ionization MS. (C) Analytical HPLC of peak e after HPLC-purification and overnight treatment with Zn in acidic HPLC solvent (30-40% B for 30 min), peak f, final coupled product, 5b, LYRAGGRNTATIMMQRGNFR-^αCHNH₂, Peak g, non-peptide impurities.
6A-6C illustrate model coupling. Example # 3 (described later). -Phe (N^α-OCH₂CH₂SH) Gly-linked product 4b. Bonding and rearrangement were performed at 37 ° C. (A)-(C) show an HPLC plot as follows. (A) 6M guanidine.HCl, 0.1M Na₂HPO_FourAnalytical HPLC after 11.5 hours in pH 7.5 (30 min at 20-40% B), peak a, N^α(Oxyethanethiol) peptide, 2b, [HSCH₂CH₂O] −GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂, Peak b, non-rearranged intermediate bound product, 4b, LYRAFG(N^α-OCH₂CH₂SH) RNTITIMMQRGNFR-^αCONH₂, Peak d, thioester peptide, 1, LYRAF−^αCOSCH₂C⁶H_Five. (B) 6M guanidine.HCl, 0.1M NaCH_ThreeCO₂Analytical HPLC after 11.5 hours in pH 4.5 (0-67% B for 30 minutes). (C) Analytical HPLC of HPLC purified peak c after overnight treatment with Zn in acidic HPLC solvent (30 min at 20-40% B), peak f, final coupled product, 5b, LYRAFGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂.
Detailed Description of the Invention
The present invention is directed to a two-step method for chemically conjugating two separate peptide fragments. More particularly, the present invention relates to a general methodology for natural (amide-forming) chemical coupling of unprotected peptide segments and purification of the native peptide bond.
The first step condenses the C-terminal thioester of the first peptide and the non-oxidized sulfhydryl moiety of the second oligopeptide, so that the first oligopeptide and the second oligopeptide are linked by a δ- or γ-aminothioester bond. Generating an intermediate oligopeptide linked at If the C-terminal residue on the first oligopeptide is non-glycine, the N-terminal residue on the second oligopeptide is glycine. If the N-terminal residue on the second oligopeptide is non-glycine, the C-terminal residue on the first oligopeptide is glycine. However, non-glycine residues are non-β branched amino acids.
The second step is the rearrangement of the δ or γ-amino thioester bond of the intermediate oligopeptide by intramolecular attack on the thioester moiety of the δ or γ-amino group, thereby the sulfhydryl moiety as a by-product derived from the thioester moiety. Substitution and the production of an oligopeptide product in which the first oligopeptide and the second oligopeptide are linked by a natural amide bond. However, the nitrogen on the amide bond contains an auxiliary functional group with a substituted sulfhydryl moiety.
An optional third step involves removing auxiliary functional groups on the amide nitrogen from the oligopeptide product using a reducing agent to produce a native peptide bond. The amide nitrogen auxiliary functional group is N-α-O- (CH₂) N-SH (where 1 ≦ n ≦ 2) and the reducing agent is zinc (the underlined nitrogen represents the bound amide nitrogen). ).
The method of the present invention allows the synthesis of peptides and proteins having either natural or modified backbone structures. FIG. 1 summarizes the procedure. Peptide α-carboxythioester (1) is converted to N via thiol exchange.^α(Ethanethiol) peptide (2a) or N_αReaction with any of the (oxyethanethiol) peptides (2b) produces the bound product 3. This thioester-linked intermediate is rearranged via an advantageous geometric rearrangement involving a 5 or 6-membered ring, and in 4a an amide bond product comprising a secondary amide in 4a or 4b an amide comprising an analogue N-oxyalkyl compound. The bound product 4 is given. N- obtained^α(Substituted) amides also potentially have advantageous solubility properties (Quibell et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 11656-11668). N- obtained^αThe (O-alkyl) amide bond product further has the advantage of being stable to HF cleavage conditions and is easily removed under mild conditions. In the case of 4b, zinc powder can be added directly to the reverse phase HPLC purified peptide in acidic eluent to reduce the NO bond of O-alkoxyhydroxamate to obtain the natural backbone structure of the bound product 5b. .
All peptide segments are in situ neutralized for tert-butoxycarbonyl (Boc) chemistry / 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate ( Stepwise synthesis by established solid phase method using HBTU) activation protocol, purified by preparative reverse phase HPLC and characterized by electrospray mass spectrometry (ESMS)

Peptide-α-thioester (1) is formed from the corresponding peptide-α-thioacid and then on the thioester resin as described in Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220. Was synthesized. Peptide-α-thioic acid with 6 equivalents of 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) in 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 5.0-6.5. Conversion to the corresponding 3-carboxy-4-nitrophenyl thioester by reaction or the corresponding benzyl ester using 10 equivalents of benzyl bromide in 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 4.0. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). Both thioesters provide sufficient leaving groups for coupling reactions with 3-carboxy-4-nitrophenyl thioester. This shows a slightly faster reaction rate than the corresponding benzylthioester (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779).
N^α(Ethanethiol) (2a) and N^αThe synthesis of (oxyethanethiol) (2b) is shown in FIG. Appropriate α-bromocarboxylic acid (activated as a symmetric anhydride (0.5 equivalent of 1,3-diisopropylcarbodiimide (DIC) in dichloromethane)) (Robey et al. Anal. Biochem. 1989, 177, 373- 377) was coupled with the deprotected N-terminal amino acid of peptide-resin 6 to give bromoacyl-peptide-resin 7. The bromide was stereochemically substituted with 8a or 8b amine group in DMSO to give peptide-resin 9. Deprotection in anhydrous HF and cleavage from the resin provides 2b directly or 2a in disulfide form, which is reduced to the free thiol.
Aminoethanethiol derivative 8a was synthesized in one step from the reaction of 2-aminoethanethiol and 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) in 80% acetonitrile in water. The synthesis of aminooxyethanethiol derivative 8b is also included and is shown in FIG. Bromide 11 was generated from the reaction of N-hydroxyphthalimide (10) with a large excess of 1,2-dibromoethane (Bauer J. Org. Chem. 1963, 28, 1604-1608). The bromide 11 was converted to the protected aminooxyethanethiol derivative 12 using 4-methylbenzyl mercaptan in the presence of the base 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU). Twelve phthalimide groups were removed in a two-step process (Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096). This method uses NaBH_FourA step of obtaining the desired aminooxyethanethiol derivative 8b by reduction with a subsequent treatment with acetic acid.
Compared to the original natural chemical bond at the X-Cys site (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779), the most notable feature of the binding chemistry of the present invention is the slowness of the first thioester bond product. It is a dislocation. Intramolecular attack by the α-NH (O-alkyl) group via the 6-membered ring intermediate in this example results in an unsubstituted α-NH at the X-Cys bond.₂It is much less preferred (Mandolini et al. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 550-554) than the easy five-membered ring-mediated attack (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). The thioester-linked initial binding product of the present invention, which is only slowly rearranged, with the exception of the Gly-Gly bond, can be isolated (FIG. 4). Of note, the C on both binding sites^αFor substituted amino acids, no rearrangement to the amide bond is visible. That is, the thioester bond intermediate was unlimitedly stable under the reaction conditions. These slow rearrangements are similar to those seen in previously reported (N-substituted) amide-forming bond chemistries (Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584-6588).
In the present invention, the use of temporary auxiliary functional groups in amide-forming linkages is based on the “thiol capture” strategy proposed by Kemp (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779 Dawson et al. Science 1994, 266, 776 -779). Natural chemical coupling and thiol capture methods have the use of unprotected peptides in segment condensation strategies to achieve the synthesis of long polypeptide chains as a defined goal. The key to the natural chemical coupling approach is the regioselective coupling at the N-terminal Cys in the presence of other Cys residues in both segments under conditions that promote thiol moiety exchange of the initial thioester-linked intermediate product. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). In contrast, the “thiol capture” strategy and related methods (Liu et al. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 933-936) require regiospecific protection of Cys side chain functional groups prior to the conjugation reaction. (Kemp et al. Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium Rivier, JE; Marshall, GR, Eds, ESCOM: Lieden, 1990; pp 920-922). This hinders the original intention of this.
Similarly, the use of a carbonyl activated α-thiocarboxyl group (ie, α-COSR) in the present invention is similar to the conventional chemistry used for peptide segment condensation (Blake et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 4055-4058; Yamashiro et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1988, 31, 322-334; Hojo et al. Peptide Chemistry Okada, Y., Ed, Protein Research Foundation: Osaka, 1994; pp 9 -12). However, these synthetic methods are based on Ag.⁺Activated peptide^αBased on conventional non-chemoselective attack by α-amine nucleophilic atoms in the second segment on COSR. Therefore, regiospecific (re) protection of all other α- and ε-amine functional groups in both segments is required.
In contrast, thioester-mediated amide-forming coupling chemistry is compatible with the use of completely unprotected peptide segments with all side-chain functional groups found in nature, including thiols (Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887; Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). For this reason, natural chemical conjugation is simple and practical and becomes a general approach to total chemical synthesis of a protein if the protein contains the appropriate binding site.
The present invention increases the utility of the natural chemical conjugation method reported by Dawson et al. (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779) by extending the number of dipeptide sequences that can be used as binding sites. Let In addition to the X-Cys binding site of the methodology, the present specification includes X-Gly and Gly-X binding sites (ie, glycine at the C-terminal residue when the N-terminal residue is non-glycine, C-terminal N-terminal residue glycine (when the residue is non-glycine) is disclosed. In preferred embodiments, X is all non-beta branched amino acids. However, our previous studies have shown that X can be any amino acid, including β-branched amino acids such as Val (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779).
The present invention potentially extends the number of sites suitable for only three natural chemical bonds to more than 50 of the 400 dipeptide sequences found in proteins. This extended applicability makes most polypeptides more accessible for natural chemical coupling, as there is considerable tolerance in the choice of binding sites in target sequences containing glycine residues.
Natural chemical bonds of the original form (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779) or the forms described herein provide direct synthetic access to polypeptide side chains of typical sized protein domains I will provide a. Other coupling chemistry

Can be used to bind synthetic domains in a modular fashion to produce large (ie,> 20 kilodaltons), fully functional synthetic proteins (Canne et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 , 2998-3007; Baca et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1881-1887). In an almost common form that incorporates all the appropriate chemical reactions (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779), the chemical binding approach represents the next generation in the evolution of polypeptide chemical synthesis and regeneration. Providing total chemical synthesis of possible and practical proteins.
Examples 1 to 4
The results of the combined example are summarized in FIG. All bonds are 8M urea, 0.1M Na₂HPO_Four, PH 7.0 or 6M guanidine.HCl, 0.1M Na₂HPO_FourIn pH 7.5, each peptide was carried out at a concentration range of 4 mg / ml to 8 mg / ml. Immediately after the peptide segment (solvation), 2-5% benzyl mercaptan (binding example # 1) or thiophenol (binding example # 2-5), a volume of binding buffer was added to maintain the thiol group in reduced form. . This is the original peptide^αA significant amount of thioester (1)^αThiobenzyl ester or peptide^αIt had the additional importance of switching to the thiophenyl ester, both having the ability to react with peptide 2 in the desired manner. The binding reaction was followed by analytical reverse phase HPLC and the product was identified by ESMS. In the examples shown below, amino acid residues associated with binding are underlined.
Example 1
peptide-^αThio (3-carboxy-4-nitro) phenyl ester 1 has the sequence LYRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂) (SEQ ID NO: 1) (actual mass 760 Da, calculated value 760 Da). N protected as 5-thio-2- (nitrobenzoic acid) disulfide^αThe (ethanethiol) peptide 2a has the sequence [(3-CO₂H-4-NO₂) -C₆H_Three-S-SCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂(SEQ ID NO: 2) (actual mass 800 Da, calculated value 800 Da) (this sequence is [HSCH₂CH₂]-GAGPAGD-^αCONH₂(SEQ ID NO: 2) (reduced to actual mass 603 Da, calculated value 603 Da). After 1 hour, the bound product 4a [LYRAGG(N^α-CH₂CH₂SH) AGPAGD-^αCONH₂(SEQ ID NO: 3) (actual mass 1163 ± 1 Da, calculated value 1163 Da)] was generated to a significant degree. Expected to be treated with 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) and 6M urea, 0.1M phosphate, pH 6.0 for 1 hour after purification of the coupled product by reverse phase HPLC − S-Nitrobenzoic acid disulfide product, LYRAGG[N^α-CH₂CH₂S-SC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂)] AGPAGD-^αCONH₂(SEQ ID NO: 3) (actual mass 1360 ± 1 Da, calculated value 1360 Da) was obtained. This confirmed that 4a was formed by the dislocation of 3a. This is because 3a is inert to 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). The results are summarized in FIG.
Example 2
5A to 5C show the process of the coupling example # 2. Peptide^αThioester segment 1 (peak a) has the sequence LYRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H, 4-NO₂) (SEQ ID NO: 1) (actual mass 760 Da, calculated value 760 Da). N^α(Oxyethanethiol) peptide 2b (peak b) has the sequence [HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 4) (actual mass 1827 ± 1 Da, calculated value 1828 Da). After reaction for 1 hour at room temperature in the presence of added thiophenol, the coupled product LYRAGG (N-OCH₂CH₂SH) RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 5) (4b, measured mass 2388 ± 1 Da, calculated value 2389 Da) is generated to a significant extent, which is the unreacted N^αCo-eluted with (oxyethanethiol) peptide 2b (peak e). After further reaction at room temperature overnight, the coupled product was purified by HPLC and zinc powder was added directly to the collected peptide in the HPLC eluent and stirred at room temperature overnight. Under these conditions, zinc efficiently reduced N—O bonds. This type of reduction is possible with various reagents (Kecketal. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 7419-7922). The obtained peptide (peak f) was generated by the reduction of the N—O bond.GGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 5) A mass consistent with (5b, measured mass 2313 ± 1 Da, calculated value 2313 Da) was given. This confirmed the dislocation from 3b to 4b as shown in FIG. This is because the cleavage of the N—O bond in untranslocated 3b results in the formation of two different peptides with a significantly lower mass.
Example 3
6A to 6C show the process of the coupling example # 3. Peptide^αThioester segment 1 (peak d) is C-terminal phenylalanine thioester [LYRAF-^αCOSCH₂C₆H_Five(SEQ ID NO: 6) (actual mass 775 Da, calculated value 775 Da)]. Therefore, it provides more steric hindrance than the above case (binding examples # 1 and # 2) (including C-terminal glycine thioester). N^α(Oxyethanethiol) peptide 2b (peak a)₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 7) (actual mass 1827 ± 1 Da, calculated value 1828 Da). The presence of more sterically hindered thioesters reduced the reaction compared to the unhindered model. However, it has been found that heating at 37 ° C. promotes the initial bonding rate. FIG. 6A shows the binding reaction after 11.5 hours at 37 ° C. The rate of rearrangement from 3b to 4b is the unrearranged product 3b, LYRAF- [^αCOSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 8) slow enough to observe (peak b, measured mass 2478 ± 1 Da, calculated 2478 Da), rearrangement product 4b, LYRAFG(N^α-OCH₂CH₂SH) RNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 9) Elution was carried out just before (peak c, measured mass 2478 ± 1 Da, calculated value 2478 Da). Unrearranged and rearranged products 3b and 4b having the same mass were identified by zinc reduction products. Intermediate 3b and peak b are converted to the peptide sequence LYRA during zinc reduction, respectively.F-^αCOOH (thioester hydrolysis) andGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂Gave two peptides with masses of 669 Da and 1753 Da. The crude reaction mixture was then diluted with 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 4.0 (up to 5 times the volume) to reduce the pH after initial binding to 4.5, thereby accelerating the rearrangement rate. Measured that. FIG. 6B shows that the rearrangement from the initial binding product 3b to 4b (peak c) was complete after 10 hours at 37 ° C., pH 4.5. By HPLC purification of this peak and subsequent zinc reduction, a peptide with the expected mass (peak f) LYRAFGRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(SEQ ID NO: 9) (5b, measured mass 2403 ± 1 Da, calculated value 2404 Da) was obtained.
Example 4
LYRAG-^αCOSCH₂C₆H_Five1 (SEQ ID NO: 1) (actual mass 685 Da, calculated value 685 Da) is represented by [HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH 2b (SEQ ID NO: 10) (actual mass 1595 ± 1 Da, calculated value 1596 Da) was bound at pH 7.5. This example provided steric hindrance in the form of an Ala residue opposite the binding site of binding example # 3. The reaction rate was the same as in Example 3, which was significantly slower than the unhindered examples (binding examples # 1 and # 2), but was accelerated by heating at 37 ° C. Non-dislocation (3b, LYRAG-^α[COSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH) (SEQ ID NO: 11) and transposition (4b, LYRA)GA(N^α-OCH₂CH₂SH) ARHTVHQRHLHG-^αCOOH) (SEQ ID NO: 12) binding product was formed, the observed mass (both unrearranged and rearranged) was 2156 ± 1 Da, calculated 2157 Da. However, unlike coupling example # 3, the rearrangement was almost complete after 2 days at 37 ° C., regardless of pH, as shown by successful reduction to amide, but the rearrangement rate was adjusted to pH 4.5 after initial coupling. Even if it was lowered, it did not accelerate.
Final binding product 5b (LYRAGAARHTVHQRHLHG-^αIt should be noted that the binding of the peptide to zinc occurred due to the presence of a significant number of histidines in COOH (SEQ ID NO: 12), observed mass 2080 ± 1 Da, calculated 2080 Da). After reduction of the N—O bond, EDTA must be added to the HPLC buffer / Zn mixture to release the peptide from the zinc. The results are summarized in FIG.
Example 5
Example 5 provides an example with a steric bulk on both sides of the binding site. LYRAF-^αCOSCH₂C₆H_Five1 (SEQ ID NO: 6) (actual mass 775 Da, calculated value 775 Da)₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH 2b (SEQ ID NO: 13) (actual mass 1595 ± 1 Da, calculated value 1596 Da) was bound at pH 7.5. An initial (ie unrearranged) binding product 3b was observed, but LYRAF-^α[COSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH (SEQ ID NO: 14) (actual mass 2246 ± 1 Da, calculated value 2247 Da), even under low pH, there was no evidence of dislocation within time. The presence of side chains on both sides of the binding site clearly gave steric hindrance, and no rearrangement via the 6-membered ring intermediate occurred under the conditions used. The results are summarized in FIG.
The above examples highlight the surprising ability of our original natural binding chemistry (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). This was recently repeated independently in essentially the same form in a model binding study (Tametal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12485-12489). We used this original native peptide bond-forming bond reaction for the chemical synthesis of several proteins with full biological activity. These include the chemokine IL-8 (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779), the enzymes HIV-1 protease and barnase, the serine protease inhibitor turkey ovomucoid third domain and eglin C and The ab / HLH transcription factor is included. This binding reaction is based on the principle published by MaxBrenner (Brenner M. peptides, Proceedings of the Eighth European peptide Symposium Beyerman, HC, Ed., North Holland: Amsterdam, 1976; pp1-7). et al. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149).
Experimental protocol
Outline
Machine-assisted solid phase peptide synthesis was performed in a custom-modified Applied Biosystems 430A peptide synthesizer (Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180 -193). Reversed phase HPLC was performed on a Rainin HPLC system using a Vydac C-18 computational column (5 μm, 0.46 × 15 cm) and a semi-separating (10 μm, 1.0 × 25 cm) column at 214 nm. Performed using UV detection. Chromatographic separation was performed using buffer B in buffer A (A = 0.1% TFA in water, B = 90% CH_ThreeA linear gradient of CN / 0.09% TFA containing 10% water) was achieved using 30-60 minutes at 1 ml / min (calculated) or 3 ml / min (for semi-separation). Mass spectra of all peptide segments were obtained using a Sciex API-III electrospray quadrupole mass spectrometer. The observed mass was derived from experimental m / z values for all observed protonation states for the molecular species using the program MacSpec (Sciex). The calculated mass is based on the average isotope composition and is programmed by MacProMass (Terry Lee and Sunil Vemuri), Beckman Research Institute, Dualte, Derived from the use of California). All other mass spectrometry was performed at The Scripps Research Institute's mass spectrometry facility.¹HNMR spectra were recorded on a Bruker 250 MHz spectrophotometer and chemical shifts were measured in Me._FourReported in parts per million of low magnetic fields derived from Si. Microanalysis was performed at The Scripps Research Institute's X-gland crystallography facility, which agreed with the calculated value of ± 0.4%. Boc-L-amino acids and HBTU were purchased from Novabiochem (La Jolla, Calif.). 4-Hydroxymethylacetoamidomethyl (PAM) resin and diisopropylethylamine (DIEA) are obtained from Applied Biosystems (Foster City, Calif.), And methylbenzhydrylamine (MBHA) is Peninsula Laboratories. Laboratories, Inc) (San Carlos, CA). Dimethylformamide (DMF) for synthesis is obtained from Baker and CH for AR₂Cl₂And HPLC CH_ThreeCN was obtained from Fisher. Trifluoroacetic acid (TFA) was obtained from Halocarbon (New Jersey). HF was purchased from Matheson Gas. 4-Methylbenzyl mercaptan was obtained from Lancaster. All other reagents were for Ar or better and were obtained from Aldrich Chemical or Fisher.
Assembly of peptide segment synthetic chain
Peptides were synthesized stepwise by established solid phase methods using in situ neutralization / HBTU activation protocol for Boc chemistry (Schnolzer et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, 180 -193). Side chain protection was as shown below. Boc-Arg (p-toluenesulfonyl) -OH, Boc-Asn (xanthyl) -OH, Boc-Asp (O-cyclohexyl) -OH, Boc-His (dinitrophenyl) -OH, Boc-Thr (benzyl) -OH And Boc-Tyr (2-bromobenzyloxycarbonyl) -OH. Boc-Gln-OH and Boc-Met-OH were used without side chain protection. The coupling reaction was monitored by quantitative ninhydrin assay (Sarinetal, Anal. Biochem., 1981, 117, 147-157), typically> 99%. After chain assembly is complete, the peptide is deprotected and simultaneously cleaved from the resin by treatment with 5% p-cresol containing HF for 5 hours at 0 ° C.^αCOSH,-^αCONH₂Or-^αCO₂H was obtained. After removal of HF under reduced pressure, the crude peptide is purified with absolute Et.₂Precipitated in O (diethyl ether), dissolved in HPLC buffer (40-50% B) and lyophilized.
Peptide shown in Figure 1 ^α Synthesis of thioester (1)
The thioacid peptide is [4- [α- (Nt-Boc-aminoacyl-S) benzyl] phenoxy] acetic acid, DCHA salt (Canne et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1217-1220), (2.0 equivalents) ) And aminomethyl-resin (1 eq, washed with 10% DIEA in DMF (Aldrich)) with HBTU (1.6 eq, Aldrich) and DIEA (1 eq, Aldrich) added as activators, Synthesized on the appropriate Boc-aminoacyl-S-resin by coupling in DMF (dimethylformamide). peptide-^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂) Thioester is a crude peptide^αCOSH (15-20 mg) is formed by dissolving in 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 5.0-6.5, to which 1.5 equivalents of 5,5′-dithio-bis (2 -Nitrobenzoic acid) was added (Dawson et al. Science 1994, 266, 776-779). The mixture was vortexed briefly and formed after 10 minutes. peptide-^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂) The identity of the ester was clearly confirmed by accurate electrospray mass measurement, which was consistent with Liu et al. (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 933-936). peptide-^αCOSCH₂C₆H_FiveThioester is a crude peptide^αCOSH (15-20 mg) was produced by dissolving in 6M guanidine.HCl, 0.1M sodium acetate, pH 4.0, to which 10 equivalents of benzyl bromide were added (Dawson et al. Science 1994, 266 , 776-779). The mixture was vortexed briefly and purified after 1 hour. LYRAG-^αCOSC₆H_Three(3-CO₂H-4-NO₂) (Actual mass 760 Da, calculated 760 Da) was purified by semi-separation HPLC (20-60% B for 40 minutes) to give a yield of 20-30%. LYRAG-^αCOSCH₂C₆H_Five(Measured mass 685 Da, calculated value 685 Da) was purified by semi-separation HPLC (15-45% B for 60 minutes) to give a yield of 25-30%. LYRAF-^αCOSCH₂C₆H_Five(Actual mass 775 Da, calculated value 775 Da) was purified by semi-separation HPLC (30-60% B for 60 minutes) to give a yield of 25-30%. Most of the yield loss was simply due to HPLC recovery.
N shown in FIG. ^α (Ethanethiol) and N ^α Synthesis of (oxyethanethiol) peptide (2)
These peptides are either MBHA (Sigma) or the appropriate Boc-aminoacyl-OCH₂Synthesized in any of -PAM-resin (Sigma). Complete chain assembly, N^αAfter removal of the Boc group with pure TFA (twice for 1 minute treatment) and 10% DIEA neutralization in DMF (twice with 1 minute treatment), the peptide was subjected to the method of Robey (Robey et al. Anal. Biochem. 1989). , 177, 373-377). Bromoacetic acid (2.0 mmol) in CH₂Cl₂Dissolved in (2 ml), DIC (1 mmol, 2-dimethylaminoisopropyl chloride or hydrochloride, Aldrich or Sigma) was added thereto. After activation for 10-15 minutes to form a symmetric anhydride, the mixture was diluted with DMF (2 ml), added to the peptide-resin and coupled for 30 minutes. The resin was then washed with DMSO and 8a (2M in DMSO) or 8b (1M in DMSO) was added and allowed to react with the bromoacetylated peptide-resin for 8-23 hours. The peptide was purified without modification after removal from the resin. [(3-CO₂H-4-NO₂) -C₆H_Three-S-SCH₂CH₂] -AGPAGD-^αCONH₂(2a) (Measured mass 800 Da, calculated value 800 Da) was purified by semi-separation HPLC (0-67% B for 60 minutes) to give -24%. [HSCH₂CH₂O]-GRNTATIMMQRGNFR-^αCONH₂(2b) (Measured mass 1827 ± 1 Da, calculated 1828 Da) was purified by semi-separation HPLC (15-40% B for 60 min) to give a yield of ˜25%. [HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH (2b) was synthesized by the above method using the racemic compound of 2-bromopropionic acid instead of bromoacetic acid. The resulting crude lyophilized product was obtained as desired peptide and bromopropionated peptide (CH₂= CHCO-ARHTVHQRHLHG-^αCOOH, observed mass 1502 ± 1 Da, calculated value 1502 Da). This was a mixture of peptides resulting from the removal of HBr. The mixture is purified by semi-preparative HPLC (10-40% B for 60 min) and [HSCH₂CH₂O]-AARHTVHQRHLHG-^αCOOH (actual mass 1595 ± 1 Da, calculated value 1596 Da) was obtained in a yield of -10%.
Synthesis of S-[(3-carboxy-4-nitro) phenylthio] -2-aminoethanethiol (8a) shown in FIG.
2-Aminoethanethiol (1.0 g, 13.0 mmol) and 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (1.75 g, 4.4 mmol), acetonitrile (100 ml) and water (25 ml) And stirred at room temperature for 14 hours. The reaction mixture was diluted with water (450 ml) and purified by preparative reverse phase HPLC in a Waters Delta Prep 4000 (with a Vidak 5.0 × 2.5 cm separation C-18 column). 8a (1.0 g, 40%) was obtained.¹HNMR (D₂O): δ7.95 (d, 1H, J = 8.7Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 8.7, 2.2Hz), 7.58 (d, 1H, J = 2.2Hz), 3.18 (t, 2H, J = 6.5Hz), 2.92 (t, 2H, J = 6.7Hz).
Synthesis of N- (2-bromoethoxy) phthalimide (11) shown in FIG.
N- (2-bromoethoxy) phthalimide (11) was synthesized by modification of the procedure of Bauer and Sureshl (Bauer et al. J. Org. Chem. 1963, 28, 1604-1608). N-hydroxyphthalimide (16.0 g, 98 mmol, Aldrich), triethylamine (30 ml, 215 mmol) and 1,2-dibromoethane (35 ml, 406 mmol, Aldrich) were combined with DMF (115 ml) and stirred overnight at room temperature. The solid was filtered and washed with DMF. The filtrate was diluted with water (800 ml) and the resulting precipitate was filtered, diluted in EtOAc (200 ml), 1N HCl (2 × 50 ml), water (1 × 50 ml), saturated NaCl (1 × 50 ml). Wash with MgSO_FourAnd dried. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting solid was recrystallized from 95% EtOH to give 11 as a white solid (16.6 g, 63%).¹HNMR (CDCl3): δ 7.82 (m, 4H), 4.49 (t, 2H, J = 6.9Hz), 3.65 (t, 2H, J = 6.9Hz); FABMS (sodium ion): [C_TenH₈BrNO_Three, H⁺The calculated value 291.9585, measured value 291.9579.
Synthesis of N- [2- [S- (4-methylbenzyl)] mercapto] ethoxy] phthalimide (12) shown in FIG.
Bromide 11 (16.6, 62 mmol), 4-methylbenzyl mercaptan (8.5 ml, 63 mmol) and DBU (9.5 ml, 64 mmol, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, Aldrich). Combined in benzene (150 ml) and stirred at room temperature for 8 hours. The solid was filtered and washed with benzene, and the filtrate was washed with 1N HCl (2 × 35 ml), water (1 × 35 ml), saturated NaCl (1 × 35 ml), MgSO 4._FourAnd dried. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting solid was recrystallized from EtOAc / hexanes to give 12 as a white solid (14.8 g, 74%).¹HNMR (CDCl3): δ 7.80 (m, 4H), 7.18 (d, 2H, J = 8.0Hz), 7.04 (d, 2H, J = 8.0Hz), 4.22 (t, 2H, J = 7.4Hz), 3.75 (s, 2H), 2.79 (t, 2H, J = 7.4Hz), 2.27 (s, 3H); FABMS: [C₁₈H₁₇NO_ThreeS, H⁺] Calculated value 328.1007, measured value 328.1016.₁₈H₁₇NO_ThreeCalculated for S C, 66.03; H, 5.23; N, 4.28; S, 9.79. Found C, 66.04; H, 4.95; N, 4.30; S, 9.58.
Synthesis of S- (4-methylbenzyl) -2-aminooxyethanethiol (8b) shown in FIG.
S- (4-methylbenzyl) -2-aminooxyethanethiol was synthesized by the method of Osby (Osby et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2093-2096). N-substituted phthalimide 12 (7.4 g, 23 mmol) was suspended in isopropanol (203 ml) and water (35 ml) to which NaBH was added._Four(3.5 g, 92 mmol) was added. The mixture was stirred overnight at room temperature. Acetic acid (25 ml) was added slowly until bubbling ceased, the flask was capped and heated at 50 ° C. for 2-3 hours. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting solution was diluted with 1N NaOH and extracted with EtOAc (4 × 50 ml). The combined EtOAc extracts were washed with saturated NaCl (1 × 50 ml) and MgSO_FourAnd dried. Volatiles were removed under reduced pressure and the resulting oil was purified by flash chromatography (1: 1 hexanes: EtOAc) to afford 8b as a clear and colorless (3.2 g, 72%) oil.¹HNMR (CDCl_Three): Δ7.21 (d, 2H, J = 8.0Hz), 7.12 (d, 2H, J = 8.0Hz), 5.40 (brs, 2H, D₂O ex.), 3.77 (t, 2H, J = 6.5Hz), 3.71 (s, 2H), 2.64 (t, 2H, J = 6.5Hz), 2.33 (s, 3H); FABMS: [C_TenH₁₅NOS, H⁺] Calculated value 198.0953, Actual value 198.0958. Calculated value C_TenH₁₅Calculated for NOS C, 60.88; H, 7.66; N, 7.10; S, 16.25. Found C, 60.79; H, 7.88; N, 7.03; S, 16.11.

Claims (8)

A method for producing an oligopeptide product by linking a first oligopeptide and a second oligopeptide at the ends, and comprising:
Step A: mixing the first and second oligopeptides in a reaction solution containing a catalytic thiol, wherein the first oligopeptide comprises a C-terminal residue having a C-terminal thioester, The oligopeptide comprises an N-terminal residue with an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety, wherein the N-terminal residue is not glycine or cysteine and the C-terminal residue is glycine;
Step B: condensing the non-oxidized sulfhydryl moiety of the N-terminal auxiliary functional group with the C-terminal thioester to produce an intermediate oligopeptide in which the first and second oligopeptides are linked by an aminothioester bond; and
Step C: Transforming the aminothioester bond of the intermediate oligopeptide of Step B to produce an oligopeptide product in which the first and second oligopeptides are linked by an amide bond having an N-linked auxiliary functional group,
A method comprising the steps of: The method of claim 1, wherein the catalytic thiol is selected from the group consisting of benzyl mercaptan and thiophenol. The method according to claim 2, wherein the N-terminal auxiliary functional group is N-α- (CH ₂ ) _n —SH (where 1 ≦ n ≦ 3). An additional step,
Step D: removing the N-terminal auxiliary functional group from the oligopeptide product of Step C using a reducing agent to produce a natural peptide bond;
The method of claim 2 comprising: The method according to claim 4, wherein the N-terminal auxiliary functional group is N-α-O— (CH ₂ ) _n —SH (where 1 ≦ n ≦ 2). 6. A method according to claim 5, wherein the reducing agent is zinc. A first oligopeptide segment comprising a C-terminal thioester;
A second oligopeptide segment comprising an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety; and
An aminothioester bond that binds the C-terminal thioester to the non-oxidized sulfhydryl group of the auxiliary functional group,
Wherein the aminothioester linkage unit spontaneously undergoes intramolecular rearrangement to form an amide bond that joins the first and second oligopeptide segments end to end; An intermediate in which the N-terminal residue of the oligopeptide segment is not glycine or cysteine and the C-terminal residue of the first oligopeptide segment is glycine. The following formula:
_{(Aa 1 -CO) -S- (CH} 2) n -X- (N-aa 2)
(Wherein aa ₁ -CO represents a first amino acid having a carbonyl group, N-aa ₂ represents a second amino acid having an amino group, X is selected from the group consisting of oxygen and methylene, 1 ≦ n ≦ 2, N-aa ₂ is neither glycine nor cysteine, and aa ₁ -CO is glycine.)
In a intermediate oligopeptide having a binding unit represented,
Mixing the first and second oligopeptides in a reaction solution containing a catalytic thiol, wherein the first oligopeptide is a C-terminal residue having a C-terminal thioester, aa ₁ -COSR (formula Wherein R is selected from the group consisting of 3-carboxy, 4-nitrophenyl and benzyl), and the second oligopeptide is an N-terminal residue having an N-terminal auxiliary functional group having a non-oxidized sulfhydryl moiety. aa ₂ (wherein, X is selected from the group consisting of oxygen and methylene, is 1 ≦ n ≦ 2) -N- α-X- (CH 2) n -SH wherein the said n-terminal residue is glycine But not the cysteine, the C-terminal residue is glycine, and
An intermediate oligopeptide having a binding unit represented by the above formula, wherein the non-oxidized sulfhydryl part of the N-terminal auxiliary functional group and the C-terminal thioester are condensed, and the first and second oligopeptides are bonded by an aminothioester bond. Manufacturing process,
An intermediate oligopeptide produced by a method comprising:

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