JP2001506488A - Recombinant bicistronic adenovirus for treating pathological conditions associated with lipoprotein dysemia - Google Patents

Recombinant bicistronic adenovirus for treating pathological conditions associated with lipoprotein dysemia

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Abstract

(57)【要約】 本発明は欠陥組換えウイルス、好ましくはコレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする少なくとも２つの核酸を含み、これらの核酸が転写プロモーターに作動的に連結され、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられていることを特徴とするアデノウイルスに関する。本発明は更に、これらのアデノウイルスの作製に有用なプラスミド構築物、これらのプラスミドまたはアデノウイルスによって形質転換された細胞、及び、上記のアデノウイルスを含有する医薬組成物に関する。 The present invention comprises at least two nucleic acids encoding a defective recombinant virus, preferably separate enzymes, proteins and / or cofactors involved in the reverse transport of cholesterol, wherein these nucleic acids are included in the transcription promoter. An adenovirus characterized in that it is operably linked and separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. The invention further relates to plasmid constructs useful for the production of these adenoviruses, cells transformed with these plasmids or adenoviruses, and pharmaceutical compositions containing the adenoviruses described above.

Description

【発明の詳細な説明】リポタンパク質異常血症に関連する病的症状を治療するための組換えバイシスト ロンアデノウイルス 本発明は、所望の遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで導入及び発現させるための新規な 組換えウイルス、その作製及び遺伝子治療におけるその使用に関する。より詳細 には本発明は、少なくとも２つの挿入された遺伝子を含み、該遺伝子の発現産物 がコレステロールの逆輸送に関与するような組換えウイルスに関する。本発明は また、本発明のアデノウイルスの産生に有用なシャトルプラスミドに関する。よ り特定的には本発明は、欠陥組換えアデノウイルス、並びに、リポタンパク質異 常血症に関連する症状を予防及び治療するためのこのようなアデノウイルスの使 用に関する。リポタンパク質異常血症が心血管及び神経のレベルで重大な結果を 招くことは周知である。 リポタンパク質異常血症は、血液及び周辺液における、コレステロール及びト リグリセリドのような脂質を運搬するリポタンパク質の代謝障害である。リポタ ンパク質異常血症は、高コレステロール血症または高トリグリセリド血症、特に アテロー ム性動脈硬化症にそれぞれ関連する重大な症状をもたらす。 アテローム性動脈硬化症は多因性の複合疾患であり、組織学的レベルでは、太 い動脈（大動脈、冠動脈、頸動脈）の壁に生じる脂質及びその他の血液誘導体の 沈積（脂質斑または線維状脂質斑）であると定義される。症状の進行に伴って多 少とも石灰化した沈積斑が病変部に存在し、また、主としてコレステロールエス テルから成る脂肪質沈積が動脈に蓄積される。これらの沈積斑に付随して、動脈 壁の肥厚、平滑筋の肥大、泡沫細胞の出現及び線維状組織の蓄積が生じる。アテ ローム斑は血管壁で極めて顕著に隆起している。このため血管が狭窄し、重症患 者ではアテローム症、血栓症、塞栓症などの血管閉塞の原因となる。 高コレステロール血症は心筋梗塞、突然死、心不全、脳血管発作のような極め て重篤な心血管疾患につながる。 従って、いくつかの症状に対しては、血漿コレステロール濃度を低下させ得る 治療方法、より詳細には、アテローム斑を形成させるコレステロール蓄積細胞を 排出するために末梢組織のレベルでコレステロールの排出（コレステロールの逆 輸送）を刺激し得る治療方法を開発することが特に重要である。コレス テロールは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤ Ｌ）のような種々のリポタンパク質によって血液中で運搬される。ＬＤＬは肝臓 の処で合成され、末梢組織にコレステロールを供給し得る。逆に、ＨＤＬは末梢 組織の処のコレステロールを捕獲して肝臓に運搬し、肝臓でコレステロールを貯 蔵及び／または分解する。 最も数多く見られる異常脂血症は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステ ロールの濃度が高いことを特徴とする異常脂血症及び低アルファリポタンパク質 血症である。低アルファリポタンパク質血症の特徴は、ＨＤＬ（高密度リポタン パク質）コレステロールの濃度が３５ｍｇ／ｄｌ未満を示すことであり、異常脂 血症の症例の４０％が低アルファリポタンパク質血症である（Ｇｅｎｅｓｔら， １９９２）。低アルファリポタンパク質血症は、ＨＤＬ粒子の合成、成熟、異化 に関与する１種または複数のタンパク質の遺伝的欠損に関連していると考えられ 、その結果としてしばしば若年性心血管疾患を発症させる（Ｄａｍｍｅｒｍａｎ ｎら，１９９５）。一般に、これらの心血管疾患の発症率とＨＤＬ粒子の濃度と の間には逆相関関係が存在する（Ｍｉｌｌｅｒら，１９８７）。 心血管疾患に対するＨＤＬの保護作用は、アテローム性動脈硬化症の病変が発 生し易いマウス株に対するｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子導入実験で証明された。ＨＤ Ｌ粒子の数を増加させることによってこれらのマウスで病変の発生が阻害される ことが判明した（Ｒｕｂｉｎら，１９９１；Ｐｌｕｍｐら，１９９４）。ＨＤＬ 粒子の保護作用は、ＨＤＬ粒子が有しているコレステロール逆輸送の機能によっ て得られると解釈されている（Ｒｅｉｃｈｅら，１９８９）。逆輸送は、過剰の コレステロールを除去するためにコレステロールを末梢組織から肝臓に運搬する 過程である（図１）。この過程は、コレステロールをＨＤＬ粒子に取込んでエス テル化する段階、低密度リポタンパク質粒子に転移させる段階、次いで該粒子を 再び肝臓で捕集する段階とから成る一連段階を含み、この過程においては勿論、 ＣＥＴＰのような複数のタンパク質、コレステロールアシルトランスフェラーゼ 及び肝性リパーゼのような酵素、及び／または、アポリポタンパク質ＡＩ及びＡ ＩＶのようなその補因子が使用されている。 低脂血症薬及び抗高血圧薬に基づいてＬＤＬコレステロール及びトリグリセリ ドの濃度を低下させる有効な治療方法は存在 しているが、低アルファリポタンパク質血症に対しては現行の治療方法では高い 治療効率は望めない。 本発明は特に、低アルファリポタンパク質血症関連症状の遺伝子治療に関する 。 本発明によって適用される治療方法は、アテローム性動脈硬化症の病変の退行 を誘導するためまたは病変の形成を予防するためにコレステロールの逆輸送速度 を増加させることを目的とする。この目的は、治療すべき細胞中でコレステロー ルの逆輸送レベルに関与する少なくとも２つのタンパク質、酵素または補因子を 有効に同時発現させる本発明によって有利に達成される。 本文中の定義に使用された“コレステロールの逆輸送に関与するタンパク質、 酵素及び／またはその補因子の１つ”という表現は、細胞中のそれらの濃度の変 調がコレステロールの逆輸送過程に自動的に影響していることを意味する。 該当する酵素の代表例として特に、レシチン−コレステロールアシルトランス フェラーゼ及び肝性リパーゼを挙げることができる。 レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣ ＡＴ）は、肝臓によって合成される６７ｋＤａの糖タンパク質であり、レシチン のアシル基がコレステロールに転移するのを触媒し、リゾホスファチジルコリン とコレステロールエステルとを産生する（Ｇｌｏｍｓｅｔ，１９６８）。この酵 素の補因子はＨＤＬ粒子の表面に結合したアポリポタンパク質ＡＩである。アポ リポタンパク質ＡＩは、末梢細胞とＨＤＬとの間のコレステロールの濃度勾配を 維持することによってコレステロールの逆輸送の第一段階で主要な役割を果たす 。 ヒトの肝性リパーゼ（ＬＨ）は肝細胞によって合成及び分泌されるトリグリセ リドヒドロラーゼ活性及びホスホリパーゼ活性をもつ６６ｋＤａの糖タンパク質 である。肝性リパーゼはプロテオグリカンヘパリン硫酸を介して肝細胞の表面に 結合することによってキロミクロン、ＩＤＬ（中密度リポタンパク質）及びＨＤ Ｌの代謝に関与している。ＬＨは大粒のＨＤＬ粒子に対して特に高い親和性を有 しており、ＨＤＬのリン脂質及びトリグリセリドを分解し、細胞コレステロール 受容性をもつ円板状ＨＤＬ粒子を形成させる。ヒトのＬＨ欠乏は、トリグリセリ ド富化ＬＤＬの増量、ＨＤＬ粒子の肥大化、若年性アテローム性動脈硬化症の発 症、などの特徴を示す（Ｈｅｇｅｌｅら， １９９３）。 タンパク質に関して考察すると、本発明で使用されたタンパク質なる用語は好 ましくは、コレステロールエステル運搬タンパク質（ＣＥＴＰ）、アポリポタン パタ質ＡＩ及びＡＩＶまたはそれらの変異体の１つを意味する。 コレステロールエステル運搬タンパク質（ＣＥＴＰ）は、脂肪組織及び肝臓で 合成される７４ｋＤａの糖タンパク質である。この糖タンパク質は血漿中で主と してＨＤＬに会合する。即ち、ＣＥＴＰはＨＤＬのコレステロールエステルが低 密度リポタンパク質に転移するのを触媒する。この転移後に、低密度リポタンパ ク質のトリグリセリドがＨＤＬに移行する。高トリグリセリド血症のトランスジ ェニックマウスの体内でＣＥＴＰを超発現させると、アテローム性動脈硬化症の 病変の発生が阻害される（Ｈａｙｅｋら，１９９５）。この実験は、ＣＥＴＰの 欠損した個体で若年性心血管疾患の発生が観察されるという所見と一致する（Ｚ ｈｏｎｇら，１９９６）。 アポリポタンパク質ＡＩは、分子量２８，０００ダルトンをもつ２６７残基の プレプロペプチドの形態で合成される２４３個のアミノ酸から成るタンパク質で ある。アポリポタンパク質 ＡＩはヒト体内では肝特異的及び服特異的に合成され、ＨＤＬ粒子の必須タンパ ク質を構成している（ＨＤＬ粒子のタンパク質の７０重量％）。ＡＩは血漿中に 多量に存在する（１．０〜１．２ｇ／リットル）。生化学的な面で最も特徴的な ＡＩの作用は、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ ）を活性化することであるが、特に細胞コレステロールの流出の刺激のような多 くの別の活性もＡＩに起因する。アポリポタンパク質ＡＩはコレステロールの逆 輸送に関連することによってアテローム性動脈硬化症の防止に重要な役割を果た す。１８６３ｂｐの長さをもつＡＩの遺伝子はクローニングされ配列決定されて いる（Ｓｈａｒｐｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（９）（１ ９８４）３９１７）。アポリポタンパク質ＡＩ型の活性をもつタンパク質性産生 物としては特に従来技術に記載された天然変異体がある。 アポリポタンパク質ＡＩＶ（アポＡＩＶ）は、３９６残基の前駆体の形態で脳 特異的に合成される３７６個のアミノ酸から成るタンパク質である。ＡＩＶの生 理学的作用としては、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（Ｌ ＣＡＴ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化すること（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ら，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２２５８−２２６４）、及 び、アポリポタンパク質ＡＩと同様に、ウシの大動脈内皮細胞に対するＨＤＬ粒 子の結合を妨害すること（Ｓａｖｉｏｎら，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．，２５７：４１７１−４１７８）が知られている。これらの２つの活性は 、アポＡＩＶがコレステロールの逆輸送のメディエーターとして介在する可能性 が極めて大きいことを示唆する。アポＡＩＶの遺伝子はクローニングされ、先行 技術に記載されている（特に国際特許ＷＯ９２／０５２５３）。アポリポタンパ ク質ＡＩＶ型の活性を有するタンパク質性産生物としては特にフランス特許出願 ＦＲ９２／００８０６に記載のフラグメント及び誘導体がある。 より詳細には本発明は、コレステロールの逆輸送に関与する酵素、タンパク質 及び／または補因子をコードする少なくとも２つの核酸を導入し発現させ得る組 換えウイルスの使用に関する。 予想外にも出願人は、少なくとも２つの核酸をバイシストロンユニットの形態 で同一組換えウイルスに組込むことによって、同一組換えウイルスによる核酸の 導入及び発現を有効に確保で きることを証明した。治療目的に使用する場合、２つのウイルスよりも１つのウ イルスだけを使用するほうが利点が多いことは明らかである。 先ず、２つの組換えウイルスの各々を構築するよりも２つの遺伝子を組込んだ １つの組換えウイルスを構築するほうが有利である。 また、請求の範囲に記載のようなベクターを治療目的で使用することによって 遺伝子発現に必要な組換えウイルスの量を半減させることができる。これは、組 換えウイルス感染細胞で免疫応答が頻発したという従来の結果を考慮すると極め て有利であることが理解されよう。免疫応答は通常は感染細胞の破壊及び／また は重大な炎症性応答として現れる。これらの２つの徴候が治療用遺伝子の発現持 続の観点から極めて不利であり、従って期待される治療効果の観点からも極めて 不利であることは明らかである。 最後に、異なる２つの組換えウイルスの等濃度の有効な導入は不確実なイベン トであり、従って、補足的な操作による調節が必要である。本発明の組換えウイ ルスを使用する場合、この種の調節を削除できるという利点が得られる。 請求の範囲に記載のウイルスは、かなりの期間にわたって細胞障害作用を伴う ことなく、コレステロールの逆輸送に関与するタンパク質、酵素及び／または補 因子をコードする２つの核酸を有効に導入及び発現し得る。 従って本発明の第一の目的は、コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素 、タンパク質及び／または補因子をコードする少なくとも２つの核酸を含む欠陥 組換えウイルスを提供することである。核酸は転写プロモーターに作動的に連結 され、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列によって互いに隔 てられている。 核酸は好ましくは、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（Ｌ ＣＡＴ）、コレステロールエステル運搬タンパク質（ＣＥＴＰ）、肝性リパーゼ （ＬＨ）、アポリポタンパク質ＡＩ及びＡＩＶまたはそれらの変異体のいずれか １つの全配列または一部配列をコードする遺伝子から選択される。 挿入される核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）フラグメント、ゲノムＤＮＡ（ ｇＤＮＡ）フラグメント、または、例えば１つもしくは複数のイントロンが挿入 されたｃＤＮＡから成るハイブリッド構築物でよい。また、合成配列でもよく半 合成配列で もよい。上記のように、コレステロールの逆輸送に関与する酵素、タンパク質及 び／または補因子またはそれらの変異体のいずれか１つの全配列または一部配列 をコードする遺伝子でもよい。本発明で使用された変異体なる用語は、注目のタ ンパク質性産生物及び場合によってはそれぞれの天然変異体の生物学的特性の少 なくとも１つを有している任意の突然変異体、フラグメントまたはペプチドを意 味する。 これらのフラグメント及び変異体は、当業者に公知の任意の技術、特に、遺伝 的及び／または化学的及び／または酵素的修飾によって得られる。遺伝的修飾は 削除、欠失、突然変異、などを包含する。 本発明の定義によれば、挿入された核酸なる用語は好ましくは、対応するヒト の酵素、タンパク質及び／または補因子の全体または一部をコードする遺伝子を 意味する。より好ましくはｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを意味する。 挿入された核酸の各々はまた、活性化配列、調節配列などを含み得る。更に、 核酸の各々は一般に、合成されたポリペプチドをターゲット細胞の分泌経路に案 内するシグナル配列をコーディング配列の上流に含んでいる。このシグナル配列 は天然の シグナル配列でもよいが、他の任意の機能性シグナル配列でもよく、または人工 のシグナル配列でもよい。 本発明の特定実施態様によれば、請求の範囲に記載された組換えウイルスは、 ＬＣＡＴをコードする核酸を少なくとも含む。より好ましくは、挿入された第二 の核酸はＬＨ、ＣＥＴＰまたはＡｐｏＡＩをコードしている。 上述のように、注目の２つの核酸の同時発現は、単一のＲＮＡを予め形成し、 次いで翻訳して２つの酵素の各々を産生させることによって行われる。これらの 目的で、組換えウイルスは２つの核酸配列に加えて、少なくとも転写プロモータ ーとポリアデニル化部位とＩＲＥＳ配列とを取込んでいる。 バイシストロンｍＲＮＡを作製し該ｍＲＮＡから２つの酵素の各々の発現を誘 導するように、転写プロモーターは２つのコーディング核酸に作動的に連結され ている。本発明の好ましい実施態様によれば、転写プロモーターは第一の核酸の 直ぐ上流に配置されている。 この転写プロモーターは特に、プロモーター配列が感染細胞中で機能し得ると いう条件があるならばプロモーター配列の下流に配置された核酸を発現させる核 酸固有のプロモーター配列 から選択され得る。転写プロモーターはまた、異なる起原の配列でもよい（他の タンパク質の発現を担当する配列でもよく、または合成配列でもよい）。特に、 真核生物の核酸配列またはウイルスの核酸配列でもよく、または、特異的もしく は非特異的及び誘導的もしくは非誘導的に遺伝子の転写を促進または抑制する誘 導配列でもよい。例えば、感染対象細胞のゲノムに由来のプロモーター配列また はウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でもよく、特に、アデノウイルス の遺伝子Ｅ１Ａ、ＭＬＰのプロモーター、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶ、ＭＴ−１、 ＳＶ４０のプロモーターでよい。真核性プロモーターとしては、遍在性プロモー ター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラ メントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ など）、治療用遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子など） 、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、腸の脂肪酸結合タン パク質のプロモーター、平滑筋細胞のαアクチンのプロモーター、肝特異的プロ モーター；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、ヒトアルブミンなど）または、刺激に応 答するプロモーター（ステロイドホルモンのレセプター、レチノ ール酸のレセプターなど）がある。更に、活性化配列、調節配列などの付加によ ってこれらの発現配列を修飾してもよい。 ＩＲＥＳ配列に関して考察すると、この配列は好ましくはピコルナウイルスに 由来する。より特定的にはピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列は脳心筋炎ウイルス またはポリオウイルスに由来する。より好ましくは、ＮＯＶＡＧＥＮのベクター ｐＣＩＴＥ−２ａ＋中に存在する脳心筋炎ウイルスに由来のフラグメントを用い る。 分かり易く表現するために、転写プロモーターと２つの核酸とポリアデニル化 部位と２つの核酸の間に存在するＩＲＥＳ配列とによって形成された構築物を以 後の記載ではバイシストロンカセットと呼ぶ。 本発明のウイルスは欠陥ウイルスである。即ち、ターケット細胞中で自立複製 することができない。従って本発明の範囲内で使用される欠陥ウイルスのゲノム においては一般に、感染細胞中でこのウイルスが複製するために必要な配列が少 なくとも欠損している。これらの領域は、（その全体または一部が）除去されて いてもよく、非機能になっていてもよく、別の配列特に上記に定義のバイシスト ロンカセットによって置換されてい てもよい。しかしながら、欠陥ウイルスがウイルス粒子のキャプシド形成に必要 なゲノムの配列を保存しているのが好ましい。 本発明のウイルスはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）またはレ トロウイルスに由来し得る。好ましい実施態様によれば、ウイルスはアデノウイ ルスである。 アデノウイルスには構造及び特性が多少異なるの種々の血清型が存在する。本 発明ではこれらの血清型のうちのヒトアデノウイルス２型もしくは５型（Ａｄ２ もしくはＡｄ５）または動物起原のアデノウイルスの使用が好ましい（国際特許 出願ＷＯ９４／２６９１４参照）。本発明の範囲で使用できる動物起原のアデノ ウイルスとしては、イヌ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例え ばＳＡＶ）起原のアデノウイルスかある。動物起原のアデノウイルスは、好まし くはイヌのアデノウイルス、好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２〔例えばマンハ ッタン株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）〕である。本発明の範 囲内では好ましくはヒトもしくはイヌ起原のアデノウイルスまたは混合アデノウ イルスを使用する。 好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノム中の少なくとも領域Ｅ１が非機 能である。注目のウイルス遺伝子を当業者に公知の任意の技術、特に、注目の１ つまたは複数の遺伝子中の１つまたは複数の塩基の完全削除、置換、部分欠失ま たは付加によって非機能にし得る。このような修飾は、例えば遺伝子工学の技術 または突然変異誘発物質を用いた（単離ＤＮＡの）ｉｎ ｖｉｔｒｏ処理または ｉｎ ｓｉｔｕ処理によって得られる。更に、他の領域、特に領域Ｅ３（ＷＯ９ ５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５ ２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（ＷＯ９５／０２ ６９７）を修飾してもよい。好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウイル スは少なくとも領域Ｅ１の欠失及び領域Ｅ３の欠失を含む。本発明のウイルスの 領域Ｅ１の欠失は好ましくはアデノウイルスＡｄ５の配列のヌクレオチド４５５ から３３２９までの範囲である。好ましい別の実施態様によれば、バイシストロ ンカセットが領域Ｅ１の欠失の処に挿入されている。 従って本発明の特定実施態様は、コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵 素、タンパク質及び／または補因子をコード する少なくとも２つの核酸を含むことを特徴とする欠陥組換えアデノウイルスに 関する。この核酸は転写プロモーターに作動的に連結されており、内部リボソー ム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられている。 本発明の好ましい組換えアデノウイルスとしては特に、ＬＣＡＴをコードする 核酸とＬＨ、ＣＥＴＰまたはＡｐｏＡＩをコードする核酸とを少なくとも含む欠 陥組換えアデノウイルスがある。この核酸は転写プロモーターに作動的に連結さ れており、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔 てられている。 これらのアデノウイルスの代表例は特に、ｐＸＬ２９７４とｐＸＬ２８２２と の間の相同組換えによって得られたＬＣＡＴ及びＣＥＴＰをそれぞれコードする 遺伝子を含む図２に示すようなアデノウイルスである。 本発明の欠陥組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術によって作製 できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ＥＰ１８５ ，５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特にこれ らのアデノウイルスは、アデノウイルスと最も好ましくはバイシストロン カセットを含むプラスミドとの間の相同組換えによって作製され得る。アデノウ イルスとプラスミドとを適当な細胞系に共トランスフェクションすることによっ て相同組換えを惹起する。使用される好ましい細胞系は、（ｉ）上記要素によっ て形質転換可能な細胞系、及び、（ｉｉ）欠陥アデノウイルスのゲノムの部分を 相補し得る配列を、好ましくは組換えが生じる危険性のない組込み形態で含む細 胞系、である。細胞系の例としては特に、アデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側 部分（１２％）が細胞系のゲノムに組込まれたヒト２９３腎胚細胞系（Ｇｒａｈ ａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）、または、特に国際 特許出願ＷＯ９４／２６９１４及びＷＯ９５／０２６９７に記載されているよう なＥ１及びＥ４の機能を相補し得る細胞系がある。次いで、増殖したアデノウイ ルスを実施例に示すように分子生物学の慣用技術によって回収し精製する。 しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば、請求の範囲に記載のアデ ノウイルスを国際特許出願ＷＯ９６／２５５０６に記載の独創的な方法で作製す る。該特許出願では、そのゲノム中に本来は存在しない１つまたは複数の制限酵 素部位に 隣接（フランキング）された組換えアデノウイルスゲノムを含む原核性プラスミ ドをシャトルプラスミドとして使用している。このプロトコルは特に図２に示さ れている。この方法の利点は、ウイルスゲノムの別の部分を付与する第二の構築 物が不要なこと及びトランス相補細胞系中の組換え段階が不要なことである。 本発明のより特定的な第二の目的は、請求の範囲に記載のアデノウイルスの産 生に使用される特定の原核性プラスミドを提供することである。 本発明の好ましい実施態様によれば、これらの原核性プラスミドは上記のよう なバイシストロンカセットを組込んでいる。 本発明のより特定的な別の目的は、アデノウイルスのゲノムとコレステロール の逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする少 なくとも２つの核酸とを含む原核性プラスミドを提供することである。２つの核 酸は転写プロモーターに作動的に連結されており、内部リボソーム侵入部位ＩＲ ＥＳをコードする配列によって互いに隔てられている。 好ましくは本発明の原核性プラスミドは、原核細胞中で複製可能な第一領域と 、アデノウイルスゲノム中に存在しない１つまたは複数の制限部位に隣接された アデノウイルスゲノムを含 む第二領域とを有しており、第二領域内に、コレステロールの逆輸送に関与する 別々の酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする少なくとも２つの核酸 が存在し、これらの２つの核酸は転写プロモーターに作動的に連結されており、 内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられてい る。 コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または補因 子、転写プロモーター、ポリアデニル化部位及びＩＲＥＳ配列の定義及びカセッ ト内部におけるそれらの編制に関しては、上記の記載から明らかであろう。 原核細胞中で複製できるように請求の範囲に記載のプラスミドが含んでいる複 製可能領域は、選択された細胞中の任意の機能性複製起点でよい。大腸菌ポリＡ 株中で複製できるＰ不適合グループのプラスミド（例えばｐＲＫ２９０）に由来 の複製起点でもよい。より一般的に、原核細胞中で複製するプラスミドに由来の 任意の複製起点でよい。このプラスミドは、ＲＫ２の誘導体、ｐＢＲ３２２（Ｂ ｏｌｉｖａｒら，１９７７）の誘導体、ｐＵＣ（Ｖｉｅｒａ ＆ Ｍｅｓｓｉｎ ｇ，１９８２）の誘導体または同じ不適合グループに由来する他のプラスミド、 即ちＣｏｌＥ１またはｐＭＢ１などでもよい。これらのプラスミドは更に、大脳 菌中で複製し得る別の不適合グループから選択されてもよい。また、例えば不適 合グループＡ、Ｂ、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＨＩ、Ｈ１１、Ｉ１、Ｉ ２、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、ＯＦ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｘ、Ｙ,、Ｚまたは９に属す るプラスミドから誘導されたプラスミドでもよい。また、大隅菌中では複製でき ないがＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐ．ｕｔｉｄａ、Ｐ ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉ ｓ 、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ のような他の宿主中では複製し得る別のプラスミドも使用できる。好ましくは、 大腸菌中で複製するプラスミドに由来の複製起点を使用する。 前述のように、本発明のプラスミド中に存在するアデノウイルスゲノムは完全 ゲノムまたは機能性ゲノムが有利である。即ち、選択されたキャプシド形成細胞 系中でウイルス株を産生さ せるために組換えまたは結合によって別の領域を付加する必要がないゲノムが有 利である。 好ましくは組換えアデノウイルスゲノムはＩＴＲ配列とキャプシド形成配列と を少なくとも含む。本発明の好ましい実施態様では、使用されるアデノウイルス のゲノムの領域Ｅ１の全体または一部が欠失している。好ましくは、使用される アデノウイルスのゲノムの領域Ｅ１のヌクレオチド４５４から３３２８までの範 囲（ＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント）または３８２から３４４６までの範 囲（ＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメント）が欠失している。 特に有利な実施態様によれば、使用されるアデノウイルスのゲノムはまた、領 域Ｅ３及び／または領域Ｅ４の全体または一部が欠失している。本発明の特定実 施態様によれば、領域Ｅ１及びＥ３が欠失したアデノウイルスゲノムが使用され る。 より詳細には、請求の範囲に記載の原核性プラスミドは、５’から３’の方向 に、原核細胞中の機能性複製起点と、ウイルスのＩＴＲ配列及びψ配列とを含む アデノウイルスゲノムの第一部分と、転写プロモーターと、コレステロールの逆 輸送に関与する１つの酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする 第一の核酸と、ＩＲＥＳ配列と、コレステロールの逆輸送に関与する第二の酵素 、タンパク質及び／または補因子をコードする第二の核酸と、ポリアデニル化部 位と、領域ｐＩＸ−ＩＶＡ２を含むアデノウイルスゲノムの第二部分とを含んで いる。 好ましくは、請求の範囲に記載された本発明の原核性プラスミドはまた、該プ ラスミドを含む原核細胞の選択を可能にする領域を含む。この領域は特に、物質 耐性、特に抗生物質耐性を与える任意の遺伝子から構成され得る。例えば、分子 生物学で常用のカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ） 、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔｒ）、またはスペクチノマイシン耐性などを与 える核酸配列を利用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。プラスミドを選択 するために、抗生物質耐性マーカーをコードする遺伝子以外の核酸配列を用いて もよい。このために一般には、細菌がもはや有していない機能（これは染色体か ら欠失した遺伝子または不活性になった遺伝子に相当する）を細菌に与える遺伝 子が用いられ、プラスミドに担持された該遺伝子はこの失われた機能を回復する 。一例として、欠損染色体機能を回復する転移ＲＮＡの遺伝子を用いる（Ｓｏｍ ｏｅｓら，１９９１）。 好ましい実施態様によれば、請求の範囲に記載の原核性プラスミドはＬＣＡＴ をコードする少なくとも１つの核酸を含み、第二の核酸はＣＥＴＰ、ＬＨまたは ＡｐｏＡＩをコードする核酸から選択される。 これらの原核性プラスミドの代表例としては特に、それぞれ図４及び図６に示 すプラスミドｐＸＬ２９７４及びｐＸＬ３０５８がある。プラスミドｐＸＬ２９ ７４は、５’から３’の方向に、複製起点と、スペクチノマイシン耐性遺伝子と 、ショ糖感受性のＳａｃＢ遺伝子と、ウイルスのＩＴＲ配列及びψ配列と、ＲＳ Ｖプロモーターと、ＩＲＥＳによって隔てられた２つのトランスジーンＬＣＡＴ 及びＣＥＴＰと、ポリアデニル化部位と、ウイルス配列ｐＩＸ及びＩＶＡ２とを 含む。プラスミドｐＸＬ３０５８は、５’から３’の方向に、複製起点と、カナ マイシン耐性遺伝子と、ウイルスのＩＴＲ配列及びψ配列と、ＲＳＶプロモータ ーと、ＩＲＥＳによって隔てられた２つのトランスジーンＬＣＡＴ及びイントロ ン＋ＡｐｏＡＩと、ポリアデニル化部位と、ウイルス配列ｐＩＸ及びＩＶＡ２と 、ショ糖感受性のＳａｃＢ遺伝子とを含む。 本発明はまた、上記の原核性プラスミドの構築に使用するた めの、本発明によって定義されたバイシストロンカセットを更に含むプラスミド 構築物に関する。 請求の範囲に記載された本発明の原核性プラスミドは特に、本発明によって定 義されたバイシストロンカセット、即ち、コレステロールの逆輸送に関与する別 々の２つの酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする２つの核酸に作動 的に連結された転写プロモーターをコードする配列と、ポリアデニル化部位と、 上記核酸間に配置されたＩＲＥＳ配列とを含む出発シャトルプラスミドの形質転 換によって作製され得る。 これらのシャトルプラスミドの代表例は特に、図３及び図５にそれぞれ示すプ ラスミドｐＸＬ２９７０及びｐＸＬ２９８４である。 コレステロールの逆輸送に関与する酵素、転写プロモーター及びＩＲＥＳ配列 の定義、並びに、カセット内部におけるそれらの編制に関しては上記の記載から 明らかである。 本発明の別の目的は、上記に定義したような原核性プラスミドを含む任意の原 核細胞に関する。このような原核細胞は特に、組換えＤＮＡを該原核細胞に導入 するために好適なベクター系が現存するような任意の細菌である。例えば、Ｅｓ ｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ ｃｏｌｉ 、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉまたはＳｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ 属の細菌がある。これらの細胞は当業者に公知の技術を用いた 形質転換によって有利に得られる。 本発明の目的はまた、低アルファリポタンパク質血症、特にアテローム性動脈 硬化症及び／または再発狭窄症に関連する症状の治療用または予防用の医薬組成 物を製造するために上記に定義の組換えウイルス、欠陥組換えアデノウイルスま たはシャトルプラスミド構築物を使用することである。 本発明はまた、上記のアデノウイルスのような１つまたは複数の欠陥組換えウ イルスを含む医薬組成物に関する。このような組成物は、外用、経口、非経口、 鼻孔内、静注、筋肉内、皮下、眼内、などの経路で投与する剤形に製造される。 好ましくは本発明の組成物は、医薬として許容される注射剤用ビヒクルを含有 する。組成物は特に、等張性で無菌の塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二 ナトリウム、塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこれ らの塩の混合物）、あるいは、必要に応じて無菌水もしくは生理的血清を添加す ることによって注射可能な溶質を復元し得る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物の 形態である。 注射によって投与されるウイルスの用量は、種々のパラメーター、特に、使用 される投与形態、関連する症状または所望の治療期間に応じて決定される。一般 には、本発明の組換えウイルスを、１０4〜１０14ｐｆｕ／ｍｌの用量の剤形に 製造して投与する。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語は、ビリオン葱濁 液の感染能力に相当し、適当な細胞培養物を感染させ、通常は４８時間後に感染 細胞プラークの数を測定することによって決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価 の測定技術は文献にも十分に記載されている。 本発明は、低アルファリポタンパク質血症に関連する症状の治療または予防、 特に心筋梗塞、アンギナ、突然死、心不全、脳血管発作、アテローム性動脈硬化 症または再発狭窄症のような心血管疾患の分野で極めて有効な新規な手段を提供 する。 更に、この治療はまたヒトだけでなく、ヒツジ、ウシ、愛玩 動物（イヌ、ネコなど）、ウマ、魚類などにも適応する。 以下の実施例に基づいて本発明を更に充分に説明する。これらの実施例は本発 明の代表例であると考えられるべきであり、本発明がこれらの実施例に限定され ると考えてはならない。図面の簡単な説明 図１は、コレステロールの逆輸送の推定メカニズムを表す概略図である。 図２は、大腸菌中の相同組換えによるアデノウイルスの産生プロトコルの説明 図である。 図３は、ＲＳＶ−ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰを含むバイシストロンシャト ルプラスミドｐＸＬ２９７０の構築プロコトルを表す。 図４は、ＲＳＶ−ＬＣＡＴ−ＴＲＥＳ−ＣＥＴＰを含む原核性プラスミドｐＸ Ｌ２９７４の構築プロコトルを表す。 図５は、ＲＳＶ−ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＬＨを含むプラスミドｐＸＬ２９８４ の構築プロコトルを表す。 図６は、ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ−ＩＲＥＳ−ＬＣＡＴを含む原核性プラスミドｐ ＸＬ３０５８を表す。材料及び方法 Ｉ−１．材料 （１）バイシストロン組換えアデノウイルスＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰ、Ｌ ＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＬＨ及びＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＡｐｏＡＩを構築するために 以下のプラスミドを使用した： −ｐＳＫ ＩＲＥＳ（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）； −ｐＸＬ２６１６ ｃＤＮＡ ＬＣＡＴ（Ｓｅｇｕｒｅｔ−Ｍａｃｅら，Ｃｉ ｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９６，９４（９）：２１７７−２１８４）； −ｐＣＲＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから市販）； −ｐＸＬ２７９４（国際特許ＷＯ９６／２５５０６）； −ｐＸＬ２７５７（国際特許ＷＯ９６／２５５０６）。 （２）肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞から得られた全ＲＮＡ。 （３）アデノウイルスのＥ１タンパク質をコードする遺伝子を含むヒト２９３腎 細胞（Ｇｒａｈａｍら，１９７７）。 （４）遺伝子型ＥｎｄＡ１，ｒｅｃＡ１，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，Ｉ−， ｔｈｙ−１，ｇｙｒＡ，ｒｅｌＡ１，ｌａｃＺＤ Ｍ１５，ｄｅｏＲ+，Ｆ+，ｄ ａｍ+，ｄｃｍ+をもつ大腸菌サブタイプＤＨ５α（Ｗｏｏｄｃｏｃｋら，１９８ ９）。 （５）酵素及び制限バッファはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入 手する。Ｉ−２．方法 分子生物学の汎用技術 プラスミドＤＮＡの分取的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、 アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル上の電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ フラグメントの精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール／クロロホルム 抽出、塩培地中のＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノールによる沈殿、大腸 菌の形質転換、などの分子生物学で慣用の方法は当業者に公知であり、文献にも 詳細に記載されている〔Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（ｅｄｓ．），“ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７〕 。 ｐＢＲ３２２、ｐＵＣの系統のプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市 販されている（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）。 結合のためには、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって ＤＮＡフラグメントをサイズに基づいて分離し、フェノールまたはフェノール／ クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈殿させ、次いで製造業者の指示通り に用いたＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュ ベートする。 大胴菌のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製 造業者の指示通りに用いて５’突出末端を埋め戻す。製造業者の指示通りに用い たＴ４ファージのＤＮＡポリメラーゼの存在下で３’突出末端を破壊する。ヌク レアーゼＳ１による調節処理によって５’突出末端を破壊する。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発は、 Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら〔Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４〕に よって開発された方法に従って行う。 いわゆるＰＣＲ法〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８ ５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．＆ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０〕によるＤＮＡ フラグメントの酵素増幅は、“ＤＮＡサーマルサイクラー”（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示通りに使用して行う。 ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキット を使用し、Ｓａｎｇｅｒらによって開発された方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７〕によって行う。細胞培養技術 （ａ）細胞の培養 ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＳＶＦ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を加え たイーグル培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で５％ＣＯ2下、３７℃で培養 する。（ｂ）培養細胞のトランスフェクション １００ｍｍのシャーレを使用し、１０％のウシ胎仔血清を加 えたＭＥＭ培地で培養した２９３細胞に１μｇのＤＮＡをリポフェクトアミン（ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によってトランスフェクトする。６時間後、培地を除去し 、細胞を完全培地（ＭＥＭ＋１０％ＳＶＦ）中でインキュベートする。トランス フェクションの７２時間後、組換えプラスミドＲＳＶ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−Ｃ ＥＴＰ）ＲＳＶ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＡｐｏＡＩ及びＲＳＶ ＬＣＡＴ−ＩＲ ＥＳ−ＬＨとβ−ガラクトシダーゼ対照とについて、それぞれがトランスフェク トした細胞の培養上清とトランスフェクトしなかった細胞の培養上清とを回収し 、４℃で保存した。ヒト血漿を対照として使用し、細胞上清の１０〜３０μｌの 画分を用いて酵素ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、ＡｐｏＡＩ及びＬＨの活性試験を実施し た。（ｃ）組換えアデノウイルスの産生及び精製 大脳菌中の相同組換えによってバイシストロンアデノウイルスＤＮＡを作製す る。次いで、このＤＮＡをＰａｃＩによって直鎖化し、２９３細胞にトランスフ ェクション後にウイルスを産生させる。タンパク質Ｅ１に対してトランス相補性 の２９３細胞に１０μｇの直鎖化したアデノウイルスＤＮＡをリポフェクトアミ ンによってトランスフェクトする。４％のＳＶＦを補 充したＭＥＭ培地中の２９３細胞を寒天で被覆した後、３７℃で８日間インキュ ベートし、組換えウイルスを含むプラークを採取してその制限プロフィルを分析 する。（ｄ）培養細胞の感染 バイシストロン組換えアデノウイルスを含む０．２５、０．５及び１ｍｌの上 清で、約４×１０5の２９３細胞を含む１２ウェルのプレートに感染させる。２ ％のＳＶＦを補充した２ｍｌのＭＥＭ中で７２時間インキュベーション後、感染 細胞の上清を採取し、酵素活性を定量する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果の生化学的有効性の評価 （ａ）ＬＣＡＴ活性の定量 ＬＣＡＴ活性は、Ｃｈｅｎら（１９８２）によって記載された手順に従い、基 質としてプロテオリポソームを用いて遊離14Ｃ−コレステロールからエステル化 １４Ｃ−コレステロールへの変換を測定することによって定量する。ホスファチ ジルコリン、コレステロール、14Ｃ−コレステロール及びアポリポタンパク質Ａ Ｉからプロテオリポソームを調製し、被験トランスフェクション培養物の２０μ ｌの培養上清と共にインキュベーションを行う。反応生成物（遊離14Ｃ−コレス テロール及びエステル 化14Ｃ−コレステロール）を薄層クロマトグラフィーで有機溶媒中の溶解度の違 いを利用して分離し、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｉｍａｇｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用 したオートラジオグラフィーによって検出する。ＬＣＡＴ活性は、２０μｌの被 験上清中の１時間あたりにエステル化される14Ｃ−コレステロールのパーセンテ ージで表される。（ｂ）ＣＥＴＰ活性の定量 ＣＥＴＰ活性は、高密度リポタンパク質粒子（ドナー）から低密度リポタンパ ク質粒子（アタセプター）にコレステロールエステルを転移させる酵素の能力を 測定することによって定量する。この反応の基質としては、Ｗａｋ−Ｃｈｅｍｉ ｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ製の基質を用いる。ドナー粒子に含まれているコ レステロールのリノール酸エステルの蛍光はドナー粒子が天然状態のときには発 光しないが、蛍光分子からアクセプター粒子への転移を触媒し得る活性ＣＥＴＰ が存在するときにだけ５３５ｎｍで蛍光が検出される。ＣＥＴＰ活性は、３０μ １の被験培養上清が５３５ｎｍで放出する１時間あたりの蛍光強度の値で表され る。（ｃ）ＬＨ活性の定量 肝性リパーゼ活性は、Ｐｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨキット によって提供される合成トリグリセリド基質を使用して定量する。この基質は、 分子が天然状態のときにはトリニトロフェノールによって遮蔽されるが、分子が 加水分解されると４００ｎｍで蛍光を放出する蛍光性ピレン基を含む。被験サン プルと基質とのインキュベーション後に４００ｎｍで放出された蛍光強度を測定 し、キットによって提供される標準血漿に基づいて２０μｌの上清に含まれてい るＬＨの量（ピコモル／分）を推定し得る。（ｄ）アポリポタンパタ質ＡＩの定量 ＡｐｏＡＩ活性は、抗ＡｐｏＡＩモノクローナル抗体を使用して定量する。こ のために、４℃で一夜のインキュベーションを行ってＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩ（Ｄ ｙｎａｔｅｃｈ）プレートを抗ＡｐｏＡＩモノクローナル抗体（炭酸塩バッファ ｐＨ９．６中で１０ｍｇ／ｍｌ）によって被覆し、次いで２％のＰＳＡを含むＰ ＢＳ，ｐＨ７．４中で３７℃で一夜飽和させる。細胞上清を次に、２％のＢＳＡ を含むＰＢＳで任意に希釈した後、３７℃で１時間インキュベートする。次に、 １／５０００に希釈したペルオキシダーゼで標識した抗ＡｐｏＡＩモノクローナ ル抗体混合物と共に３７℃で１時間のインキュベーションを行うことによって検 出する。最後に、２５０μｌのＴＭＢ（ＫＰＬ）と共にインキュベーションし６ ３０ｎｍでプレートを読取ることによって抗体過酸化物の固定を検出する。シャトルプラスミドの構築技術 バイシストロンプラスミドの構築を図３から図５に詳細に示す。得られたバイ シストロンプラスミドは、ウイルスゲノムとの組換えに必要なアデノウイルス配 列ｐＩＸ−ＩＶａ２を含むという理由でシャトルプラスミドでもある。この組換 えは、ウイルスのβ−ガラクトシダーゼ（従来のシャトルベクター）の開裂ゲノ ムとの共トランスフェクション、または、大腸菌(ｃｏｌｉシャトルベクター)中 の二重組換えによって生じる。 種々のプラスミド構造の配列一致をそれらの制限プロフィルの分析によって検 査する。この検査によって、以後のクローニングに使用できる組換えクローンを 選択し、クローニング結果の有効性を評価できる。制限酵素は、クローニングさ れたｃＤＮＡの完全性及び戦略的クローニング部位の数に関してできるだけ充分 な情報が得られるように選択される。しかしながら、この検査では、クローニン グのどの段階でも生じる可能性があ る置換点突然変異またはナンセンス点突然変異のような突然変異の存在を排除す ることはできない。このような突然変異は、問題のｃＤＮＡの全配列決定によっ て初めて明らかになる。得られた構築物の最終の有効性検査は、ＬＣＡＴ、ＣＥ ＴＰ及びＬＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性の生化学的試験またはアポＡ−Ｉの存 在の検出によって行う。実施例１ ：シャトルプラスミドＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰの構築 １−従来のシャトルベクターｐＸＬ２９７０の構築 発現ベクターｐＸＬ２９６８ ＲＳＶ ＬＣＡＴ ポリＡｂＧＨは、ＬＣＡＴ のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＸＬ２６１６と、ウシ成長ホルモンのポリアデニ ル化シグナルの上流に位置しＲＳＶプロモーターのコントロール下にあるプラス ミドｐＸＬ ＬＰＬとを、制限酵素ＳａｌＩ及びＣｌａＩによって開裂し、得ら れたフラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合することによって得られる。 そのために、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡを補充したバッファ４（２ ０ｍＭの酢酸トリス、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム及 び１ｍＭのＤＴＴ）中で、 プラスミドｐＸＬ ＲＳＶ ＬＰＬ（２μｇ）及びｐＸＬ２６１６（２μｇ）の 各々を１０単位（ｕ）のＣｌａｌで３７℃で９０分間消化する。１００ｍＭのＮ ａＣｌと１０ｕのＳａｌＩとを添加し、３７℃で９０分間の反応混合物のインキ ュベーションを再度行う。０．７％のアガロースゲルで消化産物を電気泳動させ た後、ｐＸＬＲＳＶ及びＬＣＡＴのｃＤＮＡに対応する６．５ｋｂ及び１．７ｋ ｂのバンドをゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋキットによって抽出する。２ つのバンドは４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼで１４℃で一夜インキュベーショ ン後に結合する。 組換えプラスミドｐＸＬ２９６９ ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰは、ＮｃｏＩ部位の導 入によって５’末端を修飾したＣＥＴＰのＣＤＮＡをもつプラスミドｂｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔから、ＰＣＲプライマー５’ＧＣＣＴＧＡＴＡＡＣ ＣＡＴＧＧＴＧ ＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧ ３’（配列１）によって作製する。このようにして修飾 したプラスミドをＮｃｏＩ及びＳａｌＩによって開裂し、同じ制限酵素によって 開裂されたプラスミドｐＳＫＩＲＥＳに含まれているアデノウイルスの配列ＩＲ ＥＳの下流に以下の手順でクローニングする。 バッファ３（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣ１２、１００ｍＭ のＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴ）中で２．５μｇのプラスミドＣＥＴＰと２．５ μｇのプラスミドｐＳＫＩＲＥＳとを１０ｕのＮｃｏＩによって３７℃で９０分 間消化し、次いで１０ｕのＳａｌＩで３７℃で９０分間消化する。上記の条件と 同じ条件で消化産物を電気泳動させ、１．５Ｋｂｐのバンド（ＣＥＴＰのｃＤＮ Ａ）と３．５Ｋｂｐのバンドとを抽出し、結合させる。 プラスミドｐＸＬ２９７０を得るために以下の手順で処理する。 ４μｇのプラスミドｐＸＬ２９６８を１０ｕのＳａｌＩ（バッファ３＋ＢＳＡ 、３７℃で９０分）によって直鎖化する。次いで、ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋキ ットによって抽出し、５０℃に予熱した５０μｌの水に回収する。ＳａｌＩ開裂 によって生じた付着末端を５ｕのクレノウポリメラーゼと共に２５℃で１５分間 インキュベーションして平滑末端にする。ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋキットによ って再度抽出し、２ｕの仔ウシ固ホスファターゼ（ＣＩＰ）で３７℃で６０分間 処理することによって脱リン酸化する。プラスミドｐＸＬ２９６９（４μｇ） を、先ず５ｕのSｍａＩ（バッファ４、２５℃で９０分）で消化し、次いで５ｕ のＨｉｎｃＩＩ（バッファ３＋ＢＳＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、３７℃で９０分 ）で消化する。２つのプラスミドの消化産物を０．７％のアガロースゲルで電気 泳動させ、８．５ＫｂｐのＤＮＡバンド（ｐＸＬ２９６８）と２．２ＫｂｐのＤ ＮＡバンド（ＩＲＥＳ ＣＥＴＰのｃＤＮＡ）とをＱｉａｑｕｉｃｋキットで抽 出し、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合させる（図３）。 プラスミドｐＸＬ２９７０のＬＣＡＴ活性及びＣＥＴＰ活性をトランスフェク ション３日後の２９３細胞の培養上清で定量する。 このプラスミドのＬＣＡＴ活性は、１時間あたり３．５％のコレステロールエ ステルの形成に対応し、ＣＥＴＰ活性は１２０％に対応する（後出の表１）。こ れらの活性の値は、プラスミドｐＸＬ２９７０が触媒的に活性のＬＣＡＴ及びＣ ＥＴＰを合成することを示している。（２）シャトルプラスミド−ｃｏｌｉ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰ この技術ではシャトルベクターが、 −配列ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰを包囲している大脳菌中の相同組換えに 必要な逆方向末端反復配列ＩＴＲとキャプシド形成配列ψ； −大脳菌Ｃ２１１０株中でプラスミドを複製不能にし、その結果として組換え プラスミドをクローニング可能にする複製起点ｃｏｌ Ｅ１； −組換えクローンの選択を可能にするためのショ糖自殺遺伝子Ｂ（ショ糖培養 細菌を致死させる遺伝子）とスペクチノマイシン耐性遺伝子； を含んでいなければならない。 そのために、バイシストロンシャトルプラスミドｐＸＬ２９７０ ＲＳＶ Ｌ ＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰをＢＳｔＥＩＩ及びＳｐｅＩで開裂し、開裂部位に アデノウイルスゲノムのＩＴＲ配列及びψ配列を導入し、シャトルプラスミド− ｃｏｌｉを得る。プラスミドｐＸＬ２７９４をＢＳｔＥＩＩ及びＸｂａＩで消化 することによってＩＴＲ配列及びψ配列を単離する。 ｐＸＬ２７５７をＥｃｏＲＶ及びＳｍａＩで消化することによって得られたスペ クチノマイシン−ショ糖Ｂのカセットを含む平滑末端をもつフラグメントを、ｂ ＦｓｐＩで直鎖化したシャトルプラスミドｐＸＬ２９７０＋２７９４に導入した （図４）。 実験では以下のプロトコルで処理する。 ３μｇのプラスミドｐＸＬ２９７０を２０ｕのＢＳｔＥＩＩで消化し（バッフ ァ２：１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、 １ｍＭのＤＴＴ；６０℃で９０分）、次いで１０ｕのＳｐｅＩで消化する（３７ ℃で９０分）。 得られたＤＮＡフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋキットで抽出し、２ｕのＣＩ Ｐで脱リン酸化する（６０℃で９０分）。プラスミドｐＸＬ２７９４を２０ｕの ＢＳｔＥＩＩで消化し（バッファ２、６０℃で９０分）、次いで２０ｕのＸｂａ Ｉで消化する（３７℃で９０分）。６．５Ｋｂｐのバンド（ｐＸＬ２９７０）と ２．９Ｋｂｐのバンド（ｐＸＬ２７９４のＩＴＲ ψ及びＫａｎｒ）を電気泳動 後に抽出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させる（４０００ｕ）。 得られたプラスミドｐＸＬ２９７０＋２７９４（１．５μｇ） を５ｕのＦｓｐＩで開裂し（バッファ４、３７℃で６０分）、Ｑｉａｑｕｉｃｋ キットで抽出し、プラスミドｐＸＬ２７５７を１０ｕのＳｍａI（バッファ４、 ２５℃で９０分）及び１０ｕのＥｃｏＲＶ（３７℃で９０分）で順次に消化して 得られたカセットｓａｃＢ−ｓｐｅｃｔｒを含むゲルから抽出した３．８Ｋｂｐ のＤＮＡフラグメントに結合させる（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、４００ｕ）。 スペクチノマイシン培地及びスペクチノマイシン＋ショ糖培地でシャトルプラ スミドｐＸＬ２９７４ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰを一次選択する。Ｎｃｏ Ｉ（６．２＋３＋２．２＋２）、ＮｏｔＩ（１３．５Ｋｂｐ）及びＥｃｏＲＶ（ １＋３＋９．５Ｋｂｐ）消化の結果はこれらのプラスミドの制限地図に一致する 。 プラスミドｐＸＬ２９７４のＬＣＡＴ活性は、１時間あたり２％のコレステロ ールエステルの形成に対応し、ＣＥＴＰ活性は１１４％に対応する（表１）。シ ャトルプラスミド−ｃｏｌｉ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰでもＬＣＡＴ活性 及びＣＥＴＰ活性の存在が認められる。 実施例２：シャトルプラスミドＲＳＶ ＬＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＬＨの構築 ＬＨのｃＤＮＡをベクターｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のＩＲＥＳの下流にクロー ニングし、フラグメントＩＲＥＳ−ＬＨを以下のプロトコルに従ってベクターＬ ＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＣＥＴＰと同様の方法で組込む。 プラスミドｐＸＬ２９７１（４μｇ）を４０Ｉ．Ｕ．のＢｇｌＩＩで消化（バ ッファ３、３７℃で９０分）し、次いで４０ｕのＳａｌＩで３７℃で９０分間消 化することによってＮｃｏＩ部位を除去する。これらの消化後に得られた２．５ Ｋｂｐ（重量約０．５μｇ）のＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動及び抽出によ って処理した後、バッファ４中でＮｃｏＩ（１μｇのＤＮＡあたり０．１〜１ｕ のＮｃｏＩ）によって３７℃で６０分間限定消化する。消化産物を０．７％のア ガロースゲル電気泳動によって分析し、、０．５ｕのＮｃｏＩによって得られた Ｌ Ｈ ＡＢＣのｃＤＮＡを含む１．５Ｋｂｐのバンドを、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ消 化（Ｉｕの各酵素、バッファ３、３７℃）によって得られたフラグメントｐＳＫ ＩＲＥＳ（１．３μｇ）に結合させる（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、４００ｕ）。 最終ベクターを図５に示す。対応するバイシストロンシャトルベクタ−ＬＣＡ Ｔ−ＩＲＥＳ−ＬＨをプラスミドｐＸＬ２９８４と命名する。 実施例３：シャトルプラスミドＡｐｏＡＩ−ＩＲＥＳ−ＬＣＡＴの構築 この構築の一般原理は先行の実施例に等しい。ＬＣＡＴをＰＣＲによって突然 変異させ、ＩＲＥＳの下流の適切な場所に結合できるように追加のＮｃｏＩ部位 を導入する。この構築物の全配列が解析されている。次に、フラグメントＩＲＥ Ｓ−ＬＣＡＴをアポＡ−Ｉの下流に結合させる。ｃｏｌｉ技術による処理後に得 られたベクターをｐＸＬ３０５８と命名する（図 ６）。常用の二重組換えの後で得られたウイルスベクターの活性を試験した。ア ポＡ−Ｉはウェスタンブロットで検出され、ＬＣＴ活性は１．３％と評価された （バックグラウンドノイズ０．２％）。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONRecombinant vistist for treating pathological conditions associated with lipoprotein dysemia Ronadenovirus   The present invention provides a novel method for introducing and expressing a desired gene in vivo. It relates to a recombinant virus, its production and its use in gene therapy. More details The invention comprises at least two inserted genes, the expression products of which Are involved in the reverse transport of cholesterol. The present invention The present invention also relates to a shuttle plasmid useful for producing the adenovirus of the present invention. Yo More specifically, the present invention relates to defective recombinant adenoviruses and lipoprotein variants. Use of such adenoviruses to prevent and treat conditions associated with About. Lipoprotein dysemia has significant consequences at cardiovascular and neurological levels Inviting is well known.   Lipoprotein dysemia is caused by cholesterol and glucose in blood and surrounding fluids. It is a metabolic disorder of lipoproteins that carry lipids such as glycerides. Lipota Protein dysemia is hypercholesterolemia or hypertriglyceridemia, especially Athero It causes serious symptoms, each associated with atherosclerosis.   Atherosclerosis is a multifactorial complex disease that, at the histological level, Of lipids and other blood derivatives produced on the walls of the aorta (aorta, coronary arteries, carotid arteries) It is defined as a deposit (lipid or fibrous lipid plaque). As symptoms progress, At least calcified plaques are present in the lesion, and cholesterol Fat deposits consisting of tellurium accumulate in the arteries. Associated with these plaques, the arteries Wall thickening, smooth muscle hypertrophy, appearance of foam cells and accumulation of fibrous tissue occur. Ate Loam plaques are very prominently raised in the vessel wall. As a result, blood vessels narrow and severe It causes vascular obstruction such as atheroma, thrombosis, and embolism in the elderly.   Hypercholesterolemia is extreme like myocardial infarction, sudden death, heart failure, cerebrovascular accident And lead to severe cardiovascular disease.   Thus, for some conditions, plasma cholesterol levels may be reduced Methods of treatment, more specifically, cholesterol-accumulating cells that form atherosclerotic plaques Cholesterol excretion at the level of peripheral tissues to excrete (cholesterol reverse It is particularly important to develop therapeutic methods that can stimulate transport). Choles Terols are available in low-density lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HD) L) are carried in the blood by various lipoproteins, such as L). LDL is the liver And can supply cholesterol to peripheral tissues. Conversely, HDL is peripheral Captures cholesterol from tissues and transports it to the liver, where it is stored Store and / or decompose.   The most common dyslipidemia is LDL (low density lipoprotein) cholesterol. Dyslipidemia and low alpha lipoprotein characterized by high roll concentration Is bloody. Hypoalphalipoproteinemia is characterized by HDL (high density lipoprotein (Pacific) Cholesterol concentration of less than 35 mg / dl, abnormal fat Forty percent of cases of hyperemia are hypoalphalipoproteinemia (Genest et al., 1992). Hypoalphalipoproteinemia is responsible for the synthesis, maturation and catabolism of HDL particles Is thought to be associated with a genetic defect in one or more proteins involved in Often result in juvenile cardiovascular disease (Damerman n et al., 1995). In general, the incidence of these cardiovascular diseases and the concentration of HDL particles There is an inverse correlation between (Miller et al., 1987).   Protective effects of HDL against cardiovascular disease may be caused by atherosclerotic lesions. Demonstrated in in vivo gene transfer experiments on viable mouse strains. HD Increasing the number of L particles inhibits lesion development in these mice (Rubin et al., 1991; Plump et al., 1994). HDL The protective effect of the particles is based on the reverse cholesterol transport function of the HDL particles. (Reiche et al., 1989). Reverse transport is excessive Transports cholesterol from peripheral tissues to the liver to remove cholesterol This is the process (FIG. 1). This process involves the incorporation of cholesterol into HDL particles and Telling, transferring to low density lipoprotein particles, and then And collecting again in the liver. In this process, of course, Multiple proteins like CETP, cholesterol acyltransferase And hepatic lipase and / or apolipoproteins AI and A Its cofactor, such as IV, has been used.   LDL cholesterol and triglycerides based on hypolipidemic and antihypertensive drugs There are effective treatments to lower the concentration of But high for current treatments for hypoalphalipoproteinemia Treatment efficiency cannot be expected.   The invention particularly relates to gene therapy for hypoalphalipoproteinemia-related conditions. .   The treatment method applied by the present invention is for regression of atherosclerotic lesions Reverse transport rate of cholesterol to induce cholesterol or prevent lesion formation The purpose is to increase. The goal is to achieve cholesterol in the cells to be treated. At least two proteins, enzymes or cofactors involved in the reverse transport level of Advantageously achieved by the present invention, which is effectively co-expressed.   "The protein involved in the reverse transport of cholesterol, The expression "enzyme and / or one of its cofactors" refers to a change in their concentration in cells. It means that the tone automatically affects the reverse cholesterol transport process.   Representative examples of such enzymes include, in particular, lecithin-cholesterol acyltrans. Mention may be made of ferase and hepatic lipase.   Lecithin-cholesterol acyltransferase (LC AT) is a 67 kDa glycoprotein synthesized by the liver, and lecithin Lysophosphatidylcholine catalyzes the transfer of the acyl group of And cholesterol esters (Glomset, 1968). This yeast The basic cofactor is apolipoprotein AI bound to the surface of HDL particles. Apo Lipoprotein AI increases the concentration gradient of cholesterol between peripheral cells and HDL. Main role in the first step of reverse cholesterol transport by maintaining .   Human hepatic lipase (LH) is a triglyceride synthesized and secreted by hepatocytes. 66 kDa Glycoprotein with Lidohydrolase and Phospholipase Activities It is. Hepatic lipase is expressed on hepatocytes via proteoglycan heparin sulfate By binding to kilomicron, IDL (medium density lipoprotein) and HD It is involved in L metabolism. LH has a particularly high affinity for large HDL particles Degrades HDL phospholipids and triglycerides, Form receptive disc-shaped HDL particles. LH deficiency in humans is triglyceride Increased LDL enrichment, HDL particle hypertrophy, juvenile atherosclerosis (Hegele et al., 1993).   Considering protein, the term protein used in the present invention is a good term. Preferably, cholesterol ester transfer protein (CETP), apolipotan It refers to the pattern AIs and AIVs or one of their variants.   Cholesterol ester transport protein (CETP) is found in adipose tissue and liver It is a 74 kDa glycoprotein synthesized. This glycoprotein is mainly found in plasma And meet HDL. That is, CETP has a low cholesterol ester of HDL. Catalyzes the transfer to density lipoproteins. After this transition, low density lipoprotein The triglycerides of the proteins migrate to HDL. Transtriglyceridemia Overexpression of CETP in transgenic mice results in atherosclerosis The development of lesions is inhibited (Hayek et al., 1995). In this experiment, CETP Consistent with the observation that the development of juvenile cardiovascular disease is observed in deficient individuals (Z Hong et al., 1996).   Apolipoprotein AI has 267 residues with a molecular weight of 28,000 daltons. A 243 amino acid protein synthesized in the form of a prepropeptide is there. Apolipoprotein AI is synthesized liver-specifically and clothes-specifically in the human body, and is an essential protein for HDL particles. Of the protein (70% by weight of the protein in the HDL particles). AI is in plasma Present in large amounts (1.0-1.2 g / l). The most characteristic in biochemical terms The action of AI is determined by lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT ), But especially for stimulation of cellular cholesterol efflux. Many other activities are also due to AI. Apolipoprotein AI is the opposite of cholesterol Transport-related plays a key role in preventing atherosclerosis You. The AI gene having a length of 1863 bp was cloned and sequenced. (Sharp et al., Nucleic Acids Res.12 (9)(1 984) 3917). Protein production with apolipoprotein AI type activity These include in particular the natural variants described in the prior art.   Apolipoprotein AIV (apoAIV) is a precursor of 396 residues in the brain It is a protein consisting of 376 amino acids specifically synthesized. AIV Raw Physical effects include lecithin-cholesterol acyltransferase (L Activating CAT) in vitro (Steinmetz) Et al., 1985, J. Am. Biol. Chem. , 260: 2258-2264), and And HDL granules on bovine aortic endothelial cells as well as apolipoprotein AI Disrupting the binding of offspring (Savion et al., 1987, Eur. J. Bioch). em. , 257: 4171-4178) are known. These two activities are , ApoAIV may mediate reverse cholesterol transport mediator Is extremely large. The gene for apoAIV has been cloned and It is described in the art (especially international patent WO 92/05253). Apolipotampa Among the proteinaceous products having the activity of the cytoplasmic AIV type are in particular French patent applications There are fragments and derivatives described in FR92 / 00806.   More specifically, the present invention relates to enzymes, proteins involved in the reverse transport of cholesterol, And / or a set capable of introducing and expressing at least two nucleic acids encoding a cofactor Regarding the use of replacement viruses.   Unexpectedly, Applicants have shown that at least two nucleic acids are in the form of bicistronic units. Incorporation into the same recombinant virus at Effectively ensuring introduction and expression Prove that you can. When used for therapeutic purposes, one virus is better than two viruses. Clearly, the use of ils alone has many advantages.   First, they incorporated two genes rather than constructing each of the two recombinant viruses It is advantageous to construct one recombinant virus.   Also, by using the vectors as described in the claims for therapeutic purposes, The amount of recombinant virus required for gene expression can be halved. This is a pair Considering the conventional results that frequent immune responses occurred in recombinant virus infected cells, extremely It will be appreciated that it is advantageous. The immune response usually destroys infected cells and / or Manifests as a significant inflammatory response. These two signs indicate that the therapeutic gene has been expressed. It is extremely disadvantageous from the viewpoint of continuity, and therefore also extremely It is clear that it is disadvantageous.   Finally, efficient introduction of equal concentrations of two different recombinant viruses is an uncertain event. Therefore, adjustment by supplementary operation is necessary. The recombinant wi The advantage of using a loose is that this type of adjustment can be eliminated.   The claimed virus is associated with cytotoxic effects for a considerable period of time Proteins, enzymes and / or complements involved in the reverse transport of cholesterol Two nucleic acids encoding the factor can be effectively introduced and expressed.   Accordingly, a first object of the present invention is to provide separate enzymes involved in reverse cholesterol transport. Comprising at least two nucleic acids encoding a protein and / or a cofactor The purpose is to provide a recombinant virus. Nucleic acid is operatively linked to a transcription promoter And separated from each other by sequences encoding the internal ribosome entry site (IRES). Have been.   The nucleic acid is preferably lecithin-cholesterol acyltransferase (L CAT), cholesterol ester transfer protein (CETP), hepatic lipase (LH), any of apolipoproteins AI and AIV or variants thereof It is selected from genes encoding one whole sequence or a part of the sequence.   Nucleic acids to be inserted include complementary DNA (cDNA) fragments, genomic DNA ( gDNA) fragment or, for example, one or more introns inserted It may be a hybrid construct consisting of the cloned cDNA. Also, a synthetic sequence may be used. In a synthetic array Is also good. As mentioned above, enzymes, proteins and proteins involved in reverse cholesterol transport And / or partial sequence of any one of cofactors and / or variants thereof May be a gene encoding The term mutant as used in the present invention is the subject of interest. Reduced biological properties of the proteinaceous product and, in some cases, the respective natural variants. Any mutant, fragment or peptide having at least one To taste.   These fragments and variants can be obtained by any technique known to those of skill in the art, in particular, And / or by chemical and / or enzymatic modification. Genetic modification Includes deletions, deletions, mutations, and the like.   According to the definition of the invention, the term inserted nucleic acid is preferably the corresponding human Genes encoding all or part of the enzymes, proteins and / or cofactors of means. More preferably, it means cDNA or gDNA.   Each of the inserted nucleic acids may also include an activating sequence, a regulatory sequence, and the like. Furthermore, Each of the nucleic acids generally directs the synthesized polypeptide into the secretory pathway of the target cell. An internal signal sequence is included upstream of the coding sequence. This signal sequence Is natural Signal sequence, or any other functional signal sequence, or May be used.   According to a particular embodiment of the present invention, the claimed recombinant virus comprises: It contains at least a nucleic acid encoding LCAT. More preferably, the inserted second Encodes LH, CETP or ApoAI.   As mentioned above, co-expression of two nucleic acids of interest pre-forms a single RNA, This is then done by translating to produce each of the two enzymes. these For the purpose, the recombinant virus has at least the transcription promoter in addition to the two nucleic acid sequences. And a polyadenylation site and an IRES sequence.   Produce bicistronic mRNA and induce expression of each of the two enzymes from the mRNA The transcription promoter is operably linked to the two coding nucleic acids to guide ing. According to a preferred embodiment of the present invention, the transcription promoter is of the first nucleic acid. It is located immediately upstream.   This transcription promoter is particularly useful if the promoter sequence can function in infected cells. Nucleus that expresses a nucleic acid located downstream of the promoter sequence if Acid-specific promoter sequence Can be selected from A transcription promoter may also be a sequence of different origin (other It may be a sequence responsible for the expression of the protein, or it may be a synthetic sequence). In particular, It may be a eukaryotic or viral nucleic acid sequence, or it may be specific or Are non-specific and inducible or non-inducible A conductive arrangement may be used. For example, a promoter sequence derived from the genome of the cell to be infected or May be a promoter sequence derived from the genome of the virus. Gene E1A, MLP promoter, CMV, LTR-RSV, MT-1, The promoter of SV40 may be used. Eukaryotic promoters include ubiquitous promoters. (HPRT, vimentin, α-actin, tubulin, etc.), intermediate filler Mention promoters (desmin, neurofilament, keratin, GFAP ), Promoters for therapeutic genes (MDR, CFTR, factor VIII, etc.) , Tissue-specific promoters (pyruvate kinase, villin, intestinal fatty acid binding Protein promoter, smooth muscle cell α-actin promoter, liver-specific Motor; ApoAI, ApoAII, human albumin, etc.) Responding promoters (steroid hormone receptor, retino Oleic acid receptor). Furthermore, by adding an activation sequence, a regulatory sequence, etc. Thus, these expression sequences may be modified.   Considering the IRES sequence, this sequence is preferably associated with the picornavirus. Comes from. More specifically, the IRES sequence of Picornavirus is encephalomyocarditis virus Or from poliovirus. More preferably, a vector of NOVAGEN Using a fragment derived from encephalomyocarditis virus present in pCITE-2a + You.   For clarity of expression, a transcription promoter and two nucleic acids and polyadenylation The construct formed by the site and the IRES sequence present between the two nucleic acids In the following description, it is called a bicistron cassette.   The virus of the present invention is a defective virus. In other words, autonomous replication in tucket cells Can not do it. Thus, the genome of the defective virus used within the scope of the present invention Generally require fewer sequences for the virus to replicate in infected cells. It is missing at least. These areas are removed (in whole or in part) May be non-functional, may be another sequence, especially a bicisist as defined above Has been replaced by You may. However, defective viruses are required for capsid formation of virus particles It is preferable to preserve the sequences of various genomes.   The virus of the present invention may be an adenovirus, an adeno-associated virus (AAV) or a virus. It can be derived from a Torovirus. According to a preferred embodiment, the virus is adenovirus. Ruth.   There are various serotypes of adenovirus that differ somewhat in structure and properties. Book In the present invention, human adenovirus type 2 or 5 (Ad2 Or Ad5) or the use of animal origin adenoviruses (international patents). See application WO 94/26914). Animal origin adenos that can be used within the scope of the present invention Viruses include dogs, cows, and rats (eg, Mav1, Beard et al., Vi. rology 75 (1990) 81), sheep, pigs, birds or monkeys (e.g. (SAV) originating adenovirus. Adenoviruses of animal origin are preferred Or a canine adenovirus, preferably an adenovirus CAV2 [eg Manha Or A26 / 61 (ATCC VR-800)]. The scope of the present invention Within the box preferably an adenovirus or mixed adenovirus of human or canine origin Use ils.   Preferably, at least the region E1 in the genome of the adenovirus of the invention is non-functional. Noh. The viral gene of interest can be obtained by any technique known to those skilled in the art, Complete deletion, substitution, partial deletion or deletion of one or more bases in one or more genes Or can be rendered nonfunctional by addition. Such modifications can be made, for example, by genetic engineering techniques Or in vitro treatment (of the isolated DNA) with a mutagen or Obtained by in situ processing. Further, other areas, particularly the area E3 (WO9) 5/02697), E2 (WO94 / 28938), E4 (WO94 / 2815) 2, WO94 / 12649, WO95 / 02697) and L5 (WO95 / 02 697) may be modified. According to a preferred embodiment, the adenovirus of the invention Contains at least the deletion of region E1 and the deletion of region E3. The virus of the present invention Deletion of region E1 is preferably at nucleotide 455 of the sequence of adenovirus Ad5. To 3329. According to another preferred embodiment, the bicistro Cassette has been inserted at the site of deletion of region E1.   Accordingly, certain embodiments of the present invention include separate enzymes involved in reverse cholesterol transport. Encodes element, protein and / or cofactor A defective recombinant adenovirus comprising at least two nucleic acids Related. This nucleic acid is operably linked to a transcription promoter and contains an internal ribosome. Are separated from each other by sequences encoding the IRES entry sites.   Particularly preferred recombinant adenoviruses of the present invention encode LCAT. A deletion comprising at least a nucleic acid and a nucleic acid encoding LH, CETP or ApoAI. There is a recombinant adenovirus. This nucleic acid is operably linked to a transcription promoter. And separated from each other by sequences encoding the internal ribosome entry site IRES. Have been.   Representative examples of these adenoviruses are, inter alia, pXL2974 and pXL2822. Respectively encode LCAT and CETP obtained by homologous recombination between An adenovirus containing the gene as shown in FIG.   The defective recombinant adenovirus of the present invention is produced by any technique known to those skilled in the art. (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP185) Graham, EMBO J., 573; 3 (1984) 2917). Especially this These adenoviruses are adenovirus and most preferably bicistronic. It can be made by homologous recombination with a plasmid containing the cassette. Adenow Co-transfection of the virus and plasmid into the appropriate cell line. To induce homologous recombination. Preferred cell lines used are (i) And (ii) a portion of the genome of the defective adenovirus. A cell containing a sequence that can be complemented, preferably in an integrated form without risk of recombination. Vesicle system. Examples of cell lines include, in particular, the left side of the adenovirus Ad5 genome. A human 293 kidney germ cell line (Grah) with a portion (12%) integrated into the genome of the cell line Am et al. Gen. Virol. 36 (1977) 59), or especially international As described in patent applications WO 94/26914 and WO 95/02697 There are cell lines that can complement the functions of E1 and E4. Then, the grown adenowis Ruth is recovered and purified by conventional techniques of molecular biology as shown in the examples.   However, according to a preferred embodiment of the present invention, the add Virus is produced by the inventive method described in International Patent Application WO 96/25506. You. The patent application discloses that one or more restriction enzymes not originally present in the genome. In the elementary part Prokaryotic plasmid containing flanked recombinant adenovirus genome Is used as a shuttle plasmid. This protocol is specifically illustrated in FIG. Have been. The advantage of this method is that the second construction gives another part of the viral genome And the need for a recombination step in the transcomplementation cell line.   A second more specific object of the present invention is the production of an adenovirus as defined in the claims. It is to provide a specific prokaryotic plasmid for use in life.   According to a preferred embodiment of the present invention, these prokaryotic plasmids are as described above. It incorporates a simple bicistron cassette.   Another more specific object of the present invention is to provide adenovirus genome and cholesterol Encoding small enzymes, proteins and / or cofactors involved in the reverse transport of The object is to provide a prokaryotic plasmid containing at least two nucleic acids. Two nuclei The acid is operably linked to a transcription promoter and has an internal ribosome entry site IR. They are separated from each other by an ES coding sequence.   Preferably, the prokaryotic plasmid of the invention comprises a first region capable of replication in prokaryotic cells. Flanked by one or more restriction sites not present in the adenovirus genome Includes adenovirus genome Involved in the reverse transport of cholesterol in the second region. At least two nucleic acids encoding separate enzymes, proteins and / or cofactors And these two nucleic acids are operably linked to a transcription promoter, Separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES You.   Separate enzymes, proteins and / or cofactors involved in reverse cholesterol transport Definition, cassette and transcriptional promoter, polyadenylation site and IRES sequence The above description of their organization within the project will be clear.   A plasmid comprising the claimed plasmid so that it can replicate in prokaryotic cells. The productable region may be any functional origin of replication in the selected cells. E. coli poly A Derived from a P-incompatible group of plasmids that can replicate in the strain (eg pRK290) May be the replication origin. More generally, derived from plasmids that replicate in prokaryotic cells Any replication origin may be used. This plasmid contains a derivative of RK2, pBR322 (B Oliver et al., 1977), pUC (Viera & Messin). g, 1982) or other plasmids from the same incompatible group, That is, ColE1 or pMB1 may be used. These plasmids are It may be selected from another incompatible group that can replicate in bacteria. Also, for example, unsuitable Group A, B, FI, FII, FIII, FIV, HI, H11, I1, I 2, belongs to J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z or 9 Or a plasmid derived from a suitable plasmid. It can also replicate in Osumi bacteria. NotB. subtilis,Streptomyces,P. utida,P . aeruginosa ,Rhizobium meliloti,Aglob actium tumefaciens ,Staphylococcus aureus ,streptomyces pristinaesspirali s ,Enterococcus faeciumOrClostridium Other plasmids that can replicate in other hosts, such as, can also be used. Preferably, Use an origin of replication from a plasmid that replicates in E. coli.   As mentioned above, the adenovirus genome present in the plasmid of the present invention is complete. A genome or a functional genome is advantageous. That is, the selected capsid forming cells Virus strain in the system Some genomes do not require the addition of another region by recombination or ligation to It is profitable.   Preferably, the recombinant adenovirus genome comprises an ITR sequence and a capsid forming sequence. At least. In a preferred embodiment of the invention, the adenovirus used The whole or a part of the region E1 of the genome is deleted. Preferably used The region from nucleotides 454 to 3328 of region E1 of the adenovirus genome Box (PvuII-BglII fragment) or range from 382 to 3446. The box (HinfII-Sau3A fragment) has been deleted.   According to a particularly advantageous embodiment, the genome of the adenovirus used is also the region All or part of the region E3 and / or the region E4 is deleted. Specific embodiments of the present invention According to an embodiment, an adenovirus genome in which the regions E1 and E3 have been deleted is used. You.   More particularly, the prokaryotic plasmids claimed in the 5 'to 3' direction Contains a functional origin of replication in prokaryotic cells and the ITR and ψ sequences of the virus The first part of the adenovirus genome, the transcription promoter, and the reverse of cholesterol Encodes one enzyme, protein and / or cofactor involved in transport First nucleic acid, IRES sequence, and second enzyme involved in reverse transport of cholesterol Nucleic acid encoding a protein and / or cofactor, and a polyadenylation moiety And the second part of the adenovirus genome, including the region pIX-IVA2. I have.   Preferably, the prokaryotic plasmid of the invention as claimed is also the plasmid. Includes a region that allows for the selection of prokaryotic cells containing rasmids. This area is especially It can be composed of any gene that confers resistance, especially antibiotic resistance. For example, a molecule Kanamycin resistance commonly used in biology (Kanr), ampicillin resistance (Ampr) , Tetracycline resistance (tetr) or provide spectinomycin resistance (Maniatis et al., 1989). Select plasmid Using a nucleic acid sequence other than the gene encoding the antibiotic resistance marker Is also good. For this reason, it is common for bacteria to have functions that they no longer have (this is (Corresponding to a deleted or inactivated gene) Offspring are used and the gene carried on the plasmid restores this lost function . As an example, a gene of a transfer RNA that restores the function of a defective chromosome is used (Som oes et al., 1991).   According to a preferred embodiment, the claimed prokaryotic plasmid is LCAT And at least one nucleic acid encoding CETP, LH or It is selected from nucleic acids encoding ApoAI.   Representative examples of these prokaryotic plasmids are shown in particular in FIGS. 4 and 6, respectively. And plasmids pXL2974 and pXL3058. Plasmid pXL29 74 shows the 5 'to 3' direction of the replication origin and the spectinomycin resistance gene. Sucrose-sensitive SacB gene, viral ITR and ψ sequences, and RS V promoter and two transgenes LCAT separated by an IRES And CETP, a polyadenylation site, and the viral sequences pIX and IVA2 Including. Plasmid pXL3058 contains an origin of replication, 5 'to 3', Mycin resistance gene, viral ITR and ψ sequences, and RSV promoter And two transgenes LCAT and intro separated by the IRES + ApoAI, a polyadenylation site, and the viral sequences pIX and IVA2 And the sucrose-sensitive SacB gene.   The present invention also provides a method for constructing the above-described prokaryotic plasmid. A plasmid further comprising a bicistronic cassette as defined by the present invention for Constructs.   The prokaryotic plasmids of the invention as claimed are, in particular, defined by the invention. A defined bicistronic cassette, another one involved in the reverse transport of cholesterol Operates on two nucleic acids encoding two different enzymes, proteins and / or cofactors A sequence encoding a transcriptional promoter, which is operatively linked, a polyadenylation site, Transformation of a starting shuttle plasmid containing an IRES sequence located between the nucleic acids It can be made by exchange.   Representative examples of these shuttle plasmids are in particular the plasmids shown in FIGS. 3 and 5, respectively. Rasmids pXL2970 and pXL2984.   Enzymes, transcription promoters and IRES sequences involved in reverse cholesterol transport Definitions and their organization within the cassette are given above. it is obvious.   Another object of the present invention is to provide any prokaryotic plasmid containing a prokaryotic plasmid as defined above. For nuclear cells. Such a prokaryotic cell is particularly capable of introducing recombinant DNA into the prokaryotic cell. Any bacteria for which a suitable vector system exists. For example,Es cheri chia coli ,Salmonella typhimurium,Bac illus subtilis ,Pseudomonas putida,Ps eudomonas aeruginosa ,Agrobacterium t umefaciens ,Rhizobium melilotiOrStre ptomyces There are bacteria of the genus. These cells were prepared using techniques known to those skilled in the art. Advantageously obtained by transformation.   It is also an object of the present invention to provide hypoalphalipoproteinemia, in particular atherosclerosis. Pharmaceutical composition for treating or preventing symptoms associated with sclerosis and / or restenosis To produce a recombinant virus, a defective recombinant adenovirus or a defective recombinant adenovirus as defined above. Or using a shuttle plasmid construct.   The invention also relates to one or more defective recombinant viruses, such as the adenoviruses described above. It relates to a pharmaceutical composition comprising irs. Such compositions can be used topically, orally, parenterally, It is manufactured into a dosage form for administration by intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, etc. routes.   Preferably, the composition of the present invention contains a pharmaceutically acceptable vehicle for injection. I do. The composition is especially suitable for isotonic, sterile saline solutions (monosodium phosphate, diphosphate). Sodium, sodium chloride Or potassium chloride, calcium chloride or magnesium chloride, or A mixture of these salts) or, if necessary, add sterile water or physiological serum. Of a dry composition, especially a lyophilized composition, which can reconstitute the injectable solute by It is a form.   The dose of virus administered by injection depends on various parameters, in particular The dosage depends on the mode of administration, the condition involved and the duration of treatment desired. General The recombinant virus of the present invention isFour-1014pfu / ml dosage form Manufacture and administer. The term pfu ("plaque-forming unit") refers to virion onion Infects the appropriate cell culture, usually 48 hours after infection Determined by measuring the number of cell plaques. Pfu titer of virus solution The measurement technique is well described in the literature.   The present invention provides a method for treating or preventing a condition associated with hypoalphalipoproteinemia, Especially myocardial infarction, angina, sudden death, heart failure, cerebral vascular attack, atherosclerosis New tools that are highly effective in the field of cardiovascular diseases such as stenosis or restenosis I do.   In addition, this treatment is not only for humans, but also for sheep, cattle, pets Suitable for animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.   The present invention will be more fully described with reference to the following examples. These examples are based on It should be considered that the present invention is limited to these examples. Do not think that.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a putative mechanism of reverse transport of cholesterol.   Figure 2 illustrates the protocol for the production of adenovirus by homologous recombination in E. coli. FIG.   FIG. 3 shows a bicistronic shutter containing RSV-LCAT-IRES-CETP. 1 represents the construction protocol of plasmid pXL2970.   FIG. 4 shows the prokaryotic plasmid pX containing RSV-LCAT-TRES-CETP. L2974 represents the construction protocol.   FIG. 5 shows plasmid pXL2984 containing RSV-LCAT-IRES-LH. Represents the construction protocol of.   FIG. 6 shows the prokaryotic plasmid p containing RSV-ApoAI-IRES-LCAT. XL3058.Materials and methods I-1. material (1) Bicistronic recombinant adenovirus LCAT-IRES-CETP, L To construct CAT-IRES-LH and LCAT-IRES-ApoAI The following plasmids were used:   -PSK IRES (commercially available from NOVAGEN);   -PXL2616 cDNA LCAT (Seguret-Mace et al., Ci. rculation 1996, 94 (9): 2177-2184);   -PCRII (commercially available from INVITROGEN);   -PXL2794 (International Patent WO96 / 25506);   -PXL2557 (International Patent WO 96/25506). (2) Total RNA obtained from hepatocytes and HepG2 cells. (3) Human 293 kidney containing a gene encoding adenovirus E1 protein Cells (Graham et al., 1977). (4) Genotype EndA1, recA1, hsdR17, supE44, I-, thy-1, gyrA, relA1, lacZD M15, deoR+, F+, D am+, Dcm+E. coli subtype DH5α (Woodcock et al., 198) 9). (5) Enzymes and restriction buffers are from New England Biolabs Hand.I-2. Method General-purpose molecular biology technology   Preparative extraction of plasmid DNA, cesium chloride gradient centrifugation of plasmid DNA, DNA by electrophoresis and electroelution on agarose gel or acrylamide gel Purification of fragments, phenol or phenol / chloroform of proteins Extraction, precipitation of DNA in salt medium with ethanol or isopropanol, colon Methods commonly used in molecular biology, such as bacterial transformation, are known to those skilled in the art, and are described in the literature. [Maniatis T. et al. Et al., "Molecular C loaning, a Laboratory Manual ", Cold Spr ing Harbor Laboratory, Cold Spring Ha rbor, N .; Y. Ausubel F., 1982; M. (Eds.), “ Current Protocols in Molecular Biolo gy ", John Wiley & Sons, New York, 1987] .   pBR322, pUC strain plasmids and M13 series phage Sold (Bethesda Research Laboratories) s).   For binding, agarose gel or acrylamide gel electrophoresis DNA fragments are separated based on size, and phenol or phenol / Extract with chloroform mixture, ethanol precipitate, then follow manufacturer's instructions Incubation in the presence of T4 phage DNA ligase (Biolabs) Beate.   Klenow fragment (Biolabs) of DNA polymerase of E. coli Use as directed by the manufacturer to backfill 5 'overhangs. Use as directed by manufacturer The 3 'protruding ends are destroyed in the presence of the DNA polymerase of the phage T4. Nuku The 5 'protruding end is destroyed by a regulation treatment with Rease S1.   In vitro mutagenesis with synthetic oligodeoxynucleotides Using the kit sold by Amersham, Taylor et al. ucleic Acids Res.13(1985) 8749-8864] Therefore, it is performed according to the method developed. The so-called PCR method [Poligomerase-catalyzedChainR action, Saiki R. K. Et al., Science230(198 5) 1350-1354; Mullis K. B. & Falloona F. A . , Meth. Enzym.155(1987) 335-350]. Enzymatic amplification of the fragment is performed using the "DNA thermal cycler" (Perkin E 1mer Cetus) according to the manufacturer's instructions.   Nucleotide sequence confirmation kits sold by Amersham Using the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA,74(1977) 5463-5467].Cell culture technology (A) Cell culture   293 cells were added with 10% fetal calf serum (SVF, Gibco BRL) 5% CO in Eagle's medium (MEM, Gibco BRL)TwoIncubate at 37 ℃ I do.(B) Transfection of cultured cells   Using a 100 mm petri dish, add 10% fetal bovine serum. 1 μg of DNA was added to 293 cells cultured in the obtained MEM medium, and then added to Lipofectamine ( Gibco BRL). After 6 hours, remove the medium Incubate cells in complete medium (MEM + 10% SVF). Trance 72 hours after transfection, the recombinant plasmid RSV LCAT-IRES-C ETP) RSV LCAT-IRES-ApoAI and RSV LCAT-IR For ES-LH and β-galactosidase control, The culture supernatant of the untransfected cells and the culture supernatant of the untransfected cells were collected. And stored at 4 ° C. Using human plasma as a control, 10-30 μl of cell supernatant Using the fractions, an activity test of the enzymes LCAT, CETP, ApoAI and LH was carried out. Was.(C) Production and purification of recombinant adenovirus   Generating bicistronic adenovirus DNA by homologous recombination in cerebral fungi You. This DNA was then linearized with PacI and transferred to 293 cells. After the injection, the virus is produced. Transcomplementary to protein E1 Of 293 cells of 10 g of linearized adenovirus DNA And transfect. 4% SVF supplement After covering 293 cells in a filled MEM medium with agar, the cells were incubated at 37 ° C. for 8 days. Pick plaques containing the recombinant virus and analyze its restriction profile I do.(D) Infection of cultured cells   Above 0.25, 0.5 and 1 ml containing the bicistronic recombinant adenovirus About 4 × 10FiveTo a 12-well plate containing 293 cells. 2 Infection for 72 hours in 2 ml MEM supplemented with 5% SVF. The supernatant of the cells is collected and the enzyme activity is quantified.Evaluation of biochemical efficacy of in vitro results (A) Quantification of LCAT activity   LCAT activity was determined according to the procedure described by Chen et al. (1982). Release using proteoliposomes as quality14Esterification from C-cholesterol It is quantified by measuring the conversion to 14C-cholesterol. Phosphatid Zircholine, cholesterol,14C-cholesterol and apolipoprotein A I. Prepare proteoliposomes from I. Incubate with 1 l of culture supernatant. Reaction product (free14C-Colles Terols and esters Conversion14C-cholesterol) by thin layer chromatography Use Instant Imager (Packard) Detection by autoradiography. LCAT activity was measured with 20 μl Esterified per hour in test supernatant14Percentage of C-cholesterol Page.(B) Quantification of CETP activity   CETP activity is determined from high density lipoprotein particles (donor) to low density lipoprotein. The ability of enzymes to transfer cholesterol esters to carbon particles (ataceptors) Quantify by measuring. Wak-Chemi is used as a substrate for this reaction. e, using a substrate manufactured by Medical GmbH. The core contained in the donor particles The fluorescence of the sterol linoleate is emitted when the donor particles are in their native state. Active CETP that does not light but can catalyze the transfer of fluorescent molecules to acceptor particles Fluorescence is detected at 535 nm only when is present. CETP activity is 30μ It is expressed as the value of the fluorescence intensity per hour that one test culture supernatant emits at 535 nm. You.(C) Quantification of LH activity   Hepatic lipase activity is measured using the Progen Biotechnik GmbH kit Quantification using a synthetic triglyceride substrate provided by This substrate is When the molecule is in its natural state, it is blocked by trinitrophenol, Contains a fluorescent pyrene group that emits fluorescence at 400 nm when hydrolyzed. Test Sun Measure fluorescence intensity emitted at 400 nm after pull-substrate incubation And contained in 20 μl of supernatant based on the standard plasma provided by the kit. The amount of LH (picomoles / min) can be estimated.(D) Quantification of apolipoprotein AI   ApoAI activity is quantified using an anti-ApoAI monoclonal antibody. This For this, an overnight incubation at 4 ° C. was performed to give Immulon II (D ynatech) plate with anti-ApoAI monoclonal antibody (carbonate buffer) 10 mg / ml in pH 9.6) and then containing 2% PSA Saturate overnight at 37 ° C. in BS, pH 7.4. The cell supernatant was then washed with 2% BSA After arbitrarily diluting with PBS containing, the mixture is incubated at 37 ° C. for 1 hour. next, Anti-ApoAI monoclonal labeled with peroxidase diluted 1/5000 By incubating with the antibody mixture for 1 hour at 37 ° C. Put out. Finally, incubation with 250 μl of TMB (KPL) was performed. The immobilization of the antibody peroxide is detected by reading the plate at 30 nm.Shuttle plasmid construction technology   The construction of the bicistronic plasmid is shown in detail in FIGS. Obtained buy The cistron plasmid contains the adenovirus vector necessary for recombination with the viral genome. It is also a shuttle plasmid because it contains the row pIX-IVa2. This recombination Cleavage genomics of viral β-galactosidase (conventional shuttle vector) Co-transfection with E. coli or in E. coli (coli shuttle vector) Caused by double recombination.   Sequence matches of various plasmid structures were examined by analysis of their restriction profiles. Check. This test provides a recombinant clone that can be used for subsequent cloning. You can select and evaluate the effectiveness of the cloning results. Restriction enzymes are cloned Enough for the integrity of the cDNA and the number of strategic cloning sites Is selected so that appropriate information can be obtained. However, in this test, clonin Can occur at any stage of the Eliminate the presence of mutations, such as substitution point mutations or nonsense point mutations I can't do that. Such mutations may be caused by full sequencing of the cDNA in question. Only becomes apparent. Final validation of the resulting construct was performed by LCAT, CE Biochemical test for in vitro enzyme activity of TP and LH or presence of apoA-I This is done by detecting the presence.Example 1 :Construction of shuttle plasmid LCAT-IRES-CETP 1—Construction of conventional shuttle vector pXL2970   The expression vector pXL2968 RSV LCAT poly AbGH is Plasmid pXL2616 containing the cDNA of bovine growth hormone and polyadenylation of bovine growth hormone. Plus, located upstream of the transcription signal and under the control of the RSV promoter The midl pXL LPL was cleaved with the restriction enzymes SalI and ClaI, Obtained by ligating the obtained fragment with T4 DNA ligase.   For this purpose, Buffer 4 (2) supplemented with 100 μg / ml acetylated BSA 0 mM Tris acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate and And 1 mM DTT) Plasmids pXL RSV LPL (2 μg) and pXL2616 (2 μg) Each is digested with 10 units (u) of Clal at 37 ° C. for 90 minutes. 100 mM N aCl and 10 u of SalI were added and the reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes. Perform the renewal. Digested products were electrophoresed on a 0.7% agarose gel. After that, 6.5 kb and 1.7 kb corresponding to the cDNAs of pXLRSV and LCAT The band of b is excised from the gel and extracted with the Qiaquick kit. 2 Two bands were incubated overnight at 14 ° C with 400u T4 DNA ligase. After joining.   The recombinant plasmid pXL2969 IRES-CETP was used to introduce the NcoI site. Plasmid blue having CETP cDNA modified at the 5 'end by insertion From the script, the PCR primer 5'GCCTGAATAACCATGGTGG Prepared by GCTGCCACAG 3 '(sequence 1). Modified in this way The digested plasmid is cleaved with NcoI and SalI and digested with the same restriction enzymes. Adenovirus sequence IR contained in the cleaved plasmid pSKIRES It is cloned downstream of the ES by the following procedure.   Buffer 3 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgC12, 100 mM 2.5 μg of plasmid CETP in 2.5 mM NaCl and 1 mM DTT). μg of plasmid pSKIRES with 10 u of NcoI at 37 ° C. for 90 minutes Digestion with 10 u of SalI at 37 ° C. for 90 minutes. With the above conditions The digestion product was subjected to electrophoresis under the same conditions, and a 1.5 Kbp band (cTPDN of CETP) A) and the 3.5 Kbp band are extracted and combined.   The following procedure is used to obtain plasmid pXL2970.   4 μg of plasmid pXL2968 was added to 10 u of SalI (buffer 3 + BSA). , 37 ° C for 90 minutes). Then, the DNA was quenched with Qiaquick key. Extract and collect in 50 μl water preheated to 50 ° C. SalI cleavage The cohesive end generated by the reaction was treated with 5u Klenow polymerase at 25 ° C for 15 minutes. Incubate to blunt ends. DNA was prepared with Qiaquick kit And extracted again with 2u calf solid phosphatase (CIP) at 37 ° C for 60 minutes. Dephosphorylation by treatment. Plasmid pXL2969 (4 μg) Was first digested with 5 u of SmaI (buffer 4, 90 min at 25 ° C.) and then 5 u HincII (buffer 3 + BSA, 100 mM NaCl, 37 ° C. for 90 minutes) ) To digest. The digestion products of the two plasmids were electrophoresed on a 0.7% agarose gel. Electrophoresis, 8.5 Kbp DNA band (pXL2968) and 2.2 Kbp D Extract NA band (cDNA of IRES CETP) with Qiaquick kit And ligated with 400 u of T4 DNA ligase (FIG. 3).   Transfection of LCAT activity and CETP activity of plasmid pXL2970 Quantification is performed on the culture supernatant of 293 cells 3 days after the application.   The LCAT activity of this plasmid was 3.5% cholesterol per hour. CETP activity corresponds to 120%, corresponding to steal formation (Table 1 below). This These activity values indicate that plasmid pXL2970 is catalytically active in LCAT and CCAT. This shows that ETP is synthesized.(2) Shuttle plasmid-coli LCAT-IRES-CETP   In this technology, the shuttle vector   -For homologous recombination in cerebral bacteria surrounding the sequence LCAT-IRES-CETP The required inverted terminal repeat ITR and the capsid forming sequence ψ;   -Renders the plasmid incapable of replicating in the cerebral strain C2110 and consequently recombining An origin of replication col E1 which allows the plasmid to be cloned;   A sucrose suicide gene B (sucrose culture) to enable the selection of recombinant clones A gene that kills bacteria) and a spectinomycin resistance gene; Must be included.   For this purpose, the bicistron shuttle plasmid pXL2970 RSV L CAT-IRES-CETP is cleaved with BStEII and SpeI, and at the cleavage site The ITR sequence and the ψ sequence of the adenovirus genome were introduced, and the shuttle plasmid E. coli. Plasmid pXL2794 is digested with BStEII and XbaI To isolate the ITR and ψ sequences. Species obtained by digesting pXL2557 with EcoRV and SmaI. A fragment with blunt ends containing the cutinomycin-sucrose B cassette was identified as b Introduced into the shuttle plasmid pXL2970 + 2794 linearized with FspI (FIG. 4).   In the experiment, the following protocol is used.   Digest 3 μg of plasmid pXL2970 with 20 u of BStEII (buffer A: 10 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT; 90 min at 60 ° C.), then digest with 10 u SpeI (37 90 ° C).   The resulting DNA fragment was extracted with a Qiaquick kit and 2u of CI Dephosphorylate with P (90 ° C. for 90 minutes). Plasmid pXL2794 is Digest with BStEII (buffer 2, 90 min at 60 ° C.), then 20 u Xba Digest with I (90 min at 37 ° C). 6.5 Kbp band (pXL2970) Electrophoresis of 2.9 Kbp band (ITR ψ and Kanr of pXL2794) It is later extracted and ligated by T4 DNA ligase (4000 u).   The resulting plasmid pXL2970 + 2794 (1.5 μg) Was cleaved with 5u of FspI (buffer 4, 60 minutes at 37 ° C) and Qiaquick The plasmid pXL2557 was extracted with the kit, and 10u of SmaI (buffer 4, Digested sequentially with 25 ° C. for 90 minutes) and 10 u of EcoRV (37 ° C. for 90 minutes) 3.8 Kbp extracted from the gel containing the obtained cassette sacB-spectr (T4 DNA ligase, 400u).   Shuttle plug in spectinomycin medium and spectinomycin + sucrose medium The primary selection is the Smid pXL2974 LCAT-IRES-CETP. Nco I (6.2 + 3 + 2.2 + 2), NotI (13.5 Kbp) and EcoRV ( (1 + 3 + 9.5 Kbp) digestion results are consistent with the restriction maps of these plasmids. .   The LCAT activity of plasmid pXL2974 was 2% cholesterol per hour. The CETP activity corresponds to 114%, corresponding to the formation of the ester (Table 1). Shi LCAT activity even with DNA plasmid-coli LCAT-IRES-CETP And the presence of CETP activity. Example 2:Construction of shuttle plasmid RSV LCAT-IRES-LH   The cDNA of LH was cloned downstream of the IRES in the vector bluescript. And the fragment IRES-LH was converted to a vector L according to the following protocol. It is incorporated in the same manner as CAT-IRES-CETP.   Plasmid pXL2971 (4 μg) was added to 40I. U. Digested with BglII Buffer 3, 37 ° C. for 90 minutes) and then erase with 40 u of SalI at 37 ° C. for 90 minutes. To remove the NcoI site. 2.5 obtained after these digestions The DNA fragment of Kbp (weight about 0.5 μg) was subjected to gel electrophoresis and extraction. NcoI in buffer 4 (0.1-1 u / μg DNA) (NcoI) at 37 ° C. for 60 minutes. 0.7% of digestion products Analyzed by garose gel electrophoresis and obtained with 0.5 u of NcoI L The 1.5 Kbp band containing the cDNA of HABC was excised from NcoI and SalI. Fragment (pSK) obtained by hydrolysis (Iu enzymes, buffer 3, 37 ° C.)   Ligation to IRES (1.3 μg) (T4 DNA ligase, 400 u).   The final vector is shown in FIG. Corresponding bicistron shuttle vector-LCA T-IRES-LH is designated as plasmid pXL2984. Example 3:Construction of shuttle plasmid ApoAI-IRES-LCAT   The general principle of this construction is equivalent to the previous embodiment. LCAT suddenly by PCR Additional NcoI site so that it can be mutated and bind to the appropriate location downstream of the IRES Is introduced. The entire sequence of this construct has been analyzed. Next, the fragment IRE S-LCAT is bound downstream of Apo AI. after processing by E. coli technology The resulting vector is named pXL3058 (see FIG. 6). The activity of the viral vector obtained after routine double recombination was tested. A Po-A-I was detected by Western blot and LCT activity was estimated at 1.3%. (Background noise 0.2%).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 9/20 9/20 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 セギユレ，サンドリヌ フランス国、エフ―78180・モンテイニ・ ル・ブルトヌー、リユ・シヤルル・リネ、 13──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 7/00 C12N 7/00 // C07K 14/435 C07K 14/435 C12N 9/10 C12N 9/10 9 / 20 9/20 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AU, BA, BB, BG, BR, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GH, HU, ID IL, IS, JP, KP, KR, LC, LK, LR, LT, LV, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, SL, TR, TT , UA, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventors Seguirre, Sandrinu France, F-78180 Montinini-le-Bretonneux, Rille-Charlarne-Rine, 13

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または補 因子をコードする少なくとも２つの核酸を含み、前記核酸が転写プロモーターに 作動的に連結され、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって 互いに隔てられていることを特徴とする欠陥組換えウイルス。 ２．挿入される核酸が、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ ＬＣＡＴ）、コレステロールエステル運搬タンパク質（ＣＥＴＰ）、肝性リパー ゼ（ＬＨ）、アポリポタンパク質ＡＩもしくはＡＩＶまたはこれらの変異体の全 体または一部をコードする遺伝子から選択されることを特徴とする請求項１に記 載の欠陥組換えウイルス。 ３．核酸が好ましくは、ヒトの対応する酵素、タンパク質及び／または補因子の 全体または一部をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に 記載の欠陥組換えウイルス。 ４．核酸がより好ましくは、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡであることを特徴とする請 求項１から３のいずれか一項に記載の欠陥組換えウイルス。 ５．核酸の１つがＬＣＡＴをコードすることを特徴とする請求項１から４のいず れか一項に記載の欠陥組換えウイルス。 ６．第二の核酸がＣＥＴＰ、ＬＨまたはＡｐｏＡＩをコードすることを特徴とす る請求項５に記載の欠陥組換えウイルス。 ７．転写プロモーターが好ましくは、アデノウイルスの核酸配列Ｅ１Ａ、ＭＬＰ のプロモーター、ＣＭＶ、ＲＳＶ−ＬＴＲ、ＭＴ−１、ＳＶ４０のプロモーター から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の欠陥組 換えアデノウイルス。 ８．ＩＲＥＳ配列かピコルナウイルスに由来することを特徴とする請求項１から ７のいずれか一項に記載の欠陥組換えウイルス。 ９．ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列が脳心筋炎ウイルスまたはポリオウイルス に由来することを特徴とする請求項８に記載の欠陥組換えウイルス。 １０．感染細胞中で複製するために必要なゲノムの領域が少なくとも欠失してい ることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の欠陥組換えウイルス 。 １１．好ましくはアデノウイルス、好ましくはヒトのＡｄ５型 もしくはＡｄ２型または動物起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求 項１から１０のいずれか一項に記載の欠陥組換えウイルス。 １２．コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または 補因子をコードする少なくとも２つの核酸を含み、前記核酸が転写プロモーター に作動的に連結され、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によっ て互いに隔てられていることを特徴とする欠陥組換えアデノウイルス。 １３．ＬＣＡＴをコードする遺伝子とＬＨをコードする遺伝子とを少なくとも含 み、前記遺伝子が転写プロモーターに作動的に連結され、内部リボソーム侵入部 位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられていることを特徴とする請 求項１２に記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １４．ＬＣＡＴをコードする遺伝子とアポＡ−Ｉをコードする遺伝子とを少なく とも含み、前記遺伝子が転写プロモーターに作動的に連結され、内部リボソーム 侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられていることを特徴と する請求項１２に記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １５．ＬＣＡＴをコードする遺伝子とＣＥＴＰをコードする遺 伝子とを少なくとも含み、前記遺伝子が転写プロモーターに作動的に連結され、 内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられてい ることを特徴とする請求項１２に記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １６．ｐＸＬ２９７４とｐＸＬ２８２２との相同組換えによって得られることを 特徴とする請求項１５に記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １７．領域Ｅ１内の欠失と領域Ｅ３内の欠失とを少なくとも含むことを特徴とす る請求項１２から１６のいずれか一項に記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １８．アデノウイルスゲノムと、コレステロールの逆輸送に関与する別々のタン パク質、酵素及び／または補因子をコードする少なくとも２つの核酸とを含み、 前記２つの核酸が転写プロモーターに作動的に連結され、内部リボソーム侵入部 位ＩＲＥＳをコードする配列によって互いに隔てられていることを特徴とする原 核性プラスミド。 １９．原核細胞中の複製を可能にする第一領域と、アデノウイルスゲノム中に存 在しない１つまたは複数の制限部位に隣接されたアデノウイルスゲノムを含みか つコレステロールの逆輸送 に関与する別々のタンパク質、酵素及び／または補因子をコードする少なくとも ２つの核酸を含む第二領域とから成り、前記２つの核酸が転写プロモーターに作 動的に連結され、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列によって互 いに隔てられていることを特徴とする原核性プラスミド。 ２０．アデノウイルスゲノムの領域Ｅ１及びＥ３が欠失していることを特徴とす る請求項１８または１９に記載の原核性プラスミド。 ２１．ウイルスのＩＴＲ配列及びψ配列を含むことを特徴とする請求項１８から ２０のいずれか一項に記載の原核性プラスミド。 ２２．複製起点がＲＫ２、ｐＢＲ３２２及びｐＵＣから選択された細菌プラスミ ドに由来することを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の原核 性プラスミド。 ２３．５’から３’の方向に、原核細胞中の機能性複製起点と、ウイルスのＩＴ Ｒ配列及びψ配列から成るアデノウイルスゲノムの第一部分と、転写プロモータ ーと、コレステロールの逆輸送に関与する酵素、タンパク質及び／または補因子 をコードする第一の核酸と、ＩＲＥＳ配列と、コレステロールの逆輸送に 関与する酵素、タンパク質及び／または補因子をコードする第二の核酸と、ポリ アデニル化部位と、領域ｐＩＸ−ＩＶａ２から成るアデノウイルスゲノムの第二 部分とを少なくとも含む原核性プラスミド。 ２４．前記プラスミドを含む原核細胞を選択し得る領域を更に含むことを特徴と する請求項１８から２３のいずれか一項に記載の原核性プラスミド。 ２５．核酸の少なくとも１つがＬＣＡＴをコードしており、第二の核酸がＬＨ、 ＡｐｏＡＩまたはＣＥＴＰをコードする核酸から選択されることを特徴とする請 求項１８から２４のいずれか一項に記載の原核性プラスミド。 ２６．ＬＣＡＴ及びＣＥＴＰをそれぞれコードする核酸を含むｐＸＬ２９７４で あることを特徴とする請求項２５に記載の原核性プラスミド。 ２７．ＬＣＡＴ及びＡｐｏＡＩをそれぞれコードする核酸を含むｐＸＬ３０５８ であることを特徴とする請求項２５に記載の原核性プラスミド。 ２８．コレステロールの逆輸送に関与する別々の酵素、タンパク質及び／または 補因子をコードする２つの核酸を含み、前記 ２つの核酸が転写プロモーターと、ポリアデニル化部位と、２つの核酸の間に配 置された内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳをコードする配列とに作動的に連結さ れていることを特徴とするシャトルプラスミド。 ２９．ＬＨ及びＬＣＡＴをそれぞれコードする２つの核酸を含むプラスミドｐＸ Ｌ２９８４であることを特徴とする請求項２８に記載のシャトルプラスミド。 ３０．ＬＣＡＴ及びＣＥＴＰをそれぞれコードする２つの核酸を含むプラスミド ｐＸＬ２９７０であることを特徴とする請求項２８に記載のシャトルプラスミド 。 ３１．請求項１８から２７のいずれか一項に記載の原核性プラスミドによって形 質転換された原核細胞。 ３２．低アルファリポタンパク質血症に関連した疾患の治療用または予防用の医 薬組成物を調製するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の欠陥組換 えウイルス、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス 、または、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のプラスミドの使用。 ３３．アテローム性動脈硬化症及び／または再発狭窄症の治療用の医薬組成物を 調製するための請求項３２に記載の使用。 ３４．請求項１から１１のいずれか一項に記載の１つまたは複数の欠陥組換えウ イルス、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または、 請求項２８から３０のいずれか一項に記載のプラスミドを含む医薬組成物。 ３５．注射剤の形態を有しており、１０4〜１０14ｐｆｕ／ｍｌのアデノウイル スを含有することを特徴とする請求項３４に記載の医薬組成物。[Claims] 1. At least two nucleic acids encoding separate enzymes, proteins and / or cofactors involved in the reverse transport of cholesterol, said nucleic acids being operably linked to a transcription promoter and being linked to each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. A defective recombinant virus characterized by being separated. 2. The inserted nucleic acid is derived from a gene encoding lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT), cholesterol ester transfer protein (CETP), hepatic lipase (LH), apolipoprotein AI or AIV or all or a part of these variants. The defective recombinant virus according to claim 1, which is selected. 3. The defective recombinant virus according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid is preferably a gene encoding all or part of a corresponding enzyme, protein and / or cofactor of human. 4. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleic acid is more preferably cDNA or gDNA. 5. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 4, wherein one of the nucleic acids encodes LCAT. 6. The defective recombinant virus according to claim 5, wherein the second nucleic acid encodes CETP, LH or ApoAI. 7. The transcription promoter is preferably selected from the adenovirus nucleic acid sequence E1A, MLP promoter, CMV, RSV-LTR, MT-1, SV40 promoter. The defective recombinant adenovirus according to claim 1. 8. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 7, wherein the IRES sequence is derived from a picornavirus. 9. 9. The defective recombinant virus according to claim 8, wherein the IRES sequence of Picornavirus is derived from encephalomyocarditis virus or poliovirus. 10. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 9, wherein at least a region of a genome required for replication in infected cells is deleted. 11. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 10, characterized in that it is preferably an adenovirus, preferably a human Ad5 or Ad2 type or an adenovirus of animal origin. 12. At least two nucleic acids encoding separate enzymes, proteins and / or cofactors involved in the reverse transport of cholesterol, said nucleic acids being operably linked to a transcription promoter and being linked to each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. A defective recombinant adenovirus, which is separated. 13. 10. The method according to claim 10, wherein said gene comprises at least a gene encoding LCAT and a gene encoding LH, said genes being operably linked to a transcription promoter and separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. 13. The defective recombinant adenovirus according to 12. 14． At least a gene encoding LCAT and a gene encoding Apo A-I, said genes being operably linked to a transcription promoter and separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. 13. The defective recombinant adenovirus according to claim 12. 15. A method comprising: at least a gene encoding LCAT and a gene encoding CETP, said genes operably linked to a transcription promoter and separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. 13. The defective recombinant adenovirus according to 12. 16. The defective recombinant adenovirus according to claim 15, which is obtained by homologous recombination between pXL2974 and pXL2822. 17． The defective recombinant adenovirus according to any one of claims 12 to 16, comprising at least a deletion in the region E1 and a deletion in the region E3. 18. An adenovirus genome and at least two nucleic acids encoding separate proteins, enzymes and / or cofactors involved in reverse transport of cholesterol, wherein the two nucleic acids are operably linked to a transcription promoter and internal ribosome entry A prokaryotic plasmid, wherein the prokaryotic plasmids are separated from each other by a sequence encoding the site IRES. 19. A separate protein, enzyme, comprising a first region enabling replication in prokaryotic cells and the adenovirus genome flanked by one or more restriction sites not present in the adenovirus genome and involved in reverse transport of cholesterol And / or a second region comprising at least two nucleic acids encoding a cofactor, said two nucleic acids being operably linked to a transcription promoter and separated from each other by a sequence encoding an internal ribosome entry site IRES. A prokaryotic plasmid, characterized in that: 20. The prokaryotic plasmid according to claim 18 or 19, wherein the adenovirus genome regions E1 and E3 are deleted. 21. 21. The prokaryotic plasmid according to any one of claims 18 to 20, comprising a viral ITR sequence and a ψ sequence. 22. The prokaryotic plasmid according to any one of claims 18 to 21, wherein the origin of replication is derived from a bacterial plasmid selected from RK2, pBR322 and pUC. 23.5 'to 3', involved in the functional origin of replication in prokaryotic cells, the first part of the adenovirus genome consisting of the viral ITR and ψ sequences, the transcription promoter and the reverse transport of cholesterol. A first nucleic acid encoding an enzyme, protein and / or cofactor; an IRES sequence; a second nucleic acid encoding an enzyme, protein and / or cofactor involved in reverse cholesterol transport; a polyadenylation site; A prokaryotic plasmid comprising at least a second part of the adenovirus genome consisting of the region pIX-IVa2. 24. The prokaryotic plasmid according to any one of claims 18 to 23, further comprising a region capable of selecting a prokaryotic cell containing the plasmid. 25. 25. The prokaryotic of any one of claims 18 to 24, wherein at least one of the nucleic acids encodes LCAT and the second nucleic acid is selected from nucleic acids encoding LH, ApoAI or CETP. Plasmid. 26. 26. The prokaryotic plasmid of claim 25, which is pXL2974 containing nucleic acids encoding LCAT and CETP, respectively. 27. 26. The prokaryotic plasmid of claim 25, which is pXL3058 containing nucleic acids encoding LCAT and ApoAI, respectively. 28. Comprising two nucleic acids encoding separate enzymes, proteins and / or cofactors involved in the reverse transport of cholesterol, wherein the two nucleic acids are a transcription promoter, a polyadenylation site, and an interior located between the two nucleic acids. A shuttle plasmid operably linked to a sequence encoding a ribosome entry site IRES. 29. 29. The shuttle plasmid according to claim 28, which is a plasmid pXL2984 containing two nucleic acids respectively encoding LH and LCAT. 30. 29. The shuttle plasmid according to claim 28, which is a plasmid pXL2970 containing two nucleic acids encoding LCAT and CETP, respectively. 31. A prokaryotic cell transformed with the prokaryotic plasmid of any one of claims 18 to 27. 32. The defective recombinant virus according to any one of claims 1 to 11, for preparing a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with hypoalphalipoproteinemia. 31. Use of a recombinant adenovirus according to any one of claims or a plasmid according to any one of claims 28 to 30. 33. 33. Use according to claim 32 for preparing a pharmaceutical composition for the treatment of atherosclerosis and / or restenosis. 34. 18. One or more defective recombinant viruses according to any one of claims 1 to 11, an adenovirus according to any one of claims 12 to 17, or any one of claims 28 to 30. A pharmaceutical composition comprising the plasmid according to Item. 35. 35. The pharmaceutical composition according to claim 34, which is in the form of an injection and contains 10 4 to 10 14 pfu / ml of adenovirus.
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