JP2001506122A

JP2001506122A - Monoclonal antibody fragment having immunosuppressive action

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Publication number: JP2001506122A
Application number: JP51728896A
Authority: JP
Inventors: ゾルタンネイジー; ダミールヴィドヴィック
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-11-25
Publication date: 2001-05-15
Also published as: CZ172497A3; MA23739A1; BR9509902A; TR199501542A2; FI972430A0; PE52996A1; AU4256096A; ZA9510195B; MX9704225A; PL320610A1; WO1996017874A1; HUT77342A; NO972522D0; CA2206471A1; CO4480041A1; AR002005A1; FI972430A; NO972522L; CN1168679A; IL116228A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗原提示細胞上のHLA-DRの発現をダウンレギュレーションする能力を有するmAbの1価mAb断片（Fab）を含む。Fab断片は、由来するmAbまたはmAbの2価断片（F(ab)'₂）の細胞毒性作用を示すことなく、HLA-DRの発現をダウンレギュレーションすることができる。従って、本発明のFab断片は、細胞毒性副作用を伴わない、強力なクラスII MHC特異的免疫抑制化合物である。 (57) SUMMARY The present invention includes a monovalent mAb fragment (Fab) of a mAb that has the ability to down-regulate HLA-DR expression on antigen presenting cells. Fab fragments can down regulate HLA-DR expression without exhibiting the cytotoxic effects of the mAb or divalent fragment of the mAb (F (ab) ' ₂ ). Thus, the Fab fragments of the present invention are potent class II MHC-specific immunosuppressive compounds without cytotoxic side effects.

Description

【発明の詳細な説明】免疫抑制作用を有するモノクローナル抗体断片クラスII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子は、抗原ペプチド断片に結合し、これらの抗原ペプチド断片をヘルパー（CD4⁺）T細胞（「Th」細胞）に提示する（参考文献1）。クラスII MHC分子に特異的なモノクローナル抗体（mAb）は、インビトロにおいてTh細胞の免疫応答の非常に強力な選択的阻害剤であることが報告されている（参考文献2）。このようなモノクローナル抗体は発見されて以来、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の選択的免疫抑制治療に使用できる可能性のある薬物として考えられている。初期のインビボにおける研究により、これらmAbがTh細胞性異種および自己免疫応答に対して与える有用な影響が明らかにされた（参考文献3〜6）。しかしながら、クラスII MHC特異的mAbを実験的にインビボに適用することで、予測できない合併症を生じ、実験用霊長類が死亡する場合もあった（参考文献7、8）。後者が観察されたことにより、MHC特異的m Abによる免疫調節に関するその後の研究に対する関心が低くなった。最近の報告により、トランスジェニックマウスにおいて、クラスII MHC発現が10倍低下すると、抗原提示が不十分であることにより、Th細胞反応が生じないことが示されている（参考文献19）。これは、インビボモデルでは、クラスII MHCの発現の低下は免疫抑制と相関していることを示している。本発明によれば、HLA-DR発現をダウンレギュレーションする能力を有するmAb の一価mAb断片（Fab）は、驚くべきことにmAb自体またはmAbの２価断片（F(ab)'₂ ）の細胞毒性を示さずに、それ自体で、HLA-DR発現をダウンレギュレーションできるということがわかった。従って、本発明のFab断片は、細胞毒性による副作用を伴わない、強力なクラスII MHC特異的免疫抑制化合物である。より具体的に本発明について説明する前に、図面の簡単な説明を以下に示す。図1:EBVで形質転換したB細胞株プリース（Priess）に対するDR結合競合ペプチドおよびDR特異的mAbの効果。図2：LG2に対するmAb L243の調節作用および細胞毒性作用の経時変化。図3：mAb除去後のLG2に対するL243の調節作用および細胞毒性作用の持続時間。図4：DR特異的mAb L243およびその断片の存在下での共存培養後の、種々のAPC 集団に対するHLA-DR発現のダウンレギュレーション。図5：EBVで形質転換したB細胞株LG2に対するDR特異的Fab断片の濃度増加の効果。図6：LG2細胞に対するL243およびその断片の長期共存培養の効果。図7：DR架橋に対するEBV-LCL細胞毒性の依存度。図8：休止期B細胞および単球／マクロファージに対するDRのダウンレギュレーションの選択性。図9：未熟B細胞に対するDRのダウンレギュレーションの選択性。図10：LG2細胞に対するDRのダウンレギュレーションの選択性。図11：mAbによるDRのダウンレギュレーションのアロタイプ非選択性。図12：TS-10細胞に対する1-1C4 FabによるPanクラスIIダウンレギュレーション。図13：L243およびその断片の存在下でのLG2およびプリース（Priess）細胞の共存培養後の、TNFα分泌増加の欠如。図14：Th細胞阻止およびDRのダウンレギュレーションに必要な抗体濃度。図15：固定されたAPCによる抗原提示に対する抗DR mAbおよびFab断片の効果。図16：mAb、Fab、およびペプチド拮抗物質の効力に対する抗原負荷の効果。図17：抗原の用量-応答曲線に対するFabおよびペプチドの相対的効果。図18：進行中のT細胞応答に対するクラスII拮抗物質の効果。 HLA-DR（「DR」型ヒト白血球抗原；クラスII主要組織適合遺伝子複合体（「MH C」）分子）に特異的である、ある種のモノクローナル抗体（mAb）は、抗原提示細胞（「APC」）である白血球の表面のHLA-DR分子の発現を約90％ダウンレギュレーションすることができる。同mAbは、また、活性化のためHLA-DR分子による抗原提示を必要とするヒトTh細胞クローンの活性化も阻害する。mAbの阻害力は、現在入手可能なペプチド拮抗物質の阻害力より、数100倍から数1000倍大きい（下記表１参照）。HLA-DR発現のダウンレギュレーションおよびTh細胞の活性化阻害は、免疫抑制作用を生ずる薬理学的作用である。この免疫抑制作用は、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの治療に有用と考えられる。本発明によれば、HLA-DR発現をダウンレギュレーションすることができるmAb の一価の抗原結合性mAb断片（Fab）は、驚くべきことにmAb自体またはmAbの2価断片（F(ab)'₂）の細胞毒性を示さずに、それ自体で、HLA-DR発現をダウンレギュレーションできるということがわかった。従って、本発明のFab断片は、細胞毒性による副作用を伴わない、強力なクラスII MHC特異的免疫抑制化合物である。従って、本発明には、全長のmAbが抗原提示細胞に対する細胞毒性を示し、残りの抗原提示細胞に対するHLA-DR発現をダウンレギュレーションする抗HLA-DR mAb のFab断片が含まれる。該mAbはTh細胞の活性を阻害する。本発明のFab断片が誘導されるmAbは、全てHLA-DRの最初のドメインに結合する。本発明において有用なダウンレギュレーション作用のある３種類のmAbの例としては、 LB3.1（マウスIgG_2b、pan-DRα1特異的；参考文献9〜10）と、 L243（マウスIgG_2a、pan-DRα1特異的；参考文献10〜11；ATCC寄託番号HB55）と、 SFR3-DR5（ラットIgG_2b、DRB^*110X特異的；参考文献13；ATCC寄託番号HB-151）とが挙げられる。また、HLA-DRをダウンレギュレーションする作用があり、さらに、HLA-DQおよびHLA-DPをダウンレギュレーションする作用があるmAbである1-1C4（マウスIgG₂ _a 、β鎖特異的；参考文献14）は、実施例22に記載の常法によって産生された。従って、上記mAbのFab断片は、本発明に含まれる。ダウンレギュレーション作用のあるmAbがTh細胞の活性化を阻害する能力を有することと矛盾することなく、ダウンレギュレーション作用のない５種のmAb、C CCL20（マウスIgG_2b、3種のDRB1（β鎖）対立遺伝子型（DRB1^*0101、DRB1^*0401 、DRB1^*0404）に特異的；参考文献12）、および8D1、9F1、9F2、10F12（4種は全てマウスIgG1）は、Th細胞の活性化をごく微弱にしか阻害しない、または全く阻害しない。活性なmAbは、B細胞系リンパ芽球腫細胞および正常な活性化B細胞の小集団に細胞毒性作用を示す。mAbの2価F(ab)'₂断片は、mAbと同様に、ダウンレギュレーション作用を仲介するが、細胞毒性作用もある。しかしながら、本発明によれば、mAbの1価Fab断片は細胞毒性作用を減弱しているが、驚くべきことに由来となるm Abのダウンレギュレーション特性は保持している。本発明のFab断片を得るために使用される抗HLA-DR mAbは、例えば、一般的にはケーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）によって最初に報告された方法など、通常のどの手段を用いても産生できる。モノクローナル抗体は、抗原をマウスもしくはラット、ウサギ、ヒツジなど（好ましくはマウス）に注射することにより、免疫された動物から抗体産生細胞を回収して、例えば、PAIマウス骨髄腫細胞、SP2/0-Ag14細胞、またはSP2/0-Ag14細胞（ATCC番号CRL 1581；AT CC番号CRL 8287）（抗体産生の一般的指針に関しては、例えば「Cold Spring Ha rbor Laboratory Press(1988)編、Harlow&Lee著、抗体実験手引書（Antibodies- ALaboratory Manual）」などを参照のこと）などの、骨髄腫細胞との融合といった常法で得られた細胞を不死化することによって、調製することができる。その後、ハイブリドーマの培養上清は、放射線免疫検定法、または酵素免疫検定法、またはドット-免疫結合検定法、または免疫蛍光検定法のような常法によって、モノクローナル抗体（mAb）をスクリーニングすることができる。mAbは、例えばイオン交換クロマトグラフィー、固体支持体に結合させたプロテインA、抗免疫グロブリン抗体、または抗原もしくはその一部によるアフィニティークロマトグラフィーなどの通常のクロマトグラフィーによる方法によって、ハイブリドーマ上清から精製することができる。本発明において有用なmAbの産生法は実施例22 に示す。当業者に周知の方法によれば、大量のmAbを産生するためには、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを、注射前に、例えばプリスタン（pristane）などで前処理したマウスに腹腔内注射することができる。その結果生じた１匹のマウスの腹水腫瘍から約100mg以下のmAbが産生される。mAbは、上記方法によって生じた腫瘍により産生される腹水から精製することができる。 mAbは、オクタロニー（Ouchterlony）免疫拡散法などの既知の方法によって、サブクラスを特定できる。mAbは種々の用途のために改変できること、または依然として抗原に結合できるその断片を産生できることも、当業者に既知である。該断片は、例えばパパイン、ペプシンなどによるmAbの酵素的な消化などによって産生されうる。本発明において使用できるmAbを産生するための免疫原は、好ましくは、SDS-P AGEなどの常手段によって精製されたHLA-DRのβ鎖である（例えば、国際公開第9 2/10589号(W092/10589)、Ｊ．Biol．Chemistry 262，8748〜8758(1987)、塩基配列に関する情報は、例えばGenbank（Intelligenetics、カリフォルニア州、米国）、European Bioinformatics Institute（HinxtonHall、ケンブリッジ、英国）、NBRF（ジョージタウン大学医療センター、ワシントンDC、米国）およびVecbas e（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、Medision、ウィスコンシン州、米国）のような塩基配列データベースからも入手できる。塩基配列は、本発明に使用するためのモノクローナル抗体を調製するための抗原を産生する当業者に既知の方法に使用されることが可能である）。 APCに細胞毒性を示し、HLA-DR発現をダウンレギュレーションする作用もある、上記の抗HLA-DRmAbの同定は、通常のどの手段によっても実施することができる。好ましくは、このような抗HLA-DR mAbの同定は、エプスタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr Virus）で形質転換されたヒトB細胞系リンパ芽球細胞株（EBV-LCL）がAPCのモデルとして使用される実施例3に従って、実施される（特に、活性化B細胞）。好ましくは１ミリリットルあたり約10⁵個のEBV-LCL細胞を含有する少なくとも１mlの培養物が使用される。この培養物は、20nMの抗HLA-DR mAbの存在下で16時間培養され、通常の手段によって、死んだ細胞数と生き残った生存能力のある細胞によるHLA-DR発現が測定される。本発明の目的を達成するにあたり、細胞毒性およびダウンレギュレーションは、1）上記条件下において、全長のmAbによって、EBV-LCL抗原提示細胞の少なくとも25％、好ましくは40％が死滅する場合、このmAbは抗原提示細胞に細胞毒性である、および2）mAbが上記条件下において、生存するEBV-LCL抗原提示細胞の表面のHLA-DR分子数を少なくとも平均50％減少させる場合、このmAbは抗原提示細胞におけるHLA-DR発現をダウンレギュレーションする、と定義される。通常の免疫蛍光法により、死んだ細胞を検出し、生き残った生存能力のある細胞のHLA-DR発現を測定するために、EBV-LCL抗原提示細胞を標識する。これらの細胞は、フローサイトメーター（flow cytometer）（例えば、FACScan,Becton-D ickinson,San Jose，California）を用いて分析され、死んだ細胞の割合と生き残った細胞におけるHLA-DR発現の低下を、通常の手段によって、好ましくはフローサイトメーターに通常使用されるソフトウェア（例えばFACScanサイトメーターに使用されるLYSIS IIソフトウェア）を用いて算出される。所望の性質を有するモノクローナル抗体をスクリ−ニングするために使用されるEBV-LCLは重要ではない。本発明において、通常のいかなるEBV-LCLも使用できる。本発明において有用なEBV-LCLの例としては、プリース（Priess）（ECACC(S alisbury,UK)寄託番号86052111）、LG2（Istituto Nazionale Per La Ricerca S ul Cancro(Genova,Italy)寄託番号G201 12301)、およびTS-10（ECACC(Salisbury ,UK)寄託番号85102911）が挙げられる。上記mAbのFab断片は、通常のいかなる手段によっても産生されうる。このFab 断片は当業者に既知の手段（例えば、「アンドリュー(Andrew)およびチツス（Ti tus）著、免疫グロブリンGの断片化（Fragmentation of immunoglobulin G）」、「免疫学における最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）、Col iganら編（Greene&Wiley 1994)」）を用いて、由来となるmAbをペプシンによって消化して、Fab断片を分離することによって産生される。従って、該方法、および該方法を用いて調製されたFab断片も本発明の目的とするところである。好ましくは、本発明のFab断片は、所望のFab断片をコードする遺伝子を発現する組換え細胞株によって産生される。組換え細胞株は、通常のいかなる手段によっても産生される。例えば、Fab断片をコードする遺伝子部分は、このFab断片の由来となるmAbを分泌するハイブリドーマから、通常の手段を用いてクローニングされるだろう。次いで、このFab断片のcDNAは、通常の手段によって、適当な細胞株に形質導入するために使用される発現ベクターに挿入される。本発明の好ましいFab断片は、ヒトに投与されたとき、動物、好ましくはマウスmAbから直接産生されるFab断片よりも抗原性が少なくなるように「ヒト化（hu manized）」される。本発明のヒト化Fab断片を産生する方法は重要ではない。当業者に既知の通常のいかなる手段も使用することができる。そのような方法では、モノクローナル抗体などのいかなる免疫グロブリン（Ig）も、不変領域と抗原の結合が生じる可変領域とを含むことを利用している。また、可変領域は、フレームワーク領域に存在する６つの相補性決定領域（「CDR」）からなる（Igの軽鎖および重鎖のそれぞれに3つのCDRがある）（参考文献42）。mAbの特異性に寄与するのはこのCDRである。mAbはマウスまたはその他の動物種由来であるので、mAb のヒト化は、本質的にヒト免疫グロブリンのCDRの少なくとも1つ、好ましくは6 つ全てを所望の特異性を有する動物mAbの対応するCDRと交換することによって、実施される。従って、ヒトIgは動物CDRのフレームワークとして機能する。該方法において、動物mAb（通常はマウスである）は「供与体（donor）」と記載され、ヒトIgは「受容体（acceptor）」と記載される。さらに、当技術分野において既知のヒト化mAbは、その抗原特異性を最適化するために、アミノ酸配列の「微調整」が実施されることもある。例えば、国際公開第90/7861号（W090/7861）には、10〜20個のヒトIgのパネルをスクリーニングし、可変領域がマウス供与体mAbの可変領域と最も相同性が高く、典型的には65 〜70％またはそれ以上の相同性を有するヒトIgを受容体として使用するべきであると開示されている。さらに、国際公開第90/7861号(W090/7861)の12〜15ページに開示されている4つの基準に基づくCDRの外側、供与体アミノ酸と受容体アミノ酸との置換（一般的には約３個の置換）を行うことができる。当技術分野において既知のヒト化の他の例として、欧州特許出願第0 620 276 号は、ヒト化mAbの特異性を増すために、供与体CDR移植片の外側の受容体Igに実施することができる特定の置換の階層を開示している。置換により、可変領域が供与体mAbの可変領域と相同性が高いヒト受容体Igを選択する必要性がなくなることが開示されている。ヒト化のための特別なプロトコルは、欧州特許出願第0 620 276号の8〜9ページに示されている。本発明のFab断片を得るために有用な全長のヒト化mAbを宿主細胞内で発現させるためのDNA配列、または本発明のヒト化Fab断片を発現させるためのDNA配列を作成するための方法は、当技術分野において既知であり重要ではない。該方法には、例えば、部位特異的突然変異誘発、ヒトのフレームワーク領域上へ動物CDR を組み込む重複オリゴヌクレオチドを用いて可変領域全体を構築する方法、およびPCRグラフティングが含まれる（国際公開第90/7861号(W090/7861)、欧州特許出願第0 620 276号、参考文献43）。従って、さらに本発明は、免疫グロブリンFab断片と該免疫グロブリンFab断片内に含有される6つの相補性決定領域とを含み、相補性決定領域のうちの1つ〜6 つが、 1）HLA-DRの第1ドメインに結合し、 2）HLA-DRを発現する抗原提示細胞に対して細胞毒性作用を示し、 3）抗原提示細胞上のHLA-DR発現をダウンレギュレーションする、という性質を有するモノクローナル抗体の相補性決定領域である、Fab断片として記載できる。本発明の好ましい態様は、上記によれば、免疫グロブリンFab断片がヒト由来であり、1〜3の性質を有するモノクローナル抗体が動物、好ましくはマウス由来であるヒト化Fab断片である。このヒト化Fab断片は、そこに含有される1から6の CDRが動物mAbの対応するCDRと置換されたヒト免疫グロブリンFab断片である。従って、本発明の好ましいFab断片は、ヒト免疫グロブリンFab断片とヒト免疫グロブリンFab断片内に含有される6つの相補性決定領域とを含み、相補性決定領域のうちの1つ〜6つが上記の1〜3の性質を有するモノクローナル抗体の相補性決定領域である、Fab断片である。この本発明のヒト化Fab断片は、動物mAb CDRの6つ全てを含むことが好ましい。免疫グロブリンFab断片が動物由来である場合には、本発明のFab断片は上記の 1〜3の性質を有するモノクローナル抗体自体のFab断片であってもよい。該Fab断片は、本発明の好ましいヒト化Fab断片に含まれる動物CDRを得るために使用する中間物質として有用だろう。本発明の好ましいFab断片は、上記のモノクローナル抗体LB3.1、L243、SFR3-D R5、および1-1C4から得られるFab断片と同様の性質を有する。本発明のFab断片はTh細胞の活性化を阻害するので、活性化されたTh細胞が病害または症状の原因である種々の疾病の治療に使用することができる。該疾病の1つは慢性関節リウマチである（参考文献33）。慢性関節リウマチ患者のAPC上のHLA-DRのダウンレギュレーション、ならびにそれによる患者のTh細胞活性化の阻害により、この疾病の進行を緩徐化または停止させると考えられる。慢性関節リウマチ患者におけるTh細胞活性化の阻害はまた、疼痛および炎症などの症状の原因である媒介物質の放出を減少または停止させることによって、このような症状も軽減すると考えられる。従って、本発明はまた、本明細書に記載されたFab断片、および治療上有効な薬剤、特に免疫抑制剤としての、より具体的には慢性関節リウマチの治療のためのFab断片の使用、ならびに本発明のFab断片を治療上の有効量を治療が必要な患者に投与することを含む、患者の免疫応答を抑制する方法を含む。本発明はさらに、本発明のFab断片を治療上の有効量を治療が必要な患者に投与することによって、患者の慢性関節リウマチを治療する方法を含む。投与すべきFab断片の量は通常のいかなる手段によっても決定することができる。また、本発明のFab断片の投与は通常のいかなる方法によっても実施することができる。本発明のFab断片の投与は、好ましくは本発明の薬学的組成物を用いて行われる（下記に記載）。投与は、好ましくは非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与）、特に静脈内投与で実施される。患者のTh細胞活性化を阻害し、それによって慢性関節リウマチを治療するのに必要な用量は、例えば用量制限臨床試験などの通常のいかなる方法でも、決定することができる。しかしながら、約1〜10mg／日、特に約3mg〜7mg／日、特に約5mg／日の用量の静脈内投与が好ましく（参考文献34、35）、好ましくは一回の大量投与として輸送される。治療は、好ましくは1日1回、1週間もしくはそれ以内の間であるが、必要な場合は、連日治療を3週間まで継続することができる。本発明のFab断片は、液体の薬学的組成物、例えば通常の薬学的に許容される液体の担体物質に溶解された本発明のFab断片を含む非経口投与用として、処方できる。組成物はさらにその他の薬理学的に活性な物質を含むことができる。好ましくは、組成物には、本発明のFab断片が約0.5〜5mg/ml、特に約1〜2mg/ml含まれる。好ましい液体の担体は、無菌生理食塩水である。下記の実施例1〜7に記載する結果から、HLA-DR特異的mAbによるTh細胞活性化の阻害は、（a）直接的な細胞毒性による有効なAPCの排除、（b）細胞表面発現のダウンレギュレーションにより、生存しているAPC上の有効なHLA-DR分子の減少、（C）クラスII MHC-TcR相互作用の妨害という複数の作用により機能されうることが示される。Th細胞の阻害は、DR分子のペプチド結合溝を遮断してペプチド結合溝を抗原から隔絶するmAbによっても生じうる（30）。従って、mAbは、作用が専らHLA-DR分子の抗原結合部位の遮断に基づく、現在利用されているペプチド拮抗物質よりもすぐれたTh細胞阻害物質であるのかが理解できる。抗体による細胞毒性作用およびクラスIIダウンレギュレーション作用の基礎をなす機構は研究中である。しかしながら、細胞毒性作用は架橋を必要とするが、ダウンレギュレーション作用は、由来となるmAbの細胞毒性を伴わない本発明の1 価Fab断片によっても達成される。この違いによって、抗体の断片化によるこれら2つの性質が区別できる。抗クラスII Abの過去に観察された副作用（参考文献 7、8）について、少なくとも一部は直接的な細胞毒性と関連があるとすると、本発明のFab断片は、副作用を伴わない免疫抑制剤としてこれらの抗体の治療用途に供される。実施例実施例１抗DR mAbのアイソタイプ特異性 mAbの正確な特異性は、ヒトHLAクラスII遺伝子で形質導入したマウス細胞株に対するmABの染色能力によって測定した。方法:指示したヒトクラスII遺伝子で形質導入したマウス線維芽細胞株（15）ならびに形質導入していない宿主細胞（Lmtk^-）を、一次および二次試薬として、それぞれDR特異的mAbおよびFITC結合ヤギ抗マウスIg（Southern、Birmingham 、Alabama）を用いる標準的な間接免疫蛍光法によって染色した。試料はFACScan フローサイトメーター（Becton-Dickinson、San Jose、カリフォルニア州）で分析した。結果を表1に示す。「+」および「-」は、それぞれ抗体結合の有無を示し、「NT」は試験しなかったことを示す。結論:抗体8D1、9F1、9F2、および10F12はpan-DR特異的であるが、1-1C4は3種類のヒトクラスIIアイソタイプ（DR、DP、およびDQ）全てを認識することが可能である。実施例２抗批A-DR mAbの鎖およびドメイン特異性方法:標準的な遺伝子クローニング、組換えおよび形質導入法を用いて（10）、キメラヒト／マウスクラスII分子を発現する2種類のマウスB細胞株を作成した。形質導入体M12.C3.25はマウスクラスII陰性宿主株12.C3から誘導され（15）、ヒトHLA-DRA^*0101/DRBI^*0401分子から誘導されるα1およびβ1ドメインならびに DR特異的試薬が結合しないマウスI-E^dタンパク質のα2およびβ2ドメインを含む MHC産物を発現する。形質導入体CH27.105はマウスクラスII陽性宿主株CH27から誘導され（16）、上記のキメラヒト／マウスα鎖に関連する本来のマウスEβ^k鎖を発現する。標準的な間接免疫蛍光染色法は、指示されるIgG₂およびIgG₁抗体を、プロテインA-FITC（Boehringer、Mannheim、Germany）およびヤギ抗マウスIgG₁ -FITC（Southern、Birmingham、Alabama）とそれぞれ組み合わせて用いることによって実施した。試料はFACScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson、S an Jose、California）で分析した。結果を表2に示す（表記は表1と同じ）。結論:本結果は、過去に報告されたLB3.1およびL243のDRα1特異性を確認するものである（10）。抗体8D1および1-1C4はβ1特異的であるが、CCCL20によって認識されるエピトープはβ2ドメイン依存的であると思われる。残りの試薬（9F1 、9F2、10F12）は、第２のHLA-DRドメインによって発現される決定基に結合すると考えられる。SFR3-DR5はDRB1^*0401アロタイプを認識しないので、抗DRB1^*110X mAbの対応するエピトープを、これらの形質導入体でマッピングすることはできなかった。 HLA-DR発現および細胞の生存性に対する抗DR mAbおよびその断片の効果 DR結合性拮抗ペプチドaXA（17）またはDR特異的mAbのいずれかの存在下にて前培養した抗原提示細胞（APC）のDR発現および生存性は、aXAおよび2種のmAb（LB 3.1、1-1C4）の場合には、Th細胞に対する抗原提示を遮断するそれぞれの濃度で検討した。APCの場合は、エプスタインバー（Epstein-Barr）ウイルスで形質転換したヒトB細胞系未熟リンパ細胞株（EBV-LCL）を使用した。実施例３EBV-LCL に対するDR結合性競合ペプチドおよびDR特異的mAbの効果方法:EBV-LCL（プリース（Priess）、ECACC（Salisbury、英国）寄託番号8605 2111）（10⁵細胞／ml）を、図１に示した濃度のDR特異的mAb（LB3.1、1-1C4、CC CL20）またはペプチドaX-A（aXAAAKTAAAAa-NH2;参考文献17）の存在下で、16時間培養した。その後細胞を洗浄し、一次および二次試薬としてそれぞれDR特異的 mAb（LB3.1（a）、CCCL20（b）、1-1C4（c））およびFITC結合ヤギ抗マウスIg（ Southern Biotechnology Associates Inc.，Birmingham，Alabama）を用いる標準的な間接免疫蛍光法によって染色した。試料は、FACScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson，SanJose，California）で分析した。結果を図1に示す。 X軸はHLA-DR発現を、またY軸はヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で染色した死細胞の蛍光を、共に任意の蛍光単位で示す。「バックグラウンド」は、通常培地で16時間培養し、その後それぞれ一次試薬を用いないで標識した対照細胞集団を示す。結論:ペプチドaXAの存在下での共存培養は（図1a）、細胞の生存性およびDR発現のどちらにも有意に影響しなかったが、DR特異的mAb LB3.1（図1a）および1-1 C4（図1c）は、高い細胞毒性作用を誘導しただけでなく生き残っている細胞のDR 発現を減少させた。しかしながら、CCCL20は高濃度でも生存性およびDR発現に影響を与えなかったので、これらの性質は全ての抗DR mAbに共有されるわけではなかった（図1b）。 EBV-LCLに対するDRのダウンモジュレーション作用および細胞毒性作用はさらに2種類のDR特異的mAb、L243およびSFR-DR5によって誘導されたが、他の4種類の抗DR mAb（8D1、9F1、9F2および10F12）は細胞毒性作用も示さず、またDR発現を減少させることもなかった（データは示していない）。実施例４LG2 に対するmAb L243の転調および細胞毒性作用の時間推移方法:EBV-LCL LG2（Instituto Nazionale Per La Ricerca SulCancro（Genova ，Italy）寄託番号G201 12301）（10⁵細胞／ml）を、10nM濃度のDR特異的mAbL24 3（Becton-Dickinson）の存在下で、指定の時間培養した。その後細胞を洗浄し、一次および二次試薬としてそれそれDR特異的mAb L243およびFITC結合ヤギ抗マウスIg（Southern，Birmingham，Alabma）を用いる標準的な間接免疫蛍光法によって染色した。死細胞をヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で染色し、試料をFACScanフローサイトメーターで分析した。結果を図2に示す。ヒストグラムは、死細胞（明色）とHLA-DRの発現量が低下した生細胞（暗色）の相対数を示す。結論:インビトロにおける動的試験により、mAbの細胞毒性作用は2時間後に検出可能で、8時間後に平衡に達することが実証された。DRのダウンレギュレーション作用は4時間後に検出可能になり、8時間後に最大に到達した。実施例５mAb 除去後のLG2に対するL243の転調および細胞毒性作用の持続期間方法:EBV-LCLLG2（10⁵細胞／ml）を、10nMの濃度のDR特異的mAb L243（Becton -Dickinson）の存在下で、指定の時間培養した。3回洗浄することによって抗体を除去し、指定の容量と同容量の新鮮な培地で細胞培養を再度行った。その後細胞を洗浄し、一次および二次試薬としてそれぞれDR特異的mAb L243およびFITC結合ヤギ抗マウスIg（Southern，Birmingham，Alabama）を用いる標準的な間接免疫蛍光法によって染色した。死細胞をヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で染色し、FACScanフローサイトメーターで試料を分析した。結果を図3に示す。ヒストグラムは、死細胞（明色）とHLA-DRの発現量が低下した生細胞（暗色）の相対数を示す。結論:抗体が誘導するDRのダウンレギュレーションはmAb除去後16時間持続する。実施例６DR 特界的mAb L243およびその断片の存在下における共存培養後の種々のAPC集団に対するHLA-DR発現のダウンレギュレーション種々の、形質転換していないMHCクラスII陽性細胞亜集団、静止期および活性化B細胞、単球／マクロファージ、ならびに活性化Th細胞に対する抗DR mAbの効果をさらに検討した。方法:新鮮な末梢血からのB細胞および単球／マクロファージの分離は、それぞれ、CD3（SK7）およびCD14（MΦP9）もしくはCD19（4G7）に特異的なmAb（Becto n-Dickinson）であらかじめ被覆した磁気ビーズ（Dynal）を用いて、培養前にT 細胞および単球またはB細胞（適用可能な場合）を除去することによって実施した。Thおよび未熟B細胞は、末梢血の単核細胞を、フィトヘマグルチニン（1μg/ ml、シグマ社（Sigma））およびアメリカヤマゴボウ分裂促進因子（2.5μg/ml、シグマ社）を用いてそれぞれインビトロにおいて3〜5日刺激することによって作成した。参考文献 18に従ってF(ab)’₂およびFab断片をそれぞれ分離するために、ペプシンおよびパパインによってL243を消化した。プロテインGカラムによるアフィニティークロマトグラフィーによって未消化の抗体およびそのFc断片を除去した。図４に示されるように、等濃度の全長のL243抗体（10nM）またはその F(ab)'₂（10nM）およびFab（20nM）断片の存在下で、APC（10⁵細胞／ml）を16時間培養した。その後細胞を洗浄し、実施例３に記載される方法で染色した。結果を図4に示す。X軸はHLA-DR発現を、Y軸はヨウ化プロピジウム（propidium iodid e）で染色した死細胞の蛍光を、共に任意の蛍光単位で示す。数字は、数字が記載されている4分の1区分中の細胞の割合を示す。「DR-FITC染色」および「バックグラウンドFITC染色」は、通常の培地で16時間培養した後、それぞれ一次試薬の存在下および非存在下で標識した対照細胞集団を示す。結論：細胞表面のDR分子の発現は、全長のmAb、ならびにその2価および1価断片F(ab)'₂およびFabのそれぞれの存在下で、全細胞集団において減少した。DR減少の程度は、B細胞が高く（80〜90％）、単球APCが中程度で（50〜65％）、未熟 Th細胞が低かった（50％未満）。EBV-LCLおよび活性化前の未熟B細胞を2価抗DR 試薬（全長のmAbおよびF(ab)_'2）の存在下で共存培養すると、細胞毒性作用が、それぞれ高く（60〜70％）および低く（5〜15％）なったが、１価断片（Fab）だけは、有意な細胞死を伴わずにダウンレギュレーションを誘導した。これらの実験に使用されるあらゆる形態のDR特異的mAbの存在下で前培養した、静止期B細胞、活性化Thリンパ球および単球／マクロファージの亜集団においては、細胞毒性作用は完全に消失した。同様の特徴が（一部は以降の節に示す）、全長のmAb 1-1C4およびLB3.1ならびにそれらの断片を用いて得られた（LB3.1抗体のF(ab)'₂断片は、そのアイソタイプがパパインによる消化を受けないので、作製できない）。実施例７EBV で形質転換したB細胞株LG2に対するDR特異的Fab断片の濃度増加の効果 1価および2価mAb試薬の細胞毒性の持続時間の差は、単に定量的なものであるか、または質的に異なる作用機構によるものであるかを調べるために、この差異を調べた。方法:実施例3および6に記載する方法と同じ。結果を図5に示す。表記は図1に記載するものと同じである。結論:L243-Fabの濃度の増加は、APCの生存性においていかなる有意な減少も誘導できなかった。実施例８LG2 細胞に対してL243およびその断片の共存培養の延長が与える効果方法:等濃度の全長のL243抗体（10nM）またはそのFab断片（20nM）の存在下において、APC（10⁵/ml）を指定の時間培養した。その後細胞を洗浄し、実施例6に記載する方法で染色した。結果を図6に示す。表記は図2に記載するものと同じである。結論:共存培養時間の延長は、APCの生存性においていかなる有意な減少も誘導できなかった。実施例９EBV-LCL の細胞毒性はDR架橋に依存する方法:指示通り細胞膜を結合させたFab断片を架橋するために、L243 Fab（20nM ）断片およびヤギ抗マウスIgGをあらかじめ被覆した磁気ビーズ（「抗Ig」、Dyn al）の存在下において、EBV-LCL（プリース(Priess)）（10⁵細胞／ml）を16 時間培養した。その後細胞を洗浄し、実施例6に記載するように染色した。結果を図７に示す。表記は図1に記載するものと同じである。結論:HLA-DR結合Fabの架橋は、EBV-LCLに対する細胞毒性作用を生じる。これまでの所、上記の結果から、（ａ）いかなる単核血球細胞種上で発現したHLA-DRも、特異的mAbによる連結反応の結果、ダウンレギュレーションすることが可能であること、（ｂ）予期せず、1価試薬（Fab）によるDR連結反応もDRのダウンレギュレーションを生じることが可能であること、（ｃ）細胞毒性作用はEBV、活性化Ｂ細胞モデルおよび分裂促進因子であらかじめ活性化したB細胞に対してのみ明らかであるため、細胞毒性はおそらくB細胞の活性化段階に依存していること、ならびに（ｄ）細胞毒性は2価配位子（全長のmAbおよびF(ab)'₂、架橋されたFab）による DR架橋の結果であって、抗体のFc部分を必要としないこと、が結論づけられた。過去の研究により、クラスII分子の全長のmAbまたはT細胞受容体との連結反応は、サイトカインの分泌（参考文献19〜20）、細胞成長および免疫グロブリン分泌の転調（参考文献21〜28）、共刺激（参考文献15）および細胞接着分子（参考文献20、29）のアップレギュレーションならびにCD23のダウンレギュレーション（参考文献25）などのAPCの一連の変化を示すことが報告されている。従って、m Ab存在下での前培養によるDR発現の減少は抗体が連結したクラスII分子に制限されるのか、または数多くの細胞表面タンパク質が全体的に誘導されたダウンレギュレーションの一部であるのか、を確立することは重要であった。L243のF(ab)'₂ またはFab断片の存在下での共存培養後の種々のAPC亜集団について、HLAクラス IIアイソタイプのDPおよびDQ、HLAクラスI分子およびMHCに関連のない接着タンパク質CD18の発現を分析した。実施例 10静止期B細胞および単球／マクロファージのDRのダウンレギュレーション選択性方法:実施例6に記載の方法と同じ。HLA-DP（クローンB7/21）、HLA-DQ，（SKI 0）、CD18（L130）（IgG₁サブクラスの全て、Becton-Dickinson）に特異的なmAb および抗HLAクラスI（W6-32IgG_2a、Accurate、Westbury、New York）試薬による標準的な間接免疫染色を、ヤギ抗マウスIgG₁-FITCおよびFITC標識プロテインA（ Boehringer）とそれぞれ組み合わせて使用し、実施した。この方法では、膜結合 DR特異的抗体断片の残余をさらに間接FITC標識する必要がない。結果を図8に示す。表記は図4の記載と同じである。「対照」は通常の培地で16時間培養し、その後プロテインＡおよびFITC結合ヤギ抗マウスIgG₁を共に使用して標識した細胞集団を示す。結論:DR分子は発現の低下を示したが、DP、DQ、クラスI、およびCD18分子は、 F(ab)'₂断片の存在下であらかじめ培養した静止期B細胞および単球／マクロファージでは影響を受けなかった。実施例 11未熟B細胞上におけるDRのダウンレギュレーションの選択性方法:実施例10に記載の方法と同じ。結果を図9に示す。表記は図4に記載のものと同じ。結論:DR分子はダウンレギュレーションされたが、DPNDQ、クラスI、およびCD18 分子の発現はF(ab)'₂断片の存在下であらかじめ培養した未熟Ｂ細胞内では影響を受けなかった。実施例 12LG2 細胞上におけるDRのダウンレギュレーションの選択性方法:実施例10に記載の方法と同じ。結果を図10に示す。表記は図4に記載のものと同じ。結論:DR分子の発現はFabによる架橋形成の結果、選択的に低下されたようであるが、2価F(ab)'₂断片は、その他のクラスIIアイソタイプ、クラスI分子およびC D18の有意なダウンレギュレーションを誘導した。非選択的転調の程度はわずか2 倍であり、DR低下は10倍であるので、その他の細胞表面分子の発現の低下はEBV- LCLに対する2価試薬の全般的な有害作用に関連するとみなすのが妥当である。実施例 13mAb によるDRのダウンレギュレーションのアロタイプ非選択性転調mAb LB3.1、L243および1-1C4はpan-DR特異的、すなわち、HLA-DRの対立形質の差を識別しない。それ故、転調mAb LB3.1、L243および1-1C4はDRのダウンレギュレーションのアロタイプ特異性を試験するためには適切ではない。しかしながら、この問題には、ダウンレギュレーション作用があり、DRB1^*110X（正式にはDR5;参考文献13）に専ら特異的であるmAb SFR3-DR5を用いて対処することができた。方法:B細胞（実施例6に記載のヘテロDRB1^*0101/1101X供与体の新鮮な末梢血から分離）を、DRB1^*110X特異的mAb SFR3-DR5（20％ハイブリドーマ上清液；参考文献 14）の存在下で培養した。その後細胞を洗浄し、指示されるように、DRB^* 110X特異的mAb SFR3-DR5またはDRBI*1101特異的mAb CCCL20（12）のいずれかを、ヤギ抗マウス&ラットIg（Southern）と組み合わせて用いる標準的な間接免疫蛍光法によって染色した。結果を図11に示す。表記は図4に記載のものと同じ。結論：DRB1*110X特異的試薬SFR3-DR5は、静止期ヘテロB細胞によって発現されるDRの両対立形質をダウンレギュレーションし、mAbによって認識されないDRアロタイプにも影響を与えた。従って、DRのダウンレギュレーションはアロタイプ特異的でないと思われる。実施例 141-1C4Fab によるTS-10細胞のPan−クラスIIダウンレギュレーション mAb 1-1C4はHLAクラスIIの3種類のアイソタイプ（DR、DP、DQ）全てのβ鎖を認識することができるので、mAb 1-1C4がそれに応じて3種類のアイソタイプの発現を低下させることができるかどうかを試験することが重要であった。方法:EBV-LCLTS-10（ECACC（Salisbury、UK）寄託番号85102911）を、指示通りに、1-1C4 Fab（20nM）、抗DP mAb（10nM）または抗DQ mAb（10nM）の存在下で1 6時間培養した。その後細胞を洗浄し、実施例6および10に記載の方法で染色した。結果を図12に示す。ゲーティングされた生細胞の染色プロフィールのヒストグラムを示す。X軸は任意の単位の蛍光強度を示し、Y軸は相対的細胞数を示す。白抜きのヒストグラムはそれぞれの第２の試薬で標識した対照細胞集団を示す。結論：1-1C4Fabはアイソタイプ特異的mAb（抗DP、抗DQ）で得られる減少の強度に匹敵する強度で、3種類のクラスIIアイソタイプ（DR、DP、DQ）全ての発現をダウンレギュレーションした。HLAクラスIおよびCD18分子は影響を受けていなかったので、1-1C4 FabによるpanクラスIIダウンモジュレーションは選択的であった。従って、1-1C4などのpanクラスII mAbから得られる本発明のFab断片は、慢性間接リウマチなどのHLR-DRに関連する適応症を治療するために有用であるのに加えて、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、全身エリテマトーデス、臓器移植拒絶反応および移植片宿主相関病などのHLA-DPおよびHLA-DQ発現に関連する疾病を治療するために有用と考えられる。実施例 15L243 およびその断片の存在下でのLG2およびプリース（Priess）細胞の共存培養によるTNFα分泌増加の欠如過去の研究から、EBVで形質転換したB細胞株JYのL243によるDR分子の架橋により、TNFαの分泌が増加したことが報告されている（20）。これは細胞毒性に対する機構でありうるため、同mAb L243およびその断片の存在下で共存培養したプリース（Priess）細胞およびLG2細胞によるTNFαの放出を測定した。方法:APC（10⁵細胞/ml）を、指示通りに等濃度の全長のL243抗体（10nM）またはそのF(ab)'₂（10nM）およびFab（20nM）断片の存在下で16時間培養した。培養上清のTNFα濃度を、内部調節した標準的なELISAキット（T細胞診断法（T cell Diagnostics）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を用いて測定した。モノクローナル試薬の細胞毒性およびDR転調効果を実施例4に記載の免疫蛍光法によって確認した（データは示していない）。結果を図13に示す。結論:これらの培養物中にはTNFαの有意な増加は検出されなかった。従って、細胞毒性の機構ならびに選択的DRダウンモジュレーションの機構は依然として調査中である。抗DR mAbおよびその断片とのTh細胞応答の阻害実施例 16抗DR mAb、その断片およびDR結合ペプチドとのTh細胞応答の阻害方法：参考文献32に従って調製されるCD4陽性Th細胞クローンNBHAC25、KMHA25 およびDSHABB10は、それぞれDRA/DRB1^*0101、DRA/DRB1^*0401およびDRA/DRB1^*040 1によって提示されるインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（hemagglutinin ;HA）ペプチドHA307-319（PKYVKQNTLKLAT）に反応する。マイトマイシンCで処理したAPC、抗原（134nM）および阻害物質の存在下でTh細胞をインキュベートした。抗原特異的なTh細胞の増殖を、標準的な³H-チミジン取り込み解析によって測定した。結果を表3に示す。結論:Mab LB3.1、L243および1-1C4、すなわちDR分子のダウンレギュレーションを誘導するmabもThヘルパー細胞活性化の強力な阻害物質であった。逆に、DR （CCCL20、8D1、9F1、9F2、10F12）をダウンレギュレーションしなかったmAbは、Th細胞応答に影響を与えなかったか、またはわずかな阻害作用を誘導した（表 3）。従って、DRのダウンレギュレーション能力は阻害活性と相関する。さらに、これらの結果から、ダウンレギュレーション作用のあるmAbは、クラスII分子のペプチド結合（α1およびβ1）ドメインに位置するエピトープを認識する傾向があることが示される。実施例 17Th 細胞阻害およびDRのダウンレギュレーションに必要な抗体濃度実施例16にで実証された相関関係をさらに調査するために、ダウンレギュレーションおよび阻害に必要な抗体濃度を調べた。方法:APCとしてマイトマイシンCで処理したプリース（Priess）細胞、抗原としてHA307-319ペプチド（330nM）および指定濃度のmAb LB3.1の存在下で、Th細胞クローンKMHA25およびDSIIABB10（表３参照）を培養した。抗原特異的なTh細胞の増殖（パネル上）を³H-チミジン取り込みによって3日後に測定した。mAb LB 3.1によるプリース（Priess）細胞のフローサイトメトリー（パネル下）を実施例3に記載の方法で実施した。結果を図14に示す。結論:Th応答のほぼ完璧な阻害は、（細胞を殺さないで）APCの約2/3においてD Rの90％ダウンレギュレーションを誘導したmAb濃度で達成された。このことから両方の現象に必要な濃度はほぼ同じであると考えられる。実施例 18固定されたAPCによる抗原提示に対する抗DR mAbおよびFab断片の効果 DRのダウンレギュレーションはTh細胞応答の阻害に関与する唯一の機構であるかどうかを調査した。方法:APC（LG-2）をグルタールアルデヒド（Fluka Chemie，Buchs，Switzerla nd）で固定した。実施例17に記載する方法で、mAbまたはFabの存在下でマイトマイシン処理（「My」）または固定（「Fix」）LG-2およびHA307-319（134nM）に対するTh細胞クローンNBHAC25の応答を測定した。結果を図15に示す。結論:抗クラスII mAbおよびそれらのFab断片は、クラスII分子のダウンレギュレーションが起こり得ない状態で、固定された（すなわち、死んだ）APCに提示されるペプチド抗原に対するTh細胞応答も阻害することができる。従って、クラスII-Th細胞抗原受容体（TCR）相互作用の極めて可能性が高い立体障害という、さらに少なくとも1つの機構がTh細胞阻害に役割を果たす。実施例 19mAb 、Fab、およびペプチド拮抗物質の能力に対する抗原負荷の効果 Th細胞応答の阻害における抗クラスII mAb、それらの断片、およびペプチド結合部位拮抗物質の相対的効力を比較した。方法:実施例15に記載の方法と同じ。ThクローンNBHAC25;APCLG-2。パネル上HA 307-31913.4nM、パネル下330nM。表３に記載のペプチド。結果を図16に示す。結論:抗体およびFab断片は阻害効力がほぼ同じで、後者は前者よりわずかに効力が小さい。しかしながら、両者はペプチドより数百倍効力が大きかった。抗原濃度の増加（図16のパネル下はパネル上より30倍高い）によってペプチド拮抗物質は効力が小さくなったが、mAbの効力には影響しなかったことに留意することは重要である。この観察は、阻害機構の差によって説明される。ペプチドはクラスII結合部位の抗原と直接的に競合するが、抗体はMHC-TCR相互作用を阻害するだけでなく、クラスII発現をダウンレギュレーションする。実施例 20抗原の用量−反応曲線に対するFab及びペプチドの相対的効果 Fab断片およびペプチドが広い抗原濃度範囲に対してTh細胞応答を阻害する能力を比較した。方法:実施例17に記載の方法と同じ。クローン、NBHAC25;APC、LG-2；13.4pM〜 134nMのHA307-319；100nM Fab；100μMペプチドaXA。結果を図17に示す。結論:Fab断片がペプチドより1000倍高い抗原濃度でTh細胞応答を阻害する能力を有し、この差が全ての抗原濃度範囲にわたって一定であることはデータから明らかである。実施例 21進行中のTh細胞応答に対するクラスII拮抗物質の効果種々の種類のクラスII拮抗物質が進行中のTh細胞応答を阻害することができるかどうかを確定することが重要であった。この問題は短時間枠のインビトロにおけるTh細胞応答では正しく検討できないが、種々の経過時点にAPC-抗原-Th細胞系へFab断片とペプチドとを添加して比較することを試みた。方法:実施例17に記載の方法と同じ。Thクローン、NBHAC25;APC、LG-2;４nMHA3 07-319。APCとHAのインキュベーションは-2時間から開始し、0時間にクローンを添加した。FabはLB3.1を使用した。結果を図18に示す。結論:ペプチド拮抗物質を遅れて添加することにより、阻害活性は徐々に時間依存的に失効した。これは競合物質の濃度を増加させても回復しなかった。一方、Fab断片はTh細胞より２時間遅れて添加しても、ほぼ完全な阻害を生じ、添加を遅らせたことによる阻害効力の低下はFab濃度を増加させることで補われた。従って、Fab断片は、進行中のTh細胞応答の阻害に対して、現在入手可能なペプチド競合物質よりも効力が大きいと思われる。実施例 22mAb 1-1C4 の産生 HLA-DRをmAb L243を用いてEBV-LCLプリース（Priess）から免疫沈降し、SDS-P AGEによってHLA-DRα鎖およびβ鎖を分離した。DR-β鎖を含有する28k電気泳動のバンドをゲルから切り取り、BALB/cマウスを免疫するために使用した。次に、 mAbを分泌するハイブリドーマを得るために、マウス免疫B細胞を骨髄腫株PAI-０（Stocker，W．ら、Research Disclosure，217:155〜157(1982））と融合させることによって不死化した。そのハイブリドーマの培養上清を、抗原HA 307-319およびAPCとしてプリース（Priess）の存在下においてHA/DRBI^*0401 Th細胞クローンKMHA25（表３参照）の活性化を阻害する能力についてスクリーニングした。ハイブリドーマ1-1C4は、阻害能力を有するmAbを分泌すると確認された。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Monoclonal antibody fragment having immunosuppressive action Class II major histocompatibility complex (MHC) molecules bind to antigenic peptide fragments Then, these antigenic peptide fragments are used as helpers (CD4⁺) Presented to T cells ("Th" cells) (Ref. 1). Monoclonal antibodies (mAbs) specific for class II MHC molecules Is a very potent selective inhibitor of Th cell immune response in vitro Has been reported (Reference 2). Such monoclonal antibodies have been discovered Since then, it can be used for selective immunosuppressive treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis It is considered as a potential drug. Early in vivo studies showed that Useful effects of these mAbs on Th cell xenogeneic and autoimmune responses revealed Crabs (references 3-6). However, class II MHC-specific mAbs were Application in vivo causes unpredictable complications and kills laboratory primates (See References 7, 8). The latter was observed, indicating that MHC-specific m Interest in subsequent studies on immunomodulation by Abs was reduced. Recent reports Causes a 10-fold reduction in class II MHC expression in transgenic mice Insufficient antigen presentation indicates no Th cell response (Ref. 19). This is due to reduced expression of class II MHC in an in vivo model. Indicates a correlation with immunosuppression. According to the present invention, a mAb capable of down-regulating HLA-DR expression Surprisingly, the monovalent mAb fragment (Fab) is either the mAb itself or a bivalent fragment of the mAb (F (ab) ′_Two ) Down-regulates HLA-DR expression by itself without showing cytotoxicity I knew I could do it. Therefore, the Fab fragment of the present invention is It is a potent class II MHC-specific immunosuppressive compound without action. More specific Before describing the present invention, a brief description of the drawings is provided below. Figure 1: Competitive DR binding pepti against the EBV-transformed B cell line, Pries. And DR-specific mAb effects. Figure 2: Time course of the regulatory and cytotoxic effects of mAb L243 on LG2. Figure 3: Duration of regulatory and cytotoxic effects of L243 on LG2 after mAb removal . Figure 4: Different APCs after co-culture in the presence of DR-specific mAb L243 and its fragments Down-regulation of HLA-DR expression on population. Figure 5: Effect of increasing the concentration of DR-specific Fab fragment on B cell line LG2 transformed with EBV. Fruit. Figure 6: Effect of long-term co-culture of L243 and its fragments on LG2 cells. Figure 7: Dependence of EBV-LCL cytotoxicity on DR cross-linking. Figure 8: Down-regulation of DR on resting B cells and monocytes / macrophages Options. Figure 9: Selectivity of DR down-regulation on immature B cells. Figure 10: Selectivity of DR down-regulation on LG2 cells. Figure 11: Allotype non-selectivity of DR down-regulation by mAb. Figure 12: Pan class II down-regulation by 1-1C4 Fab on TS-10 cells N. Figure 13: LG2 and Pries cells in the presence of L243 and its fragments Lack of increased TNFα secretion after co-culture. Figure 14: Antibody concentration required for Th cell inhibition and DR down-regulation. Figure 15: Effect of anti-DR mAb and Fab fragments on antigen presentation by immobilized APC. Figure 16: Effect of antigen loading on mAb, Fab, and peptide antagonist potency. Figure 17: Relative effect of Fab and peptide on antigen dose-response curves. Figure 18: Effect of class II antagonists on ongoing T cell responses. HLA-DR ("DR" human leukocyte antigen; class II major histocompatibility complex ("MH C)) certain monoclonal antibodies (mAbs) that are specific for Approximately 90% down-regulation of HLA-DR molecule expression on the surface of leukocytes, cells ("APCs") Can be managed. The mAb is also activated by HLA-DR molecules for activation. It also inhibits the activation of human Th cell clones that require antigen presentation. mAb inhibition , Hundreds to thousands times greater than the inhibitory power of currently available peptide antagonists (See Table 1 below). Down-regulation of HLA-DR expression and activation of Th cells Inhibition is a pharmacological effect that produces an immunosuppressive effect. This immunosuppressive effect It is considered useful for treating immune diseases, particularly rheumatoid arthritis. According to the present invention, mAbs capable of down-regulating HLA-DR expression of The monovalent antigen-binding mAb fragment (Fab) is surprisingly the mAb itself or the divalent fragment of the mAb. Piece (F (ab) '_Two) Down-regulates HLA-DR expression by itself without showing cytotoxicity I found that I could ration. Therefore, the Fab fragment of the present invention It is a potent class II MHC-specific immunosuppressive compound without sexual side effects. Therefore, in the present invention, the full-length mAb exhibits cytotoxicity against antigen-presenting cells, -HLA-DR mAb down-regulates HLA-DR expression on antigen presenting cells Fab fragments are included. The mAb inhibits Th cell activity. The Fab fragment of the present invention All derived mAbs bind to the first domain of HLA-DR. Examples of three types of down-regulating mAbs useful in the present invention Then, LB3.1 (mouse IgG_2b, Pan-DRα1 specific; references 9 to 10); L243 (mouse IgG_2a, Pan-DRα1 specific; references 10 to 11; ATCC accession number HB55) , SFR3-DR5 (rat IgG_2b, DRB^*110X specific; reference 13; ATCC deposit number HB-151) And the like. It also has the effect of down-regulating HLA-DR. 1-1C4 (mouse IgG), a mAb that down-regulates HLA and HLA-DP_Two _a , Β-chain specific; reference 14) was produced by conventional methods as described in Example 22. Therefore, Fab fragments of the above mAbs are included in the present invention. The ability of down-regulating mAbs to inhibit Th cell activation 5 mAbs and Cs with no down-regulation, consistent with CCL20 (mouse IgG_2b, Three DRB1 (β-chain) alleles (DRB1^*0101, DRB1^*0401 , DRB1^*0404); References 12), and 8D1, 9F1, 9F2, 10F12 (4 Mouse IgG1) inhibits Th cell activation only minimally or not at all. Does not harm. Active mAbs promote B cell lymphoblastoma cells and a small population of normally activated B cells Shows cytotoxic effects. Bivalent F (ab) 'of mAb_TwoFragments are down-regulated, similar to mAbs. It mediates the action of a drug, but also has a cytotoxic effect. However, according to the present invention The monovalent Fab fragment of the mAb attenuated the cytotoxic effect, but surprisingly M Ab down-regulation characteristics are retained. The anti-HLA-DR mAb used to obtain the Fab fragment of the present invention is, for example, generally Was first reported by Kohler and Milstein It can be produced using any ordinary means such as the above-mentioned method. Monoclonal antibodies are anti- Inject the original into mice or rats, rabbits, sheep, etc. (preferably mice) By recovering antibody-producing cells from the immunized animal, for example, PAI mouse Myeloma cells, SP2 / 0-Ag14 cells, or SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC number CRL 1581; AT (CC number CRL 8287) (for general guidelines on antibody production, see, eg, "Cold Spring Ha rbor Laboratory Press (1988), Harlow & Lee, Antibody Experiment Guide (Antibodies- ALaboratory Manual), etc.) and fusion with myeloma cells. Can be prepared by immortalizing cells obtained by a conventional method. That Later, the culture supernatant of the hybridoma was used for radioimmunoassay or enzyme immunoassay, Or by a standard method such as a dot-immunobinding assay or an immunofluorescence assay Monoclonal antibodies (mAbs) can be screened. mAbs, for example Ion exchange chromatography, protein A bound to a solid support, anti-immunity Affinity chromatography with globulin antibody or antigen or part thereof Hybridomas can be prepared by conventional chromatography methods such as It can be purified from the supernatant. A method for producing a mAb useful in the present invention is described in Example 22. Shown in According to methods well known to those skilled in the art, to produce large amounts of mAb, the desired antibody is Secreted hybridomas are injected before injection, eg with pristane. Treated mice can be injected intraperitoneally. The resulting one mouse Ascites tumors produce less than about 100 mg of mAb. mAb was generated by the above method It can be purified from ascites produced by the tumor. mAbs are obtained by known methods, such as Ouchterlony immunodiffusion. Identify subclasses. mAbs can be modified for various applications, or It is also known to those skilled in the art, however, that fragments thereof that can bind to an antigen can be produced. The fragment is obtained, for example, by enzymatic digestion of the mAb with papain, pepsin, etc. Can be produced. The immunogen for producing a mAb that can be used in the present invention is preferably SDS-P Β-chain of HLA-DR purified by conventional means such as AGE (for example, International Publication No. 9 No. 2/10589 (W092 / 10589); Biol. Chemistry 262, 8748-8758 (1987), base sequence Information about columns can be found, for example, in Genbank (Intelligenetics, CA, USA ), European Bioinformatics Institute (HinxtonHall, Cambridge, UK) , NBRF (Georgetown University Medical Center, Washington DC, USA) and Vecbas e (University of Wisconsin Biotechnology Center, Medision, Wisconsin (US, USA). The base sequence is The art of producing antigens for preparing monoclonal antibodies for use in the invention Can be used in a manner known to those skilled in the art). Shows cytotoxicity to APC and also down-regulates HLA-DR expression The above-mentioned identification of the anti-HLA-DRmAb can be carried out by any usual means. You. Preferably, the identification of such anti-HLA-DR mAbs is based on Epstein Barr Human B cell lymphoblastoid cell line transformed with irs (Epstein-Barr Virus) (EBV-LCL) is implemented in accordance with Example 3 where APC is used as a model. And activated B cells). Preferably about 10 per milliliter^FiveEBV-LCL cells At least 1 ml of the containing culture is used. This culture contains 20 nM anti-HLA-DR Cultured for 16 hours in the presence of the mAb and survived by normal means with dead cells HLA-DR expression by viable cells is measured. Achieve the object of the present invention In the above, cytotoxicity and down regulation are 1) under the above conditions. At least 25%, preferably 40% of EBV-LCL antigen presenting cells by full length mAb If this is killed, this mAb is cytotoxic to antigen presenting cells, and 2) Under the above conditions, the number of HLA-DR molecules on the surface of surviving EBV-LCL antigen-presenting cells was reduced. This mAb reduces HLA-DR expression in antigen-presenting cells by at least 50% on average. It is defined as down-regulating. Dead cells are detected by normal immunofluorescence and survivable cells are detected. To measure HLA-DR expression in the vesicles, EBV-LCL antigen presenting cells are labeled. these Cells are analyzed using a flow cytometer (eg, FACScan, Becton-D ickinson, San Jose, California). Remaining Decreased HLA-DR expression in the infected cells by conventional means, preferably Software commonly used for light meters (eg FACScan cytometers) LYSIS II software used). Used to screen monoclonal antibodies with desired properties EBV-LCL is not important. In the present invention, any ordinary EBV-LCL can be used. You. Examples of EBV-LCL useful in the present invention include Pries (ECACC (S alisbury, UK) accession number 86052111), LG2 (Istituto Nazionale Per La Ricerca S ul Cancro (Genova, Italy) accession number G201 12301) and TS-10 (ECACC (Salisbury , UK) Deposit No. 85102911). The Fab fragment of the mAb can be produced by any conventional means. This Fab Fragments can be obtained by means known to those skilled in the art (eg, “Andrew and Titus” tus), Fragmentation of immunoglobulin G ” , "Current Protocols in Immunology, Col igan et al. (Greene & Wiley 1994) ”), and the mAb from which Produced by digestion and separation of the Fab fragments. Therefore, the method, And the Fab fragment prepared using the method is also an object of the present invention. Good Preferably, the Fab fragment of the present invention is a set that expresses a gene encoding a desired Fab fragment. Produced by a recombinant cell line. Recombinant cell lines can be obtained by any Is also produced. For example, the gene portion encoding the Fab fragment Cloned from a hybridoma secreting the desired mAb using conventional means. Will be. Then, the cDNA of the Fab fragment can be prepared by appropriate means using appropriate cells. Inserted into an expression vector used to transduce the strain. Preferred Fab fragments of the present invention, when administered to humans, are suitable for animals, preferably mice. Humanized (hu) to be less antigenic than Fab fragments directly produced from manized) ". The method of producing the humanized Fab fragment of the present invention is not critical. This Any conventional means known to the artisan can be used. In such a way Any immunoglobulin (Ig), including monoclonal antibodies, constant regions and antigens And the variable region in which the binding occurs. The variable area is Consists of six complementarity determining regions (“CDRs”) present in the Chain And each of the heavy chains has three CDRs) (42). Contributes to mAb specificity It is this CDR. Since mAbs are derived from mice or other animal species, mAbs The humanization of essentially at least one, preferably 6 of the CDRs of a human immunoglobulin By replacing all of them with the corresponding CDRs of an animal mAb with the desired specificity Will be implemented. Thus, human Ig functions as a framework for animal CDRs. The person In the method, an animal mAb (usually a mouse) is described as a "donor" , Human Igs are described as "acceptors". In addition, humanized mAbs known in the art optimize their antigen specificity. To this end, "fine tuning" of the amino acid sequence may be performed. For example, international public A panel of 10 to 20 human Igs will be screened in Kaino 90/7861 (W090 / 7861) However, the variable region has the highest homology to the variable region of the mouse donor mAb, typically 65 Human Ig with ~ 70% or more homology should be used as receptor It is disclosed. In addition, pages 12-15 of WO 90/7861 (W090 / 7861) Outside the CDRs based on the four criteria disclosed in Substitution with an acid (generally about 3 substitutions) can be made. As another example of humanization known in the art, see European Patent Application No. 0 620 276 The signal is applied to an acceptor Ig outside the donor CDR graft to increase the specificity of the humanized mAb. It discloses a particular hierarchy of substitutions that can be made. The substitution results in a variable region Eliminates the need to select human receptor Igs with high homology to the variable region of the donor mAb It is disclosed. A special protocol for humanization is described in European Patent Application No. 0 It is shown on pages 8-9 of 620 276. A full-length humanized mAb useful for obtaining the Fab fragment of the present invention is expressed in a host cell. DNA sequence for expressing the humanized Fab fragment of the present invention or a DNA sequence for expressing the humanized Fab fragment of the present invention. Methods for making are known in the art and are not critical. In the method For example, site-directed mutagenesis, animal CDRs onto human framework regions Methods for constructing the entire variable region using overlapping oligonucleotides that incorporate And PCR grafting (WO 90/7861 (W090 / 7861), European Patent Application No. 0 620 276, reference 43). Therefore, the present invention further provides an immunoglobulin Fab fragment and the immunoglobulin Fab fragment. And six of the complementarity determining regions contained therein, wherein one of the complementarity determining regions One is 1) binds to the first domain of HLA-DR, 2) Shows cytotoxic effect on antigen presenting cells expressing HLA-DR, 3) Down-regulate HLA-DR expression on antigen-presenting cells It can be described as a Fab fragment, which is the complementarity determining region of a monoclonal antibody . According to a preferred embodiment of the present invention, according to the above, the immunoglobulin Fab fragment is human-derived. Wherein the monoclonal antibody having the properties of 1-3 is derived from an animal, preferably a mouse Is a humanized Fab fragment. This humanized Fab fragment contains one to six of the CDRs are human immunoglobulin Fab fragments in which the CDR has been replaced by the corresponding CDR of an animal mAb. Obedience Thus, a preferred Fab fragment of the present invention is a human immunoglobulin Fab fragment and a human immunoglobulin. And six complementarity-determining regions contained within the Brin Fab fragment. Determining the complementarity of monoclonal antibodies, one to six of which have the above properties 1-3 Region, Fab fragment. This humanized Fab fragment of the present invention preferably contains all six of the animal mAb CDRs. . When the immunoglobulin Fab fragment is derived from an animal, the Fab fragment of the present invention may contain the above-described Fab fragment. It may be a Fab fragment of the monoclonal antibody itself having the properties of 1 to 3. Fab cut The pieces are used to obtain animal CDRs contained in a preferred humanized Fab fragment of the invention. May be useful as an intermediate. Preferred Fab fragments of the present invention are monoclonal antibodies LB3.1, L243, SFR3-D described above. It has properties similar to those of Fab fragments obtained from R5 and 1-1C4. Fab fragment of the present invention Inhibits Th cell activation, so activated Th cells can cause disease or symptoms Can be used for the treatment of various diseases. One of the diseases is rheumatoid arthritis. It is a gusset (Reference 33). HLA-DR down-regulation on APC in patients with rheumatoid arthritis Regulation, and thereby inhibition of patient Th cell activation, It is thought to slow or stop the progress of the disease. For patients with rheumatoid arthritis Inhibition of Th cell activation may also be a mediator of symptoms such as pain and inflammation. It is believed that reducing or stopping the release of Can be Thus, the present invention also provides Fab fragments as described herein, and therapeutically effective As drugs, especially as immunosuppressants, more specifically for the treatment of rheumatoid arthritis Use of a Fab fragment of the present invention, and a therapeutically effective amount of the Fab fragment of the present invention in a patient in need of treatment. A method of suppressing a patient's immune response, including administering to a subject. The present invention By administering a therapeutically effective amount of the Fab fragment of the present invention to a patient in need of treatment. Accordingly, the present invention includes a method of treating rheumatoid arthritis in a patient. Amount of Fab fragment to be administered Can be determined by any conventional means. In addition, the Fab fragment of the present invention The administration of the pieces can be carried out by any conventional method. The administration of the Fab fragment of the present invention is preferably performed using the pharmaceutical composition of the present invention. (Described below). Administration is preferably parenteral (subcutaneous, intramuscular, or Or intravenous administration), especially intravenous administration. Inhibits Th cell activation in patients The dose required to treat rheumatoid arthritis thereby may be, for example, a dose limit The determination can be made by any conventional method, such as a clinical trial. However Intravenous doses of about 1 to 10 mg / day, especially about 3 mg to 7 mg / day, especially about 5 mg / day. Preferred (34, 35), preferably delivered as a single large dose. Treatment Is preferably once a day, for a week or less, but if necessary, Daily treatment can be continued for up to 3 weeks. The Fab fragments of the present invention can be used in liquid pharmaceutical compositions, such as normal pharmaceutically acceptable Formulated for parenteral administration comprising the Fab fragment of the invention dissolved in a liquid carrier material it can. The composition may further comprise other pharmacologically active substances. Good Preferably, the composition comprises about 0.5-5 mg / ml, in particular about 1-2 mg / ml, of a Fab fragment of the invention. I will. A preferred liquid carrier is sterile saline. From the results described in Examples 1-7 below, Th cell activation by HLA-DR specific mAb Inhibition of (A) the elimination of effective APC by direct cytotoxicity, (b) cell surface expression Down-regulation reduces the number of effective HLA-DR molecules on living APCs. Low, may function by multiple actions of interfering with (C) class II MHC-TcR interactions Is shown. Th cell inhibition blocks the peptide binding groove of the DR molecule and It can also be caused by mAbs that sequester the binding groove from antigen (30). Therefore, mAb Currently used peptides based on blocking the antigen binding site of the HLA-DR molecule Do antagonist It can be understood that it is a Th cell inhibitor superior to quality. Basis for cytotoxic and class II down-regulation by antibodies The eggplant mechanism is under study. However, cytotoxic effects require cross-linking, The down-regulation effect is a factor of the present invention without cytotoxicity of the mAb from which it is derived. It is also achieved by multivalent Fab fragments. Due to this difference, antibody fragmentation These two properties can be distinguished. Previously observed side effects of anti-class II Ab (references) Regarding 7) and 8), at least in part, The Fab fragments of the invention are useful for the therapeutic use of these antibodies as immunosuppressants without side effects Offered to Example Example 1Isotype specificity of anti-DR mAb The exact specificity of the mAb depends on the mouse cell line transduced with the human HLA class II gene. It was determined by the staining ability of the mAB. Methods: Mouse fibroblast cell line transduced with the indicated human class II gene (15) And untransduced host cells (Lmtk^-) As primary and secondary reagents , DR-specific mAb and FITC-conjugated goat anti-mouse Ig (Southern, Birmingham , Alabama) using standard indirect immunofluorescence. The sample is FACScan Minutes with a flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) Was analyzed. Table 1 shows the results. `` + '' And ``-'' indicate presence or absence of antibody binding, respectively And "NT" indicates not tested. Conclusion: Antibodies 8D1, 9F1, 9F2, and 10F12 are pan-DR specific, whereas 1-1C4 is three Of all human class II isotypes (DR, DP, and DQ) It is. Example 2Chain and domain specificity of anti-critical A-DR mAb Methods: Using standard gene cloning, recombination and transduction methods (10) Created two mouse B cell lines expressing chimeric human / mouse class II molecules . The transductant M12.C3.25 was derived from the mouse class II negative host strain 12.C3 (15), Human HLA-DRA^*0101 / DRBI^*Α1 and β1 domains derived from 0401 molecules and Mouse I-E to which DR specific reagent does not bind^dContains the α2 and β2 domains of the protein Express MHC products. Transductant CH27.105 was derived from mouse class II positive host strain CH27. The native mouse Eβ induced (16) and associated with the chimeric human / mouse α chain described above^kchain Is expressed. Standard indirect immunofluorescence staining is performed using the indicated IgG_TwoAnd IgG₁Antibodies , Protein A-FITC (Boehringer, Mannheim, Germany) and goat anti-mouse IgG₁ -Use in combination with FITC (Southern, Birmingham, Alabama) It was carried out by. The sample was a FACScan flow cytometer (Becton-Dickinson, S an Jose, California). The results are shown in Table 2 (notations are the same as in Table 1). Conclusion: This result confirms the previously reported DRα1 specificity of LB3.1 and L243 (10). Antibodies 8D1 and 1-1C4 are β1-specific, but are not The recognized epitope appears to be β2 domain dependent. Remaining reagent (9F1 , 9F2, 10F12) bind to determinants expressed by the second HLA-DR domain it is conceivable that. SFR3-DR5 is DRB1^*0401 Does not recognize allotypes, so anti-DRB1^*110X The corresponding epitope of the mAb cannot be mapped in these transductants Did not. Effects of anti-DR mAb and its fragments on HLA-DR expression and cell viability In the presence of either DR binding antagonist peptide aXA (17) or DR specific mAb DR expression and viability of cultured antigen presenting cells (APCs) were determined by aXA and two mAbs (LB In the case of 3.1, 1-1C4), at each concentration that blocks antigen presentation to Th cells investigated. For APC, transfected with Epstein-Barr virus The replaced human B-cell line immature lymphocyte cell line (EBV-LCL) was used. Example 3EBV-LCL Of DR-binding competitor peptide and DR-specific mAb on ATP Method: EBV-LCL (Priess, ECACC (Salisbury, UK) Deposit No. 8605) 2111) (10^FiveCells / ml) were converted to DR-specific mAbs (LB3.1, 1-1C4, CC CL20) or 16 hours in the presence of peptide aX-A (aXAAAKTAAAAa-NH2; ref. 17) The culture was continued for a while. The cells are then washed and DR-specific as primary and secondary reagents, respectively. mAbs (LB3.1 (a), CCCL20 (b), 1-1C4 (c)) and FITC-conjugated goat anti-mouse Ig ( (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, Alabama) Stained by standard indirect immunofluorescence. The sample was a FACScan flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, California). The results are shown in Figure 1. X-axis stains for HLA-DR expression, Y-axis stains with propidium iodide The fluorescence of the dead cells thus obtained is shown in arbitrary fluorescence units. "Background" Control cells cultured in normal medium for 16 hours, and then labeled without using primary reagents Indicates a population. Conclusion: Co-culture in the presence of peptide aXA (Fig. 1a) demonstrates cell viability and DR development. The DR-specific mAbs LB3.1 (FIG. 1a) and 1-1 did not significantly affect either of the current C4 (Fig. 1c) induces high cytotoxic effects but also DR of surviving cells Expression was reduced. However, even at high concentrations, CCCL20 affects survival and DR expression. These properties were not shared by all anti-DR mAbs because they had no effect. (Figure 1b). Further down-modulation and cytotoxic effects of DR on EBV-LCL Was induced by two DR-specific mAbs, L243 and SFR-DR5, but four other The anti-DR mAbs (8D1, 9F1, 9F2 and 10F12) have no cytotoxic effects and have no DR expression Decrease There was no reduction (data not shown). Example 4LG2 Over time of the modulation and cytotoxic effects of mAb L243 on thyroid Method: EBV-LCL LG2 (Instituto Nazionale Per La Ricerca SulCancro (Genova , Italy) Deposit number G201 12301) (10^FiveCells / ml) at 10 nM concentration of DR-specific mAb L24 The cells were cultured for the specified time in the presence of 3 (Becton-Dickinson). Then wash the cells DR-specific mAb L243 and FITC-conjugated goat anti- Standard indirect immunofluorescence using mouse Ig (Southern, Birmingham, Alabma). And stained. Dead cells are stained with propidium iodide and tested. The charge was analyzed on a FACScan flow cytometer. The result is shown in figure 2. histogram Indicates the relative number of dead cells (light) and viable cells with reduced HLA-DR expression (dark) . Conclusion: In vitro kinetic studies show that the cytotoxic effects of mAbs are detected after 2 hours. It was demonstrated to be available and to reach equilibrium after 8 hours. DR down-regulation The action became detectable after 4 hours and reached a maximum after 8 hours. Example 5mAb Duration of modulation and cytotoxic effects of L243 on LG2 after removal Method: EBV-LCLLG2 (10^FiveCells / ml) at a concentration of 10 nM DR specific mAb L243 (Becton -Dickinson) for the indicated time. Antibody by washing 3 times Was removed, and cell culture was performed again with the same volume of fresh medium as indicated. Then thin Cells are washed and DR-specific mAbs L243 and FITC conjugated as primary and secondary reagents, respectively. Standard indirect immunization using goat anti-mouse Ig (Southern, Birmingham, Alabama) Staining was performed by epifluorescence. Dead cells to propidium iodide And samples were analyzed on a FACScan flow cytometer. The results are shown in Figure 3. Histograms of dead cells (light) and viable cells with reduced HLA-DR expression (dark) Indicates the relative number. Conclusion: Antibody-induced DR down-regulation lasts 16 hours after mAb removal . Example 6DR Different APC populations after co-cultivation in the presence of the specialty mAb L243 and its fragments Down-regulation of HLA-DR expression on Escherichia coli Various untransformed MHC class II positive cell subpopulations, stationary phase and activity Of anti-DR mAb on activated B cells, monocytes / macrophages, and activated Th cells The results were further examined. Methods: Separation of B cells and monocytes / macrophages from fresh peripheral blood Specific mAb (Becto) specific for CD3 (SK7) and CD14 (MΦP9) or CD19 (4G7) n-Dickinson) before magnetic culture using magnetic beads (Dynal). Perform by removing cells and monocytes or B cells (if applicable) Was. Th and immature B cells convert peripheral blood mononuclear cells into phytohemagglutinin (1 μg / ml, Sigma) and American pokeweed mitogen (2.5 μg / ml, (Sigma) by in vitro stimulation for 3-5 days. Done. F (ab) ′ according to reference 18_TwoAnd Fab fragments separately L243 was digested with pepsin and papain. By protein G column Undigested antibody and its Fc fragment by affinity chromatography Removed. As shown in FIG. 4, an equal concentration of full-length L243 antibody (10 nM) or its F (ab) '_Two(10 nM) and Fab (20 nM) fragments in the presence of APC (10 nM).^FiveCells / ml) at 16:00 The culture was continued for a while. The cells were then washed and stained as described in Example 3. result Is shown in FIG. The X axis represents HLA-DR expression, and the Y axis represents propidium iodid The fluorescence of dead cells stained in e) is shown in arbitrary fluorescence units. Numbers are numbers The percentage of cells in the listed quarters is shown. DR-FITC staining and Background FITC staining is performed by culturing in a normal medium for 16 hours, Shows control cell populations labeled in the presence and absence of. Conclusion: Expression of DR molecules on the cell surface is a full-length mAb and its bivalent and monovalent disruptions Piece F (ab) '_TwoAnd in the presence of Fab, respectively, in the total cell population. DR reduction Low, high B cells (80-90%), moderate monocyte APC (50-65%), immature Th cells were low (less than 50%). Bivalent anti-DR for EBV-LCL and pre-activated immature B cells Reagents (full length mAb and F (ab)_'2) When co-cultured in the presence of High (60-70%) and low (5-15%) respectively, but monovalent fragments (Fab) Ke Down-regulation was induced without significant cell death. Used for these experiments Resting B cells, pre-cultured in the presence of any form of DR-specific mAb used, activity In a subpopulation of activated Th lymphocytes and monocytes / macrophages, cytotoxic effects are Completely disappeared. Similar features (some of which are shown in the following sections) are the full length mAbs 1-1C4 and LB3.1 and (F (ab) 'of LB3.1 antibody)_TwoThe fragment is the isotype Cannot be produced because the pulp is not digested by papain). Example 7EBV Of increasing concentration of DR-specific Fab fragment on B2 cell line LG2 transformed with Escherichia coli Differences in duration of cytotoxicity of monovalent and divalent mAb reagents are only quantitative To determine whether the difference is due to a qualitatively different mechanism of action. Was examined. Method: Same as described in Examples 3 and 6. FIG. 5 shows the results. The notation is shown in Fig. 1. Same as described. Conclusion: Increasing concentrations of L243-Fab induce any significant decrease in APC viability. I couldn't lead. Example 8LG2 Effect of prolonged co-culture of L243 and its fragments on cells Method: In the presence of an equal concentration of full-length L243 antibody (10 nM) or its Fab fragment (20 nM) APC (10^Five/ ml) for the specified time. After that, wash the cells and proceed to Example 6. Staining was performed as described. FIG. 6 shows the results. Notation is the same as that described in FIG. is there. Conclusion: Extended co-culture time induces any significant decrease in APC viability could not. Example 9EBV-LCL Cytotoxicity depends on DR cross-linking Method: To crosslink the cell membrane-bound Fab fragment as indicated, use L243 Fab (20 nM ) Fragments and magnetic beads pre-coated with goat anti-mouse IgG ("anti-Ig", Dyn al) in the presence of EBV-LCL (Priess) (10^Five16 cells / ml) Cultured for hours. The cells were then washed and stained as described in Example 6. result Is shown in FIG. The notation is the same as that described in FIG. Conclusion: Cross-linking of HLA-DR binding Fab produces a cytotoxic effect on EBV-LCL. So far, from the above results, (A) HLA-DR expressed on any mononuclear blood cell type can be ligated by specific mAbs As a result, it is possible to down-regulate, (B) Unexpectedly, DR down-regulation of DR ligation reaction with monovalent reagent (Fab) Be able to produce (C) Cytotoxic effects are presumed to be EBV, activated B cell model and mitogen Cytotoxicity is probably only apparent for activated B cells. Dependence on the activation stage, and (D) Cytotoxicity was measured for bivalent ligands (full-length mAb and F (ab) '_TwoBy cross-linked Fab) It was concluded that the result of DR crosslinking was that the Fc portion of the antibody was not required. Previous studies have shown that class II molecules can be linked to full-length mAbs or T cell receptors. Is the secretion of cytokines (19-20), cell growth and immunoglobulin content Modulation of secretion (Refs. 21-28), costimulation (Ref. 15) and cell adhesion molecules (Ref. Up-regulation of references 20, 29) and down-regulation of CD23 It has been reported to show a series of changes in APC, such as (ref. 25). Therefore, m Reduction of DR expression by preculture in the presence of Ab is restricted to antibody-linked class II molecules Down-regulation, where a number of cell surface proteins are totally induced It was important to establish if it was part of a simulation. L243's F (ab) '_Two Or HLA class for various APC subpopulations after co-culture in the presence of Fab fragments Adhesion proteins unrelated to the II isotypes DP and DQ, HLA class I molecules and MHC The expression of protein CD18 was analyzed. Example 10Down-regulation selectivity of quiescent B cells and DR of monocytes / macrophages Method: Same as described in Example 6. HLA-DP (clone B7 / 21), HLA-DQ, (SKI 0), CD18 (L130) (IgG₁MAbs specific to all of the subclasses, Becton-Dickinson) And anti-HLA class I (W6-32IgG_2a, Accurate, Westbury, New York) Standard indirect immunostaining using goat anti-mouse IgG₁-FITC and FITC-labeled protein A ( Boehringer). In this method, membrane binding There is no need for further indirect FITC labeling of the remainder of the DR-specific antibody fragment. The results are shown in FIG. You. The notation is the same as that in FIG. The “control” is cultured for 16 hours in a normal medium, and Goat anti-mouse IgG conjugated with protein A and FITC₁Labeled cells using together Indicates a population. Conclusion: DR molecules showed reduced expression, whereas DP, DQ, Class I, and CD18 molecules F (ab) '_TwoQuiescent B cells and monocytes / macrophages previously cultured in the presence of the fragments. Was unaffected. Example 11Selectivity of DR down-regulation on immature B cells Method: Same as described in Example 10. The results are shown in FIG. The notation is the one described in Fig. 4. Same as Conclusion: DR molecules were down-regulated, but DPNDQ, class I, and CD18 Expression of molecule is F (ab) '_TwoEffect in immature B cells pre-cultured in the presence of fragments Did not receive. Example 12LG2 Selectivity of DR down-regulation on cells Method: Same as described in Example 10. The results are shown in FIG. The notation is the one described in Fig. 4. Same as Conclusion: DR molecule expression appears to be selectively reduced as a result of Fab cross-linking. But divalent F (ab) '_TwoFragments include other class II isotypes, class I molecules and C Induced significant down-regulation of D18. Only 2 non-selective modulations Since the DR reduction is 10-fold and the DR reduction is 10-fold, the reduction in the expression of other cell surface molecules is EBV- It is reasonable to assume that it is related to the overall adverse effect of bivalent reagents on LCL. Example 13mAb Allotype non-selectivity of DR down-regulation Transposed mAbs LB3.1, L243 and 1-1C4 are pan-DR specific, i.e. allelic forms of HLA-DR Does not identify quality differences. Therefore, the transposed mAbs LB3.1, L243 and 1-1C4 are Not suitable for testing the allotype specificity of regulation. But However, this problem has a down-regulatory effect and DRB1^*110X (formally Can be addressed using the mAb SFR3-DR5, which is exclusively specific for DR5; Came. Method: B cells (hetero DRB1 as described in Example 6)^*0101 / 1101X Donor fresh peripheral blood DRB1^*110X-specific mAb SFR3-DR5 (20% hybridoma supernatant; reference Cultured in the presence of literature 14). Then wash cells and DRB as directed^* 110X-specific mAb SFR3-DR5 or DRBI * 1101-specific mAb CCCL20 (12) , Standard indirect immunization in combination with goat anti-mouse & rat Ig (Southern) Staining was performed by the fluorescence method. The results are shown in FIG. Notation is the same as that described in FIG. Conclusion: DRB1 * 110X specific reagent SFR3-DR5 is expressed by quiescent heterologous B cells Down-regulate both alleles of the DR It also affected the rotype. Therefore, DR down regulation is allotype Seems not to be specific. Example 141-1C4Fab -Induced down-regulation of TS-10 cells mAb 1-1C4 recognizes β-chains of all three HLA class II isotypes (DR, DP, DQ). MAb 1-1C4 expresses three isotypes accordingly It was important to test if it could be reduced. Method: EBV-LCLTS-10 (ECACC (Salisbury, UK) Deposit No. 85102911) as directed In the presence of 1-1C4 Fab (20 nM), anti-DP mAb (10 nM) or anti-DQ mAb (10 nM) The cells were cultured for 6 hours. The cells were then washed and stained as described in Examples 6 and 10. . The results are shown in FIG. Histogram of staining profile of live gated cells Show ram. The X axis shows the fluorescence intensity of an arbitrary unit, and the Y axis shows the relative cell number. White The undrawn histogram shows the control cell population labeled with each second reagent. Conclusion: 1-1C4Fab is more potent than isotype-specific mAbs (anti-DP, anti-DQ) Expression of all three class II isotypes (DR, DP, DQ) with comparable strength Was down-regulated. HLA class I and CD18 molecules are not affected Or Therefore, pan class II downmodulation with 1-1C4 Fab was selective. Was. Therefore, Fab fragments of the present invention obtained from pan class II mAbs such as 1-1C4 Useful for treating indications related to HLR-DR such as sexual rheumatoid arthritis In addition, multiple sclerosis, type I diabetes, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Associated with HLA-DP and HLA-DQ expression such as organ transplant rejection and graft-host disease May be useful for treating certain diseases. Example 15L243 Co-culture of LG2 and Pries cells in the presence of and its fragments Lack of increased TNFα secretion Previous studies have shown that cross-linking of DR molecules by L243 of B cell line JY transformed with EBV And increased TNFα secretion (20). This has a negative effect on cytotoxicity. In the presence of mAb L243 and its fragments, The release of TNFα by Pries cells and LG2 cells was measured. Method: APC (10^FiveCells / ml) with equal concentrations of full-length L243 antibody (10 nM) or Is its F (ab) '_Two(10 nM) and Fab (20 nM) fragment for 16 hours. culture A standard ELISA kit (T cell diagnostic method (T cell Diagnostics) (Cambridge, Mass.). mono The cytotoxicity and DR modulation effect of the clonal reagent were determined by the immunofluorescence method described in Example 4. (Data not shown). FIG. 13 shows the results. Conclusion: No significant increase of TNFα was detected in these cultures. Therefore, The mechanism of cytotoxicity as well as the mechanism of selective DR downmodulation remains Under investigation. Inhibition of Th cell response with anti-DR mAb and its fragments Example 16Inhibition of Th cell response with anti-DR mAb, fragments thereof and DR binding peptides Methods: CD4-positive Th cell clones NBAHC25, KMHA25 prepared according to reference 32 And DSHABB10 are DRA / DRB1 respectively^*0101, DRA / DRB1^*0401 and DRA / DRB1^*040 Influenza virus hemagglutinin (hemagglutinin) presented by 1 ; HA) Reacts with peptide HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT). Treated with mitomycin C Cells were incubated in the presence of activated APC, antigen (134 nM) and inhibitors . Proliferation of antigen-specific Th cells^ThreeMeasured by H-thymidine incorporation analysis Specified. Table 3 shows the results. Conclusion: Down regulation of Mab LB3.1, L243 and 1-1C4, DR molecule Inducing mabs were also potent inhibitors of Th helper cell activation. Conversely, DR MAbs that did not down regulate (CCCL20, 8D1, 9F1, 9F2, 10F12) Did not affect the Th cell response or induced a slight inhibitory effect (Table 3). Thus, the ability to downregulate DR correlates with inhibitory activity. further These results indicate that mAbs with down-regulation activity are class II molecules. Propensity to recognize epitopes located in the peptide binding (α1 and β1) domains of It is shown that there is. Example 17Th Antibody concentration required for cell inhibition and DR down-regulation To further investigate the correlation demonstrated in Example 16, The concentration of antibody required for the application and inhibition was determined. Methods: Pries cells treated with mitomycin C as APC, antigen In the presence of HA307-319 peptide (330 nM) and the specified concentration of mAb LB3.1 Cell clones KMHA25 and DSIIABB10 (see Table 3) were cultured. Antigen-specific Th cells Vesicle growth (on panel)^ThreeMeasured 3 days later by H-thymidine incorporation. mAb LB Performed flow cytometry of Pries cells (under panel) according to 3.1 The procedure was as described in Example 3. The results are shown in FIG. Conclusion: Nearly complete inhibition of the Th response is approximately 2/3 of APC (without killing cells) A 90% down-regulation of R was achieved at the induced mAb concentration. From this The concentrations required for both phenomena are expected to be approximately the same. Example 18Effect of anti-DR mAb and Fab fragment on antigen presentation by immobilized APC Downregulation of DR is the only mechanism involved in inhibiting Th cell responses Was investigated. Method: APC (LG-2) was converted to glutaraldehyde (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) nd). Mitomas in the presence of mAbs or Fabs as described in Example 17. For isine treatment ("My") or fixed ("Fix") LG-2 and HA307-319 (134nM) The response of the Th cell clone NBAAC25 to the Th cell clone was measured. The results are shown in FIG. Conclusion: Anti-class II mAbs and their Fab fragments down regulate class II molecules. To a fixed (ie, dead) APC with no possible translation It can also inhibit Th cell responses to a given peptide antigen. Therefore, Steric hindrance, which is highly likely to interact with In addition, at least one mechanism plays a role in Th cell inhibition. Example 19mAb Of antigen loading on the ability of steroid, Fab, and peptide antagonists Anti-class II mAbs, their fragments, and peptide binding in inhibiting Th cell responses The relative potency of joint site antagonists was compared. Method: Same as described in Example 15. Th clone NBAHC25; APCLG-2. HA on panel 307-31913.4nM, 330nM below the panel. A peptide according to Table 3. FIG. 16 shows the results. Conclusion: Antibodies and Fab fragments have similar potency, with the latter being slightly more potent than the former. Power is small. However, both were hundreds of times more potent than the peptide. antigen Increasing concentrations (bottom panel in Figure 16 is 30 times higher than above panel) with peptide antagonist Note that quality decreased potency but did not affect mAb potency Is important. This observation is explained by differences in the mechanism of inhibition. Peptides are Competes directly with the antigen at the binding site for antibody II, but the antibody inhibits the MHC-TCR interaction As well as down-regulate class II expression. Example 20Relative effect of Fab and peptide on antigen dose-response curves Ability of Fab fragments and peptides to inhibit Th cell response over a wide range of antigen concentrations The forces were compared. Method: Same as described in Example 17. Clone, NBACH25; APC, LG-2; 13.4 pM ~ 134 nM HA307-319; 100 nM Fab; 100 μM peptide aXA. The results are shown in FIG. Conclusion: the ability of Fab fragments to inhibit Th cell responses at 1000 times higher antigen concentration than peptide It is clear from the data that this difference is constant over the entire antigen concentration range. It is easy. Example 21Effects of class II antagonists on ongoing Th cell responses Various classes of class II antagonists can inhibit ongoing Th cell responses It was important to determine whether or not. This problem has been addressed in a short time frame in vitro. Response cannot be examined correctly, but APC-antigen-Th cells An attempt was made to add Fab fragments and peptides to the system for comparison. Method: Same as described in Example 17. Th clone, NBACH25; APC, LG-2; 4nMHA3 07-319. Incubation of APC and HA starts at -2 hours and clones at 0 hours. Was added. Fab used LB3.1. The results are shown in FIG. Conclusion: By adding peptide antagonists late, inhibitory activity gradually increases over time. Expired dependently. It did not recover with increasing concentrations of competitor. on the other hand Fab fragments were almost completely inhibited even when added 2 hours later than Th cells. The decrease in inhibitory potency due to the delay of was compensated for by increasing the Fab concentration. Thus, Fab fragments are currently available for the inhibition of ongoing Th cell responses. It appears to be more potent than the tide competitor. Example 22mAb 1-1C4 Production of HLA-DR was immunoprecipitated from EBV-LCL pries (Priess) using mAb L243, and SDS-P HLA-DR α and β chains were separated by AGE. 28k electrophoresis containing DR-β chain Band was excised from the gel and used to immunize BALB / c mice. next, To obtain mAbs that secrete mAbs, mouse immune B cells were transformed with the myeloma strain PAI-0. (Stocker, W. et al., Research Disclosure, 217: 155-157 (1982)). Immortalized by The culture supernatant of the hybridoma was transferred to the antigens HA 307-319 and HA / DRBI in the presence of Pries and APC^*0401 Th cell claw KMHA25 (see Table 3) was screened for its ability to inhibit activation. C It was confirmed that the hybridoma 1-1C4 secreted a mAb having an inhibitory ability.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) C12P 21/08 C12P 21/08 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, J, TM, TT, UA, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. An immunoglobulin Fab fragment and six complementarity-determining regions contained in the Fab fragment; And a Fab fragment comprising one to six of the complementarity determining regions, 1) The monoclonal antibody binds to the first domain of HLA-DR, 2) Monoclonal antibody is cytotoxic to antigen presenting cells expressing HLA-DR Yes, 3) Monoclonal antibody down-regulates HLA-DR expression on antigen presenting cells Is a complementarity determining region of a monoclonal antibody having the property of Fab fragment. 2. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is a mouse monoclonal antibody. Fab fragment. 3. 3. The Fab fragment according to claim 2, wherein the immunoglobulin is a human immunoglobulin. 4. The six complementarity determining regions of the Fab fragment 4. The Fab fragment according to claim 3, which is a region. 5.1) a pharmaceutically acceptable liquid carrier, and 2) a therapeutically effective amount of claim 2 A liquid pharmaceutical composition comprising the Fab fragment according to any one of claims 4 to 4. 6. The set according to claim 5, wherein the content of the Fab fragment is 0.5 to 5 mg / ml of the liquid composition. Adult. 7. The composition according to claim 6, wherein the content of the Fab fragment is 1 to 2 mg / ml of the liquid composition. object. 8. The monoclonal antibody according to claim 1 or 2, which is cleaved with pepsin and a Fab fragment Is isolated by a method known in the art. 5. A method for preparing the Fab fragment according to any one of 4. 9. An Fab fragment prepared by the method according to claim 8. 10. 5.A drug according to claim 1, which is a therapeutically active drug particularly as an immunosuppressant. Fab fragment according to 1. 11. A Fab according to any of claims 1 to 4, for suppressing a patient's immune response. Use of fragments. 12. Fab according to any of claims 1 to 4, for the treatment of rheumatoid arthritis. Interruption Use of pieces. 13. The invention described in the specification and claims. 14． A therapeutically effective amount of an Fab fragment containing the Fab fragment of claim 3 or 4. A method of suppressing an immune response in a patient, comprising administering.