JP2001505433A - Human G protein receptor HCEGH45, PACAP-like (G protein pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-like) receptor - Google Patents

Human G protein receptor HCEGH45, PACAP-like (G protein pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-like) receptor

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Abstract

(57)【要約】 ヒトGタンパク質レセプターHCEGH45ポリペプチドとそのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）およびそのようなポリペプチドを組換え法で生産する方法が開示されている。上記ポリペプチドに対するアンタゴニストとアゴニストを同定するために上記ポリペプチドを使用する方法も開示されている。上記ポリペプチドに対するアンタゴニストはPACAP分泌不全状態の治療と薬理学的健忘症モデルの創出に使用でき、一方アゴニストは健忘症とアルツハイマー病の治療に使用できる。またそのレセプター核酸配列中の突然変異を検出する診断法と宿主から得た試料中のそれらレセプターの可溶型のレベルを検出する診断法も開示されている。   (57) [Summary] Disclosed are the human G protein receptor HCEGH45 polypeptide, DNA (RNA) encoding such polypeptide, and methods for recombinantly producing such polypeptide. Also disclosed are methods of using the polypeptide to identify antagonists and agonists for the polypeptide. Antagonists to the above polypeptides can be used to treat PACAP deficiency conditions and create pharmacological amnesia models, while agonists can be used to treat amnesia and Alzheimer's disease. Also disclosed are diagnostic methods for detecting mutations in the receptor nucleic acid sequence and for detecting the levels of soluble forms of those receptors in samples obtained from the host.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧタンパク質レセプターHCEGH45，PACAP様（Ｇタンパク質下垂体アデニル酸 シクラーゼ活性化ポリペプチド様）受容体 本発明は新たに同定されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによって コードされるポリペプチド、そのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用な らびにそのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より具体的に は、本発明のポリペプチドはヒト７回膜貫通型レセプターである。この膜貫通型 レセプターはＧタンパク質共役レセプターである。より具体的には、この７回膜 貫通型レセプターはamnesiac様神経ペプチドのヒトＧタンパク質下垂体アデニル 酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（PACAP）様レセプターであると推定され、以 下これを「HCEGH45」という場合もある。また本発明は上記ポリペプチドの作用 を阻害することに関する。 発明の背景 医学的に重要な数多くの生物学的過程が、Ｇタンパク質および／またはcAMPな どの第二メッセンジャーを必要とするシグナル伝達経路に関与するタンパク質に よって媒介されることは十分に確証されている（Lefkowitz,Nture,351:353-354, 1991）。ここではそれらのタンパク質をＧタンパク質またはPPGタンパク質関連 経路関与タンパク質という。このようなタンパク質の例としてはGPCレセプター 、例えばアドレナリン作用薬やドーパミンに対するレセプター（Kobilka，B.K. ら，PNAS,81:46-50(1987)；Kobilka，B.K.ら，Science,238:650-(:56(1987);Bun zow,J.R.ら,Nature,336:783-787(1988)）、Ｇタンパク質そのもの、エフェクタ ータンパク質、例えばホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼおよびホスホジエ ステラーゼ、アクチュエータータンパク質、例えばプロテインキナーゼＡおよび プロテインキナーゼC（Simonら,Science,252:802-8(1991)）などがある。 例えばシグナル伝達の一形態では、ホルモン結合の効果が細胞内部にある酵素 アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌクレオチ ドGTPの存在に依存し、GTPはホルモン結合にも影響を及ぼす。Ｇタンパク質はホ ルモンレヤプターをアデニル酸シクラーゼと結びつける。Ｇタンパク質は、ホル モンレセプターによって活性化されると、GTPと結合されたGDPを交換することが 示されている。次に、そのGTP保持型は活性化されたアデニル酸シクラーゼに結 合する。Ｇタンパク質自身によって触媒されるGTPのGDPへの加水分解は、Ｇタン パク質をその基礎不活性型に戻す。このようにＧタンパク質は、からエフェクタ ーにシグナルを中継する中間体として、またシグナルの持続時間を制御する時計 として、二重の役割を果たしている。 ウシ大脳から精製されたPACAPレセプタータンパク質は欧州特許出願公開番号0 618 291 A2に開示されており、その明細書は参考文献として本明細書の一部を 構成する。 発明の要約 本発明の一態様として、新規ポリペプチドならびにその断片、類似体および誘 導体が提供される。本発明ポリペプチドはヒト由来である。 本発明の一態様として、新規成熟レセプターポリペプチドならびに生物学的に 活性かつ診断または治療に有用なその断片、類似体および誘導体が提供される。 本発明レセプターポリペプチドはヒト由来である。 本発明のもうひとつの態様として、本発明レセプターポリペプチドをコードす る単離された核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）ならびにそのアン チセンス類似体および生物学的に活性かつ診断または治療に有用なその断片が提 供される。 本発明のさらなる態様として、組換え技術によって上記レセプターポリペプチ ドを生産する方法であって、本発明レセプターポリペプチドをコードする核酸配 列を含有する組換え原核および/または真核宿主細胞を該ポリペプチドの発現を 促進する条件下で培養した後、該ポリペプチドを回収することからなる方法が提 供される。 本発明のさらなる態様として、上記レセプターポリペプチドに対する抗体が提 供される。 本発明のもうひとつの態様として、本発明レセプターポリペプチドに結合し、 それを活性化するか、その活性化を阻害する化合物のスクリーニング法が提供さ れる。 本発明のさらなる態様として、本発明レセプターポリペプチドに結合しそれを 活性化する化合物を宿主に投与する方法が提供される。これは健忘症、神経細胞 死に関係する疾患（例えばアルツハイマー病）および他の分泌不全状態の予防お よび/または治療に役立つ。 本発明のさらなる態様として、本発明レセプターポリペプチドに結合しその活 性化を阻害する化合物を宿主に投与する方法が提供される。これはPACAP分泌不 全状態の予防および/または治療と、薬理学的健忘症の誘発に役立つ。 本発明のもうひとつの態様として、本発明レセプターポリペプチドの過少発現 または本発明レセプターポリペプチドに対するリガンドの過少発現に関係する状 態を治療するために、遺伝子療法によって本発明レセプターポリペプチドを投与 する方法が提供される。 本発明のさらなる態様として、本発明ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブ リダイズするに足る長さを持つ核酸分子を含んでなる核酸プローブが提供される 。 本発明のさらなる態様として、上記ポリペプチドをコードする核酸配列中の突 然変異に関係する疾患を検出するためおよびそのレセプターポリペプチドの可溶 型のレベルの変化を検出するための診断測定法が提供される。 本発明のさらなる態様として、上記レセプターポリペプチドまたは上記ポリペ プチをコードするポリヌクレオチドを、科学研究、DNAの合成およびDNAベクター の製造に関係する試験管内用途に使用する方法が提供される。 本発明のこれらの態様と他の態様は、本明細書から当業者には明らかなはずで ある。 図面の簡単な説明 下記の図面は本発明の態様を例示するものであって、請求の範囲によって包含 される本発明の範囲を限定しようとするものではない。 図１は本発明Ｇタンパク質共役レセプターのcDNA配列と対応する推定アミノ酸 配列を表す。アミノ酸には標準的な一文字略号を使用している。配列決定は373 自動DNAシークエンサー（AppliedBiosystems社）を使って行なった。 図２は本Ｇタンパク質共役レセプターの二次構造上の特徴を示す図である。最 初の７つの図はα-ヘリックス、β-シート、ターン領域またはコイルド領域であ るアミノ酸配列の領域を表わす。枠で囲んだ領域は表示した領域に対応する領域 である。二組目の図は、細胞内の細胞質にさらされているアミノ酸配列の領域ま たは膜を貫通しているアミノ酸配列の領域を表わす。親水性プロットは、膜の脂 質二重層であってしたがって疎水性であるタンパク質配列の領域と、脂質二重層 膜の外側にあって親水性である領域とを表わしている。抗原領域は脂質二重層膜 の外側にあって抗体を結合できるので、抗原性インデックス（antigenic index ）は親水性プロットと一致する。さらに表面確率プロットは抗原性インデックス と親水性プロットに一致する。両親媒性プロットは極性であり非極性であるタン パク質配列の領域を示す。可撓領域は膜の外側にある領域で、非可撓領域は膜貫 通領域であるという意味で、可撓領域は二組目の図と一致する。 図３は本発明Ｇタンパク質共役レセプターとラットPACAP様レセプターのアミ ノ酸配列の整列を表わす。 好ましい態様の詳細な説明 本発明の一態様として、図１の推定アミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドまた はATCC寄託番号97132として1995年４月28日に寄託されたクローンのcDNAによっ てコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（ポリヌクレ オヂド）が提供される。 本発明ポリヌクレオチドは、ヒト小脳組織に由来するcDNAライブラリー中に発 見された。これはその構造上、Ｇタンパク質共役レヤプターファミリーに関係す る。これは874アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフ レームを含む。このタンパク質はラットPACAP様レヤプターに対して同一性22.91 0％、類似性48.607％という最も高い相同性を示す。 本発明ポリヌクレオチドはRNA型であってもよいし、cDNA、ゲノムDNAおよび合 成DNAなどといったDNA型であってもよい。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一 本鎖である場合はコード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。本成熟ポ リペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または上記寄託ク ローンのコード配列と同一であってもよいし、図１のDNAまたは 上記寄託cDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードするが、遺伝コードの冗長性また は縮重性ゆえに異なっているコード配列であってもよい。 図１の成熟ポリペプチドまたは上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペ プチドをコードするポリヌクレオチドは、その成熟ポリペプチドのコード配列の みを含んでもよいし、その成熟ポリペプチドのコード配列とリーダーまたは分泌 配列などの追加コード配列もしくはプロタンパク質配列とを含んでもよく、また 、成熟ポリペプチドのコード配列（随意に追加コード配列を伴ってもよい）と非 コード配列（イントロンや、成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3 '側にある非コード配列など）とを含んでもよい。 したがって「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、そ のポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドと、追加コード配列お よび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 さらに本発明は、図１の推定アミノ酸配列を持つポリペプチドまたは上記寄託 クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、類似体および誘導体 をコードする、上記ポリヌクレオチドの変種に関する。このポリヌクレオチド変 種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変種であってもよいし 、上記ポリヌクレオチドの天然には存在しない変種であってもよい。 したがって本発明は、図１に示す成熟ポリペプチドと同じ成熟ポリペプチドま たは上記寄託クローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに図１のポリペプチドまたは 上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体また は類似体をコードする上記ポリヌクレオチドの変種を包含する。そのようなヌク レオチド変種としては、欠失変種、置換変種および付加または挿入変種が挙げら れる。 上述のように本ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または上記寄託ク ローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコード配列を持ちう る。当技術分野では知られているように対立遺伝子変種は、コードされるポリペ プチドの機能を実質的に変えない１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠 失もしくは付加を持ちうる代替型ポリヌクレオチド配列である。 本ポリヌクレオチドは、膜貫通部分と細胞内部分を欠く本ポリペプチドの細胞 外部分からなる本レセプターペプチドの可溶型もコードしうる。 また本発明は、上記成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞によるポリペプ チドの発現と分泌を促進するポリヌクレオチド配列（例えばポリペプチドの細胞 からの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に同じ読み枠で融 合しているポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプチドはプ レタンパク質であり、そのリーダー配列は宿主細胞によって切断されて、そのポ リペプチドの成熟型を生成しうる。本ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に5' アミノ酸残基が追加されたプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列を持つ 成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そのタンパク質の不活性型である。そ のプロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 したがって本発明ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、プロ配列を持つタン パク質、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を持つタンパク質を コードしうる。 本発明ポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製に備えてマーカー配列 に同じ読み枠で（in frame）融合されたコード配列を持ってもよい。細菌宿主の 場合はpQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列 として、そのマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えることができ、 またCOS-7細胞などの哺乳類宿主を使用する場合は、例えば赤血球凝集素（HA） 標識をマーカー配列にすることができる。HA標識はインフルエンザ赤血球凝集素 タンパク質由来のエピトープに相当する（Wilsonら，Cell,37:767（1984））。 「遺伝子」という用語はポリペプチド鎖の生産に関与するDNAの区間を意味し 、これはコード領域の前後にある領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個 々のコード区間（エクソン）の間にある介在配列（イントロン）を含む。 完全長HCEGH45遺伝子の断片をcDNAライブラリー用のハイブリダイゼーション プローブとして用いることにより、その完全長遺伝子や、その遺伝子に対して高 い配列類似性または類似する生物活性を持つ他の遺伝子を単離することができる 。このタイプのプローブは少なくとも30塩基からなることが好ましく、例えば50 塩基以上を含んでもよい。またこのプローブは、完全長転写物に相当 するcDNAクローンや、調節およびプロモーター領域、エクソンならびにイントロ ンを含む完全なHCEGH45遺伝子を含有する１個または複数個のゲノムクローンを 同定するためにも使用できる。スクリーニングの一例では、オリゴヌクレオチド プローブの合成に既知のDNA配列を用いることによってその遺伝子のコード領域 を単離する。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレオチド を用いて、ヒトのcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニング し、そのライブラリーのどの構成要素にそのプローブがハイブリダイズするかを 決定する。 さらに本発明は配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、より好 ましくは少なくとも95％の同一性がある場合に上述の配列にハイブリダイズする ポリヌクレオチドに関する。特に本発明は厳密な条件下で上述のポリヌクレオチ ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「厳密 な条件」という用語は、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の 同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ま しい態様として上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド は、図１のcDNA（配列番号1）または上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポ リペプチドと実質上同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー ドする。 また上記ポリヌクレオチドは、上述のように、本発明ポリヌクレオチドにハイ ブリダイズし、かつ、該ポリヌクレオチドに対して同一性を持つ（活性は保持し ても、保持しなくてもよい）、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、より好ま しくは少なくとも50塩基を持ってもよい。このようなポリヌクレオチドは、例え ば、配列番号１のポリヌクレオチド用の（例えばポリヌクレオチド回収用の）プ ローブとして、または診断用プローブとして、もしくはPCRプライマーとして使 用できる。 したがって本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドに対しで少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、より 好ましくは少なくとも95％の同一性を持つポリヌクレオチドならびに少なくとも 30塩基、好ましくは少なくとも50塩基からなるその断片およびそのようなポ リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。 本明細書で言及する寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約に基づいて維持されるだろう。これらの寄託物は当業者にとっ て便利なように用意したものに過ぎず、35U.S.C砦112に基いて寄託が必要である と認めるものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列とそれによっ てコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書の一部を構 成し、万一ここに記載する配列の説明と何らかの矛盾が生じた場合は、これらが 支配的となる。上記寄託物を製造、使用または販売するには許諾が必要な場合が あり、本明細書はそのような許諾を与えるものではない。 さらに本発明は、図１の推定アミノ酸配列を持つＧタンパク質共役レセプター ポリペプチドまたは上記寄託cDNAによってコードされるアミノ酸配列を持つＧタ ンパク質共役レセプターポリペプチドならびにそのようなポリペプチドの断片、 類似体および誘導体に関する。 図１のポリペプチドまたは上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに 関して「断片」、「誘導体」および「類似体」という場合、これらの用語はその ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能または活性（すなわちＧタンパク質共役 レセプターとしての機能）を保持するポリペプチドか、Ｇタンパク質共役レセプ ターとしては機能しないとしてもそのリガンドまたはレセプターに結合する能力 を保持するポリペプチド（例えば当該レセプターの可溶型）を意味する。類似体 にはプロタンパク質部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを 生成しうるプロタンパク質が含まれる。 本発明ポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドおよび合成ポ リペプチドのいずれであってもよく、組換えポリペプチドであることが好ましい 。 図１のポリペプチドまたは上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの 断片、誘導体または類似体は（i）1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存的ま たは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されている もの（その置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであっても よいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、（ii）1つまたはそれ以上の アミノ酸残基が置換基を含むものであってもよく、また（iii）成熟ポリペプチ ド がもうひとつの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大させるための化 合物（例：ポリエチレングリコール））に融合しているものや、（iv）リーダー または分泌配列や、成熟ポリペプチドの精製に利用される配列またはプロタンパ ク質配列などといった追加アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているもので あってもよい。そのような断片、誘導体および類似体は、本明細書の記述から、 当業者の技術範囲に含まれると考えられる。 本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドは単離された形で提供されることが 好ましく、また均一に精製されることが好ましい。 「単離された」という用語は、その物質がその当初の環境（例えばそれが天然 に存在するものであればその自然環境）から取り出されていることを意味する。 例えば生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単 離されていないが、その天然系で共在する物質の一部または全部から分離された そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌ クレオチドがベクターの一部であったり、かつ/または、そのようなポリヌクレ オチドまたはポリペプチドが組成物の一部であっても、そのようなベクターまた は組成物がその自然環境の一部でないという点で、それらは単離されている。 本発明ポリペプチドは配列番号２のポリペプチド（特にその成熟ポリペプチド ）および配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも70％の類似性（好ましく は70％の同一性）、より好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくと も90％の類似性（より好ましくは90％の同一性）、さらに好ましくは配列番号２ のポリペプチドに対して少なくとも95％の類似性（さらに好ましくは95％の同一 性）を持つポリペプチドを包含し、また一般的には少なくとも30アミノ酸、より 好ましくは少なくとも50アミノ酸を含有する上記ポリペプチドの一部をも包含す る。 当技術分野では知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、 一方のポリペプチドのアミノ酸配列とその保存的アミノ酸置換を、他方のポリペ プチドの配列と比較することによって決定される。 本発明ポリペプチドの断片または一部は、対応する完全長ポリペプチドのペプ チド合成による生産に使用できる。つまりこれらの断片は完全長ポリペプチドを 生産するための中間体として使用できる。本発明ポリヌクレオチドの断片または 一部は、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用できる。 また本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺 伝子操作された宿主細胞および組換え技術による本発明ポリペプチドの生産に関 する。 宿主細胞は本発明ベクター（それは例えばクローニングベクターであってもよ いし、発現ベクターであってもよい）によって遺伝子操作（形質導入または形質 転換もしくはトランスフェクト）される。ベクターは例えばプラスミド、ウイル ス粒子、ファージなどの形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーター を活性化したり、形質転換体を選択したり、またはHCEGH45遺伝子を増幅するた めに適宜変更が施された従来の栄養培地で培養できる。温度やpHなどといった培 養条件は、発現用に選択したその宿主細胞に対して過去に用いられた条件であり 、当業者には明らかだろう。 本発明ポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生産するため に使用できる。したがって例えば本ポリヌクレオチド配列はポリペプチドを発現 させるための様々な発現ベクターのいずれに含まれてもよい。そのようなベクタ ーとしては染色体DNA配列、非染色体DNA配列および合成DNA配列、例えばSV40の 誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド 、プラスミドとファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例 えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽性狂犬病ウイルス）などが 挙げられる。ただし他のベクターまたはプラスミドであっても、それがその宿主 内で複製可能かつ生存可能であるかぎり使用できる。 適当なDNA配列は様々な方法でベクターに挿入できる。一般的には、当技術分 野で知られる方法により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にDNA配列を挿入 する。そのような方法その他は、当業者の技術範囲に含まれると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列はmRNA合成を指令する適当な発現制御配列（プロモ ーター）に機能的に作用するように連結される。そのようなプロモーターの代表 例としてはLTRまたはSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrp、λファージPLプ ロモーターおよび原核細胞、真核細胞またはそれらのウイルス中の遺 伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げることができ る。発現ベクターは翻訳開始用のリボソーム結合部位と転写終結区（ターミネー ター）をも含有する。またベクターは発現の増幅に適した配列を含んでもよい。 さらに発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型上の 特徴（例えば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐 性、大腸菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性など）を与える１ つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含有することが好ましい。 上述したような適当なDNA配列と適当なプロモーターまたは制御配列とを含有 するベクターを適当な宿主の形質転換に使用することによって、その宿主にその タンパク質を発現させることができる。 適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌な どの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバエやスポドプテラ（ Spodotera）Sf9などの昆虫細胞、CHO、COSまたはボーズ黒色腫などの動物細胞、 アデノウイルス植物細胞などを挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明 細書の教示から、当業者の技術範囲に含まれると考えられる。 より具体的には本発明は上に概説した配列の１つまたはそれ以上を含む組換え 構築物をも包含する。これらの構築物は本発明の配列が前向きまたは逆向きに挿 入されているベクター（プラスミドやウイルスベクターなど）を含む。この態様 の好ましい側面として、上記構築物はさらに上記配列に機能的に作用するように 連結された調節配列（例えばプロモーターなど）をも含有する。好適なベクター とプロモーターは当業者に多数知られており市販されている。次に挙げるベクタ ーはその例である。細菌用:pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen社）、pbs、pD10、Phag escript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（ Stratagene社）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia社 ）。真核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、p0G44、pXT1、pSG（Stratagene社）、pSVK3 、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia社）。ただし、他のプラスミドまたはベクター であっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能である限り使用できる。 プロモーター領域はCAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクタ ーや、選択マーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の望ましい遺伝子から選 択できる。適当なべクターはPKK232-8とPCM7である。特に有名な細菌プロモータ ーとしてはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpが挙げられる。真核プ ロモーターとしてはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レ トロウイルスのLTR、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクター とプロモーターの選択は当技術分野の通常の技術水準に十分含まれる。 さらなる態様として本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関する。本 発明の宿主細胞は哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよいし、酵母細胞 のような下等真核細胞であってもよく、また細菌細胞のような原核細胞であって もよい。宿主細胞への上記構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクショ ン、DEAE-デキストランによるトランスフェクションまたはエレクトロポレーシ ョンによって達成できる（Davisら,Basic Methods in Molecular Biology，ニュ ーヨーク・Elsevier社（1986））。 宿主細胞中の構築物を従来のように使用することにより、その組換え配列によ ってコードされる遺伝子産物を生産できる。別法として本発明ポリペプチドを従 来のペプチド合成装置で合成的に生産することもできる。 成熟タンパク質は適当なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌また は他の細胞中で発現させることができる。本発明DNA構築物から得られるRNAを用 いて上記タンパク質を生産するために無細胞翻訳系も使用することもできる。原 核宿主および真核宿主での使用に適したクローニングベクターと発現ベクターは 、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第２版，ニューヨーク 州コールドスプリングハーバー（1989））に記述されており、その記述は参考文 献として本明細書の一部を構成する。 本発明ポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写はそのベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーはプロモ ーターに作用してその転写を増進する通常10〜300bpのDNAのシス作用性配列であ る。複製起点の後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイル ス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオー マエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどがその例である。 一般的に組換え発現ベクターは、複製起点、その宿主細胞の形質転換を可能に する選択マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカロミセス・ セレビシェTRP1遺伝子）および下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来 のプロモーターを含むだろう。そのようなプロモーターは、なかんずく3-ホスホ グリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファター ゼまたは熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。異 種構造配列は翻訳開始配列と終結配列および好ましくは翻訳されたタンパク質の 周辺腔または細胞外培地への分泌を指令する能力を持つリーダー配列と、適当な 位相で組み立てられる。随意にその異種配列は発現した組換え産物の安定化や簡 便な精製などといった所望の特徴を付与するＮ末端同定ペプチド（identificati on peptide）を含む融合タンパク質をコードしてもよい。 細菌用として有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA 配列を適当な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に機能的プロモータ ーに対して機能的に作用しうる解読位相（reading phase）で挿入することによ り構築される。ベクターはそのベクターの維持を保証し、かつ、所望であればそ の宿主内での増幅を行うために、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーと複 製起点を含むだろう。形質転換に好適な原核宿主としては大腸菌、枯草菌、ネズ ミチフス菌ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコ ッカス属の様々な種が挙げられる。ただし他の宿主も選択肢として使用できる。 細菌用として有用な発現ベクターの典型例としては周知のクローニングベクタ ーpBR322（ATCC37017）の遺伝子配列を含む市販のプラスミドに由来する選択マ ーカーと細菌性複製起点を含むものを挙げることができる（ただしこれに限るわ けではない）。そのような市販ベクターとしては例えばpKK223-3（Pharmacia Fi ne Chemicals社，スウェーデン・ウプサラ）とGEM1（PromegaBiotec.社,米国ウ ィスコンシン州マディソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分は適当 なプロモーターおよび発現させようとする構造配列と組み合わされる。 適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで生育した後、選 択したプロモーターを適当な手段（例えば温度変化や化学的誘導）によって誘導 し、細胞をさらに培養する。 典型的には細胞を遠心分離によって収集し、物理的または化学的手段によって 破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために確保する。 タンパク質の発現に使用する微生物細胞は凍結−融解サイクル、超音波処理、 機械的破壊または細胞溶解剤の使用など、都合のよい方法のいずれでも破壊でき る。 組換えタンパク質を発現させるためには種々の啼乳類細胞培養系も使用できる 。哺乳類発現系の例としてはGluzman，Cell,23:175（1981）に記載のサル腎繊維 芽細胞のCOS-7株や、適合するベクターを発現させることのできる他の細胞株（ 例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳類発現ベ クターは複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサーを含み、さらに任意 の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプ ライス受容部位、転写終結配列および5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要な 非転写遺伝子要素を提供するにはSV40スプライシングによって得られるDNA配列 およびポリアデニル化部位を使用できる。 Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドは、例えば硫酸アンモニウムまたは エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホ スホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび レクチンクロマトグラフィーなどといった方法によって、組換え細胞培養から回 収、精製できる。必要に応じて成熟タンパク質の構造を完成させる際にタンパク 質再生段階を使用できる。最後に最終的な精製段階として高性能液体クロマトグ ラフィー（HPLC）を使用できる。 本発明ポリペプチドは天然の精製産物であってもよいし、化学合成法の生成物 であってもよく、また組換え技術によって原核宿主または真核宿主（例えば培養 された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞）から生 産されるものであってもよい。組換え生産法に使用する宿主に依存して本発明ポ リペプチドはグリコシル化されることもあり、またグリコシル化されないことも ある。本発明ポリペプチドは開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。 本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドはヒト疾患の治療法および診断法を 発見するための研究試薬、研究材料として使用できる。 本発明Ｇタンパク質共役レセプターはそのレセプターのアンタゴニストおよび /またはアゴニストをスクリーニングする方法で使用できる。 一般にそのようなスクリーニング法にはそのレセプターを表面に発現させる適 当な細胞を用意する必要がある。具体的には本発明レセプターをコードするポリ ヌクレオチドを使用して細胞をトランスフェクトし、それによってＧタンパク質 共役レセプターを発現させる。そのようなトランスフェクションは上述したよう な方法で行いうる。 そのようなスクリーニング法の一つでは、本発明Ｇタンパク質共役レセプター を発現させるようにトランスフェクトされたメラノフォアを使用する。そのよう なスクリーニング技術はPCT WO92/01810（1992年２月６日公開）に記述されてい る。 したがって例えばそのようなアッセイは、Ｇタンパク質共役レセプターをコー ドするメラノフォア細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングしようとす る化合物の両方と接触させることによってレセプターアンタゴニストをスクリー ニングするために使用できる。そのリガンドによって生成するシグナルの阻害は 、化合物がそのレセプターのアンタゴニスト候補であること、すなわちその化合 物がレセプターの活性化を阻害することを示す。 このスクリーニングは、上記の細胞をスクリーニングしようとする化合物と接 触させ、その化合物がシグナルを生成するかどうか、すなわちその化合物がレセ プターを活性化するかどうかを決定することによってアゴニストを決定するため に使用できる。 他のスクリーニング技術には、例えばScience,246:181-296（1989年10月）に 記述されているように、レセプターの活性化が引き起こす細胞外pHの変化を測定 する系でＧタンパク質共役レセプターを発現させる細胞（例えばトランスフェク トCHO細胞）を使用する方法がある。例えば、アゴニスト候補またはアンタゴニ スト候補をＧタンパク質共役レセプターを発現させる細胞と接触させ、第 二メッセンジャー反応（例えばシグナル伝達またはpH変化）を測定することによ り、そのアゴニスト候補またはアンタゴニスト候捕が有効であるかどうかを決定 しうる。 もうひとつのそのようなスクリーニング技術では、Ｇタンパク質共役レセプタ ーをコードするRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に導入し、そのレセプターを 一時的に発現させる。アンタゴニストスクリーニングの場合は、次にそのレヤプ ター卵母細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングしようとする化合物と 接触させ、次いでカルシウムシグナルの阻害を検出する。 もうひとつのスクリーニング技術では、レセプターがホスホリパーゼＣまたは Ｄと連係するようにＧタンパク質共役レセプターを発現させる。そのような細胞 の典型例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胚性腎細胞などを挙げることができ る。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングはそのレセプターの活性 化またはそのレセプターの活性化の阻害をホスホリパーゼ第二シグナルから検出 することによって上述のように行いうる。 もうひとつの方法では、表面にそのレセプターを持つ細胞に対するリガンドの 結合の阻害を測定することによってアンタゴニストをスクリーニングする。この ような方法では、真核細胞がその表面にＧタンパク質共役レセプターを発現させ るようにそのレセプターをコードするDNAを細胞にトランスフェクトし、標識型 既知リガンドの存在下にその細胞をアンタゴニスト候補と接触させる。リガンド は例えば放射活性などによって標識できる。レセプターに結合された標識リガン ドの量ば、例えばそのレセプターの放射活性を測定することによって測定される 。そのレセプターに結合する標識リガンド量の低下から判断してそのアンタゴニ スト候補がそのレセプターに結合する場合は、そのレセプターへの標識リガンド の結合が阻害される。 また本発明はＧタンパク質共役レセプターに結合しうるとわかっていないリガ ンドがそのレセプターに結合できるかどうかを決定する方法であって、Ｇタンパ ク質共役レセプターを発現させる哺乳類細胞を、そのＧタンパク質共役レセプタ ーへのリガンド類の結合が可能な条件下にそのリガンドと接触させ、そのレセプ ターと結合するリガンドの存在を検出することにより、そのリガンドがそのＧ タンパク質共役レセプターに結合するかどうかを決定することからなる方法を提 供する。アゴニストおよび/またはアンタゴニストを決定するための上述の系も 、そのレセプターに結合するリガンドを決定するために使用できる。 一般にスクリーニング法によって決定されるＧタンパク質共役レセプターのア ンタゴニストは様々な治療目的に使用できる。例えばそのようなアンタゴニスト は高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、うつ病、片頭 痛、嘔吐、良性前立腺肥大の治療に使用されている。 Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニストも喘息、パーキンソン病、急性心不 全、低血圧、尿閉および骨粗霜症などの治療薬として治療目的で使用される。 アンタゴニスト候補は、Ｇタンパク質共役レセプターに結合するが第二メッセ ンジャー反応を誘発しないためにそのＧタンパク質共役レセプターの活性が妨害 される抗体または場合によってオリゴヌクレオチドである。 アンタゴニスト候補としては、生物学的機能を失っていてＧタンパク質共役レ セプターに結合しても何の反応も誘発しない、Ｇタンパク質共役レセプターのリ ガンドに密接に関連するタンパク質（すなわちそのリガンドの断片）も挙げられ る。 またアンタゴニスト候補にはアンチセンス技術を使って調製されるアンチセン スコンストラクトも含まれる。アンチセンス技術は三重らせん形成もしくはアン チセンスDNAまたはアンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の制御に使用でき、こ れらの方法は共にDNAまたはRNAに対するポリヌクレオチドの結合に基づいている 。例えば本発明成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード 部分を用いて約10〜40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計す る。DNAオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子領域に相補的になるように 設計されるので（三重らせん−Leeら,Nud.Acids.Res.,6:3073（1979）；Cooney ら，Science，241:456（1988）；Dervanら，Science，251:1360（1991）を参照 ）、Ｇタンパク質共役レセプターの転写と産生が妨害される。アンチセンスRNA オリゴヌクレオチドはin vivoでmRNAにハイブリダイズし、そのmRNA分子のＧタ ンパク質共役レセプターへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano，J.Neuroch em.，56:560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression（訳：遺伝子発現のアンチセンス阻 害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド）,CRCPress社，フロリダ州ボカラト ン（1988）を参照）。アンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAがin vivoで発現 してポリペプチドの産生を阻害しうるように上述のオリゴヌクレオチドを細胞に 送達することもできる。 もうひとつのアンタゴニスト候補は、Ｇタンパク質共役レセプターに結合して それをリガンドに接近できなくすることによって正常な生物学的活性を妨害する 小分子である。小分子の例としては小ペプチドまたは小さいペプチド様分子が挙 げられるが、これらに限るわけではない。 アンタゴニスト候補には、リガンドに結合してそのリガンドが膜結合型Ｇタン パク質共役レセプターと相互作用するのを防ぐ可溶型のＧタンパク質共役レセプ ター（例えばそのレセプターの断片）も含まれる。 本発明Ｇタンパク質共役レセプターはPACAP様レセプターまたはセクレチンレ セプターであると推定的に同定された。この同定はアミノ酸配列相同性の結果と して行われた。 これらのアンタゴニストは分泌過多状態の治療と、薬理学的健忘症の誘発また は長期記憶の達成に使用しうる。これらのアンタゴニストは、例えば後述するよ うな製薬上許容できる担体との組成物として使用しうる。 上述のようなスクリーニング法によって同定されるアゴニストは、分泌不全状 態の治療、記憶の向上、健忘症の治療とアルツハイマー病などの疾患を予防およ び/または治療するための神経症における神経細胞死の予防に使用しうる。 これらのアンタゴニストまたはアゴニストは適当な医薬担体と組み合わせて使 用しうる。そのような組成物は治療有効量のポリペプチドと製薬上許容できる担 体または賦形剤を含有する。そのような担体としては食塩水、緩衝食塩水、デキ ストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げら れる（ただしこれらに限るわけではない）。その製剤はその投与法に適合してい るべきである。 本発明は本発明医薬組成物の１つまたはそれ以上の成分で満たされた１つまた はそれ以上の容器からなる医薬パックまたはキットをも提供する。そのような容 器には医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関に よって規定された形式でヒト投与に関する製造、使用または販売の該機関による 認可を反映する情報を付すことができる。また本発明のポリペプチド、アゴニス トおよびアンタゴニストを他の治療用化合物と併用してもよい。 これら医薬組成物は局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻孔内または皮内 経路など都合のよい方法で投与できる。これら医薬組成物は特定の適応の治療お よび/または予防に有効な量で投与される。一般的には少なくとも約10μg/kg体 重の量で投与され、ほとんど場合は約8mg/kg体重/日を超えない量で投与される だろう。ほとんどの場合、投与量は投与経路、症状などを考慮して一日あたり約 10μg/kg〜約1mg/kg体重である。 また本発明は細胞表面での本発明HCEGH45レセプターポリペプチドの発現を検 出する方法であって、その細胞から全mRNAを得て、そのようにして得たmRNAを、 そのレセプターをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブ リダイズできる少なくとも10ヌクレオチドの核酸分子を含んでなる核酸プローブ とハイブリダイゼーション条件下に接触させ、そのプローブにハイブリダイズし たmRNAの存在を検出することにより、その細胞によるそのレセプターの発現を検 出することによる方法を提供する。 また本発明は本発明レセプターポリペプチドと関連するレセプターを同定する 方法を提供する。これら関連レセプターは本発明HCEGH45レセプターポリペプチ ドに対する相同性によって、または低ストリンジェンシー交差ハイブリダイゼー ションによって、もしくは関連する天然リガンドまたは合成リガンドと相互作用 するか、本発明神経ペプチドレセプターポリペプチドの遺伝子的または薬理学的 遮断後に類似する挙動を誘発するレセプターを同定することによって同定しうる 。 HCEGH45レセプターポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストま たはアゴニストは、しばしば「遺伝子療法」と呼ばれるin vivoでのそれらポリ ペプチドの発現により、本発明に従って使用しうる。 したがって例えば患者から得た細胞をポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド（DNAまたはRNA）を使ってex vivoで操作し、そのポリペプチドで処置 しようとする患者に操作したその細胞を提供しうる。このような方法は当技術分 野ではよく知られている。例えば本発明ポリペプチドをコードするRNAを含有す るレトロウイルス粒子を使用して、当技術分野で知られている手法で細胞を操作 しうる。 さらに、in vivoでポリペプチドを発現させるために、例えば当技術分野で知 られている手法により、in vivoで細胞を操作してもよい。in vivoで細胞を操作 しin vivoでポリペプチドを発現させるには、当技術分野で知られているように 、本発明ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を生産す るための生産細胞を患者に投与すればよい。そのような方法による本発明ポリペ プチドの上記その他の投与法は、本発明の教示するところから、当業者には明ら かなはずである。例えば細胞を操作するための発現ビヒクルはレトロウイルス粒 子以外のもの、例えば適当な送達ビヒクルと組み合わせればin vivoで細胞を操 作するために使用できるアデノウイルスなどであってもよい。 上述のレトロウイルスプラスミドベクターの出発物質になりうるレトロウイル スとしては、モロニーネズミ白血病ウイルス、牌臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウ イルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイ ルス、ヒト免疫不全症ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス、脊髄増 殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限るわけではな い。一態様としてレトロウイルスプラスミドベクターはモロニーネズミ白血病ウ イルスから誘導される。 ベクターは１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。使用しうる好適なプロ モーターとしてはレトロウイルスLTR、SV40プロモーター、Millerら，Biotechni ques, Vol.7,No.9,980.990（1989）に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プ ロモーターまたは他の任意のプロモーター（例：細胞プロモーター、例えばヒス トンプロモーター、polIIIプロモーター、β-アクチンプロモーターなど（ただ しこれらに限らない）の真核細胞プロモータ一）が挙げられるが、これらに限る わけではない。使用しうる他のウイルスプロモーターとしてはアデノウイルスプ ロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、B19パルボウイルスプロモ ーターが挙げられるが、これらに限るわけではない。適当なプロモータ ーの選択は、本明細書の記述から、当業者には明らかだろう。 本発明ポリペプチドをコードする核酸配列は好適なプロモーターの制御下にあ る。使用しうる好適なプロモーターとしては、アデノウイルスメジャー後期プロ モーターなどのアデノウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プ ロモーターなどの異種プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモータ ー、MMTプロモーターやメタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモータ ー、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモーター、 ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどの ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスLTR（上述の修飾レト ロウイルスＬＴＲを含む）、β-アクチンプロモーター、ヒト成長ホルモンプロ モーターが挙げられるが、これらに限るわけではない。プロモーターは本発明ポ リペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。 生産細胞株を作出するために、そのレトロウイルスプラスミドベクターを用い てパッケージング細胞を形質導入する。トランスフェクトしうるパッケージング 細胞の例としてはMiller,Human Gene Therapy,Vol.1，5〜14頁（1990）（この刊 行物の全内容は参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載のDAN、PE501 、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17.H2、ψCRE、ψCRIP、GP:+E-8 6およびGP+envAm12細胞系が挙げられるが、これらに限るわけではない。ベクタ ーは当技術分野で知られている任意の手段でパッケージング細胞に形質導入でき る。そのような手段としてはエレクトロポレーション、リポソームの使用および CaPO4沈殿法が挙げられるが、これらに限るわけではない。もうひとつの方法と して、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに封入するか脂質にカッ プリングしてから、宿主に投与してもよい。 生産細胞株は本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウ イルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウイルスベクター粒子はinvi troまたはin vivoで真核細胞の形質導入に使用できる。形質導入された真核細胞 はそのポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるだろう。形質導入されう る真核細胞としては胚幹細胞、胚性癌腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、繊維 芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞、気管支上皮細胞などが挙げられるが、 これらに限るわけではない。 本発明遺伝子を例えば先天性欠損遺伝子がもたらすいくつかの疾患の遺伝子診 断薬として使用することも考えられる。これらの遺伝子はその欠損遺伝子の配列 を正常な遺伝子の配列と比較することによって検出できる。次に「突然変異型」 遺伝子がレセプター活性異常と関係することを確かめることができる。またもう ひとつの手段として、突然変異型レセプター遺伝子を適当なベクターに挿入し、 機能測定系（例えばHEK293細胞のレセプター欠損株における比色アッセイ、McCo nkeyプレートでの発現、相補性実験）で発現させることにより、突然変異を確認 または同定できる。「突然変異型」遺伝子が同定されたら、その「突然変異型」 レセプター遺伝子の保持者に関して集団をスクリーニングできる。 本発明遺伝子に突然変異を保持する個体は様々な技術によりDNAレベルで検出 しうる。診断に使用する核酸は血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料などと いった患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは検出に直接使用してもよ いし、分析に先立ってPCRで酵素的に増幅してもよい（Saikiら,utre,324:163-16 6,1986）。RNAやcDNAも同じ目的に使用できる。一例として、本発明遺伝子中の 突然変異を同定および分析するには、本発明核酸に相補的なPCRプライマーを使 用できる。例えば欠失と挿入は正常遺伝子型と比較しで増幅産物のサイズの変化 によって検出できる。点変異は放射線標識した本発明RNA配列または放射線標識 した本発明アンチセンスDNA配列に増幅したDNAをハイブリダイズさせることによ って同定できる。完全に一致する配列は、RNaseＡ消化または融解温度の相違に よって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と識別できる。このような診断薬は出生前 検査さらには新生児検査にとりわけ役立つだろう。 基準遺伝子と「突然変異体」の間の配列の相違は直接DNA配列決定法で明らか にできる。またクローン化したDNA断片をプローブとして特定のDNA断片を検出す ることもできる。この方法の感度はPCRと組み合せると著しく向上する。例えば 配列決定用プライマーを二本鎖PCR産物または改良PCR法によって生成した一本鎖 テンプレート分子と共に使用する。配列決定は放射線標識したヌクレオチドを用 いる従来の方法か、蛍光標識を使った自動配列決定法によって行われる。 DNA配列の相違に基づく遺伝子検査は変性剤を含む（または含まない）ゲルに おけるDNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって達成できる。特 定位置での配列変化は化学的切断法や、RNaseおよびS1保護法などのヌクレアー ゼ保護アッセイでも明らかにできる（例えばCottonら，PNAS，USA,86:43974101 ，1985を参照）。 またいくつかの疾患はmRNAの変化によって検出されうる遺伝子発現の変化の結 果であるか、もしくはそのような変化を特徴とする。本発明遺伝子を基準として 使用することにより、このタイプのレセプター関連機能の低下を示す個体を同定 することもできる。 また本発明は種々の組織における本発明HCEGH45レセプターポリペプチドの可 溶型のレベルの変化を検出するための診断測定法に関する。宿主から得た試料中 の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するために使用ざれる測定法は 当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタ ンブロット分析、また好ましくはELISA法などがある。 ELISA法ではまずHCEGH45レセプターの抗原に特異的な抗体（好ましくはモノク ローナル抗体）を調製する。さらにそのモノクローナル抗体に対するリポーター 抗体を調製する。リポーター抗体には放射活性や蛍光などの検出可能な試薬（こ の例ではセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素）を結合する。次に宿主から試料 を採取し、その試料中のタンパク質を結合する固形支持体（例えばポリスチレン 皿）上でインキュベートする。次に非特異的タンパク質（ウシ血清アルブミンな ど）と共にインキュベートすることによって、皿上の遊離のタンパク質結合部位 をすべて覆う。次に上記モノクローナル抗体をその皿中でインキュベートする。 この間にモノクローナル抗体はポリスチレン皿に結合したHCEGH45レセプタータ ンパク質のすべてに結合する。未結合のモノクローナル抗体をすべて緩衝液で洗 い流す。次にセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体をその 皿に入れ、HCEGH45レセプタータンパク質に結合したすべてのモノクローナル抗 体にそのリポーター抗体を結合させる。次に未結合のリポーター抗体を洗い流す 。次にペルオキシダーゼ基質をその皿に加え、所定の期間中に発色した色の量を 標準曲線と比較すれば、所定の体積の患者試料中に存在する HCEGH45レセプタータンパク質の量の測定値になる。 本発明の配列は染色体同定にも有用である。この配列は個々のヒト染色体上の 特定位置に特異的にターゲティングされ、それにハイブリダイズできる。さらに 染色体上の特定部位を同定することは、現在必要とされていることでもある。現 在のところ染色体位置のマーキングに利用できる、実際の配列データ（反復多型 （repeat pclymorphism's））に基づく染色体マーキング試薬はほとんどない。 本発明による染色体へのDNAのマッピングは、それらの配列を疾患に関係する遺 伝子と相関させる際の重要な第一段階である。 簡単に述べると配列はそのcDNAからPCRプライマー（15〜25bpが好ましい）を 調製することによって染色体上にマッピングできる。ゲノムDNA中の２以上のエ クソンにまたがることによって増幅工程を複雑にすることのないプライマーをす ばやく選択するには、そのcDNAのコンピューター分析を用いる。次に個々のヒト 染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングにそれらのプライマ ーを用いる。そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみ が増幅断片を与えるだろう。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て る迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを使って本発明を用い ることにより、同様の方法で特定の染色体に由来する断片のパネルまたは大きい ゲノムクローンのプールでサブマッピング（sublocalization）を行うことがで きる。染色体でのマッピングに同様に使用できる他のマッピング法としてはin s ituハイブリダイゼーション、染色体特異ｃＤＮＡライブラリーを構築ずるため のハイブリダイゼーションによる予備選択および標識フロー選別（labeled flow -sorted）染色体を使った予備スクリーニングが挙げられる。 中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（FIS H）を用いると一段階で正確な染色体位置が得られる。この技術は50または60程 度の短いcDNAにも使用できる。この技術の概要についてはVermaら，Human Chrom osomes:a Manual of Basic Techniques,Pergamon Press社，ニューヨーク（1988 ）を参照されたい。 配列を正確な染色体位置にマッピングしたら、その配列の染色体上の物理的位 置を遺伝地図データと相関させることができる。そのようなデータは例えばMcKu sick,Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ・メ ディカル・ライブラリーからオンラインで入手できる）に認められる。次に同じ 染色体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖解析（物理的に隣接す る遺伝子の同時遺伝）によって同定する。 次に患者と非患者の間でそのcDNAまたはゲノム配列の相違を決定する必要があ る。ある突然変異が患者の一部または全部に観測され、正常な個体には観測され ない場合、その突然変異はその疾患の原因因子であるかもしれない。 物理的マッピング技術と遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、その疾患 に関係する染色体領域に正確にその位置が特定されるcDNAは50〜500個の原因遺 伝子候補のうちの一つになるだろう（マッピング解像度を１メガ塩基、20kbにつ き１遺伝子と仮定）。 本ポリペプチド、それらの断片または他の誘導体、その類似体もしくはそれら を発現させる細胞は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として使用で きる。これらの抗体は例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でありう る。本発明はキメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体およびFab断片またはFab発現 ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体および断片の生産には当技術 分野で知られる種々の方法を使用できる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成する抗体は動物にそのポリ ペプチドを直接注射するか、動物（好ましくはヒト以外の動物）にそのポリペプ チドを投与することによって得ることができる。そのようにして得た抗体はその ポリペプチド自体に結合するだろう。この方法で、完全な天然ポリペプチドを結 合する抗体を生成させるためにそのペプチドの断片のみをコードする配列も使用 できる。そのような抗体はそのポリペプチドを発現させる組織からそのポリペプ チドを単離するために使用できる。 モノクローナル抗体の製造には連続継代細胞系培養によって生産される抗体を 与える任意の技術を使用できる。その例としてはハイブリドーマ技術（Kohlerお よびMilstein,Nature,256:495-497,1975）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ 細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら,Immunology Today 4:72,1983）およ びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，M onoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss社,77-96頁（1985））が 挙げられる。 一本鎖抗体の生産について記述した技術（米国特許4,946,778）は本発明の免 疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることができる。 またトランスジェニックマウスを用いて本発明免疫原性ポリペプチド産物に対す るヒト化抗体を発現させることもできる。 下記の実施例を参照して本発明をさらに説明する。ただし本発明はこれらの実 施例に限定されないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や量はすべ て重量に基づく。 実施例 下記実施例の理解を容易にするため、頻繁に使用する方法および/または用語 をいくつか説明しておく。 「プラスミド」は小文字ｐとその前後の大文字および/または数字で指定され る。ここでの出発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手できるか、 または入手できるプラスミドから公表された方法に従って構築できる。また当技 術分野ではここに記述するプラスミドと等価なプラスミドが知られており、それ らは当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とはそのDNA中の特定配列でのみ作用する制限酵素によるDNAの 触媒的切断を指す。ここで使用する種々の制限酵素は市販されており、それらの 反応条件、補因子、その他の必要条件は当業者に知られているであろうものを使 用した。分析には通常１μｇのプラスミドまたはDNA断片を約２単位の酵素と共 に約20μｌの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築用のDNA断片を単離する場 合は、通常、より大きい体積中で5〜50μｇのDNAを20〜250単位の酵素で消化す る。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は製造者によって指定される。通 常は37℃で約１時間のインキュベーション時間を使用するが、これは供給者の指 示に従って変化しうる。消化後、その反応液をポリアクリルアミドゲルで直接電 気泳動して所望の断片を単離する。 切断した断片のサイズ分離はGoeddelら,Nudeic Acids Res.，8:4057（1980） に記載の8％ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。 「オリゴヌクレオチド」とは化学的に合成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオ チドまたは２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合 成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないので、キナーゼの存在下にATPで リン酸基を付加しないと、もうひとつのオリゴヌクレオチドには連結しないだろ う。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結するだろう。 「連結（ライゲーション）」とは２本の二本鎖核酸断片間にリン酸ジエステル 結合を形成させる過程をいう（Maniatisら，同上,146頁）。特に断わらない限り 、連結は、既知の緩衝液と条件を用い、連結しようとするほぼ等モル量のDNA断 片0.5μｇにつき10単位のT4DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で行いうる。 特に明言しない限り、形質転換はGrahamおよびVan der Eb，Virology,52:456- 457（1973）の方法で行なった。 実施例１ COS-7細胞での組換えHCEGH45の発現 発現プラスミドHCEGH45-HAは1）SV40複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、 3）大腸菌複製起点、4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV40 イントロンおよびポリアデニル化部位を含有するベクターpcDNAI/Amp（Invitrog en社）に由来する。全HCEGH45前駆体とその3'末端に同じ枠で（in frame）融合 したHA標識とをコードするDNA断片を上記ベクターのポリリンカー領域にクロー ニングした。したがってその組換えタンパク質の発現はCMVプロモーターに制御 される。HA標識は既に記述したようにインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に 由来するエピトープに対応する（Wilsonら，Cell,37:767,1984）。我々が標的と するタンパク質にHA標識を融合することにより、そのHAエピトープを認識する抗 体を使ってその組換えタンパク質を容易に検出できるようになる。 プラスミド構築法は次の通りである。 HCEGH45をコードするDNA配列（ATCC No.97132）を、次の２つのプライマーを 用いるPCRによって構築しクローニングした。5'プライマーGGCTTCCTCGAATCCCGTC ATGAACTCC（配列番号4）はEcoRI部位とそれ に続くHCEGH45コード配列の開始コドンから始まる９ヌクレオチドとを含有する 。3'配列GGGTTCTCGAGCGGGCACTGCTCACAGAGGAGACG(配列番号5)はXhoI部位、翻訳終 止コドン、HA標識およびHCEGH45コード配列の最後の11ヌクレオチド（終止コド ンを含まない）に相補的な配列を含有する。したがってそのPCR産物はEcoRI部位 、HCEGH45コード配列、翻訳終結終止コドンおよびXhol部位を含有する。そのPCR 増幅DNA断片とベクターpcDNAI/AmpをEcoRIおよびXhoI制限酵素で消化し連結した 。その連結混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems社（92037カリ フォルニア州ラホーヤ、ノーストリーパインロード11099）から入手できる）を 形質転換し、その形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養して、耐性コ ロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、制限分析によって 正しい断片の存在を調べた。組換えHCEGH45を発現させるため、DEAE-デキストラ ン法（Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版,Cold Spr ing Laboratory Press（1989））によってCOS-7細胞に上記発現ベクターをトラ ンスフェクトした。HCEGH45-HAタンパク質の発現は放射線標識および免疫沈殿法 （HarlowおよびLarle,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La boratory Press（1988））によって検出した。トランスフェクションの２日後に 細胞を35S-システインで８時間標識した。次に培養培地を集め、細胞を界面活性 剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl，1％NP-40,0.1％SDS，1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tr is,pH7.5）で溶解した（Wilsonら，同上,37:767（1984））。細胞溶解液と培養 培地の両方をHA特異モノクローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパク質を15 ％SDS-PAGEゲルで分析した。 実施例２ バキュロウイルス発現系を用いたHCEGH45のクローニングと発現 完全長HCEGH45タンパク質をコードするDNA配列（ATCC No.97132）をその遺伝 子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅 した。 その5'プライマーは GTGCGTCCCGGGTTCCTCAGACCGCCATCATGAACTCC（配列番号6）と いう配列を持ち、SmaI制限酵素部位（太字部分）を含有し、その後ろに真核細胞 における効率のよい翻訳開始シグナルに似た17ヌクレオチド（Kozak,J.Mol.Biol .,196:947-950（1987））が続き、その直後にHCEGH45遺伝子の最初の９ヌクレオ チドが続いている（翻訳開始コドン「ATG」に下線を引いてある）。 3'プライマーはCGGGTACCAGAGCGGGCACTGCTCACAGAGGAGACG(配列番号7)という配 列を持ち、制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位とHCEGH45遺伝子の3'非翻 訳配列に相補的な13ヌクレオチドとを含有する。増幅された配列は市販のキット （「Geneclean」,BIO 101社，カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて1％アガロー スゲルから単離した。次にその断片をエンドヌクレアーゼSmalおよびAsp718で消 化した後、上述のように精製した。この断片をF2と呼ぶ。 バキュロウイルス発現系（概要についてはSummerおよびSmith,A Manual of Me thods ForBaculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,Texas Ag ricultural Experimental Station Bulletin No.1555（1987）を参照されたい） を用いたHCEGH45タンパク質の発現には、ベクターpA2（pVL941ベクターを改良し たもの；後述）を使用する。この発現ベクターはオートグラファ核多角体病ウイ ルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus；AcMNPV）の強力 なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターと、それに続く制限エンドヌクレア ーゼSmalおよびAsp718の認識部位とを含有する。効率のよいポリアデニル化のた めにシミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位が使用される。組換えウイ ルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘ ドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行するポリヘドリンプロモーターと 同じ方向に挿入される。ポリヘドリン配列の両端には同時にトランスフェクトさ れる野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換え用にウイルス配列を隣接させる 。pRG1の代わりにpAc373、pVL941およびpAcIM1（LuckowおよびSummers,Virology ,170:31-39,1989）などといった他の多くのバキュロウイルスベクターも使用で きるだろう。 そのプラスミドを制限酵素SmalおよびAsp718で消化した後、ウシ腸ホスファタ ーゼを用いて当技術分野で知られている手法で脱リン酸化した。次にその DNAを1％アガロースゲルから上述のように単離した。このベクターをV2と呼ぶ。 断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4DNAリガーゼで連結した。次に大腸菌HB1 01細胞を形質転換し、そのプラスミド（pBac-HCEGH45）を含有する細菌を制限酵 素SmaIおよびAsp718を使って同定した。クローン化した断片の配列をDNA配列決 定によって確認した。 リポフェクション法（Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417（198 7））を用いて５μｇのプラスミドpBac-HCEGH45を市販の直鎖化されたバキュロ ウイルス（「BaculoGoldTMバキュロウイルスDNA」,Pharmingen社，カリフォルニ ア州サンディエゴ）1.0μと同時にトランスフェクションした。 １μｇのBaculoGoldTMウイルスDNAと５μｇのプラスミドpBac-HCEGH45を無血 清グレース培地（Life Technologies社，メリーランド州ガイサースブルク）50 μｌの入ったマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、リ ポフェクチン10μｌとグレース培地90μｌを加え、混合し、室温で15分間インキ ュベートした。次に血清を含まないグレース培地lmlが入っている35mm組織培養 プレートに接種したSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に上記トランスフェクション 混合物を滴下した。プレートを前後にゆすって新たに加えた溶液を混合した。次 にそのプレートを27℃で５時間培養した。５時間後、トランスフェクション溶液 をプレートから取り除き、10％ウシ胎児血清を補足したグレース昆虫培地1mlを 加えた。そのプレートを培養器に戻し、培養を27℃で４日間続けた。 ４日後に上清を集め、SummersおよびSmith（上記）の記述と同様にしてプラー クアッセイを行なった。改良点として「Blue Gal」（Life Technologies社，ガ イサースブルク）を含むアガロースゲルを使用した。これにより青く染色したプ ラークを容易に単離できる。（「プラークアッセイ」に関する詳細な説明はLife Technologies社（ガイサースブルク）が発行しているuser's guide for insect cellculture and baculovirology（訳：昆虫細胞培養とバキュロウイルス学に関 するユーザーズガイド）の9-10頁にも認められる。） ４日後にウイルスの連続希釈液を細胞に加え、青く染まったプラークをエッペ ンドルフピペットのチップで拾った。次に組換えウイルスを含有するその寒天を グレース培地200μｌが入ったエッペンドルフチューブに再懸濁した。短い遠心 分離によって寒天を除去し、組換えバキュロウイルスを含有するその上清を用い て35mm皿に接種したSf9細胞を感染させた。４日後にそれら培養皿の上清を収集 し、４℃で保存した。 Sf9細胞を10％熱非働化FBSを補足したグレース培地で生育した。その細胞を組 換えバキュロウイルスV-HCEGH45に感染多重度（MOI）２で感染させた。６時間後 に培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF900II培地（Life Technologi es社，ガイサースブルク）に置換した。42時間後、５μCiの35S-メチオニンと５ μCiの35S-システイン（Amersham社）を加えた。細胞をさらに16時間培養した後 、遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグ ラフィーで可視化した。 実施例３ ヒト組織におけるHCEGH45の発現パターン ヒト組織におけるHCEGH45の発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析 を行う。RNAzolTMBシステム（Biotecx Laboratories社,77033テキサス州ヒュー ストン、サウスループイースト6023）を使って全細胞RNA試料を単離する。記載 の各ヒト組織から単離した全RNA約10μｇを1％アガロースで分離し、ナイロンフ ィルターにブロットする（Sambrook,FritschおよびManiatis,Molecular Cloning ,Cold Harbor Press,1989）。標識反応は50ngのDNA断片を使いStl-atagene社のP rime-Itキットに従って行う。標識されたDNAはSelect-G-50カラムで精製する（5 Prime-3Prime社,80303コロラド州ボールダー、アラパホ一ロード5603）。次にそ のフィルターを0.5M NaPO4（pH7.4）および7％SDS中65℃で1,000,000cpm/mlの放 射活性標識した完全長HCEGH45遺伝子とハイブリダイズさせる。0.5×SSC/0.1％S DSを使って室温で２回、60℃で２回洗浄した後、増感紙を用いてそのフィルター を−70℃で終夜感光させる。HCEGH45のメッセージRNAはヒト小脳組織に豊富であ る。 実施例４ 遺伝子療法による発現 皮膚生検によって対象から繊維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に 入れ、小片に分割する。小さい組織塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く。 各フラスコに約10片ずつを入れる。そのフラスコを上下逆さにし、きつく密閉し て室温で終夜放置する。室温で24時間後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフ ラスコの底に固定したまま、新鮮な培地（例えば10％FBS、ペニシリンおよびス トレプトマイシンを含むハムF12培地）を加える。次にこれを37℃で約１週間培 養する。この時点で新鮮な培地を加え、以降、数日毎に交換する。さらに２週間 培養すると繊維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン処理して、より大 きなフラスコに移す。 モロニーネズミ肉腫ウイルスの末端反復配列が隣接したpMV-7（Kirschmeier,P .T.ら,DNA,7:219-25（1988））をEcoRIとHindIIIで消化した後、ウシ腸ホスファ ターゼで処理する。その線状ベクターをアガロースゲルで分画し、ガラスビーズ を用いて精製する。 本発明ポリペプチドをコードするcDNAをそれぞれ5'末端配列および3'末端配列 に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。その5'プライマーはEcoRI部位を含 有し、3'プライマーはHindIII部位を含む。モロニーネズミ肉腫ウイルス線状骨 格と増幅したEcoRI-HindIII断片をT4DNAリガーゼの存在下に等量ずっ混合する。 得られた混合物を上記二断片の連結に適した条件下で維持する。その連結混合物 を用いて細菌HB101を形質転換した後、目的の遺伝子がベクターに正しく挿入さ れていることを確認するために、それをカナマイシン含有寒天上で平板培養する 。 両種性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を10％ウシ血清（CS）、ペニシ リンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中コ ンフルエント密度まで組織培養する。次に上記遺伝子を含有するＭＳＶベクター をその培地に加え、パッケージング細胞をそのベクターで形質導入する。パッケ ージング細胞は上記遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生産するようになる （このパッケージング細胞を生産細胞と呼ぶ）。 形質導入された生産細胞に新鮮な培地を加えた後、コンフルエント生産細胞の 10cmプレートから培地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその使用済 み培地をミリポアフィルターに通して剥離した生産細胞を除去し、その培地を使 って繊維芽細胞を感染させる。繊維芽細胞のサブコンフルエント（sub-confluen t）プレートから培地を除去し、生産細胞から得た培地にすばやく置換する。こ の培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高ければ、実質上全 ての繊維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が極めて低い場合は 、neoやhisなどの選択マーカーを持つレトロウイルスベクターを使用する必要が ある。 次に操作した上記繊維芽細胞をそのまま、またはサイトデックス３ミクロキャ リアービーズ（cytodex 3 microcarrier beads）上でコンフルエントに成長させ た後、宿主に注射する。その繊維芽細胞は上記タンパク質産物を生産するように なっている。 上の記述に照らして本発明には数多くの変更態様や変法が可能であるので、具 体的に説明した態様の他にも添付の請求の範囲内で本発明を実施することができ る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human G protein receptor HCEGH45, PACAP-like (G protein pituitary adenylate Cyclase-activating polypeptide-like) receptor   The present invention relates to newly identified polynucleotides, Use of the encoded polypeptide, its polynucleotides and polypeptides And its production of polynucleotides and polypeptides. More specifically The polypeptide of the present invention is a human seven-transmembrane receptor. This transmembrane type The receptor is a G protein-coupled receptor. More specifically, this seven-time membrane The penetrating receptor is the human G protein pituitary adenyl of the amnesiac-like neuropeptide Presumed to be an acid cyclase activating polypeptide (PACAP) -like receptor, This may be called "HCEGH45" below. The present invention also relates to the action of the above polypeptide. Related to inhibiting.                                Background of the Invention   Numerous medically important biological processes include G proteins and / or cAMP. Which proteins involved in signaling pathways require second messengers Therefore, it is well established that it is mediated (Lefkowitz, Nature, 351: 353-354, 1991). Here, we related those proteins to G protein or PPG protein It is called a pathway participating protein. Examples of such proteins include the GPC receptor For example, receptors for adrenergic drugs and dopamine (Kobilka, B.K. Et al., PNAS, 81: 46-50 (1987); Kobilka, B.K. et al., Science, 238: 650-(: 56 (1987); Bun. zow, J.R., et al., Nature, 336: 783-787 (1988)), G protein itself, effector Proteins such as phospholipase C, adenyl cyclase and phosphodie Sterases, actuator proteins such as protein kinase A and And protein kinase C (Simon et al., Science, 252: 802-8 (1991)).   For example, in one form of signal transduction, an enzyme whose hormone-binding effect is inside a cell Activation of adenylate cyclase. Enzyme activation by hormones is nucleotide GTP also affects hormone binding, depending on the presence of GTP. G protein Binds Lemon Reaptor with adenylate cyclase. G protein When activated by the mon receptor, it can exchange GDP bound to GTP. It is shown. Second, the GTP-retained form binds to activated adenylate cyclase. Combine. The hydrolysis of GTP to GDP catalyzed by the G protein itself is a The protein is returned to its basic inactive form. Thus, the G protein is an effector Clock as an intermediate to relay the signal to the user and to control the duration of the signal As it plays a dual role.   PACAP receptor protein purified from bovine cerebrum is European Patent Application Publication No. 0  618 291 A2, the specification of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Constitute.                                Summary of the Invention   In one aspect of the invention, novel polypeptides and fragments, analogs and derivatives thereof A conductor is provided. The polypeptide of the present invention is of human origin.   In one aspect of the invention, novel mature receptor polypeptides and biologically Fragments, analogs and derivatives thereof are provided that are active and useful in diagnosis or therapy. The receptor polypeptide of the present invention is of human origin.   In another embodiment of the present invention, the present invention encodes the receptor polypeptide of the present invention. Isolated nucleic acid molecules (including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA) and their nucleic acids Thisense analogs and fragments thereof that are biologically active and diagnostic or therapeutic Provided.   In a further embodiment of the present invention, the above-described receptor polypeptide is obtained by recombinant technology. A method for producing a nucleic acid, comprising: a nucleic acid sequence encoding the receptor polypeptide of the present invention. Recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cells containing the sequence can be used to express the polypeptide. After culturing under promoting conditions, a method comprising recovering the polypeptide is proposed. Provided.   As a further aspect of the present invention, an antibody against the receptor polypeptide is provided. Provided.   In another embodiment of the present invention, which binds to the receptor polypeptide of the present invention, Methods for screening for compounds that activate it or inhibit it are provided It is.   As a further aspect of the invention, it binds to and binds to the receptor polypeptide of the invention. Methods for administering a activating compound to a host are provided. This is amnesia, nerve cells Prevention of diseases related to death (eg, Alzheimer's disease) and other secretory dysfunctions And / or useful for treatment.   As a further aspect of the present invention, it binds to the receptor polypeptide of the present invention and its activity. Provided are methods of administering a compound that inhibits sex to a host. This is PACAP secretion Helps prevent and / or treat all conditions and induce pharmacological amnesia.   In another embodiment of the present invention, under-expression of the receptor polypeptide of the present invention Or a condition related to the under-expression of a ligand for the receptor polypeptide of the present invention A receptor polypeptide of the present invention by gene therapy to treat a condition A method is provided for doing so.   In a further aspect of the present invention, a hybrid Provided is a nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule having a length sufficient for redistribution. .   In a further aspect of the present invention, there is provided a method for constructing a nucleic acid sequence encoding the above-described polypeptide. To detect diseases associated with mutations and to solubilize their receptor polypeptides Diagnostic assays are provided for detecting changes in mold levels.   In a further aspect of the present invention, the receptor polypeptide or the polypeptide Petit-encoding polynucleotides for scientific research, DNA synthesis and DNA vectors Provided for use in in vitro applications related to the manufacture of   These and other aspects of the invention should be apparent to those skilled in the art from this specification. is there.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The following drawings illustrate embodiments of the invention and are encompassed by the following claims. It is not intended to limit the scope of the invention.   FIG. 1 shows the cDNA sequence of the G protein-coupled receptor of the present invention and the corresponding deduced amino acids. Represents an array. Amino acids use standard single letter abbreviations. 373 sequencing This was performed using an automatic DNA sequencer (AppliedBiosystems).   FIG. 2 is a diagram showing characteristics of the secondary structure of the present G protein-coupled receptor. Most The first seven figures are the α-helix, β-sheet, turn region or coiled region. The amino acid sequence region. The area surrounded by the frame is the area corresponding to the displayed area It is. The second set shows the amino acid sequence region exposed to the cytoplasm inside the cell. Or a region of the amino acid sequence that penetrates the membrane. The hydrophilicity plot shows the membrane fat Regions of protein sequences that are lipid bilayers and are therefore hydrophobic, and lipid bilayers The region outside the membrane and being hydrophilic is shown. Antigen region is lipid bilayer membrane Can bind to the antibody outside of the ) Is consistent with the hydrophilicity plot. Furthermore, the surface probability plot is an antigenic index And in agreement with the hydrophilicity plot. Amphipathic plots show polar and non-polar tan The region of the protein sequence is shown. The flexible region is the region outside the membrane and the non-flexible region is the transmembrane The flexible region coincides with the second set of figures in the sense that it is a communication region.   FIG. 3 shows the G protein-coupled receptor of the present invention and the rat PACAP-like receptor. Noic acid sequences are represented.                         Detailed description of preferred embodiments   In one embodiment of the present invention, a mature polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. Is based on the cDNA of the clone deposited on April 28, 1995 as ATCC Deposit No. 97132. Isolated nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding a mature encoded polypeptide Mode) is provided.   The polynucleotide of the present invention is expressed in a cDNA library derived from human cerebellar tissue. Was seen. This is structurally related to the G-protein coupled receptor family. You. This is an open reading frame that encodes a 874 amino acid residue protein. Including frames. This protein has an identity of 22.91 with rat PACAP-like receptor. It shows the highest homology of 0% and similarity of 48.607%.   The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA, cDNA, genomic DNA and synthetic DNA. It may be a DNA type such as adult DNA. DNA can be double-stranded or single-stranded, When it is a main strand, it may be a coding strand or a non-coding (antisense) strand. This mature port The coding sequence encoding the repeptide may be the coding sequence shown in FIG. It may be identical to the coding sequence of the loan or the DNA or Encodes the same mature polypeptide as the deposited cDNA above, but with the redundancy of the genetic code or May be coding sequences that differ due to degeneracy.   The mature polypeptide of FIG. 1 or the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA described above. A polynucleotide that encodes a peptide has the coding sequence of the mature polypeptide. Or the coding sequence of the mature polypeptide and leader or secretion Sequence and other additional coding sequences or proprotein sequences, And the coding sequence of the mature polypeptide (optionally with additional coding sequence) A coding sequence (e.g., an intron or 5 'and / or 3 'Side non-coding sequence).   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" A polynucleotide containing only the coding sequence of the polypeptide, and additional coding sequences and And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   Furthermore, the present invention relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. Fragments, analogs and derivatives of the polypeptide encoded by the cDNA of the clone And a variant of the above polynucleotide. This polynucleotide variant The species may be a naturally occurring allelic variant of the above polynucleotide. Non-naturally occurring variants of the above polynucleotides.   Thus, the present invention provides a mature polypeptide identical to the mature polypeptide shown in FIG. Or the same maturation as the mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone A polynucleotide encoding a polypeptide as well as the polypeptide of FIG. 1 or Fragments, derivatives or polypeptides encoded by the cDNA of the deposited clone Include variants of the above polynucleotides that encode analogs. Such nuku Leotide variants include deletion variants, substitution variants and addition or insertion variants. It is.   As described above, the polynucleotide comprises the coding sequence shown in FIG. Has a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of the loan coding sequence You. As is known in the art, an allelic variant is one in which the encoded polypeptide is Substitutions or deletions of one or more nucleotides that do not substantially alter the function of the peptide Alternative polynucleotide sequences that may have loss or addition.   The polynucleotide is a cell of the polypeptide lacking the transmembrane and intracellular portions. A soluble form of the receptor peptide, consisting of an external moiety, may also be encoded.   The present invention also relates to a polypeptide, wherein the coding sequence of the mature polypeptide is A polynucleotide sequence that promotes expression and secretion of a tide (eg, a polypeptide cell In the same reading frame as a leader sequence that functions as a secretory sequence that controls transport from Includes polynucleotides that match. A polypeptide having a leader sequence Protein, whose leader sequence is cleaved by the host cell to It can produce a mature form of the polypeptide. The polynucleotide is 5 ′ to the mature protein It may encode a proprotein with additional amino acid residues. Have a professional array The mature protein is a proprotein and the inactive form of the protein. So Cleavage of the prosequence leaves the active mature protein.   Therefore, the polynucleotide of the present invention comprises a mature protein, a protein having a prosequence. Proteins or proteins with both pro and presequences (leader sequences) Can code.   The polynucleotide of the present invention has a marker sequence for purification of the polypeptide of the present invention. May have the coding sequence fused in frame. Bacterial host If the hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector is a marker sequence As, can be prepared for purification of the mature polypeptide fused to the marker, When a mammalian host such as COS-7 cells is used, for example, hemagglutinin (HA) The label can be a marker sequence. HA label is influenza hemagglutinin Corresponds to a protein-derived epitope (Wilson et al., Cell, 37: 767 (1984)).   The term "gene" refers to a section of DNA involved in the production of a polypeptide chain. , This is the region before and after the coding region (leader and trailer) and the individual Includes intervening sequences (introns) between the various coding segments (exons).   Hybridization of full-length HCEGH45 gene fragment for cDNA library By using as a probe, the full-length gene and the gene Other genes with similar sequence similarity or similar biological activity can be isolated . This type of probe preferably consists of at least 30 bases, for example 50 It may contain more than a base. This probe also corresponds to a full-length transcript CDNA clones, regulatory and promoter regions, exons and intro One or more genomic clones containing the complete HCEGH45 gene Can also be used to identify. In one example of screening, oligonucleotide The use of a known DNA sequence in the synthesis of the probe allows the coding region of that gene Is isolated. Labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention For screening human cDNA, genomic DNA or mRNA libraries using To determine which components of the library the probe will hybridize to. decide.   In addition, the invention relates to at least 70%, preferably at least 90%, more preferably between sequences. Hybridizes to the above sequence, preferably at least 95% identical Related to polynucleotides. In particular, the invention relates to the above-described polynucleotides under stringent conditions. And polynucleotides that hybridize to the polynucleotide. As used herein, "strict The term "conditions" means that there is at least 95%, preferably at least 97%, It means that hybridization occurs only when there is identity. Like As a preferred embodiment, a polynucleotide that hybridizes to the above-described polynucleotide Is the mature plasmid encoded by the cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA described above. A polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the polypeptide. Do.   Further, as described above, the above-mentioned polynucleotide is high in the polynucleotide of the present invention. Hybridize and have identity to the polynucleotide (activity retained , Or may not be retained), at least 20 bases, preferably 30 bases, more preferably Alternatively, it may have at least 50 bases. Such polynucleotides are, for example, For example, a probe for the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 (eg, for recovering the polynucleotide) Used as a lobe, as a diagnostic probe, or as a PCR primer Can be used.   Accordingly, the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. At least 70% identity, preferably at least 90% identity to Preferably a polynucleotide having at least 95% identity and at least Fragments thereof consisting of 30 bases, preferably at least 50 bases, and such Pertains to polypeptides encoded by the oligonucleotides.   The deposit referred to herein relates to the international recognition of the deposit of microorganisms in patent proceedings. Will be maintained under the Budapest Treaty. These deposits are available to those skilled in the art. It is only provided for convenience and requires a deposit based on 35U.S.C Fort 112 I do not admit. The sequence of the polynucleotide contained in the deposit and The amino acid sequence of the polypeptide encoded by In the unlikely event that any inconsistencies arise with the sequence descriptions given here, Become dominant. Permission may be required to manufacture, use or sell the deposit And the present specification does not grant such a license.   Further, the present invention provides a G protein-coupled receptor having the deduced amino acid sequence of FIG. G protein having an amino acid sequence encoded by the polypeptide or the deposited cDNA Protein-coupled receptor polypeptides and fragments of such polypeptides, It relates to analogs and derivatives.   1 or the polypeptide encoded by the deposited cDNA described above. When referring to "fragments," "derivatives" and "analogs" in relation to Substantially the same biological function or activity as the polypeptide (ie, G protein Polypeptide that retains the function as a receptor) or G protein-coupled receptor Ability to bind to its ligand or receptor, even if it does not function as a receptor (Eg, a soluble form of the receptor). Analog Contains an active mature polypeptide that is activated by cleavage of the proprotein part. Includes proprotein that can be produced.   The polypeptides of the present invention include recombinant polypeptides, natural polypeptides and synthetic polypeptides. Any of the polypeptides, preferably a recombinant polypeptide .   Of the polypeptide of FIG. 1 or the polypeptide encoded by the deposited cDNA Fragments, derivatives or analogs are (i) conservative in one or more amino acid residues. Or a non-conservative amino acid residue (preferably a conservative amino acid residue) (Even if the replacement amino acid residue is one encoded by the genetic code) May or may not), and (ii) one or more The amino acid residue may contain a substituent, and (iii) the mature polypeptide Do Is another compound (eg, a compound for increasing the half-life of the polypeptide) Compound (eg, polyethylene glycol)) and (iv) leader Or secretory sequences or sequences or proproteins used to purify the mature polypeptide An additional amino acid, such as a protein sequence, is fused to the mature polypeptide. There may be. Such fragments, derivatives and analogs are, from the description herein, It is believed to be within the skill of those in the art.   The polypeptides and polynucleotides of the present invention may be provided in an isolated form. Preferably, it is preferably purified uniformly.   The term "isolated" refers to the substance that is in its original environment (e.g., Means that it is extracted from its natural environment). For example, natural polynucleotides or polypeptides present in living animals are simply Not separated, but separated from some or all of the coexisting substances in its natural system The polynucleotide or polypeptide has been isolated. Such a polynu The nucleotide is part of a vector and / or such a polynucleotide Even if the otide or polypeptide is part of the composition, such vectors or They are isolated in that the compositions are not part of their natural environment.   The polypeptide of the present invention is a polypeptide of SEQ ID NO: 2 (particularly the mature polypeptide thereof). ) And at least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (preferably Is 70% identity), more preferably at least for the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Also 90% similarity (more preferably 90% identity), even more preferably SEQ ID NO: 2 At least 95% similarity (more preferably 95% identity to Sex) and generally comprises at least 30 amino acids, more Also encompasses portions of the above polypeptides, preferably containing at least 50 amino acids. You.   As is known in the art, the "similarity" between two polypeptides is The amino acid sequence of one polypeptide and its conservative amino acid substitutions are It is determined by comparing with the sequence of the peptide.   A fragment or portion of a polypeptide of the present invention may be a peptide of the corresponding full-length polypeptide. Can be used for production by tide synthesis. That is, these fragments form the full-length polypeptide Can be used as an intermediate for production. A fragment of the polynucleotide of the present invention or Some can be used for the synthesis of full-length polynucleotides of the invention.   The present invention also relates to a vector containing the polynucleotide of the present invention and a vector of the present invention. The production of polypeptides of the invention by genetically engineered host cells and recombinant techniques I do.   The host cell is a vector of the invention (which may be, for example, a cloning vector). And gene manipulation (transduction or traits) Conversion or transfection). Vectors are eg plasmids, viruses Particles, phages, and the like. The engineered host cell is a promoter To activate, select transformants, or amplify the HCEGH45 gene The culture can be performed in a conventional nutrient medium that has been appropriately modified. Culture such as temperature and pH Fermentation conditions are those previously used for the host cell selected for expression. Will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotide of the present invention is used for producing a polypeptide by recombinant technology. Can be used for Thus, for example, the polynucleotide sequence expresses a polypeptide May be included in any of a variety of expression vectors. Such a vector Examples of chromosomal DNA sequences, non-chromosomal DNA sequences and synthetic DNA sequences, such as SV40 Derivatives, bacterial plasmids, phage DNA, baculovirus, yeast plasmid , Vectors derived from combinations of plasmid and phage DNA, viral DNA (eg Vaccinia, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus) No. However, even if other vectors or plasmids are in their host It can be used as long as it is replicable and viable within.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector in various ways. Generally, this technology Insert a DNA sequence into the appropriate restriction endonuclease site using known methods I do. Such methods and others are considered to be within the skill of those in the art.   The DNA sequence in the expression vector may be replaced with an appropriate expression control sequence (promoter) that directs mRNA synthesis. ) Is operatively linked to the Representative of such a promoter Examples include LTR or SV40 promoter, E. coli lac or trp, λ phage PLStep Motor and prokaryotic, eukaryotic or their viruses Other promoters known to control gene expression can be mentioned. You. The expression vector contains a ribosome binding site for translation initiation and a transcription termination site (terminator). ). The vector may also include a sequence suitable for amplifying expression.   In addition, expression vectors provide a phenotypic selection for transformed host cells. Characteristics (eg, dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture) (Eg, tetracycline resistance and ampicillin resistance in Escherichia coli) Preferably, it contains one or more selectable marker genes.   Contains appropriate DNA sequence and appropriate promoter or control sequence as described above By using the resulting vector for transformation of an appropriate host, The protein can be expressed.   Representative examples of suitable hosts include E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, and the like. Which bacterial cells, fungal cells such as yeast, Drosophila melanogaster and Spodoptera ( Spodotera) insect cells such as Sf9, animal cells such as CHO, COS or Bose melanoma, Adenovirus plant cells and the like can be mentioned. Selection of an appropriate host Given the teachings of the specification, it is believed to be within the skill of those in the art.   More specifically, the present invention relates to a recombinant comprising one or more of the sequences outlined above. Constructs. These constructs are inserted with the sequence of the invention forward or backward. Includes inserted vectors (such as plasmids and viral vectors). This aspect In a preferred aspect, the construct is further operatively acting on the sequence. It also contains linked regulatory sequences, such as a promoter. Suitable vector Many promoters are known to those skilled in the art and are commercially available. The following vectors -Is an example. For bacteria: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, Phag escript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A ( Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) ). For eukaryotic cells: pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3 , PBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). However, other plasmids or vectors Can be used as long as it is replicable and viable in its host.   The promoter region is a CAT (chloramphenicol transferase) vector Or any other vector with a selectable marker to select from any desired gene. You can choose. Suitable vectors are PKK232-8 and PCM7. Especially famous bacterial promoter -LacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR, PLAnd trp. Eukaryotic Motors include immediate early CMV, HSV thymidine kinase, early and late SV40, Torovirus LTR and mouse metallothionein-I. Suitable vector The choice of promoter and promoter is well within the level of ordinary skill in the art.   In a further aspect, the present invention relates to host cells containing the above-described constructs. Book The host cells of the invention may be higher eukaryotic cells, such as mammalian cells, or yeast cells. May be lower eukaryotic cells, such as bacterial cells, or prokaryotic cells, such as bacterial cells. Is also good. Introduction of the above constructs into the host cells can be accomplished by calcium phosphate transfection. Transfection or electroporation with DEAE-dextran (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, -York Elsevier (1986)).   Conventional use of the construct in the host cell allows the recombinant sequence to be used. Can be produced. Alternatively, the polypeptide of the invention It can also be produced synthetically on a conventional peptide synthesizer.   The mature protein may be derived from mammalian cells, yeast, bacteria, Can be expressed in other cells. Using RNA obtained from the DNA construct of the present invention Cell-free translation systems can also be used to produce the above proteins. original Cloning and expression vectors suitable for use in nuclear and eukaryotic hosts are , Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, New York Cold Spring Harbor, USA (1989)) A part of the specification of the present application.   Transcription of a DNA encoding the polypeptide of the present invention by higher eukaryotes is carried out in a vector thereof. It is increased by inserting an enhancer sequence into the gene. Enhancer is Promo Cis-acting sequence of DNA, usually 10-300 bp, that acts on You. SV40 enhancer, cytomegaloyl at the late 100-270 bp of the replication origin Early promoter enhancer, a polio on the late side of the replication origin Maenhancers and adenovirus enhancers are examples.   In general, recombinant expression vectors provide an origin of replication, which allows for transformation of their host cells. Selectable markers (such as the ampicillin resistance gene of Escherichia coli and Saccharomyces (S. cerevisiae TRP1 gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences Would include a promoter. Such promoters are, inter alia, 3-phospho Glycolytic enzymes such as glycerate kinase (PGK), α-factor, acid phosphatase Or an operon encoding a heat shock protein. Different Species structural sequences include translation initiation and termination sequences and, preferably, A leader sequence capable of directing secretion into the periplasmic or extracellular medium; Assembled in phase. Optionally, the heterologous sequence can be used to stabilize or simplify expressed recombinant products. N-terminal identification peptide (identificati on peptide).   An expression vector useful for bacteria is a structural DNA encoding a desired protein. A functional promoter with the appropriate translation initiation and termination signals By inserting in a reading phase that can function functionally Is constructed. The vector guarantees the maintenance of the vector and, if desired, In order to perform amplification in multiple hosts, one or more phenotypic selectable markers may be combined. Will include origin. Suitable prokaryotic hosts for transformation include E. coli, Bacillus subtilis, and murine Salmonella typhi and Pseudomonas sp., Streptomyces sp. And Staphyloco Various species of the genus Caucus are included. However, other hosts can be used as options.   A well-known cloning vector is a typical example of an expression vector useful for bacteria. -A selection marker derived from a commercially available plasmid containing the gene sequence of pBR322 (ATCC37017). And those containing bacterial origins of replication (but not limited to Not only). Such commercially available vectors include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fi ne Chemicals, Uppsala, Sweden and GEM1 (PromegaBiotec., USA) Madison, WI). These pBR322 "skeleton" parts are appropriate Combined with a suitable promoter and the structural sequence to be expressed.   After transforming an appropriate host strain and growing the host strain to an appropriate cell density, Induce selected promoter by appropriate means (eg temperature change or chemical induction) And the cells are further cultured.   Typically, the cells are collected by centrifugation and by physical or chemical means Break up and reserve the resulting crude extract for further purification.   Microbial cells used for protein expression are freeze-thaw cycles, sonication, Can be disrupted by any convenient method, such as mechanical disruption or use of cell lysing agents You.   Various mammalian cell culture systems can also be used to express recombinant proteins . Examples of mammalian expression systems include monkey kidney fibers described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). Blast cell line COS-7 and other cell lines that can express compatible vectors ( For example, C127, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines). Mammalian expression vector The vector contains an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, and Ribosome binding site, polyadenylation site, splice donor site, sp It will also include a rice acceptor site, transcription termination sequence and 5 'flanking non-transcribed sequence. necessary DNA sequences obtained by SV40 splicing to provide non-transcribed genetic elements And polyadenylation sites can be used.   G protein-coupled receptor polypeptides include, for example, ammonium sulfate or Ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, e Sufocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Chromatography, hydroxyapatite chromatography and From recombinant cell culture, use methods such as lectin chromatography. It can be collected and purified. When necessary, complete the structure of the mature protein You can use a quality regeneration stage. Finally, high performance liquid chromatography as the final purification step Raffy (HPLC) can be used.   The polypeptide of the present invention may be a natural purified product or a product of a chemical synthesis method. And prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, cultured Bacteria, yeast, higher plant cells, insect cells and mammalian cells) It may be produced. The present invention depends on the host used in the recombinant production method. Lipids can be glycosylated or not glycosylated is there. The polypeptide of the present invention may include an initial methionine amino acid residue.   The polynucleotides and polypeptides of the present invention provide therapeutic and diagnostic methods for human disease. Can be used as research reagents and materials for discovery.   The G protein-coupled receptor of the present invention comprises an antagonist of the receptor and It can be used in methods of screening for agonists.   In general, such screening methods are suitable for expressing the receptor on the surface. It is necessary to prepare appropriate cells. Specifically, a poly-protein encoding the receptor of the present invention Transfecting the cells using the nucleotides, thereby transforming the G protein Express the coupled receptor. Such transfection is as described above. It can be done in any way.   In one such screening method, the present G protein-coupled receptor Using a transfected melanophore. Like that Novel screening techniques are described in PCT WO92 / 01810 (published February 6, 1992). You.   Thus, for example, such an assay would encode a G protein-coupled receptor. Try to screen receptor melanophore cells for receptor ligands Receptor antagonist by contacting it with both Can be used for Inhibition of the signal generated by that ligand That the compound is a candidate antagonist for its receptor, ie, its compound Indicate that the substance inhibits receptor activation.   This screening involves contacting the compounds to be screened for the cells described above. To determine whether the compound produces a signal, i.e., To determine agonists by determining whether to activate the putter Can be used for   Other screening techniques include, for example, Science, 246: 181-296 (October 1989). Measure changes in extracellular pH caused by receptor activation as described Cells that express G protein-coupled receptors in a system that CHO cells). For example, agonist candidate or antagoni Contacting the candidate with a cell that expresses a G protein-coupled receptor; By measuring two messenger reactions (eg, signal transduction or pH changes) To determine whether the candidate agonist or antagonist is effective Can.   Another such screening technique involves a G protein-coupled receptor. RNA encoding Xenopus is introduced into Xenopus oocytes and its receptor It is expressed temporarily. In the case of antagonist screening, Receptor oocytes and compounds to be screened for Contact is made and then inhibition of the calcium signal is detected.   In another screening technique, the receptor is phospholipase C or The G protein-coupled receptor is expressed in association with D. Such cells Typical examples include endothelial cells, smooth muscle cells, embryonic kidney cells and the like. You. Screening for an antagonist or agonist depends on its receptor activity Of protein activation or its receptor activation is detected from the phospholipase second signal This can be done as described above.   Another approach is to use ligands for cells that have their receptors on the surface. Antagonists are screened by measuring inhibition of binding. this In such methods, eukaryotic cells express a G protein-coupled receptor on their surface. Cells transfected with the DNA encoding the receptor The cell is contacted with a candidate antagonist in the presence of a known ligand. Ligand Can be labeled, for example, by radioactivity. Labeled ligand bound to the receptor Is measured, for example, by measuring the radioactivity of the receptor. . Judging from the decrease in the amount of labeled ligand bound to the receptor, If the candidate binds to the receptor, a labeled ligand to the receptor Is inhibited.   The present invention also relates to Riga which is not known to be capable of binding to G protein-coupled receptors. A method for determining whether a protein can bind to its receptor, comprising: A mammalian cell that expresses a protein-coupled receptor is expressed by a G protein-coupled receptor. Contact with the ligand under conditions that allow binding of the ligand to the receptor. By detecting the presence of a ligand that binds to the G A method consisting of determining whether it binds to a protein-coupled receptor Offer. The above-described system for determining agonists and / or antagonists , Can be used to determine the ligand that binds to its receptor.   In general, G protein-coupled receptors determined by screening methods Antagonists can be used for a variety of therapeutic purposes. For example such an antagonist Is hypertension, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, mental illness, depression, one head It is used to treat pain, vomiting and benign prostatic hyperplasia.   G protein-coupled receptor agonists are also used in asthma, Parkinson's disease, acute heart failure It is used for therapeutic purposes as a remedy for all, hypotension, urinary retention and osteoporosis.   Candidate antagonists bind to G protein-coupled receptors, G protein-coupled receptor activity interferes with no triggering of ginger response Antibodies or, optionally, oligonucleotides.   As candidate antagonists, G protein-coupled A G-protein coupled receptor that does not elicit any response when bound to a sceptor Also include proteins closely related to Gand (ie fragments of its ligand). You.   Antagonist candidates also include antisense prepared using antisense technology. Also includes constructs. Antisense technology uses triple helix formation or It can be used to control gene expression with chisense DNA or antisense RNA. Both of these methods are based on polynucleotide binding to DNA or RNA . For example, the 5 'code of the polynucleotide sequence encoding the mature polypeptide of the invention Use parts to design antisense RNA oligonucleotides about 10-40 base pairs in length You. DNA oligonucleotides become complementary to gene regions involved in transcription As designed (triple helix-Lee et al., Nud. Acids. Res., 6: 3073 (1979); Cooney Et al., Science, 241: 456 (1988); see Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991). ), Transcription and production of G protein-coupled receptors are hindered. Antisense RNA The oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and the G-tag of the mRNA molecule. Block translation into protein-coupled receptors (antisense-Okano, J. Neuroch em., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression Oligodeoxynucleotides as harmful agents), CRCPress, Boca Rato, Florida (1988)). Antisense RNA or antisense DNA is expressed in vivo The above oligonucleotides to cells so that they can inhibit polypeptide production It can also be delivered.   Another candidate antagonist binds to a G protein-coupled receptor Prevents normal biological activity by making it inaccessible to ligands It is a small molecule. Examples of small molecules include small peptides or small peptide-like molecules. But not limited to these.   Candidate antagonists include ligands that bind to a membrane and that membrane bound G protein Soluble G-protein coupled receptor that prevents interaction with protein-coupled receptors (Eg, a fragment of the receptor).   The G protein-coupled receptor of the present invention is a PACAP-like receptor or secretin receptor. It was putatively identified as a scepter. This identification is based on the results of amino acid sequence homology. It was done.   These antagonists can treat hypersecretory conditions and induce pharmacological amnesia or Can be used to achieve long-term memory. These antagonists are described, for example, below. May be used as a composition with a pharmaceutically acceptable carrier.   An agonist identified by the screening method described above is Treatment, improving memory, treating amnesia and preventing and preventing diseases such as Alzheimer's disease. And / or to prevent neuronal cell death in treating neurosis.   These antagonists or agonists may be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Can be used. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide and a pharmaceutically acceptable carrier. Contains body or excipients. Such carriers include saline, buffered saline, Examples include: sucrose, water, glycerol, ethanol and combinations thereof. (But not limited to). The formulation is compatible with the method of administration Should be.   The present invention relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Also provides a pharmaceutical pack or kit comprising more containers. Like that Containers that require government agencies to regulate the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biologicals. The production, use or sale of human administration in a prescribed form Information reflecting the authorization can be added. The polypeptide of the present invention, agonis And antagonists may be used in combination with other therapeutic compounds.   These pharmaceutical compositions can be topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal. Administration can be by any convenient means, such as by route. These pharmaceutical compositions are useful for the treatment of specific indications. And / or administered in a prophylactically effective amount. Generally at least about 10μg / kg body Given in heavy doses, most often not more than about 8 mg / kg body weight / day right. In most cases, the dosage should be about 10 μg / kg to about 1 mg / kg body weight.   The present invention also examines the expression of the HCEGH45 receptor polypeptide of the present invention on the cell surface. A method of obtaining the total mRNA from the cell, and obtaining the mRNA thus obtained, Specifically hybridizes to a sequence contained within the sequence of the nucleic acid molecule encoding the receptor Nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of at least 10 nucleotides that can be redistributed And hybridized to the probe under hybridization conditions. Detection of the mRNA by detecting the presence of the mRNA. Provide a way out.   The present invention also identifies a receptor associated with the receptor polypeptide of the present invention. Provide a way. These related receptors are the HCEGH45 receptor polypeptides of the present invention. By low homology or low stringency cross-hybridization Interaction with related or related natural or synthetic ligands Or the genetic or pharmacological properties of the neuropeptide receptor polypeptides of the invention. Can be identified by identifying receptors that elicit similar behavior after blockade .   HCEGH45 receptor polypeptides and polypeptide antagonists Or agonists are required for these polymorphs in vivo, often referred to as "gene therapy". Depending on the expression of the peptide, it may be used according to the invention.   Thus, for example, a cell obtained from a patient may be a polynucleotide encoding a polypeptide. Manipulate ex vivo with tide (DNA or RNA) and treat with that polypeptide The engineered cells may be provided to the patient to be tried. Such methods are known in the art. Well known in the field. For example, containing RNA encoding the polypeptide of the present invention. Use retrovirus particles to manipulate cells in a manner known in the art Can.   In addition, in order to express the polypeptide in vivo, for example, it is known in the art. Cells may be manipulated in vivo by known techniques. Manipulate cells in vivo To express a polypeptide in vivo, as is known in the art, Producing a retroviral particle containing RNA encoding the polypeptide of the present invention. Production cells may be administered to the patient. The polypeptide of the present invention by such a method These and other modes of administration of peptides are apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. It should be. For example, an expression vehicle for manipulating cells is a retroviral particle Manipulate cells in vivo in combination with something other than the offspring, e.g., a suitable delivery vehicle. It may be an adenovirus that can be used for production.   Retrovirus that can be a starting material for the aforementioned retroviral plasmid vector Moloney murine leukemia virus, spleen necrosis virus, Rous sarcoma virus Ils, Harvey sarcoma virus, avian leukemia virus, gibbon leukemia Virus, retroviruses such as human immunodeficiency virus, adenovirus, spinal cord increase Sarcoma virus and breast cancer virus, including but not limited to No. In one embodiment, the retroviral plasmid vector is Moloney murine leukemia c. Derived from Irus.   The vector contains one or more promoters. Suitable professionals that can be used Motors include retrovirus LTR, SV40 promoter, Miller et al.Biotechni ques, Vol. 7, No. 9, 980.990 (1989), the human cytomegalovirus (CMV) Promoter or any other promoter (eg, a cellular promoter such as His Ton promoter, polIII promoter, β-actin promoter, etc. However, the present invention is not limited to these. Do not mean. Other viral promoters that may be used include adenovirus promoters. Motor, thymidine kinase (TK) promoter, B19 parvovirus promoter But not limited to these. Suitable promoter The choice of key will be apparent to those skilled in the art from the description herein.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. You. Suitable promoters that can be used include adenovirus major late promoters. Adenovirus promoters such as motors, cytomegalovirus (CMV) promoters Heterologous promoters, such as promoters, respiratory syncytial virus (RSV) promoters ー, inducible promoters such as MMT promoter and metallothionein promoter ー, heat shock promoter, albumin promoter, ApoAI promoter, Human globin promoter, herpes simplex thymidine kinase promoter, etc. Viral thymidine kinase promoter, retroviral LTR (modified Virus LTR), β-actin promoter, human growth hormone Motors include, but are not limited to. The promoter is the present invention. It may be a natural promoter that controls the gene encoding the repeptide.   Use the retroviral plasmid vector to create a production cell line To transduce the packaging cells. Transfectable packaging Examples of cells include Miller,Human Gene Therapy,Vol.1, 5-14 pages (1990) (this publication The entire contents of the exhibit are incorporated herein by reference, DAN, PE501 , PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17.H2, ψCRE, ψCRIP, GP: + E-8 6 and GP + envAm12 cell lines, but are not limited to. Vector Can transduce the packaging cells by any means known in the art. You. Such means include electroporation, the use of liposomes and CaPOFourPrecipitation methods include, but are not limited to. Another way and The retroviral plasmid vector in liposomes or After the pulling, it may be administered to the host.   The production cell line is an infectious retrovirus containing a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention. Generate ills vector particles. Such retroviral vector particles are It can be used for transducing eukaryotic cells in vitro or in vivo. Transduced eukaryotic cells Will express a nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Will be transduced Eukaryotic cells include embryonic stem cells, embryonic carcinoma cells and hematopoietic stem cells, hepatocytes, fibers Blast cells, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, bronchial epithelial cells, and the like, However, it is not limited to these.   Genetic diagnosis of some diseases in which the gene of the present invention is caused by, for example, a birth defect gene It is also conceivable to use it as a drug. These genes are the sequences of the defective genes Can be detected by comparing with the normal gene sequence. Next, "mutant" It can be ascertained that a gene is associated with abnormal receptor activity. Again As one means, insert the mutant receptor gene into an appropriate vector, Functional assay systems (eg colorimetric assay in receptor-deficient strains of HEK293 cells, McCo Confirmation of mutation by expression in nkey plate, complementation experiment) Or can be identified. Once the "mutant" gene is identified, the "mutant" The population can be screened for carriers of the receptor gene.   Individuals carrying mutations in the gene of the present invention can be detected at the DNA level using various techniques Can. Nucleic acids used for diagnosis include blood, urine, saliva, tissue biopsy and autopsy materials. Can be obtained from the cells of such patients. Genomic DNA may be used directly for detection Alternatively, it may be enzymatically amplified by PCR prior to analysis (Saiki et al., Utre, 324: 163-16 6,1986). RNA and cDNA can be used for the same purpose. As an example, in the gene of the present invention, To identify and analyze mutations, use PCR primers complementary to the nucleic acids of the invention. Can be used. For example, deletions and insertions change the size of the amplified product compared to the normal genotype Can be detected by The point mutation is a radiolabeled RNA sequence of the present invention or a radiolabel. The amplified DNA is hybridized with the antisense DNA sequence of the present invention. Can be identified. Perfectly matched sequences may be due to RNase A digestion or differences in melting temperatures. Therefore, it can be distinguished from a double-stranded molecule having a mismatch. Such diagnostics are prenatal It may be particularly useful for testing and even for newborns.   Sequence differences between reference genes and "mutants" revealed by direct DNA sequencing Can be. In addition, a specific DNA fragment is detected using the cloned DNA fragment as a probe. You can also. The sensitivity of this method is significantly improved when combined with PCR. For example Double-stranded PCR product or single-stranded generated by modified PCR method for sequencing primers Use with template molecules. Sequencing uses radiolabeled nucleotides This can be done by conventional methods or by automated sequencing using fluorescent labels.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with (or without) denaturants By detecting a change in the electrophoretic mobility of the DNA fragment in the sample. Special Sequence changes at fixed positions can be performed by chemical cleavage or nucleases such as RNase and S1 protection. Protective assays can also be demonstrated (eg, Cotton et al., PNAS, USA, 86: 43974101). , 1985).   Also, some diseases result in alterations in gene expression that can be detected by alterations in mRNA. Fruit or is characterized by such a change. Based on the gene of the present invention Use to identify individuals exhibiting this type of reduced receptor-related function You can also.   The present invention also relates to the possibility of using the HCEGH45 receptor polypeptide of the present invention in various tissues. The present invention relates to a diagnostic assay for detecting a change in the level of a soluble form. In the sample obtained from the host Assays that can be used to detect levels of soluble receptor polypeptides Radioimmunoassays, competitive binding assays, Wester Blot analysis, and preferably ELISA method.   In the ELISA method, first, an antibody (preferably monoclonal antibody) specific to the antigen of the HCEGH45 receptor is used. (Ronal antibody). Reporter for the monoclonal antibody Prepare antibodies. Reporter antibodies include detectable reagents (such as radioactivity or fluorescence). In this example, horseradish peroxidase enzyme is conjugated. Next, sample from host And a solid support (eg, polystyrene) that binds the proteins in the sample. On a plate). Next, non-specific proteins (such as bovine serum albumin) Incubation with free protein binding sites on the dish Cover all. The monoclonal antibody is then incubated in the dish. During this time, the monoclonal antibody was conjugated to the HCEGH45 receptor Binds to all of the proteins. Wash all unbound monoclonal antibodies with buffer Flush away. Next, a reporter antibody bound to horseradish peroxidase was All monoclonal antibodies bound to the HCEGH45 receptor protein The reporter antibody is allowed to bind to the body. Next, wash away unbound reporter antibody . Next, a peroxidase substrate is added to the dish and the amount of color developed during a given period is determined. Compared to the standard curve, present in a given volume of patient sample It is a measure of the amount of HCEGH45 receptor protein.   The sequences of the present invention are also useful for chromosome identification. This sequence is located on individual human chromosomes It is specifically targeted to a specific location and can hybridize to it. further Identifying specific sites on a chromosome is also currently needed. Present Actual sequence data (repeated polymorphisms) currently available for marking chromosomal locations There are few chromosome marking reagents based on (repeat pclymorphism's)). The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention allows those sequences to be linked to disease-related artifacts. This is an important first step in correlating with a gene.   Briefly, the sequence consists of a PCR primer (preferably 15-25 bp) By preparing it, it can be mapped on the chromosome. More than one d in genomic DNA Primers that do not complicate the amplification process by spanning For quick selection, use computer analysis of the cDNA. Then individual humans Primers for PCR screening of somatic cell hybrids containing chromosomes Use Only the hybrid containing the human gene corresponding to the primer Will give an amplified fragment.   PCR mapping of somatic hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes It is a quick method. Using the present invention with the same oligonucleotide primers In the same way, a panel of fragments or large fragments from a particular chromosome Sublocalization can be performed on a pool of genomic clones. Wear. Another mapping method that can also be used for chromosomal mapping is in s To construct itu hybridization and chromosome-specific cDNA library Selection and labeled flow sorting by hybridization of -sorted) Preliminary screening using chromosomes.   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomes (FIS Using H), a precise chromosomal location can be obtained in one step. This technology is about 50 or 60 It can also be used for short-duration cDNAs. For an overview of this technology, see Verma et al., Human Chromium. osomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988 Please refer to).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on the chromosome Location can be correlated with genetic map data. Such data is, for example, McKu sick, Mendelian Inheritance in Man, Jones Hopkins University Welch Me (Available online from Dical Library). Then the same Linkage analysis of disease-gene relationships mapped to chromosomal regions Co-inheritance of genes).   Next, differences in the cDNA or genomic sequence between patients and non-patients need to be determined. You. Certain mutations are observed in some or all patients and in normal individuals. If not, the mutation may be the causative agent of the disease.   With the current resolution of physical mapping technology and gene mapping technology, the disease CDNAs whose locations are accurately identified in chromosomal regions associated with One of the candidate genes (mapping resolution of 1 megabase, 20kb) 1 gene).   The present polypeptides, their fragments or other derivatives, their analogs or them Can be used as an immunogen to produce antibodies against them. Wear. These antibodies can be, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. You. The present invention relates to chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies and Fab fragments or Fab expression Also includes the products of the library. Techniques for producing such antibodies and fragments are known in the art. Various methods known in the art can be used.   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention will give animals that polypeptide. The peptide may be injected directly or the animal (preferably a non-human animal) may be injected with the polypeptide. It can be obtained by administering tide. The antibody thus obtained is Will bind to the polypeptide itself. In this way, the complete native polypeptide is linked. Also use sequences encoding only fragments of that peptide to generate matching antibodies it can. Such antibodies can be used to express the polypeptide from tissues that express the polypeptide. Can be used to isolate tide.   Monoclonal antibody production requires antibodies produced by continuous cell line culture. Any technique that gives you can be used. An example is the hybridoma technology (Kohler And Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975), trioma technology, human B Cell hybridoma technology (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72,1983) and EBV hybridoma technology for the production of human and human monoclonal antibodies (Cole et al., M onoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77-96 (1985)) No.   The technology described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) is It can be adapted for the production of single chain antibodies against the epidemiological polypeptide product. In addition, the transgenic mouse was used to test the immunogenic polypeptide product of the present invention. Humanized antibodies can also be expressed.   The invention is further described with reference to the following examples. However, the present invention does not It should be understood that the invention is not limited to the examples. Unless otherwise specified, all percentages and amounts are Based on weight.                                  Example   Frequently used methods and / or terms to facilitate understanding of the following examples Some are explained.   "Plasmids" are designated by a lower case p and upper and lower case letters and / or numbers. You. Whether the starting plasmids here are commercially available or publicly available without restriction, Alternatively, it can be constructed from available plasmids according to published methods. Also this skill Plasmids equivalent to the plasmids described here are known in the art. Will be apparent to those skilled in the art.   "Digestion" of DNA refers to the digestion of DNA by a restriction enzyme that acts only at specific sequences in that DNA. Refers to catalytic cleavage. The various restriction enzymes used here are commercially available and their Use reaction conditions, cofactors, and other requirements as would be known to one of skill in the art. Used. For analysis, usually 1 μg of plasmid or DNA fragment is co- In about 20 μl of buffer solution. A place to isolate DNA fragments for plasmid construction In general, digest 5-50 μg of DNA with 20-250 units of enzyme in a larger volume You. Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes are specified by the manufacturer. Through Usually an incubation time of about 1 hour at 37 ° C is used, but this is It can vary as indicated. After digestion, the reaction solution is directly charged on a polyacrylamide gel. The desired fragment is isolated by electrophoresis.   Size separation of the cut fragments is described by Goeddel et al., Nudeic Acids Res., 8: 4057 (1980). Performed using the 8% polyacrylamide gel described in the above.   "Oligonucleotide" is a single-stranded polydeoxynucleotide that can be chemically synthesized. Means a tide or two complementary polydeoxynucleotide chains. Such a case Since synthetic oligonucleotides do not have a 5 'phosphate group, ATP can be used in the presence of a kinase. Without a phosphate group, it would not ligate to another oligonucleotide U. The synthetic oligonucleotide will ligate to a fragment that has not been dephosphorylated.   "Ligation" is a phosphodiester between two double-stranded nucleic acid fragments. This refers to the process of forming a bond (Maniatis et al., Supra, p. 146). Unless otherwise noted For ligation, use known buffers and conditions, and cut approximately equimolar amounts of DNA to be ligated. This can be done with 10 units of T4 DNA ligase (“ligase”) per 0.5 μg piece.   Unless otherwise stated, transformation was performed by Graham and Van der Eb, Virology, 52: 456-. 457 (1973).                                   Example 1                     Expression of recombinant HCEGH45 in COS-7 cells   The expression plasmid HCEGH45-HA is composed of 1) SV40 replication origin, 2) ampicillin resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) CMV promoter followed by a polylinker region, SV40 The vector pcDNAI / Amp (Invitrog containing intron and polyadenylation sites) en company). In-frame fusion to all HCEGH45 precursors and their 3 'ends The DNA fragment encoding the isolated HA label is cloned into the polylinker region of the above vector. I did it. Therefore, the expression of the recombinant protein is controlled by the CMV promoter Is done. HA labeling is applied to influenza hemagglutinin protein as described above. Corresponding to the epitope of interest (Wilson et al., Cell, 37: 767, 1984). We are the target By fusing an HA tag to a protein to be The body will be able to easily detect the recombinant protein.   The plasmid construction method is as follows.   The DNA sequence encoding HCEGH45 (ATCC No.97132) was Constructed and cloned by PCR used. 5 'primer GGCTTCCTCGAATCCCGTC ATGAACTCC (SEQ ID NO: 4) is an EcoRI site and Followed by 9 nucleotides starting from the start codon of the HCEGH45 coding sequence . The 3 'sequence GGGTTCTCGAGCGGGCACTGCTCACAGAGGAGACG (SEQ ID NO: 5) has an XhoI site, Stop codon, HA tag and the last 11 nucleotides of the HCEGH45 coding sequence (stop codon (Comprising no sequence). Therefore, the PCR product is EcoRI site , HCEGH45 coding sequence, translation termination stop codon, and Xhol site. That PCR The amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp were digested with EcoRI and XhoI restriction enzymes and ligated. . The ligation mixture was used for the E. coli SURE strain (Stratagene Cloning Systems (92037 potassium). (Available from 11099) on North Tree Pine Road, La Jolla, California After transformation, culture the transformed culture on an ampicillin medium plate to I chose Ronnie. Plasmid DNA is isolated from transformants and analyzed by restriction analysis. The presence of the correct fragment was checked. DEAE-dextra to express recombinant HCEGH45 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spr. Transforming the above expression vector into COS-7 cells by Transfected. HCEGH45-HA protein expression is determined by radiolabeling and immunoprecipitation (Harlow and Larle, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La boratory Press (1988)). Two days after transfection Cells35Labeled with S-cysteine for 8 hours. Next, collect the culture medium and make the cells surfactant Agent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tr is, pH 7.5) (Wilson et al., supra, 37: 767 (1984)). Cell lysate and culture Both media were precipitated with HA-specific monoclonal antibodies. 15 precipitated proteins Analyzed on% SDS-PAGE gel.                                   Example 2        Cloning and expression of HCEGH45 using baculovirus expression system   The DNA sequence encoding the full-length HCEGH45 protein (ATCC No. 97132) was Amplification using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the offspring did.   The 5 'primer is GTGCGTCCCGGGTTCCTCAGACCGCCATCATGWith AACTCC (SEQ ID NO: 6) Contains the SmaI restriction enzyme site (in bold), followed by a eukaryotic cell Nucleotides (Kozak, J. Mol. Biol) similar to an efficient translation initiation signal in ., 196: 947-950 (1987)), followed immediately by the first 9 nucleosides of the HCEGH45 gene. Followed by a tide (the translation initiation codon "ATG" is underlined).   The 3 'primer is CGGGTACCAGAGCGGGCACTGCTCACAGAGGAGACG (SEQ ID NO: 7). Column, the cleavage site for the restriction endonuclease Asp718 and the 3 'non-inversion of the HCEGH45 gene. 13 nucleotides complementary to the translation sequence. The amplified sequence is a commercial kit ("Geneclean", BIO 101, La Jolla, CA) using 1% agarose Isolated from sgel. Next, the fragment was digested with the endonucleases Smal and Asp718. After purification, purification was performed as described above. This fragment is called F2.   Baculovirus expression system (Summary and Smith, A Manual of Me thods ForBaculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Ag ricultural Experimental Station Bulletin No.1555 (1987)) For expression of HCEGH45 protein using E. coli, vector pA2 (modified from pVL941 vector) Used later). This expression vector is used for autographer nuclear polyhedrosis disease. Potency of Rus (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) Polyhedrin promoter followed by restriction endonucleases And recognition sites for Asmal and Asp718. Efficient polyadenylation The polyadenylation site of simian virus (SV) 40 is used for this. Recombinant ui For easy selection of virus, the β-galactosidase gene from E. coli was A polyhedrin promoter preceding the polyadenylation signal of the drin gene; Inserted in the same direction. Both ends of the polyhedrin sequence are simultaneously transfected. Flanking viral sequences for cell-mediated homologous recombination of wild-type viral DNA . pAc373, pVL941 and pAcIM1 (Luckow and Summers, Virology , 170: 31-39, 1989). I will.   After digestion of the plasmid with the restriction enzymes Smal and Asp718, bovine intestinal phosphatase Dephosphorylation was performed by using a method known in the art. Then the DNA was isolated from a 1% agarose gel as described above. This vector is called V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated with T4 DNA ligase. Next, E. coli HB1 01 Transform cells and restrict bacteria containing the plasmid (pBac-HCEGH45) Identification was performed using elementary SmaI and Asp718. DNA sequencing of the cloned fragment sequence Confirmed by constant.   Lipofection method (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (198 7)) and replace 5 μg of plasmid pBac-HCEGH45 with a commercially available linearized baculo. Virus ("BaculoGoldTMBaculovirus DNA ", Pharmingen, California (San Diego, Ohio).   1μg BaculoGoldTMBlood-free with viral DNA and 5 μg of plasmid pBac-HCEGH45 Clear Grace's medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 50 Mix in a sterile well of a microtiter plate containing μl. After that, Add 10 μl of Pofectin and 90 μl of Grace's medium, mix and incubate at room temperature for 15 minutes. Was added. Next, 35 mm tissue culture containing 1 ml of serum-free Grace's medium Transfection of Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) inoculated on the plate The mixture was added dropwise. The plate was rocked back and forth to mix the newly added solution. Next The plate was incubated at 27 ° C. for 5 hours. 5 hours later, transfection solution From the plate and add 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal bovine serum. added. The plate was returned to the incubator and the culture was continued at 27 ° C. for 4 days.   Four days later, the supernatant was collected and pulled up as described by Summers and Smith (supra). The assay was performed. As an improvement, "Blue Gal" (Life Technologies, Agarose gel containing (Issersburg) was used. This makes the blue stained Lark can be easily isolated. (A detailed description of the "plaque assay" can be found at Life User's guide for insect published by Technologies GmbH (Gaithersburg) cellculture and baculovirology User's guide) on pages 9-10. )   Four days later, serial dilutions of the virus are added to the cells and the blue stained plaques I picked it up with the tip of a Ndolph pipette. Then the agar containing the recombinant virus The cells were resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. Short centrifuge Remove the agar by separation and use the supernatant containing the recombinant baculovirus To infect Sf9 cells inoculated into 35 mm dishes. After 4 days, collect the supernatant of the culture dishes And stored at 4 ° C.   Sf9 cells were grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Group the cells The cells were infected with the modified baculovirus V-HCEGH45 at a multiplicity of infection (MOI) of 2. 6 hours later Medium was removed and SF900II medium lacking methionine and cysteine (Life Technologi es, Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi35S-methionine and 5 μCi35S-cysteine (Amersham) was added. After culturing the cells for another 16 hours Collect the labeled protein by centrifugation, label the protein with SDS-PAGE and autoradiograph Visualized by Raffy.                                   Example 3                   Expression pattern of HCEGH45 in human tissues   Northern blot analysis to determine the expression level of HCEGH45 in human tissues I do. RNAzolTMB system (Biotecx Laboratories, Hugh, Texas, 77033) Ston, South Loop East 6023) to isolate total cellular RNA samples. Description Approximately 10 μg of total RNA isolated from each human tissue was separated with 1% agarose. Blot (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning , Cold Harbor Press, 1989). The labeling reaction was performed using 50 ng of DNA fragment and Stl-atagene P Perform according to the rime-It kit. The labeled DNA is purified on a Select-G-50 column (5 Prime-3Prime, 5603 Arapaho Road, Boulder, Colorado 80303). Next Filter with 0.5M NaPOFour1,000,000 cpm / ml at 65 ° C in pH 7.4 and 7% SDS Hybridize with the radioactively labeled full-length HCEGH45 gene. 0.5 × SSC / 0.1% S After washing twice at room temperature and twice at 60 ° C using DS, filter the screen using intensifying screen. Are exposed overnight at -70 ° C. HCEGH45 message RNA is abundant in human cerebellar tissue You.                                   Example 4                             Expression by gene therapy   Obtain fibroblasts from the subject by skin biopsy. Transfer the obtained tissue to a tissue culture medium. Put and divide into small pieces. The small tissue mass is placed on the wet surface of a tissue culture flask. Place about 10 pieces in each flask. Turn the flask upside down and seal tightly And leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, the flask is inverted and the tissue mass is While fixed to the bottom of the Lasco, keep fresh media (eg 10% FBS, penicillin and Ham's F12 medium containing streptomycin). Next, incubate this at 37 ° C for about one week. Nourish. At this point, fresh medium is added and subsequently changed every few days. Another two weeks Culture produces a monolayer of fibroblasts. Trypsinize the monolayer to make it larger Transfer to Kina flask.   PMV-7 flanked by Moloney murine sarcoma virus terminal repeats (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)), digested with EcoRI and HindIII, and Treat with Tase. The linear vector is fractionated on an agarose gel, Purify using   CDNA encoding the polypeptide of the present invention has a 5′-terminal sequence and a 3′-terminal sequence, respectively. Amplify using PCR primers corresponding to The 5 'primer contains an EcoRI site And the 3 'primer contains a HindIII site. Moloney murine sarcoma virus linear bone Equally amplified EcoRI-HindIII fragments are mixed in equal amounts in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions suitable for ligation of the two fragments. Its linked mixture After transforming the bacterium HB101 using Plate it on agar containing kanamycin to make sure that .   Amphoteric pA317 or GP + am12 packaging cells were transfected with 10% bovine serum (CS) Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing phosphorus and streptomycin Tissue culture to confluent density. Next, an MSV vector containing the above gene Is added to the medium and the packaging cells are transduced with the vector. Package Gingival cells produce infectious virions containing the above genes (This packaging cell is called the production cell).   After adding fresh medium to the transduced production cells, the confluent production cells Collect the medium from the 10 cm plate. Its spent containing infectious virus particles Through the Millipore filter to remove the detached production cells, and use the medium. To infect fibroblasts. Sub-confluen of fibroblasts t) Remove the medium from the plate and quickly replace with medium from production cells. This Remove the medium and replace with fresh medium. If the virus titer is high, virtually all All fibroblasts will be infected and will not need to be selected. If the titer is very low Need to use a retroviral vector with a selectable marker such as neo or his is there.   Next, the above-described manipulated fibroblasts are used as they are, Grow confluent on rear beads (cytodex 3 microcarrier beads) After that, the host is injected. So that the fibroblasts produce the protein product Has become.   Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above description. The present invention may be practiced within the scope of the appended claims in addition to the specifically described embodiments. You.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ローゼン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム アメリカ合衆国20832メリーランド州 オ ールニ、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 リ，イ アメリカ合衆国94086カリフォルニア州 サニーベイル、レイクサイド・ドライブ 1247番──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 25/28 C07K 14/72 C07K 14/72 16/28 16/28 C12N 1/15 C12N 1/15 1 / 19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 1/68 Z C12Q 1/02 G01N 33/53 1/68 C12N 5/00 B G01N 33 / 53 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, K , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI , GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW ( 72) Inventor Rosen, Craig A. United States 20882 Rolling Hill Road, Raytonsville, MD 22400 No. 72 (72) Inventor Leuven, Stephen M. United States 20832 Herniage Hills Dry, Orni, MD No. 18528 (72) Inventor Li, I 1247 Lakeside Drive, Sunnyvale, California 94086 California

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1. 次に示すポリヌクレオチドからなる群より選択される要素を含む単離され たポリヌクレオチド： （a）図1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 （b）ATCC受託番号97132に含まれるDNAによってコードされる成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド、 （c）（a）または（b）のポリヌクレオチドにハイブリダイズでき、また少なく とも70％同一であるポリヌクレオチド、および （d）（a）または（b）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片。 2. DNAである請求項1のポリヌクレオチド。 3. 図1のヌクレオチド1からヌクレオチド4568までを含む請求項1のポリヌク レオチド。 4. 図1のポリペプチドの可溶型をコードする請求項１のポリヌクレオチド。 5. 請求項2のDNAを含有するベクター。 6. 請求項5のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。 7. 請求項6の宿主細胞から該DNAによってコードされるポリペプチドを発現さ せることからなるポリペプチド生産法。 8. 請求項5のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトすることか らなる、ポリペプチドを発現させる能力を持つ細胞の作出法。 9. 次に示す物質からなる群より選択される要素を含むレセプターポリペプチ ド： （I）図1の推定アミノ酸配列を持つポリペプチドおよびその断片、類似体および 誘導体、ならびに （ii）ATCC受託番号97132のcDNAによってコードされるポリペプチドおよび該ポ リペプチドの断片、類似体または誘導体。 10. 請求項9のポリペプチドに対する抗体。 11. 請求項9のポリペプチドを活性化する化合物。 12. 請求項9のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 13. Gタンパク質レセプターを活性化する必要がある患者の治療法であって、 請求項11の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 14. Gタンパク質レセプターを阻害する必要がある患者の治療法であって、請 求項12の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 15. 該化合物がポリペプチドであり、その化合物の治療有効量が該アゴニス トをコードするDNAをその患者に与えて該アゴニストをin vivoで発現させること によって投与される請求項13の方法。 16. 請求項9のポリペプチドの過少発現に関係する疾患またはその疾患に対す る罹病性を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の突 然変異を決定することからなる方法。 17. ポリペプチドがポリペプチドの可溶性断片であって、レセプターのリガ ンドを結合する能力を持つ請求項9のポリペプチド。 18. 宿主から得た試料中の請求項17のポリペプチドの存在を分析することか らなる診断法。 19. Gタンパク質共役レセプターポリペプチドに結合しそれを活性化する化合 物とGタンパク質共役レセプターポリペプチドに結合しそれを阻害する化合物の 同定法であって、 そのレセプターポリペプチド（このレセプターは該レセプターポリペプチドへ の化合物の結合に反応して検出可能なシグナルを与えることができる第二の成分 を伴うものとする）を表面に発現させる細胞を、ある化合物と、そのレセプター ポリペプチドへのその化合物の結合が許されるような条件下で接触させ、 該第二成分によって生成されるシグナルの存在または不在を検出することによ ってその化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを同定 することからなる方法。 20. 請求項9のポリペプチドの過少発現に関係する疾患またはその疾患に対す る罹病性を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の突 然変異を決定することからなる方法。[Claims]   1. an isolated polynucleotide containing an element selected from the group consisting of the following polynucleotides: Polynucleotide: (A) a polynucleotide encoding the polypeptide of FIG. 1, (B) the mature polypeptide encoded by the DNA contained in ATCC accession number 97132 A polynucleotide encoding (C) hybridizable to the polynucleotide of (a) or (b), and A polynucleotide that is 70% identical to both, and (D) A polynucleotide fragment of the polynucleotide of (a) or (b).   2. The polynucleotide according to claim 1, which is DNA.   3. The polynucleotide of claim 1 comprising nucleotides 1 to 4568 of FIG. Leotide.   4. The polynucleotide of claim 1 which encodes a soluble form of the polypeptide of FIG.   5. A vector containing the DNA of claim 2.   6. A host cell transformed or transfected with the vector of claim 5.   7. Expressing the polypeptide encoded by the DNA from the host cell of claim 6. Producing a polypeptide.   8. Whether the cells are transformed or transfected with the vector of claim 5. A method for producing cells capable of expressing a polypeptide.   9. Receptor polypeptides containing elements selected from the group consisting of: Do: (I) a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 and fragments, analogs and Derivatives, and (Ii) a polypeptide encoded by the cDNA of ATCC Accession No. 97132 and the polypeptide A fragment, analog or derivative of a polypeptide.   10. An antibody against the polypeptide of claim 9.   11. A compound that activates the polypeptide of claim 9.   12. A compound that inhibits activation of the polypeptide of claim 9.   13. A method of treating a patient in need of activating a G protein receptor, 12. A method comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the compound of claim 11.   14. Treatment of patients who need to inhibit the G protein receptor 13. A method comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the compound of claim 12.   15. The compound is a polypeptide, and the therapeutically effective amount of the compound is Giving the patient DNA encoding the antibody to express the agonist in vivo 14. The method of claim 13 administered by:   16. A disease associated with the underexpression of the polypeptide of claim 9 or the disease thereof. A method for diagnosing susceptibility, comprising the steps of: A method comprising determining the mutation.   17. If the polypeptide is a soluble fragment of the polypeptide and the receptor 10. The polypeptide of claim 9, which has the ability to bind to a polypeptide.   18. analyzing the presence of the polypeptide of claim 17 in a sample obtained from the host; Diagnostic method.   19. Compounds that bind to and activate G protein-coupled receptor polypeptides Compounds that bind to and inhibit G-protein coupled receptor polypeptides An identification method,   The receptor polypeptide (this receptor is A second component capable of providing a detectable signal in response to the binding of the compound of With a compound and its receptor Contacting under conditions that permit binding of the compound to the polypeptide;   Detecting the presence or absence of the signal generated by the second component. To determine if the compound is an effective agonist or antagonist The method that consists of doing.   20. A disease associated with the underexpression of the polypeptide of claim 9 or the disease. A method for diagnosing susceptibility, comprising the steps of: A method comprising determining the mutation.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0618291A3 (en) * 1993-02-26 1997-12-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
EP0871667A4 (en) * 1994-11-18 1999-05-12 Human Genome Sciences Inc G-protein coupled receptor
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