JP2001504214A

JP2001504214A - 化合物混合物の吸収、分布、代謝、排出（ａｄｍｅ）および薬物動態学的特性を分析するための方法

Info

Publication number: JP2001504214A
Application number: JP51199998A
Authority: JP
Inventors: エム．ディーツ，コリヌ; エイ．ギボンズ，ジャクリーン; ダブリュー．テイラー，エリック
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1996-08-29
Filing date: 1997-08-28
Publication date: 2001-03-27
Also published as: AU4330997A; EP0923733A1; WO1998009166A1; US5989918A

Abstract

(57)【要約】化合物のADME/PK特性を分析するための方法は、(1)動物または器官にペルフルオロカーボンエマルジョン代用血液で灌流すること、(2)試験化合物の混合物を投与すること、(3)灌流物のアリコートを採取すること、(4)エマルジョンを破壊すること、および(5)試験化合物の濃度について灌流物の水相を分析することである。

Description

【発明の詳細な説明】化合物混合物の吸収、分布、代謝、排出（ADME）および薬物動態学的特性を分析するための方法発明の分野本発明は、薬物動熊学および薬理学的調査の分野に関する。より詳細には、本発明は、動物における化学的混合物のADME/PK（吸収、分布、代謝、排出、および薬物動態学）特性を調べるためのペルフルオロカーボンエマルジョンを用いる概念、ならびに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、質量分析、およびキャピラリー電気泳動のような技術による直接分析のためのエマルジョンを調製するための方法を記載する。発明の背景薬物の開発は、所望の生物学的効果を示す化合物の能力（例えば、細菌の増殖を阻害する能力、標的酵素の活性を阻害する能力、神経伝達物質の取り込みを増加または調節する能力など）に基づく、リード化合物の同定に始まる。生物学的活性は、代表的には、候補薬物を迅速に同定するように設計されるインビトロでの実験またはアッセイに基づいて決定される。代表的には、試験した化合物のうちの小さな割合しか、さらなる調査に値する十分な活性および選択性を示さない。一旦、候補またはリード化合物が同定され、そしてさらなる開発のために選択されると、そのADME/PK特徴が決定される。ADME/PKは、身体内における薬物の吸収、分布、代謝、排出、および薬物動態学に関する。薬物のADME/PK特性は重要であり、そしてしばしば単なるリード化合物と薬学的産物とを識別するために役立つ。例えば、経口的にはほとんど吸収されない薬物は、有効であるために、静脈内（または他の非経口）投与（これは、処置される条件に受け入れられないかもしれない）を必要とする。抗生物質として有効な化合物は、その分配によりその化合物が神経系に運ばれない場合は、細菌髄膜炎を処置するのに無効であり得る。迅速に代謝されるおよび／または排出される化合物は、その意図される目的を果たすに十分なほど長く身体内に存在しないかもしれない。これらの特性は全て、薬物候補物のインビトロでの活性とは独立しており、そして現在の情報に基づいて予測することは困難または不可能である。ADME/PKに影響を与える複雑な要因は、正確にモデル化することが困難であり、そして化合物が臨床試験に進み得る前に生組織および調査動物の使用を必要とさせる。薬物の発見の速度を向上させ、そして必要とされる動物の数を減らすために、生存動物（すなわち、インビボ）または動物から単離された器官もしくは器官系のいずれかを含む手順において、（単一の化合物でなく）リード化合物の混合物のADME/PKを特徴付けることが望ましい。 ADME/PKのインビボでの分析では、血漿は一般的に、分析終点として用いられる生体相（biophase）である。血漿中の個々の薬物候補物の測定は、代表的には、多数の血漿成分から化合物を分離しそして定量するための、各々の分子の生理化学的特性に基づく独特の抽出方法を含む。化学的混合物の全ての化合物についての１つの血漿抽出方法の最適化は、迅速なスクリーニングのための主要な問題を提起する。発明の要旨本発明者らは、現在、試験動物または組織の血液を、乳化した代用血液で置換し、試験化合物を投与し、そして得られる代用血液を分析することにより、候補化合物のADME/PK分析を改善するための方法を発明した。好ましくは、試験化合物は、試験化合物の混合物として投与される。本発明の別の局面は、ADME/PK特性に基づく薬学的候補物のライブラリーを設計するための方法である。図面の簡単な説明図１は、エマルジョンが破壊される前（「試験サンプル」）または後（「参照サンプル」）にペルフルオロカーボンエマルジョンに添加された化合物の混合物から得られたuv RP-HPLCトレースを示す。図２は、イソプロパノールまたはアセトニトリルを用いるエマルジョンの破壊と比較した、ペルフルオロカーボンエマルジョンに添加された化合物の混合物から得られたuv RP-HPLCトレースを示す。図３は、添加されたタンパク質ありおよびなしで得られた、ペルフルオロカーボンエマルジョンに添加された化合物の混合物から得られたuv RP-HPLCトレースを示す。図４は、灌流を始めて０分後、５分後、および45分後で、単離されたラット胃腸管の一部を通してのペルフルオロカーボンエマルジョンの灌流から得られたRP -HPLCトレースを示す。詳細な説明定義用語「ADME/PK」は、動物、単離された器官、または組織に投与された際の、薬学的化合物または潜在的に薬学的化合物の吸収、分布、代謝、および排泄薬物動態をいう。「動物」は、薬学的調査に有用な全ての動物、好ましくは温血動物、より好ましくはヒトまでおよびヒトを含む哺乳動物を含む。用語「代用血液」は、試験動物の血液を置換するために用いられ得るか、または血液の非存在下で単離された器官を灌流するために用いられ得、そして実験の間の動物、器官、または組織の生命を維持するために十分である流体をいう。本発明の目的のために好ましい代用血液は、評価される薬学的候補物に化学的に類似である化合物をほとんどまたは全く含まない代用血液である。現在好ましい代用血液は、Geyer，Fed Proc（1975）34:1499-1505;Geyer，「Advances in Blood Substitute Research」(Alan R．Liss，Inc.，NY，NY，1983)，157-68頁;Spenc e，Art ．Cell Blood Subs.，and Immob．Biotech.」（1994）22(4):955-963;Spe nce，Art ．Cells，Blood Subs.，and Immob．Biotech.（1995）23(3):367-380; およびDracker，Immunol Invest（1995）24:403-10（これらは全て本明細書中に参考として援用される）により記載されるもののような、フルオロカーボンエマルジョンである。本明細書中で使用される用語「ペルフルオロカーボン」は、炭素原子に結合した全ての水素がフッ素原子で置換されている有機分子をいう。従って、例えば、ペルフルオロエタンは、式Ｆ₃Ｃ−ＣＦ₃を有する。集団的に、これらは、水溶液中での不溶性、低粘度、および水の約２倍の比重により特徴付けられる。液体ペルフルオロカーボンは、溶解濃度はヘンリーの法則に従って分圧に正比例して、単純溶液中にかなりの量の酸素および二酸化炭素（および他の非極性気体）を溶解する。ペルフルオロカーボン化合物は、一般に、熱安定性であり、そして高い炭素−フッ素結合エネルギーに起因して生化学的に不活性である。フッ素の疎水性の性質は、フッ素が酵素的攻撃を受け付けないようにする。ペルフルオロカーボンは、界面活性剤（detergent）または界面活性剤（surfactant）の存在下での超音波処理により化合物を小さな粒子（代表的には直径0.1〜0.3ミクロン）の中に乳化させることによりインビボで用いられる。ペルフルオロカーボンは、これらが代用血液として受容可能にする場合には、本発明の実施に適切である。例示的なペルフルオロカーボンは、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロトリプロピルアミン、ビス(ペルフルオロブチル)エチレン、ペルフルオロ-N,N-ジメチルシクロヘキシルメチルアミン、ペルフルオロトリメチルビシクロ(3.3.1)ノナン、ペルフルオロビシクロ(5.3.0)デカン、およびペルフルオロブチルテトラヒドロフランを含むがこれらに限定されない。用語「界面活性剤」は、「表面が活性な」薬剤、この場合、水性懸濁液中のペルフルオロカーボン化合物を乳化するために有用な薬剤をいう。好ましい界面活性剤は、（意図される実験の持続時間で）一般に非毒性である。適切な界面活性剤は、レシチンベース界面活性剤、卵黄リン脂質、およびポリオキサマー（Plur 限定されない。ポリオキサマーは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマーである。広範な範囲の分子量およびＨＬＢ（親水性／親油性バランス）値で利用可能である。現在好ましいポリオキサマーは、ポリオキサマー -188（Pluronic F68としても知られる）である。例えば、Hammerschmidtら，「B lood Substitutes」（T.M.S．Chang編，Marcel Dekker，Inc.，NY 1988）431-38 頁；Breuningerら，J.Pediatr Surg（1993）28:144-50;Mattreyら，Crit Care M ed（1989）17:652-56（これらの全ては本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。用語「水混和性有機溶媒」は、水溶液と混合され得、そしてペルフルオロカーボンエマルジョンを破壊する（すなわち壊す）有機溶媒をいう。適切な水混和性有機溶媒は、アルコール（例えば、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、シクロヘキサノールなど）；アミン（例えば、トリエチルアミン）；および他の溶媒（例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ピリミジンなど）を含むがこれらに限定されない。現在好ましい水混和性有機溶媒は、イソプロパノールおよびアセトニトリルである。用語「単離された器官」は、付随する血管系とともに生器官または器官系（例えば、腎臓、肺、胃腸管、心臓、肝臓、脳など）をいう。一般に、単離された器官は、薬学的化合物（または潜在的な薬学的化合物）のADME/PK特性を実証または示唆することにおけるそれらの有用性のために選択される。一般的な方法および詳細な記載ラットにおける血液をペルフルオロカーボン含有代用血液に置換することにより、混合物の各成分に特有の抽出工程を伴わない分析方法の組み合わせによって、多様な化学的混合物の定量を達成し得る。単離された器官および器官系に関係するADME/PK手順では、代表的には、血液または水性緩衝液のいずれかでの灌流により器官を酸素化する。器官の生存能力は、一般的に、灌流液としての血液で良好であるが、上記で留意したように、この媒体は化学的混合物の成分の容易な定量をたやすくできなくしている。対照的に、水性緩衝液は混合物成分の単純な分析の可能性を有するが、このような媒体は酸素を輸送する能力が劣ることに起因して、組織の生存能力を失うことになり得る。従って、単離された器官または器官系でペルフルオロカーボン含有代用血液での使用は、以下の二つのカギとなる有益性を有する：1)灌流液中の複数の分析物の容易な測定；および2)水性緩衝液で達成された組織生存能力に比べて増強された組織生存能力。本発明は、生きている動物または動物からの単離された器官もしくは器官系の実験における化学的混合物のADME/PKの特徴付けを提供する。二つのプロセスを含み、一方は動物中で化学的混合物を試験するためのペルフルオロカーボンエマルジョンの使用を含み、そして他方は標準的な分析法によるアッセイのためペルフルオロカーボンエマルジョンの調製を含む。動物を含む、本発明のプロセスには、ペルフルオロカーボンエマルジョンでの血液脈管系の血液の置換、続いて試験動物または単離した器官もしくは器官系への化学的混合物を投与を必要とする。次いで、新規な分析手順を使用してペルフルオロカーボンエマルジョン中で、混合物成分のADME/PKの最終結果を経時的に追跡する。分析手順では、水混和性有機溶媒（例えば、イソプロパノール）の添加によるエマルジョンの最初の化学的崩壊、次いで遠心分離により別々の相への媒体の分離が存在する。次いで、HP LC、質量分析法、およびキャピラリー電気泳動法を含む多数の方法のいずれかにより上清相を直接的に分析する。文献において種々の代用血液が教示されている、および／または市販されている。本発明の適切な代用血液は、(1)少なくとも実験の持続時間は研究している動物または組織に十分な酸素を供給するように、そして(2)最小数の干渉物質、すなわち、試験される化合物と相互作用し得るかまたは実験条件下で試験される化合物と混同され得る化合物に寄与するように選択される。現在好ましい代用血液は、ペルフルオロカーボンエマルジョンである。本発明の実施において使用される代表的なペルフルオロカーボンエマルジョンは、少なくとも約5％(w/v)のペルフルオロカーボン、より代表的には少なくとも約10％(w /v)、さらに一層代表的には少なくとも約12％(W/V)、そのうえさらに一層代表的には少なくとも約15％(w/v)を含有し、そして必要に応じて少なくとも約20％(w/ v)のペルフルオロカーボンを含有する。適切なペルフルオロカーボンエマルジョンは代表的には約90％(w/v)未満のペルフルオロカーボン、より代表的には約85 ％(w/v)未満、さらに一層代表的には約80％(w/v)未満、そのうえさらに一層代表的には約75％(w/v)未満、より代表的には約70％(w/v)未満を含有し、そして必要に応じて約65％(w/v)未満のペルフルオロカーボンを含有する。好ましくは、本発明のペルフルオロカーボンエマルジョンは、少なくとも約20％(w/v)未満のペルフルオロカーボンを含有する。勿論、実験設計は、試験される化合物、意図される投与経路、および決定される特定のADME/PKの特性に依存する。例えば、動物または胃腸管の単離された部分を灌流し、化合物または化合物の混合物を投与し、そして灌流液中の化合物（単数または複数）の出現速度をモニターすることにより、胃からの試験化合物の吸収を研究し得る。同様に、灌流液に化合物（単数または複数）を直接添加し、そして灌流液から化合物が消失する速度を測定することにより系からの除去速度を研究し得る。初回通過代謝を、肝臓を使用する灌流実験を通して研究し得る。次いで、この情報を用いて潜在的な生体学的利用能について化合物（または化合物のライブラリー全体）をスクリーニングし得、これは生物薬剤学的薬剤（bi opharmaceutical agent）として有用である最良の機会を有する化合物を研究することを可能にする。例えば、多様なライブリーにおける全てのトリアジン化合物は肝臓により迅速に代謝されたことが見出し得る。この情報により、初回通過代謝が可能である将来の応用におけるトリアジンライブラリーの調査を先行させ得る。あるいは、特有の部分を有する化合物がすみやかに吸収され、これによりすべてがその部分を使用する化合物のライブリーを設計することになることを見出し得る。逆に、大きな疎水基を含む、ライブリーからの全ての化合物が、経口的に吸収されず、経口投与のための化合物を設計する際にその特徴を避ける化合物ライブラリーを設計することになることを見出し得る。従って、特定の応用のための特定のライブラリーを選択するように作成されたデータを使用し得、そして実際、所望のADME/PK特性を提供する化学的特徴を組み込むためのライブリーを設計し得る。この方法では、標的特性が同定され（例えば、血液脳関門を通過する透過性）、そして多種多様な構造的および化学的特性を有する化合物の混合物のADME/PKの特徴が決定される。ADME/PK決定より得られたデータは、血液脳関門を通過する透過性を最大にする構造的および化学的特徴について分析され、次いでこの情報はさらに適切な特徴を組み込む化合物のライブラリーを設計するのに使用される。化合物の混合物を、様々の方法のいずれかにより、例えば、WO91/09735および WO94/06451に教示される（両方とも本明細書中に参考として援用される）技術により、または単純に化合物を一緒に混合することにより調製し得る。本発明の技術は、本発明が夾雑するタンパク質（１〜２の充分に規定されたピークは別として）を本質的に含まない生体相、および普遍的な抽出手順を提供するので、化合物の混合物および単一の化合物の両方の分析に有用である。本発明の方法では、灌流液は、好ましくは、エマルジョンを崩壊させ、水相と非水相とを分離し、そして水相を（例えば、逆相HPLC、薄層クロマトグラフィーなどにより）分析することにより分析される。ペルフルオロカーボンエマルジョンは、代表的には、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような水混和性有機溶媒を、必要に応じて生理食塩液の存在下で添加することにより崩壊し得る。いったん崩壊されると、エマルジョンの二つの相は、静置により分離し得るが、好ましくは遠心分離法により分離される。所望により、エマルジョンを崩壊するための他の溶媒および方法が使用され得る。一般に、(1)研究中の化合物を水相に分配する場合、そして(2)好ましくは、非水相中で全ての血漿タンパク質を沈降させる場合、この分析法は有利である。試験化合物と血漿タンパク質との相互作用を研究するため、例えば、血清アルブミンへの結合および試験化合物の血漿半減期へのその影響を調べるために血漿タンパク質を故意に組み込み得る。以下に示す実施例は、当業者に対するさらなる指針として提供され、そしていずれにしても本発明を制限すると解釈されるべきでない。実施例１（化合物分配の実証）ペルフルオロカーボンエマルジョンを、水混和性有機溶媒（例えば、イソプロパノール）で最初に崩壊させ、続いて遠心分離してこの媒体を別々の相に分離することによる分析のためにこのエマルジョンを調製する。次いで、HPLC、質量分析法、およびキャピラリー電動泳動法を含む多数の方法のいずれかにより、上清（supernate）を直接分析する。上清分画のみを分析に供するために、ペレット化分画中に隔離された分析物は測定において検出されない。従って、上清の分析は、ペルフルオロカーボンエマルジョン中の分析物の濃度を普遍的に決定する方法を提供し得ない。それゆえ、本発明者らは、ペルフルオロカーボンエマルジョン由来の上清が、このエマルジョン中に存在する分析物の公平な観察を提供するか否かという問題と取り組んだ。試験サンプルの調整。３種類の化学物質混合物を使用した：CHIR 4565、CHIR 4575およびCHIR 4582(Chiron Corp.，Emeryville，CA)(各々は24-オリゴ-N-置換グリシン(WO91/09735およびWO94/06451を参照のこと、両方とも本明細書中において参考として援用される)を含有する)。DMSO中0.2mMの等モルの混合物成分を有する混合物の各々に対して、ストック溶液を調製した。以下のように、混合物の各々に対して試験サンプルを調製した。1.5mlの微量遠心分離チューブに、製で販売されるペルフルオロトリブチルアミンベースエマルジョン0.250mlにストック溶液の10μlアリコートを溶解させ、そしてボルテックスミキサー(vortex m ixer)で30秒間攪拌した。エマルジョンを化学的に崩壊させるため、0.30mlのイソプロピルアルコール(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)および50μlの35％塩化ナトリウムを各々サンプルに添加した。溶液をボルテックスミキサーで１分間攪拌し、そして16,000×Ｇにて８分間の遠心分離により、ペルフルオロカーボンは沈降させた。上清の0.50ml部分(上清の全容量の83％)を、さらなる分析のために取り出した。参照サンプルの調整。Oxypherol-ET Emulsion^TMの0.250ml部分を、上述のように試験サンプルの調製のために相分離した。しかし、参照サンプルについては、最初の手順ではなく最終の手順で化学的混合物を添加した。従って、8.3μlの化学的混合物を、上清液の0.50ml部分に添加した。（10μlのストック溶液を試験サンプルに添加したが、上清の全容量の83％のみがさらなる分析のために回収された；従って10μlの83％、すなわち8.3μlのストック溶液が参照サンプルに添加されたことに留意すべきである）。ブランクサンプルの調整。DMSOの25μlアリコートを、0.250mlのOxypherol-ET Emulsion^TMに溶解させた。この溶液を、試験サンプルの調製について上述したように相分離に供した。 HPLC分析のためのサンプルの調整。試験サンプル、参照サンプル、およびブランクサンプルを、冷蔵冷却器トラップ（Savant Instruments，Inc.，Hicksville ，NY）を装備した減圧濃縮器中で凍結乾燥した。水中に2％アセトニトリル、0. 2％ヘプタンスルホン酸、および0.1％トリフルオロ酢酸をとして含有する媒体(p H2)の0.lml容量を各サンプルに添加し、そして凍結乾燥した物質を、ボルテックスミキサーで溶液を約３分間攪拌することにより溶解させた。HPLC系でのサンプル回収の較正のために、ルシファーイエロー（Molecular Probes，Eugene，DR）を各サンプルに10ng/mlで添加した。25μl容量のサンプルを、75μlのHPLC緩衝液Ａ（下記）にHPLC系への注入前に添加した。逆相高速液体クロマトグラフィー。サンプルの分析を、Ｃ₁₈Monitorカラム（5 μ×150mm、孔径100Å；Michrom BioResources Inc.，Auburn，CA）を使用する逆相HPLCにより実施した。カラムを、ミクロボア（microbore）HPLC系(Michrom BioResources，Inc)に取り付けた。クロマトグラフィーの移動相は以下のとおりであった；HPLC緩衝液Ａ（水中２％アセトニトリル、0.2％ヘプタンスルホン酸、および0.2％トリフルオロ酢酸、ｐＨ３）；およびHPLC緩衝液Ｂ（水中75％アセトニトリル、0.2％ヘプタンスルホン酸、および0.08％トリフルオロ酢酸、pH ２）。流速を50μl/分に維持し、そして線形勾配を、0〜100％緩衝液Ｂの37分間の移行により実施した。溶出液を、２つの検出器でモニターした：1)215nmに設定したuv検出器（化学的混合物の成分のモニタリングのため）；および2)それぞれ、425nmおよび530nmに設定した励起および放出を有する蛍光定量検出器（ルシファーイエローのモニタリングのため）。結果の要約。混合物の成分の回収率を評価するために、HPLC「ハンドプリント（handprint）」（すなわち、クロマトグラムの形状）を試験サンプルと参照サンプルとで比較した。図１に示したプロットは実験で得られたHPLCハンドプリントの代表例である。プロットにおける二つのHPLCクロマトグラム間の良好な相関により、ペルフルオロカーボンエマルジョン由来の上清は、エマルジョン中のCH IR 4565の成分の公平な尺度を首尾よく提供することが定性的に実証される。混合物成分の回収率を定量的に評価するために、ピーク面積を積分および総計し、そして試験サンプルと参照サンプルとの面積を比較することより、回収率を算出した。これを、各混合物について２〜３回、反復した；以下の表は、これらの複数の試験の平均および標準偏差を報告する。 ^*混合物を比較するANOVA、p値：0.1772 全体的に、本実施例で示した結果により、化学的崩壊に続く遠心分離法による本発明者らの方法は、ペルフルオロカーボンエマルジョン中の複雑な化学的混合物を分析するための容易でかつ信頼できる方法を提供することが確認される。実施例２（タンパク質沈降でのエマルジョン崩壊）（A）アセトニトリルでの崩壊：ペルフルオロカーボンエマルジョンは無タンパク質で調製されているため、エマルジョンでの血液を置換すると、組織からエマルジョンへとタンパク質が徐々に拡散することになる（Geyer、前出）。分析という点からみると、タンパク質は一般にHPCLのような従来の方法による分析物の測定に適合しないので、これは潜在的に問題となり得る。アセトニトリルはペルフルオロカーボンエマルジョンからタンパク質を除去するための魅力的な薬剤と考えられた。なぜなら、血漿タンパク質を効率的な沈降を生じることが周知であるからである。このセットの試験では、本発明者らは以下のことを決定するために設定した： (1)ペルフルオロカーボンエマルジョンを化学的に崩壊するために、イソプロパノールの代わりにアセトニトリルを使用し得かどうか；および(2)アセトニトリルを使用するエマルジョンの崩壊により、上清から多量の血漿タンパク質が除去されるかどうか。第一セットの実験を、実施例１に記載したとおりに実施したが、イソプロパノールの代わりにアセトニトリルを使用した。図２のプロットは、代表的な結果を示す。ここでは、分析物の回収率は、エマルジョンの化学的崩壊においてイソプロパノールをアセトニトリル（HPLCグレード；Fisher Scientific、Fairlawn N J）に置き換えた場合に同一であることが見出された。この知見により、ペルフルオロカーボンエマルジョン由来の上清中の分析物の回収率を損なうことなく、イソプロピルの代わりにアセトニトリルを使用し得ることが示される。 (B)タンパク質沈降：第２のセットの実験では、血漿で見出される最も豊富な２つのタンパク質を調べた：アルブミンおよびα−アミノ糖タンパク質(AAG)。ウシ血清アルブミン（最小純度99％；Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）およびαアミノ糖タンパク質（AAG；最小純度99％；Sigma Chemical Co.）を、それ c Corp.，Los Angeles，CA）に添加した。上述の第（A）部のように、アセトニトリルを使用してエマルジョンを化学的に崩壊させた。図３におけるプロットより、タンパク質改変エマルジョン由来の上清は、タンパク質無添加のエマルジョン由来の上清と判別できないHPLCプロフィールを有することが示される。この知見より、アセトニトリルを使用して、ペルフルオロカーボンエマルジョンより血漿タンパク質をすみやかにかつ効率的に除去し得ることが実証される。実施例３（ペルフルオロカーボンエマルジョンでのラット胃腸管の灌流）この実験の目的は、ペルフルオロカーボンエマルジョンが、動物の血液脈管系にける使用の後にHPLC分析に受け入れられるかどうかを決定することであった。ラット胃腸管の単離された部分をエマルジョンで洗い流すことにより灌流し、次いでエマルジョンによる再循環様式でこのセグメントを灌流し、腸間膜動脈でエマルジョンを添加し、そしてこれを門脈で抽出した。この実験を行うために、本発明者らは、重量約400gの雄性CDラット(Charles R iver，Wilmington，MA)を使用した。一晩絶食後、ラットを、ケタミンおよびキシラジンの筋肉内注射の投与により麻酔し、そして加温パッドに配置した。手術を、本明細書中に参考として援用される、Pangら.,Drug Metab Disp(1986)14： 102-11によって記載される方法に従って実施した。簡単に言えば、正中切開で開腹して、そして腸全体を取り出し、そして生理食塩液浸漬ガーゼ上に配置した。腸の血液脈管系を単離し、連絡した血管を介しての灌流液の方向転換（redirect ion）を防ぐために、腸ならびに動脈系および静脈系に、以下のようなクランプをかけた：(1)腸（幽門下2cmおよび盲腸直上）；(2)下腸間膜、胃、脾臓および肝臓の動脈ならびに腹腔軸動脈での動脈系；(3)幽門、膵―十二指腸および脾臓の静脈の静脈系；ならびに(4)大動脈および上腸間膜動脈の上および下の大静脈の静脈系。大動脈を分枝させるところで上腸間膜動脈にカニューレを挿入して、 1mlのヘパリン処理した生理食塩水を注入した。胃腸管の脈管系より血液を洗い es，CA）を、４ml/分の流速で蠕動ポンプによって上腸間膜動脈に灌流する一方、門脈より流出する血液を廃液容器に導いた。脈管系の10mlの洗い流し後に、門脈より流出する灌流液を、Oxypherolの100mlレザーバーへと逆に導き、それにより、脈管系を再循環的様式で灌流する閉鎖ループをつくり出した。次いで、腸間膜系を、Oxypherolの100mlレザーバーから５分間毎に採取した１mlのサンプルで 45分間灌流した。サンプルを、実施例１に記載したように、HPLC分析のために調製した。図４のプロットより、HPLCトレースの「バックグラウンド」は、胃腸管脈管系を介しての灌流直後（５分以内）に増加すること、およびこのバックグラウンドが45分間の観察期間にわたって一定のままであることが示される。これらの知見により、ペルフルオロカーボンエマルジョンは、動物の血液脈管系での使用の後にHPLC分析を受けられることが示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者テイラー，エリックダブリュー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94609, オークランド，62エヌディーストリート 561

Claims

【特許請求の範囲】１．試験動物における試験化合物のADME/PK特性を決定するための方法であって、以下の工程： (a)該試験動物の血液を代用血液で置換する工程； (b)該試験化合物を該試験動物に投与する工程； (c)該代用血液の一部を該試験動物から取り出す工程；および (d)該試験化合物またはその代謝産物の存在について該部分を分析する工程；を包含する、方法。２．前記代用血液がフルオロカーボンエマルジョンを含む、請求項１に記載の方法。３．前記フルオロカーボンが、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロトリプロピルアミン、ビス(ペルフルオロブチル)エチレン、ペルフルオロ-N,N-ジメチルシクロヘキシルメチルアミン、ペルフルオロトリメチルビシクロ(3.3.1)-ノナン、ペルフルオロビシクロ(5.3.0)デカン、およびペルフルオロブチルテトラヒドロフランからなるペルフルオロカーボンの群から選択される、請求項２に記載の方法。４．前記フルオロカーボンが、ペルフルオロトリブチルアミンである、請求項３に記載の方法。５．前記フルオロカーボンエマルジョン代用血液が、それが分析される前に破壊される、請求項２に記載の方法。６．前記フルオロカーボンエマルジョンが、水混和性有機溶媒を添加することにより破壊される、請求項５に記載の方法。７．前記水混和性有機溶媒が、アルコール、アミン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、およびピリジンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。８．前記水混和性有機溶媒が、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。９．前記試験化合物が、試験化合物の混合物として投与される、請求項１に記載の方法。１０．単離された生器官における試験化合物のADME/PK特徴を決定するための方法であって、以下の工程： (a)該単離された器官に代用血液を灌流する工程； (b)該試験化合物を該単離された器官に投与する工程； (c)該代用血液の一部を該単離された器官から取り出す工程；および (d)該試験化合物またはその代謝産物の存在について該部分を分析する工程；を包含する、方法。１１．前記代用血液が、フルオロカーボンエマルジョンを含む、請求項１０に記載の方法。１２．前記フルオロカーボンが、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロトリプロピルアミン、ビス(ペルフルオロブチル)エチレン、ペルフルオロ-N,N-ジメチルシクロヘキシルメチルアミン、ペルフルオロトリメチルビシクロ(3.3.1)-ノナン、ペルフルオロビシクロ(5.3.0)デカン、およびペルフルオロブチルテトラヒドロフランからなるペルフルオロカーボンの群から選択される、請求項１１に記載の方法。１３．前記フルオロカーボンが、ペルフルオロトリブチルアミンである、請求項１２に記載の方法。１４．前記フルオロカーボンエマルジョン代用血液が、それが分析される前に破壊される、請求項１１に記載の方法。１５．前記フルオロカーボンエマルジョンが、水混和性有機溶媒を添加することにより破壊される、請求項１４に記載の方法。１６．前記水混和性有機溶媒が、アルコール、アミン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、およびピリジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。１７．前記水混和性有機溶媒が、イソプロパノールおよびアセトニトリルからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。１８．前記試験化合物が、試験化合物の混合物として投与される、請求項１０に記載の方法。１９．標的特性に重要なADMK/PK特徴を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程： (a)標的特性を同定する工程； (b)該標的特性を含む動物または単離された器官を提供する工程； (c)該動物または単離された器官にペルフルオロエマルジョン代用血液を貫流する工程； (d)試験化合物の多様な混合物を投与する工程；および (e)該標的特性に対する性能について、該試験化合物のADME/PK特徴を分析する工程；を包含する、方法。２０．前記標的特性が、胃腸管からの吸収、肺からの吸収、初回通過代謝、血液脳関門透過、および腎排泄からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。