JP2001503990A - Small and sensitive method for detecting environmental hazards - Google Patents

Small and sensitive method for detecting environmental hazards

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JP2001503990A
JP2001503990A JP52284898A JP52284898A JP2001503990A JP 2001503990 A JP2001503990 A JP 2001503990A JP 52284898 A JP52284898 A JP 52284898A JP 52284898 A JP52284898 A JP 52284898A JP 2001503990 A JP2001503990 A JP 2001503990A
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ラロツサ，ロバート・アラン
スコルニク，パブロ・アリール
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イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

(57)【要約】 環境ストレスにおける微妙な変化は現在では、環境ストレスに対する遺伝子応答として致死下レベルで検出および測定することができる。本発明は、非常に高処理能の分析を可能にするために非常に少量で環境ストレスレベルの変化を検出するための改善された方法を提供する。ストレス変化は遺伝子工学的に作成される微生物の発光出力の変化として示される。本発明では、発光遺伝子複合体はストレス誘導性プロモーターの制御下に置かれる。その容量としては約０．５μＬ〜約１０ｍＭの範囲が企図され、そこにディテクター生物体が懸濁される。 (57) Abstract Subtle changes in environmental stress can now be detected and measured at sublethal levels as a gene response to environmental stress. The present invention provides an improved method for detecting changes in environmental stress levels in very small amounts to enable very high throughput analysis. The change in stress is indicated as a change in the luminescence output of a microorganism that is genetically engineered. In the present invention, the luminescent gene complex is placed under the control of a stress-inducible promoter. The volume is contemplated to be in the range of about 0.5 μL to about 10 mM, in which the detector organism is suspended.

Description

【発明の詳細な説明】 環境傷害物を検出するための少量で高感度の方法 発明の分野 本発明は、細胞代謝を狂わせるのに必要なレベル以下のレベルでの環境傷害物 (environmental insults)の検出の際の改善に関する。一層具体的には本発明は 、環境傷害物の存在がレポーター遺伝子の発現を誘導するであろうようなレポー ター遺伝子もしくは遺伝子複合体に操作的に連結されるストレス誘導性プロモー ターを含んでなるＤＮＡ構築物を含む形質転換細菌宿主を提供する。好ましいレ ポーター遺伝子は、細菌性生物発光の原因となるものである。約１μＬと約１０ μＬとの間の容量が有用であり、これにより高処理量分析が可能となる。 背景 一般大衆の関心が高まってきたことおよび政府規制が課せられていることによ り、土壌および地下水中の汚染物質を検出することが可能な環境検知系の開発に 弾みがかかってきている。例えばガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ）および質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ） のような分析機器を取り込む高感度かつ特異的な検出系がここ数年知られてきて いるものの；しかしながらこれらの系は高価な装置および熟練したオペレーター を必要とする。それに加え、試料の調製およびデータ分析は時としては厄介かつ 時間の浪費となる。標準的な米国水質毒性検査（ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｕ ． Ｓ．ｗａｔｅｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ）に用いられる例えばダフニア（Ｄａｐｈｎｉａ ）のような生きた生物体を必要とする毒性アッセイは一層単純で はあるものの；しかしながらこれらの検査は非特異的でありそして特に迅速では ない。 幾分かでも一層迅速なものは、感受性要素として細菌を取り込ませている細胞 ベースの毒性アッセイである。これらの系は、通常の自動分析系における試薬と して細菌細胞を用いる。例えばＲＯＤＴＯＸ系（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｋａｇａｋｕ 社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）は、細菌の酸素消費を測定するバッチアッセイで あり、そして下水植物における使用のために設計された。例えばＧＢＩ ＴＯＸ ＡＬＡＲＭ系（Ｇｅｎｏｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ Ｂｅｒｌｉｎｅｒ Ｉｎｇｅｎ ｉｅｕｉｒｋｏｌｌｅｃｔｉｖｅ社，Ｂｅｒｌｉｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のよう な他の細菌ベースの他の系は特別な化学物質の存在を測定することができる。Ｇ ＢＩ ＴＯＸＡＬＡＲＭは試料中の０．１ｐｐｍという少量のシアン化カリウム の存在を検出できることが知られている。これらの検出系は有用ではあるが、し かし厄介かつ複雑な検出系がその妨げとなっている。最近では細菌の生物発光と いう現象が、単純かつ一層感受性の高い検出様式を環境検知系に提供するものと みなされている。 生物発光の現象は最初は、１８５年、Ｒａｐｈｅｌ Ｄｕｂｏｉｓによる厳密 な科学的調査の基で確認され、その際、同氏は発光性甲虫ピロフルス（Ｐｙｒｏ ｐｈｒｕｓ ）および発光性二枚貝フォラス（Ｐｈｏｌａｓ）から取得される無細 胞抽出物は室温で混合した際にはインビトロで光を放つ反応を生じることを観察 した。そのとき以来、生物発光系が普通の蛍、海洋性腔腸動物、魚類、陸生およ び淡水性蠕虫、ならびに細 菌、藻類、および真菌類の種を含む無数の異なる生物体において同定および調査 されてきている。 細菌性生物発光は、５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕ ｘＤ 、およびｌｕｘＥ）の産物が協同して光を発するように作用する現象である 。ｌｕｘＤの産物は、ある前駆体からＣ１４脂肪酸を作り出す。このＣ１４脂肪 酸はＡＴＰ依存反応の際には、細胞のエネルギー状態に細菌の生物発光をカップ リングさせるｌｕｘＥ産物の作用を介してアシル−酵素複合体へと活性化される 。このアシル−酵素（ｌｕｘＥ産物）は、移転剤（ｔｒａｎｆｅｒ ａｇｅｎｔ ）として作用してｌｕｘＣ産物にアシル基を供与する。このアシル−ＬｕｘＣ二 元性複合体はその後に、ＮＡＤＰＨが電子対およびプロトン供与体として作用し てアシル複素共役をＣ１４アルデヒドに還元する反応で還元を受ける。この反応 は、細胞の還元力を細菌の光発光にカップリングさせる。ルシフェラーゼ（ｌｕ ｘＡ とｌｕｘＢの産物）による触媒反応を受ける光産生反応が光を作り出す。光 発光のためのエネルギーはアルデヒドから脂肪酸への転化およびＦＭＮＨ2酸化 により提供され、光産生と細胞のエネルギー状態との間の別のカップリングを提 供する。 最近では天然に生物発光する生物体が毒性検査の際の感受性要素として用いら れている。ＭＩＣＲＯＴＯＸ系（Ｍｉｃｒｏｂｉｃｓ Ｃｏｒｐ．社、Ｃａｒｌ ｓｂａｄ、ＣＡ）がその一例である。ＭＩＣＲＯＴＯＸ系はフォトバクテリウム ホスポレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｏｒｅｕｍ）の天 然のベースライン発光を測定し、そしてそれをその生物体の周囲の環境の敵対性 に関連付ける。光産生とエネルギー産生の中心的代謝現象との間における以下の ３つ、すなわちＡ ＴＰレベル、ＮＡＤＰＨレベル、およびＦＭＮＨ2レベルのカップリングがフォ トバクテリウム ホスポレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｏ ｒｅｕｍ ）における光産生に必要となるため、これらの代謝の利用性もしくは相 互作用を妨げるいずれかの傷害物は生物発光（ｌｕｘ）系の活性の減少をもたら し、そしてそのためそれに関連してその生物体による光産生の減少をもたらすで あろう。 生物発光系の主な属性は、光産生の減少が迅速であり、ある傷害物に対する暴 露の数分以内に生じることである。これらの系の他の主要な利点は、光検出は見 事なほど感度が高くなり得（単光子のレベルにまで落とせる）、そして移動式野 外用ユニットに容易に適応できる。それに加え、光検出の実際の業務計画では、 検出機の汚れや腐食が有意な作業中断時間の原因となる競合技術（例えば、イオ ン−選択性電極）における主要な弱点となる、検出機を湿潤した生物学的試料に 接触させることの必要が排除される。 組換えＤＮＡ技術の最近の進歩により、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子複合 体を異種遺伝子産物として発現させることが可能となった。これは一般的には宿 主プロモーターの調節下にｌｕｘ構造遺伝子複合体を入れることにより達成され る。そのため例えば、ホタルのルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡがｌａｃＺ プロモーターの調節下で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で発現され（Ｔａｔｓｕｍ ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１１３１，（２），ｐｐ １６１−１６５，（１９９２））、そしてｌｕｘＡＢ融合遺伝子がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）内で、それを強力なＰｘｙｎプロモーターの調節下に置くこ とにより大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で達成可能なものに相当するレベル で発現されている（Ｊａｃｏｂｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０（ １−２），ｐｐ２５１−２５６，（１９９１））。 そのアッセイ中で光発光因子になるように細菌を変換する組換え遺伝子技術を 用いてＭＩＣＲＯＴＯＸ系の代替系が開発されている。Ｒｙｃｈｅｒｔら（Ｅｎ ｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃ．Ｗａｔｅｒ Ｑｕａｌ． ，６（４），ｐｐ４１５−４ ２２，（１９９１））は、ｌｕｘ遺伝子複合体を含むプラスミドｐＪＥ２０２を 宿す組換え大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）が、Ｚｎ2+、臭化エチジウム、ペンタコロ フィエーテ（ｐｅｎｔａｃｈｏｒｏｐｈｅａｔｅ）ナトリウム、Ｃｕ2+、および ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に対して感受性を示すことを示した。このアッ セイにおける応答は、形質転換させた大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）が発光するベー スライン光の減少により記録される。 ＭＩＣＲＯＴＯＸおよび類似の系は有用ではあるものの、それらの感受性は細 胞を代謝的に死滅化させるもしくは無能にさせる傷害物のレベルを検出すること に限定される。これらの系により検出されるためには傷害物は、細胞の中心的代 謝を妨害するか、あるいはＬｕｘ蛋白質を不活化するかのいずれかに十分な程高 いレベルに至っている必要がある。 細胞の代謝に影響を及ぼすのに必要とされるもの以下のレベルで傷害物のレベ ルを検出することが可能であることが必要とされることがよくある。このような ものは、致死濃度の汚染物質が有用な微生物集団を根絶し、有意な費用および工 場の中断時間をもたらす廃棄物処理施設の例である。好ましい検知系は、有用な 微生物集団が損害を被る以前に致死下レベルで傷害物の存在を検出することがで きるものであろう。このような初期での警告は自生の微生物集団を救済する迅速 な救済策のきっか けを作るのに用いることができるだろう。 最近では、ｌｕｘ構造遺伝子を、化学的に応答可能な細菌プロモーターに融合 させ、そしてその後にそのようなキメラを適切な宿主内に入れることにより組換 え細菌が開発されている。このような組換え細菌は特異的刺激に応じて成長する センサー生物体である。この種類の遺伝子融合物の例は、Ｂｕｒｌａｇｅら（Ｊ ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ，１７２（９） ｐｐ４７４９−４７５７（１９９０）） により記載されており、ここではナフタレン分解経路のためのプロモーターを含 むプラスミドＮＡＨ７からのＤＮＡ断片がビブリオ フィスケリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）のｌｕｘ遺伝子に融合され、そしてシュードモナス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）の株を形質転換するのに用いられた。得られた形質転換体 はナフタレンの存在下で光発光の増加を示した。生物発光の誘導は、形質転換を 受けた生物体によるナフタレン分解と一致することが証明された。 水銀（Ｈｇ）に対する特異的な応答性を示す別の検査系がＨ．Ｍｏｌｄｅｒｓ （欧州特許第４５６６６７号）により記載されている。ここでは、Ｈｇイオンに より特異的に誘導可能であり、生物発光の原因となる細菌ルシフェラーゼ（ｌｕ ｘＡＢ ）遺伝子複合体に融合させたｍｅｒプロモーターを含む指示菌株が提供さ れる（ベクターを介在させる遺伝子導入による）。Ｍｏｌｄｅｒの検査系は、水 銀の存在によるｍｅｒプロモーターの誘導、およびその後の検査結果としての組 換え細菌からの光発光の増加を頼みとしている。 ＢｕｒｌａｇｅらおよびＭｏｌｄｅｒｓの方法は、生物発光を増加させる方法 により単一の傷害物を特異的に検出するという点では当該技術 分野を優る幾つかの利点を提供する。これらの系は環境試料中の特定化学物質の 存在を検出するのに有用ではあるが、一般細胞毒性の指示物としては満足の行く ものではない。Ｂｕｒｌａｇｅにより用いられたプロモーターはナフタレン分解 経路では機能性を示し、そしてナフタレンを炭素源として用いることができる宿 主内に入れられる。従ってこの検出系はいずれにしても細胞毒性には関連しない 。同様に、Ｍｏｌｄｅｒｓのｍｅｒ−プロモーターは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） に固有なものではなく、そしてそのため大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における毒性 の天然の指示物ではない。未知の傷害物の第一次検出のための一層一般的な検査 系は、一つの特定な化学物質により活性化されるよりはむしろ細胞毒性もしくは ストレスに特異的に関連付けられたプロモーターを利用する。 細胞性ストレスの結果として活性化される遺伝子は環境傷害物の検出のための 有利な代替手法を提供する。ストレス遺伝子は全ての細胞に見いだされ、そして 正常な細胞代謝を変化させることがあってよいいずれかの種類のストレスの結果 として活性化される遺伝子として特定される。環境ストレスは蛋白質のオーバー ラップセット（ａｎ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ）の合成を誘導することがよくある。最もよく認識されているクラスのストレ ス遺伝子は、蛋白質のリフォールディング、リサイクリング、および再合成の際 の役割を担っていると考えられる一連の細胞性蛋白質をコードする熱ショック遺 伝子である。熱ショック現象は上昇させた温度に対する応答として最初に記載さ れた。その後の研究により、ファージ感染、マクロファージによる被包化、なら びに有機分子および重金属の存在を初めとする多種多様のストレスに対する暴露 がこの熱ショック応答の引き金を引き得ることも 示された。この誘導性作用物質の共通のテーマは細胞内の幾つかの蛋白質の変性 であってよい。（ＬａＲｏｓｓａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５（３）， ｐｐ５２９−５３，（１９９１））。従ってこの応答は広範囲の環境傷害物を統 合および伝達してよい。ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１ ６９（１），ｐｐ２６−３２，（１９８７））は、ＣｄＣｌ2、Ｈ2Ｏ2、エタノ ール、ピューロマイシン、およびナリジクス酸を初めとする多種多様の化学物質 が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で熱ショック遺伝子を誘導することができることを 示した。Ｂｏｌｍら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８ （１），ｐｐ ３３１−３３４，（１９９２））は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） 培養物の、ベンゼン、ＣｄＣｌ2、クロロピリホス（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｖｏｓ ）、２，４−ジクロロアニリン、ジオクチルフタレート、ヘキサクロロベンゼン 、ペンタクロロフェノール、トリクロロエチレン、およびテトラプロピル−ベン ゼンスルホン酸塩は二次元ゲル電気泳動により分析すると、最高３９までの異な るストレス蛋白質の誘導をもたらすと教示している。 細胞は定常状態を維持しようと試みるため、ストレス応答は、トリガリング因 子として作用するいずれかの条件についての最低阻害濃度をはるかに下回る濃度 で活性化される。この事実により、いずれかの環境検知系におけるストレス応答 の使用が特に有利となり、なぜなら傷害物の検出を微生物細胞の死滅化以前に達 成することができるためである。このような系は、微生物集団が破壊されてしま った後にならないと環境汚染物質が検出されないことがよくある廃棄物処理施設 においては極度に有用となるであろう。 今日までにはストレス応答の誘導は環境検査の領域で用いられているが成功の 度合いはたいして高いものでないままである。Ｋｏｅｈｌｅｒら（Ａｒｃｈ．Ｅ ｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ． ，２２（３），３３４−８（１ ９９２））は、重金属および殺虫剤の存在に応答する軟体動物（ｍｏｌｌｕｓｃ ｓ）およびナメクジの様々な種におけるＨＳＰ７０蛋白質のレベルをアッセイす るための検査系を記載している。この系はＰｂ2+の存在に応答するＨＳＰ７０の 増加レベルを示すものの、技術は繁雑であり、そして感受性に欠ける。一層洗練 された技術がＳａｕｎｄｅｒｓら（国際公開第９００２９４７号）により記載さ れる。このＳａｕｎｄｅｒらの技術は、水性環境内で汚染物質に暴露される生物 内でのＨＳＰ６０およびＨＳＰ７０の増加レベルを検出することを必要とする。 手軽な検出メカニズムを利用し、微生物集団を死滅化させるのに必要とされる よりも十分に低いレベルでの多種多様な傷害物を検出することができる高い感受 性の生物学的検査系がＰＣＴ／ＵＳ ９３／１１５２７に開示された。可能な使 用は、大気の質と水質の監視、農薬および製剤の設計、製造、および発酵過程の 管理、管理監視、ならびに毒性スクリーニングを含む。これらの適用は、化学、 飲料、食品および香辛料、化粧品、農業、環境、規制および健康管理産業を初め とする多くの事業に利益をもたらすことができる。出願人の改善点、すなわちＰ ＣＴ／ＵＳ ９３／１１５２７の生物学的検査を少量で高処理能の適用法に採用 することが本明細書中、実施例２４に開示される。 発明の要約 本発明は：発光の変化により環境傷害物の存在に応答することができ る適切な生物発光ディテクター生物体を培養する段階；ある環境傷害物を含むこ とが疑われる試料の存在に前記ディテクター生物体を暴露する段階；そのディテ クター生物体により産生される発光の変化を測定する段階；および前記試料中に 存在する環境傷害物のレベルに前記発光の変化を相関させる段階、を含む環境傷 害物の存在を検出するための改善された方法を提供する。改善は、ディテクター 生物体を懸濁する方法に用いられる非常に少量の容積の使用に対するものである 。特にその改善は、（ａ）原核生物ディテクター生物体を含む溶液を、約０．５ μｌ〜約１０μｌの容積を有する少なくとも一つの容器内に小分けし、前記原核 生物ディテクター生物体が、そのプロモーターが包括的調節回路（ａｇｌｏｂａ ｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ）に感受性を示すストレス誘導性プ ロモーター配列の制御下におかれる発現可能な異種ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合 体を含むように遺伝的に操作されていること； （ｂ）ある環境傷害物に、その原核生物ディテクター生物体を暴露すること； （ｃ）その原核生物ディテクター生物体の発光の増加を測定するための発光検 出機を用いること、 を包含する。容器がマイクロタイタープレートのウエルであり、そして発光検出 機がｘ−線フィルムである方法。環境傷害物に暴露される際に原核生物ディテク ター生物体が対数期にある方法。 本発明は、本出願内に含まれるテキストであるＰＣＴ／ＵＳ ９３／１１５２ ７に記載される方法に対する改良である。 図面の簡単な説明 配列表、および生物学的寄託 図１は、プラスミドｐＧｒｐＥＬｕｓ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５の構築 の説明である。 図２は、プラスミドｐＲＹ００６の構築の説明である。 図３は、プラスミドｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２の構築の説明である。 図４は、エタノールの存在に応答するＴＶ１０６０による発光の増加のグラフ 表示である。 図５は、エタノールの増加濃度の存在に応答するＴＶ１０６０による発光の増 加のグラフ表示である。 図６ａは、様々な濃度のエタノールの存在に応答するＷＭ１０２１による発光 の増加のグラフ表示である。 図６ｂは、様々な濃度のエタノールの存在に応答するＷＭ１０２６による発光 の増加のグラフ表示である。 図７は、ｐＧｒｐＥ．Ｌｕｘ．５で形質転換させたｔｏｌＣ +およびｔｏｌＣ - ディテクター細胞のペンタクロロフェノールへの相対的感受性のグラフ表示であ る。 以下の株はブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の規定に従い 、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａｃｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ，ＭＤ ２０８５２、ＵＳＡ）に寄託した：寄託者同定名称 ＡＴＣＣ番号 寄託日 ＴＶ１０６０ ６９１４２ １９９２年１２月３日 ＴＶ１０６１ ６９３１５ １９９３年５月１３日 ＴＶ１０７６ ６９３１４ １９９３年５月１３日 ＷＭ１２０２ ６９３１３ １９９３年５月１３日 ＷＭ１０２１ ６９１４１ １９９２年１２月３日 ＷＭ１０２６ ６９１４３ １９９２年１２月３日 ＷＭ１３０２ ６９３１６ １９９３年５月１３日 「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣにおける寄託の際の培養物の受託番号である。 発明の詳細な記述 本発明は、ある発現可能な遺伝子融合物を含むディテクター生物体を、ストレ ス誘導性プロモーターと、構造遺伝子との間に導入してｌｕｘ遺伝子の発現をも たらすことで、致死レベル以下での環境傷害物の検出の方法を提供する。 本発明のディテクター生物体により検出され得る環境傷害物は、工業用地、廃 棄物用用水路（ｗａｓｔｅ ｓｔｒｅａｍ）、および農業流去水内で一般に見い だされる多種多様の有機および無機汚染物質を含む。このような化合物は制約さ れる訳ではないが、ポリ芳香族性炭化水素（ＰＡＨ）、ハロゲン化芳香族化合物 、ならびに例えば鉛、カドミウム、銅、亜鉛、およびコバルトのような多種多様 の重金属を含む。本発明の方法により検出されることが示された化合物は、アト ラジン、ベンゼン、硫 酸銅、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、エタノール、メタノール、２−ニトロ フェノール、４−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール、フェノール、ト ルエン、ジメチルスルホキシド、硝酸銅、塩化カドミウム、塩化ナトリウム、ア セテート、プロピオネート、過酸化水素、ピューロマイシン、塩化水銀、２，４ −ジクロロアナリン、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、塩化メチ レン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、アクリルアミド、メチルビオロゲン、マイトマ イシンＣ、メナジオン、臭化エチジウム、ヒドロキサミン酸セリン、およびキシ レンを含む。検出される他の環境ストレスは低ホスフェートレベル、乏しい窒素 源、乏しい炭素源、および紫外線光での照射である。 以下の定義が本明細書で用いられ、そして請求の範囲の理解のために参照され るべきである。 用語「プロモーター」および「プロモーター領域」は、通常は転写が正しい部 位で開始するのに必要とされるＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子につ いての認識を提供することによりそのコーディング領域の発現を制御する構造遺 伝子の蛋白質コーディング配列の上流（５’側）のＤＮＡの配列を意味する。プ ロモーター配列は必要ではあるが、その遺伝子の発現を稼働させるのには必ずし も十分ではない。 ある「断片」は、特別な領域のＤＮＡ配列の断片を構築する。 「核酸」は、糖、ホスフェート、およびプリンもしくはピリミジンの内のいず れかを含む単量体（ヌクレオチド）からなる一本鎖もしくは二本鎖であることが できる分子を意味する。細菌および高等植物では「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ ）は遺伝子物質を意味する一方で、「リボ核酸」（ＲＮＡ）はＤＮＡからの情報 の蛋白質への翻訳にかかわる。 「調節」および「調節する」は、独占的にではないが主に、ある遺伝子の転写 開始の上流（５’側）に位置するＤＮＡ配列因子により調節される遺伝子発現の 制御を意味する。調節は、ある刺激に対する全か無かの応答をもたらしてよく、 もしくは遺伝子の発現のレベルにおける変化をもたらしてよい。 用語「コーディング配列」は、蛋白質、ポリペプチド、もしくはそれらの一部 分をコードし、そして転写の開始を稼働させる調節配列を排除する遺伝子の部分 を意味する。コーディング配列はその細胞内に通常は見いだされてよく、あるい はそれは導入される場合には通常は細胞の部位内には見いだされないものでよく 、この場合にはこれは異種遺伝子と称される。コーディング配列は、天然に存在 するかもしくは合成される様々な源に由来するセグメントの複合物であってよい 。 用語「構築」もしくは「構築する」は、いずれかの源に由来する直線もしくは 環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡのプラスミド、ウイルス、 自主的に複製する配列、ファージ、もしくはヌクレオチド配列を意味し、この場 合、多数のヌクレオチド配列が連結もしくは組換えされて独特な構築物となり、 これは適切な３’非翻訳配列とともに、ある選択された遺伝子産物のためのプロ モーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる。 用語「形質転換」は、核酸の導入後の、ある細胞内への新規の遺伝子獲得を意 味する。 用語「操作的に連結される」は、機能的ＲＮＡに転写されるのに適切な向きお よび読み取り枠内の２本のＤＮＡ断片の融合を意味する。 用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの、遺伝 子産物への転写および翻訳を意味する。発現の際には、遺伝子産物の配列をコー ドするＤＮＡ鎖が最初に相捕的ＲＮＡに転写され、これはしばしばメッセンジャ ーＲＮＡであり、そしてその後にはこうして転写されたメッセンジャーＲＮＡは 、もしその遺伝子産物が蛋白質であれば既述の遺伝子産物へと翻訳される。 用語「翻訳開始シグナル」は、蛋白質合成の開始を指定する核酸内の３つのヌ クレオチド単位（コドン）を意味する。 用語「プラスミド」は本明細書で用いられる場合には、細胞の中心となる代謝 の部分ではなく、そして通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をとる遺伝子を保持 することがしばしばである追加的染色体因子を意味する。 用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、二本鎖ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配 列内で結合および切断を行う酵素を意味する。 用語「生物発光」は、いずれかの生きた生物体からの光発光の現象を意味する 。 用語「ｌｕｘ」は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘ Ｅ を含み、そして細菌の生物発光の現象の原因となるｌｕｘ構造遺伝子を意味す る。ｌｕｘ遺伝子複合体は個々のｌｕｘ遺伝子の全てを含み、協働して作用する か、あるいはｌｕｘＡおよびｌｕｘＢがその複合体の部分である限りではそのｌ ｕｘ 構造遺伝子のいずれかのサブセットを含んでよい 用語「ストレス」もしくは「環境的ストレス」は、環境傷害物に対する暴露の 結果として細胞内にもたらされる状況を意味する。 用語「傷害物」もしくは「環境傷害物」は、細菌細胞もしくは細胞の 集団における通常の細胞代謝の変化をもたらすいずれかの物質もしくは環境の変 化を意味する。環境傷害物は制約される訳ではないが、化学物質、環境汚染物質 、重金属、温度の変化、ｐＨの変化、ならびに酸化的損傷、ＤＮＡ損傷、嫌気性 環境を生じる作用物質、窒素の利用可能性の変化、もしくは病原体を含む。 用語「ストレス応答」は、検出可能なレベルのストレス蛋白質の誘導、あるい は他の傷害物もしくは増加用量の環境傷害物に対する暴露に対する一層高い程度 の耐性の状態のいずれかをもたらす細胞応答を意味する。 用語「ストレス蛋白質」は、環境ストレスの結果としてか、もしくは環境傷害 物の存在により誘導されるいずれかの蛋白質を意味する。典型的なストレス蛋白 質は制約される訳ではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）遺 伝子ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓ Ｕ 、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｉｄＡ 、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ 、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、およびｆａｂＡを含む。 用語「ストレス遺伝子」は、その転写が環境ストレスの結果としてか、もしく は環境傷害物の存在により誘導されるいずれかの遺伝子を意味する。典型的には 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ストレス遺伝子は制約される訳ではないが、ｇｒｏＥ Ｌ 、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ 、ｃｌｐＢ、ｃ１ｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｉｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ 、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐ ｈｏＡ 、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡを含む。 用語「熱ショック遺伝子」は、その合成がシグマ−３２蛋白質をコードする構 造遺伝子（ｒｐｏＨ）により正の方向に調節されるいずれかの遺伝子を意味する 。 用語「ストレス誘導性プロモーター」は、ストレス遺伝子を活性化し、そして ストレス遺伝子産物の増加発現をもたらすことができるいずれかのプロモーター を意味する。 用語「ディテクター生物体」は、ある構造遺伝子に融合されるストレス誘導性 プロモーターからなる遺伝子融合物を含み、そしてある環境傷害物に応答してｌ ｕｘ 遺伝子産物を発現することが可能な生物体を意味する。典型的には、ディテ クター生物体は制約される訳ではないが細菌を含む。 用語「対数期」もしくは「対数期増殖」は、ディテクター細胞数の指数関数的 増幅を可能にする条件下で増殖するディテクター生物体の細胞培養物を意味する 。 用語「相対的光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）」は「ＲＬ Ｕ」と略され、そして使用されるルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）に 独特な内部標準に対して較正してあるルミノメーターにより測定される光発光の 測定値を意味する。ディテクター生物体の構築のための宿主細胞 本発明において適切なディテクター生物体の構築のための宿主細胞は、ｌｕｘ 遺伝子融合物の発現を行うことができるいずれかの細胞を含み原核生物細胞が好 ましく、そして腸内細菌クラスのメンバーが最も好ましい。 腸内細菌は、科エンテリオバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ ｒｉａｃｅａｅ ）のメンバーであり、そしてエシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌ ａ ）のようなメンバーを含む。これらはグラム陰性の直線杆菌（ｓｔｒｉｇｈｔ ｒｏｄ）であり、０．３〜１．０×１．０〜６．０ｍｍ、周毛性鞭毛による運 動性か（タトゥメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）を除外する）、あるいは非運動性で ある。それらは酸素の存在および非存在下で成長し、そしてペプトン、ミートエ キストラクト（ｍｅａｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、および（通常は）マッコンキー（ ＭａｃＣｏｎｋｅｙ’ｓ）培地上でよく成長する。幾つかのものは唯一の炭素源 としてのＤ−グルコース上で成長する一方で、他のものはビタミンおよび／また はミネラル（一つもしくは複数）を必要とする。これらは呼吸および発酵代謝を 有する有機栄養性であるが好塩性ではない。酸およびしばしば可視できる気体が Ｄ−グルコース、他の炭水化物、およびポリヒドロキシアルコールの発酵中に産 生される。これらはオキシダーゼ陰性であり、そしてシゲラ ディセンテリアエ （Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）０グループ１およびゼノルハブ ドゥス ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ）を例外としてカタラーゼ陽性である。硝酸塩は亜硝酸塩に還元される（エルウ ィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）およびエルシナ（Ｙｅｒｓｉｎａ）の内の幾つかの株 を例外とする）。ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含有量は３８〜６０モル％である（Ｔm、Ｂ ｄ）。大半の属の内の種からのＤＮＡは少なくとも２０％が互いにそしてこの科 の内の基準種である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に関連する。 記載に値する例外はイエルシナ（Ｙｅｒｓｉｎａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕ ｓ ）、プロビデニカ（Ｐｒｏ ｖｉｄｅｎｉｃａ ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、およびエドワルドシエラ（Ｅ ｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ）の種であり、これらのＤＮＡは１０〜２０％が他の属 からの種のものに関連する。エルウィニア クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃ ｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ）を例外として、検査した全ての種は腸内細菌に共通の 抗原を含む（Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｈ．Ｂｅｒｇｙら、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌ ｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９８４）。 本発明において特に有用なものは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、および属サルモ ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のメンバー、ならびにｒｅｃＡ遺伝子およびその 上流プロモーター領域が既に同定されている腸内細菌である。ストレス誘導性プロモーター 本発明は、環境傷害物の存在に対して感受性を示すストレス誘導性プロモータ ーを提供する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方からのストレス誘導性プ ロモーターが用いられてよいが、しかしながら細菌からのプロモーターが好まし く、そして大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）からのプロモーターが最も好ましい。適切 なストレス誘導性プロモーターは制約される訳ではないが、以下の表Ｉに示され る「応答性遺伝子」という見出しの遺伝子リストから選択されてよい：表Ｉ ＊ その発現が対応するストレスにより増加し、そしてその発現が対応する調節 遺伝子（一つもしくは複数）により調節される遺伝子。 表Ｉは、反応性遺伝子（一つもしくは複数）の、特別な調節遺伝子（一つもし くは複数）および調節回路との関係、ならびに特別な刺激によりトリガリングさ れる関連細胞性ストレス応答を示す。 表Ｉ中、先に列挙されるストレス遺伝子の内の大半のものは正の調節を受ける ことが知られているものの、ＤＮＡ損傷の結果として作られるＳＯＳ応答は負に 調節される回路を表す。正および負の調節メカニズムの定義については、Ｂｅｃ ｋｗｉｔｈ、Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎ ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ． ｅ ｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ｐｐ． １４３９−１４４３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃ ｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１ ９８７））を参照されたい。 ＤＮＡ損傷に対するＳＯＳ応答は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）においてよく理解 されている。ｌｅｘＡ遺伝子の産物（ＬｅｘＡレプレッサー）は、少なくとも１ ７の染色体遺伝子の発現を調節するオペレーター要素に結合する（Ｗａｌｋｅｒ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ ｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅ ｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ｐｐ．１３４６−１３５７， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ，Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７））。ＤＮＡ損傷もしくはＤＮＡ複製の妨害の 際には未知のＳＯＳ−誘導性シグナルが産生される。このシグナルはｒｅｃＡ遺 伝子産物と相互作用を行って、その遺伝子産物を、限られた数のレプレッサー分 子の蛋白質分解の速度を増加させる形態に変換させる（Ｌｉｔｔｌｅ，．Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ ． １７５：４９４３−４９５０）。これらのレプレッサー分 子は溶原状態にある紫外線光誘導性ファージゲノムによりコードされかつそれら から発現される染色体ｌｅｘＡ遺伝子およびレプレッサーの産物である。ＳＯＳ プロモーターはＬｅｘＡレプレッサーのＲｅｃＡ蛋白質介在性蛋白質分解により 抑制から解放される。中でもそのＳＯＳ応答性プロモーターはｒｅｃＡおよびｕ ｖｒＡ である。多重コピープラスミド上のｒｅｃＡプロモーター−ｌｕｘ融合物 が生物発光を生じ、そして形質転換された宿主細胞の生物発 光がＤＮＡ損傷に応答して増加するようになることが見いだされている。この結 果の正確なメカニズムは未知であるが、本発明が正に調節される包括的調節回路 の研究に限られないことは明らかであり、なぜなら（１）幾つかの負に調節され る回路が多重コピー状態における応答性遺伝子のプロモーターと共に作動するで あろうし、そして（２）単一コピー状態にある負に調節されるプロモーターを挿 入する幾つかの手法が存在するためである［例えば、Ｏｄｅｎら、Ｇｅｎｅ ９ ６：２９−３６（１９９０）；Ｓｙｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ ５３：８５−９６（ １９８７）；Ｗｉｎａｎｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６１：１２１９− １２２１（１９８５）；Ａｒｐｓ ａｎｄ Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ 、１６９：１０６１−１０７０（１９８７）；Ｊａｓｉｎａｎｄ Ｓｃｈ ｉｍｍｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５９：７８３−７８６（１９８４）］ 。発現ベクターおよび形質転換宿主の構築 本発明は更には、Ｌｕｘ蛋白質の発現のために細菌宿主細胞を形質転換するこ とができる、ストレス誘導性プロモーター−ｌｕｘ遺伝子融合物を含む形質転換 ベクターをも提供する。多種多様の形質転換ベクターが用いられてよいが、しか しながら大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を形質転換することができるものが好ましい 。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３、ｐＧｒｐＥＬｕｘ．５、ｐＲＹ００１、ｐＲＹ００２ 、およびｐＲＹ００６は、その構築が以下の本文に詳細に記載される適切な形質 転換ベクターの５つの具体例である。これらのベクターはストレスプロモーター −ｌｕｘレポーター融合物を宿主細胞内に導入する目的のために作成されたベク ターの総計数の内のほんの一例を表す。しかしながら、分子生物学の当 業者には、それらの構築に用いられる方法および材料は、記載される他の全ての ベクターの代表的なものであることが容易に理解されるであろう。他の好ましい ベクターが実施例１０の表Ｖに列挙される。 ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５はｇｒｐＥプロモーターを 含むベクターである一方で、ｐＲＹ００１、ｐＲＹ００２、およびｐＲＹ００６ はｄｎａＫプロモーターを含む。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３、ｐＧｒｐＥＬｕｘ．５ 、およびｐＲＹ００６は全て直接クローニングの方法により作成された一方で、 ｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２のための構築方法の部分としてはＰＣＲプロト コールが利用された。例えばこれらのような形質転換ベクターは一般的であり、 そして適切なベクターの構築は当該技術分野によく知られる手法により達成され てよい。ｌｕｘ遺伝子の好ましい源は、プローモーターを欠くｌｕｘ遺伝子複合 体を含む既存のプラスミドである。同様に形質転換ベクターの構築のためのスト レス誘導性プロモーターＤＮＡの好ましい源は、そのストレス誘導性プロモータ ーＤＮＡが都合のよい制限部位にフランクされており、制限酵素消化による単離 に適する既存のプラスミドであるか、あるいはＰＣＲ反応の産物のいずれかであ る。 ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５ベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ストレス遺伝子ｇｒｐＥおよびｌｕｘ遺伝子複合体から構築される 。ｐＧｒｐＥ４は、ｐＵＣ１８に由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターであ る（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−４９４９−０１）。ｐＧｒｐ Ｅ４はｇｒｐＥ遺伝子を含み、これは５’末端がＥｃｏＲＩ部位に結合し、そし て３’末端がＢｂｕＩ部位に結合するそれ自体のプロモーターを含む。追加的に 、このｇｒｐＥプ ロモーターでは、その３’末端はＥｃｏＲＩ部位のすぐ下流でＰｖｕＩＩおよびＨａｅ ＩＩＩ部位に結合している（図１）。ＥｃｏＲＩおよびＢｂｕＩ制限酵素 での消化によりｇｒｐＥ遺伝子に対応する１．１ｋｂ断片がもたらされる。Ｐｖ ｕ ＩＩでの更に進んだ消化により２つの断片がもたらされ、その内の一つはｇｒ ｐＥプロモーターを含む。そのｇｒｐＥプロモーター断片上の３’ＰｖｕＩＩ部 位は、リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカーへの連結を介してＥｃｏＲＩ部位へと 転換される。ＨａｅＩＩＩによる更なる消化によっては５’ＨａｅＩＩＩ部位お よび３’ＰｖｕＩＩ部位が都合よく結合したｇｒｐＥプロモーター断片がもたら される（図１）。 ｌｕｘ遺伝子複合体を含むｐＵＣＤ６１５プラスミドはＲｏｇｏｗｓｋｙら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ． １６９（１１）、ｐｐ５１０１−５１２（１９８７ ））により完全に記載されている。プラスミドｐＵＣＤ６１５は、カナマイシン およびアンピリシン耐性のための遺伝子を含み、そしてプロモーターを欠くｌｕ ｘ 遺伝子オペロンを含む１７．６ｋｂのプラスミドである（図１）。ｐＵＣＤ６ １５はまず制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化してプラスミドの開鎖を行 い、その後にはｐａｒｐＥ ＩＶのＨａｅＩＩＩ消化物からのＤＮＡ断片との連 結を行う。 典型的には、連結反応の産物はまず、適切な宿主を形質転換すること、そして 生物発光をスクリーニングすることによりスクリーニングされる。多種多様の宿 主が用いられてよく、高い形質転換頻度を有する宿主が好ましい。ＸＬ１Ｂｌｕ ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）およびＤＨ５−α（ＧＩ ＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）が２つのこのような宿主 である。生物発光スクリーニン グの好ましい方法は、適切なＸ−線フィルムに対して形質転換体の格子状培養物 （ｇｒｉｄｄｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を暴露し、そしてその後に暴露の証拠とし て現像したフィルムを肉眼分析することを必要とする。形質転換させた宿主から のプラスミドの再単離および制限消化、ならびにその後のゲル電気泳動を用いて 正しいプラスミドの存在を確認する。２つの異なる形質転換コロニーから単離さ れたプラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５は、制限酵素 分析を基にすると識別不能となる。幾つかの実験条件下では、ｐＧｒｐＥＬｕｘ ．５で形質転換させた細胞はｐＧｒｐＥＬｕｘ．３で形質転換させたものと比較 すると高目のベースライン生物発光を示し、そしてそれ故、ｐＧｒｐＥＬｕｘ． ５は多くの環境傷害物の検出にとって好ましい。 本発明は更には、環境傷害物の存在下で発光を増加させることができる形質転 換宿主細胞をも提供する。多くの適切な宿主を利用することができ、この場合、 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）が好ましく、そして大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＲＦ Ｍ４４３が最も好ましい。ＲＦＭ４４３はＷ３１０２に由来し、これはＢ．Ｂａ ｃｈｍａｎｎ、Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ ｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．，ｐｐ． １１９０−１２２０ ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ，Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７））により完全に記載されている。ｐＧｒｐ Ｅｌｕｘ．３によるＲＦＭ４４３の形質転換は新規の株ＴＶ１０６０をもたらし 、これは既にブダペスト条約（Ｂｉｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の条項の基に ＡＴＣＣに寄託してある。ｐＧｒｐＥＬｕｘ． ５によるＲＭＦ４４３の形質転換により新規の株ＴＶ１０６１がもたらされる。 株ＴＶ１０６１からの生物発光のベースラインは株ＴＶ１０６０からのものより も大きい。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６０にはＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１ ４２が割り当てられており、そしてＴＶ１０６１にはＡＴＣＣ Ｎｏ．６９３１ ５が割り当てられている。 ｄｎａＫプロモーターを含むプラスミドｐＲＹ００６の構築はｐＧｒｐＥＬｕ ｘ．３のものに類似するプロトコールに従う。ｄｎａＫプロモーターをコードす るＤＮＡが、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりラムダファー ジ（Ｌａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ）９Ｅ４から取得された。９Ｅ４は、引用により 本明細書に取り込まれるＫｏｈａｒａら（Ｃｅｌｌ ５０、４９５−５０８、１ ９８７）により完全に記載されている。制限酵素消化により、５’末端にＢａｍ ＨＩ部位が結合し、そして３’末端にＥｃｏＲＩ部位が結合するｄｎａＫプロモ ーター領域を包含する３．７ｋｂのＤＮＡ断片が作られた。ｐＧｒｐＥＬｕｘ． ３の構築の際と同様に、このｌｕｘ遺伝子複合体の源はｐＵＣＤ６１５である。 ｐＵＣＤ６１５はまずＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、そしてそ の後にそのｄｎａＫプロモーター断片との連結によりプラスミドｐＲＹ００６が 作られた（図２）。 ｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２の構築は、９Ｅ４からｄａｎＫプロモーター をコードするＤＮＡを増幅するためにＰＣＲプロトコールが用いられたことを除 外するとｐＲＹ００６のものに類似する。簡潔に記載すると、９Ｅ４からのｄａ ｎＫ プロモーターのＰＣＲ増幅は、引用により本明細書に取り込まれるＣｏｗｉ ｎｇら、ＰＮＡＳ ８２、２６７９−２６８３、１９８５、により記載されるｄ ｎａＫ プロモーター配列を 用いて達成した。 増幅は、引用により本明細書に取り込まれる製造業者により記載される要領（ Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔＮＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）で実施した。ｄｎａＫプロモーター領域 に対応する増幅産物は、増幅プライマーの構築により決定された都合のよいＢａ ｍ ＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。このｄｎａＫプロモーター領域を、 予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化してあるｐＵＣＤ６１５に連結 した。 連結したＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを形質転換し、 そして得られる形質転換体を、Ｘ−線フィルムに暴露することにより、そして制 限消化により、そしてその後にアガロースゲル上で分析することにより生物発光 についてスクリーニングした。株ＤＨ５−αをこの初回スクリーニングについて 選択したが、それはその形質転換頻度が高かったためである。２つの独立したコ ロニーを選択した。これらの形質転換体ｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２から単 離されたこの２つのプラスミドは独立したコロニーから選択されたものの、制限 酵素分析に基づくと識別不可能であり、そして本発明の目的のためには同一とみ なされる。幾つかの実験条件下では、ｐＲＹ００２で形質転換した細胞は、ｐＲ Ｙ００１で形質転換したものと比較すると環境傷害物に応答して一層高目の生物 発光を呈し、そしてそれ故、ｐＲＹ００２は検出用には好ましい。その後にｐＲ Ｙ００１、ｐＲＹ００２、およびｐＲＹ００６を用いてＲＦＭ４４３を形質転換 してそれぞれ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＷＭ１０２１、ＷＭ１２０２、および ＷＭ１０２６を作成した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＷＭ１０２１、ＷＭ１２ ０２、およびＷＭ １０２６はブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の条項に従いＡ ＴＣＣに寄託してある。大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）ＷＭ１０２１にはＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１４１が割り当てられている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＭ１２０２ にはＡＴＣＣ Ｎｏ．６９３１３が割り当てられている。大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌ ｉ ）ＷＭ１０２６にはＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１４３が割り当てられている。先に 記載したように、ｌｕｘレポーターに融合させた他のストレス遺伝子のプロモー ターの構築は、ＰＣＲプライマーおよび鋳型ＤＮＡの源がプロモーターの配列に より読み取られる際には違っていることを除外しては、ｐＲＹ００１およびｐＲ Ｙ００２の構築と同一であった。全てのプロモーターの配列は公開されており、 そして核酸配列のＧｅｎｂａｎｋデーターベースを通して容易に取得することが できる。 ストレス誘導性プロモーター−ｌｕｘプラスミドは自律複製性プラスミドとし て本発明の形質転換宿主内に存在するものの；しかしながらこの作業を日常的に こなす者であれば、ストレス誘導性プロモーター−ｌｕｘプラスミドが形質転換 宿主のゲノム内に組み込まれた形質転換宿主を提供することも可能であることを 理解するであろう。これは当業者により知られる手法により達成されてよい。ス トレス誘導性プロモーターは遺伝子産物の発現を稼働させてよく、この遺伝子産 物が次にはｌｕｘ遺伝子複合体の発現を活性化する。この場合には、プロモータ ーおよびｌｕｘ遺伝子複合体は異なる遺伝子要素上に生じてよい。 一例として、多数の抑制メカニズムの内のいずれかが思い起こされてよい［Ｈ ａｒｔｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｔｈ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、１７：１−１０５（１９７３）］。あるものでは、 染色体上に組み込まれるｌｕｘ遺伝子複合体は、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ 、ｌｕｘＢ、もしくはｌｕｘＥにおけるナンセンス突然変異を含み、そして構造 的プロモーターにより稼働される。ストレス誘導性プロモーターは、それがナン センス抑制遺伝子の発現を稼働するように融合される。ストレスの非存在下では 生物発光は観察されず、なぜなら生物体が５つの必要不可欠なＬｕｘ蛋白質の合 成を行うことができないためである。その生物体がストレスを受ける場合には抑 制遺伝子が転写される。この抑制遺伝子産物の発現により５つの必要不可欠なＬ ｕｘ 蛋白質の発現が可能となり、そしてそのためその生物体は光を産生する。膜突然変異 場合によっては本発明のディテクター細胞は、スクリーニング過程を容易にさ せるであろう突然変異を含んでよい。従って、目的の化学物質は細胞内に入り込 むことができ、細胞内に保持され、そしてその細胞性機構の標的分子と相互作用 を行うことができる必要がある。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の様々な突然変異体 が細胞内への透過性および細胞内蓄積に影響を及ぼすことが知られている。ｒｆ ａ （Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．、Ｆ．Ｄ．Ｌｅｅ、およびＷ．Ｅ．Ｄｕｒｓｔｏｎ、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ． ＵＳＡ 、７０（３）：ｐ．７８２−７８ ６、（１９７３））、ｅｎｖＡ(Ｙｏｕｎｇ，Ｋ、およびＬ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒ 、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.、１７３：ｐ．３６０９−３６１４、(１９９１))、ｉｍｐ （Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ａ．、Ｒ．Ｍｉｓｒａ、およびＳ．Ｂｅｎｓｏｎ 、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２２：ｐ．４９１−５０１、（１９８９））、ｌｐｐ（ Ｇｉａｍ，Ｃ．Ｚ．、Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ）およびＨ．Ｃ．Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ． 、（２５９）：ｐ．５６０１−５ ６０５、（１９８４））、もしくはｓｕｒＡ（Ｔｏｒｍｏ，Ａ．、Ｍ．Ａｌｍｉ ｒｏｎ、およびＲ．Ｋｏｌｔｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１７２）：ｐ ． ４３３９−４３４７、（１９９０））の突然変異対立遺伝子を保持する株は 多種多様の化学物質に対する感受性が増加している。例えばｅｍｒ（Ｍａ，Ｄ． ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６：ｐ．４５−５５、（１９９５））も しくはａｃｒＡＢ（Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｉ．Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．、１９ ：ｐ．１１６７−１１７５、（１９９６））のような突然変異での流出ポンプ（ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ）の破壊、またはｔｏｌＣ（Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１７２（９）、ｐｐ ５５１１−５５１３、（１９９ ０））のような突然変異での、そのような細胞が用いるチャネルの破壊によって も、化学物質に対する感受性の増加がもたらされる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） もしくは他の細菌の適切な宿主株は、一つの既知の突然変異もしくは突然変異の 組み合わせ物を保持するように構築されてよい。場合によっては、ｔｏｌＣ-突 然変異、もしくはスクリーニング過程を容易にさせるために細胞膜の特性に変化 をもたらす他の突然変異を含むディテクター生物体を提供することが本発明の範 囲内に含まれる。 具体的には、毒性有機物に対する細胞包膜の透過性が増大している高度な感受 性を備えたディテクター生物体を作成する目的では、ｔｏｌＣ -突然変異が大腸 菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＲＦＭ４４３内に組み込まれた。この大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）形質導入体ＤＥ１１２は、ｔｏｌＣ遺伝子座での突然変異を除外しては 株ＲＦＭ４４３とアイソジェニック（同種同系）である。これは、ドナーとして 株ＣＳ１５６２（ｔｏｌＣ ：：ｍｉｎｉＴｎ１０）（Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １７２（９）、ｐｐ５５１１−５５１３、（１９９０））およびレシピエントと して株ＲＦＭ４４３上で成長させた溶解物を用いるファージＰ１により介在され る普遍形質導入により構築した。得られたテトラサイクリン耐性形質導入体を、 疎水性化合物であるクリスタルバイオレットについての過敏性反応についてスク リーニングした。 ＤＥ１１２を、先に記載される標準的形質転換法に従い、ｐＧｒｐＥＬｕｘ． ５もしくはｐＲＹ００２のいずれかで形質転換して、ｔｏｌＣ-突然変異を有す るディテクター生物体ＴＶ１０７６（ｇｒｐＥ ｌｕｘ ｆｕｓｉｏｎ）および ＷＭ１３０２（ｄｎａＫ ｌｕｘ ｆｕｓｉｏｎ）を作成した。ＴＶ１０７６お よびＷＭ１３０２はブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の条項 に従い、ＡＴＣＣに寄託してあり、そしてＡＴＣＣ Ｎｏ．６９３１４およびＡ ＴＣＣ Ｎｏ．６９３１６とそれぞれ表示される。少容量アッセイ法 先に記載されるように、多種多様な作用物質および条件が細菌生物体内でスト レス応答を産生させることが知られている。例えば高処理アッセイ系を考慮した 培養培地容積の減少のようなアッセイ系の改変は、これらの条件が細胞ストレス 応答を生じてもよいアッセイに制約を課してよい。例えば少容量培養物（１〜２ μｌ）は高速蒸発（浸透圧モル濃度およびｐＨを変化させる）、ならびに培地表 面と細胞との相互作用により産生される細胞膜上の物理的ストレスに供される。 例えば、高張性環境においてストレスを受けるＨｅｌａ細胞が細胞容積の迅速な 減少、細胞生存率の３０％の減少、および超微構造変化を呈することが示されて いる（Ｗｈｅａｔｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８４）、６（３− ４）、１６３−８１）。 真核生物細胞における浸透性ストレスの効果により、様々なストレス遺伝子の 誘導がもたらされることはよく知られている。例えば、哺乳類腎臓細胞における ＨＳＰ−７２およびＨＳＰ−２５（Ｒａｕｃｈｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉ ｏｌ ．（１９９７）、２７３（１．Ｐｔ．２）、Ｆ９−Ｆ１７；Ｓｃｈｏｂｅｒ ら、Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．（１９９７）、４３４（３）、２９２−２ ９９；Ｏｈｎｏら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、Ｓｕｐｐｌ．（１９９６）、５７ 、Ｓ１１０−Ｓ１１８）；ヒトＨｅＬａ細胞内のＨＳＰ−７０（Ｈａｔａｙａｍ ａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９９７）、２０（６）、６０５− ６１２）；およびサッカロミセス エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓ ｐ ．）における熱耐性（Ｐｉｐｅｒ，Ｐ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒ ｅｖ． （１９９３）、１１（４）、３３９−５６）は全て浸透性ストレスの増加 により誘導されることが示されている。同様に、原核生物種では浸透圧は熱ショ ック蛋白質および他のストレス誘導性蛋白質の発現に影響を及ぼすことが知られ ている。例えば、細菌性グローバルレギュレーター（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌ ａｔｏｒ）シグマが大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）における遺伝子発現の浸透調節に おいて示唆されており（Ｈｅｎｇｇｅ−Ａｒｏｎｉｓ，Ｒ，、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ ．（１９９６）、２１（５）、８８７−８９３；Ｃｈｕａｎｇら、Ｊ ．Ｂａｃｔｅｒ１ｏｌ ．（１９９３）、１７５（７）、２０２６−３６）、そし てＵｓｐＡユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ストレス遺伝子は浸透ストレス により誘導可能であることが示されている（Ａｌｅ ｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）、１１（６）、１ ０５９−７１）。 刊行物により、ストレス遺伝子は浸透ストレスにより容易に活性化されること が教示されるが（少量での細胞培養の結果）、本方法は非常に少量のアッセイに おける使用に適用されている。ＬＵＸ遺伝子複合体を連結させた細菌性ストレス プロモーターを含むディテクター生物体を利用する、細胞が約１μｌから約１０ μｌの培地中に懸濁されるスクリーニングが開発されており、この場合約２μｌ から８μｌの培地が好ましい。細胞はこれらの条件下では約６０〜１２０分間安 定であり、ストレスを示す高いベースライン発光を発することはない。これらの 細胞は複数の環境傷害物を検出するためにこれらの容積で用いられてよい。好ましい態様の記述 本発明の方法は、傷害物の存在に応答する生物発光の変化を示すことができる ディテクター生物体を用いることにより環境傷害物の存在について試料をモニタ ーすることを考慮して設計される。形質転換株ＴＶ１０６０、ＴＶ１０６１、Ｔ Ｖ１０７６、ＷＭ１０２１、ＷＭ１２０２、ＷＭ１３０２、およびＷＭ１０２６ は全て適切であり、そしてディテクター生物体としての使用に適する。好ましい ベクターの場合と同様に、これらのディテクター生物体は、環境傷害物を検出す る目的のために作製された合計のディテクター生物体の一サンプルに過ぎない。 しかしながら、それらの構築に用いられる方法および材料は記載される他の全て のベクターの代表的なものであることは分子生物学の当業者には容易に明らかな ことであろう。他の好ましい形質転換ディテクター生物体が実施例１０の表Ｖに 列挙される。至適成長条件下では発光のベースライン レベルはディテクター生物体により産生される。活発に成長している培養物への 環境傷害物の導入によりストレス誘導性プロモーターが誘導され、これは次にはｌｕｘ 複合体を活性化し、ディテクター生物体から発せられる光の量を増加させ るであろう。発せられた光の量は傷害物のレベルに相関する。本発明の目的のた めにはディテクター生物体が、傷害物を含むことが疑われる試料に暴露される直 前に対数期で活発に、そして約１０クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ）から ５０クレット単位の細胞密度（この場合、約２０クレット単位が最も好ましい） で成長する場合が最も好ましい。光発光は、制約される訳ではないが、肉眼分析 、写真フィルムに対する暴露、シンチレーション計数、もしくは光電子増倍管を 取り込むいずれかの装置（この場合、Ｄｙｎａ Ｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎにより産生されるものに類似するルミノメーターが最も好ましい）を含む光 子を検出することができる多種多様な方法によりモニターされてよい。 ある態様ではエタノールの様々な濃度が、ストレスをディテクター生物体に適 用するのに用いられた。図４に見られるように、ＴＶ１０６０培養物（ｇｒｐＥ プロモーターｌｕｘ融合物を含む）中の４％の最終濃度のエタノールはストレス 後１０００秒目に劇的な発光増加をもたらした。図５におけるのと同様に、エタ ノール濃度の増加は、ストレスを受けた培養物からの発光をそれに対応するよう に増加させた。追加的には有機汚染物質であるアトラジン、ペンタクロロフェノ ール（ＰＣＰ）、フェノール、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ） 、ベンゼン、メタノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、アト ラジン、トルエン、ジメチルスルホキシド、アセテート、プロピオネー ト、ピューロマシシン、２，４−ジクロロ−アナリン、プロパノール、ブタノー ル、イソプロパノール、塩化メチレン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、アクリルアミ ド、メチルビオロゲン、ヒドロキサム酸セリン、メナジオン、臭化エチジウム、 マイトマイシンＣ、およびキシレン、ならびに重金属の塩である硫酸銅、硝酸鉛 、塩化カドミウム、および塩化水銀、銅が本方法により検出された。更に検出さ れたのは、高浸透力（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）、紫外線（Ｕ．Ｖ． ）光照射、酸化剤である過酸化水素、ならびに限定されたリン酸塩、乏しい窒素 源、および乏しい炭素源よりなる成長条件であった。化学物質は適切な溶媒中に 溶解し、そしてそれを検査のために細胞培養物に添加するか、またはそれらの可 溶性特性に依存して成長培地に直接添加するかのいずれかであった。ベンゼン、 エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、塩化 メチレン、ジメチルスルホキシド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、フェノール、ト ルエン、およびキシレンはＬＢ培地に直接添加する一方で、２−ニトロフェノー ル、４−ニトロフェノール、およびアトラジンは最初にメタノールに溶解してか らＬＢ培地で希釈した。硫酸銅、硝酸鉛、塩化カドミウム、塩化水銀、塩化ナト リウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、過酸化水素、ピューロマイ シン、メチルビオロゲン、アクリルアミド、メナジオン、臭化エチジウム、ヒド ロキサム酸セリン、およびマイトマイシンＣは、まず水に溶解してからＬＢ培地 で希釈した。ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、２，４−ジクロロフェノキシ 酢酸、および２，４−ジクロロアナリンはまずエタノールに溶解し、そして最後 に検査のためにＬＢ培地に希釈した。全ての場合において、エタノールもしくは メタノールのいずれかの最終濃 度、または水での培地のわずかながらの稀釈は有意な応答を誘導しないようなも のであった。 図７ならびに表ＩＩおよびＩＩＩに示されるデータは本検出系の２つの側面を 示す。第一に、有機および無機汚染物質は即時法により低濃度で検出することが でき、そして第二に、系の感度はｔｏｌＣ-突然変異体を含む宿主ディテクター 生物体の使用により増強され得る。 図７は、ペンタクロロフェノールの存在に対する、ｔｏｌＣ-突然変異を含む もしくは含まないＧｒｐＥ．Ｌｕｘ．５融合物で形質転換させたディテクター生 物体の相対的感受性を比較している。データから理解できるようにｔｏｌＣ-突 然変異体は、ｔｏｌＣ +親株と比較するとＰＣＰの存在に対して有意に高い感受 性を示す。表ＩＩＩ（実施例９）は、ＰＣＰ、２，４−Ｄ、フェノール、アトラ ジン、エタノール、メタノール、２−ニトロフェノール、および硫酸銅の存在に 対する、ｔｏｌＣ -突然変異を含むおよび含まないｐＹＲ００２融合物で形質転 換させたディテクター融合物の相対的感受性を比較するデータを含む。同様に、 ＰＣＰおよび２，４−ＤはｔｏｌＣ-突然変異体により優先的に検出されること が明らかである。ｔｏｌＣ-宿主は、ＰＣＰおよび２，４−Ｄよりも程度は下が るもののフェノールに対して一層高い感受性を示すようでもある。ｔｏｌＣ-突 然変異は、例えば硫酸銅のような非有機混入物に対するディテクター生物体の感 受性にはほとんど影響を及ぼさないように思われ、このことはｔｏｌＣ -突然変 異が疎水性化合物に対してのみ宿主細胞包膜の透過性を増加させることが知られ ているという事実と照らし合わせると予期されることである。 場合によっては本発明の方法を用いて、ディテクター生物体により産 生されるベースライン発行の減少を検出することにより傷害物の致死レベルが検 出されてよい。傷害物の致死レベルは、中心的代謝もしくはディテクター生物体 のいずれかのｌｕｘ蛋白質機能のいずれかを妨害し、これはその培養物から発せ られる光の減少により示される。 図６ａおよび６ｂは、様々な濃度のエタノールのストレスに対する形質転換体 ＷＭ１０２１およびＷＭ１０２６（ｄｎａＫプロモーターｌｕｘ融合物を含む） の感受性を説明する。１％〜４％に変化するエタノールの致死下濃度では光発光 はＴＶ１０６０培養物に類似の様式で増加したことを記載することは興味深い。 それとは対照的に、８％〜１６％の範囲のエタノールの致死濃度はディテクター 培養物からの光発光の減少をもたらした。同様に、高濃度のＰＣＰはやはり、株 ＴＶ１０７６における光出力の減少をもたらした（図７）。従って、本発明の方 法は二−モジューラー関数（ｂｉ−ｍｏｄｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のもの であり得ることが明らかである。ある様式では致死下レベルの傷害物の検出は、 ストレス誘導性プロモーターの誘導のメカニズム、およびその後に生じるディテ クター生物体からの光産生の増加を通して可能となる。別の様式では、中心的細 胞代謝を妨害することができる傷害物も検出することができ、なぜなら生物発光 はエネルギーと還元力とに依存する現象であり、そして中心的代謝のいずれかの 妨害はベースライン発光の現象をもたらすであろうためである。それに加え、ス トレスプロモーター−ｌｕｘ融合物からの光産生の誘導は光出力の減少をもたら すのに必要とされる濃度と比較すると、それを下回る濃度の特別な汚染物質で生 じることが明らかである。 実施例 材料および方法 制限酵素消化、リン酸化、連結、および形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．、に記載される要領で実施し た。キアーゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．社）を用いる アガロースゲルからの制限断片の単離は製造業者により指定される要領で実施し た。ストラタクリーン（Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、 ＬａＪｏｌａ、ＣＡ）およびゲネクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０ １）を用いて制限消化物から酵素を、製造業者により指定される要領で除去した 。略語の意味は以下のとうりである：「ｈ」は時間（一時間もしくは複数時間） を意味し、「ｍｉｎ」は分（一分もしくは複数分）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（ 一秒もしくは複数秒）を意味し、そして「ｄ」は日（一日もしくは複数日）を意 味する。実施例１ プラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５の構築およびＲＦ Ｍ４４３の形質転換 これらのプラスミドを構築する計画の概要が図１に示される。図１は、構築の 作業を詳しく説明することを意味するが、しかしながらＤＮＡ構築物は尺度を表 すようには描かれていない。 プラスミドｐＧｒｏＥ４はｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ ．２７−４９４９−０１）に由来し、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）ストレス遺伝子ｇｒｐＥをそのプロモータ ー配列を含む状態で含む。ｐＧｒｐＥ４プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｂｕ Ｉで消化し、そしてｇｒｐＥプロモーターおよび構造遺伝子に相当する１ ．１ｋｂの断片をその後のアガロースゲル電気泳動で単離した（図１）。ｇｒｐ Ｅ プロモーターでは便宜上、５’末端にＥｃｏＲＩ部位が、そして３’末端にＰ ｖｕ ＩＩ部位が結合している。単離された断片をさらに制限酵素ＰｖｕＩＩで消 化し、構造遺伝子からプロモーター領域を分離した（図１）。ＥｃｏＲＩリンカ ー断片（Ｓｔｒａｇｅｎｅ社、Ｃａｔａｌｏｇ ＃９０１０２７）をリン酸化し 、そしてその後にＰｖｕＩＩ消化の産物に連結させて、プロモーター上の３’Ｐ ｖｕ ＩＩ部位をＥｃｏＲＩ部位で置換した。ＨａｅＩＩＩでの更なる消化により 一連の断片がもたらされ、その内の一つは５’末端にＨａｅＩＩＩが、そして３ ’末端にＥｃｏＲＩが結合したｇｒｐＥプロモーターを含む（図１）。 プラスミドｐＵＣＤ６１５（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９（１１） ｐｐ ５１０１−５１２、（１９８７））は、カナマイシンおよびアンピリシン耐性の ための遺伝子を含み、そしてｌｕｘの開始地点の上流の多重クローニング部位を 含むプロモーター無しのｌｕｘ遺伝子オペロンを含む１７．６ｋｂのプラスミド である（図１）。ｐＵＣＤ６１５をまず制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消 化してプラスミドの開鎖を行い、そしてその後にはＨａｅＩＩＩ消化からのＤＮ Ａ断片との連結を行う（図１）。 活性なｇｒｐＥ−ｌｕｘ融合物をスクリーニングする目的で、連結させたＤＮ Ａを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 ）を、標準的ＣａＣｌ2形質転換プロトコールにより 形質転換させ、そしてカナマイシン耐性を用いてプラスミドの存在についてスク リーニングした。コロニーを、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地 上で、格子様式（ｇｒｉｄｄｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）で、３７℃で一晩成長させ 、そして生物発光のために更にスクリーニングして、どの形質転換体がｐＵＣＤ ６１５のｌｕｘ遺伝子に融合されたプロモーター配列を含むかを決定した。生物 発光のスクリーニングは格子状態のコロニー（ｇｒｉｄｄｅｄ ｃｏｌｏｎｙ） をＸ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に 周囲の温度で暴露し、そして現像したフィルムを肉眼で分析することにより実施 した。予想されたプラスミドによる形質転換の確認は更には、制限断片の存在お よびサイズについて、制限消化の後に光を生じる細胞からのプラスミドＤＮＡの アガロースゲル電気泳動分析によっても得られた。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ 、およびＳａｌＩ消化からの制限断片により、プラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ．３ およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５内のｇｒｐＥプロモーターの存在および方向が確認 された。 プラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ． ３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５を大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）宿主株ＲＦＭ４４３内への形質転換により移入させて大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）株ＴＶ１０６０およびＴＶ１０６１を各々取得した。大腸菌ＲＦ Ｍ４４３はもともとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１０２に由来し、このＷ３１ ０２についてはＢ．ＢａｃｈｍａｎｎによりＥ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ． ｅｔ．ａｌ． Ｅｄｓ．、ｐｐ １１９０−１２２０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏ ｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７）） 中に全て記載されている。実施例２ プラスミドｐＲＹ００６の構築およびＲＦＭ４４３の形質転換 ｐＲＹ００６を構築するのに用いられる計画の概要が図２に示される。図２は 構築の作業を詳しく説明するが、しかしながらＤＮＡ構築物は尺度を表すように は描かれていない。 ｄｎａＫプロモーターを含むＤＮＡはラムダ（Ｌａｍｂｄａ）ファージ９Ｅ４ （Ｋｏｈａｒａ，Ｙら；Ｃｅｌｌ ５０、４９５−５０８、１９８７）から、マ ジックラムダプレップ（Ｍａｇｉｃ ＬａｍｂｄａＰｒｅｐ．）を用い、製造業 者から示唆されるプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏ ｎ、ＷＩ）に従い取得された。ファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏ ＲＩで消化した。数々のＤＮＡ断片がこの処理により放出され、それらにはＣ ｏｗｉｎｇら（ＰＮＡＳ ８２、２６７９−２６８３、１９８５）により記載さ れるｄｎａＫプロモーター領域を包含する３．７ＫｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ 制限断片、および５’からこの領域までの約３．０ｋｂのＤＮＡ、およびＤｎａ Ｋ蛋白質のアミノ末端をコードするプロモーター領域の３’側７００ｂｐが含ま れる。消化されたＤＮＡを、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し てあるｐＵＣＤ６１５に連結させた（図２）。得られるプラスミド構築物を用い て大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５−α（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ． ８２６３５ａ）を形質転換さ せ、そして形質転換させた細菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培 地上に３７ ℃で一晩おいた。得られるコロニーを最初には実施例１に記載される要領でＸ− ＯＭＡＴ ＡＲフィルムへの暴露により生物発光についてスクリーニングした。 所望されるプラスミド構築物の存在を、形質転換させた細菌からのプラスミドＤ ＮＡの制限酵素分析により確認した。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでの 消化によりアガロースゲル電気泳動後には３．７ｋｂの制限断片が得られ、所望 される構築物の存在を確認した。このプラスミドをｐＲＹ００６と表示した。ｐ ＲＹ００６を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＲＦＭ４４３内に形質転換により導入 して、株ＷＭ１０２６を作製した。 実施例３ プラスミドｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２の構築およびＲＦＭ４４３ の形質転換 このプラスミドを構築するのに用いられた計画の概要が図３に示される。図３ は構築の作業を詳しく説明することを意味し；しかしながらＤＮＡ構築物は尺度 を表すようには描かれていない。 ｄｎａＫプロモーター（Ｃｏｗｉｎｇら、ＰＮＡＳ ８２、２６７９−２６８ ３、１９８５により記載される）を含むＤＮＡはラムダ（Ｌａｍｂｄａ）ファー ジ９Ｅ４（Ｋｏｈａｒａ，Ｙら、Ｃｅｌｌ ５０，４９５−５０８、１９８７） から、マジックラムダプレップ（Ｍａｇｉｃ Ｌａｍｂｄａ Ｐｒｅｐ．）（Ｐ ｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、製造業者から示 唆されるプロトコールに従い取得された。ｄｎａＫプロモーター領域のＰＣＲ増 幅は以下の増幅プライマーを用いて達成した： 上側：5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3' （配列番号１） 下側：5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3' （配列番号２） ＤＮＡ増幅は製造業者により記載される要領で実施された（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社、 Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）。 試薬の濃度は： １Ｘ緩衝液 ２００ｕＭ ｄＡＴＰ ２００ｕＭ ｄＣＴＰ ２００Ｕｍ ｄＧＴＰ ２００ｕＭ ｄＴＴＰ ２．５単位のアンプリタックポリメラーゼ(Amplitaq Polymerase) （Perkin-Elmer Cetus社） １００ｐＭ上側プライマー １００ｐＭ下側プライマー １ｎｇ ９Ｅ４ファージＤＮＡ鋳型 １００μＬになるまでのｄＨ2Ｏ であった。 この反応は、以下の要領でプログラムされるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ｃｅ ｔｕｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００サーマルサイクラー を用いて実施した： 溶解： ９４℃で１０秒間 アニーリング ５０℃で１０秒間 伸長： ７２℃で１５秒間 サイクル数 ３０ 得られる増幅産物は長さが２０７塩基対であり、そしてＧｅｎｅＢａ ｎｋに寄託してあるｄｎａＫプロモーター領域をコードする１８２ｂｐセグメン ト全体（受託番号１０４２０；場所 ＥＣＯＤＮＡＫ）、ならびに短い５’およ び３’フランク配列を含む。ＰＣＲ−増幅させたＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩお よびＥｃｏＲＩで消化し、そして予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消 化してあるｐＵＣＤ６１５に連結させた（図３）。得られるプラスミド構築物を 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＨ５−α（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｃａｔ． Ｎｏ． ８２６３５ａ）内に標準的形質転換プ ロトコールにより導入させ、そして細菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含 むＬＢ培地上におき、そして３７℃で一晩成長させた。得られるコロニーを最初 には実施例１に記載される要領でＸ−線フィルムへの暴露により生物発光につい てスクリーニングした。２つのコロニーを形質転換分析用に拾いあげ、そして所 望されるプラスミド構築物の存在を、形質転換させた細菌からのプラスミドＤＮ Ａの制限酵素分析により確認した。アガロースゲル電気得移動後の１９３ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片の出現により所望される構築物の存在が確認さ れた。これらのプラスミドをｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２と表示した。ｐＲ Ｙ００１およびｐＲＹ００２は異なる形質転換コロニーであるものの、これらは 制限酵素マッピング上では識別されず、そして本発明の目的では同等と見なされ る。ｐＲＹ００１およびｐＲＹ００２を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＲＦＭ４４ ３内に形質転換により導入して、各々株ＷＭ１０２１およびＷＭ１２０２を作製 した。 実施例４ ４％エタノールでの生物発光のストレス誘導 株ＴＶ１０６０を、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中３７℃ で、クレット（Ｋｌｅｔｔ）５６（＃６６赤色フィルターを装着したクレット− サムエルソン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計上で測定した）に達す るまで成長させ、Ｋｌｅｔｔ ５６に達した時点で同一培地中に周囲の温度で１ ：１１に希釈し、そして２０クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ）の密度に達 するまで周囲の温度で３時間成長させた。１００μＬの細胞をマイクロタイター プレートのウエル内に入れ、そしてその後には１０μＬ ４０％エタノール（実 験用、最終濃度４％エタノール）もしくは１０μＬの蒸留水（対照）のいずれか の添加を行った。このプレートを直ぐさまルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａ ｎ社、Ｆｉｎｌａｎｄ）内に入れ、そして生物発光をＲＬＵ対時間で測定した。 図４に見られるように、４％エタノールでのストレスを受けた、形質転換させた ＴＶ１０６０培養物からの光発光はストレス後１０００秒目に劇的に増加して１ ３０ＲＬＵの最高レベルに達した。対照培養物への蒸留水の添加はベースライン 発光に何の変化ももたらさなかった（図４）。 実施例５ 様々な濃度のエタノールでの生物発光のストレス誘導 株ＴＶ１０６０を、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩 成長させ、そして同一の培地中で１：１００に希釈し、そしてクレット（Ｋｌｅ ｔｔ）２０に達するまで室温で成長させた。１００μＬの細胞を、１００μＬの 、２％、４％、８％、もしくは１６％のいずれか（各々、１％、２％、４％、お よび８％の最終濃度のエタノールをもたらす、実験用）、または１００μＬの同 一培地（対照）を含むマイ クロタイタープレートのウエルに入れた。このプレートを個別にルミノメーター 、モデルＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｃｈ ａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）内に入れ、そして生物発光をＲＬＵ対時間として測定し た。図５に見られるように、エタノールでのストレスを受けた、形質転換させた ＴＶ１０６０培養物からの光発光は、エタノールの増加濃度に対応する発光の増 加を示した。実施例４と同様に、発光の増加はストレス後１０００秒目に観察さ れた。対照培養物はベースライン発光には変化を生じなかった（図５）。最高光 発光はストレス後３０００秒目に８％エタノールで観察され、対照と比較すると 光産生の２６３倍の増加が示された。より低いレベルのエタノールストレスでは 、それに対応する低いレベルの光出力がもたらされ、この場合、４％、２％、お よび１％のエタノール濃度により、対照と比較すると各々９６、１３．５、およ び３．９倍の光発光増加がもたらされた。 実施例６ 株ＷＭ１０２１およびＷＭ１０２６での生物発光のストレス誘導 株ＷＭ１０２１およびＷＭ１０２６は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含 むＬＢ培地中３７℃で約１８時間成長させた。その後に培養物を新鮮な培地で１ ：５０に希釈し、そして周囲の温度で約３時間成長させた。細胞が２０クレット 単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ）の密度に達した際に、８０μＬの細胞懸濁物を、 様々な濃度のエタノール２０μＬを含むマイクロタイタープレートのウエルに入 れ、そしてそのプレートを直ぐさまＤｙｎａｔｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ＭＬ ３０ ００ルミノメーター内に入れた。エタノールは最終濃度１６％、８％、４％、２ ％、および１％で存在し、そして脱イオン水対照を含んでいた。ルミノメーター は、２分間隔で発光を測定するように予めプログラムしておいた。図６ａおよび ６ｂは、各々ＷＭ１０２１およびＷＭ１０２６によりエタノールの様々な濃度に 応答して産生されて生じる発光データを示す。図６ａに示されるように、発光は 、１％、２％、および４％エタノールという致死下濃度を与えられた培養物では ストレス後１０００秒目に急激に増加した。一層高目の８％および１６％という 致死エタノール濃度では発光がベスライン以下に減少するのが観察され、これに より細胞死が示唆された。図６ｂは、宿主細胞ＷＭ１０２６を用いる類似の結果 を示す。従って光は致死下レベルのエタノールに応答して増加する一方で、光出 力は一層高い致死レベルで減少する。この実験により、致死したおよび致死レベ ルの両方の傷害物の存在を検出する本発明の能力が示される。 実施例７ ｐＧｒｐＥ．Ｌｕｘ．５で形質転換させたｔｏｌＣ+およびｔｏｌＣ-株における ペンタクロロフェノールによる生物発光のストレス誘導の比較 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ディテクター生物体に有機化合物に対する高い透過 性を提供する目的では、ｔｏｌＣ- 突然変異体ＤＥ１１２をＲＦＭ４４３から構 築した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＥ１１２はｔｏｌＣ遺伝子座での突然変 異を除外しては株ＲＦＭ４４３とは同種同系である。これはファージＰ１により 媒介される形質導入により、ドナーとして株ＣＳ１５６２（ｔｏｌＣ：：ｍｉｎ ｉＴｎ１０）およびレシピエントとして株ＲＦＭ４４３上で成長させた溶解物を 用いて構築した。ＣＳ１５６２（ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０）はＡｕｓｔｉ ｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２、５３１２、（１９９０）に完全に 記載されており、そして形質導入手順はＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、（１９７２ ） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ２０１−２０５、に記 載されている。ＲＦＭ４４３はもともとはＷ３１０２から取得され、このＷ３１ ０２は、Ｂ．Ｂａｃｈｍａｎｎにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｎｉｅｄｈａｒｄら、Ｅｄｓ．ｐｐ１１９０−１２２０ 、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、（１９８７））に完全に記載されている。得られるテ トラサィクリン耐性組換え体は疎水性化合物であるクリスタルバイッレットに対 する過敏性反応についてスクリーニングした。 ＤＥ１１２およびＲＦＭ４４３はｔｏｌＣ遺伝子座を除外すると同種同系であ る。両株とも実施例１に記載される要領でプラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ．５で形 質転換し、そして各々ＴＶ１０７６（ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０）およびＴ Ｖ１０６１（ｔｏｌＣ+ ）と表示した。 両方の株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）を含む ＬＢ培地中、２５℃で一晩成長させた。この一晩培養物を、カナマイシン（Ｋａ ｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＬＢ培地内に１：５０で希 釈し、そしてこれを２５℃で４時間、震盪しながらインキュベートした。細胞密 度はクレットーサマーソン（Ｋｅｌｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計で決定し た。両方の株が２５と２９クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔｓ）の間の値に 達した際に、細胞を検査用に用いた。 各培養物からの細胞（５０μＬ）を、マイクロタイタープレートのウエル内の カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）および様々な濃度の ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）を含むＬＢ培地に各ウエル中の最終容量が１ ００μＬとなるように添加した。 エタノール中のＰＣＰの１００ｍｇ／ｍＬ保存溶液を用いて、カナマイシン（ Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中のＰＣＰの７５μ ｇ／ｍＬ溶液を作成した。この溶液（５０μＬ）をマイクロタイタープレートの ウエル中に入れ、そして一連の２倍希釈物をこれらから作成した。等量の細胞を 添加した際には最高エタノール濃度は０．０３７％となり、この濃度はこれらの 細胞から有意な応答を誘導しないことが知られている。 光測定値は周期的間隔を空け、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ ３０００マイクロタ イタープレートルミノメーター中２５℃で測定し、そしてそのデータを、誘導率 の関数としてのＰＣＰの濃度としてプロットしてある図７のグラフに示す。誘導 率は、ＰＣＰ非存在下での光出力（ＲＬＵ）で除算されるＰＣＰの存在下での光 出力（ＲＬＵ）として特定される。 図７は、添加後６０分目の誘導率対ＰＣＰ用量を示す。低用量ではｔｏｌＣ+ 株ＴＶ１０６１からの光出力の誘導なし（比率＝１）が観察された。しかしなが ら、これら低めの用量ではｔｏｌＣ- 株ＴＶ１０７６は光出力の有意な増加を見 せた。また一層高目の用量ではｔｏｌＣ+ 株の誘導が観察され、そしてＰＣＰの 毒性効果（光出力の喪失）がｔｏｌＣ- 株で観察された。従ってｔｏｌＣ- 株は、ｔｏｌＣ+ 株において検出され得るものよりも、この化合物の一層低い濃度を検 出するのに有用である。同様に、他の疎水性化合物も、ｇｒｐＥ：：ｌｕｘ融合 物を含む プラスミドとのこの宿主株の組み合わせにより一層容易に検出されるであろう。 実施例８ ｐＧｒｐＥ．Ｌｕｘ．５で形質転換させたｔｏｌＣ-およびｔｏｌＣ+株 の有機および無機汚染物質による生物発光のストレス誘導 ＴＶ１０６１およびＴＶ１０７６を先に記載される要領で工学的に作成した。 両方の株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）を含むＬ Ｂ培地中、２５℃で一晩成長させた。この一晩培養物を、カナマイシン（Ｋａｎ ａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＬＢ培地内に４０および１０ ０倍に希釈し、そしてこれを２５℃で４時間、震盪しながらインキュベートした 。細胞密度はクレット−サマーソン（Ｋｅｌｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計 で決定した。両方の株が１５と３０クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔｓ）の 間の値に達した際に、細胞を検査用に用いた。 各培養物からの細胞（５０μＬ）を、マイクロタイタープレートのウエル内の 、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）、および様々な濃 度のベンゼン、エタノール、メタノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフ ェノール、ＰＣＰ、フェノール、トルエン、およびキシレンを含むＬＢ培地に、 各ウエル中の最終容量が１００μＬとなるように添加した。対照ウエルは、これ らの検査用化合物を溶解するのに用いられた溶媒の適切な容量を含んだ。 ベンゼン、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタ ノール、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、フ ェノール、トルエン、およびキシレンを、カナマイシ ン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地に直接添加した 。２−ニトロフェノー（１３６ｍｇ／ｍＬ）および４−ニトロフェノール（１１ ２ｍｇ／ｍｌ）のメタノール中の保存溶液を、検査される濃度にまで、カナマイ シン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地内で希釈した 。メタノールの最終濃度は、これらの細胞からの有意な応答を誘導しないような ものであった。ＰＣＰのエタノール中の保存溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、検査 される濃度にまで、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ） を含むＬＢ培地内で希釈した。エタノールの最終濃度は、それが細胞からの有意 な応答を誘導しないようなものであった。硫酸銅（２５０ｍＭ）、硝酸鉛（１０ ０ｍＭ）、塩化水銀（１００ｍＭ）、塩化ナトリウム（２０％）、酢酸ナトリウ ム（２Ｍ）、プロピオン酸ナトリウム（２Ｍ）、過酸化水素（３０％）、ピュー ロマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）、メチルビオロゲン（２００ｍｇ／ｍＬ）、およ びアクリルアミド（１Ｍ）の水中の保存溶液を、検査する濃度にまで、カナマイ シン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中に稀釈した 。塩化カドミウム（１００ｍＭ）の水中の保存溶液を、検査する濃度にまで、カ ナマイシンを含まないＬＢ培地中に希釈した。 光測定値は２時間の周期にわたり、周期的な間隔を空けて測定し、このデータ を表ＩＩに示す。全ての発光測定値は、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ ３０００マイ クロタイタープレートルミノメーター中、２５℃で測定した。 表ＩＩ中のデータは検査化合物への暴露後１時間目に取られた測定値を表し、 そして最大発光を与える検査化合物の濃度として表示される。 データは更にはベースライン発光に対して、誘導された発光が何倍増加したかも 示す。＊ 検査した最大濃度 表ＩＩから、多種多様の化学的化合物および環境条件が、プラスミドｐＧｒｐ ＥＬｕｘ．５を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株からの生物発光を誘導するであ ろうことが明らかとなる。従って、ｔｏｌＣ- 突然変異を含むディテクター生物 体が、幾つかの環境傷害物にとっての好ましい宿主であることが結論づけられて よい。 実施例９ ｐＲＹ００２で形質転換させたｔｏｌＣ+およびｔｏｌＣ-株における有機および 無機汚染物質による生物発光のストレス誘導 ＤＥ１１２（ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０）は実施例７に記載される要領で 工学的に作成し、そしてＲＦＭ４４３の源は既に論議されている。両株をプラス ミドｐＲＹ００２で、実施例３に記載される標準法により形質転換し、そして各 々ＷＭ１３０２（ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０）およびＷＭ１２０２（ｔｏｌ Ｃ＋ ）と表示した。 両株を一晩、２５℃で、５０μｇ／ｍＬでのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉ ｎ）を含むＬＢ培地中で成長させた。この一晩培養物を、カナマイシン（Ｋａｎ ａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＬＢ培地中に１：１００に希釈 し、そして２５℃で４時間震盪しながらインキュベートした。細胞密度はクレッ ト−サマーソン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計で計測した。両株の 測定値が２８クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ）になった際に、細胞を検査 に使用した。 各培養物からの細胞（５０μＬ）を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（ ５０μｇ／ｍＬ）、ならびに様々な濃度のＰＣＰ、２，４−ジクロロフェノキシ 酢酸（２，４−Ｄ）、フェノール、エタノール、メタノール、２−ニトロフェノ ール、アトラジン、および硫酸銅を含むＬＢ 培地を含むマイクロタイタープレートのウエルに、各ウエルの最終容量が１００ μＬになるように添加した。対照ウエルは検査化合物を溶解するのに用いた溶媒 の適切な容量を含んでいた。 化学物質は実施例８に本質的には記載される要領で検査用に調製した。硫酸銅 は培養培地に直接添加し、そしてアタラジンはまずメタノールに溶解してから細 胞培養物に添加した。アタラジンを例外として、全ての溶媒は、系のストレス応 答を観察するのに必要とされるレベル以下のレベルで添加した。アタラジン試料 中に存在するメタノールのレベルは低いながらも検出可能な応答を誘導し：表Ｉ ＩＩにおけるデータは、単独メタノール等量で取得される応答以上で検出される 正味の応答である。 光測定値は２時間の期間にわたり、周期的間隔を空けて測定し、そしてデータ を表ＩＩＩに示す。全ての発光測定値はＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ ３０００マイ クロタイタープレートルミノメーター中、２５℃で測定した。 表ＩＩＩのデータは検査化合物への暴露後１時間目に取られた測定値を示し、 そして最大発光を与える検査化合物の濃度として表示される。データは、誘導さ れる生物発光がベースライン生物発光の何倍増加にあたるかを示してもいる。 ＊ 検査した最大濃度 ＊＊ 「Ｃｏｎｃ．ｆｏｒ Ｍａｘ．Ｉｎｄ．」は、最大誘導のための濃度を意 味する ＊＊＊ 「Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒ．」は、ベースライン生物発光の何倍の増加であ るかを意味する 表ＩＩのデータから、幾つかの種類の化学的化合物は、プラスミドｐＲＹ００ ２を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株からの生物発光を誘導するであろうことが 明らかとなる。ｔｏｌＣ- およびｔｏｌＣ+ 宿主の両方ともが疎水性が低い化合物 に対して類似の感受性を示した。ｔｏｌＣ- 突然変異を含むディテクター生物体 は幾つかの環境傷害物にとっての好ましい宿主であると結論づけられてよい。 実施例１０ ｌｕｘオペロンに融合させたプロモータ−ｌｏｎ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｋａｔ Ｇ、ｍｉＦ、ｕｓｐＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｕＡの構築 追加的プラスミドを構築するための作業は、異なるプライマーおよび鋳型がＰ ＣＲ反応に用いられ、そしてＰＣＲ反応には４０周期が用いられたことを除外す ると、図３に詳しく説明されそして実施例３に記載されるｐＲＹ００１およびｐ ＲＹ００２の構築法と同一である。これらのプライマーおよび鋳型は以下の表Ｉ Ｖに列挙される。 a プロモーター配列はＧｅｎｂａｎｋで入手することができる。b 上側のプライマーの下線を施した領域はＢａｍＨＩ制限酵素開裂部位である 。３’〜制限部位は所望されるプロモーターの上流の領域に相補的な配列である （一般的には１８ヌクレオチド）。c 下側のプライマーの下線を施した領域はＥｃｏＲＩ制限酵素開裂部位である 。３’〜制限部位は所望されるプロモーターの下流の領域に相補的な配列である （一般的には１８ヌクレオチド）。d ＰＣＲ反応のための鋳型は染色体ＤＮＡ調製物（Ｃ、Ｚｙｓｋｉｎｄ ＆ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２ 、に従って調製される）か、もしくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ１２上で成長 させ、その受託番号により示される[Ｂｏｕｆｆａｒｄら、ＣＡＢＩＯＳ ８： ５６３−６５７(１９９２)]大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）染色体［Ｋｏｈａｒａら 、Ｃｅｌｌ ５０；４９５−５０８（１９８７）］を網羅する特別なλ形質導入 用ファージのオーバラップセット（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｔ）の内の一 つからの水で再懸濁させたプラークのいずれかであった。プラークからの増幅は Ｂｅｒｇ［Ｋｉｒｓｈｎａｎ，Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９９ ２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：１１５３］の方法 に従って実施された一方で、染色体調製物からの増幅は１μｌの染色体ＤＮＡ調 製物を鋳型として用いた点でＢｅｒｇのものとは異なっていた。e ＰＣＲ産物の計算されたサイズ。アガロースゲル電気泳動分析により産物の サイズを確認した。 表ＩＶに列挙される全てのプロモーター配列は公開されており、そしてＧｅｎＢ ａｎｋから入手することができる。上側のプライマーの下線を施した領域はＢａ ｍ ＨＩ制限酵素開裂部位である。３’〜制限部位は所望されるプロモーターの上 流の領域に相補的な配列である（一般的には１８ヌクレオチド）。下側のプライ マーの下線を施した領域はＥｃｏＲＩ制限酵素開裂部位である。３’〜制限部位 は所望されるプロモーターの上流の領域に相補的な配列である（一般的には１８ ヌクレオチド）。ＰＣＲ反応のための鋳型は染色体ＤＮＡ調製物（Ｃ、Ｚｙｓｋ ｉｎｄ ＆ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ 、１９９２、に従って調製される）か、もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ 上で成長させ、その受託番号により示される（Ｂｏｕｆｆａｒｄら、ＣＡＢＩＯ Ｓ ８：５６３−５６７（１９９２））大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）染色体（Ｋｏ ｈａｒａら、Ｃｅｌｌ ５０；４９５−５０８（１９８７））を網羅する特別な λ形質導入用ファージのオーバラップセット（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｔ ）からの水で再懸濁させたプラークかのいずれかであった。プラークからの増幅 はＢｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９、１１５ ３（１９９１）、の方法により実施した。染色体調製物からの増幅は、１μＬの 染色体ＤＮＡ調製物を鋳型として用いたという点でＢｅｒｇのものとは異なって いた。ＰＣＲ産物の計算されたサイズはアガロースゲル電気泳動により確認した 。 得られるプラスミドの各々を３つの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主株：ＲＦＭ ４４３、ＤＥ１１２、およびＷ３１１０の中にいれた。プラス ミドおよび形質転換させた宿主細胞を以下の表Ｖに列挙する。 プロモーター−レポーター融合物は、既知の感受性のプロモーターに適切な多 種多様の環境傷害物を用いて、形質転換させた宿主細胞中で検査した。プロモー ターおよびそれらに対応する誘導性傷害物を表ＶＩにまとめてある。 b 多形質発現性調節応答を引き起こす。c 生物発光応答の増加を開始させる化学誘導d 正の調節回路による生物発光発現を妨げる遺伝子構築物。e エタノールは熱ショック応答の強力な誘導物である［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ａｎｄ ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ． 、ｐｐ．１３３４−１３４５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）］。f マイトマイシンＣはＳＯＳ応答の既知の誘導物である[Ｗａｌｋｅｒ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃ ｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ(Ｎｅｉｄｈａｒ ｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．、ｐｐ．１３４６−１３５７、Ａｍｅｒｉ ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ，ＤＣ(１９８７)]。g カドミウムは遺伝子損傷を引き起こすことが報告されている［Ｎｅｉｄｈａ ｒｄｔ ａｎｄ ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．、ｐｐ．１３３４−１３４５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏ ｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）］。h この化合物はスーパーオキシドを産生するレドックスサイクルを促進させる 。スーパーオキシドは過酸化水素への不同変化を受ける。スーパーオキシドは、 過酸化水素への暴露により誘導される４０の蛋白質に加え、４０の蛋白質の合成 を誘導する［Ｄｅｍｐｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ２５：３１５−３ ３７（１９９１）］。i 過酸化水素はｏｘｙＲ調節、ならびに大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびＳ． ティフィムリウム（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）内で誘導されるおおよそ ４０のポリペプチドの中の幾つかの他の蛋白質を誘導する［Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ４１：７５３−７６２（１９８５）；Ｓｔｏｒｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４８：１８９−１９４（１９９０）；Ｄｅｍｐｌｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ ｅｔ ． ２５．３１５−３３７（１９９１）］。j Ｔ．Ｖａｎ Ｄｙｋ． 未発表。k この化学物質はｔＲＮＡSerのアミノアシル化を妨げるため緊縮応答を誘導す る［Ｃａｓｈｅｌ ａｎｄ Ｒｕｄｄ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅ ｄｓ．、ｐｐ．１４１０−１４３８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）；Ｗｉ ｎｋｌｅｒ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ ｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．、ｐｐ．３９５− ４１１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）］。l 異化代謝産物活性化応答は良好な炭素源の非存在によるトリガリングを受け る［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｉｎｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｓｃｈａｅｃｔｅｒ．Ｐ ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ：Ａ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｅｓ 、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９９０）、ｐｐ．３５１−３８８；Ｍａｇａ ｓａｎｉｋ ａｎｄ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａ ｌ．Ｅｄｓ．、ｐｐ．１３１８−１３２５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７） ］。m 限られたホスフェート濃度の使用によりホスフェート飢餓調節が誘導される ［Ｗａｎｎｅｒ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．、ｐｐ．１３２ ６−１３３３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７）］。n 単独のＮ源としてのグルタミンの使用によりＮ飢餓調節の発現が誘導される ［Ｒｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｍａｇａｓａｎｉｋ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎ ｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎ ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ．Ｆ．Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．、ｐｐ．１３０２−１３２０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉ ｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９ ８７）］。 実施例１１ エタノールもしくは硫酸銅に対するｌｏｎ形質転換宿主細胞の応答 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ｐＬｏｎＥ６／ＲＦＭ４４３を、カナマイシン（ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中、２６℃で一晩成長 させ、そしてカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）を含む新 鮮なＬＢ培地中に稀釈し、そして初期対数期に まで２６℃で成長させた。５０μＬの細胞を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉ ｎ）（５０μｇ／ｍＬ）、および様々な濃度のエタノール（その培地に直接添加 される）もしくは硫酸銅（水中の２５０ｍＭの保存溶液から希釈される）を含む ５０μＬのＬＢ培地に添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ル ミノメーター内、２６℃で、インキュベーション時間の関数として定量した。エ タノールにより誘導される最大応答は、エタノールの最終濃度が４％の際に観察 され；エタノールの添加後６０分目では発光は、非処理対照におけるものよりも 、エタノール存在下では１３４倍大きかった。最大硫酸銅誘導は、最終濃度が５ ｍＭの際にもたらされ；６０分目で誘導率は４０８倍となった。 実施例１２ マイトマイシンＣ、臭化エチジウム、もしくは塩化カドミウムに対するｒｅｃＡ 形質転換宿主細胞の応答 プラスミドｐＲｅｃＡＬｕｘ３を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株を一晩２６ ℃で、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地 中で成長させ、そしてカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ） を含む新鮮なＬＢ培地に希釈し、そして初期対数期になるまで２６℃で成長させ た。５０μＬの細胞を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ ）、および様々な濃度のマイトマイシンＣ（水中の２ｍｇ／ｍｌの保存溶液から 希釈されたもの）を含む５０μＬのＬＢ培地に添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔ ｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。０．５μｇ／ｍＬ のマイトマイシンＣの添加後１００分目での誘導率は以下のとおりであった： 株DPD2791 （pRecALux3／W3110） 4.74 株DPD2794 （pRecALux3／RFM443） 20.00 株DPD2797 （pRecALux3／DE112） 15.70 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２７９４は臭化エチジウムの存在に対する応 答を示した。細胞を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（２５μｇ／ｍＬ） を含むＬＢ培地中、２６℃で一晩成長させ、そして新鮮なＬＢ培地に希釈し、そ して初期対数期にまで２６℃で成長させた。５０μＬの細胞を、様々な濃度の臭 化ブロマイド（水中の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液から希釈されたもの）を含む５０ μＬのＬＢ培地に添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノ メーター内、２６℃で定量した。０．２５ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウムの添加後 １８０分目では誘導率は１．９倍であった。 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２７９４は更には、ディスク分散アッセイ （ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）による塩化カドミウムの存在に 対して応答することが示された。細胞を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ） （５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢアガープレート上に広げ、そして１００ｍＭの塩 化カドミウム溶液２０μｌで予め湿潤させてあるフィルターディスクをそのアガ ープレート上に置いた。３７℃での一晩のインキュベーションの後に、そのアガ ープレートを室温にまで冷ました。ＤｕＰｏｎｔ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎフィル ムを１０分間プレートに暴露した。成長阻害の領域（１８ｍｍ直径）を囲む、生 物発光が増強されている領域（３５ｍｍ直径）が観察された。 実施例１３ メチルビオロゲン、過酸化水素、もしくはメナジオンに対するＫａｔＧ形質転換 宿主細胞の応答 プラスミドｐＫａｔＬｕｘ２およびｐＫａｔＧＬｕｘ６を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）株を一晩３７℃でＬＢ培地中で成長させ、そして新鮮なＬＢ培地内に 希釈し、そして初期対数期になるまて３７℃で成長させた。４０μＬの細胞を６ ０μＬのＬＢ培地、および水中の２００ｍｇ／ｍＬ保存溶液から希釈したメチル ビオロゲン（ＭＶ）もしくは水中の０．３％溶液から希釈した過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2）の様々な濃度のものに添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０ ００ルミノメーター内、２６℃で定量した。データを以下の表ＶＩＩおよびＶＩ ＩＩに示す。 ＊ 検査した最高濃度。 大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２５１１は更にはメナジオンの存在に対し ても増加生物発光を示して応答することが示された。細胞を一晩、カナマイシン （Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中、２６℃で成長さ せ、そしてＬＢ培地に希釈し、そして対数期になるまで２６℃で成長させた。２ ０μＬの細胞を、８０μＬのＬＢ培地中の様々な濃度のメナジオン（水中の２０ ０ｍｇ／ｍＬの溶液から希釈したもの）を含むマイクロタイタープレートのウエ ルに添加した。光出力をＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２ ６℃で定量した。８０分目では、２．３ｍＭメナジオンで処理した細胞の生物発 光は非処理対照よりも１２００倍大きかった。 実施例１４ メチルビオロゲンもしくは過酸化水素に対するＭｉｃＦ形質転換宿主細胞の応答 プラスミドｐＭｉｃＦＬｕｘ１およびｐＭｉｃＦＬｕｘ２を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株をＬＢ培地中、３７℃で一晩成長させ、そして新鮮なＬＢ培地内 に希釈し、そして初期対数期になるまで３７℃で成長させた。４０μＬの細胞を 、６０μＬのＬＢ培地、および水中の２００ｍｇ／ｍＬ保存溶液から希釈したメ チルビオロゲンもしくは過酸化水素（水中の０．３％溶液から希釈したもの）の 様々な濃度のものに添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミ ノメーター内、２６℃で定量した。データを以下の表ＩＸおよびＸに示す。 ＃ 分析した最長誘導。 ＊ 検査した最大濃度。 実施例１５ エタノールおよび硫酸銅に対するＵｓｐＡ形質転換宿主細胞の応答 プラスミドｐＵｓｐＡＬｕｘ．２を含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＥ１３ ４を一晩、２６℃で、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ） を含むＬＢ培地中で成長させ、そしてカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５ ０μｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＬＢ培地内に希釈し、そして初期対数期にまで２６ ℃て成長させた。５０μＬの細胞を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５ ０μｇ／ｍＬ）およびエタノ ール（培地に直接添加する）もしくは硫酸銅（水中の２５０ｍＭ保存溶液から希 釈されたもの）の様々な濃度のものを含むＬＢ培地に添加した。光出力を、Ｄｙ ｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。エタノール により誘導された最大応答は、エタノールの最終濃度が４％の際に観察され；エ タノールの添加後６０分目に誘導率は１４８倍となった。最大硫酸銅誘導は最終 濃度が５ｍＭの際にもたらされ；６０分目には誘導率は６．９倍となった。 実施例１６ プロピオネート、アセテート、もしくは過酸化水素に対するｘｔｈＡ形質転換宿 主細胞の応答 ｌｕｘオペロンに融合されたｘｔｈＡプロモーターを有するプラスミドを含む 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株を、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（２５μ ｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中、２６℃で成長させ、そしてカナマイシン（Ｋａｎ ａｍｙｃｉｎ）（２５μｇ／ｍＬ）を含む新鮮なＬＢ培地に希釈し、そして初期 対数期になるまで２６℃で成長させた。５０μＬの細胞を、カナマイシン（Ｋａ ｎａｍｙｃｉｎ）（２５μｇ／ｍＬ）、およびアセテート（水中の２Ｍ保存溶液 から希釈されたもの）、プロピオネート（水中の２Ｍ保存溶液から希釈されたも の）、もしくは過酸化水素（水中の３０％保存溶液から希釈されたもの）の様々 な濃度のものを含む５０μＬのＬＢ培地に添加した。光出力を、Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。株ＤＰＤ２７７８への ０．０２５％過酸化水素の添加後９時間目では生物発光は、添加なしの対照のも のよりも７０倍大きく；１００ｍＭアセテートの添加後１日目では誘導率は５４ であり；そして１００ｍＭプロピオ ネートの添加後３日目では応答率は２０７となった。株ＤＰＤ２７８１について は０．０５％過酸化水素の添加後１８時間目では生物発光は添加なしの対照のも のよりも６６０倍大きく；１００ｍＭアセテートの添加後１日目では誘導率は６ １であり；そして１００ｍＭプロピオネートの添加後３日目では誘導率は２９１ となった。 実施例１７ 遺伝子発現に対するｈｉｓ形質転換宿主細胞の応答 ｌｕｘオペロンに融合されたｈｉｓプロモーターを有するプラスミドを含む大 腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）株は、適切な調節因子の存在における遺伝子発現の依存 性を示す遺伝子実験において緊縮応答系により調節されることが示された。プラ スミドＤＮＡを、他の点では同種同系であり、正常の調節を有する（株ＣＦ１６ ４８）、ｒｅｌＡ調節遺伝子が突然変異を生じている（株ＣＦ１６９３）、もし くはｒｅｌＡおよびｓｐｏＴ調節遺伝子の両方に突然変異を生じている（株１６ ５１）株内にＣａＣｌ2により介在される形質転換により導入した。これらの株 は、Ｍ．Ｃａｓｈｅｌ（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ３’５’−ｂｉｓｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎ ｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｌＡ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｏＴ ｎｕｌｌ ｍｕｔａ ｔｉｏｎｓ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：５９８０−５９９０）から 取得した。これらの株は、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）（１５μｇ／ ｍＬ）を含むＬＢ培地中、一晩、３７℃で成長させ、そして同一培地で希釈し、 そして初期対数期になるまで３７℃で成長させた。生物発光、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３ ０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。３つのプラスミドは各々ｒｅｌＡ 突然変異体では生物発光の減少を示し、そしてｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ二重突然変異 体では劇的な生物発光の減少を示した。データを以下の表ＸＩＩに示す。 これらの融合物はヒドロキサム酸セリンに対する暴露によっても誘導すること ができた。この化合物はセリル−ｔＲＮＡシンセターゼによるｔＲＮＡserアミ ノアシル化の特異的阻害剤である［Ｐｉｚｅｒ ａｎｄ Ｔｏｓａ（１９７１） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １０６：９７２−９８２］。細胞を、ウラシル（ ２５μｇ／ｍＬ）、硫酸カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、およびグルコース（ ０．４％）を補足した最小E培地（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅ ｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ Ｙ、１９８０）中、２９℃で震盪しながら一晩成長させた。細胞を、硫 酸カナマイシンを省略したことにより唯一改変した同一培地内で２０倍に希釈し 、そして先に記載される要領で１９と３４クレット単位（Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ ）との間にまで成長させた。水中のＤ，Ｌ−ヒドロキサム酸セリン（Ｄ，Ｌ−ｓ ｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）の２ｍｇ／ｍＬ溶液を、硫酸カナマイシ ンの省略によってのみ唯一改変した同一培地内に稀釈した（連続２倍稀釈）。こ れらの希釈物（５０μＬ）を５０μＬの活発に成長する培養物とマイクロタイタ ープレート内で混合した。光出力をＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメー ター内、２６℃で定量した。インキュベーションの１１８０分後には以下の誘導 率が観察された： このデータにより、多種多様の範囲のアミノ酸生合成阻害剤を検出することがで きるバイオセンサーを開発するために緊縮応答メカニズムの知識が利用されたこ とが暗示される。多くの除草剤はアミノ酸生合成の阻害剤であるため、このバイ オセンサーは数々の除草剤の有用なディテクターであってよい［例えば、アセト ラクテートシンターゼ特異的除草剤（スルホニル尿素、イミダゾリノン、および トリアゾロピリミジンクラスにおけるものを含む）、ホスフィノスリシン、およ びグリホセート］。実施例１８ 限られたホスフェートに対するｐｈｏＡ形質転換宿主細胞の応答 ｌｕｘオペロンに融合されたｐｈｏＡプロモーターを有するプラスミドを含む 大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ１５２２からＤＰＤ１５３３は、限られたホ スフェートに対する応答を示した。これらの株は、トリシンを欠き、そして炭素 源としてのグルコース（０．４％）、ビタミンＢ１（０．００００２％）、およ び標準濃度のホスフェート（２．０ｍＭ）、もしくは限られた濃度のホスフェー ト（０．１ｍＭ）を含むＭＯＰＳ培地（Ｂｏｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８ ２）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｈｉｎ ｌａｙｅ ｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７：９７ ５９−９７６９）上で単一コロニーについて線条培養した。一晩、３７℃でのイ ンキュベーションの後にはプレートを室温に冷まし、そして様々な時間、ＤｕＰ ｏｎｔ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓフイルムに暴露した。標準濃度のホスフェート で成長する株はそのフィルムに有意な露光をもたらすのに３時間を必要とした。 それとは対照的に、限られたホスフェート培地で生育する株はフィルムの有意な 露光を生じるのにわずか１時間のみを必要とし、従って限られた炭素源による生 物発光の誘導が示された。 この結果をルミノメーターを用いて実施する実験により確認した。培養物を一 晩震盪しながら２９℃で、グルコース（０．４％）、ウラシル（２５μｇ／ｍＬ ）、および硫酸カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を捕足してある２ｍＭリン酸カ リウムを含む先の最小培地中で生育させた。 細胞を遠心分離により回収し、それから、硫酸カナマイシンおよびリン酸カリウ ムの省略によってのみ改変された同一培地の等量中に再懸濁させた。５０μＬの 細胞を、硫酸カナマイシンを欠き、そして０〜２０００μＭの範囲となるリン酸 カリウムの最終濃度となるように改変した５０μＬの同一培地に添加した。光出 力を、再懸濁させた細胞の添加後３００分を上回る時間の関数としてＤｙｎａｔ ｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。２つの株［ＤＰＤ １５２２（ｐＰｈｏＡＬｕｘ３／Ｗ３１１０）およびＤＰＤ１５２３（ｐＰｈｏ ＡＬｕｘ４／Ｗ３１１０）］についての典型的結果を以下に示す：ｎｉ：誘導が観察されない ＊ ベースライン測定値を上回る測定可能な発光増加の時間実施例１９ 単一の窒素源としてのグルタミンに対するｇ１ｎＡ形質転換宿主細胞の応答 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２８３１を、０．１％(ＮＨ4)2ＳＯ4を含 む最小ホスフェート培地（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、（１９７７）Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔ ｈｅｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ 、１２９：１００１−１００９）中、一晩成長させた。これら の培養物を遠心分離により回収し、そして同一培地（対照）、もしくは（ＮＨ4 ）2ＳＯ4を欠くが単一の窒素源として０．００４％のグルタミンを含むその培地 のいずれかの中に再懸濁させた。発光はＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノ メーター内、２６℃で定量した。再懸濁後６２分目には、乏しい窒素源（グルタ ミン）を有する培地中の細胞は対照培養物よりも６２倍大きな生物発光を示した 。 実施例２０ ｌａｃ含有性プラスミドおよび宿主細胞の構築 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）は、ビブリオ フィスケリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓ ｃｈｅｒｉ ）のプラスミド由来ｌｕｘ遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃプ ロモーターの調節下に置かれるように構築した。ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ− Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８５） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍ１３ ｐｈ ａｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ１３ｍｐ１８ ａｎｄ ｐＵＣ １９ ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）の２３２塩基対のＰ ｖｕ ＩＩ〜ＥｃｏＲＩ断片を、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣＤ６ １５（Ｒｏｇｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、（１９８７） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴｉＣ５８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ 、１６９：５１０１−５１１２）内に連結させてｐＬａｃＬｕｘをもたらせた 。このプラスミドはもともとは、Ｆ’ｌａｃＩqを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、ＸＬ１−Ｂ ｌｕｅ：Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆ ｏｒｍｉｎｇ ｒｅｃＡ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：３７６−３７９）内で単離されたため、ｌｕｘ遺 伝子はＩＰＴＧにより誘導可能となった。このプラスミドを更にＣａＣｌ2によ り媒介される形質転換により大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０、ＲＦＭ４ ４３、およびＤＥ１１２内に挿入した（実施例１０、表Ｖを参照されたい）。 実施例２１ 炭素源レベルに対するｌａｃ形質転換宿主細胞の応答 グルコースは、各々プラスミドｐＬａｃＬｕｘを含む大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）株ＴＶ１０５８およびＴＶ１０６８についての好ましい炭素源であり、これら の株を、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含み、０．４％のグルコースを欠損 するもしくは含むかのいずれかであるＬＢ培地中、一晩、２６℃で成長させた。 この一晩培養物を希釈し、そしてその 一晩培養物と同一培地中、初期対数期になるまで成長させた。培養物混濁度を、 ＃６６赤色フィルターを装着させたクレット−サマーソン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍ ｍｅｒｓｏｎ）比色計で測定した。５０μＬの細胞培養物中に存在する発光を、 Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量した。データ を以下の表ＸＩＶに示す。 従って、プラスミドｐＬａｃＬｕｘを含む細胞は、ＬＢ培地中に存在する至適 下炭素源下で成長させた場合には生物発光を増加させる。 実施例２２ ｆａｂＡ形質転換宿主細胞の構築および脂肪酸飢餓に対する応答 ｆａｂＡ遺伝子は、脂肪酸中の二重結合の配置、およびそのため大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）の膜の配置の原因となる酵素をコードする。このような二重結合は 成長には絶対必要とされる。ｆａｂＡの合成は２つのプロモーター要素、すなわ ち；低レベルの構成性上流プロモーターおよび誘導性下流プロモーター、により 指令される。ｆａｂＡを取り囲む配列中の２つのプロモーターの位置が決定され ている。表ＩＶに示されるＰＣＲプロモーターは、構造性上流プロモーター抜き で誘導性下流プロモーターのクローニングを可能にさせるように設計されている 。下流プロモーターの転写はＲＮＡレベルでは少なくとも１０倍調節することが できる（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：８４３− ８４９（１９９１））。ｆａｂＡ−ｌａｃ融合物において研究される二重ｆａｂ Ａプロモーターの調節は、β−ガラクトシダーゼ比活性のレベルでは１３倍の調 節を示している（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７０：６７１−６７９ （１９９２））。ｆａｂＡ発現の調節はｆａｄＲ遺伝子産物により媒介される（ Ｎｕｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４：５５４−５６０（ １９８３））。ＦａｄＲ蛋白質は、調節を受ける下流ｆａｂＡプロモーターの− ４０領域に結合することによりｆａｂＡ転写を刺激する。余剰の膜合成能が存在 する場合には、長鎖アシル−ＣｏＡ分子が蓄積する。これらの分子はＦａｄＲ蛋 白質に結合し、それを調節を受けたｆａｂＡプロモーターから解離させる（Ｈｅ ｎｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７０：６７１−６７９（１９９２））。従っ てｆａｂＡ−ｌｕｘ融合物は膜合成の状態のモニターとして作用することが期待 される。脂肪酸飢餓の条件下では長鎖アシル−ＣｏＡプールは小さく、そしてｆ ａｂＡ −ｌｕｘの発現は高くなるべきであり；余剰な脂肪酸が大きなプールの長 鎖アシル−ＣｏＡをもたらし、そしてそのためこの融合物からの低レベルのｌｕ ｘ 発現がもたらされるはずである。この融合物は脂肪酸合成阻害ばかりでなく、 ＣｏＡ有用性をもモニターするはずであり、この有用性はイソロイシン−バリン 合成酵素アセトラクテートシンターゼの阻害を含む多くの因子により限定され得 る（ＬａＲｏｓｓａ ｅｔ ａｌ．、ｐｐ．１０８−１２１ ｉｎ Ｂｉｏｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ｓ、ｅｄ．ｂｙ Ｂａｒａｋ、Ｃｈｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｓｓ、ＶＣ Ｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）。ｆａｂＡ：：ｌｕｘ融合物を含む潜在的ディテ クター生物休上に脂肪酸飢餓のストレスを生じさせる方法は、増殖培地中に３− デセノイル−Ｎ−アセチルシステアミンを含ませることによる脂肪酸脱飽和の阻 害（Ｎｕｎｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ、１５４：５ ５４−５６０）、またはスルホメツロンメチル（Ｖａｎ Ｄｙｋ ｅｔ ａｌ． 、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９８７）２０７：４３５−４４０）のような 除草剤もしくはアミノ酸バリン（ＬａＲｏｓｓａ ｅｔ ａｌ．、（１９８７） Ｊ．Ｂａｃｔｅｔｒｉｏｌ． １６９：１３７２−１３７８）の作用によるプ ロピニル−ＣｏＡとしての細胞内ＣｏＡの金属イオン封鎖を含んでよい。ｆａｂＡＬｕｘの構築およびＲＦＭ４４３の形質転換 ｆａｂＡ：：ｌｕｘ遺伝子融合物を含む形質転換用プラスミドの構築は、ｐＲ Ｙ００１およびｐＲＹ００２の調製のための実施例３に本質的には記載される方 法および材料を用いて調製される。ｆａｂＡプロモーターのＰＣＲ増幅は表ＩＶ に列挙されるプライマーを用いて達成される。ｆａｂＡ遺伝子の配列は既知であ り、そして核酸配列のＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易に入手することがで きる。ｆａｂＡ：：ｌｕｘ融合物を保持するプラスミドはｐＦａｂＡＬｕｘとし て引用される。 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主ＲＦＭ４４３は、実施例３においてＷＭ１０２ １およびＷＭ１２０２の構築のために記載される材料および方法を用いる際に、 ｐＦａｂＡＬｕｘを用いて形質転換される。 ｐＦａｂＡＬｕｘで形質転換する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主ＲＦＭ４４３ は、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含む最小Ｅ培地中で一 晩、２９℃で成長させる。この一晩培養物を希釈し、そしてその一晩希釈物と同 一培地で初期対数期にまで成長させる。培養物混濁度を、＃６６赤色フィルター を装着させたクレット−サマーソン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ）比色計 で測定する。５０μｇ／ｍＬのスルホメツロンメチルの存在もしくは非存在下で の５０μＬの細胞培養物中に存在する発光を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ ルミノメーター内、２６℃で定量する。スルホメツロンメチルの存在下での培養 物は、スルホメツロンメチルの非存在下での培養物と比較した際には、１０〜２ ５倍の発光の増加を示すことが観察される。 従って、プラスミドｐＦａｂＡＬｕｘを含む細胞は、脂肪酸合成阻害の条件下 で成長させられる際には生物発光を増加させることが期待される。 実施例２３ 物理的攻撃誘発に対する応答 ｒｅｃＡ：：ｌｕｘ、ｕｖｒＡ：：ｌｕｘ、ｇｒｐＥ：：ｌｕｘ、ｄｎａＫ： ：ｌｕｘ 、ｋａｔＧ：：ｌｕｘ、ｍｉｃＦ：：ｌｕｘ、およびｕｓｐＡ：：ｌｕ ｘ 融合物を紫外線光照射に暴露した。ｇｒｐＥ：：ｌｕｘ以外の全ては生物発光 を増加させることによりこの物理的攻撃誘発に応答した。株を一晩、震盪しなが ら、硫酸カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を補足してあるＬＢ培地中、２６℃で 成長させた。ＬＢ培地中に２０倍稀釈した後には培養を震盪しながら、２０〜４ ０クレット（Ｋｌｅｔｔ）単位の密度に至るまで継続した。培養物（５０μｌ） および新鮮なＬＢ培地（５０μｌ）をマイクロタイタープレートのウエルに添加 してから、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００装置（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ社）での２５４ｎｍの照射を行った。その後に光出力を、照射後の時間の 関数としてＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ３０００ルミノメーター内、２６℃で定量し た。応答率は２４０分のインキュベーションの後に算出した。これらは表ＸＶＩ に報告される： 実施例２４ 少容量アッセイ 実施例２４は、本発明のディテクター細胞を、再現性のある結果を伴う０．５ μｌのアッセイ容量という少量を利用するアッセイ方法に適用してよいことを示 す。実験１ ＴＶ１０６１の一晩培養物をＬＢ−１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｍｐｉ ｃｉｌｌｉｎ）中で成長させた。翌日この培養物を１／５０に希釈し、そして０ ．８のＯＤ６００になるまで成長させた。７マイクロリットルの細胞を、直径３ ．５ｍｍおよび深さ０．９ｍｍ、そして容量８マイクロリットルのウエルを有す るマイクロタイタープレートの内の６０ウエルの各々に添加した。１．２マイク ロリットルの２０％エタノールをそれらのウエルの内の半分のものに添加して最 終濃度を３％とした。 室温で４０分置いた後、Ｘ−線フィルムをシートの上に１０分間置いた。１マ イクロリットルを２つの異なるウエルから、エタノール添加後、０、３０、およ び６０分目に試料採取した。連続稀釈を行い、そしてＬＢ−アンピシリン（Ａｍ ｐｉｃｉｌｌｉｎ）プレート上にのせてプレート培養した。このＸ−線フィルム を現像した。 翌日プレート上のコロニーを係数し、そして細胞の濃度は３．９×１０8ｍｌ 、もしくはウエル当たり２．７×１０6細胞であると決定された。このＸ−線フ ィルムはエタノールによる発光の明らかな誘導を示した。１時間の実験中、細胞 密度は２．２倍増加した。実験２ ＴＶ１０６１の一晩培養物をＬＢ−１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａ ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）中で生育させた。この培養物を１／５０に希釈し、そして ０．５のＯＤ６００になるまで成長させた。細胞を、以下の希釈物および添加物 を含む６本のチューブに分けた： チューブ１ ５００μｌ＋１５μｌ １００％ ＥｔＯＨ チューブ２ ５００μｌ チューブ３ ５００μｌの１／２０希釈物＋１５μｌ １００％ ＥｔＯＨ チューブ４ ５００μｌの１／２０希釈物 チューブ５ ５００μｌの１／１００希釈物＋１５μｌ １００％ ＥｔＯＨ チューブ６ ５００μｌの１／１００希釈物 これらの希釈物を暗室に持ち込み、そこではエタノールによる発光の誘導が希 釈していない試料および１／２０稀釈試料では明らかであった。 各１マイクロリットルの３本の試料をチューブ１〜６から取り出し、そして氷 上に置いた。８、２、および０．５マイクロリットルアリコートを各々、８マイ クロリットルの容積のウエルを有するマイクロタイタープレートの内の９ウエル に添加した。Ｘ−線フィルムをそのマイクロタイタープレートの上に１５、３０ 、および９０分間置いた。氷上に置いた試料の連続稀釈を行い、そしてＬＢ−ア ンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）上でプレート培養した。コロニーを翌日計 数し、そしてもともとの細胞濃度が１．２×１０8細胞／ｍｌであると決定され た。 Ｘ−線フィルムにより決定されるように、エタノールによる良好な誘導が、６ ．０×１０4細胞を含む０．５マイクロリットルの試料を初めとする全ての非希 釈試料中に生じた。１／２０稀釈のものでは誘導は８マイクロリットルの試料に おいてはっきりと観察された。これらの結果は、この系が小さなウエル容積、も しくは少ない細胞数によるストレスを受けなかったことを示す。 検査した構築物の内、一つを除く全ては物理的および化学的ストレスに応答し たことが明らかとなった。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION           Small and sensitive method for detecting environmental hazards                             Field of the invention   The present invention provides environmental hazards at levels below the levels required to disrupt cell metabolism. (Detection of environmental insults) More specifically, the present invention Reports that the presence of an environmental hazard would induce reporter gene expression Stress-inducible promoter operably linked to a target gene or gene complex A transformed bacterial host comprising a DNA construct comprising the DNA construct. Preferred Porter genes are responsible for bacterial bioluminescence. About 1 μL and about 10 Volumes between μL are useful, which allows for high-throughput analysis.                               background   Increasing public interest and imposed government regulations To develop environmental detection systems that can detect pollutants in soil and groundwater. It is gaining momentum. For example, gas chromatography (Gas Chrom) Atomography) and Mass Spectrometry Highly sensitive and specific detection systems that incorporate analytical instruments such as However, these systems are expensive equipment and skilled operators Need. In addition, sample preparation and data analysis are sometimes cumbersome and It wastes time. Standard US Water Toxicity Test (the standard U . S. For example, daphnia (water toxicity test)Daphnia Toxicity assays that require living organisms such as However, these tests are non-specific and particularly rapid Absent.   Somewhat even faster are cells that have taken up bacteria as a susceptibility factor Based toxicity assay. These systems are compatible with reagents used in normal automated analysis systems. And use bacterial cells. For example, RODTOX (Central Kagaku) (Tokyo, Japan) is a batch assay that measures bacterial oxygen consumption. Yes, and designed for use in sewage plants. For example, GBI TOX ALARM system (Genossenschaft Berliner Ingen) ieeurkollective, Berlin, Germany) Other systems based on other bacteria can measure the presence of specific chemicals. G BI TOXALARM is a small amount of potassium cyanide of 0.1 ppm in the sample. Is known to be able to detect the presence of While these detection systems are useful, However, cumbersome and complicated detection systems hinder this. Recently, bacterial bioluminescence This provides a simpler and more sensitive mode of detection for environmental sensing systems. Have been considered.   The phenomenon of bioluminescence was first rigorous in 185, by Rachel Dubois. Was confirmed by scientific research based on the luminous beetle Pirofluus (Pyro phrus ) And luminous bivalve foras (Pholas) Observed that vesicle extract produced a light-emitting reaction in vitro when mixed at room temperature did. Since then, bioluminescent systems have become common fireflies, marine gut, fish, terrestrial and And freshwater helminths Identification and investigation in countless different organisms, including fungal, algae, and fungal species Have been.   Bacterial bioluminescence consists of five structural genes (luxA,luxB,luxC,lu xD ,andluxEIs a phenomenon in which the products work together to emit light. .luxDProduce C14 fatty acids from certain precursors. This C14 fat Acids couple bacterial bioluminescence to the energy state of cells during ATP-dependent reactions. Let it ringluxEActivated into acyl-enzyme complex through the action of the product . This acyl-enzyme (luxEProduct) is a transfer agent Acting asluxCDonate the acyl group to the product. This acyl-LuxC2 The ternary complex is then formed by NADPH acting as an electron pair and a proton donor. To reduce the acyl heteroconjugate to a C14 aldehyde. This reaction Couples the reducing power of cells to the light emission of bacteria. Luciferase (lu xA WhenluxBThe light-producing reaction, which is catalyzed by the product of light The energy for emission is the conversion of aldehyde to fatty acid and FMNHTwoOxidation And provides another coupling between light production and cellular energy state. Offer.   Recently, naturally bioluminescent organisms have been used as susceptibility factors in toxicity testing. Have been. MICROTOX system (Microbics Corp., Carl sbad, CA) is an example. MICROTOX is Photobacterium   Hospoleum (Photobacterium phosphoreum) Heaven Measure the natural baseline luminescence and report it to the hostility of the environment surrounding the organism Associate with The following between light production and the central metabolism of energy production: Three, A TP level, NADPH level, and FMNHTwoLevel coupling Tobacterium hospoleum (Photobacterium phospo reum ), The availability or phase of these metabolisms Any obstacle that interferes with interaction is bioluminescent (lux) Resulting in reduced activity of the system And thus in connection therewith leads to a reduction in light production by the organism. There will be.   A key attribute of the bioluminescent system is the rapid decrease in light production and the exposure to certain injuries. It occurs within minutes of dew. Another major advantage of these systems is that light detection is not Things can be as sensitive as possible (down to the level of single photons), and mobile Can be easily adapted to external units. In addition, in the actual work plan of light detection, Competing technologies (for example, ion detectors) where contamination and corrosion of the detector cause significant downtime The main weakness in the (selective electrode) is that the detector can be used for wet biological samples. The need for contact is eliminated.   With recent advances in recombinant DNA technology, luciferase (lux) Gene complex It has become possible to express the body as a heterologous gene product. This is generally an inn Under the control of the main promoterluxAchieved by including a structural gene complex You. Thus, for example, the cDNA encoding firefly luciferaselacZ E. coli under the control of a promoterE.coliIs expressed in () i et al., Biochem. Biophys Acta. , 1131, (2), pp   161-165, (1992)), andluxABThe fusion gene is Bacillus (Bacillus ) Within it powerfulPxynBe placed under the control of a promoter And E. coli (E.coli) Level equivalent to what can be achieved within (Jacobs et al., Mol.Gen. Genet., 230 ( 1-2), pp 251-256, (1991)).   Recombinant gene technology that converts bacteria into light-emitting factors in the assay An alternative system for the MICROTOX system has been developed. Rychert et al. (En viron. Toxic. Water Qual. , 6 (4), pp415-4 22, (1991))luxPlasmid pJE202 containing the gene complex The harboring recombinant E. coli (E.coli) Is Zn2+, Ethidium bromide, pentacoro Pentachorophate Sodium, Cu2+,and It was shown to be sensitive to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. This app The response in Say was based on the transformed E. coli (E.coli) A luminous base It is recorded by a decrease in the sine light.   Although MICROTOX and similar systems are useful, their sensitivity is small. To detect the level of an injury that metabolically kills or renders the vesicle metabolic Is limited to In order to be detected by these systems, the injury is Sufficiently high to either interfere with Xie or inactivate Lux protein Level must be reached.   Levels of injury at levels below those required to affect cellular metabolism It is often necessary to be able to detect files. like this One is that lethal concentrations of contaminants eradicate useful microbial communities and have significant cost and engineering costs. Figure 2 is an example of a waste treatment facility that results in downtime of the site. Preferred detection systems are useful It can detect the presence of injuries at sublethal levels before the microbial population suffers damage. Will be able to. These early warnings are quick to rescue native microbial communities What is the remedy? Could be used to make injuries.   recently,luxFusion of structural gene to chemically responsive bacterial promoter And then recombining such chimeras by placing them in a suitable host Bacteria are being developed. Such recombinant bacteria grow in response to specific stimuli Sensor organism. Examples of this type of gene fusion are described in Burlage et al. (J . Bacteriol , 172 (9) pp 4749-4747 (1990)). Which includes a promoter for the naphthalene degradation pathway. DNA fragment from plasmid NAH7Vibrio fischeri)ofluxFused to the gene, and Pseudomonas (Ps eudomonas ) Was used to transform the strain. Transformant obtained Showed an increase in light emission in the presence of naphthalene. Induction of bioluminescence leads to transformation It proved to be consistent with naphthalene degradation by the recipient organism.   Another test system that shows a specific response to mercury (Hg) is H. Molders (EP 456 667). Here, Hg ion Bacterial luciferase that is more specifically inducible and causes bioluminescence (lu xAB ) Fused to gene complexmerAn indicator strain containing a promoter is provided (By vector-mediated gene transfer). Molder's test system is water Due to the presence of silvermerInduction of promoters and subsequent sets of test results They rely on increased light emission from the exchanged bacteria.   Burlage et al. And Molders' method of increasing bioluminescence Technology in that it specifically detects a single It offers several advantages over the field. These systems are designed for specific chemical substances in environmental samples. Useful for detecting presence, but satisfactory as an indicator of general cytotoxicity Not something. The promoter used by Burage is naphthalene digestion Accommodations that show functionality in the pathway and can use naphthalene as a carbon source Put in the Lord. Therefore, this detection system is not associated with cytotoxicity anyway . Similarly, MoldersmerThe promoter is E. coli (E.coli) Is not unique to, and therefore E. coli (E.coliToxicity in) Not a natural indicator of. A more general test for the primary detection of unknown obstacles The system is cytotoxic or rather than activated by one particular chemical. Utilizes promoters specifically associated with stress.   Genes Activated as a Result of Cellular Stress for Detection of Environmental Injuries Provides an advantageous alternative. Stress genes are found in all cells, and The consequences of any type of stress that may alter normal cellular metabolism As a gene that is activated as Environmental stress is over protein Wrap set (an overlapping set of protein) Often it induces the synthesis of s). The most recognized class of strain Genes are involved in protein refolding, recycling, and resynthesis. Shock shock encodes a series of cellular proteins thought to play a role It is a messenger. The heat shock phenomenon was first described as a response to elevated temperature. Was. Subsequent studies have shown that phage infection, macrophage encapsulation, And exposure to a wide variety of stresses, including the presence of organic molecules and heavy metals Can trigger this heat shock response Indicated. The common theme of this inducible agent is the denaturation of some proteins in the cell. It may be. (LaRossa et al.,Mol. Microbiol, 5 (3), pp 529-53, (1991)). This response therefore governs a wide range of environmental hazards. May be combined and communicated. Van Bogelen et al. (J. Bacteriol, 1 69 (1), pp26-32, (1987)) is CdClTwo, HTwoOTwo, Etano And a wide variety of chemicals, including puromycin and nalidixic acid Is E. coli (E.coli) Can induce the heat shock gene Indicated. Bolm et al. (Appl. Environ. Microbiol. , 58 (1), pp 331-334, (1992)), E. coli (E.coli) Culture of benzene, CdClTwo, Chloropyrivos ), 2,4-dichloroaniline, dioctyl phthalate, hexachlorobenzene , Pentachlorophenol, trichloroethylene, and tetrapropyl-ben Zensulfonate, when analyzed by two-dimensional gel electrophoresis, showed up to 39 different Taught to induce stress proteins.   Since cells attempt to maintain a steady state, the stress response is a triggering factor. Much lower than the lowest inhibitory concentration for any of the conditions acting as offspring Activated by. Due to this fact, stress response in any environmental sensing system Is particularly advantageous because the detection of injuries can be achieved before microbial cell killing. This is because it can be achieved. Such systems can destroy microbial communities. Waste treatment facilities where environmental pollutants are often not detected until after Would be extremely useful in   To date, the induction of stress responses has been used in the area of environmental testing, but has not been successful. The degree remains not very high. Koehler et al. (Arch. E nviron. Contam. Toxicol. , 22 (3), 334-8 (1 992)) are molluscs that respond to the presence of heavy metals and pesticides (mollusc s) and assaying the level of HSP70 protein in various species of slugs The test system for this is described. This system is Pb2+HSP70 responds to the presence of Although showing increasing levels, the technique is cumbersome and lacks sensitivity. Further refinement The described technique has been described by Saunders et al. (WO 9002947). It is. The technique of Saunder et al. Is intended for organisms exposed to contaminants in an aqueous environment. Need to detect the increased levels of HSP60 and HSP70 within the cell.   Needed to kill microbial populations using simple detection mechanisms High sensitivity to detect a wide variety of obstacles at levels much lower than A sex bioassay system was disclosed in PCT / US 93/11527. Possible use Applications include monitoring air and water quality, designing, manufacturing, and fermenting pesticides and formulations. Includes control, control monitoring, and toxicity screening. These applications include chemistry, Beverage, food and spices, cosmetics, agriculture, environment, regulatory and health care industries And many businesses can benefit. Applicant's improvement, ie P Use of CT / US 93/11527 biological tests for small, high-throughput applications This is disclosed in Example 24 herein.                             Summary of the Invention   The present invention: can respond to the presence of environmental obstacles by altering luminescence Culturing a suitable bioluminescent detector organism; including any environmental hazards Exposing said detector organism to the presence of a suspected sample; Measuring the change in luminescence produced by the vector organism; and Correlating the change in luminescence with the level of an environmental hazard present. An improved method for detecting the presence of a harmful object is provided. Improvement is a detector For the use of very small volumes used in methods of suspending organisms . In particular, the improvement is that (a) the solution containing the prokaryotic detector organism is reduced to about 0.5 subdividing into at least one container having a volume of from about 10 μl to about 10 μl, Biological detector organisms whose promoter is a global regulatory circuit (agloba) (regulatory circuit) Expressable heterologous luxCDABE gene complex under control of promoter sequence Be genetically engineered to include the body;   (B) exposing the prokaryotic detector organism to an environmental injury;   (C) a luminescence detector for measuring the increase in luminescence of the prokaryotic detector organism. Using a departure machine, Is included. The container is the well of a microtiter plate and luminescence detection The method wherein the machine is an x-ray film. Prokaryotic detection when exposed to environmental hazards The method in which the target organism is in log phase.   The present invention relates to PCT / US 93/1152, a text contained within this application. 7 is an improvement over the method described in FIG.                         BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Sequence listing and biological deposit   FIG. 1 shows the plasmid pGrpELus. 3 and pGrpELux. Building 5 It is description of.   FIG. 2 illustrates the construction of plasmid pRY006.   FIG. 3 illustrates the construction of plasmids pRY001 and pRY002.   FIG. 4 is a graph of the increase in luminescence by TV1060 in response to the presence of ethanol. It is a display.   FIG. 5 shows the increase in luminescence by TV1060 in response to the presence of increasing concentrations of ethanol. It is an additional graph display.   FIG. 6a shows luminescence by WM1021 in response to the presence of various concentrations of ethanol. 5 is a graphical representation of the increase in.   FIG. 6b shows luminescence by WM1026 in response to the presence of various concentrations of ethanol. 5 is a graphical representation of the increase in.   FIG. 7 shows pGrpE. Lux. Transformed with 5tolC +andtolC - 5 is a graphical representation of the relative sensitivity of detector cells to pentachlorophenol. You.   The following strains are subject to the provisions of the Budapest Treaty , The American Type Culture Collection n (ATCC) (12301 Packlawn Drive, Rockville) le, MD 20852, USA):Depositary identification name ATCC number Deposit date   TV1060 69142 December 3, 1992   TV1061 69315 May 13, 1993   TV1076 69314 May 13, 1993   WM1202 69313 May 13, 1993   WM1021 69141 December 3, 1992   WM1026 69143 December 3, 1992   WM1302 69316 May 13, 1993   "ATCC number" is the accession number of the culture at the time of deposit at the ATCC.                         Detailed description of the invention   The present invention provides for the storage of a detector organism containing an expressible gene fusion in a strain. Between the inducible promoter and the structural geneluxGene expression The method provides a method for detecting environmentally hazardous substances at a sublethal level.   Environmental hazards that can be detected by the detector organisms of the present invention include industrial land, waste Commonly found in waste streams and agricultural runoff It contains a wide variety of organic and inorganic pollutants. Such compounds are restricted But not necessarily polyaromatic hydrocarbons (PAH), halogenated aromatic compounds And a wide variety such as, for example, lead, cadmium, copper, zinc, and cobalt Containing heavy metals. Compounds shown to be detected by the method of the present invention are Razine, benzene, sulfur Copper acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, ethanol, methanol, 2-nitro Phenol, 4-nitrophenol, pentachlorophenol, phenol, Ruene, dimethyl sulfoxide, copper nitrate, cadmium chloride, sodium chloride, Acetate, propionate, hydrogen peroxide, puromycin, mercury chloride, 2,4 -Dichloroanaline, propanol, butanol, isopropanol, methyl chloride Ren, Triton X100, Acrylamide, Methyl viologen, Mitoma Isin C, menadione, ethidium bromide, serine hydroxamate, and xy Including ren. Other environmental stresses detected include low phosphate levels, poor nitrogen Source, a poor carbon source, and irradiation with ultraviolet light.   The following definitions are used herein and are referred to for an understanding of the claims. Should be.   The terms “promoter” and “promoter region” usually refer to the part where transcription is correct. RNA polymerase and / or other factors required to initiate That control the expression of its coding region by providing recognition It means the DNA sequence upstream (5 'side) of the gene's protein coding sequence. Step A motif sequence is required, but not required to drive expression of that gene. Is not enough.   Certain "fragments" construct fragments of DNA sequences in particular regions.   "Nucleic acid" refers to any of sugars, phosphates, and purines or pyrimidines. It may be single-stranded or double-stranded consisting of monomers (nucleotides) containing Means a molecule that can be made. In bacteria and higher plants, "deoxyribonucleic acid" (DNA ) Means genetic material, while "ribonucleic acid" (RNA) is information from DNA Involved in the translation of proteins into proteins.   “Regulation” and “regulate” are primarily, but not exclusively, the transcription of a gene. Of gene expression regulated by DNA sequence elements located upstream (5 ') of initiation Means control. Modulation may result in an all-or-nothing response to a stimulus, Alternatively, it may result in a change in the level of expression of the gene.   The term "coding sequence" refers to a protein, polypeptide, or portion thereof Part of the gene that encodes the minute and eliminates regulatory sequences that drive transcription initiation Means The coding sequence may or may not be normally found within the cell. May not be normally found in the cell site when introduced. , In which case it is called a heterologous gene. The coding sequence is naturally occurring May be a composite of segments from various sources to be synthesized or synthesized .   The term “construct” or “construct” refers to a straight line or Circular single-stranded or double-stranded DNA or RNA plasmids, viruses, A sequence, phage, or nucleotide sequence that replicates autonomously. In this case, many nucleotide sequences are ligated or recombined into a unique construct, This, together with the appropriate 3 'untranslated sequence, provides a pro- Motor fragments and DNA sequences can be introduced into cells.   The term “transformation” refers to the acquisition of a new gene into a cell after introduction of the nucleic acid. To taste.   The term "operably linked" refers to the proper orientation for transcription into functional RNA. And fusion of two DNA fragments in the open reading frame.   The term "expression" refers to the genetic expression of a gene that encodes the sequence of a gene product. Means transcription and translation to offspring products. During expression, the gene product sequence DNA strands are first transcribed into complementary RNA, which is often a messenger -RNA, and then the transcribed messenger RNA is If the gene product is a protein, it is translated into the aforementioned gene product.   The term "translation initiation signal" refers to three nucleic acids in a nucleic acid that specify the initiation of protein synthesis. Means a nucleotide unit (codon).   The term “plasmid,” as used herein, refers to the central metabolism of a cell. Carrying genes that are not part of and usually take the form of circular double-stranded DNA molecules It often means additional chromosomal elements.   The term "restriction endonuclease" refers to a specific nucleotide sequence in double-stranded DNA. Means an enzyme that binds and cleaves in a row.   The term "bioluminescence" refers to the phenomenon of light emission from any living organism .   the term"lux"luxA,luxB,luxC,luxD,andlux E And cause bacterial bioluminescence phenomenaluxMeans structural gene You.luxGene complexes are individualluxContains all of the genes and works together OrluxAandluxBAs long as is part of the complexl ux May contain any subset of structural genes   The terms "stress" or "environmental stress" A condition that results in a cell.   The term “injury” or “environmental injury” refers to bacterial cells or cells. Any substance or environmental change that causes a normal change in cellular metabolism in the population Means Environmental injuries are not restricted, but chemicals, environmental pollutants , Heavy metals, temperature changes, pH changes, and oxidative damage, DNA damage, anaerobic Including agents that produce the environment, changes in nitrogen availability, or pathogens.   The term “stress response” refers to the induction or detectable level of a stress protein, or Is a higher degree of exposure to other or increasing doses of environmental hazards Refers to a cellular response that results in any of the states of resistance.   The term "stress protein" is used as a result of environmental stress or Means any protein induced by the presence of a substance. Typical stress protein The quality is not limited, but E. coli (Escherichia coli) DaughtergroEL,groES,dnaK,dnaJ,grpE,lon,lys U ,rpoD,clpB,clpP,uspA,katG,uvrA,fidA ,sodA,sodB,soi-28,narG,recA,xthA,his ,lac,phoA,glnA,andfabAincluding.   The term “stress gene” refers to whether the transcription is a result of environmental stress or Means any gene induced by the presence of an environmental injury. Typically E. coli (E.coli) Stress genes are not restricted,groE L ,groES,dnaK,dnaJ,grpE,lon,lysU,rpoD ,clpB,c1pP,uspA,katG,uvrA,fidA,sodA,sodB ,soi-28,narG,recA,xthA,his,lac,p hoA ,glnA,micF,andfabAincluding.   The term "heat shock gene" refers to a structure whose synthesis encodes a sigma-32 protein. Gene (rpoH) Means any gene that is positively regulated by .   The term "stress-inducible promoter" activates stress genes, and Any promoter capable of causing increased expression of the stress gene product Means   The term "detector organism" refers to a stress-inducible, fused to a structural gene Contains a gene fusion consisting of a promoter and responds to certain environmental injuriesl ux An organism capable of expressing the gene product is meant. Typically, Vector organisms include, but are not limited to, bacteria.   The term “log phase” or “log phase growth” is an exponential change in the number of detector cells. Refers to a cell culture of a detector organism that grows under conditions that allow for amplification .   The term “Relative Light Unit” is “RL U "and is used for the luminometer used Luminescence measured by a luminometer calibrated against a unique internal standard Mean measured value.Host cells for construction of detector organisms   Host cells for the construction of detector organisms suitable in the present invention are lux Prokaryotic cells, including any cells capable of effecting expression of the gene fusion, are preferred. Preferred and members of the enterobacterial class are most preferred.   Intestinal bacteria are of the family EnteriobacillusEnterobacte riaceae ), And Escherichia (Escherich ia ), Salmonella (Salmonella), And Shigella (Shigell a )). These are gram negative straight rods   rod), 0.3-1.0 × 1.0-6.0 mm, movement by periflagellate flagella Mobility (Tatumera (Tatumella)) Or non-motor is there. They grow in the presence and absence of oxygen, and peptone, meat Meat extract, and (usually) MacConkey ( (MacConkey's) medium. Some are the only sources of carbon While growing on D-glucose as vitamins and / or Requires one or more minerals. They regulate respiratory and fermentative metabolism Has organic nutrition but is not halophilic. Acids and often visible gases Produced during fermentation of D-glucose, other carbohydrates, and polyhydroxy alcohols Be born. These are oxidase negative and Shigella disenteriae (Shigella dysenteriae0) Group 1 and Xenorhub Doss Nematofils (Xenorhabdus nematophilus ) Are catalase-positive with the exception of Nitrate is reduced to nitrite (Eluw Inia (Erwinia) And Ersina (YersinaSome of the strains With the exception). The G + C content in the DNA is 38-60 mol% (Tm, B d). DNA from species within most genera is at least 20% different from each other and from this family. Escherichia coli (Escherichia coli)is connected with. An exception worth mentioning is Yersina (Yersina), Proteus (Proteu s ), Providenica (Pro videnica ), Hafnia (Hafnia), And Edouard Sierra (E dwardsiella ), And these DNAs constitute 10-20% of other genera. Related to species from Erwinia Chrisantemi (Erwinia c hrysanthemi With the exception of all species tested are common to intestinal bacteria. Including antigen (Bergy's Manual of Systematic B acteriology, D.C. H. Bergy et al., Baltimore: Wil. liams and Wilkins, 1984).   Particularly useful in the present invention are E. coli (E.coli), And the genus Salmo Nera (Salmonella) Members, andrecAGenes and their Enterobacteria whose upstream promoter region has already been identified.Stress-inducible promoter   The present invention relates to a stress-inducible promoter that is sensitive to the presence of an environmental injury. Offer. Stress-inducing probes from both prokaryotic and eukaryotic cells Promoters may be used, however, promoters from bacteria are preferred. And E. coli (E.coli)) Are most preferred. Appropriate Various stress inducible promoters are not limited, but are shown in Table I below. May be selected from a list of genes under the heading "Responsive genes":Table I * Its expression is increased by corresponding stress and its expression is correspondingly regulated Gene regulated by gene (s).  Table I shows the specific regulatory genes (if one or more) of the reactive gene (s). Or multiple) and its relationship to the regulation circuit, and triggered by special stimuli FIG.   In Table I, most of the stress genes listed above are positively regulated Although known, the SOS response produced as a result of DNA damage is negative. Represents the circuit to be adjusted. For a definition of positive and negative regulatory mechanisms, see Bec kwith,E. FIG. coli and Salmonella typhimu rium ; Cellular an d Molecular Biology (Neidhardt, FCE t al. Eds. Pp. 1439-1443, American Soc Internet of Microbiology, Washington, DC (1 987)).   The SOS response to DNA damage isE.coliWell understood in Have been.lexAThe product of the gene (LexA repressor) has at least one 7 that bind to an operator element that regulates the expression of chromosomal genes (Walker   inE. FIG. coli and Salmonella typhimuri um Cellular and Molecular Biology (Ne idhardt, F.C. C. et al. Eds. Pp. 1346-1357, American Society of Microbiolology, Was Hinton, DC (1987)). DNA damage or interference with DNA replication Sometimes an unknown SOS-inducible signal is produced. This signalrecARemains It interacts with the gene product to convert the gene product into a limited number of repressors. Are converted to a form that increases the rate of proteolysis of the offspring (Little,.J. B acteriol . 175: 4943-4950). These repressors The offspring are encoded by the UV light-inducible phage genome Chromosome expressed fromlexAProducts of genes and repressors. SOS The promoter is activated by RecA protein-mediated proteolysis of LexA repressor. Released from restraint. Among them, the SOS-responsive promoterrecAandu vrA It is. On multiple copy plasmidrecAPromoter-luxFusion Produces bioluminescence, and biotransformation of the transformed host cells. It has been found that light becomes increased in response to DNA damage. This result The exact mechanism of the result is unknown, but the present invention regulates a comprehensive regulation circuit It is clear that the study is not limited to the study of (1) some negatively regulated Circuit operates with the promoter of a responsive gene in a multiple copy state. And (2) insert a negatively regulated promoter in single copy state Because there are several approaches to enter them [eg, Oden et al.,Gene  9 6: 29-36 (1990); Symons et al.Gene  53: 85-96 ( 1987); Winans et al.J. Bacteriol. 161: 1219- 1221 (1985); Arps and Winkler,J. Bacter iol , 169: 1061-1070 (1987); Jasinand Sch. immel,J. Bacteriol, 159: 783-786 (1984)]. .Construction of expression vector and transformed host   The invention further provides for transforming a bacterial host cell for expression of a Lux protein. A stress-inducible promoterluxTransformation containing gene fusion Vectors are also provided. A wide variety of transformation vectors may be used, but only While E. coli (E.coli) Are preferred. . pGrpELux. 3, pGrpELux. 5, pRY001, pRY002 , And pRY006 are suitable traits whose construction is described in detail in the text below. 5 are five specific examples of conversion vectors. These vectors are stress promoters −luxVectors created for the purpose of introducing a reporter fusion into a host cell 2 represents only one example of the total count of data. However, in the field of molecular biology, It will be apparent to those skilled in the art that the methods and materials used in their construction are It will be readily understood that they are representative of vectors. Other preferred The vectors are listed in Table V of Example 10.   pGrpELux. 3 and pGrpELux. 5 isgrpEPromoter PRY001, pRY002, and pRY006 IsdnaKIncludes promoter. pGrpELux. 3, pGrpELux. 5 , And pRY006 were all created by the method of direct cloning, As part of the construction method for pRY001 and pRY002, the PCR protocol The call was used. For example, transformation vectors such as these are common; Construction of the appropriate vector is accomplished by techniques well known in the art. May be.luxPreferred sources of genes lack promotersluxGene complex It is an existing plasmid containing the body. Similarly, a strategy for constructing a transformation vector A preferred source of loess-inducible promoter DNA is its stress-inducible promoter. -DNA is flanked at convenient restriction sites and isolated by restriction digestion Existing plasmid suitable for PCR or the product of a PCR reaction. You.   pGrpELux. 3 and pGrpELux. 5 vector is E. coli (E.   coli) Stress genegrpEandluxConstructed from gene complexes . pGrpE4 is derived from E. coli derived from pUC18 (E.coli) Vector (Pharmacia, Cat. No. 27-4949-01). pGrp E4grpEGene, which has a 5 'EcoBinds to the RI site and The 3 'endBbuIncludes its own promoter that binds to the I site. Additionally ,thisgrpEStep In the motor, its 3 'end isEcoJust downstream of the RI sitePvuII andHae It binds to the III site (FIG. 1).EcoRI andBbuI restriction enzyme By digestion ingrpEA 1.1 kb fragment corresponding to the gene is obtained.Pv u Further digestion with II resulted in two fragments, one of which was gr Includes pE promoter. ThatgrpE3 'on promoter fragmentPvuPart II Position is phosphorylatedEcoVia linkage to the RI linkerEcoTo the RI site Is converted.Hae5 'by further digestion with IIIHaeIII site And 3 'PvuII site conveniently boundgrpEPromoter fragment results (FIG. 1).   luxThe pUCD615 plasmid containing the gene complex was described by Rogowsky et al.J. Bacteriol . 169 (11), pp 5101-512 (1987 )). Plasmid pUCD615 contains kanamycin. And a gene for ampicillin resistance, and lacks a promoterlu x This is a 17.6 kb plasmid containing the gene operon (FIG. 1). pUCD6 15 is a restriction enzymeEcoRI andSmaDigestion with I to open the plasmid And then parpE IVHaeLinkage with DNA fragment from III digest Perform a knot.   Typically, the products of the ligation reaction are first transformed into a suitable host, and Screened by screening for bioluminescence. A wide variety of inns A host may be used, and a host having a high transformation frequency is preferred. XL1Blu e (Stratagene, LaJolla, Calif.) and DH5-α (GI BCO-BRL, Gaithersburg, MD) has two such hosts. It is. Bioluminescent screenin A preferred method is to use a grid culture of transformants on a suitable X-ray film. (Grounded culture) and then as evidence of exposure Requires visual analysis of the developed film. From the transformed host Using plasmid re-isolation and restriction digestion followed by gel electrophoresis Check for the presence of the correct plasmid. Isolated from two different transformed colonies Plasmid pGrpELux. 3 and pGrpELux. 5 is a restriction enzyme Indistinguishability based on analysis. Under some experimental conditions, pGrpELux . 5 transformed with pGrpELux. Compare with those transformed in 3 It shows a higher baseline bioluminescence and therefore, pGrpELux. 5 is preferred for the detection of many environmental hazards.   The invention further relates to a transformant capable of increasing luminescence in the presence of an environmental hazard. A transformed host cell is also provided. Many suitable hosts are available, in which case E. coli (E.coli) Is preferred, and E. coli (E.coli) Stock RF M443 is most preferred. RFM443 is derived from W3102, which is Ba chmann,E. FIG. coli and Salmonella typhim urium ;Cellular and Molecular Biology (Neidhardt et al. Eds., Pp. 1190-1220). , American Society of Microbiolology, Wa Shinton, DC (1987)). pGrp Elux. 3 transformation of RFM443 results in a new strain TV1060 , Which is already under the terms of the Budapest Treaty Deposited with the ATCC. pGrpELux. Transformation of RMF443 with 5 results in a new strain TV1061. The baseline of bioluminescence from strain TV1061 is higher than that from strain TV1060 Is also big. E. coli (E.coli) The TV1060 has ATCC No. 691 42, and the TV 1061 is assigned ATCC No. 6931 5 has been assigned.   dnaKThe construction of the plasmid pRY006 containing the promoter was carried out using pGrpELu x. Follow a protocol similar to that of 3.dnaKEncode the promoter DNA is a restriction enzymeEcoRI andBamLambda fur by digestion with HI Obtained from Lambda phage 9E4. 9E4 is quoted Kohara et al. (Cell 50, 495-508, 1), incorporated herein. 987). At the 5 'end by restriction enzyme digestionBam The HI site binds and at the 3 'endEcoRI site bindsdnaKpromotion A 3.7 kb DNA fragment containing the promoter region was generated. pGrpELux. As with the construction of 3luxThe source of the gene complex is pUCD615. pUCD615 firstBamHI andEcoDigest with RI restriction enzyme and After thatdnaKLigation with the promoter fragment results in plasmid pRY006. Made (Figure 2).   Construction of pRY001 and pRY002 from 9E4DanKpromoter Except that a PCR protocol was used to amplify the DNA encoding When removed, it is similar to that of pRY006. Briefly, from 9E4da nK PCR amplification of the promoter is described in Cowi, incorporated herein by reference. ng et al., PNAS 82, 2679-2683, 1985.d naK Promoter sequence Achieved using   Amplification is performed as described by the manufacturer, incorporated herein by reference ( Geneamp PCR Reagent KitNPerkin-Elmer   Cetus, Norwalk, CT).dnaKPromoter region The amplification product corresponding to is conveniently determined by construction of the amplification primers.Ba m HI andEcoIt contained an RI site. thisdnaKPromoter region Preliminary restriction enzymeBamHI andEcoLigation to pUCD615 digested with RI did.   Escherichia coli (E.coli) Transforming strain DH5α, The resulting transformants are then exposed to X-ray film and Bioluminescence by restriction digestion and subsequent analysis on agarose gel Was screened for Strain DH5-α for this initial screening The choice was made because of its high frequency of transformation. Two independent co I chose Ronnie. From these transformants pRY001 and pRY002, The two separated plasmids were selected from independent colonies, but were restricted. Indistinguishable based on enzyme analysis, and considered identical for the purposes of the present invention. Done. Under some experimental conditions, cells transformed with pRY002 were Higher organisms in response to environmental damage compared to those transformed with Y001 It exhibits luminescence and therefore pRY002 is preferred for detection. Then pR Transform RFM443 with Y001, pRY002, and pRY006 And E. coli (E.coli) Strains WM1021, WM1202, and WM1026 was created. E. coli (E.coli) Stocks WM1021, WM12 02, and WM 1026 is an A in accordance with the terms of the Budapest Treaty. Deposited with TCC. E. coli (E  .coli) WM1021 has ATCC No. 69141 are allocated. E. coli (E.coli) WM1202 ATCC No. 69313 are allocated. E. coli (E  .col i ) WM1026 has ATCC No. 69143 has been assigned. First As described, the promotion of other stress genes fused to the lux reporter In the construction of the promoter, the source of the PCR primers and the template DNA is PRY001 and pR001, except that they differ when read more It was identical to the construction of Y002. All promoter sequences are publicly available, And it can be easily obtained through Genbank database of nucleic acid sequences. it can.   Stress-inducible promoterluxThe plasmid is an autonomously replicating plasmid. However, although present in the transformed host of the present invention; If it does, stress-inducible promotersluxPlasmid is transformed That it is also possible to provide a transformed host integrated into the host's genome. You will understand. This may be achieved by techniques known to those skilled in the art. S A tress-inducible promoter may drive expression of the gene product, Things are nextluxActivates the expression of the gene complex. In this case, the promoter ー andluxGene complexes may occur on different genetic elements.   As an example, any of a number of suppression mechanisms may be recalled [H artman and Roth, Advances in Genetics , 17: 1-105 (1973)]. In some, Integrated on the chromosomeluxThe gene complex isluxC,luxD,luxA ,luxBOrluxEAnd a nonsense mutation in Powered by a dynamic promoter. Stress-inducible promoters Fused to drive expression of the sense suppressor gene. In the absence of stress No bioluminescence is observed because the organism has five essentialLuxProtein synthesis This is because it is not possible to perform the operation. If the organism is under stress, The regulatory gene is transcribed. The expression of this repressor gene product requires five essentialL ux Expression of the protein is enabled, and the organism produces light.Membrane mutation   In some cases, the detector cells of the invention facilitate the screening process. It may contain mutations that will cause it. Therefore, the target chemical enters the cell. Can interact with target molecules of its cellular machinery Need to be able to do that. E. coli (E.coli) Various mutants Is known to affect cell permeability and intracellular accumulation.rf a (Ames, BN, FD Lee, and WE Durston,P rc. Nat. Acad. Soc. USA , 70 (3): p. 782-78 6, (1973)),envA(Young, K, and LL Silver ,J. Bacteriol., 173: p. 3609-3614, (1991)),imp (Sampson, BA, R. Misra, and S. Benson ,Genetics, 122: p. 491-501, (1989)),lpp( Giam, C .; Z. , S.P. Hayashi) and H.E. C. Wu,J. Biol . Chem. , (259): p. 5601-5 605, (1984)), orsurA(Tormo, A., M. Almi ron, and R.R. Kolter,J. Bacteriol., (172): p . 4339-4347, (1990)). Sensitivity to a wide variety of chemicals is increasing. For exampleemr(Ma, D.S. Et al.,Mol. Microbiol., 16: p. 45-55, (1995)) OracrAB(Paulsen, IT, et al.Mol. Micro. , 19 : P. Efflux pumps with mutations such as 1167-1175, (1996)) destruction of efflux pump), ortolC(Schnaitman et al.,J. Bacteriol , 172 (9), pp 5511-5513, (199 By disruption of the channels used by such cells with mutations such as 0)) This also results in increased sensitivity to chemicals. E. coli (E.coli) Alternatively, a suitable host strain of another bacterium may have one known mutation or mutation. It may be constructed to hold the combination. In some cases,tolC-Jump Mutations or changes in cell membrane properties to facilitate the screening process It is an object of the present invention to provide a detector organism containing other mutations that result in Included in the box.   Specifically, a high degree of perception of increased permeability of the cell envelope to toxic organics In order to create sensitive detector organisms,tolC -Mutation is colon Fungus (E.coli3.) Incorporated into strain RFM443. This E. coli (E.c oli ) The transductant DE112 istolCExcluding mutations at loci Isogenic (syngeneic) with strain RFM443. This is as a donor Share CS1562 (tolC :: miniTn10) (Schnaitman et al.,J. Bacteriol, 172 (9), pp 5511-5513, (1990)) and recipients Mediated by phage P1 using lysates grown on strain RFM443 Was constructed by universal transduction. The obtained tetracycline resistance transductant was Hypersensitivity reaction to crystal violet, a hydrophobic compound I was leaning.   DE112 was prepared according to the standard transformation method described previously, using pGrpELux. 5 or transformed with pRY002 to carry the tolC-mutation Detector organism TV1076 (grpE lux fusion)and WM1302 (dnaK lux fusion)created. TV 1076 And WM1302 are subject to the terms of the Budapest Treaty And deposited with the ATCC, and ATCC No. 69314 and A TCC No. 69316, respectively.Low volume assay   As described above, a wide variety of agents and conditions can be struck in bacterial organisms. It is known to produce a response. For example, consider high-throughput assay systems Modification of the assay system, such as a decrease in culture medium volume, can result in these conditions Constraints may be placed on assays that may produce a response. For example, small volume cultures (1-2 μl) is for fast evaporation (changing osmolarity and pH), and Subjected to physical stress on cell membranes produced by the interaction of surfaces with cells. For example, Hela cells that are stressed in a hypertonic environment have a rapid cell volume. Decreased, a 30% decrease in cell viability, and have been shown to exhibit ultrastructural changes (Wheatley et al.,Mol. Physiol. (1984), 6 (3- 4), 163-81).   The effects of osmotic stress in eukaryotic cells allow the expression of various stress genes. It is well known that induction results. For example, in mammalian kidney cells HSP-72 and HSP-25 (Rauchman et al.,Am. J. Physi ol . (1997), 273 (1. Pt. 2), F9-F17; Et al.,Pfluegers Arch. (1997), 434 (3), 292-2 99; Ohno et al.Kidney Int. Suppl. (1996), 57 , S110-S118); HSP-70 (Hatayama) in human HeLa cells a,Biol. Pharm. Bull.(1997), 20 (6), 605- 612); and Saccharomyces sp.Saccharomyces s p . ) (Piper, P.,FEMS Microbiol. R ev. (1993), 11 (4), 339-56) all increase osmotic stress Has been shown to be induced by Similarly, for prokaryotes, the osmotic pressure is Known to affect the expression of protein and other stress-inducible proteins ing. For example, bacterial global regulator (global regul) ator) Sigma is E. coli (E  .coli) For regulation of gene expression (Hengge-Aronis, R ,,Mol. Micr obiol . (1996), 21 (5), 887-893; Chuang et al.,J . Bacter1ol . (1993), 175 (7), 2026-36), and handUspAUniversal stress genes are osmotic stress (Ale) xander et al.Mol. Microbiol.(1994), 11 (6), 1 059-71).   Publication states that stress genes are easily activated by osmotic stress Is taught (results of cell cultures in small volumes), but the method can be used in very small assays. Applied for use in Bacterial stress linked LUX gene complex Utilizing a detector organism containing a promoter, the cells may contain from about 1 μl to about 10 μl. Screens have been developed which are suspended in μl of medium, in which case about 2 μl To 8 μl of medium is preferred. Cells are allowed to rest for about 60-120 minutes under these conditions. It does not emit high baseline light emission indicating stress. these Cells may be used in these volumes to detect multiple environmental hazards.Description of the preferred embodiment   The method of the present invention can exhibit a change in bioluminescence in response to the presence of an obstacle Monitor samples for the presence of environmental hazards using detector organisms It is designed in consideration of Transformants TV1060, TV1061, T V1076, WM1021, WM1202, WM1302, and WM1026 Are all suitable and suitable for use as detector organisms. preferable As with vectors, these detector organisms detect environmental hazards. It is only one sample of the total detector organism made for this purpose. However, the methods and materials used to construct them are It is readily apparent to those skilled in molecular biology that It will be. Other preferred transformed detector organisms are listed in Table V of Example 10. Enumerated. Baseline of luminescence under optimal growth conditions Levels are produced by the detector organism. To actively growing cultures The introduction of environmental harmful substances induces a stress-inducible promoter, which in turnlux Activates the complex and increases the amount of light emitted from the detector organism Will be. The amount of light emitted is correlated to the level of the obstacle. The purpose of the present invention The detector organism is immediately exposed to a sample suspected of containing an injury. Previously active in the log phase, and from about 10 klet units Cell density of 50 klet units (in this case about 20 klet units are most preferred) Most preferably, the growth is performed. Light emission is not restricted, but it can be Exposure to photographic film, scintillation counting, or photomultiplier tubes Any device that captures (in this case, Dyna Tech Corporation) luminometer similar to that produced by on is most preferred) The offspring may be monitored by a variety of different methods capable of detecting the offspring.   In some embodiments, different concentrations of ethanol may apply stress to the detector organism. Used to As seen in FIG. 4, the TV1060 culture (grpE 4% final concentration of ethanol (including the promoter lux fusion) A dramatic increase in luminescence was obtained 1000 seconds later. As in FIG. Increasing the concentration of phenol from the stressed cultures Increased. Additionally, the organic pollutants atrazine and pentachloropheno (PCP), phenol, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) , Benzene, methanol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol, at Razine, toluene, dimethyl sulfoxide, acetate, propionate G, puromassin, 2,4-dichloro-analine, propanol, butanol , Isopropanol, methylene chloride, Triton X100, acrylamide , Methyl viologen, serine hydroxamate, menadione, ethidium bromide, Mitomycin C and xylene, and salts of heavy metals such as copper sulfate and lead nitrate , Cadmium chloride, mercury chloride, and copper were detected by this method. Further detected What was obtained was high osmotic strength, ultraviolet (UV). ) Light irradiation, oxidant hydrogen peroxide, as well as limited phosphate, poor nitrogen Source and poor growth of carbon sources. Chemicals in a suitable solvent Lysate and add it to the cell culture for testing or It was either added directly to the growth medium depending on the solubility characteristics. benzene, Ethanol, methanol, propanol, isopropanol, butanol, chloride Methylene, dimethyl sulfoxide, Triton X-100, phenol, Ruene and xylene were added directly to the LB medium, while 2-nitrophenol was added. , 4-nitrophenol, and atrazine were first dissolved in methanol. Were diluted with LB medium. Copper sulfate, lead nitrate, cadmium chloride, mercury chloride, sodium chloride Lium, sodium acetate, sodium propionate, hydrogen peroxide, puromy Syn, methyl viologen, acrylamide, menadione, ethidium bromide, hydr Serine loxamate and mitomycin C are first dissolved in water and then LB medium. Diluted. Pentachlorophenol (PCP), 2,4-dichlorophenoxy Acetic acid and 2,4-dichloroanaline are first dissolved in ethanol and finally Was diluted in LB medium for testing. In all cases, ethanol or Final concentration of any of the methanol Or a slight dilution of the medium in water may not induce a significant response. It was.   The data shown in FIG. 7 and Tables II and III illustrate two aspects of the detection system. Show. First, organic and inorganic contaminants can be detected at low concentrations using instant methods. Can, and secondly, the sensitivity of the systemtolC-Host detector containing mutants It can be enhanced by the use of an organism.   FIG. 7 illustrates the presence of pentachlorophenol,tolC-Including mutation Or GrpE. Lux. Detector raw transformed with 5 fusions The relative sensitivity of objects is compared. Understand from the datatolC-Jump Naturally, the mutanttolC +Significantly higher sensitivity to the presence of PCP when compared to the parent strain Shows sex. Table III (Example 9) shows PCP, 2,4-D, phenol, attra Gins, ethanol, methanol, 2-nitrophenol, and the presence of copper sulfate AgainsttolC -Transformation with pYR002 fusion with and without mutation Includes data comparing the relative sensitivity of the replaced detector fusions. Similarly, PCP and 2,4-DtolC-Preferential detection by mutants Is evident.tolC-The host is less than PCP and 2,4-D However, it also appears to be more sensitive to phenol.tolC-Jump Mutations are, for example, the sensitivity of the detector organism to non-organic contaminants such as copper sulfate. Seems to have little effect on receptivity,tolC -Sudden change Differences are known to increase host cell envelope permeability only to hydrophobic compounds Is expected in light of the fact that   Occasionally produced by a detector organism using the method of the invention. The level of injury lethality can be detected by detecting a decrease in baseline issuance May be served. The lethal level of the injury is determined by the central metabolic or detector organism. Any ofluxInterferes with any of the protein functions, which emanates from the culture This is indicated by a reduction in the amount of light emitted.   Figures 6a and 6b show transformants against stress of various concentrations of ethanol. WM1021 and WM1026 (dnaK(Including promoter lux fusion) Explain the sensitivity of Light emission at sublethal concentrations of ethanol varying from 1% to 4% Is interesting to note that it increased in a similar manner to the TV1060 culture. In contrast, lethal concentrations of ethanol ranging from 8% to 16% are This resulted in reduced light emission from the culture. Similarly, high concentrations of PCP are still This resulted in a decrease in light output in TV 1076 (FIG. 7). Therefore, the present invention The method is for a bi-modular function It is clear that In some modalities, detection of sublethal levels of injury is Mechanism of stress-inducible promoter induction and subsequent Through increased light production from the vector organism. In another style, the central details Injuries that can interfere with vesicle metabolism can also be detected because of bioluminescence Is a phenomenon that depends on energy and reducing power, and This is because the disturbance will cause a phenomenon of baseline emission. In addition, Induction of light production from the tress promoter-lux fusion results in reduced light output Lower levels of special contaminants than those required for It is clear that                               Example Materials and methods   Restriction enzyme digestion, phosphorylation, ligation, and transformation were performed as described in Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning; A Laboratory Manu al, Second Edition (1989) Cold Spring H arbor Laboratory Press. , The procedure described in Was. Using a Qiagen column (Qiagen, Inc.) Isolation of restriction fragments from agarose gels was performed as specified by the manufacturer. Was. Strataclean (Stratagene, Inc. LaJola, CA) and GeneClean (Bio10). The enzyme was removed from the restriction digest using 1) as specified by the manufacturer . Abbreviations have the following meanings: "h" is time (one or more hours) , “Min” means minutes (one or more minutes), and “sec” means seconds ( One or more seconds), and "d" means day (s). To taste.Example 1 Plasmid pGrpELux. 3 and pGrpELux. 5 and RF Transformation of M443   An overview of the scheme for constructing these plasmids is shown in FIG. Figure 1 shows the construction Means to elaborate the work, however, the DNA constructs It is not drawn as such.   Plasmid pGroE4 was obtained from pUC18 (Pharmacia, Cat. . 27-4949-01) and E. coli (Escherichia coli ) Stress genegrpEThe promoter -Includes the state including the sequence. pGrpE4 plasmid was replaced with a restriction enzymeEcoRI andBbu Digest with I, andgrpE1 corresponding to promoter and structural gene . The 1 kb fragment was isolated by subsequent agarose gel electrophoresis (FIG. 1).grp E At the 5 'end of the promoter for convenienceEcoRI site and at the 3 'endP vu The II site is attached. The isolated fragment is further digested with restriction enzymesPvuTurn off with II The promoter region was separated from the structural gene (FIG. 1).EcoRI linker -Fragmentation (Stragene, Catalog # 901027) And thenPvuLigated to the product of the II digestion,P vu The II site was replaced with an EcoRI site.HaeWith further digestion in III A series of fragments is provided, one of which is at the 5 'end.HaeIII and 3 ’EndEcoRI boundgrpEIncludes promoter (Figure 1).   Plasmid pUCD615 (J. Bacteriol, 169 (11) pp 5101-512, (1987)) are kanamycin and ampicillin resistant And a gene forluxMultiple cloning site upstream of the start of Without promoterlux17.6 kb plasmid containing gene operon (FIG. 1). First, use pUCD615 as a restriction enzyme.EcoRI andSmaErase with I To open the plasmid, and thenHaeDN from III digestion Ligation with fragment A is performed (FIG. 1).   ActivegrpE-luxLigated DN for screening fusions E. coli using AE.coli) Strain XL1Blue (Stratagene) ) With standard CaClTwoDepending on the transformation protocol Transform and screen for the presence of the plasmid using kanamycin resistance. I was leaning. Colonies were transformed into LB medium containing kanamycin (25 μg / mL). Above grown overnight at 37 ° C. in gridded fashion , And further screened for bioluminescence, to determine which transformants are pUCD 615 ofluxIt was determined whether to include a promoter sequence fused to the gene. Creature Screening for luminescence was performed in gridded colonies. To X-OMAT AR film (Kodak, Rochester, NY) Performed by naked eye analysis of exposed and developed film at ambient temperature did. Confirmation of transformation with the expected plasmids further confirms the presence of restriction fragments. Size and size of plasmid DNA from cells that produce light after restriction digestion. It was also obtained by agarose gel electrophoresis analysis.HindIII,BamHI ,andSalI digestion with plasmid pGrpELux. 3 And pGrpELux. Within 5grpEConfirmation of presence and direction of promoter Was done.   Plasmid pGrpELux. 3 and pGrpELux. 5 for E. coli (E .coli) Transformation into host strain RFM443 to transform E. coli (E .coli) Strain TV1060 and TV1061 were obtained respectively. E. coli RF M443 was originally E. coli (E.coli) W31 derived from W3102 02 for B.I. By BachmannE. FIG. coli and Salm onella typhimurium; Cellular and Mole cultural Biology (Neidhardt, FC et al. Eds. , Pp 1190-1220, American Society o f   Microbiology, Washington, D.M. C. (1987)) All are described in.Example 2 Construction of plasmid pRY006 and transformation of RFM443   An overview of the scheme used to construct pRY006 is shown in FIG. Figure 2 The construction process is described in detail, however, DNA constructs Is not drawn.   dnaKThe DNA containing the promoter was Lambda phage 9E4 (Kohara, Y et al .;Cell  50, 495-508, 1987). Manufacturing industry using Magic Lambda Prep. Protocol (Promega Corp., Madiso) n, WI). Restriction enzyme for phage DNABamHI andEc o Digested with RI. A number of DNA fragments are released by this treatment, including owing et al. (PNAS 82, 2679-2683, 1985). BednaK3.7 Kb of the promoter regionBamHI-EcoRI Restriction fragments, and about 3.0 kb of DNA from 5 'to this region, and Dna Contains 700 bp 3 'of the promoter region encoding the amino terminus of the K protein It is. Digest the digested DNA with restriction enzymesBamHI andEcoDigest with RI Ligation to pUCD615 (Figure 2). Using the resulting plasmid construct E. coli (E.coli) Strain DH5-α (GIBCO-BRL, Gaith) ersburg, MD, Catalog No. 82635a) was transformed. And transformed bacteria are grown in LB medium containing 50 μg / mL kanamycin. 37 on the ground C. overnight. The resulting colonies were first X-produced as described in Example 1. Screened for bioluminescence by exposure to OMAT AR film. The presence of the desired plasmid construct is determined by plasmid D from the transformed bacteria. NA was confirmed by restriction enzyme analysis. Restriction enzymeBamHI andEcoAt RI After digestion, a 3.7 kb restriction fragment was obtained after agarose gel electrophoresis. The presence of the construct to be performed was confirmed. This plasmid was designated as pRY006. p RY006 is transformed into E. coli (E.coli) Transformation into strain RFM443 Thus, strain WM1026 was prepared.                             Example 3 Construction of plasmids pRY001 and pRY002 and RFM443 Transformation   An overview of the scheme used to construct this plasmid is shown in FIG. FIG. Means elaborating the construction work; however, DNA constructs are Is not drawn to represent.   dnaKPromoters (Cowing et al., PNAS 82, 2679-268). 3, 1985), the DNA containing Lambda fur Di 9E4 (Kohara, Y et al.Cell  50, 495-508, 1987). From Magic Lambda Prep. (P romega Corp. Inc., Madison, Wis.) Obtained according to suggested protocol.dnaKIncrease PCR of promoter region The width was achieved using the following amplification primers:   Upper side: 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3 '(SEQ ID NO: 1)   Lower: 5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3 '(SEQ ID NO: 2)   DNA amplification was performed as described by the manufacturer (GeneAmp). PCR Reagent Kit, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). The reagent concentrations are:   1X buffer   200 uM dATP   200uM dCTP   200Um dGTP   200uM dTTP   2.5 units of Amplitaq Polymerase         (Perkin-Elmer Cetus)   100 pM upper primer   100 pM lower primer   1 ng 9E4 phage DNA template   DH up to 100 μLTwoO Met.   This reaction is performed as described in Perkin-Elmer ce tus GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler Performed using:   Dissolution: 94 ° C for 10 seconds   Annealing 50 ° C for 10 seconds   Extension: 15 seconds at 72 ° C   Number of cycles 30   The resulting amplification product is 207 base pairs in length, and GeneBa deposited with nkdnaK182 bp segment encoding the promoter region Whole (accession number 10420; location ECODNAK), as well as short 5 'and And 3 'flank sequences. PCR-amplified DNA as restriction enzymeBamHI AndEcoDigest with RI and pre-restriction enzymeBamHI andEcoTurn off with RI And ligated to pUCD615 (FIG. 3). The resulting plasmid construct is E. coli (E.coli) Strain DH5-α (GIBCO-BRL, Gaithe) rsburg, MD, Cat. No. 82635a). Protocol, and bacteria were loaded with 50 μg / mL kanamycin. And grown overnight at 37 ° C. The resulting colony first Bioluminescence upon exposure to X-ray film as described in Example 1. Screened. Two colonies were picked for transformation analysis and The presence of the desired plasmid construct is determined by plasmid DN from the transformed bacteria. A was confirmed by restriction enzyme analysis. 193 bp after agarose gel electrophoresisBam HI-EcoThe presence of the desired construct is confirmed by the appearance of the RI restriction fragment. Was. These plasmids were designated as pRY001 and pRY002. pR Although Y001 and pRY002 are different transformed colonies, these Not identified on restriction enzyme mapping and considered equivalent for the purposes of the present invention You. pRY001 and pRY002 were transformed into E. coli (E.coli) Stock RFM44 3 by transformation to produce strains WM1021 and WM1202, respectively. did.                             Example 4 Bioluminescence stress induction with 4% ethanol   Strain TV1060 was incubated at 37 ° C. in LB medium containing kanamycin (25 μg / mL). Then, Klett 56 (Klett equipped with # 66 red filter- Reach Samuelson (measured on a Klett-Summerson colorimeter) Until Klett 56 is reached at ambient temperature in the same medium. : Dilute to 11 and reach a density of 20 Klet Units Growth for 3 hours at ambient temperature until complete. 100 μL cells in microtiter Place in the wells of the plate and then add 10 μL 40% ethanol (real Experimental, 4% ethanol final concentration) or 10 μL of distilled water (control) Was added. Immediately place this plate on a luminometer (Luminoska). n, Finland) and bioluminescence was measured in RLU versus time. Transformed, stressed with 4% ethanol as seen in FIG. Light emission from the TV1060 culture increased dramatically at 1000 seconds after stress, with 1 The highest level of 30 RLU was reached. Distilled water addition to control cultures is baseline No change in luminescence was observed (FIG. 4).                             Example 5 Bioluminescence stress induction at various concentrations of ethanol   Strain TV1060 was incubated overnight in LB medium containing kanamycin (25 μg / mL) Grown and diluted 1: 100 in the same medium and Klet tt) Growing at room temperature until reaching 20. 100 μL of cells are transferred to 100 μL of , 2%, 4%, 8%, or 16% (1%, 2%, 4%, And 8% final concentration of ethanol, experimental), or 100 μL of the same My medium containing one medium (control) Placed in wells of crotiter plate. Separate this plate into a luminometer , Model ML3000 (Dynatech Laboratories, Ch. antenna, VA) and bioluminescence is measured as RLU vs. time. Was. Transformed, stressed with ethanol, as seen in FIG. The light emission from the TV1060 culture shows an increase in light emission corresponding to the increasing concentration of ethanol. Addition was indicated. As in Example 4, an increase in luminescence was observed 1000 seconds after stress. Was. Control cultures did not change baseline luminescence (FIG. 5). Highest light Luminescence was observed in 8% ethanol 3000 seconds after stress, compared to control A 263-fold increase in light production was shown. At lower levels of ethanol stress , Resulting in a correspondingly low level of light output, in this case 4%, 2%, and so on. And 1% ethanol concentration, respectively, 96, 13.5, and And a 3.9-fold increase in light emission.                             Example 6 Bioluminescence stress induction in strains WM1021 and WM1026   Strains WM1021 and WM1026 contain kanamycin (50 μg / mL). The cells were grown in LB medium at 37 ° C. for about 18 hours. The culture is then added to fresh medium for 1 hour. : 50 and grown for about 3 hours at ambient temperature. 20 klet cells When the density of the unit (Klett Unit) is reached, 80 μL of the cell suspension is Place in wells of microtiter plates containing 20 μL of various concentrations of ethanol And immediately place the plate on Dynatech Model ML 30 00 luminometer. Ethanol has a final concentration of 16%, 8%, 4%, 2% %, And 1%, and included a deionized water control. Luminometer Was pre-programmed to measure luminescence at 2 minute intervals. FIG. 6a and 6b was brought to different concentrations of ethanol by WM1021 and WM1026, respectively. Figure 4 shows the luminescence data generated in response. As shown in FIG. For cultures given sublethal concentrations of 1%, 2%, and 4% ethanol It increased sharply 1000 seconds after the stress. 8% and 16% higher At the lethal ethanol concentration, luminescence was observed to decrease below the This suggested cell death. FIG. 6b shows similar results using host cell WM1026. Is shown. Thus, while light increases in response to sublethal levels of ethanol, Power diminishes at higher lethal levels. This experiment shows that lethal and lethal levels The ability of the present invention to detect the presence of both obstacles is demonstrated.                             Example 7 pGrpE. Lux. 5 in the tolC + and tolC − strains Comparison of stress induction of bioluminescence by pentachlorophenol   E. coli (E.coli) High penetration of organic compounds into the detector organism For the purpose of providing sex,tolC - Mutant DE112 is constructed from RFM443. I built it. E. coli (E.coli) Stock DE112 istolCSudden change at locus Except for differences, it is homologous to strain RFM443. This is due to phage P1 By mediated transduction, strain CS1562 (as donor)tolC:: min iTn10) and lysates grown on strain RFM443 as recipient It was constructed using CS1562 (tolC:: miniTn10) is Austi nJ. Bacteriol. 172, 5312, (1990) And a transduction procedure is described in Miller, J .; H. ,Exp elements in Molecular Genetics , (1972 ) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold   Spring Harbor, New York, pp 201-205. It is listed. RFM443 was originally obtained from W3102, and this W31 02 is B.I. By Bachmann,E. FIG. coli and Salmone lla typhimurium: Cellular and Molecular ar Biology (Niedhard et al., Eds. Pp 1190-1220. , American Society of Microbiology, Wa Shinton DC, (1987)). Obtained Tracyclin resistant recombinants respond to the hydrophobic compound crystal viret. Were screened for a hypersensitivity reaction.   DE112 and RFM443tolCWhen loci are excluded, it is homologous You. For both strains, the plasmid pGrpELux. Shape 5 Transpose and each TV1076 (tolC:: miniTn10) and T V1061 (tolC + ).   Both strains contain 50 μg / mL Kanamycine Grow overnight in LB medium at 25 ° C. This overnight culture is transformed with kanamycin (Ka 1:50 in fresh LB medium containing (mymycine) (50 μg / mL). This was incubated at 25 ° C. for 4 hours with shaking. Cell density The degree is determined with a Kettt-Summerson colorimeter. Was. Both strains have values between 25 and 29 Klet Units When reached, cells were used for testing.   Cells (50 μL) from each culture were added to the wells of a microtiter plate. Kanamycine (50 μg / mL) and various concentrations In LB medium containing pentachlorophenol (PCP), the final volume in each well is 1 It was added so as to be 00 μL.   Using a 100 mg / mL stock solution of PCP in ethanol, kanamycin ( 75 μg of PCP in LB medium containing Kanamycine) (50 μg / mL) A g / mL solution was made. This solution (50 μL) was added to the microtiter plate. Wells were placed and a series of two-fold dilutions were made from these. Equal amount of cells When added, the maximum ethanol concentration was 0.037%, which was It is known that it does not induce a significant response from the cells.   Light measurements are periodically spaced and Dynatech ML 3000 micrometer Measured in an Iterplate luminometer at 25 ° C. and the data 7 is plotted as a concentration of PCP as a function of Guidance The rate is the light in the presence of PCP divided by the light output in the absence of PCP (RLU). Specified as output (RLU).   FIG. 7 shows induction versus PCP dose 60 minutes after addition. At low doses tolC + No induction of light output from strain TV1061 (ratio = 1) was observed. But At these lower dosestolC - Strain TV1076 sees a significant increase in light output I let you. At higher dosestolC + Strain induction was observed and PCP Toxic effects (loss of light output)tolC - Was observed in the strain. ThereforetolC - The stock istolC + Detect lower concentrations of this compound than can be detected in the strain. Useful to get out. Similarly, other hydrophobic compounds alsogrpE :: luxfusion Including things The combination of this host strain with the plasmid will be more easily detected.                             Example 8 pGrpE. Lux. 5 tolC - and tolC + strains transformed Of bioluminescence stress by organic and inorganic pollutants in water   TV 1061 and TV 1076 were engineered as previously described. Both strains were treated with L containing 50 μg / mL kanamycin. Grow overnight in B medium at 25 ° C. This overnight culture is transformed with kanamycin (Kan amycine) (50 μg / mL) in fresh LB medium Dilute 0-fold and incubate at 25 ° C. for 4 hours with shaking . Cell density was measured using a Keltt-Summerson colorimeter. Decided. Both strains have 15 and 30 Klet Units Cells were used for testing when values between them were reached.   Cells (50 μL) from each culture were added to the wells of a microtiter plate. , Kanamycine (50 μg / mL), and various concentrations Benzene, ethanol, methanol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol In an LB medium containing phenol, PCP, phenol, toluene, and xylene, The solution was added so that the final volume in each well was 100 μL. This is the control well The appropriate volume of the solvent used to dissolve these test compounds was included.   Benzene, ethanol, methanol, propanol, isopropanol, pig Ethanol, methylene chloride, dimethyl sulfoxide, Triton X-100, Enol, toluene, and xylene Was added directly to the LB medium containing Kanamycine (50 μg / mL). . 2-nitrophenol (136 mg / mL) and 4-nitrophenol (11 Stock solution in methanol (2 mg / ml) to the tested concentration Diluted in LB medium containing Shin (Kanamycine) (50 μg / mL) . The final concentration of methanol is such that it does not induce a significant response from these cells. Was something. Check the stock solution of PCP in ethanol (100mg / mL) Kanamycin (50 μg / mL) Was diluted in LB medium containing. The final concentration of ethanol is significant Did not induce a significant response. Copper sulfate (250 mM), lead nitrate (10 0 mM), mercury chloride (100 mM), sodium chloride (20%), sodium acetate (2M), sodium propionate (2M), hydrogen peroxide (30%), pew Romycin (10 mg / mL), methyl viologen (200 mg / mL), and A solution of acrylamide (1M) in water to the concentration to be tested. Diluted in LB medium containing Kanamycine (50 μg / mL) . Transfer a stock solution of cadmium chloride (100 mM) in water to the concentration to be tested. Diluted in LB medium without namycin.   Light measurements are taken at periodic intervals over a two hour period and the data Are shown in Table II. All luminescence measurements are from Dynatech ML 3000 My It was measured at 25 ° C. in a crotiter plate luminometer.   The data in Table II represents the measurements taken one hour after exposure to the test compound, It is displayed as the concentration of the test compound giving the maximum luminescence. The data also shows how many times the induced luminescence increased relative to the baseline luminescence. Show.* Maximum concentration tested   From Table II, a wide variety of chemical compounds and environmental conditions were determined for plasmid pGrp. ELux. E. coli containing 5 (E.coli) To induce bioluminescence from the strain It will be clear. Therefore,tolC - Detector organism containing the mutation It has been concluded that the body is a preferred host for some environmental Good.                             Example 9 Organic and tolC + and tolC − strains transformed with pRY002 Induction of bioluminescence stress by inorganic pollutants   DE112 (tolC:: miniTn10) is as described in Example 7. Engineered and the source of RFM443 has already been discussed. Plus both shares The plasmid pRY002 was transformed by the standard method described in Example 3 and Each WM1302 (tolC:: miniTn10) and WM1202 (tol C + ).   Both strains were grown overnight at 25 ° C. at 50 μg / mL with Kanamyci. grown in LB medium containing n). This overnight culture is transformed with kanamycin (Kan amycin) (50 μg / mL) diluted 1: 100 in fresh LB medium And incubated at 25 ° C with shaking for 4 hours. Cell density is Measured with a Klett-Summerson colorimeter. Of both stocks Inspect cells when measured value reaches 28 klet units Used for   Cells (50 μL) from each culture were transferred to Kanamycin (Kanamycin) ( 50 μg / mL), as well as various concentrations of PCP, 2,4-dichlorophenoxy. Acetic acid (2,4-D), phenol, ethanol, methanol, 2-nitropheno LB, which contains urea, atrazine, and copper sulfate The wells of the microtiter plate containing the medium have a final volume of 100 It was added to make up to μL. Control wells are solvents used to dissolve test compounds Included proper capacity.   Chemicals were prepared for testing essentially as described in Example 8. Copper sulfate Is added directly to the culture medium, and atalazine is first dissolved in methanol and then Was added to the cell culture. With the exception of atalazine, all solvents are stress-sensitive in the system. It was added at a level below that required to observe the answer. Atalazine sample The level of methanol present in induces a low but detectable response: Table I Data in II is detected above response obtained with a single methanol equivalent This is a net response.   Light measurements are taken at periodic intervals over a two hour period, and data Are shown in Table III. All luminescence measurements are on Dynatech ML 3000 My It was measured at 25 ° C. in a crotiter plate luminometer.   The data in Table III shows the measurements taken one hour after exposure to the test compound; It is displayed as the concentration of the test compound giving the maximum luminescence. Data is derived It also shows how many times the resulting bioluminescence corresponds to the baseline bioluminescence. * Maximum concentration tested ** “Conc. For Max. Ind.” Means the concentration for maximum induction. Taste *** "Fold Incr." Is a multiple fold increase in baseline bioluminescence. Means or   From the data in Table II, it can be seen that some types of chemical compounds are compatible with plasmid pRY00 E. coli containing 2E.coliThat it will induce bioluminescence from the strain It becomes clear.tolC - andtolC + Compounds with low hydrophobicity in both hosts Showed similar sensitivity.tolC - Detector organism containing the mutation May be concluded to be a preferred host for some environmental insults.                             Example 10 promoter fused to lux operon-lon, recA, uvrA, kat Construction of G, miF, uspA, xthA, his, lac, phoA, gluA   The task of constructing additional plasmids is that different primers and templates Used for CR reactions and excludes that 40 cycles were used for PCR reactions Thus, pRY001 and pRY01 as detailed in FIG. 3 and described in Example 3. It is the same as the construction method of RY002. These primers and templates are listed in Table I below. V. a  The promoter sequence can be obtained from Genbank.b   The underlined region of the upper primer isBamHI restriction enzyme cleavage site . 3'-restriction site is a sequence complementary to the region upstream of the desired promoter (Generally 18 nucleotides).c   The underlined area of the lower primer isEcoRI cleavage site . 3'-restriction site is a sequence complementary to the region downstream of the desired promoter (Generally 18 nucleotides).d   The template for the PCR reaction was a chromosomal DNA preparation (C, Zyskind & Bernstein, Recombinant DNA Laboratory   Manual, Academic Press, New York, 1992 ) Or E. coli (E.coli) Growing on K12 And given by its accession number [Buffard et al., CABIOS 8: 563-657 (1992)] E. coli (E.coli) Chromosome [Kohara et al. , Cell 50; 495-508 (1987)]. Phage overlapping set One of the plaques was resuspended with water from one. Amplification from plaque Berg [Kirshnan, Blakesley and Berg (199) 2) Nucleic Acids Research 19: 1153] The amplification from the chromosomal preparation was carried out according to It differed from Berg's in that the product was used as a template.e   Calculated size of PCR product. Product agarose gel electrophoresis analysis I checked the size. All promoter sequences listed in Table IV are published and GenB available from Ank. The underlined region of the upper primer isBa m HI restriction enzyme cleavage site. 3'-restriction site above desired promoter Sequence complementary to the region of flow (generally 18 nucleotides). Lower ply The underlined area of the maEcoRI restriction enzyme cleavage site. 3 'to restriction site Is a sequence complementary to the region upstream of the desired promoter (generally 18 nucleotide). The template for the PCR reaction is a chromosomal DNA preparation (C, Zysk ind & Bernstein,Recombinant DNA Labo rattro Manual , Academic Press, New York , 1992), or E. coli (E.coli) K12 And is indicated by its accession number (Boughfard et al.,CABIO S   8: 563-567 (1992)) E. coli (E.coli) Chromosome (Ko) hara et al.Cell  50; 495-508 (1987)). Overlapping set of phage for λ transduction ) Was any of the plaques resuspended in water. Amplification from plaque Is Berg et al.Nucleic Acids Research  19, 115 3 (1991). Amplification from chromosome preparations Differs from Berg's in that a chromosomal DNA preparation was used as a template. Was. The calculated size of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis .   Each of the resulting plasmids was transformed into three E. coli (E.coli) Host strain: RFM 443, DE112, and W3110. plus The mid and transformed host cells are listed in Table V below.   Promoter-reporter fusions are suitable for promoters of known sensitivity. A variety of environmental harms were tested in transformed host cells. Promo And their corresponding inducible insults are summarized in Table VI. b  Triggers a pluripotent regulatory response.c   Chemical induction to initiate an increase in bioluminescence responsed   Gene constructs that prevent bioluminescence expression by positive regulatory circuits.e   Ethanol is a strong inducer of the heat shock response [Neidhardt and VanBogelen inE. FIG. coli and Salmon cella typhimurium Cellular and Molecu lar Biology (Neidhardt. FC et al. Eds. Pp. 1334-1345, American Society of Mi crobiology, Washington, DC (1987)].f   Mitomycin C is a known inducer of the SOS response [Walker inE. FIG. coli and Salmonella typhimurium C cellular and Molecular Biology (Neidhar dt. F. C. et al. Eds. Pp. 1346-1357, Ameri can Society of Microbiology, Washingt on, DC (1987)].g   Cadmium has been reported to cause genetic damage [Neidha rdt and VanBogelen inE. FIG. coli and Sa lmonella typhimurium ; Cellular and Mo circular Biology (Neidhardt. FC et al. Eds. Pp. 1334-1345, American Society o f Microbiology, Washington, DC (1987)].h   This compound promotes the redox cycle producing superoxide . Superoxide undergoes unequal conversion to hydrogen peroxide. Superoxide is Synthesis of 40 proteins in addition to 40 proteins induced by exposure to hydrogen peroxide [Demple,Ann. Rev.Genet. 25: 315-3 37 (1991)].i   Hydrogen peroxideoxyRRegulation, as well as E. coli (E.coli) And S.D.   Tifimurium (S.typhimuriumApproximately) Induces several other proteins among the 40 polypeptides [Christman   et al.Cell  41: 753-762 (1985); Storz. et al.Science  2 48: 189-194 (1990);Annu. Rev.Gen et . 25.315-337 (1991)].j   T. Van Dyk. unpublished.k   This chemical is tRNASerInduces a stringent response to prevent aminoacylation of [Cashel and Rudd inE. FIG. coli and Sal monella typhimurium Cellular and Mol; ecological biology (Neidhardt. FC et al. E. ds. Pp. 1410-1438, American Society of   Microbiology, Washington, DC (1987); Wi. nkler inE. FIG. coli and Salmonella typh imurium Cellular and Molecular Biolo; gy (Neidhardt. FC et al. Eds., pp. 395- 411, American Society of Microbiology , Washington, DC (1987)].l   Catabolite activation response is triggered by the absence of good carbon sources [Neidhardt, Ingraham and Schaecter. P hysiology of the Bacterial Cell: A Mo rectangular Approach, Sinauer Associates , Sunderland, MA (1990), pp. 90-70. 351-388; Mega sanik and Neidhardt inE. FIG. coli and S almonella typhimurium Cellular and M molecular Biology (Neidhardt. FC et al. l. Eds. Pp. 1318-1325, American Society   of Microbiology, Washington, DC (1987) ].m   Use of limited phosphate concentration induces phosphate starvation regulation [Wanner inE. FIG. coli and Salmonella ty phimurium Cellular and Molecular Bio; logic (Neidhardt. FC et al. Eds., pp. 132) 6-1333, American Society of Microbiol oggy, Washington, DC (1987)].n   Use of glutamine as sole N source induces expression of N starvation regulation [Reitzer and Magasanik inE. FIG. coli an d Salmonella typhimurium ; Cellular an d Molecular Biology (Neidhardt. FC et.   al. Eds. Pp. 1302-1320, American Soci ety of Microbiology, Washington, DC (19 87)].                             Example 11 Response of lon transformed host cells to ethanol or copper sulfate   E. coli (E.coli) Strain pLonE6 / RFM443 was transformed with kanamycin ( Grow overnight in LB medium containing Kanamycin) (50 μg / mL) at 26 ° C. And a new formulation containing Kanamycin (50 μg / mL) Dilute in fresh LB medium and in early log phase Grown at 26 ° C. Fifty microliters of cells are transferred to Kanamyci (Kanamyci). n) (50 μg / mL) and various concentrations of ethanol (added directly to the medium) Or copper sulfate (diluted from a 250 mM stock solution in water) Added to 50 μL of LB medium. Light output, Dynatech ML3000 Quantification in a minometer at 26 ° C. as a function of incubation time. D Maximum response induced by ethanol is observed at a final ethanol concentration of 4% At 60 minutes after the addition of ethanol, the luminescence was greater than in the untreated control. And 134 times greater in the presence of ethanol. The maximum copper sulphate induction was a final concentration of 5 In the case of mM; at 40 minutes the induction rate was 408-fold.                           Example 12 RecA for mitomycin C, ethidium bromide, or cadmium chloride Transformed host cell response   E. coli containing plasmid pRecALux3 (E.coli) 26 strains overnight LB medium containing kanamycin (50 μg / mL) Grown in and kanamycin (50 μg / mL) And grown at 26 ° C until early log phase. Was. Fifty microliters of cells were transferred to Kanamycin (50 μg / mL). ), And various concentrations of mitomycin C (from a 2 mg / ml stock solution in water) (Diluted) was added to 50 μL of LB medium. Light output, Dynat Quantification was performed at 26 ° C. in an ech ML3000 luminometer. 0.5 μg / mL The induction rates at 100 minutes after addition of mitomycin C were as follows:     DPD2791 (pRecALux3 / W3110) 4.74     DPD2794 (pRecALux3 / RFM443) 20.00     DPD2797 (pRecALux3 / DE112) 15.70 E. coli (E.coli) Strain DPD2794 responds to the presence of ethidium bromide. The answer was shown. Cells were purified with Kanamycin (25 μg / mL). Grown overnight at 26 ° C. in LB medium containing And grown at 26 ° C. until early log phase. Fifty microliters of cells are treated with various concentrations of odor Containing brominated bromide (diluted from a 10 mg / mL stock solution in water) Added to μL of LB medium. The light output is Dynatech ML3000 lumino Quantification was performed at 26 ° C. in a meter. After addition of 0.25 mg / mL ethidium bromide At the 180th minute, the induction rate was 1.9 times.   E. coli (E.coli) Strain DPD2794 further comprises a disk dispersion assay (Disk diffusion assay) for the presence of cadmium chloride To respond. The cells were converted to kanamycin (Kanamycin). (50 μg / mL) on an LB agar plate containing 100 mM salt Filter disks pre-wetted with 20 μl of cadmium bromide solution -Placed on the plate. After overnight incubation at 37 ° C, the agar -The plate was cooled down to room temperature. DuPont Reflection Fill The system was exposed to the plate for 10 minutes. Raw, surrounding the area of growth inhibition (18 mm diameter) A region (35 mm diameter) where the emission of light was enhanced was observed.                             Example 13 KatG transformation for methyl viologen, hydrogen peroxide or menadione Host cell response   E. coli containing plasmids pKatLux2 and pKatGLux6 (E.coli ) Grow the strain in LB medium overnight at 37 ° C and place in fresh LB medium Diluted and grown at 37 ° C. until early log phase. Add 40 μL of cells to 6 0 μL of LB medium and methyl diluted from a 200 mg / mL stock solution in water Hydrogen peroxide (H) diluted from 0.3% solution in viologen (MV) or waterTwo OTwo) At various concentrations. The light output is Dynatech ML30 Quantification was performed at 26 ° C. in a 00 luminometer. The data are summarized in Tables VII and VI below. Illustrated in II. * The highest concentration tested.   E. coli (E  .coli) Strain DPD2511 is even more sensitive to the presence of menadione It was also shown to respond with increased bioluminescence. Allow cells to grow overnight, kanamycin (Kanamycin) (25 μg / mL) in LB medium at 26 ° C. And diluted in LB medium and grown at 26 ° C. until log phase. 2 0 μL of cells were added to various concentrations of menadione (20 μL in water) in 80 μL of LB medium. Microtiter plate containing a solution diluted from a 0 mg / mL solution). Was added. The light output was measured in a Dynatech ML3000 luminometer, It was quantified at 6 ° C. At 80 minutes, biogenesis of cells treated with 2.3 mM menadione Light was 1200 times greater than the untreated control.                             Example 14 Response of MicF transformed host cells to methyl viologen or hydrogen peroxide   E. coli containing plasmids pMicFLux1 and pMicFLux2 (E.   coliA) grow the strain in LB medium at 37 ° C. overnight and in fresh LB medium And grown at 37 ° C. until early log phase. 40 μL of cells Diluted from a 200 mg / mL stock solution in water, 60 μL of LB medium, and water. Of tilviologen or hydrogen peroxide (diluted from a 0.3% solution in water) Added to various concentrations. Light output, Dynatech ML3000 Lumi Quantification was performed at 26 ° C. in a nomometer. The data is shown in Tables IX and X below. # Longest lead analyzed. * Maximum concentration tested. Example 15 Response of UspA transformed host cells to ethanol and copper sulfate   Plasmid pUspALux. E. coli containing 2E.coli) Stock DE13 4 overnight at 26 ° C., Kanamycin (50 μg / mL) And grown in LB medium containing Kanamycin (5 (0 μg / mL) in fresh LB medium containing C. and grown. Fifty microliters of cells were transferred to Kanamycin (5 0 μg / mL) and etano Tool (added directly to the medium) or copper sulfate (diluted from a 250 mM stock solution in water). LB medium containing various concentrations of the same. The light output is Dy Quantification was performed at 26 ° C. in a natech ML3000 luminometer. ethanol The maximal response induced by was observed at a final ethanol concentration of 4%; At 60 minutes after the addition of the ethanol, the induction ratio was 148 times. Maximum copper sulfate induction is final A concentration of 5 mM was achieved; at 60 minutes the induction was 6.9-fold.                             Example 16 XthA-transformed hotel for propionate, acetate or hydrogen peroxide Primary cell response luxFused to the operonxthAIncludes plasmid with promoter E. coli (E.coli) Strain was transformed with Kanamycin (25 μm); g / mL) in LB medium containing 26 ° C. and kanamycin (Kan amycin) (25 μg / mL) and diluted in fresh LB medium Grow at 26 ° C. until log phase. Fifty microliters of cells were transferred to kanamycin (Ka namycin) (25 μg / mL), and acetate (2M stock solution in water) ), Propionate (diluted from a 2M stock solution in water) ) Or hydrogen peroxide (diluted from a 30% stock solution in water) Was added to 50 μL of LB medium containing various concentrations. Light output is Dynatec Quantification was performed at 26 ° C. in an hML3000 luminometer. To the stock DPD2778 Nine hours after the addition of 0.025% hydrogen peroxide, the bioluminescence was comparable to the control without addition. 70 fold greater than that at day 1 after addition of 100 mM acetate, with an induction of 54 And 100 mM propio On the third day after the addition of the nate, the response rate was 207. About DPD2781 18 hours after the addition of 0.05% hydrogen peroxide, no bioluminescence was observed for the control without addition. 660-fold greater than that at day 1 after addition of 100 mM acetate, an induction of 6 And on day 3 after addition of 100 mM propionate, the induction was 291 It became.                             Example 17 Response of his-transformed host cells to gene expression luxFused to the operonhisLarge containing plasmids with promoters Enterobacteria (E  .coli) Strain depends on gene expression in the presence of appropriate regulators It has been shown in gender experiments that it is regulated by a stringent response system. Plastic Smid DNA was identified as otherwise syngeneic and with normal regulation (strain CF16 48),relAIf the regulatory gene is mutated (strain CF1693), KuharelAandspoTMutations in both regulatory genes (strain 16 51) CaCl in the strainTwoMediated transformation. These strains Is M. Cashel (Xiao et al. (1991) Residual)   Guanosine 3'5'-bispyrophosphate syn thetic activity of relA null mutants   can be eliminated byspoT  null muta tions. J. Biol. Chem. 266: 5980-5990) I got it. These strains contain Ampicillin (15 μg / mL) in LB medium containing overnight at 37 ° C. and diluted in the same medium, The cells were grown at 37 ° C. until the early log phase. Bioluminescence, Dynatech   ML3 Quantification was performed at 26 ° C. in a 000 luminometer. Each of the three plasmidsrelA Mutants show reduced bioluminescence, andrelA,spoTDouble mutation The body showed a dramatic decrease in bioluminescence. The data is shown in Table XII below.  These fusions can also be induced by exposure to serine hydroxamate Was completed. This compound is a tRNA with seryl-tRNA synthetaseserAmi It is a specific inhibitor of noacylation [Pizer and Tosa (1971)   J. Bacteriol. 106: 972-982]. Cells are converted to uracil ( 25 μg / mL), kanamycin sulfate (10 μg / mL), and glucose ( 0.4%) supplemented with a minimum E medium (Davis et al., Advance) d Bacterial Genetics. Cold Spring Ha rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1980) at 29 ° C. with shaking overnight. Cells Diluted 20-fold in the same medium, which was modified only by omitting the kanamycin acid And 19 and 34 klet units as described above (Klett Unit) ) And grown up. Serine D, L-hydroxamate in water (D, Ls erine hydroxamate) was added to a kanamycin sulfate solution. Dilutions in the same medium, only modified by omission of the solution (two-fold serial dilutions). This 50 μL of these dilutions (50 μL) were added to 50 μL of actively growing culture and microtiter -Mix in the plate. Light output is Dynatech ML3000 Luminometer Quantification was performed at 26 ° C. in a thermometer. Following induction after 1180 minutes of incubation Rates were observed: This data allows the detection of a wide variety of amino acid biosynthesis inhibitors. Knowledge of astringent response mechanisms was used to develop Is implied. Because many herbicides are inhibitors of amino acid biosynthesis, Osensors may be useful detectors for a number of herbicides [e.g. Lactate synthase-specific herbicides (sulfonylureas, imidazolinones, and Triazolopyrimidine class), phosphinothricin, and And glyphosate].Example 18 Response of phoA transformed host cells to limited phosphate luxFused to the operonphoAIncludes plasmid with promoter E. coli (E  .coli) Strains DPD1522 through DPD1533 are limited A response to the phate was indicated. These strains lack tricine and Glucose (0.4%), vitamin B1 (0.00002%) and And standard concentration of phosphate (2.0 mM) or limited concentration of phosphate Medium (0.1 mM) (Bochner et al. (198) 2) Complete analysis of cellular nucl eotides by two-dimension thin layer r chromatography,J. Biol. Chem. 257: 97 59-9969) on a single colony. Overnight at 37 ° C After incubation, the plates are cooled to room temperature and for various times DuP The film was exposed to an on Reflections film. Standard concentration of phosphate Strains required 3 hours to provide significant exposure to the film. In contrast, strains growing on limited phosphate media have a significant Only one hour is required to produce an exposure, and thus production from a limited carbon source Induction of paraluminescence was shown.   This result was confirmed by an experiment performed using a luminometer. Remove the culture Glucose (0.4%), uracil (25 μg / mL) at 29 ° C. with shaking overnight ) And kanamycin sulfate (10 μg / mL) They were grown in the above minimal medium containing lium. Cells are harvested by centrifugation and then kanamycin sulfate and potassium phosphate. Resuspended in an equal volume of the same medium modified only by omitting the system. 50 μL The cells were treated with phosphate, lacking kanamycin sulfate and ranging from 0 to 2000 μM. The solution was added to 50 μL of the same medium modified to the final concentration of potassium. Light out Force as a function of time greater than 300 minutes after addition of resuspended cells, Dynat Quantification was performed at 26 ° C. in an ech ML3000 luminometer. Two strains [DPD 1522 (pPhoALux3 / W3110) and DPD1523 (pPhoALux3 / W3110) ALux4 / W3110)] is shown below:ni: no induction observed * Time of measurable luminescence increase above baseline measurementExample 19 Response of g1nA transformed host cells to glutamine as a single nitrogen source   E. coli (E.coli) Strain DPD2831 with 0.1% (NHFour)TwoSOFourIncluding Minimal phosphate medium (Bender et al., (1977) Bioc). chemical parameters of glutamine synt hetase from Klebsiella aerogenes,J. B acteriol , 129: 1001-1099). these Cultures were harvested by centrifugation and either in the same medium (control) or (NHFour )TwoSOFourMedium lacking but containing 0.004% glutamine as the sole nitrogen source Was resuspended in any of Light emission is Dynatech ML3000 lumino Quantification was performed at 26 ° C. in a meter. At 62 minutes after resuspension, a poor nitrogen source (gluta Cells in the medium with (min) showed 62 times more bioluminescence than the control culture .                             Example 20 Construction of lac-containing plasmids and host cells   E. coli (E.coli) Is Vibrio Fiskeri (Vibrio fis cheri ) From plasmidluxGene is E. coli (E.coli)lacStep It was constructed to be placed under the control of a motor. pUC19 (Yanisch- Perron et al. , (1985) Improved M13 ph age cloning vectors and host strains : Nucleotide sequences of the M13mp18   and pUC 19 vectors, Gene 33: 103-119).P vu II ~EcoRI fragmentSmaI andEcoPUCD6 digested with RI 15 (Rogowsky et al., (1987) Regulation   of thevir  geness ofAgrobacterium t umefaciens   plasmid pTiC58,J. Bacterio l , 169: 5101-5112) to yield pLacLux. . This plasmid was originally F'lacIqE. coli containingE.coli) Strain XL1-Blue (Bullock et al. (1987), XL1-B lue: A high efficiency plasmid transf ormingrecA Escherichia coli  strain with beta-galactosidase selection, Bi otechniques, 4: 376-379).luxRemains The gene became inducible by IPTG. This plasmid is further transformed into CaClTwoBy E. coli (E.coli) Strain W3110, RFM4 43, and inserted into DE 112 (see Example 10, Table V).                             Example 21 Response of lac transformed host cells to carbon source levels   Glucose was isolated from E. coli (each containing plasmid pLacLux).E.coli ) Are preferred carbon sources for strains TV1058 and TV1068, Contains kanamycin (25 μg / mL) and lacks 0.4% glucose Grow overnight at 26 ° C. in either LB medium containing or containing. Dilute this overnight culture and It was grown in the same medium as the overnight culture until early log phase. Culture turbidity, # 66 Kret-Sumson equipped with a red filter (merson) colorimeter. The luminescence present in 50 μL of cell culture is Quantification was performed at 26 ° C. in a Dynatech ML3000 luminometer. data Is shown in Table XIV below.   Therefore, cells containing plasmid pLacLux are optimally located in LB medium. Increases bioluminescence when grown under lower carbon sources.                             Example 22 Construction of FabA Transformed Host Cells and Response to Fatty Acid Starvation fabAThe gene is responsible for the arrangement of the double bonds in the fatty acids, and therefore for E. coli (E   .coli) Encodes an enzyme responsible for the arrangement of the membrane. Such a double bond It is absolutely necessary for growth.fabASynthesis involves two promoter elements, namely Low; constitutive upstream and inducible downstream promoters Commanded.fabAOf the two promoters in the sequence surrounding ing. The PCR promoters shown in Table IV are without the constitutive upstream promoter. Designed to allow cloning of an inducible downstream promoter . Downstream promoter transcription can be regulated at least 10-fold at the RNA level (Henry et al.,J. Mol. Biol. 222: 843- 849 (1991)).fabA−lacDouble studied in fusionfab Regulation of the A promoter is a 13-fold modulation at the level of β-galactosidase specific activity. Clauses (Henry et al.,Cell  70: 671-679 (1992)).fabARegulation of expressionfadRMediated by gene products ( Nunn et al. ,J. Bacteriol, 154: 554-560 ( 1983)). FadR protein is regulated downstreamfabAPromoter- By binding to 40 regionsfabAStimulates transcription. Excessive membrane synthesis ability exists If so, long-chain acyl-CoA molecules accumulate. These molecules are FadR proteins. Binds to white matter and regulates itfabADissociate from the promoter (He nry et al. ,Cell, 70: 671-679 (1992)). Follow handfabA−luxThe fusion is expected to act as a monitor of the state of membrane synthesis Is done. Under conditions of fatty acid starvation, the long-chain acyl-CoA pool is small, andf abA −luxExpression should be high; surplus fatty acids have a large pool length Resulting in a chain acyl-CoA, and thus low levels oflu x Expression should result. This fusion not only inhibits fatty acid synthesis, It should also monitor the CoA utility, which isoleucine-valine Can be limited by many factors, including inhibition of the synthetase acetolactate synthase (LaRossa et al., Pp. 108-121 in Biosy). nthesis of Branched Chain Amino Acid s, ed. by Barak, Chipman and Schloss, VC H Publishers, New York, 1990).fabA :: luxPotential details including fusions The method of causing the stress of fatty acid starvation during the resting of the bioreactor is as follows. Inhibition of fatty acid desaturation by including decenoyl-N-acetylcysteamine Harm (Nunn et al., (1983))J. Bactriol, 154: 5 54-560), or sulfometuron methyl (Van Dyk et al. ,Mol. Gen Genet(1987) 207: 435-440). Herbicides or the amino acid valine (LaRossa et al., (1987)   J. Bacteriol. 169: 1372-1378). It may include sequestration of intracellular CoA as ropinyl-CoA.Construction of fabALux and transformation of RFM443 fabA :: luxConstruction of the plasmid for transformation containing the gene fusion is performed by pR One essentially as described in Example 3 for the preparation of Y001 and pRY002 It is prepared using methods and materials.fabATable IV shows the PCR amplification of the promoter. This is accomplished using the primers listed infabAGene sequence is known And are readily available from the GenBank database of nucleic acid sequences. Wear.fabA :: luxThe plasmid carrying the fusion was called pFabALux. Quoted.   E. coli (E.coli) Host RFM443 is WM102 in Example 3. 1 and using the materials and methods described for the construction of WM1202, Transformed with pFabALux.   E. coli transformed with pFabALux (E.coli) Host RFM443 Was performed in minimal E medium containing kanamycin (10 μg / mL). Grow at 29 ° C. overnight. Dilute the overnight culture and mix with the overnight dilution. Grow to early log phase in one medium. Measure culture turbidity using a # 66 red filter -Klett-Summerson colorimeter equipped with Measure with In the presence or absence of 50 μg / mL sulfometuron methyl Of the luminescence present in 50 μL of cell culture was analyzed by Dynatech ML3000. Quantify at 26 ° C. in a luminometer. Culture in the presence of sulfometuron-methyl The products were 10-2 when compared to cultures in the absence of sulfometuron methyl. It is observed to show a 5-fold increase in luminescence.   Therefore, cells containing the plasmid pFabALux were treated under conditions of fatty acid synthesis inhibition. It is expected to increase bioluminescence when grown in.                             Example 23 Response to physical attack trigger recA :: lux,uvrA :: lux,grpE :: lux,dnaK: : Lux ,katG :: lux,micF :: lux,anduspA :: lu x The fusion was exposed to UV light irradiation.grpE :: luxEverything except bioluminescence Responded to this physical attack challenge by increasing. Shake the strain overnight Et al. At 26 ° C. in LB medium supplemented with kanamycin sulfate (25 μg / mL). Grew. After a 20-fold dilution in LB medium, the culture was shaken for 20-4. Continued to a density of 0 Klet units. Culture (50 μl) And fresh LB medium (50 μl) to microtiter plate wells After that, the Stratalinker 1800 device (Stratag (e.g., ene) at 254 nm. After that, the light output is Quantification at 26 ° C. in a Dynatech ML3000 luminometer as a function Was. Response rates were calculated after 240 minutes of incubation. These are shown in Table XVI Reported to: Example 24 Low volume assay   Example 24 demonstrates that the detector cells of the present invention can be used with 0.5 with reproducible results. indicates that it may be applied to assay methods that utilize small volumes of assay volume You.Experiment 1   The overnight culture of TV1061 was LB-100 μg / ml ampicillin (Ampi (Chillin). The next day, the culture was diluted 1/50 and . Growed to an OD600 of 8. Add 7 microliters of cells to a diameter of 3 . Has wells of 5 mm and 0.9 mm deep and 8 microliter capacity Was added to each of the 60 wells of the microtiter plate. 1.2 microphone Add a liter of 20% ethanol to half of the wells and add The final concentration was 3%.   After 40 minutes at room temperature, the X-ray film was placed on the sheet for 10 minutes. One Microliters were added from two different wells, after addition of ethanol, 0, 30, and Samples were taken at 60 and 60 minutes. Serial dilutions are performed and LB-ampicillin (Am picillin) plate. This X-ray film Was developed.   The next day the colonies on the plate were counted and the concentration of cells was 3.9 x 108ml Or 2.7 × 10 per well6The cells were determined. This X-ray Film showed a clear induction of luminescence by ethanol. Cells during one hour experiment Density increased by a factor of 2.2.Experiment 2   The overnight culture of TV1061 was LB-100 μg / ml ampicillin (A mpicillin). This culture was diluted 1/50 and Grow to an OD600 of 0.5. Cells are diluted with the following dilutions and additives Divided into 6 tubes containing:           Tube 1 500 µl + 15 µl 100% EtOH           Tube 2 500μl           Tube 3 500 µl 1/20 dilution + 15 µl 100% EtOH           Tube 4 500 μl 1/20 dilution           Tube 5 500 μl 1/100 dilution + 15 μl 100% EtOH           Tube 6 500 μl of 1/100 dilution   Bring these dilutions to a dark room, where the induction of luminescence by ethanol is dilute. This was evident in the undiluted and 1/20 diluted samples.   Remove three samples of 1 microliter each from tubes 1-6 and place on ice Put on top. Aliquot 8, 8, and 0.5 microliter aliquots each 9 wells in a microtiter plate with a volume of chlorliters Was added. X-ray film was placed on the microtiter plate for 15,30 , And 90 minutes. Make serial dilutions of the sample placed on ice and LB-A Plates were plated on Ampicillin. Colonies are counted the next day Counts and the original cell concentration is 1.2 × 108Determined to be cells / ml Was.   Good induction by ethanol, as determined by X-ray film, was 6%. . 0x10FourAll non-diluted samples, including 0.5 microliter samples containing cells Occurred in the sample. In the case of 1/20 dilution, induction was performed on an 8 microliter sample. Was clearly observed. These results indicate that the system has a small well volume, Or a low cell number.   All but one of the examined constructs responded to physical and chemical stress. It became clear that.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 微生物集団にかかる環境ストレスを検出するための改善された方法にお いて、（ａ）ある環境傷害物に原核生物ディテクター生物体を暴露する段階であ って、前記原核生物ディテクター生物体がストレス誘導性プロモーター配列の制 御下に置かれる発現可能な異種ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含むように遺伝 子的に操作されたものであり、この場合前記プロモーターは包括的調節回路に対 して応答性を示すものである段階；および（ｂ）前記原核生物ディテクター生物 体の発光の増加を測定する段階、からなり、改善が、 （ａ）約０．５μｌ〜約１０μｌの容量を有する少なくとも一つの容器の中に 原核生物ディテクター生物体を含む培地を分配し、前記原核生物ディテクター生 物体がストレス誘導性プロモーター配列の制御下に置かれる発現可能な異種ｌｕ ｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含むように遺伝子的に操作されており、この場合プ ロモーターは包括的調節回路に対して応答性を示すものであり； （ｂ）環境傷害物に原核生物ディテクター生物体を暴露し； （ｃ）原核生物ディテクター生物体の発光の増加を測定するために発光検出機 を用いる、 ことを含んでなる改善された方法。 ２． 容器がマイクロタイタープレートのウエルであり、そして発光検出機が ｘ−線フィルムである、請求の範囲１の方法。 ３． 原核生物ディテクター生物体は、環境傷害物に暴露するとき、対数期に ある、請求の範囲１の方法。 ４． ストレス誘導性プロモーター配列が、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＫ、ｇｒｐＥ 、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕ ｓｐＡ 、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｍｉｃＦ、ｆａｂＡ、ｌａｃ、ｈｉｓ 、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、およびｎａｒＧか らなる群より選択される、請求の範囲１の改善された方法。 ５． 原核生物ディテクター生物体が腸内原核生物である、請求の範囲１の方 法。 ６． 原核生物ディテクター生物体が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である、請求 の範囲１の方法。 ７． 更に発光の増加を環境ストレスのレベルに相関させることを含む、請求 の範囲１の方法。 ８． 環境傷害物が、アトラジン、ベンゼン、硫酸銅、２，４−ジクロロフェ ノキシ酢酸、エタノール、メタノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェ ノール、ペンタクロロフェノール、フェノール、トルエン、ジメチルスルホキシ ド、硝酸鉛、塩化カドミウム、塩化ナトリウム、メナジオン、臭化エチジウム、 ヒドロキサム酸セリン、アセテート、プロピオネート、過酸化水素、ピューロマ イシン、塩化水銀、２，４−ジクロロアニリン、プロパノール、ブタノール、イ ソプロパノール、塩化メチレン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、アクリルアミド、メ チルビオロゲン、マイトマイシンＣ、キシレン、および紫外線照射からなる群よ り選択される、請求の範囲１の方法。 ９． 環境傷害物が、 （ｉ）ｒｐｏＨもしくはその遺伝子産物の作用を変化させる蛋白質損 傷、 （ｉｉ）ｏｘｙＲもしくはその遺伝子産物の作用を変化させる酸化的損傷、 （ｉｉｉ）ｓｏｘＲＳもしくはそれらの各遺伝子産物の作用を変化させる酸化 的損傷、 （ｉｖ）ｆａｄＲもしくはその遺伝子産物の作用を変化させる膜損傷、 （ｖ）ｒｅｌＡおよびｓｐｏＴもしくはそれらの各遺伝子産物の作用を変化さ せるアミノ酸飢餓、 （ｖｉ）ｃｙａおよびｃｒｐもしくはそれらの各遺伝子産物の作用を変化させ る炭素飢餓、 （ｖｉｉ）ｐｈｏＢ、ｐｈｏＭ、ｐｈｏＲ、およびｐｈｏＵ、もしくはそれら の各遺伝子産物の作用を変化させるホスフェート飢餓、 （ｖｉｉｉ）ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＧ、およびｇｌｎＬ、もしくはそれ らの各遺伝子産物の作用を変化させる窒素飢餓、 （ｉｘ）それ自体の調節因子の作用を変化させるユニバーサルストレス応答； （ｘ）ｒｐｏＳもしくはその遺伝子産物の作用を変化させる定常期応答；ある いは （ｘｉ）ｌｅｘＡもしくはｒｅｃＡまたはそれらの各遺伝子産物の作用を変化 させるＤＮＡ損傷、 を刺激する、請求の範囲１の方法。[Claims] 1. An improved method for detecting environmental stress on a microbial population, comprising: (a) exposing a prokaryotic detector organism to an environmental hazard, wherein said prokaryotic detector organism comprises a stress-inducible promoter sequence. Genetically engineered to contain an expressible heterologous lux CDABE gene complex that is placed under the control of a promoter, wherein the promoter is responsive to a global regulatory circuit; And (b) measuring the increase in luminescence of said prokaryotic detector organism, the improvement comprising: (a) prokaryotic detector organism in at least one container having a volume of about 0.5 μl to about 10 μl. The medium containing the cells, wherein the prokaryotic detector organism is placed under the control of a stress-inducible promoter sequence. Genetically engineered to contain an expressible heterologous luxCDABE gene complex, wherein the promoter is responsive to a global regulatory circuit; (b) a prokaryotic detector for environmental damage Exposing the organism; (c) using a luminescence detector to measure the increase in luminescence of the prokaryotic detector organism. 2. The method of claim 1 wherein the container is a well of a microtiter plate and the luminescence detector is an x-ray film. 3. 2. The method of claim 1, wherein the prokaryotic detector organism is in a logarithmic phase when exposed to an environmental hazard. 4. Stress-inducible promoter sequence, groEL, dnaK, grpE, phoA , glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, u spA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi- 28. The improved method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of: recA , xthA , and narG . 5. 2. The method of claim 1, wherein the prokaryotic detector organism is an intestinal prokaryote. 6. Prokaryotic an organism detector organism Escherichia coli (E. Coli), the method of claim 1, wherein. 7. 2. The method of claim 1, further comprising correlating the increase in luminescence to the level of environmental stress. 8. Environmentally hazardous substances include atrazine, benzene, copper sulfate, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, ethanol, methanol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol, pentachlorophenol, phenol, toluene, dimethylsulfoxide, lead nitrate, and cadmium chloride. , Sodium chloride, menadione, ethidium bromide, serine hydroxamate, acetate, propionate, hydrogen peroxide, puromycin, mercury chloride, 2,4-dichloroaniline, propanol, butanol, isopropanol, methylene chloride, Triton X100, acrylamide, methyl 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of viologen, mitomycin C, xylene, and ultraviolet radiation. 9. Environmentally hazardous substances include (i) protein damage that alters the action of rpoH or its gene product, (ii) oxidative damage that alters the action of oxyR or its gene product, (iii) the action of soxRS or each of their gene products (Iv) membrane damage that alters the action of fadR or its gene product; (v) amino acid starvation that alters the action of relA and spoT or their respective gene products; (vi) cya and crp or (Vii) phoB , phoM , phoR , and phoU , or phosphate starvation that alters the action of each of their gene products; (viii) glnB , glnD , glnG , and glnL. Or that Nitrogen starvation altering the action of each of these gene products, (ix) universal stress response altering the action of its own regulator; (x) stationary phase response altering the action of rpoS or its gene product; or ( xi) stimulating DNA damage that alters the action of lexA or recA or their respective gene products.
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