JP2001502912A - Human tumor necrosis factor receptor-like 2 - Google Patents

Human tumor necrosis factor receptor-like 2

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、レセプターの腫瘍壊死因子ファミリーの新たなメンバーに関する。本発明は、ヒトＴＲ２レセプターおよびその２つのスプライス変異体をコードする単離された核酸分子に関する。ＴＲ２ポリペプチドもまた提供され、ベクター、宿主細胞およびこれらの組換え製造もまた提供される。本発明はさらに、ＴＲ２レセプター活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクリーニング方法に関する。また、ＴＲ２レセプターの異常発現に関連する病状を検出する診断方法も提供される。さらに、ＴＲ２レセプターを発現する細胞の増殖および分化の異常に関連する病状を治療する治療方法も提供される。   (57) [Summary] The present invention relates to new members of the tumor necrosis factor family of receptors. The present invention relates to isolated nucleic acid molecules encoding the human TR2 receptor and two splice variants thereof. Also provided are TR2 polypeptides, as are vectors, host cells and recombinant production thereof. The present invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of TR2 receptor activity. Also provided is a diagnostic method for detecting a condition associated with abnormal expression of a TR2 receptor. Further, a therapeutic method for treating a pathology associated with abnormal proliferation and differentiation of a cell expressing the TR2 receptor is also provided.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍壊死因子レセプター−ライク２ 発明の分野 本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーの新規なメンバーに 関する。より詳細には、ネズミ科ＣＤ４０に対してかなりの相同性を有する、ヒ トＴＮＦ−レセプター−関連タンパク質（本明細書において図１Ａ−１ＢのＴＲ ２レセプターを意味する）をコードする単離された核酸分子が提供される。ＴＲ ２−ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２と称される、２種の異なるＴＲ２スプライス変 異体もまた提供される。ヒトタイプ２ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−ＲＩＩ）に相 同性のあるＴＲ２ポリペプチドもまた提供される。さらに、ベクター、宿主細胞 およびこれらを製造するための組換え方法が提供される。本発明はまた、ＴＲ２ レセプターポリペプチドの活性の阻害および増強の両方、ならびにＴＲ２レセプ ター遺伝子発現を検出するための診断法に関する。 関連する分野 ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシ ン）は、総じてサイトカインと称される、インターフェロン、インターロイキン および増殖因子を含む、ポリペプチドメディエーターの広義のクラスに関連する メンバーである(Beutler，B．and Cerami，A.，Annu．Rev．Immunol.，7:625-65 5(1985))。 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、もともとはその抗−腫瘍活 性の結果として見出されたが、しかしながら、現在では宿主中で生物化学的プロ セスおよび病理の重要な役割を担う多面発現性のサイトカインであると認識され ている。現在までのところ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β(リンホトキシン−α)、Ｌ Ｔ−β、ＴＲＡＩＬおよび、Ｆａｓレセプター、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０ 、ＯＸ４０および４−１ＢＢレセプターのリガンドの、１０個のＴＮＦ−関連 サイトカインファミリーが知られる。これらのタンパク質は、保存されたＣ−末 端配列、および、ＴＮＦ−βを除き、しばしば膜アンカーとして用いられる可変 性Ｎ−末端配列を有する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両者は、ＴＮＦレセプ ターに結合すると、ホモトリマーとして機能する。 ＴＮＦは、単核球、線維芽細胞、Ｔ−細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を 含む多くの細胞タイプ、主に、活性化マクロファージにより産生される。ＴＮＦ −αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫促進、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、抗−ウ イルス応答の産生、敗血症ショック、脳性マラリア、細胞毒性、化学療法の間に 産生される電離性放射線の有害作用、例えば、酵素の変性、脂質過酸化およびＤ ＮＡ損傷などに対する防御(Nata et al.，J．Immunol．136(7):2483(1987))、増 殖調節、血管内皮作用および代謝作用において役割を担うことが報告されている 。ＴＮＦ−αはまた、内皮細胞を刺激し、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ およびＩＬ−６を含む種々の因子を分泌させ、細胞増殖を促進する。加えて、Ｔ ＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１などの種々の細 胞接着分子をアップレギュレーションする。ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドは また、プログラムされた細胞死を誘発することが示されている。 ＴＮＦ−βは、抗ウイルス状態および腫瘍壊死の誘発、多形核白血球の活性化 、内皮細胞上のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体抗原の誘発、内皮細胞上の付 着分子の誘発および成長ホルモン刺激を含む、多くの活性を有する(Ruddle,N.an d Homer，R.，Prog．Allergy 40:162-182(1988))。 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βはどちらも増殖調節に関与し、分化のいくつかの 段階で造血細胞と相互作用し、種々のタイプの前駆体細胞の増殖を阻害し、未分 化の骨髄単核細胞の増殖を誘発する。Porter，A.，Tibtech 9:158-162(1991)。 「ノックアウト」マウスを用いた最近の研究から、ＴＮＦ−β産生の欠損した マウスは、末梢リンパ器官の異常発達および脾臓構造における形態的変化を示す ことが示されている(Aggarwal et al.，Eur Cytokine Netw，7(2):93-124（1996 ）に概説される)。リンパ器官に関して、膝窩、鼠蹊、傍大動脈、腸間膜、腋窩 および脳リンパ節は、ＴＮＦ−β−／−マウスにおいて発達しなかった。加えて 、Ｔ ＮＦ−β−／−マウス由来の末梢血は、正常マウスと比較して含まれる白血球細 胞が３培減少していた。しかしながら、ＴＮＦ−β−／−マウス由来の末梢血は 、その正常対照と比較して４倍以上のＢ細胞を含有した。さらに、ＴＮＦ−βは 、ＴＮＦ−αと対照的に、ＥＢＶ−感染Ｂ細胞の増殖を誘発することが示されて いる。これらの結果から、ＴＮＦ−βがリンパ球発達に関与することが示される 。 ＴＮＦ−αまたは−βにより媒介される種々の細胞性応答の誘発における第一 段階は、特異的細胞表面または可溶性レセプターへのそれらの結合である。約５ ５−ＫＤａ（ＴＮＦ−ＲＩ）および７５−ＫＤａ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）の２つの別 個のＴＮＦレセプターが同定されており(Hohman et al.，J．Biol．Chem.，264: 14927-14934(1989))、両方のレセプタータイプに対応するヒトおよびマウスｃＤ ＮＡが単離され、解析されている(Loetscher et al.，Cell，61:351(1990))。両 方のＴＮＦ−Ｒは、細胞外、膜貫通および細胞内領域を含む細胞表面レセプター の典型的な構造を共有する。 これらの分子は、細胞結合形態のみならず、完全なレセプターの切断された細 胞外ドメイン(Nophar et al.，EMBO Journal，9(10):3269-76(1990))、および、 さもなければ膜貫通ドメインが欠損している完全なレセプターからなる可溶性形 態でも存在する。ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩの細胞外ドメインは、２８ ％の同一性を共有し、有意なサブユニット間の配列相同性を有する４回繰り返さ れるシステイン−リッチなモチーフにより特徴付けられる。細胞タイプおよび組 織の大多数は、両方のＴＮＦレセプターを発現しているようであり、両方のレセ プターは、シグナルトランスダクションにおいて活性であるが、しかしながら、 異なる細胞性応答を媒介できる。さらに、ＴＮＦ−ＲＩＩは、ＰＣＴ ＷＯ９４ ／０９１３７において示されるように、ＴＮＦによりヒトＴ−細胞増殖を排他的 に媒介することが示された。 ＴＮＦ−ＲＩ依存応答には、Ｃ−ＦＯＳ、ＩＬ−６−およびマンガンスーパー オキシドジスムターゼｍＲＮＡの蓄積、プロスタグランジンＥ２合成、ＩＬ−２ レセプターおよびＭＨＣクラスＩおよびＩＩ細胞表面抗原発現、増殖阻害、なら びに細胞毒性が包含される。ＴＮＦ−Ｒ１はまた、ホスホリパーゼＡ2、プロテ インキナーゼＣ、ホスファチジルコリン−特異的ホスホリパーゼＣおよびスフィ ンゴミエリナーゼなどのセカンドメッセンジャーシステムを刺激する(Pfefferk et al.，Cell，73:457-467(1993))。 いくつかのインターフェロンおよび他の薬剤は、ＴＮＦレセプターの発現を調 節することが示されている。例えば、レチノイン酸は、いくつかの細胞タイプに おいてＴＮＦレセプターの産生を誘発するが、他の細胞においては産生をダウン レギュレーションすることが示されている。加えて、ＴＮＦ−αは、両方のタイ プのレセプターの局在化に作用することが示されている。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ −ＲＩのインターナリゼーションおよびＴＮＦ−ＲＩＩの分泌を誘発する(Aggar wal et al.，前掲にて概説される)。それゆえ、両方のＴＮＦ−Ｒの産生および 局在化は、種々の薬剤により調節される。 酵母ツーハイブリッドシステムならびに共同沈降および精製の両方が、両方の タイプのＴＮＦ−Ｒと結合するリガンドを同定するのに用いられている(Aggarwa l et al.，前掲およびVandenabeele et al.，Trends in Cell Biol.，5:392-399 (1995)に概説される)。ネズミ科ＴＮＦ−Ｒの細胞質ドメインと相互作用するい くつかのタンパク質が同定されている。これらのタンパク質のうちの２つが、ア ポトーシスのバキュロウイルス阻害剤に関連しているようであり、このことは、 プログラムされた細胞死の調節におけるＴＮＦ−Ｒの直接的な役割を示唆する。 発明の概要 本発明は、図１Ａ−１Ｂ(配列番号２)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）および図 ７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示されるアミノ酸配列、または、ＡＴＣＣ受託番号 ９７０５９、９７０５８および９７０５７（１９９５年２月１３日）として細菌 宿主中に入れて寄託されたＴＲ２レセプターをコードするｃＤＮＡクローンによ りコードされるアミノ酸配列を有する、ＴＲ２レセプターおよびそのスプライス 変異体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本 発明はまた、本発明の単離された核酸分子を包含する組換えベクター、該組換え ベクターを含む宿主細胞、ならびに該ベクターおよび宿主細胞を作成する方法、 および組換え技術によりＴＲ２ポリペプチドまたはペプチドを製造するためのそ れらの使用方法に関する。 本発明はさらに、本明細書に記載するポリヌクレオチドによりコードされるア ミノ酸配列を有する単離されたＴＲ２ポリペプチドを提供する。 本発明はまた、ＴＲ２レセプターにより誘発される細胞性応答を増強または阻 害する能力を有する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、ＴＲ ２レセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させ、細胞性応答をアッセイし 、標準細胞性応答と細胞性応答とを比較し、ここで標準は、接触を候補化合物の 非存在下で行う；これにより、標準よりも増加した細胞性応答は、化合物がアゴ ニストであることを示し、標準よりも減少した細胞性応答は、化合物がアンタゴ ニストであることを示す方法を提供する。 別の態様において、細胞リガンドのＴＲ２レセプターへの結合において候補化 合物が有する作用を調べることを含む、アゴニストおよびアンタゴニストについ てのスクリーニングアッセイが提供される。詳細には、該方法は、ＴＲ２レセプ ターをリガンドペプチドおよび候補化合物と接触させ、ＴＲ２レセプターへのリ ガンド結合が候補化合物の存在により増加または減少するかどうかを調べること を含む。 本発明はさらに、ＴＲ２レセプター発現における変化による異常細胞増殖の結 果として起こる病状の診断または予測に有用な診断方法を提供する。 本発明のさらなる態様は、体内でのＴＲ２レセプター活性の増加したレベルを 必要とする個体を治療する方法であって、該個体に、治療的に有効量の本発明の 単離されたＴＲ２ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物を投与するこ とを含む方法に関する。 本発明のさらに別の態様は、体内でのＴＲ２レセプター活性の減少したレベル を必要とする個体を治療する方法であって、該個体に、治療的に有効量の本発明 のＴＲ２レセプターアンタゴニストを含む組成物を投与することを含む方法に関 する。 本発明はさらに、本発明のポリペプチドの可溶性形熊を提供する。可溶性ペプ チドは、膜貫通ドメインを欠くポリペプチド配列を含む、アミノ酸配列により定 義される。かかるＴＲ２レセプターの可溶性形態は、レセプターの膜結合形態の アンタゴニストとして有用である。 図面の簡単な説明 図１Ａ−図１Ｂは、ＴＲ２レセプターのヌクレオチド（配列番号１）および推 定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。タンパク質は、約３６アミノ酸残基（下 線）(配列番号２のアミノ酸残基−３６〜−１)の予想されるリーダー配列を有し 、推定分子量は約３０，４１７ｋＤａである。さらに、約３７〜約２００のアミ ノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基１〜１６４）は、細胞外ドメインを構成； 約２０１〜約２２５（配列番号２のアミノ酸残基１６５〜１８９）は、膜貫通ド メイン(下線)；約２２６〜約２８３（配列番号２のアミノ酸残基１９０〜２４７ ）は、細胞内ドメインを構成すると推定される。２つの潜在的なアスパラギン− 結合グリコシル化部位は、１１０および１７３のアミノ酸部位に位置する(配列 番号２のアミノ酸残基７４〜１３７)。 図２は、図１Ａ−図１ＢのＴＲ２レセプタータンパク質およびネズミ科ＣＤ４ ０タンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図３は、図１Ａ−図１ＢのＴＲ２レセプターアミノ酸配列の解析を示す。アル ファ、ベータ、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域； 可変領域；抗原インデックスおよび表面確率を示す。「Antigenic Index-Jameso n-Wolf」グラフにおいて、図１Ａ−１Ｂにおけるアミノ酸残基３９〜７０、１０ ６〜１２０、１４２〜１８９および２７６〜２８３（配列番号２のアミノ酸残基 ３〜３４、７０〜８４、１０６〜１５３および２４０〜２４７）は、ＴＲ２レセ プタータンパク質の示された高い抗原性領域に対応する。 図４Ａ−４Ｂは、ＴＲ２−ＳＶ１レセプターのヌクレオチド（配列番号４）お よび推定アミノ酸（配列番号５）配列を示す。タンパク質は、約３６アミノ酸残 基（下線）(配列番号５のアミノ酸残基−３６〜−１)の予想されるリーダー配列 を有し、推定分子量は約１９．５ｋＤａである。 図５は、全長ＴＲ２−ＳＶ１レセプタータンパク質およびヒトタイプ２ＴＮＦ レセプター（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図６は、ＴＲ２−ＳＶ１レセプターアミノ酸配列の解析を示す。アルファ、ベ ータ、ターンおよびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可変領域； 抗原インデックスおよび表面確率を示す。「Antigenic Index-Jameson-Wolf」グ ラフにおいて、図４Ａ−４Ｂにおけるアミノ酸残基３９〜７０、９９〜１３６お よび１７１〜１８５（配列番号５のアミノ酸残基３〜３４、６３〜１００および １３５〜１４９）は、ＴＲ２−ＳＶ１レセプタータンパク質の示された高い抗原 性領域に対応する。 図７Ａ−７Ｂは、ＴＲ２−ＳＶ２レセプターのヌクレオチド（配列番号７）お よび推定アミノ酸（配列番号８）配列を示す。このタンパク質は、推定リーダー 配列を欠き、推定分子量は約１４ｋＤａである。 図８は、ＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質およびヒトタイプ２ＴＮＦレセ プター（配列番号９）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図９は、ＴＲ２−ＳＶ２レセプターアミノ酸配列の解析を示す。アルファ、ベ ータ、ターンおよびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可変領域； 抗原インデックスおよび表面確率を示す。「Antigenic Index-Jameson-Wolf」グ ラフにおいて、図７Ａ−７Ｂにおけるアミノ酸残基５６〜６８および９３〜１３ ６（配列番号８）は、ＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質の示された高い抗原 性領域に対応する。 図１０は、図１Ａ−１ＢのＴＲ２レセプタータンパク質および図４Ａ−４Ｂの ＴＲ２−ＳＶ１レセプタータンパク質のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図１１は、図１Ａ−１ＢのＴＲ２レセプタータンパク質および図７Ａ−７Ｂの ＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図１２は、ＴＲ２−ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質のアミ ノ酸配列間の類似性の領域を示す。 図１３Ａ−１３Ｃは、図１Ａ−１ＢのＴＲ２レセプタータンパク質および図４ Ａ−４ＢのＴＲ２−ＳＶ１レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列 間の類似性の領域を示す。 図１４Ａ−１４Ｃは、図１Ａ−１ＢのＴＲ２レセプタータンパク質および図７ Ａ−７ＢのＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列 間の類似性の領域を示す。 図１５Ａ−１５ＥはＴＲ２−ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク 質をコードするヌクレオチド配列間の類似性の領域を示す。 図１６は、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）のＴＲ２レセプターと他のＴＮＦＲフ ァミリーメンバーのアミノ酸配列の整列を示す。ＴＲ２のアミノ酸配列を、ＴＮ ＦＲ−１(配列番号１０)、ＴＮＦＲ−ＩＩ(配列番号１１)、ＣＤ４０（配列番号 １２）および４−ＩＢＢ（配列番号１３）のものと、配列相同性および保存シス テイン残基に基づいて整列させた。 好ましい具体例の詳細な説明 本発明は、ＴＲ２ポリペプチド（図１Ａ−１Ｂ(配列番号２))およびそのスプ ライス変異体、アミノ酸配列がクローニングされたｃＤＮＡの配列決定により決 定されたＴＲ２−ＳＶ１(図４Ａ−４Ｂ（配列番号５))およびＴＲ２−ＳＶ２(図 ７Ａ−７Ｂ(配列番号８))をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸 分子を提供する。図１Ａ−１Ｂに示されるＴＲ２タンパク質は、ネズミ科ＣＤ４ ０レセプター（図２(配列番号３)）と配列相同性を有する。１９９５年２月１３ 日に、American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville ，Maryland 20852に、受託番号９７０５９として寄託した。図１Ａ−１Ｂ（配列 番号１）に示されるヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９中のクロ ーンと少し異なる同じアミノ酸をコードする配列を含むｃＤＮＡクローン（クロ ーンＩＤ ＨＬＨＡＢ４９）を配列決定することによって得た。図１Ａ−１Ｂ（ 配列番号１）に示されるｃＤＮＡ配列は、５’および３’非コーディングヌクレ オチド配列および３つのヌクレオチドにおいて、ＡＴＣＣ受託のものと異なる。 ＡＴＣＣ受託番号９７０５９で寄託されたクローンは、ＴＲ２開始コドンの５ ’ 側に８個のヌクレオチドおよびＴＲ２終止コドンの３’側に２１個のヌクレオチ ドを含む。対照的に、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示されるＨＬＨＡＢ４９の ＴＲ２ｃＤＮＡ配列は、ＴＲ２コーディング配列の５’および３’末端の両方に 、かなり長い非コーディングヌクレオチド配列を含む。さらに、図１Ａ−１Ｂ（ 配列番号１）に示されるＴＲ２レセプターヌクレオチド配列は、ヌクレオチド３ １４にアデニン、ヌクレオチド３８６にシトシン、ヌクレオチド６２７にシトシ ンを含む。対照的に、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９のクローンは、ヌクレオチド ３１４にグアニン、ヌクレオチド３８６にチミン、ヌクレオチド６２７にチミン を含む。 本発明のＴＲ２レセプターは、少なくともこれらの３つのヌクレオチドおよび ２つのアミノ酸における変化を含む、いくつかの対立遺伝子変異体を包含する。 同定されているヌクレオチド配列変異体は、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示す 、ヌクレオチド３１４にグアニンまたはアデニン、ヌクレオチド３８６にチミン またはシトシン、ヌクレオチド６２７にチミンまたはシトシンのいずれかを含む 。ヌクレオチド６２７に同定された変化は、サイレントであるが、ヌクレオチド ３８６における変化により、ヌクレオチド３８５〜３８７のコドンがセリンまた はフェニルアラニンのいずれかをコードし、ヌクレオチド３１４における変化に より、ヌクレオチド３１３〜３１５のコドンがリジンまたはアルギニンをコード することになる。 図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）および図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示すヌクレ オチド配列をまた、１９９５年２月１３日に、American Type Culture Collecti on，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852に、それぞれ受託番号 ９７０５８（ＴＲ２−ＳＶ１）および９７０５７（ＴＲ２−ＳＶ２）として寄託 したｃＤＮＡクローンを配列決定することにより得た。寄託クローンは、ｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）プラスミド（Stratagene，LaJolla，CA）中に含ま れる。 本明細書において用いる「スプライス変異体」なる用語は、はじめは同じゲノ ムＤＮＡ配列から転写され、異なるＲＮＡスプライシングを受けるＲＮＡ分子か ら産生されるｃＤＮＡ分子を意味する。異なるＲＮＡスプライシングは、１次Ｒ ＮＡ転写物が、一般的にはイントロンの除去のためにスプライシングを受け、そ れぞれが異なるアミノ酸配列をコードする１より多くのｍＲＮＡが産生される場 合に起こる。用語「スプライス変異体」はまた、上記のｃＤＮＡ分子によりコー ドされるタンパク質を意味する。 本明細書において用いる「ＴＲ２タンパク質」、「ＴＲ２レセプター」、「ＴＲ２ レセプタータンパク質」および「ＴＲ２ポリペプチド」は、アミノ酸配列同一性 の領域を有し、図１Ａ−１Ｂ(配列番号２)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）または 図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示されるタンパク質に対応するレセプター活性を 有するタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列の異なるスプライシングの結果 の、すべてのタンパク質を意味する。図１Ａ−１Ｂに示されるＴＲ２タンパク質 、図４Ａ−４Ｂに示されるＴＲ２−ＳＶ１タンパク質および図７Ａ−７Ｂに示さ れるＴＲ２−ＳＶ２タンパク質は、かかるレセプタータンパク質の例である。 核酸分子 特記しない限り、本明細書においてＤＮＡ分子の配列決定により決定されたす べてのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems，I nc．のModel 373など)を用いて決定し、本明細書で決定されたＤＮＡ分子により コードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定したい ずれかのＤＮＡ配列の翻訳により予測した。それゆえ、この自動化アプローチに より決定されるＤＮＡ配列について当該分野で知られるように、本明細書で決定 されるいずれのヌクレオチド配列もいくつかの誤りを含み得る。自動化により決 定されるヌクレオチド配列は、配列決定したＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配 列と、典型的には少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％ 〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列を、当該分野で周知のマニュ アルＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによりより正確に決定できる。当該 分野でまた知られるように、実際の配列と比べて決定されたヌクレオチド配列中 の単一の挿入または欠失により、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフ トが起こり、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予想されるアミノ 酸 配列が、かかる挿入または欠失の点から、配列決定されたＤＮＡ分子により実際 にコードされるアミノ酸配列とまったく異なることとなる。 図１Ａ−１Ｂ、図４Ａ−４Ｂまたは図７Ａ−７Ｂのヌクレオチド配列などの、 本明細書において提供される情報を用い、出発物質としてｍＲＮＡを用いるｃＤ ＮＡのクローニングに用いられるものなどの、標準的なクローニングおよびスク リーニング法を用い、ＴＲ２ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を得る ことができる。本発明の例として、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に記載される核 酸分子は、活性化されたヒトＴ−リンパ球由来のｃＤＮＡライブラリー中に見出 された。図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）および図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に記載 される核酸分子は、それぞれ、ヒト胎児心臓およびヒト刺激された単球由来のｃ ＤＮＡライブラリー中に見出された。 実施例６に記載されるように、ＴＲ２ｍＲＮＡは、肺、脾臓および胸腺を含む 、多数の組織において検出され、ヒト細胞においてあらゆるところで発現される ようである。ＴＲ２ ＲＮＡはまた、Ｂリンパ球(ＣＤ１９+)、ＣＤ４+（ＴH1お よびＴH2クローン）およびＣＤ８+Ｔリンパ球の両方、単球および内皮細胞にお いて発現されることが見出された。 実施例６においてまた示されるように、ＴＲ２ｍＲＮＡの産生は、ＴＮＦαに よりＭＧ６３細胞において誘導可能であった。さらに、ＴＲ２ｍＲＮＡの蓄積が 、ＰＭＡまたはＤＭＳＯ処理した際に、ＨＬ６０、Ｕ９３７およびＴＨＰ１細胞 で観察された。ＰＭＡおよびＤＭＳＯは、これら３つの細胞種の分化を誘発する ことが知られる薬剤である。 図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）のＴＲ２ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列 は、約２８３アミノ酸残基の、約３６アミノ酸残基の予想されるリーダー配列を 有し、推定分子量が約３０，４１７ｋＤａであるタンパク質をコードするオープ ンリーディングフレームを含む。予想される成熟ＴＲ２レセプターのアミノ酸配 列は、図１Ａ−１Ｂのアミノ酸残基約３７〜約２８３（配列番号２のアミノ酸残 基１〜２４７）に示される。実施例６において示されるように、リーダー配列切 断部位の位置は、ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質について確認され、図１Ａ−１Ｂ に示されるアミノ酸３６および３７の間（配列番号２のアミノ酸残基−１〜１） であることが見出された。図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ２タンパ ク質は、配列番号３に示されるネズミ科ＣＤ４０タンパク質と約２９％同一であ り、約４７％類似する(図２参照)。 同様に、ＴＲ２のＴＲ２−ＳＶ１スプライス変異体の決定されたｃＤＮＡヌク レオチド配列（図４Ａ−４Ｂ(配列番号４)）は、約１８５アミノ酸残基の、約３ ６アミノ酸残基の予想されるリーダー配列を有し、推定分子量が約１９．５ｋＤ ａであるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。予想さ れる成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプターのアミノ酸配列は、図４Ａ−４Ｂ（配列番号 ５）のアミノ酸残基約３７〜約１８５（配列番号５のアミノ酸残基１〜１４９） に示される。図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）に示されるＴＲ２−ＳＶ１タンパク質 は、配列番号６に示されるヒトタイプ２ＴＮＦレセプタータンパク質と約２５％ 同一であり、約４８％類似する(図５参照)。 ＴＲ２のＴＲ２−ＳＶ２スプライス変異体の決定されたｃＤＮＡヌクレオチド 配列（図７Ａ−７Ｂ(配列番号７)）は、約１３６アミノ酸残基の、予想されるリ ーダー配列を有さない、推定分子量が約１４ｋＤａであるタンパク質をコードす るオープンリーディングフレームを含む。予想されるＴＲ２−ＳＶ２レセプター のアミノ酸配列は、図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）のアミノ酸残基約１〜約１３６ に示される。図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示されるＴＲ２−ＳＶ２タンパク質 は、配列番号９に示されるヒトタイプ２ＴＮＦレセプタータンパク質と約２７％ 同一であり、約４５％類似する(図８参照)。 図１Ａ−１Ｂ、図４Ａ−４Ｂおよび図７Ａ−７Ｂに示されるＴＲ２、ＴＲ２− ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質のヌクレオチドおよびアミノ 酸配列の両方の比較は、いくつかの密接な同一の領域を示す。図１Ａ−１Ｂ（配 列番号２）に示されるＴＲ２レセプタータンパク質のアミノ酸配列は、図４Ａ− ４Ｂ（配列番号５）に示されるＴＲ２−ＳＶ１レセプタータンパク質と、約６０ ％同一であり、約７３％類似し、それぞれの配列のはじめの約１００アミノ酸に おいて、２つのタンパク質は１つの位置において異なる(図１０)。 同様に、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）のＴＲ２レセプタータンパク質のアミノ 酸配列は、図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示されるＴＲ２−ＳＶ２レセプタータ ンパク質のアミノ酸配列と約６０％同一であり、約７１％類似する；しかしなが ら、２つのタンパク質は、ＴＲ２−ＳＶ２タンパク質の中心部分において６０ア ミノ酸長にわたって、ほとんど同一である(図１１)。 対照的に、ＴＲ２−ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２タンパク質は、互いにアミノ 酸レベルで、約２０％同一であり、約３８％類似するのみである。図１Ａ−１Ｂ (配列番号２)に示すＴＲ２タンパク質とこれらのタンパク質との比較と異なり、 これらのタンパク質は、ＴＲ２−ＳＶ２タンパク質の全体の１３６アミノ酸配列 にわたって、その相同性を有する(図１２)。 開示されるＴＲ２タンパク質をコードするｃＤＮＡのそのヌクレオチド配列に 関して、これらの配列の比較は、ＴＲ２ｃＤＮＡは核酸レベルで密接な同一性の ある大きな領域を有することを示す(図１３Ａ−１３Ｃ、図１４Ａ−１４Ｃおよ び図１５Ａ−１５Ｅ)。例えば、ＴＲ２およびＴＲ２−ＳＶ１タンパク質をコー ドするｃＤＮＡ配列は、そのヌクレオチド配列においてほぼ同一の大きな領域を 有し、これは、それぞれのタンパク質のＮ末端およびその５’および３’非コー ディング領域の両方をコードする(図１３Ａ−図１３Ｃ)。さらに、ＴＲ２−ＳＶ １およびＴＲ２−ＳＶ２タンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は 、かなりの相同性を有するが、この同一性は、それぞれのコーディング配列を超 えたその３’領域に限られる(図１５Ａ−１５Ｅ)。 ２つの異なるｃＤＮＡ配列間のかかるほぼ同一の領域は、配列の伸長された範 囲上に維持される場合、それぞれの分子がもともと同一のゲノムＤＮＡ配列から 転写されたことを当業者に示す。さらに、当業者は、１より多くのコドンが同じ アミノ酸をコードできるので、アミノ酸レベルでの２つのタンパク質間の同一性 は、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列が同一性の類似する領域を有するこ とを必ずしも意味しないことを認識する。上記のデータは、本発明のＴＲ２レセ プターは、単一のゲノムＤＮＡ配列から転写され、単一のはじめのＲＮＡ転写物 の複数のスプライス変異体であることを示す。 スプライス変異体と称する、別にスプライスされたＲＮＡから産生される関連 するタンパク質は、当該分野で知られている。例えば、ｓｒｃ遺伝子の転写物は 、異なるＲＮＡスプライシングを受け、細胞種特異的産物を産生する。ほとんど の細胞において、Ｓｒｃタンパク質は、５３３個のアミノ酸からなるが、神経細 胞においては、さらに短いエキソンがｍＲＮＡ中に含まれ、５３９個のアミノ酸 のタンパク質となる。Alberts，B．et al.，MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL(3r d Edition，Garland Publishing，Inc.，1994)，455参照のこと。同様に、性特 異的ｍＲＮＡ転写物がドロソフィラ(Drosophila)中で同定されており、この場合 、異なるｍＲＮＡスプライシングにより、オスでは長さ約５５０アミノ酸のおよ びメスでは長さ約４３０アミノ酸のＤｓｘと呼ばれるタンパク質が得られる。こ れら２つのスプライス変異体タンパク質は、約４００アミノ酸の共通のコア配列 を有する。同上457参照のこと。 本発明において、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ２レセプタータ ンパク質は、ＴＲ２レセプタータンパク質が翻訳されるＲＮＡによりコードされ る全長ポリペプチドであると考えられる。図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）に示され るＴＲ２−ＳＶ１スプライス変異体をコードするＲＮＡは、図１Ａ−１Ｂに示さ れるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０２をコードする領域中に挿入を含み、図１ Ａ−１Ｂに示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１８４をコードする領域中に欠 失を含むものと考えられる。図７Ａ−７Ｂに示されるＴＲ２−ＳＶ２スプライス 変異体をコードするＲＮＡは、図１Ａ−１Ｂに示されるアミノ酸配列のアミノ酸 残基１０２をコードするヌクレオチド配列で開始し、図１Ａ−１Ｂに示されるア ミノ酸配列のアミノ酸残基１８４および２４３をコードする領域中に挿入を含む ものと考えられる。 示されるように、本発明はまた、本発明のＴＲ２レセプターの成熟形態を提供 する。シグナル仮説によれば、哺乳同物細胞により分泌されるタンパク質は、シ グナルまたは分泌性リーダー配列を有し、これは、一度、成長するタンパク質鎖 が粗面小胞体から送り出され始めると、成熟タンパク質から切断される。ほとん どの哺乳動物細胞および昆虫細胞さえも、同じ特異性で分泌されたタンパク質を 切断する。しかしながら、ある場合には、分泌されたタンパク質の切断は、完全 に均一でなく、その結果、２またはそれ以上のタンパク質の成熟タイプが生じる 。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、完全なタンパク質の一次構造 により最終的に決定され、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列に固有である 。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９および９７０５８として同 定される宿主中に含まれるｃＤＮＡクローン、および、図１Ａ−１Ｂ（配列番号 ２）および図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）に示されるｃＤＮＡクローンによりコー ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチ ド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号９７０５９および９７０５８として同定さ れる宿主中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有す る成熟ＴＲ２ポリペプチドは、寄託された宿主中のベクターに含まれるクローン のヒトＤＮＡ配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺 乳動物細胞（例えば、以下に示すようなＣＯＳ細胞）における発現により産生さ れるＴＲ２レセプターの成熟形態を意味する。 本発明はまたＡＴＣＣ受託番号９７０５７に含まれる、分泌性リーダー配列を 含まない、ｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、図７Ａ −７Ｂ（配列番号８）のＴＲ２−ＳＶ２レセプタータンパク質をコードする核酸 配列を提供する。 タンパク質が分泌性リーダーならびにリーダ配列の切断ポイントを有するかど うかを予測する方法が利用可能である。例えば、McGeoch(Virus Res．3:271-286 (1985))およびvon Heinje(Nucleic Acids Res．14:4683-4690(1986))の方法を用 いることができる。これらの方法のそれぞれの公知の哺乳動物分泌性タンパク質 の切断ポイント予測の正確性は、７５〜８０％の範囲である。von Heinje、前掲 。しかしながら、２つの方法は、所定のタンパク質について必ずしも同じ切断ポ イントを予測するとは限らない。 本発明の場合、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞内位置を予測するた めの優れたシステムであるコンピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）(K．Naka i and M．Kanehisa，Genomics 14:897-911(1992))により、図１Ａ−１Ｂ(配列 番号２)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）および図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示 される完全なＴＲ２ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を解析した。この局 在化のコンピューター予測の一部として、McGeochおよびvon Heinjeの方法を取 り入れる。ＰＳＯＲＴプログラムによる解析は、配列番号２および配列番号５の アミノ酸−１および１の間の切断部位を予測した。その後、完全なアミノ酸配列 をさらに、von Heineの（−１，−３）ルールの単純な形態を適用して、視覚観 察により解析した。von Heinje、前掲。かくして、配列番号２に示されるＴＲ２ タンパク質およびＴＲ２−ＳＶ１タンパク質のリーダー配列は、配列番号２およ び配列番号５の両方のアミノ酸残基−３６〜−１からなると予測されるが、予測 される成熟ＴＲ２タンパク質は、配列番号２に示されるＴＲ２タンパク質につい てはアミノ酸残基１〜２４７からなり、配列番号５に示されるＴＲ２−ＳＶ１タ ンパク質については残基１〜１４９からなる。 実施例６に示されるように、ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のリーダー配列の切 断部位を、発現された融合タンパク質のアミノ酸解析を用いて確認した。この融 合タンパク質は、配列番号２および配列番号５のアミノ酸１に対応するアミノ酸 ３７から始まることが見出され、これは、リーダー配列の切断部位がこのタンパ ク質のアミノ酸３６および３７間（配列番号２および配列番号５のアミノ酸残基 −１〜１に対応する）であることを示す。 しかしながら、配列決定の誤りならびに異なる公知のタンパク質のリーダーの 切断部位の多様性から、当業者は、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９のｃＤＮＡによ りコードされるＴＲ２レセプターポリペプチドは、約２８３個のアミノ酸を含む が、２５０〜３１６個のアミノ酸の範囲内のいずれでもよく；このタンパク質の リーダー配列は約３６個のアミノ酸であるが、約３０〜約４２個のアミノ酸の範 囲内のいずれでもよいことを認識するであろう。同様に、ＡＴＣＣ受託番号９７ ０５８のｃＤＮＡによりコードされるＴＲ２−ＳＶ１レセプターポリペプチドは 、約１８５個のアミノ酸を含むが、１６３〜２０７個のアミノ酸の範囲内のいず れでもよく；このタンパク質のリーダー配列は約３６個のアミノ酸であるが、約 ３０〜約４２個のアミノ酸の範囲内のいずれでもよい。さらに、ＡＴＣＣ受託番 号 ９７０５７のｃＤＮＡによりコードされるＴＲ２−ＳＶ２レセプターポリペプチ ドは、約１３６個のアミノ酸を含むが、１２０〜１５２個のアミノ酸の範囲内の いずれでもよい。 示されるように、本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態にあって もよく、例えばクローニングまたは合成して製造されたｃＤＮＡおよびゲノムＤ ＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖であっても よい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコーディング鎖 であってもよく、アンチセンス鎖としても知られる、非−コーディング鎖であっ てもよい。 「単離された」核酸分子は、天然の環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡま たはＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本 発明では単離されたと考える。さらに、単離されたＤＮＡ分子の例には、異種宿 主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の（部分的にまたは実質的 に）精製されたＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のＤ ＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が包含される。本発明の単離 された核酸分子にはさらに、合成されたかかる分子が包含される。 本発明の単離された核酸分子には、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示されるオ ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図１Ａ−１Ｂ（配列 番号２）(最後の２４７アミノ酸)に示される成熟ＴＲ２レセプターのコーディン グ配列を含むＤＮＡ分子；上記した配列と実質的に異なる配列を含むが、遺伝コ ードの縮重により、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＲ２レセプタータ ンパク質をコードする、ＤＮＡ分子が含まれる。もちろん、遺伝コードは、当該 分野で周知である。それゆえ、当業者にはかかる縮重変異を作成することは、慣 用である。 同様に、本発明の単離された核酸分子には、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）に示 されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図４Ａ−４ Ｂ（配列番号５）(最後の１４９アミノ酸)に示される成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプ ターのコーディング配列を含むＤＮＡ分子；上記した配列と実質的に異なる配列 を含むが、遺伝コードの縮重により、ＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードする、 ＤＮＡ分子が含まれる。 さらに、本発明の単離された核酸分子には、図７Ａ１示されるオープンリーデ ィングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子、および、上記した配列と実質的に 異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重により、ＴＲ２−ＳＶ２レセプターをコ ードする、ＤＮＡ分子が含まれる。 他の態様において、本発明は、それぞれ、１９９５年２月１３日にＡＴＣＣ受 託番号９７０５９、９７０５８および９７０５７として寄託されたプラスミド中 に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＴＲ２、 ＴＲ２−ＳＶ１およびＴＲ２−ＳＶ２ポリペプチドをコードする単離された核酸 分子を提供する。さらなる具体例において、これらの核酸分子は、成熟ポリペプ チドまたはＮ−末端メチオニンを欠く全長ポリペプチドをコードする。本発明は さらに、図１Ａ−１Ｂ(配列番号１)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）および図７Ａ −７Ｂ(配列番号７)に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子； 上記の受託クローン中に含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列；または上記の配 列の一つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。かかる単離された分子、 特にＤＮＡ分子は、染色体を用いるインサイチューハイブリダイゼーションによ る遺伝子マッピングのプローブとして、および、例えばノザンブロット解析によ り、ヒト組織における本発明のＴＲ２レセプター遺伝子の発現を検出するための プローブとして、有用である。 本発明はさらに、本明細書に記載する単離された核酸分子のフラグメントに関 する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ−１Ｂ(配列番号１) 、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）もしくは図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示される ヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子のフラグメントは、本明細書で 述べるような診断プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも約１５ヌ クレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、よりさらに好まし くは少なくとも約３０ヌクレオチド、それ以上に好ましくは、約４０ヌクレオチ ドの長さのフラグメントを意味する。もちろん、寄託されたｃＤＮＡまたは図１ Ａ −１Ｂ(配列番号１)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）もしくは図７Ａ−７Ｂ（配列 番号７）に示されるヌクレオチド配列のすべてではないがほとんどに対応するフ ラグメントなどの５０〜４００ヌクレオチドの長さのより長いフラグメントもま た、本発明により有用である。例えば、少なくとも２０ヌクレオチドの長さのフ ラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ−１Ｂ(配 列番号１)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）および図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に 示されるヌクレオチド配列由来の２０またはそれ以上の連続する塩基を含むフラ グメントを意味する。 本発明の好ましい核酸フラグメントには、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）のＴＲ ２レセプタータンパク質細胞外ドメイン（図１Ａ−１Ｂの約３７〜約２００のア ミノ酸残基を構成すると予測される(配列番号２のアミノ酸残基１〜１６４)）を 含むポリペプチド；ＴＲ２レセプター膜貫通ドメイン（図１Ａ−１Ｂのアミノ酸 残基２０１〜２２５（配列番号２のアミノ酸残基１６５〜１８９）を含むポリペ プチド；ＴＲ２レセプター細胞内ドメイン(図１Ａ−１Ｂのアミノ酸残基約２２ ６〜約２８３を構成すると予想される（配列番号２のアミノ酸残基１９０〜２４ ７)）を含むポリペプチド；膜貫通ドメインのすべてまたは一部が欠失した、図 １Ａ−１Ｂ（配列番号２）のＴＲ２レセプタータンパク質細胞外および細胞内ド メインを含むポリペプチド、をコードする核酸分子が包含される。 本発明の好ましい核酸フラグメントにはまた、成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプター （図４Ａ−４Ｂの約３７〜約１８５のアミノ酸残基を構成すると予想される(配 列番号５のアミノ酸残基１〜１４９)）および完全なＴＲ２−ＳＶ２レセプター （図７Ａ−７Ｂの約１〜約１３６のアミノ酸残基を構成すると予想される(配列 番号８)）を含むポリペプチドをコードする核酸分子が包含される。 リーダー配列について上記したように、細胞外、膜貫通および細胞内ドメイン を構成するアミノ酸残基をコンピューター解析により予測した。それにより、当 業者は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基は、各ドメインを決定するの に用いるクライテリアに応じてわずかに変わり得る（例えば、約１〜約１５のア ミノ酸残基で）ことを認識するであろう。 本発明の好ましい核酸フラグメントにはまた、ＴＲ２レセプタータンパク質の エピトープ−坦持部分をコードする核酸分子が包含される。特に、本発明のかか る核酸フラグメントには、図１Ａ−１Ｂの約３９〜約７０のアミノ酸残基（配列 番号２のアミノ酸残基３〜３４）含むポリペプチド；図１の約１０６〜約１２０ のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基７０〜８４）を含むポリペプチド； 図１Ａ−１Ｂの約１４２〜約１８９のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基 １０６〜１５３）を含むポリペプチド；図１Ａ−１Ｂの約２７６〜約２８３のア ミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基２４０〜２４７）を含むポリペプチド； 図４Ａ−４Ｂの約３９〜約７０のアミノ酸残基（配列番号５のアミノ酸残基３〜 ３４）を含むポリペプチド；図４Ａ−４Ｂの約９９〜約１３６のアミノ酸残基( 配列番号５のアミノ酸残基６３〜１００);図４Ａ−４Ｂの約１７１〜約１８５の アミノ酸残基(配列番号５のアミノ酸残基１３５〜１４９)；図７Ａ−７Ｂの約５ ６〜約６８のアミノ酸残基(配列番号８)；図７Ａ−７Ｂの約９３〜約１３６のア ミノ酸残基(配列番号８)、をコードする核酸分子が包含される。本発明者等は、 上記ポリペプチドフラグメントがＴＲ２レセプターの抗原性領域であることを調 べた。その他のＴＲ２タンパク質のかかるエピトープ坦持部分を決定する方法は 、以下に詳細に記載する。 別の態様において、本発明は、例えばＡＴＣＣ受託９７０５９、９７０５８お よび９７０５７中に含まれるｃＤＮＡクローンなどの上記した本発明の核酸分子 の一つのポリヌクレオチドの一部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェ ントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ( １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリ ウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、２０ｇ／ｍ ｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩インキュベートし、 ついでフィルターを０．１×ＳＳＣで約６５℃にて洗浄することを意味する。 ポリヌクレオチドの「部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは対照 ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも 約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約３０ヌクレオチド、よりさらに好 ましくは約３０〜７０ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（Ｄ ＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。これらは、上記に記載したように、また以下に より詳細に記載するように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である 。 例えば、「少なくとも２０ヌクレオチドの長さ」のポリヌクレオチドの部分は、 対照ポリヌクレオチド（例えば、寄託ｃＤＮＡまたは図１Ａ−１Ｂ(配列番号１) 、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）もしくは図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示される ヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列由来の２０またはそれ以上の連続するヌ クレオチドを意味する。 もちろん、ポリＡ配列（例えば、図１Ａ−１Ｂ(配列番号１)、図４Ａ−４Ｂ（ 配列番号４）もしくは図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示されるＴＲ２レセプター ｃＤＮＡ配列の３’末端ポリ（Ａ）領域など）に、またはＴ（またはＵ）残基の 相補的な伸長にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレ オチドは、ポリ（Ａ）伸長を含む核酸分子またはこれと相補的な核酸分子(例え ば、事実上いずれの二本鎖ｃＤＮＡクローン)のいずれともハイブリダイズする ので、本発明の核酸の一部とハイブリダイズするのに用いる本発明のポリヌクレ オチドに包含しない。 記載したように、ＴＲ２ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子には、限 定するものではないが、成熟ポリペプチドそれ自体のアミノ酸配列をコードする もの；成熟ポリペプチドおよび、約３６アミノ酸のリーダーもしくは分泌配列、 プレー、プローもしくはプレプロータンパク質配列などの付加的配列をコードす る配列；上記した付加的コーディング配列を含むかまたは含まず、付加的な、非 −コーディング配列、例えば、限定するものではないが、イントロンおよび非− コーディング５’および３’配列、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシン グおよびポリアデニル化シグナル、例えば−リボソーム結合およびｍＲＮＡの安 定性などを含む）において役割を担う転写、非−翻訳配列などを含む、成熟ポリ ペプチドのコーディング配列；付加的機能を提供するアミノ酸などの付加的なア ミノ酸をコードする付加的なコーディング配列、が包含される。それゆえ、ポリ ペプチドをコードする配列は、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコ ードする配列などのマーカー配列に融合させてもよい。本発明のこの態様の特定 の好ましい具体例において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクタ ー(Qiagen，Inc.)中に提供されるｔａｇなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであ り、多くのものが市販されている。Gentz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:821-824(1989)に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは融合タ ンパク質の簡便な精製を供給する。「ＨＡ」タグは、精製に有用な他のペプチド であり、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応し、Wi lson et al.，Cell 37:767(1984)に記載されている。以下に記載するように、他 のかかる融合タンパク質には、Ｎ−またはＣ−末端にてＩｇＧ−Ｆｃに融合した ＴＲ２レセプターが包含される。 さらに、本発明は、ＴＲ２レセプターの部分、アナログまたは誘導体をコード する、本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体 など、天然に起こり得る。「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体上の所定の座 を占める遺伝子のいくつかの異なる形態の一つを意味する。Genes II，Lewin，B .，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然の変異体は、当該分野で 公知の変異誘発技術を用いて産生し得る。 かかる変異体には、１またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい、ヌ クレオチド置換、欠失または付加により産生されるものが包含される。変異体は 、コーディング領域、非−コーディング領域もしくはその両方で変化していてよ い。コーディング領域の変化により、保存または非保存アミノ酸置換、欠失また は付加が起こり得る。これらのうち特に好ましいものは、サイレント置換、付加 および欠失であり、これらはＴＲ２レセプターまたはその部分の特性および活性 を変化させない。この点において、保存置換もまた特に好ましい。 本発明のさらなる具体例には、（ａ）図１Ａ−１Ｂ(配列番号２のアミノ酸残 基−３６〜２４７)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５のアミノ酸残基−３６〜１４９ ）または図７Ａ−７Ｂ（配列番号８のアミノ酸残基１〜１３６）に示される完全 なア ミノ酸配列を有するＴＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ） 図１Ａ−１Ｂ(配列番号２のアミノ酸残基−３５〜２４７)、図４Ａ−４Ｂ（配列 番号５のアミノ酸残基−３５〜１４９）または図７Ａ−７Ｂ（配列番号８のアミ ノ酸残基２〜１３６）に示される完全であるがＮ−末端メチオニンを欠くアミノ 酸配列をコードするヌクレオチド；（ｃ）図１Ａ−１Ｂの約３７〜約２８３の位 置のアミノ酸配列(配列番号２のアミノ酸残基１〜２４７)、図４Ａ−４Ｂの約３ ７〜約１８５の位置のアミノ酸配列（配列番号５のアミノ酸残基１〜１４９）ま たは図７Ａ−７Ｂの約１〜約１３６の位置のアミノ酸配列（配列番号８）を有す る成熟ＴＲ２レセプター（いずれの付随するリーダー配列も除去された全長ポリ ペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）それぞれＡＴＣＣ受託番号９ ７０５９、９７０５８および９７０５７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー ドされるリーダーを含む完全アミノ酸配列を有するＴＲ２、ＴＲ２−ＳＶ１また はＴＲ２−ＳＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）それぞれ ＡＴＣＣ受託番号９７０５９および９７０５８に含まれるｃＤＮＡクローンによ りコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２またはＴＲ２−ＳＶ１レセプタ ーをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＴＲ２またはＴＲ２−ＳＶ１レセプタ ー細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＴＲ２レセプター膜貫 通ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＴＲ２レセプター細胞内ドメ インをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）膜貫通ドメインのすべてもしくは部 分が除去されたＴＲ２レセプター細胞外および細胞内ドメインをコードするヌク レオチド配列；および（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ） 、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌク レオチド配列に、少なくとも９０％同一性、より好ましくは、少なくとも９５％ 、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のヌクレオチド配列を有するポリ ヌクレオチドを含む単離された核酸分子が包含される。 例えば、ＴＲ２ポリペプチドをコードする対照ヌクレオチド配列に少なくとも ９５％「同一性」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレ オチド配列がＴＲ２レセプターをコードする対照ヌクレオチド配列の１００ヌク レオチド当たり５個までの点突然変異を含んでいてもよい以外は、ポリヌクレオ チドのヌクレオチド配列が、対照配列と同一であることを意味する。いいかえる と、対照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一性のヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドを得るためには、対照配列中のヌクレオチドの５％までが、 欠失されるか、他のヌクレオチドに置換されていてもよく、または、対照配列中 の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが対照配列中に挿入されていて もよい。対照配列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末 端部分で、またはこれらの末端部分間のいずれかの場所で起こってもよく、対照 配列中のヌクレオチド間に個々に散在してもよく、または対照配列中の１または それ以上の隣接するグループ中にあってもよい。 実際には、個々の核酸分子が、例えば、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示され るヌクレオチド配列またはそのタンパク質をコードする寄託ｃＤＮＡクローンの ヌクレオチオド配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ま たは９９％同一性を有するかどうかを、Bestfit program(Wisconsin Sequence A nalysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，Universty Reserch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)などの公知のコンピュ ータープログラムを用いて慣用的に調べることができる。Bestfitは、Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)のローカルホモ ロジーアルゴリズムを用い、２つの配列間のホモロジーの最大のセグメントを見 出す。個々の配列が、本発明の対照配列に対して９５％同一性を有するかどうか を調べるためにBestfitまたはいずれかの他の配列整列プログラムを用いる場合 、当然、同一性のパーセンテージが対照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算 される、対照配列中の全ヌクレオチド数の５％までのホモロジーにおいてギャッ プが許容されるように、パラメーターをセットする。 本発明は、ＴＲ２レセプター活性を有するポリペプチドをコードするかどうか に関係なく、図１Ａ−１Ｂ(配列番号1)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）または図 ７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示される核酸配列、または、寄託ｃＤＮＡの核酸配 列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性 の核酸分子に、関する。なぜなら、特定の核酸分子がＴＲ２レセプター活性を有 するポリペプチドをコードしていない場合であっても、当業者であれば、例えば 、ハイブリダイゼーションプローブもしくはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プラ イマーとして、核酸分子の使用方法を知っているからである。ＴＲ２レセプター 活性を有するポリペプチドをコードしていない本発明の核酸分子の使用には、な かでも、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴＲ２レセプター遺伝子または対立遺 伝子もしくはスプライス変異体の単離；（２）Verma et al.，Human Chromosome s:A Manual of Basic Techniquies，Pergamon Press，New York(1988)に記載さ れるように、ＴＲ２レセプター遺伝子の正確な染色体位置を調べるための中期染 色体伸長へのインサイチューハイブリダイゼーション(例えば「ＦＩＳＨ」)；（３ ）特異的組織中でのＴＲ２レセプターｍＲＮＡ発現を検出するためのノザンブロ ット解析、が包含される。 しかしながら、図１Ａ−１Ｂ(配列番号１)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）また は図７Ａ−７Ｂ（配列番号７）に示される核酸配列、または、寄託ｃＤＮＡの核 酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同 一性の配列を有し、実際にＴＲ２レセプター活性を有するポリペプチドをコード する核酸分子が好ましい。「ＴＲ２レセプター活性を有するポリペプチド」は、 特定の生物学的アッセイで測定した場合、本発明のＴＲ２レセプター（全長タン パク質、スプライス変異体または好ましくは成熟タンパク質）の活性と、同一で ある必要はないが、類似する活性を示すポリペプチドを意味する。例えば、ＴＲ ２レセプター活性を、実施例６において以下に記載するような、ポリペプチド− Ｆｃ融合タンパク質のリンパ球増殖を阻害する能力を調べることにより測定でき る。ＴＲ２レセプター活性はまた、遊離もしくは細胞表面上に発現するコグネイ トリガンドなどのポリペプチドのレセプターを発現する完全な細胞における増殖 活性を付与する能力を調べることにより、測定してもよい。 当然、遺伝コードの縮重性により、寄託ｃＤＮＡの核酸配列または図１Ａ−１ Ｂ(配列番号1)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号４）または図７Ａ−７Ｂ（配列番号７ ）に示される核酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ ま たは９９％同一性の配列を有する核酸分子の大多数が、「ＴＲ２レセプター活性 を有する」ポリペプチドをコードすることが当業者に認識されるであろう。実際 、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体はすべて同じポリペプチドをコードす るので、このことは上記した比較アッセイを行うことなくても、当業者には明確 であろう。さらに、縮重変異体でない核酸分子についても、相当数がＴＲ２タン パク質活性を有するポリペプチドをコードすることが当業者に認識されるであろ う。これは、タンパク質機能にほとんど影響しないかさほど影響しないアミノ酸 置換について、当業者に知られていることによる（例えば、第１の脂肪族アミノ 酸を第２の脂肪族アミノ酸に置換すること）。 例えば、表現型にサイレントなアミノ酸置換の作成方法についてガイダンスは 、Bowie，J．U．etal.，"Deciphering the Message in Protein Sequences:Tole rance to Amino Acid Substitutions"，Science 247:1306-1310(1999)に記載さ れ、そこではタンパク質が驚くほどアミノ酸置換に寛容であることが著者により 示される。 ベクターおよび宿主細胞 本発明は、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで 遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＴＲ２ポリペプチドまたは そのフラグメントの製造にも関する。 ポリヌクレオチドを宿主中における増殖用の選択マーカーを含むベクターに連 結させてもよい。一般的に、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈澱物な どの沈殿物、またはチャージした脂質などとの複合中で導入する。ベクターがウ イルスである場合、適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロでパッケー ジし、ついで宿主細胞中に導入してもよい。 ＤＮＡ挿入物は、例えば、ファージラムダＰＬプロモーター、イー．コリ（Ｅ ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０早期および後 期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適当なプロモ ーターと機能的に連結させるべきである。他の適当なプロモーターは当業者に知 ら れている。さらに、発現構築物は、転写開始、終止の部位、および転写領域に翻 訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコ ーディング部分は、好ましくは翻訳されるべきタンパク質の始まりの部分に開始 コドンおよび末端の適当な部分に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵ ＡＧ）を含む。 記載するように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも一つの選択マーカー を含む。かかるマーカーには、真核細胞培養用にジヒドロフォレートレダクター ゼまたはネオマイシン耐性、イー．コリおよび他の細菌の培養用にテトラサイク リンまたはアンピシリン耐性遺伝子が包含される。適当な異種宿主の代表例には 、限定するものではないが、イー．コリ、ストレプトマイセス(Streptomyces)お よびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)細胞などの細菌細胞 ；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２およびスポドプテラ(Spodoptera) Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーウェス（Bows）黒色種細 胞などの動物細胞；および植物細胞が包含される。上記した宿主細胞に適した培 養培地および条件は、当該分野で知られている。 ベクターの中でも、細菌において用いるのに好ましいものは、ｐＱＥ７０、ｐ ＱＥ６０およびｐＱＥ−９(Qiagenから入手可能)；ｐＢＳベクター、ファージス クリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(Stratageneから入手可能)；およびｐｔｒｃ９９ａ、 ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia から入手可能）が包含される。真核細胞ベクターのうち好ましいものは、ｐＷＬ ＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ(Stratageneから 入手可能)；およびｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmacia から入手可能）が包含される。他の適当なベクターは、当業者に容易に認識され るであろう。 構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェ クション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他の方法 により行うことができる。かかる方法は、Davis et al.，Basic Methods In Mol ecular Biology(1986)などの、多くの標準的な実験マニュアルに記載される。 ポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態にて発現されてもよく、分泌 シグナルのみならず、さらなる異種性機能的領域を含んでいてもよい。例えば、 さらなるアミノ酸の領域、とくにチャージしたアミノ酸を、ポリペプチドのＮ− 末端に加えて、精製の間、またはその後の取り扱いおよび保存の間、宿種細胞に おける安定性および保持性を改良させてもよい。また、ペプチド部分をポリペプ チドに加えて精製を促進してもよい。かかる領域は、ポリペプチドの最終的な製 造の前に除去してもよい。ペプチド部分をポリペプチドに加えて、分泌および排 出を生じさせること、安定性を改良すること、および精製を促進することは、な かでも当該分野でよく知られた常套技術である。好ましい融合タンパク質は、タ ンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域が含まれる。例えば、 ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４５３３（カナダ対応特許２０４５８６９）には、免疫グロ ブリン分子の定常部の種々の部分とともに別のヒトタンパク質またはその一部を 含む融合タンパク質が開示される。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、 治療および診断において非常に有用であり、それゆえ、例えば、薬物動態学的特 性を改良する(ＥＰ−Ａ ０２３２２６２)。一方、いくつかの使用においては、 融合タンパク質が、記載された有利な方法において発現され、検出され、精製さ れた後に、Ｆｃ部分を削除できることが望ましい。これは、Ｆｃ領域が、例えば 融合タンパク質が免疫化のための抗原として用いられる場合など、治療および診 断における使用の障害となる場合である。薬剤の発見において、例えば、ヒトｈ ＩＬ−５レセプターなどのヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同 定する高処理スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。D. Bennett et al.，Journal of Molecular Recognition，Vol．8:52-58(1995)およ びK．Johanson et al.，The Journal of Biological Chemistry，Vol．270，No ．16:9459-9471(1995)参照。 ＴＲ２レセプターを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イ オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ ィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、 ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー を含め、周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製できる。高性 能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いるのが最も好ましい。本発 明のポリペプチドには、天然のものを精製した産物、化学的合成法の産物、例え ば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含め、原核または真核細 胞から組換え技術により産生された産物が包含される。組換え産生法において用 いた宿主に応じ、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよくグリ コシル化されていなくてもよい。加えて、本発明のポリペプチドには、ある場合 には宿主−媒介プロセスの結果として、初期修飾メチオニン残基を含んでいても よい。 ＴＲ２ポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、寄託ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、または、図 １Ａ−１Ｂ(配列番号２)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）および図７Ａ−７Ｂ（配 列番号８）のアミノ酸配列を有する単離されたＴＲ２ポリペプチド、または上記 のポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。 本発明のポリペプチドは、膜結合形態であってもよく、可溶性循環形態であっ てもよい。可溶性ペプチドは、配列が膜貫通ドメインを欠くポリペプチド配列を 含む、アミノ酸配列により定義される。かかるＴＲ２レセプターの可溶性形態の 一例は、分泌性リーダー配列を有するが、細胞内および膜貫通ドメインの両方を 欠く、ＴＲ２−ＳＶ１スプライス変異体である。それゆえ、ＴＲ２−ＳＶ１レセ プタータンパク質は、このタンパク質を発現する細胞から可溶性形態で分泌され る。 本発明のポリペプチドは、膜貫通領域、細胞内および細胞外領域を有する膜結 合性レセプターとして存在してもよく、または、膜貫通ドメインを欠く可溶性形 態で存在してもよい。ＴＲ２レセプターのかかる形態の一例は、リーダー配列に 加えて、膜貫通、細胞内および細胞外ドメインを含む、図１Ａ−１Ｂ（配列番号 ２）に示されるＴＲ２レセプターである。かくして、ＴＲ２レセプターのこの形 態は、このタンパク質を発現する細胞の細胞質膜中に局在する。 当業者においては、ＴＲ２レセプターのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク 質の構造または機能に重大な影響なしに変え得ることが認識されるであろう。か かる配列中の差異を考える場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存 在することを思い出さなくてはならない。それゆえ、本発明はさらに、実質的な ＴＲ２レセプター活性を示すかまたは以下に記載するようなタンパク質部分など のＴＲ２タンパク質の領域を含む、ＴＲ２レセプターの変異体を包含する。かか る変異体には、欠失、挿入、逆位、繰り返し、および置換の種類が包含される。 上記したように、どのアミノ酸変化が表現型にサイレントであるらしいかについ てのガイダンスは、Bowie，J．U．et al.，"Deciphering the Message in Prote in Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions"，Science 247:1306-13 10(1999)に記載される。 それゆえ、図１Ａ−１Ｂ(配列番号２)、図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）および図 ７Ａ−７Ｂ（配列番号８）のポリペプチドまたは寄託ｃＤＮＡにコードされるポ リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１またはそれ以上 のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残 基）で置換され、かかる置換アミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされていても コードされていなくてもよいもの、（ｉｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が 置換基を有するもの、（iii）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増 加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）などの他の化合物と融合して いるもの、または（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしく は分泌性配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いる配列、またはプロプロテ イン配列などの、さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合したものであって もよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当 業者の範囲内であると考えられる。 特に重要なのは、チャージしたアミノ酸の他のチャージしたアミノ酸および中 性または負にチャージしたアミノ酸との置換である。後者により、タンパク質中 の正のチャージが減少し、ＴＲ２タンパク質の特徴が改良される結果となる。凝 集の防御が特に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の欠損だけでなく、これら が免疫源性であり得るるので、医薬製剤を調製する場合にも問題となり得る(Pin ckard et al.，Clin Exp．Immunol．2:331-340(1967);Robbins et al.，Diabete s 36:838-845(1987);Cleland et al.，Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier S ystems 10:307-377(1993))。 アミノ酸の置換は、細胞表面レセプターへの結合選択性も変化させ得る。Osta de et al.，Nature 361:266-268(1993)には、ある変異により、ＴＮＦ−αがＴ ＮＦレセプターの２つの知られるタイプのうちの一つのみへ選択的に結合するこ とになることが記載される。それゆえ、本発明のＴＲ２レセプターは、天然の変 異またはヒトの操作のいずれかによる、１またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失 または付加を含んでいてもよい。 記載するように、タンパク質の折りたたみまたは活性に重要な影響を与えない 保存アミノ酸置換などの、小さな変化が好ましい(表１参照)。 表１ 保存アミノ酸置換 機能に必須な本発明のＴＲ２タンパク質におけるアミノ酸を、位置指定突然変 異誘発またはアラニン−スキャンニング突然変異誘発(Cunningham and Wells，S cience 244:1081-1085(1989))などの当該分野で公知の方法により同定できる。 後者の方法は、分子のそれぞれの残基にて単一のアラニン突然変異を導入する。 得られる突然変異分子を、ついでレセプター結合、またはインビボもしくはイン ビトロ増殖活性などの生化学的活性について試験する。リガンド−レセプター結 合に必須な部位を、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識などの構造解析によ っても決定できる(Smith et al.，J．Mol．Biol．224:899-904(1992)およびde V os et al.，Science 255:306-312(1992))。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、単離形態にて提供される。「単離され た ポリペプチド」は、天然の環境から除去されたポリペプチドを意味する。それゆ え、組換え宿主細胞中で産生され含まれるポリペプチドは、本発明において「単 離された」ものと考える。また、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主か ら部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドをも意味する。例えば、組換 えにより産生されたＴＲ２レセプターは、Smith and Johnson,Gene 67:31-40(19 88)において記載される一工程法により実質的に精製できる。 本発明のポリペプチドには、リーダーを含む寄託ｃＤＮＡによりコードされる ポリペプチド；リーダーを含まない寄託ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ ド(すなわち、成熟タンパク質)；リーダーを含む図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）ま たは図４Ａ−４ｂ（配列番号５）のポリペプチド；リーダーを含むがＮ−末端メ チオニンを欠く、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）または図４Ａ−４ｂ（配列番号５ ）のポリペプチド；リーダーを欠く図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）または図４Ａ− ４Ｂ（配列番号５）のポリペプチド；図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）のポリペプチ ド；図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示すＴＲ２レセプターの細胞外ドメイン、膜 貫通ドメイン、および細胞内ドメイン；上記したポリペプチドに対して、少なく とも８０％同一性、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％同一性、さ らにより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一性を 有し、かかるポリペプチドの少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少な くとも５０個のアミノ酸の部分を含む、ポリペプチドが包含される。 ＴＲ２ポリペプチドの対照アミノ酸配列に対して、例えば少なくとも９５％「 同一性」のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列 が、ポリペプチド配列が、ＴＲ２レセプターの対照アミノ酸の１００アミノ酸当 たり５つまでのアミノ酸変化を含んでいてもよい他は、対照配列と同一であるこ とを意味する。いいかえると、対照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一性のア ミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ酸残基の ５％までが、欠失されるか、他のアミノ酸に置換されていてもよく、または、対 照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されて いてもよい。対照配列のこれらの変異は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカル ボキ シ末端部分で、またはこれらの末端部分間のいずれかの場所で起こってもよく、 対照配列中の残基間に個々に散在してもよく、または対照配列中の１またはそれ 以上の隣接するグループ中にあってもよい。 実際には、個々のポリペプチドがたとえば、図１Ａ−１Ｂ(配列番号２)、図４ Ａ−４Ｂ（配列番号５）または図７Ａ−７Ｂ（配列番号８）に示されるアミノ酸 配列または寄託ｃＤＮＡクローンの一つによりコードされるアミノ酸配列と、少 なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する 1かどうかを、Bestfit program(Wisconsin Sequence Analysis Package，Versio n 8 for Unix，Genetics Computer Group，Universty Reserch Park，575 Scien ce Drive，Madison，WI 53711)などの公知のコンピュータープログラムを用いて 慣用的に調べることができる。例えば、個々の配列が、本発明の対照配列に対し て９５％同一性を有するかどうかを調べるためにBestfitまたはいずれかの他の 配列整列プログラムを用いる場合、当然、同一性のパーセンテージが対照アミノ 酸配列の全長にわたって計算され、対照配列中の全アミノ酸残基数の５％までの ホモロジーにおいてギャップが許容されるように、パラメーターをセットする。 本発明のポリペプチドを、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ ルまたはモレキュラーシーブゲル濾過カラム上で、分子量マーカーとして用いる ことができる。 他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ−坦持部位 を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。これらのポリペプチド部分のエ ピトープは、本明細書において記載するポリペプチドの免疫原性もしくは抗原性 エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場 合に抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合 できるタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。一般 に、タンパク質の免疫原性エピトープの数は、抗原性エピトープの数よりも少な い。例えば、Geysen et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：3998-4002(1983 )を参照。 抗原性エピトープを坦持するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が 結合可能なタンパク質分子の領域を含むもの）の選択に関して、タンパク質配列 の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、慣用的に部分的に模倣したタンパ ク質と反応する抗血清を誘発できることが当該分野で周知である。例えば、Sutc liffe，J．G.，Shinnick．T．M.，Green，N．and Learner，R．A．(1983)Antibo dies that react with predetermined sites on proteins．Science 219:660-66 6を参照。タンパク質−反応性血清を誘発可能なペプチドは、しばしばタンパク 質の一次配列中に示され、簡単な化学ルールのセットにより特徴付けることがで き、完全なタンパク質の免疫決定領域（すなわち、免疫原性エピトープ）または アミノもしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。 本発明の抗原性ペピトープ−坦持ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、 本発明のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体を含む抗体を産 生するのに有用である。例えば、Wilson et al.，Cell37:767-778（1984）777参 照。本発明の抗原性エピトープ−坦持ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の ポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好 ましくは少なくとも９個、もっとも好ましくは、約１５〜約３０個の間のアミノ 酸配列を含む。 限定するものではないが、ＴＲ２レセプター−特異的抗体を産生するのに用い ることができる抗原性ポリペプチドまたはペプチドの例には、図１の約３９〜約 ７０(配列番号２のアミノ酸残基３〜３４)のアミノ酸残基を含むポリペプチド； 図１Ａ−１Ｂの約１０６〜約１２０（配列番号２のアミノ酸残基７０〜８４）の アミノ酸残基を含むポリペプチド；図１Ａ−１Ｂの約１４２〜約１８９（配列番 号２のアミノ酸残基１０６〜１５３）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１ の約２７６〜約２８３（配列番号２のアミノ酸残基２４０〜２４７）のアミノ酸 残基を含むポリペプチド；図４Ａ−４Ｂの約３９〜約７０（配列番号５のアミノ 酸残基３〜３４）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図４Ａ−４Ｂの約９９〜 約１３６（配列番号５のアミノ酸残基６３〜１００）のアミノ酸残基を含むポリ ペプチド；図４Ａ−４Ｂの約１７１〜約１８５（配列番号５のアミノ酸残基１３ ５〜１４９）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図７Ａ−７Ｂの約５６〜約６ ８（配列番号８）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図７Ａ−７Ｂの約９３〜 約１３６（配列番号８）のアミノ酸残基を含むポリペプチド、が包含される。上 記したように、本発明者等は上記のポリペプチドフラグメントがＴＲ２レセプタ ータンパク質の抗原性領域であることを決定している。 本発明のエピトープ−坦持ペプチドおよびポリペプチドはまた、慣用手段によ り製造してもよい。Houghten，R．A．（1985）General method for the rapid s olid-phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of antigen -antibody interaction at the level of individual amino acids．Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 82:5131-5135。この「Simultaneous Multiple Peptide Synth esis(SMPS)」プロセスは、さらに、Houghtenらの米国特許第４６３１２１１号（ １９８６）に記載される。 本発明のＴＲ２ポリペプチドおよび上記のそのエピトープ−坦持フラグメント を免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組み合わせ、キメラポリペ プチドとすることができることが、当業者に認識されるであろう。これらの融合 タンパク質は、精製を促進し、インビボでの半減期を増加させる。このことは、 例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドのはじめの２つのドメイン、および哺乳動物 免疫グロブリンの長鎖または短鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタ ンパク質について、示されている（ＥＰＡ３９４８２７；Traunecker at al.，N ature 331:84-86(1988))。ＩｇＧ部分によりジスルフィド結合二量体構造を有す る融合タンパク質は、モノマーＴＲ２レセプタータンパク質またはタンパク質フ ラグメント単独よりも他の分子の結合および中和において効率的である(Fountou lakis et al.，J．Biochem 270:3958-3964(1995))。 病状の検出 ＴＮＦファミリーリガンドは、本発明のＴＲ２レセプターを含め、ＴＮＦ−フ ァミリーレセプターに結合することにより、様々な細胞性応答を誘発する。ＴＮ Ｆレセプタータンパク質の強力なリガンドであるＴＮＦ−βは、リンパ球発達、 腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘発、多形核白血球の活性化、内皮細胞上のクラス Ｉ主要組織適合遺伝子複合体抗原の誘発、内皮細胞上の接着分子の誘発および成 長ホルモン刺激を含め、多くの生物化学的プロセスに関与することが知られる(R uddle and Homer，Prog．Allergy，40:162−182(1988))。また、ＴＮＦレセプタ ータンパク質のリガンドである、ＴＮＦ−αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、 自己免疫疾患、移植片拒絶反応、抗−ウイルス応答の産生、敗血症ショック、脳 性マラリア、細胞毒性、化学療法の間に産生される電離性放射線の有害作用、例 えば、酵素の変性、脂質過酸化およびＤＮＡ損傷などに対する防御(Nata et al. ，J．Immunol．136(7):2483(1987))、増殖調節、血管内皮作用および代謝作用に おいて役割を担うことが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、内皮細胞を刺激し 、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含む種々の因子を分泌 させ、細胞増殖を促進する。加えて、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ −１およびＶＣＡＭ−１などの種々の細胞接着分子をアップレギュレーションす る。ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドはまたプログラムされた細胞死を誘発する ことが示されている。 ＴＲ２ポリペプチドを発現し、ＴＲ２レセプターリガンドに対して強力な細胞 性応答を有すると考えられる細胞には、Ｂリンパ球(ＣＤ１９+)、ＣＤ４+および ＣＤ８+の両方のＴリンパ球、単球、内皮細胞、および、表２および３に示され る他の細胞種が含まれる。「ＴＮＦ−ファミリーリガンドに対する細胞性応答」 は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドにより誘発される、細胞、細胞系、組織、組織 培養または患者に対する遺伝子型、表現型、および／または形態学的変化を意味 する。記載するように、かかる細胞性応答には、正常なＴＮＦ−ファミリーリガ ンドに対する生理的な応答のみならず、アポトーシスの阻害などによる、細胞増 殖の増加または細胞増殖の増加の阻害などに関連する疾患も包含される。アポト ーシスープログラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する 生理的なメカニズムであり、その異常調節により多くの異なる病原性プロセスが 引き起こされ得る(Ameisen，J．C.，AIDS 8:1197−1213(1994);Krammer，P．H． et al.，Curr．Opin．Immunol．6:279-289(1994))。 異常な細胞生存に関連する特定の病状の哺乳動物におけるある組織は、対応す る「標準的な」哺乳動物、すなわち、病状を有さない同じ種の哺乳動物と比較す る場合、ＴＲ２レセプタータンパク質およびＴＲ２レセプタータンパク質をコー ドするｍＲＮＡを有意に変化したレベルで発現すると考えられる。さらに、この タンパク質のある形態は分泌されるので、病状を有さない同じ種の哺乳動物由来 の血清と比較した場合、ＴＲ２レセプタータンパク質の増強したレベルが、病状 を有する哺乳動物由来の体液（例えば、血清、血漿、尿および脊髄液）中に検出 可能であると考えられる。それゆえ、本発明は、病状の診断に有用な診断方法で あって、哺乳動物細胞または体液中のＴＲ２レセプタータンパク質をコードする 遺伝子の発現レベルをアッセイし、標準のＴＲ２レセプター遺伝子発現レベルと 遺伝子発現レベルを比較し、それにより標準に対する遺伝子発現レベルの増加ま たは減少が、異常細胞生存に関連するある病状を示すことを含む方法を提供する 。 本発明のＴＲ２レセプターが関与する病状の診断が従来法によりすでに行われ ている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、これにより有意 に異常なＴＲ２レセプター遺伝子発現を示す患者が、より低いレベルで遺伝子を 発現する患者と比較して、悪い臨床的結果となるであろう。 「ＴＲ２レセプタータンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイす ること」は、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測 定または概算することにより）または相対的（例えば、第２の生物学的サンプル 中のＴＲ２レセプタータンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することに より）のいずれかで、第１のサンプル中のＴＲ２レセプタータンパク質レベルま たはＴＲ２レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、定性的また は定量的に測定または概算することを意味する。 好ましくは、第１の生物化学的サンプル中のＴＲ２レセプタータンパク質レベ ルまたはｍＲＮＡレベルを測定または概算し、病状を有さない個体から得られた 第２の生物化学的サンプルから得られた標準のＴＲ２レセプタータンパク質レベ ルまたはｍＲＮＡレベルと比較する。当該分野で認識されるように、一度標準の ＴＲ２レセプタータンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルがわかると、これを比 較のための標準として繰り返し用いることができる。 「生物化学的サンプル」は、ＴＲ２レセプタータンパク質またはｍＲＮＡを含 む、個体、細胞系、組織培養または他の源から得られる生物化学的サンプルを意 味する。生物化学的サンプルには、分泌された成熟ＴＲ２レセプタータンパク質 を含む哺乳動物体液（血清、血漿、尿、滑液および脊髄液など）、胸腺、前立腺 、心臓、胎盤、筋肉、肝臓、脾臓、肺、腎臓および他の組織が包含される。組織 生検および体液を哺乳動物から得る方法は、当該分野で周知である。生物化学的 サンプルがｍＲＮＡを包含する場合、組織生検が好ましい源である。 細胞生存の増加またはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、ガン(小胞リ ンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン−依存性腫瘍など)；自己免 疫疾患（全身性エリテマトーデス、および免疫−関連糸球体腎炎、慢性関節リウ マチなど）およびウイルス感染症(ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよび アデノウイルスなど)、情報移植片対宿主疾患、急性移植片拒絶反応、および慢 性移植片拒絶反応が包含される。細胞生存の減少またはアポトーシスの増加に関 連する疾患には、ＡＩＤＳ；神経変性性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン 病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性)；骨髄形成不良症候群(再生 不良性貧血など)、虚血性傷害(心筋梗塞、発作および再灌流傷害により引き起こ されるものなど)、毒素−誘発肝疾患(アルコールにより引き起こされるものなど )、敗血症ショック、カヘキシーおよび食欲不振が包含される。 可溶性レセプターのレベルを検出するのに利用可能なアッセイ、例えば、ラジ オイムノアッセイ、競合−結合アッセイ、ウエスタンブロット解析は、当業者に 周知であり、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを用いてもよい。 完全なＴＲ２レセプタータンパク質、またはアルブミンなどの担体タンパク質 とともに、または十分に長い場合には（少なくとも約２５アミノ酸）担体なしに 、動物系（ウサギまたはマウスなど）に提示してもよい、その抗原性ポリペプチ ドフラグメントに対して、ＴＲ２レセプター−タンパク質特異的抗体を作成可能 である。 本明細書で用いる場合、「抗体」(Ａｂ)または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ )なる用語は、完全な分子ならびにＴＲ２レセプタータンパク質に特異的に結合 可 能な抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2フラグメントなど）を 包含する。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメ ントを欠き、循環からより速く消失し、完全な抗体の非−特異的組織結合が少な い(Wahl et al.，J．Nucl．Med．24:316-325(1983))。それゆえ、これらのフラ グメントが好ましい。 本発明の抗体は、様々な方法のいずれかにより調製してもよい。例えば、ＴＲ ２レセプタータンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞を、動物 に投与し、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。好ま しい方法において、ＴＲ２レセプタータンパク質の調製物は、調製され、精製さ れ、実質的に天然の混合物を含まないようにする。ついで、かかる調製物を動物 に導入し、より高い特異活性を有するポリクローナル抗血清を産生する。 もっとも好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（または そのＴＲ２レセプタータンパク質結合フラグメント）である。かかるモノクロー ナル抗体は、ハイブリドーマ技術(Kohler et al.，Nature 256:495(1975);Kohle r et al.，Eur．J．Immunol．6:511(1976);Kohler et al.，Eur．J．Immunol．6 :292(1976);Hammerling et al.，In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrid omas，Elsevier，N．Y.，（1981）pp．563-681)を用いて調製できる。一般に、 かかる方法は、ＴＲ２レセプタータンパク質抗原またはより好ましくはＴＲ２レ セプタータンパク質−発現細胞で動物（好ましくはマウス）を免疫化することを 含む。適当な細胞を、抗−ＴＲ２レセプタータンパク質抗体を結合する能力によ り認識できる。かかる細胞を、適当な組織培養培地中で培養してもよい；しかし ながら、１０％ウシタ胎仔血清（５６℃にて不活化）および約１０ｇ／ｌの非必 須アミノ酸、約１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのス トレプトマイシンを加えたアールの修飾イーグル培地(Earle's modified Eagle' s medium)中で細胞を培養することが好ましい。かかるマウスの脾臓細胞を抽出 し、適当な骨髄腫細胞系と融合する。本発明にしたがって、いずれかの適当な骨 髄腫細胞系を用いてもよい；しかしながら、American Type Culture Collection ，Rockville，Marylandから利用可能な親骨髄腫細胞系（ＳＰ2Ｏ）を 用いることが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で 選択的に維持し、ついでWands et al．(Gastroenterology 80:225-262(1981))に 記載されるような限定希釈によりクローニングする。かかる選択を通して得られ たハイブリドーマ細胞を、ついでアッセイし、ＴＲ２レセプタータンパク質抗原 を結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。 ＴＲ２レセプター機能のアゴニストおよびアンタゴニスト 一態様において、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドにより誘導されるＴ Ｒ２の活性（例えば、細胞増殖、造血発達など）を阻害する方法であって、ＴＲ ２ポリペプチドを発現する細胞に、ＴＲ２レセプター媒介シグナルを減少させる ことのできる、ＴＲ２レセプターリガンド、アナログまたはアンタゴニストの有 効量を投与することを含む方法に関する。好ましくは、ＴＲ２レセプター媒介シ グナルを増加させ、細胞増殖の増加を示す疾患を治療する。アンタゴニストには 、ＴＲ２レセプターの可溶性形態およびＴＲ２レセプター媒介シグナルを遮断す るＴＲ２ポリペプチドに対する抗体が包含できる。好ましくは、ＴＲ２レセプタ ー媒介シグナルを減少させ、疾患を治療する。 さらなる態様において、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドにより誘導さ れる細胞増殖を増加させる方法であって、ＴＲ２ポリペプチドを発現する細胞に 、ＴＲ２レセプター媒介シグナルを増加させることのできるアゴニストの有効量 を投与することを含む方法に関する。好ましくは、ＴＲ２レセプター媒介シグナ ルを増加させ、細胞増殖の減少を示す疾患を治療する。本発明のアゴニストには 、ＴＲ２レセプター媒介シグナルを刺激するＴＲ２ポリペプチドに対するモノク ローナル抗体が包含される。好ましくは、ＴＲ２レセプター媒介シグナルを増加 させ、疾患を治療する。 「アゴニスト」は、ＴＲ２ポリペプチドにより媒介される細胞増殖および分化 を増強することのできる天然および合成化合物を意味する。かかるアゴニストに は、ＴＲ２レセプターの発現を増加するか、または発現されたレセプターの感受 性を増加する薬剤が包含される。「アンタゴニスト」は、ＴＲ２媒介細胞増殖お よ び分化を阻害することのできる天然および合成化合物を意味する。かかるアンタ ゴニストには、ＴＲ２レセプターの発現を減少させるか、または発現されたレセ プターの感受性を減少させる薬剤が包含される。本発明の候補「アゴニスト」ま たは「アンタゴニスト」が細胞増殖および分化を増強または阻害できるかどうか は、以下により詳細に記載するものを含め、当該分野で公知のＴＮＦ−ファミリ ーリガンド／レセプター細胞性応答アッセイを用いて調べることができる。 かかるスクリーニング技術の一つは、例えば、Science 246:181-296(1989,10 月）に記載されるような、レセプター活性化により引き起こされる細胞外ｐＨ変 化を測定するシステムにおいて、レセプターを発現する細胞（例えば、トランス フェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。例えば、化合物を本発明のレセプタ ーポリペプチドを発現する細胞と接触させ、セカンドメッセンジャー応答、例え ばシグナルトランスダクションまたはｐＨ変化を測定し、潜在的な化合物がレセ プターを活性化するか阻害するかを調べてもよい。 かかるスクリーニング技術の別のものは、レセプターをコードするＲＮＡをア フリカツメガエル卵母細胞中に導入し、一時的にレセプターを発現させることを 含む。レセプター卵母細胞を、ついでレセプターリガンドおよびスクリーニング する化合物と接触させ、その後、レセプターの活性を阻害すると考えられる化合 物のスクリーニングの場合には、カルシウムシグナルの阻害または活性化を検出 してもよい。 他の方法は、表面上にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害 を調べることによる、本発明のレセプターポリペプチドの活性を阻害する化合物 、アンタゴニストのスクリーニングを含む。かかる方法は、真核細胞をレセプタ ーをコードするＤＮＡでトランスフェクトして、その表面上にレセプターを発現 するようにし、細胞を公知のリガンドの標識形態の存在下で化合物と接触させる ことを含む。リガンドを例えば放射活性により標識できる。レセプターに結合し た標識リガンドの量を、例えばレセプターの放射活性を測定することにより、測 定する。レセプターと結合する標識リガンドの減少により調べられるように化合 物がレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害され る。 本発明のポリペプチドの可溶性形態を上記したリガンド結合アッセイにおいて 用いてもよい。ＴＲ２レセプターのこれらの形態は、それらが分泌された後、細 胞外培地においてリガンドと接触する。ついで、分泌されたタンパク質がＴＲ２ レセプターリガンドに結合するかどうかを調べる。 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストのさらなるスクリーニングアッセイ は、Tartaglia．L．A.，and Goeddel，D．V.，J．Biol．Chem．267(7):4304-430 7(1992)に記載される。 かくして、さらなる態様において、候補アゴニストまたはアンタゴニストがＴ ＮＦ−ファミリーリガンドに対する細胞性応答を増強または阻害可能であるかど うかを調べるためのスクリーニング方法が提供される。該方法は、ＴＲ２ポリペ プチドを発現する細胞を候補化合物およびＴＮＦ−ファミリーリガンドに接触さ せ、細胞性応答をアッセイし、候補化合物の非存在下にリガンドと接触させてア ッセイを行う、標準の細胞性応答とその細胞性応答を比較することを含み、それ により、標準に対して増加した細胞性応答は、候補化合物がリガンド／レセプタ ーシグナル経路のアゴニストであることを示し、標準と比較して減少した細胞性 応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナル経路のアンタゴニストであ ることを示す。「細胞性応答をアッセイすること」は、候補化合物および／また はＴＮＦ−ファミリーリガンドに対する細胞性応答を定性的または定量的に測定 すること（例えば、Ｔ細胞増殖またはトリチウム化チミジン標識における増加ま たは減少を測定または概算すること）を意味する。本発明により、ＴＲ２ポリペ プチドを発現する細胞を、内在性または外因性の投与されたＴＮＦ−ファミリー リガンドのいずれかと接触させることができる。 さらなる態様において、胸腺増殖アッセイを用いて、リガンドおよび潜在的な 薬物候補の両方を同定してもよい。例えば、胸腺細胞を組織から分け、培養培地 中で増殖させる。3Ｈ−チミジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ ＢｒｄＵ）などのＤＮＡ前駆体の組み込みを、ＤＮＡ合成および細胞性増殖のパ ラメーターとしてモニターする。ＤＮＡ中に組み込まれたＢｒｄＵを有する細胞 を、Ｂｒｄｌに対するモノクローナル抗体を用いて検出し、酵素または蛍光色素 −結 合第２抗体により測定できる。反応を蛍光計または分光光度計により定量する。 ２つの対照ウェルおよび実験ウェルを上記のようにセットし、ＴＮＦ−βまたは 結合リガンドをすべてのウェルに添加し、本発明の可溶性レセプターポリペプチ ドを、第２の対照ウェルに個々に添加し、実験ウェルにはスクリーニングすべき 化合物を入れる。スクリーニングすべき化合物の上記の相互作用を刺激または阻 害する能力をついで定量してもよい。 本発明のアゴニストには、例えば、ＴＮＦ−ファミリーリガンドペプチドフラ グメント、トランスフォーミング増殖因子βおよび神経伝達物質（グルタメート 、ドーパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートなど）などの化合物が包含され る。好ましいアゴニストには、ＴＲ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに対 して作成されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が包含される。ＴＮＦ −ファミリーレセプターに対して作成されるかかるアゴニスト抗体は、Tartagli a，L.A.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9292-9296(1991)およびTartaglia，L ．A.,and Goeddel，D．V.，J．Biol．Chem．267(7):4304-4307(1992)に開示され ている。また、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９１３７を参照のこと。さらに好ましい アゴニストには、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シ トシン、アラビノサイド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセートおよび ビンクリスチンなどの化学療法剤が包含される。他には、エタノールおよびβ− アミロイドペプチドが包含される(Science 267:1457−1458(1995))。 本発明のアンタゴニストには、ＴＲ２レセプターの可溶性形態が包含される( 例えば、全長レセプターの細胞外領域由来のリガンド結合ドメインを含む、図１ Ａ−１Ｂに示されるＴＲ２レセプターのフラグメントなど)。天然または合成さ れたものであってもよい、レセプターのかかる可溶性形態は、ＴＮＦ−ファミリ ーリガンドへの結合を、レセプターの細胞表面結合形態と競合することにより、 ＴＲ２、ＴＲ２−ＳＶ１またはＴＲ２−ＳＶ２媒介シグナルをアンタゴナイズす る。本発明のアンタゴニストには、ＴＮＦ−ファミリーリガンドに特異的な抗体 および以下の実施例５および６に記載するようなＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質が 包含される。「ＴＮＦ−ファミリーリガンド」は、ＴＮＦレセプターファミリー群に結合し、 リガンド／レセプターシグナル経路を誘発する能力を有する、天然の、組換えの および合成のリガンドを意味する。ＴＮＦリガンドファミリー群には、限定する ものでないが、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α(ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとして も知られる)、ＬＴ−β(複合体ヘテロトリマ−ＬＴ−α２−β中に見られる)、 ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌお よび神経成長因子（ＮＧＦ）が包含される。 実施例６に示す実験は、本発明のＴＲ２レセプターがリンパ球の増殖を誘発で きることを示す。さらに、かかる増殖は、Ｆｃ抗体フラグメントと融合したＴＲ ２タンパク質フラグメントにより阻害できる。 ＴＮＦαは、単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）の感染からマウス を防御することが示されている。Rossol-Voth，R et al.，Ｊ．Gen．Virol．72: 143-147(1991)。ＴＮＦαの防御作用のメカニズムは知られていないが、インタ ーフェロン、ＮＫ細胞殺傷のいずれも関与していないようである。ＴＮＦＲファ ミリーの一つメンバーが、ＨＳＶ−１の細胞への侵入を媒介することが示されて いる。Montgomery，R．et al.，Eur．Cytokine Newt．7:159(1996)。さらに、こ のＴＮＦＲの細胞外ドメインに特異的な抗体は、ＨＳＶ−１の細胞への侵入を遮 断する。それゆえ、本発明のＴＲ２レセプターには、ＴＮＦＲ媒介ウイルス細胞 内侵入を防御できるＴＲ２アミノ酸配列および抗体の両方を包含する。かかる配 列および抗体は、ウイルスへの結合を細胞表面局在ＴＮＦＲと競合することによ り、または、ウイルスの細胞表面レセプターへの結合を直接遮断することのいず れかにより機能できる。 本発明の抗体を、本発明のＴＲ２レセプター免疫原を用いる種々の方法のいず れかにより調製してもよい。かかるＴＲ２レセプター免疫原には、図１Ａ−１Ｂ （配列番号２）に示されるＴＲ２レセプタータンパク質、およびＴＲ２−ＳＶ１ （図４Ａ−４Ｂ（配列番号５）およびＴＲ２−ＳＶ２（図７Ａ−７Ｂ（配列番号 ８）ポリペプチド（これらはいずれもリーダー配列を含んでいてもいなくてもよ い）およびＴＲ２レセプターのリガンド結合、細胞外、膜貫通、細胞内ドメイン またはこれらのいずれかの組み合わせを含むレセプターのポリペプチドフラグメ ントが包含される。 本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体、アゴニストまたはアンタ ゴニストは、Tartag1ia and Goeddel，J．Biol．Chem．267(7):4304-4307(1992) ;Tartaglia et al.，Cell 73:213-216(1993)およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９１ ３７に記載される方法にしたがって作成できる。本明細書で用いる、「抗体」（A ｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる用語は、完全な分子ならびに抗 原に結合可能なそのフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2フラグメン トなど）を包含する。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2フラグメントは、完全な抗体のＦ ｃフラグメントを欠き、循環からより速く消失し、完全な抗体の非−特異的組織 結合が少ない(Wahl et al.，J．Nucl．Med．24:316-325(1983))。 好ましい方法において、本発明の抗体はｍＡｂである。かかるｍＡｂは、ハイ ブリドーマ技術(Kohler and Millstein，Nature 256:495-497(1975)および米国 特許第４３７６１１０号;Harlow et al.，Antibodies:A Laboratory Manual，Co ld Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988;Monoclon al Antibodies and Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Ple num Press，New York，NY，1980;Campbell,"Monoclonal Antibody Technology" ，In:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13(Burdon et al.，eds.)，Elsevier，Amsterdam(1984))を用いて調製できる。 ＴＲ２レセプタードメインに結合するタンパク質および他の化合物もまた本発 明の候補アゴニストおよびアンタゴニストである。かかる結合化合物は、酵母ツ ー−ハイブリッドシステム(Fields and Song，Nature 340:245-246(1989))を用 いて、「検索(capture)」できる。酵母ツー−ハイブリッドシステムの変形バージ ョンが、Roger Brentおよび彼の共同研究者により記載されている(Gyuris，J．e t al.，Cell 75:791-803(1993)；Zervos，A．S．et al.，Cell 72:223-232(1993 ))。好ましくは、酵母ツー−ハイブリッドシステムを本発明にしたがって用い、 ＴＲ２レセプターのリガンド結合、細胞外、細胞内および膜貫通ドメインに結合 する化合物を検索する。かかる化合物は、本発明の優れた候補アゴニストおよび アン タゴニストである。 上記したツー−ハイブリッドアッセイを用い、ＴＲ２レセプターの細胞内ドメ インまたはその一部を用いて、インビボでレセプターと相互作用する細胞性タン パク質を同定してもよい。また、かかるアッセイを用いて、ＴＲ２レセプター機 能の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するリガンドを同定して もよい。このスクリーニングアッセイは、これまで成熟ＴＮＦ−ＲＩＩの細胞質 ドメインと相互作用するタンパク質を同定し、２つのレセプター結合タンパク質 を同定するのに、用いられている。Rothe，M．et al.，Cell 78:681(1994)。Ｔ Ｒ２レセプターの細胞質ドメインと結合するかかるタンパク質およびアミノ酸配 列は、本発明の優れた候補アゴニストおよびアンタゴニストである。 他のスクリーニング技術は、例えば、Science 246:181-296（1989）に記載さ れるような、レセプター活性化により引き起こされる細胞外ｐＨ変化を測定する システムにおいて、本発明のポリペプチドを発現する細胞（例えば、トランスフ ェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。他の例では、潜在的なアゴニストまた はアンタゴニストを本発明のポリペプチドを発現する細胞と接触させ、セカンド メッセンジャー応答、例えばシグナルトランスダクションを測定し、潜在的なア ンタゴニストまたはアゴニストが有効であるかどうかを調べてもよい。 ＴＲ２レセプターアゴニストを用い、腫瘍増殖の阻害およびある転移可能な腫 瘍の壊死などのリガンド活性を刺激できる。アゴニストを用い、例えば、Ｔ−細 胞、線維芽細胞および造血細胞分化などの細胞分化を刺激することもできる。Ｔ Ｒ２レセプターに対するアゴニストもまた、微生物に対する宿主の防御において ＴＲ２の役割を増加させ、関連する疾患（リステリア・モノサイトゲン(Listeri a monosytogenes)からなどの感染症）およびクラミジアを防御する。アゴニスト を用い、放射線治療の間に産生される電離性放射線の有害作用、例えば、酵素の 変性、脂質過酸化およびＤＮＡ損傷に対して防御することもできる。 本発明のレセプターポリペプチドに対するアゴニストを用い、微生物に対する 宿主防御におけるＴＮＦの役割を増加させ、関連する疾患を防御できる。アゴニ ストを用い、放射線治療の間に産生される電離性放射線の有害作用、例えば、酵 素の変性、脂質過酸化およびＤＮＡ損傷に対して防御することもできる。 アゴニストを用い、リンパ球増殖および分化の速度を増加することにより、抗 −ウイルス応答を媒介、増殖を調節、免疫応答を媒介、ＨＩＶなどの疾患に関連 する免疫不全を治療することもできる。 本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを用い、腫瘍増殖の刺激および ある転移可能な腫瘍の壊死などのリガンド活性を阻害することができる。アンタ ゴニストを用い、例えば、Ｔ−細胞、線維芽細胞および造血細胞分化などの細胞 性分化を阻害することもできる。アンタゴニストを用い、移植片対宿主拒絶反応 、同種移植片拒絶反応、およびＡＩＤＳなどのＴ−細胞媒介自己免疫疾患を治療 することもできる。Ｔ−細胞増殖がタイプ２ＴＮＦレセプターを介して刺激され ることも示されている。したがって、レセプターをアンタゴナイズすることで、 Ｔ−細胞の増殖を防御し、Ｔ−細胞媒介自己免疫疾患を治療できる。 ＡＩＤＳとされる免疫不全の状態は、ＣＤ４+Ｔ−リンパ球の数および機能が 減少する第２期である。最近の報告から、ＣＤ４+Ｔ−細胞の１日あたりの損失 は、３．５×１０7および２×１０9細胞の間であると概算される(WeiX.，et al. ，Nature 373:117−122(1995))。ＨＩＶ感染症におけるＣＤ４+Ｔ−細胞減少の 一つの原因は、ＨＩＶ−誘発アポトーシスであると考えられる。実際、ＨＩＶ− 誘発アポトーシス細胞死は、インビトロのみならず、より重要なことには、感染 した個体においても示されている(Ameisen，J．C.，AIDS 8:1197-1213(1994);Fi nkel，T．H.，and Banda，N．K.，Curr．Opin．Immunol．6:605-615(1995);Muro -Cacho，C．A.，etal.，J．Immunol．154:5555-5566(1995))。さらに、アポトー シスおよびＣＤ４+Ｔ−リンパ球減少は、ＡＩＤＳの異なる動物モデルにおいて も密接に関連しており(Brunner，T.，et al.，Nature 373:441-444(1995);Gouge on，M．L.，et al.，AIDS Res．Hum．Retroviruses 9:553-563(1993))、アポト ーシスは、ウイルス複製がＡＩＤＳとなっていないこれらの動物モデルにおいて は観察されない(Gougeon，M．L．et al.，AIDS Res．Hum．Retroviruses 9:553- 563(1993))。さらに、データは、非感染であるがプライムされるかまたは活性化 されたＨＩＶ−感染個体由来のＴ−リンパ球は、ＴＮＦ−ファミリーリガン ドＦａｓＬと遭遇後にアポトーシスを受けることを示す。ＨＩＶ感染後に死ぬこ ととなる単球細胞系を用いて、Ｕ９３７細胞のＨＩＶによる感染により、Ｆａｓ Ｌのデノボ発現が起こり、ＦａｓＬがＨＩＶ−誘発アポトーシスを媒介すること が示されている(Badley，A．D．et al.，J．Virol．70:199-206(1996))。さらに 、ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、非感染マクロファージにおいて検出可能であ り、その発現はＨＩＶ感染後にアップレギュレートされ、その結果、非感染ＣＤ ４+Ｔ−リンパ球が選択的に死ぬ結果となっていた(Badley，A．D．et al.，J．V irol．70:199-206(1996))。 実施例６に示されるように、図１Ａ−１Ｂに示されるＴＲ２レセプターは、Ｃ Ｄ４+Ｔ−リンパ球において発現され、リンパ球増殖を誘導できる。それゆえ、 本発明により、ＨＩＶ+個体を治療する方法であって、本発明のアゴニストを投 与し、ＣＤ４+Ｔ−リンパ球の増殖および分化の速度を増加させることを含む方 法が提供される。かかるアゴニストには、ＴＲ２レセプター（例えば、ＴＮＦα 、ＰＭＡおよびＤＭＳＯ）の発現を誘発できるか、または、リンパ球増殖および 分化を誘発するかかるレセプターのシグナルを増強できる薬剤が包含される。投 与の方法および投薬量は、以下に詳細に記載する。 同種移植片の拒絶反応において、ほとんどの部分について免疫系は環境的抗原 によりプライムされるのみであるため、受容動物の免疫系は応答するようにプラ イムされていない。同じ種の他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよ びバクテリアが提示されるのと同じように提示されない。同種移植片拒絶反応の 場合、免疫抑制管理が設計され、免疫系がエフェクター段階に到達するのを防ぐ 。しかしながら、異種移植片拒絶反応の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶反 応よりも疾患再発に似ていることがある。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島 細胞の破壊により証拠付けられるように、すでに活性化されている。それゆえ、 疾患再発において、免疫系はすでにエフェクター段階にある。本発明のアンタゴ ニストは、ＴＲ２媒介リンパ球増殖および分化の速度を減少させることにより、 同種移植片および異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制できる。かかるアン タゴニストには、実施例５および６において記載するＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク 質 が包含される。かくして、本発明はさらに、免疫応答を抑制する方法を提供する 。 加えて、ＴＮＦαは、自己免疫から生じる糖尿病に罹患しやすい動物種におい て糖尿病を防御することが示されている。Porter，A.，Tibtech 9:158-162(1991 )を参照。かくして、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは、タイプＩ糖 尿病などの自己免疫疾患の治療において有用であり得る。 加えて、細胞増殖および分化においてＴＲ２レセプターにより担われる役割は 、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストがこれらのレセプターの異常な細胞 性発現を含む病状を治療するのに用いることができることを示す。ある環境にお いて、ＴＲ２レセプターは炎症応答を誘発でき、アンタゴニストはこの応答を遮 断するのに有用な試薬となり得る。それゆえ、ＴＲ２レセプターアンタゴニスト （例えば、ＴＲ２レセプターの可溶性形態；中和化抗体）は、慢性関節リウマチ 、骨関節炎、乾癖、敗血症および炎症性腸疾患などの炎症性疾患の治療に有用で あり得る。 ＴＲ２レセプターに対するアンタゴニストは、重大な臨床状態として残る、敗 血症ショックを治療および／または予防するのに用いることができる。敗血症シ ョックは、病原体から直接的よりもむしろ、ＴＮＦおよびＩＬ−１などのタンパ ク質因子により媒介される過剰な宿主応答の結果として起こる。例えば、リポポ リサッカライドは、ＴＮＦの放出を引き起こし、その血清濃度を強く一時的に増 加させる。ＴＮＦは、過量で投与された場合、ショックおよび組織損傷を引き起 こす。したがって、ＴＲ２レセプターに対するアンタゴニストは、ＴＮＦの作用 を遮断し、敗血症ショックを治療／予防すると考えられる。これらのアンタゴニ ストは、ＴＮＦの高い血清レベルに関係する子供の髄膜炎菌血症を治療するのに も用いることができる。 ＴＲ２レセプターに対するアンタゴニストにより治療できる他の疾患には、Ｔ ＮＦレセプターリガンドにより媒介される炎症、細菌感染症、カヘキシーおよび 脳性マラリアが包含される。ＴＲ２レセプターアンタゴニストは、ＴＮＦなどの レセプターに対するリガンドにより媒介される炎症を治療するのにも用いること ができる。 投与方法 本明細書で記載するアゴニストまたはアンタゴニストを、インビトロ、エクス ビボ、またはインビボで、本発明のレセプターを発現する細胞に投与できる。ア ゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の投与とは、ＴＮＦ−ファミリーリ ガンドに対する細胞性応答を増強または阻害するのに十分な量の化合物を意味し 、ポリペプチドを含む。特に、アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の 投与とは、ＴＲ２レセプター媒介活性を増強または阻害するために有用な量を意 味する。もちろん、細胞増殖および／または分化を増強する場合には、本発明の アゴニストをＴＮＦ−ファミリーリガンドとともに投与できる。当業者には、ア ゴニストまたはアンタゴニストの有効量を、経験的に決定でき、純粋な形態また は医薬上許容される塩、エステルまたはプロドラッグの形態で用いることができ ることが認識されるであろう。アゴニストまたはアンタゴニストを、１またはそ れ以上の医薬上許容される助剤と組み合わせて、組成物として投与できる。 ヒト患者に投与する場合、本発明の化合物および組成物の一日全使用量は、医 薬判断の範囲内でかかり付けの医師により決定されることが理解されるであろう 。特定の患者に対する具体的な治療上の有効用量レベルは、医薬分野で周知の因 子に依存する。 一般的な計画として、用量当たりの非経口投与されるＴＲ２ポリペプチドの医 薬的に効果的な全量は、患者体重１ｋｇあたり、約１μｇ／日〜１０ｍｇ／日の 範囲内であるが、上記したように、治療的裁量にゆだねられる。より好ましくは 、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、もっとも好ましくは、ヒト用には 、ホルモンについて約０．０１および１ｍｇ／ｋｇ／日の間である。連続的に投 与される場合、ＴＲ２ポリペプチドは、典型的には、１日当たり１〜４回注射ま たは連続的な皮下注入（例えばミニ−ポンプを用いて）のいずれかにより、約１ μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で投与される。静脈バッ ク溶液もまた用い得る。 本発明のＴＲ２レセプターポリペプチドを含む医薬組成物は、経口、直腸、非 経口、槽内、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴剤または経皮パッチによるな ど）、口腔内投与、または経口もしくは鼻スプレーとして投与できる。「医薬上 許容される担体」には、非−毒性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、被包 化材料またはいずれかのタイプの処方助剤を意味する。本明細書で用いる「非経 口」なる用語は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内注射およ び注入を含む投与の形態を意味する。 本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参考にして、本発明をより容易 に理解できるであろう。この実施例は単に例示であって、本発明を限定するもの ではない。 実施例１ イー．コリ内でのＴＲ２の発現および精製 この実施例において、細菌発現ベクターｐＱＥ６Ｏを細菌発現用に用いる。（ QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）ｐＱＥは、アンピ シリン抗生物質耐性(「Ａｍｐr」)をコードし、細菌の複製起点(「ｏｒｉ」)、ＩＰ ＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位(「ＲＢＳ」)、QIAGEN，Inc.（前掲 ）から販売されるニッケル−ニトリロ−トリ酢酸(「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニテ ィ樹脂を用いるアフィニティ精製を可能とするヒスチジン残基をコードする６個 のコドン、および適当な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは 、ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、ポリペプチドのカルボキシ ル末端に共有結合する６個のＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有す るポリペプチドを産生するように挿入されるように、整列する。しかしながら、 この実施例において、ポリペプチドコーディング配列を、６個のＨｉｓコドンの 翻訳が妨害され、それゆえ、６×Ｈｉｓタグを有さないポリペプチドが産生され るように、導入する。 疎水性のリーダー配列を欠くＴＲ２タンパク質の所望の部分をコードするＤＮ Ａ配列を、ＴＲ２タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列および寄託構築物の ｃＤＮＡコーディング配列の３’側の配列にアニールする、ＰＣＲオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて、寄託ｃＤＮＡクローンから増幅する。ｐＱＥ６０ベ クターにおけるクローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレ オチドを５’および３’配列のそれぞれに添加する。 成熟タンパク質のクローニングのため、５’プライマーは、 ５’ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴ３’（配列番号 １４） の、下線で示したＮｃｏＩ制限部位、それに続く図１Ａ−１Ｂ中の成熟ＴＲ２配 列のアミノ末端コーディング配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む配列を有す る。当業者は、もちろん、５’プライマーが始まるタンパク質コーディング配列 中のポイントを代えて、成熟形態よりも短いか長い完全なタンパク質の所望の部 分を増幅できることを認識するであろう。 ３’プライマーは、 ５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＣ３’（配 列番号１５） の、下線で示したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、それに続くＴＲ２レセプターの細胞 外ドメインをコードする配列番号１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示すヌクレオチド 配列の３’末端と相補的な１８ヌクレオチドを含む配列を有する。 増幅したＴＲ２ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥをＮｃｏＩおよびＨ ｉｎｄＩＩＩで消化し、ついで消化したＤＮＡをともにライゲートする。ＴＲ２ ＤＮＡの制限されたｐＱＥベクターへの挿入により、その連結するストップコド ンを含むＴＲ２タンパク質コーディング領域が、ＩＰＴＧ−誘導性プロモーター から下流および開始ＡＵＧとのフレーム中に置かれる。連結するストップコドン は、挿入ポイントの下流の６個のヒスチジンコドンの翻訳を妨げる。 ライゲーション混合物で、コンピテントイー．コリ細胞を、Sambrook et al. ，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2nd Ed．;Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)に記載されるものなどの標準的 な方法を用いて、トランスフォームする。ｌａｃリプレッサーを発現し、カナマ イシン耐性(「Ｋａｍr」)を授与する、プラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む イー．コリ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書で記載する実施例を行うために 用いる。ＴＲ２タンパク質の発現に適する多くの株のうちの一つであるこの株は 、QIAGEN，Inc．（前掲）から市販される。トランスフォーマントを、アンピシ リンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で生育する能力により同定す る。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、クローニングしたＤＮＡの同 定を、制限解析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により確認した。 所望の構築物を含むクローンをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナ マイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を含むＬＢ培地の液体培養物中で一晩(「Ｏ／ ｎ」)生育させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５〜１：２５０の希釈で大き な培養物中に摂取する。細胞を、６００ｎｍでの光学密度(「ＯＤ６００」)が０． ４および０．６の間にまで増殖させる。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド(「ＩＰＴＧ」)をついで最終濃度１ｍＭにまで添加し、ｌａｃＩレプレッ サーを不活化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転 写を誘発する。続けて、細胞をさらに３〜４時間培養する。ついで細胞を遠心分 離により集める。 ついで、細胞を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８中で４℃にて３〜４時間、撹 拌する。細胞破片を遠心分離により除去し、ＴＲ２を含む上澄を２００ｍＭのＮ ａＣｌを含む５０ｍＭのＮａ−酢酸緩衝液、ｐＨ６に対して透析する。別に、タ ンパク質をプロテアーゼ阻害剤を含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー ル、２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析することにより、うま く再生できる。復元後、タンパク質をイオン交換、疎水性相互作用およびサイズ 排除クロマトグラフィーにより精製できる。別法として、抗体カラムなどのアフ ィニティクロマトグラフィー工程を用い、純粋なＴＲ２タンパク質を得ることが できる。精製タンパク質を４℃にて保存するかまたは−８０℃にて凍結させる。 実施例２ 実施例２(ａ)：バキュロウイルス発現系におけるＴＲ２タンパク質の可溶性フラ グメントのクローニングおよび発現 この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを用い、天然に 結合する分泌性シグナル（リーダー）配列を欠く、図１Ａ−１Ｂに示すＴＲ２レ セプタータンパク質の成熟細胞外ドメインをコードするクローニングしたＤＮＡ を、バキュロウイルス中に挿入した。このタンパク質を、バキュロウイルスリー ダー、および、Summers et al.，A Manual of Methods for Baculovirus Vector s and Insect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experimental St ation Bulltein No．1555(1987)に記載されるような標準的な方法を用いて発現 させた。この発現ベクターは、オートグラハ・カリフォルニカ（Autographa cal ifornica）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモータ ー、それに続くバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌性シグナルペプチド （リーダー）およびＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８などの慣用の制限 部位を含む。シミアンウイルス４０(「ＳＶ４０」)のポリアデニル化部位を効率的 なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するため、プラ スミドは、同じ方向で、弱いドロソフィラプロモーターの制御下に、イー．コリ 由来のベーターガラクトシダーゼ遺伝子、それに続くポリヘドリン遺伝子のポリ アデニル化シグナルを含む。野生型ウイルスＤＮＡとの細胞−媒介相同性組換え のために、挿入された遺伝子の両側にウイルス性の配列を置き、クローニングさ れたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを作成する。 構築物が、シグナルペプチドを含む転写、翻訳分泌などのために適当に位置す るシグナルを提供し、必要ならばＡＵＧのフレーム中にある限り、当業者であれ ば容易に認識できるように、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１な どの他の多くのバキュロウイルスベクターを上記のベクターの代わりに用いるこ とができる。かかるベクターは、例えば、Luckow et al.，Virology 170:31-39 に記載される。 寄託クローン（ＡＴＣＣ受託番号９７０５９）中のＴＲ２レセプタータンパク 質の成熟細胞外ドメイン（図１Ａ−１Ｂに示すアミノ酸３７〜２００）を本質的 にコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の関連する５’および３’配列に対応する ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。上記の５’プライマー は、 ５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＡＣ３’(配列番号１６) の、下線で示したＢａｍＨＩ制限酵素部位、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947 -950(1987)に記載されるような真核細胞における翻訳開始のための効率的なシグ ナル、それに続く、図１Ａ−１Ｂに示す、ヌクレオチド３５４で始まる、ＴＲ２ タンパク質のコーディング配列の１５塩基を含む、配列を有する。３’プライマ ーは、５’ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＣ３ ’（配列番号１７） の、下線で示したＡｓｐ７１８制限部位、それに続く、図１Ａ−１Ｂのコーディ ング配列に相補的な１７ヌクレオチドを含む配列を有する。 増幅したフラグメントを市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla， Ca.)を用いて、１％アガロースゲルから単離した。ついでフラグメントをＢａｍ ＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、１％アガロースゲル上で精製した。このフラ グメントを本明細書において「Ｆ１」と称する。 プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、子ウシ小腸 ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。ついでＤＮＡを市販のキット(「Genecl ean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)を用いて１％アガロースゲルから単離した。 このベクターＤＮＡを本明細書において「ＶＩ」と称する。 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを 用いてともにライゲートした。大腸菌ＨＢ１０１細胞をライゲーション混合物で トランスフォームし、培養プレートに播いた。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)などの他の適当なイー．コリ宿主を用いてもよ い。ＰＣＲ法を用いてヒトＴＲ２配列を有するプラスミドを含む細菌を同定した 。このＰＣＲにおいて、遺伝子を増幅するのに用いたプライマーおよびセカンド プライマーの一つは、ベクター内からのものであり、ＴＲ２遺伝子フラグメント を含む細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示すようにした。クローニングされた フラグメントの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。該プラスミドを本明細書 において「ｐＢａｃＴＲ２−Ｔ」と称する。 Felgner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417(1987)に記載さ れるリポフェクチン法を用いて、５μｇのｐＢａｃＴＲ２−Ｔを、１．０μｇの 市販の線状バキュロウイルスＤＮＡ(「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Pharming en，San Diego，CA.)とともにトランスフェクトした。１μｇのBaculoGoldTMウ イルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＲ２−Ｔを、５０μｌの血清 不含グレースの培地(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)を含むマイク ロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェク チン＋９０μｌのグレースの培地を添加し、混合し、室温にて１５分間インキュ ベートした。ついで、トランスフェクション混合物を、血清を含まない１ｍｌの グレースの培地を含む３５ｍｍの組織培養プレート中にまかれたＳｆ９昆虫細胞 （ＡＴＣＣＣＲＬ １７１１）に滴下した。プレートを前後に揺らし、新たに添 加した溶液を混合した。ついでプレートを５時間２７℃にて培養した。５時間後 、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、１０％胎仔ウシ血清を含む １ｍｌのグレースの昆虫培地を添加した。プレートを培養器に戻し、培養を２７ ℃にて４日間続けた。 ４日後、上澄を回収し、Summers and Smith（前掲）により記載されるように 、プラークアッセイを行った。「Blue Gal」(Life Technologies Inc.，Gaihersb urg)を含むアガロースゲルを用い、青色染色プラークを形成するｇａｌ−発現ク ローンの同定および単離を容易にした。(このタイプの「プラークアッセイ」の 詳説は、Life Techonologies Inc.，Gaithersburg，p9-10により頒布される昆虫 細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド中に見ることができる。)適 当なインキュベーション後、青色染色プラークをマイクロピペッター（例えば、 エッペンドルフ）のチップで取った。ついで、組換えウイルスを含む寒天を２０ ０μｌのグレースの培地を含むマイクロ遠心チューブ中で再懸濁し、組換えバキ ュロウイルスを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍ皿中に播いたＳｆ９細胞を感染さ せた。４日後、これらの培養皿の上澄を集め、ついでこれらを４℃にて保存した 。組換えウイルスをＶ−ＴＲ２−Ｔと呼ぶ。 用いた遺伝子の発現を確認するため、Ｓｆ９細胞を１０％加熱不活化ＦＢＳを 含むグレースの培地中で増殖させた。細胞を、感染多重度(「ＭＯＩ」)２の組換 えバキュロウイルスＶ−ＴＲ２−Ｔで感染させた。６時間後、培地を除去し、メ チオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ＩＩ培地(Life Technologies Inc .，Rockville，MDより利用可能)で置き換えた。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ− メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン(Amershamより利用可能)を添加し タンパク質を放射線標識した。さらに細胞を１６時間インキュベートし、ついで 、遠心分離により集めた。上澄中のタンパク質ならびに細胞内タンパク質をＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥついでオートラジオグラフィーにより解析した。精製したタンパク 質のアミノ末端のアミノ酸配列のマイクロシークエンシングを用い、成熟タンパ ク質の網の末端配列、および、分泌性シグナルペプチドの切断点および長さを決 定した。 実施例２(ｂ)：バキュロウイルス発現系におけるＴＲ２タンパク質のクローニン グおよび発現 実施例２(ａ)において記載したＴＲ２レセプターの末端切断バージョンのクロ ーニングおよび発現と同様に、図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示す全長ＴＲ２レ セプタータンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを作成した。 この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を用い、天然に結合 する分泌性シグナル（リーダー）配列を含む、完全なタンパク質をコードするク ローニングしたＤＮＡをバキュロウイルスに挿入し、成熟ＴＲ２タンパク質を発 現させた。ｐＡ２ベクターの他の特徴は、実施例２(ａ)において用いたｐＡ２ ＧＰベクターについて記載したのと同様である。 図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示すＡＵＧ開始コドンおよび天然に結合するリ ーダー配列を含む寄託クローン中の全長ＴＲ２タンパク質をコードするｃＤＮＡ 配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いて増幅した。５’プライマーは、 ５’ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧ ３’（配列番号１８） の、下線で示したＢａｍＨＩ制限酵素部位、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947 -950 (1987)に記載されるような真核細胞における翻訳開始のための効率的なシグナル 、それに続く、図１Ａ−１Ｂに示す、ＡＵＧ開始コドンで始まる、完全なＴＲ２ タンパク質の配列の２１塩基を含む配列を有する。３’プライマーは、 ５’ＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡ３’( 配列番号１９) の、下線で示したＡｓｐ７１８制限部位、それに続く、図１Ａ−１Ｂの非コーデ ィング配列に相補的な２１ヌクレオチドを含む配列を有する。 増幅したフラグメントを単離し、実施例２(ａ)において記載したように制限酵 素で消化し、プラスミドｐＢａｃＴＲ２を作成した。 ５μｇのｐＢａｃＴＲ２を、１μｇのBaculoGoldTM(Pharmingen)ウイルスＤＮ Ａおよび１０μｌのリポフェクチンTM(Life Technologies，Inc.)とともに、全 量２００μｌの血清不含培地中でトランスフェクトした。一次ウイルスを感染後 (pi)４〜５日で集め、プラークアッセイに用いた。プラーク精製ウイルスを、続 けて、実施例２(ａ)において記載したように、増幅させ、凍結させた。 発現したタンパク質を放射線標識するために、Ｓｆ９細胞を、０．５×１０6 細胞／ｍｌを含む２．０ｍｌの細胞懸濁液を有する１２ウェル皿にまき、４時間 付着させた。組換えバキュロウイルスを用い、１〜２のＭＯＩで細胞を感染させ た。４時間後、培地を、１．０ｍｌのメチオニンおよびシステインを抜いた血清 不含培地（−Ｍｅｔ／−Ｃｙｓ）で置き換えた。感染後３日に、培養基を［35Ｓ ］−Ｍｅｔおよび［35Ｓ］−Ｃｙｓをそれぞれ２μＣｉ含む、０．５ｍｌの−Ｍ ｅｔ／−Ｃｙｓで置き換えた。細胞を１６時間標識し、その後、培養基を除去し 、遠心分離により浄化した（上澄）。細胞を０．２ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９；１３０ｍＭ ＮａＣｌ；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ；０． ５ｍＭ ＤＴＴおよび０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌＮＰ−４０）を添加して皿中で溶 解させ、ついで１．０ｍｌにまでｄＨ2Ｏで希釈した(細胞抽出物)。３０μｌの 上澄および細胞抽出物のそれぞれを、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タン パク質ゲルを染色し、脱染色し、増幅させ、乾燥させ、オートラジオグラフィー に付した。組換えタンパク質に対応する標識されたバンドは、暴露後１６〜７２ 時間 後に可視化された。 実施例３ 哺乳動物細胞におけるＴＲ２のクローニングおよび発現 典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写開始を媒介するプロモータ ーエレメント、タンパク質コーディング配列、および転写の終止および転写物の ポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントには、エンハンサ ー、Ｋｏｚａｋ配列およびＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部 位が隣接する介在配列が包含される。ＳＶ４０からの早期および後期プロモータ ー、例えば、ＰＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩなどのレトロウイルスからのロング ・ターミナル・リピート（ＬＴＲＳ）、および、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ ）の早期プロモーターなどを用いて非常に効率的な転写を行うことができる。し かしながら、細胞性エレメントもまた用いることができる（例えば、ヒトアクチ ンプロモーター）。本発明を実行するのに用いる適当な発現ベクターには、例え ば、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、ｐＲＳＶｃａｔ( ＡＴＣＣ３７１５２)、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）およびｐＢＣ １２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７０１９）などのベクターが包含される。用いることので きる哺乳動物宿主細胞には、ヒトＨｅ１ａ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞 、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、 ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞が包含される。 別法として、染色体中に組み込まれた遺伝子を含む安定な細胞系で、遺伝子を 発現できる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンまたはヒグロマイシンなどの選択 マーカーとともにトランスフェクションすることにより、トランスフェクトされ た細胞の同定および単離が可能となる。 トランスフェクトされた遺伝子を増幅させ、大量のコードされるタンパク質を 発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロフォレートレダクターゼ）マーカ ーは、数百または数千コピーの目的の遺伝予を坦持する細胞系を確立するのに有 用である。他の有用な選択マーカーは、酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）である (Murphy et al.，Biochem J．227:277-279(1991);Bebbington et al.，Bio/Tech nology 10:169-175(1992))。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を選択培 地中で増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は、染 色体中に組み込まれた増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）およびＮＳＯ細胞を、タンパク質の産生のためにしばしば用いる。 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ ー（ＬＴＲ）(Cullen et al.，Molecular and Cellular Biology，438-447(1985 ,３月))とＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント(Boshart et al.，Cell 41:521- 530(1985))を含む。例えば、制限酵素切断部位、ＢａｍＨＩ、ＸｂａｌおよびＡ ｓｐ７１８を有する多重クローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを容 易にする。ベクターは、加えて、ラットプレプロインシュリン遺伝子の、３’イ ントロン、ポリアデニル化および終止シグナルを含む。 実施例３(ａ)：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現 発現プラスミド、ｐＴＲ２ＨＡを、ＴＲ２をコードするｃＤＮＡを発現ベクタ −ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Invitrogen，Inc．から入手 可能）中にクローニングすることにより作成する。 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは:(１)イー．コリおよび他の原核細胞に おける増殖に有効なイー．コリ複製起点;(２)プラスミド−含有原核細胞の選択 のためのアンピシリン耐性遺伝子;(３)真核細胞における増殖のためのＳＶ４０ 複製起点;(４)ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン;(５)ｃ ＤＮＡがＣＭＶプロモーターの発現制御下に適切に置かれ、ポリリンカーの制限 部位によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに機能的に連結す るように整列した、血球凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン、そ れに続く終止コドンおよびポリアデニル化シグナル、を含む。ＨＡタグは、Wils on et al.，Cell 37:767(1984)により記載されるインフルエンザ血球凝集素タン パク質由来のエピトープに対応する。ＨＡタグの標的タンパク質への融合 により、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の検出および 回収が容易になる。ｐｃＤＮＡＩＩＩは、加えて、選択可能なネオマイシンマー カーを含む。 ＴＲ２をコードするＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー領域中にク ローニングし、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターにより調節されるよ うにする。プラスミド構築方法は以下のとおりである。イー．コリにおけるＴＲ ２の発現のためのベクターの構築についてほぼ上記したように、寄託クローンの ＴＲ２ｃＤＮＡを便利な制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。本実施例 において用いる適当なプライマーは、以下のものを含む。下線で示したＢａｍＨ Ｉ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドンおよび完全なＴＲ２の５’コーディ ング領域の６個のさらなるコドンを含む５’プライマーは、以下の配列： ５’ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧ ３’(配列番号２０) を有する。下線で示したＸｂａＩ部位、終止コドン、ＨＡタグ、および３’コー ディング配列の１９塩基対を含む３’プライマーは、以下の配列(３’末端に)： ５’ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡ ＴＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣ３’(配列番号２１) を有する。 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクター、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ついでライゲートする。ライゲーション混 合物をイー．コリＳＵＲＥ株（Stratagene Coloning Systems，11099 North Tor rey Pines Road，La Jolla，CA 92037より利用可能）中にトランスフォームし、 トランスフォームした培養物をアンピシリン培地プレート上に播いて、ついでこ れをインキュベートしてアンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤ ＮＡを耐性コロニーから単離し、ＴＲ２−コーディングフラグメントの存在につ いて、制限解析または他の手段により調べる。 組換えＴＲ２の発現のため、例えばSambrook et al.，Molecular Cloning:a L aboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York (1989)に記載されるような、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記した発現 ベクターでＣＯＳ細胞をトランスフェクトする。細胞をベクターによるＴＲ２の 発現用の条件下でインキュベートする。 ＴＲ２−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Harlow et al.，Antibodies: A Laboratory Manual，2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold S pring Harbor，New York(1988)に記載される方法を用いて、放射線標識および免 疫沈降により検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後、細胞 を、35Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることにより標識 する。Wilson et al．（上記に引用）に記載されるように、細胞および培地を回 収し、細胞を洗浄し、界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、 １％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶解させる。ＨＡ−特異的モノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物お よび培養基からタンパク質を沈澱させる。ついで、沈澱したタンパク質をＳＤＳ −ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより解析する。予想される大きさの 発現産物が細胞溶解物中に見られ、これは、負の対照中には見られない。 実施例３(ｂ)：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現 ベクターｐＣ４をＴＲ２タンパク質の発現用に用いる。プラスミドｐＣ４は、 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である 。該プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下のマウスＤＨＦＲ遺伝子 を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされた、ジヒドロホレート活性 を欠くチャイニーズハムスター卵巣−または他の細胞を、化学療法剤メトトレキ セートを含む選択培地(アルファマイナスＭＥＭ、Life Technologies)中で細胞 を増殖させることにより選択できる。メトトレキセート（ＭＴＸ）に耐性な細胞 におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅については、よく示されている(例えば、Alt．F ．W.，Kellems，R．M.，Bertino，J．R.，and Schimke，R．T.，1978，J．Biol ．Chem．253:1357-1370，Hamlin，J．L．and Ma，C．1990，Biochem．et Biophy s．Acta，1097:107-143，Page，M．J．and Sydenham，M．A．1991，Biotechnolo gy 9:61-68 を参照)。高い濃度のＭＴＸで増殖する細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果と して、標的酵素、ＤＨＦＲを過剰産生することにより、薬剤に対する耐性を確立 する。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結する場合、これは、通常、ともに増 幅し、過剰発現される。この方法を用いて、１０００コピー以上の増幅遺伝子を 坦持する細胞系を確立できることが、当該分野で知られている。その後、メトト レキセートが回収されると、宿主細胞の１またはそれ以上の染色体中に組み込ま れた増幅遺伝子を含む細胞系が得られる。 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現用に、ラウス肉腫ウイルスのロング ・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）の強力なプロモーター(Cullen et al.，Mole cular and Cellular Biology，438-447(1985，３月))とヒトサイトメガロウイノ レス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント(B oshart et al.，Cell 41:521-530(1985))を含む。プロモーターの下流は、Ｂａ ｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位であり、遺伝子の組み込 みを可能とする。これらのコーディング配列の後ろに、プラスミドは、ラットプ レプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。 例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター 、またはＨＩＶおよびＨＴＬＶＩなどの他のレトロウイルス由来のロング・ター ミナル・リピートなどの、他のきわめて有効なプロモーターもまた発現用に用い ることができる。ClontechのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系お よび類似の系を用いて、哺乳動物細胞において調節された方法でＴＲ２タンパク 質を発現できる(Gossen，M.，& Bujard，H．1992，Proc．Natl．Acad．Sci，USA 89:5547-5551)。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えばヒト成長ホルモン またはグロビン遺伝子由来の他のシグナルを用いることができる。染色体中に組 み込まれた目的の遺伝子を坦持する安定な細胞系を、ｇｐｔ、Ｇ４１８またはヒ グロマイシンなどの選択マーカーとともにトランスフェクションして選択するこ ともできる。例えば、Ｇ４１８とメトトレキセートなど、はじめに１より多くの 選択マーカーを用いることが有利である。 プラスミドｐＣ４を、当該分野で公知の方法により、制限酵素ＢａｍＨＩおよ びＡｓｐ７１８で消化し、ついで子ウシ小腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化 する。ついで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。 リーダー配列を含む完全なＴＲ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、遺伝 子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用い て増幅する。５’プライマーは、 ５’ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧ ３’(配列番号２２) の、下線で示したＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続くKozak,M.,Ｊ.Mol.Biol.1 96:947-950(1987)に記載されるような、真核細胞における翻訳開始のための効果 的なシグナル、および図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示すＴＲ２タンパク質のコ ーディング配列の２１塩基を含む配列を有する。３’プライマーは、５’ＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣ ＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡ３’(配列番号１ ９) の、下線で示したＡｓｐ７１８制限部位、それに続く、図１Ａ−１Ｂ（配列番号 １）に示すＴＲ２遺伝子の非コーディング配列に相補的な２１ヌクレオチドを含 む配列を有する。 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８ で消化し、ついで１％アガロースゲル上で精製する。単離したフラグメントおよ び脱リン酸化ベクターを、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートする。 イー．コリＨＢ１０１またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を、ついでトランスフォーム し、例えば、制限酵素解析を用いてプラスミドｐＣ４中に挿入されたフラグメン トを含む細菌を同定する。 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ クション用に用いる。５μｇの発現プラスミドｐＣ４をリポフェクチン(Felgner et al.，前掲)を用いて０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとともにトラ ンスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優勢な選択マーカー、Ｇ４ １８を含む抗生物質の一群に対して耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来の ｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むアルファマイナス ＭＥＭ中に播く。２日後、細胞をトリプシン処理し、１０、２５または５０ｎｇ ／ｍｌのメトトレキセート＋１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むアルファマイナスＭ ＥＭのハイブリドーマクローニングプレート(Greiner,Germany)中に播く。１０ 〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理し、ついで、６−ウェルペトリ皿ま たは１０ｍｌフラスコ中に、異なる濃度のメトトレキセート（５０ｎＭ、１００ ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、播く。最大濃度のメト トレキセートで増殖するクローンを、ついで、より高い濃度のメトトレキセート （１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６−ウェルプレ ートに移す。同じ方法を１００−２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られ るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ びウェスタンブロットにより、または逆相ＨＰＬＣ解析により解析する。 実施例４ ＴＲ２ｍＲＮＡ発現の組織分布 なかでも、Sambrook et al.(前掲)により記載される方法を用いて、ノザンブ ロット解析を行い、ヒト組織におけるＴＲ２遺伝子発現を調べる。ＴＲ２タンパ ク質（配列番号１）の全体のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブを、製造 者の指示にしたがって、rediprimeTMＤＮＡ標識システム(Amersham Life Scienc e)を用いて、32Ｐで標識する。標識後、プローブを製造者のプロトコール番号Ｐ Ｔ１２００−１にしたがって、CHROMA SPIN−100TMカラム(Colntech Laboratori es,Inc.)を用いて、精製する。精製した標識プローブを、ついでＴＲ２ｍＲＮＡ について種々のヒト組織を調べるのに用いる。 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むマルチプル組織ノ ザン（ＭＴＮ）ブロットをClonthechから入手し、製造者のプロトコール番号Ｐ Ｔ１１９０−１にしたがって、ExpressHybTMハイブリダイゼーション溶液(Clont ech)を用いて、標識プローブで調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続 けて、ブロットを固定し、−７０℃にて一晩フィルムに暴露し、標準的な方法に したがってフィルムを確立する。 実施例５ 実施例５(ａ)：ＴＲ２−Ｆｃ（ＴＲ２−Ｉｇ融合タンパク質）および切断された ＴＲ２の発現および精製 翻訳されたＴＲ２レセプターの推定膜貫通ドメインを、非極性トランスバイレ イヤーヘリックスを同定するための、Goldman et al．（Ann．Rev．of Biophys ．Biophys．Chem．15:321-353(1986))の方法を用いて、疎水性により調べた。推 定リーダーペプチドおよび細胞外ドメインをコードするこの膜貫通ドメインの上 流領域を、Ｆｃ融合タンパク質の製造のために選択した。ＢｇｌＩＩ部位(単一 下線)、ファクターＸａプロテアーゼ部位およびＡｓｐ７１８Ｉ部位（二重下線 ）を３’末端に加えた、ＨＴＸＢＳ４０由来の対応するコーディング領域を有す るプライマーを設計し、ＰＣＲに付した。ＴＲ２コーディング配列の１８ヌクレ オチドを含む、このプライマー対（フォファード３５−ｍｅｒ： ５’ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴ Ｇ３’(配列番号２３)、リバースプライマー５３−ｍｅｒ： ＧＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣ３’(配列番号２４)) によるＰＣＲにより、予想される大きさの一つのバンドが得られた。これをＣＯ ＳＦｃｌｉｎｋ中にクローニングし、ＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋプラスミドを得た。 ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化し、ＣＯＳＦｃｌｉｎｋプ ラスミド(Johansen，et al.，J．Biol．Chem．270:9459-9471(1995))中にライゲ ートし、ＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋを作成した。 ＣＯＳ細胞を一時的にＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋでトランスフェクトし、得られた 上澄をタンパク質Ａアガロースで免疫沈降させた。ヤギ抗−ヒトＦｃ抗体を用い る免疫沈降物のウエスタンブロット解析により、グリコシル化ＴＲ２−Ｆｃにつ いて予想される大きさ（４７．５ｋＤよりも大きい）と一致する強いバンドが示 された。１５Ｌ−時ＣＯＳトランスフェクションを行い、得られた上澄を精製し た(以下参照)。精製タンパク質を用い、マウスを免疫し、ついで、ｍＡｂの産生 のためにＤＮＡを注射した。 ＣＨＯ細胞をＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋでトランスフェクトし、安定な細胞系を作 成した。５つの系を伸長についてドットブロット解析により選択し、振盪フラス コに入れた。最も高いレベルのＴＲ２−Ｆｃタンパク質発現を示す系をウエスタ ンブロット解析により同定した。この系の上澄より精製したＴＲ２−Ｆｃタンパ ク質を、完全なタンパク質としてまたはファクターＸａ切断およびビオチニル化 後のいずれで、フローサイトメトリーにより細胞結合研究に用いた(以下参照)。 クローンＨＴＸＢＳ４０は、図１Ａ−１Ｂ（配列番号１）に示す配列と、ＨＴ ＸＢＳ４０がヌクレオチド３１４にグアニン、ヌクレオチド３８６にチミン、ヌ クレオチド６２７にシトシンを含む点で異なる、ＴＲ２の対立遺伝子変異体であ る。 ＴＲ２の細胞外ドメインの発現に適したプラスミドを以下のように構築し、抗 −ＴＲ２ ｍＡｂの作成用にマウスを免疫した。ＦｃフラグメントをＢｇｌＩＩ ／ＸｂａＩ消化によりＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋから除去し、クレノウを用いて、突 出部を埋めて、プラスミドの平滑末端を再度ライゲートした。得られるフレーム シフトは、もともとはＴＲ２−Ｆｃｌｉｎｋ中に導入されていたアミノ酸のすぐ 後に、ＢｇｌＩＩ部位の添加により、ストップコドンを導入した。それゆえ、Ｔ Ｒ２の細胞外ドメインのＣ−末端は、この構築物（ＴＲ２ｅｘｌｉｎｋ）中にお いて２個のアミノ酸（ＲＳ）のみが続く。 実施例５(ｂ)：ＣＨＯ ＥＩＡ条件培地からのＴＲ２−Ｆｃの精製、その後のＴ Ｒ２の切断およびビオチニル化 アッセイ 精製を通しての生成物純度を、還元および非還元条件下で泳動させる１５％Ｌ ａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でモニターした。タンパク質濃度をＡ280 によりモニターし、配列から計算して、レセプターについて０．７の吸光率、キ メラについて１．２８の吸光率と想定した。吸光率をＡＡＡにより確かめた。 ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のプロテインＧクロマトグラフィー 以下に記載するすべての工程を４℃にて行った。１５ＬのＣＨＯ条件培地（Ｃ Ｍ）（細胞培養中回収後、０．２μフィルターに付した）を１９９ｃｍ／時間の 線計流速にて、プロテインＧの５×１０ｃｍカラムに付した。カラムを、サンプ ルの適用前に、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で洗浄し、２０ｍＭリン酸ナト リウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡化した。ＣＭをロード後、カ ラムを５カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、 ｐＨ７で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。４３５ｍｌの溶 出物をすぐに３ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５で中和し、０．２μフィルターに付した 。Ａ280に基づき、吸光率１．２８、６５ｍｇのタンパク質が０．１５ｍｇ／ｍ ｌで回収された。 濃縮／透析 ３８５ｍｌのプロテインＧ溶出物を、３０Ｋ膜に適合したＡｍｉｃｏｎ撹拌セ ル中で、最終濃度１．７の３４ｍ１にまで濃縮した。濃縮物を緩衝液に対して透 析した。 遊離レセプターを作成するためのファクターＸａ切断および精製 ６ｍｌ（１０．２ｍｇ）のＴＲ２−Ｆｃを５０μｇのファクターＸａに加え、 １：２００のｅ：ｓ比とした。混合物を一晩４℃にてインキュベートした。 遊離ＴＲ２レセプターのプロテインＧカラムクロマトグラフィー プロテインＧの１ｍｌカラムを、重力流を用い、使い捨てカラム中で、２０ｍ Ｍリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化した。切 断したレセプターをカラムに３回通し、その後、カラムをＡ280吸光度が見られ なくなるまで、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６ ．５で洗浄した。カラムを２．５ｍｌの１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で溶出 し、８３μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で中和した。ＴＲ２は、非結合フラ クション中に溶出した。 濃縮 約１２ｍｌのプロテインＧカラムからの非結合フラクションを、Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ１０Ｋセル(Amicon)中で約１ｍｌ、Ａ280、吸光率０．７により３．５ｍ ｇ／ｍｌと評価される最終濃度にまで濃縮した。 モノＳカラムクロマトグラフィー 濃縮したサンプルを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６で５ｍｌに希釈し、 ２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６で平衡化した０．５×５ｃｍモノＳカラムに 、３００ｃｍ／ｈの線形流速で付した。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６で洗浄し、２０カラム容積の、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６〜２０ｍ Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６の線形勾配で溶出した。ＴＲ ２タンパク質は、非結合フラクション中に溶出した。 濃縮／透析 モノＳカラムからの３ｍｌの非結合フラクションを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ Ｋセルを用いて上記のように１ｍｌに濃縮し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ ０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７に対して透析した。透析後の濃度は、２．１ｍｇ ／ｍｌであった。 ビオチニル化 ２．１ｍｇ／ｍｌのＴＲ２の０．５ｍｇを、１００ｍＭホウ酸塩、ｐＨ８．５ に対して透析した。２０倍モル過量のＮＨＳ−ＬＣビオチンを添加し、混合物を 回転装置上に一晩４℃で放置した。ビオチニル化ＴＲ２を２０ｍＭリン酸ナトリ ウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７に対して透析し、滅菌濾過し、−７０ ℃にて保存した。ビオチニル化をストレプトアビジンＨＲＰでプローブしたウェ スタンブロット上で示し、続けてＥＣＬ試薬で確立した。 実施例６ ＴＲ２レセプターの膜結合形態は、リンパ球増殖および分化を誘発するＴＮＦＲ である。 腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）／神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）スーパーフ ァミリーのメンバーは、分子の細胞外部分の約３０〜４０アミノ酸からなるシス テインーリッチモチーフの３〜６回繰り返しの存在により特徴付けられる(Malle tt，S．and Barclay，A．N.，Immunol．Today 12:220(1991))。ＴＮＦＲ−Ｉの 結晶構造は、システイン−リッチモチーフ（ＴＮＦＲドメイン）が、ジスルフィ ド結合のねじれラダーにより結合されている残基の３つの伸長した鎖からなって いることを示した(Banner，D．W．et al.，Cell 73:431(1993))。これらのレセ プターは、システイン残基の欠失、およびセリン、スレオニンおよびプロリンの 高い割合により特徴付けられ、Ｏ−結合した糖でグリコシル化されているらしい 、膜貫通ドメインに直接隣接するヒンジ−様領域を含む。これらの分子の細胞質 部分は、限定された配列相同性−異なる細胞性シグナルに対する根拠となるであ ろう知見を示す。現在までのところ、ヒト細胞から同定されているメンバーには 、ＣＤ４０(Stamenkovic，I．et al.，EMBO J．8:1403(1989))、４−１ＢＢ(Kwo n，B．S．and Weissman，S．M.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1963(1989)) 、ＯＸ−４０(Mallett，S．et al.，EMBO J．9:1063(1990))、ＴＮＦＲ−Ｉ(Loe tscher，H．et al.，Cell 61:351(1990);Schall，T．J．et al.，Cell 61:361(1 990))、ＴＮＦＲ−ＩＩ(Smith，C．A．etal.，Science 248:1019(1990))、ＣＤ ２７(Van Lier，R．A．et al.，J．Immunol．139:1589(1987))、Ｆａｓ(Itoh，N ．et al.，Cell 66:233(1991))、ＮＧＦＲ(Johnson，D．et al.，Cell 47:545(1 986))、ＣＤ３０(Durkop，H．et al.，Cell 68:421(1992))およびＬＴＢＲ(Bean s，M．et al.，Genomics 16:214(1993))が包含される。 ＳＦＶ−Ｔ２(Smith，C．A.，et al.，Science 248:1019(1990))、Ｖａ５３(How ard，S．T．et al.，Virology 180:633(1991))、Ｇ４ＲＧ(Hu，F.-Q．et al.，V irology 204:343(1994))およびｃｒｍＢ(Smith，G．L.，J．Gen．Viol．74:1725 (1993))などの可溶性ＴＮＦＲをコードするウイルス性オープンリーディングフ レームも また同定されている。 最近の集中的な研究により、これらの分子が細胞増殖(Banchereau，J．et al. ，Science 251:70(1991);Pollok，K．E．et al.，J．Immunol．150:771(1993);B aum，P．R．et al.，EMBO J．13:3992(1994))、細胞生存(Grass，H．-J．et al. ，Blood 83:2045(1994);Torcia，M．et al.，Cell 85:345-356(1996))および細 胞死(Tartaglia，L．A．et al.，Cell 74:845(1993);Gillette-Ferguson，I．an d Sidman，C．L.，Eur．J．Immunol．24:1181(1994);Krammer，P．H．et al.，C urr．Opin．Immunol．6:279(1994))を調節することにより、、免疫調節(Armitag e，R．J.，Curr．Opin．Immunol．6:407(1994);Smith，C．A．et al.，Cell 75: 959(1994))などの種々の生物学的活性に関与することが示されている。 それらの生物学的重要性およびこのスーパーファミリーの種々のメンバーのた め、本発明者等はスーパーファミリーのさらなるメンバーの存在を予想した。Ｅ ＳＴ−データベースを調べることにより、本発明者等はＴＮＦＲスーパーファミ リーの新たなメンバーを同定した。ここで、ＴＲ２と呼ぶ分子の初期解析につい て報告する。 材料および方法 ＴＮＦＲスーパーファミリーの新たなメンバーの同定およびクローニング ５００以上の異なるｃＤＮＡライブラリーから得られた発現配列タグ(ＥＳＴ) ｃＤＮＡデータベース(Adams，M．D．et al.，Science 252:1651(1991);Adams， M．D．et al.，Nature 355:632(1992))を、ｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｎ アルゴリズム(Altschul，S．F．et al.，J．Mol．Biol．215:403(1990))を用い て、ＴＮＦＲスーパーファミリのシステインーリッチモチーフとの配列類似性に ついてスクリーニングした。ヒトＴ細胞系ライブラリーにおいて、アミノ酸レベ ルでＴＮＦＲ−ＩＩに対して有意な同一性を示す、一つのＥＳＴ（ＨＴＩＳＢ５ ２−ＡＴＣＣ受託番号９７０５９）を同定した。この配列を用いて、ヒトリンパ 球の５’−ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ(Clontech，PT1155-1．Cat．#7301- 1)を用いて、ＲＡＣＥ(rapid amplification of cDNA ends)により、欠損 する５’末端をクローニングした。この配列は、４つのさらなるＥＳＴ（ＨＴＯ ＢＨ４２、ＨＴＯＡＵ６５、ＨＬＨＡ４９およびＨＴＸＢＳ４０）とマッチした 。これらのおよび他のｃＤＮＡの完全な配列決定により、これらがＴＮＦＲスー パーファミリーと相同的な同一のオープン・リーディング・フレームを含むこと が示され、これらをＴＲ２と名付けた。いくつかの他のＥＳＴおよびｃＤＮＡの 解析により、いくつかのｃＤＮＡは、上記で同定したオープン・リーディング・ フレーム中に挿入されたさらなる配列を有し、様々な部分的にスプライスされた ｍＲＮＡを表すことが示された。 細胞 研究した骨髄およびＢ−細胞系は、分化経路の異なる段階で細胞タイプを示す 。ＫＧ１ａおよびＰＬＢ９８５(Koeffler，H．et al.，Blood 56:265(1980);Tuc ker，K．et al.，Blood 70:372(1987))は、Phillip Koeffler(UCLA School of M edicine)から、ＢＪＡ−Ｂは、Z．Jonak(SmithKline Beecham)から入手し、およ び骨芽細胞の特徴を示すストロマ細胞系のＴＦ２７４は、健康な男性のドナーの 骨髄から作成された(Tan&Jonak、発行されていない）。他のすべての細胞系は、 AmericanType Culture Collection(Rockville，MD)から入手した。単球は、末梢 血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる遠心分離および組織培養皿への付着により調製 した。ＣＤ１９+、ＣＤ４+およびＣＤ８+を、免疫磁気ビーズ（Dynal，Lake Suc cess，NY）によりＰＢＭＣから単離した。ヒト冠動脈からの内皮細胞をclonetic s(Clonetics，CA)から購入した。 ＲＮＡおよびＤＮＡブロットハイブリダイゼーション 成人組織の全ＲＮＡをClontech(Palo Alto，CA)から購入するか、TriReagent( Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)で一次細胞および細胞系か ら抽出した。５〜７．５μｇの全ＲＮＡを記載されるように(Sambrook et al.， Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))、ホルムアミドを含む１％アガ ロースゲル中で分画し、Ｚｅｔａ−プローブナイロン膜(Biorad，Hercules，CA) に真空−ブロッティングにより、定量的に移した。ブロットを、32Ｐ−標識した ＴＲ２のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントまたはＯＸ−４０プローブでプレハ イブリダイズ、ハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下で洗浄し、Ｘ−線 フィルムに暴露した。 高分子量ヒトＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲル中で 分画した。ＤＮＡを変性し、中和し、ナイロン膜に移し、32Ｐ−標識したＴＲ− ２またはその変異体ｃＤＮＡにハイブリダイズした。 インサイチューハイブリダイゼーションおよびＦＩＳＨ検出 インサイチューハイブリダイゼーションおよびヒト染色体中のＴＲ２位置のＦ ＩＳＨ検出をすでに記載されているように(Heng，H．H．Q．et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 89:9509(1992);Heng，H．H．Q．et al.，Human Molecular Ge netics 3:61(1994))行った。ＦＩＳＨシグナルおよびＤＡＰＩバンディングパタ ーンを、写真を撮ることにより別々に記録し、染色体バンドとＦＩＳＨマッピン グデータとの割り当てを、ＤＡＰＩバンドされた染色体でＦＩＳＨシグナルを重 ね合わせることにより行った(Heng，H．H．Q．and Tsui，L．-C.，Chromosama， 102:325(1993))。 組換えＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の製造 細胞外ドメインの全体の推定オープン・リーディング・フレームを含むＴＲ２ の５'部分を、ポリメラーゼ鎖反応(Saiki，R．K．et al.，Science 239:487(198 8))により増幅した。正確な方向にクローニングするために、フォワードプライ マーの５’末端上にＨｉｎｄＩＩＩ部位、およびリバースプライマーの５’末端 上にＢｇｌＩＩ部位を作成した。ヒトＩｇＧ1のＦｃ部分をＡＲＨ−７７（ＡＴ ＣＣ）細胞ＲＮＡからＰＣＲ−増幅し、ｐＧｅｍ７ベクター(Promega)のＳｍａ Ｉ部位中にクローニングした。ヒンジ、ＣＨ2およびＣＨ3ドメイン配列を含むＦ ｃフラグメントは、その５’末端にＢｇｌＩＩ部位および３’末端にＸｈｏＩ部 位を有する。ＴＲ２ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ヒ トＩｇ Ｇ1Ｆｃの上流に挿入し、フレーム内の融合を配列決定により確認した。ＴＲ２ −ＦｃフラグメントをプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩで消化することに より放出させ、ｐｃＤＮＡ３発現プラスミド中にクローニングした。 ＰｖｕＩで線状化したＴＲ２−Ｆｃプラスミドをリン酸カルシウム共沈法によ り、ＮＩＨ３Ｔ３中に移した。４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中での選択後、ネオ マイシン−耐性コロニーを取り上げ、広げた。抗−ヒトＩｇＧ1を用いるＥＬＩ ＳＡおよび32Ｐ−標識したＴＲ２プローブを用いるノザン解析を、上澄において 高いレベルのＴＲ２−Ｆｃを産生するクローンを選択するのに用いた。いくつか の実験において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に産生されるわ ずかに異なって操作されたＴＲ２−Ｆｃを用いた。ＴＲ２−ＦｃをプロテインＧ クロマトグラフィーにより精製し、ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質のＮ−末端のア ミノ酸配列を、自動ペプチド配列決定機（ＡＢＩ）により決定した。ＴＲ２−Ｆ ｃを用い、ポリクローナルウサギ抗−ＴＲ２抗体を産生した。 ＭＬＡ−媒介ＰＢＭＣ増殖の遮断 ＰＢＭＣを、３人の健康な成人ボランティアから、４００×ｇ、３０分間のＦ ｉｃｏｌｌ勾配遠心により単離した。ＰＢＭＣを回収し、１０％ＦＢＳ、３００ μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌゲネトマイシンを含むＲＰＭ １１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中で洗浄し、２つのドナーについては、１× １０6細胞／ｍｌに、３番目のドナーについては２×１０5細胞／ｍｌに調整した 。 ５０μｌの各細胞懸濁液を、５０μｌのＴＲ２−Ｆｃ、ＩＬ−５Ｒ−Ｆｃ、抗 −ＣＤ４ｍＡｂまたは対照ｍＡｂとともに、９６ウェル(丸底)プレート(Falcon ，Franklin Lakes，NS)に加えた。プレートを３７℃にて５％ＣＯ2中、９６時間 インキュベートした。ついで、１μＣｉの[3Ｈ]−メチルチミジン(ICN Biomedic als，Costa Mesa，CA)をさらに１６時間添加した。細胞を回収し、放射活性を計 測した。 結果および考察 ＴＲ２はＴＮＦＲスーパーファミリーの新たなメンバーである。 図１Ａ−１Ｂ（配列番号２）は、単離されたｃＤＮＡの１つ（ＨＬＨＡＢ４９ ）のもっとも長いオープン・リーディング・フレームから推定されたＴＲ２のア ミノ酸配列を示す。データベースにおける他の配列決定されたｃＤＮＡおよびＥ ＳＴとの比較は、図１Ａ−１Ｂに示すタンパク質配列の位置１７（Ａｒｇまたは Ｌｙｓのいずれか）および４１（ＳｅｒまたはＰｈｅのいずれか）(配列番号２ におけるアミノ酸残基−２０および５)にてアミノ酸変化を起こす、潜在的な対 立遺伝子変異体を示した。 オープン・リーディング・フレームは、分子量が３０，４１７と計算される、 ２８３アミノ酸をコードする。ＴＲ２タンパク質は、レセプターであると予想さ れた。それゆえ、潜在的なシグナル配列および膜貫通ドメインを調べた。Ｃ末端 側への２３アミノ酸の疎水性伸長（アミノ酸２０１〜２２５）(図１Ａ−１Ｂ)は 、これが潜在的に単一のヘリカルスパンを作成するため、膜貫通ドメインである とされたが、しかし、シグナル配列は明確ではなかった。潜在的な外のドメイン ＴＲ２をＦｃ−融合タンパク質としてＮＩＨ３Ｔ３およびＣＨＯ細胞中に発現さ せ、組換えＴＲ２−Ｆｃタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を、両方の場合で決 定した。プロセスされた成熟ＴＲ２のＮ−末端配列は、アミノ酸３７で開始し、 これは、はじめの３６アミノ酸がシグナル配列を形成することを示す(図１Ａ− １Ｂ)。 ＴＲ２に対して作成されたポリクローナルウサギ抗体を用いて、天然のＴＲ２ の分子サイズを、ウェスタン解析により３８ｋＤであると決定した。プロセスさ れたＴＲ２のタンパク質骨格は分子量２６，０００の２４７アミノ酸から構成さ れるので、このタンパク質は翻訳後修飾されなければならない。２つの潜在的な アスパラギン−結合グリコシル化部位が、アミノ酸位置１１０および１７３（図 １Ａ−１Ｂ）に位置する。ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーと同様に、ＴＲ２ は、Ｘ−線結晶学(Banner，et al.，Cell 73:431(1993))により示される特徴的 なシステイン−リッチモチーフを含み、繰り返し構造単位を示す(Banner，D．W ．et al.，Cell 73:431(1993))。図１６は、ＴＲ２(配列番号２)、ＴＮＦＲ−Ｉ (配列番号１０)、ＴＮＦＲ−ＩＩ(配列番号１１)、ＣＤ４０（配列番号１２）お よび４−１ＢＢ（配列番号１３）と整列した潜在的なＴＮＦＲドメインを示す。 ＴＲ２は、２つの完全なＴＮＦＲドメインおよび２つの不完全なものを含んだ。 ＴＲ２細胞質テイル（ＴＲ２ｃｙ）は、ＣＤ４０ｃｙおよび４−１Ｂｂｃｙの ものとより密接に関連しているようであり、ＦａｓおよびＴＮＦＲ−Ｉ細胞内ド メインに見られる細胞死誘導領域を含まない。相同性は、中程度であるが、ＴＲ ２のＴｈｒ266は、４−1ＢＢのＴｈｒ233およびＣＤ４０のＴｈｒ254と整列する 。このことは、Inuiら（Inui，S et al.，Eur．J．Immunol．20:1747(1990)）が 、Ｔｈｒ254がＣＤ４０シグナルトランスダクションに必須であり、ＣＤ４０の ＴＨＲ254が変異すると、ＣＤ４０ｂｄはＣＤ４０ｃｙに結合しない(Hu，H．M． et al.，J．Biol．Chem．269:30069(1994))ことが見出されているため、重要で ある可能性がある。４−１ＢＢおよびＣＤ４０を介するシグナルは、それぞれＴ 細胞およびＢ細胞をともに刺激することが見出されている(Banchereau，J and R ousset，F.，Nature 353:678(1991);Hurtaldo，J．et al.，J．Immunol．155:33 60(1995))。 表２ 組織および細胞におけるＴＲ２およびＯＸ４０の遺伝子発現 ＴＲ２ ＲＮＡ発現 ヒト組織ＲＮＡブロットを用いて、ＴＲ２ ＲＮＡ発現の組織分布を調べた。 ＴＲ２ ＲＮＡを、いくつかの組織で検出し、肺、脾臓および胸腺では比較的高 いレベル（表２）であったが、脳、肝臓または骨格筋ではこの方法では検出され なかった(表２)。ＴＲ−２はまた、単球、ＣＤ１９+Ｂ細胞、および休止または ＰＭＡ＋ＰＨＡ−処理ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞においても発現された。これ は、骨髄および内皮細胞においては弱く発現されるのみであったが(表２および ３)、発現は、造血細胞系ＫＧ１ａ（表２）においても観察された。比較のため 、他のＴＮＦＦスーパーファミリーのメンバーであるＯＸ−４０の組織分布を調 べた(表２)。ＴＲ２とは異なり、ＯＸ−４０は、試験したいずれの組織において も検出されず、活性化されたＴ−細胞およびＫＧ１ａにおいてのみ検出された。 ＴＦ２７４(骨髄ストロマ)、ＭＧ６３およびＴＥ８５(骨肉腫)、ＲＬ９５−２( 子宮内膜肉腫)、ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ(胸癌細胞)、ＢＥ、ＨＴ２９(結腸 癌細胞)、ＨＴＢ−１１およびＩＭＲ−３２（神経芽腫）を含め、いくつかの細 胞系ではＴＲ２発現が見られなかったが、ＴＲ２は、横紋筋肉腫ＨＴＢ−８２に おいて見られた(データは示さない)。 いくつかの細胞系を、誘導性ＴＲ２発現について調べた。骨髄単球系統に属す るＨＬ６０、Ｕ９３７およびＴＨＰ１はすべて、異なる薬剤ＰＭＡまたはＤＭＳ Ｏに応答してＴＲ２発現を増加した。これらの薬剤に応答した発現の増加は、Ｋ Ｇ１ａおよびＪｕｒｋａｔ細胞において観察された。対照的に、ＰＭＡは、ＭＧ ６３においてＴＲ２発現を誘発しなかったが、予期せぬことに、ＴＮＦ−αは誘 発した。 ほとんどすべての場合において、優勢なｍＲＮＡは約１．７ｋｂの大きさであ るが、いくつかのより大きな分子量種がいくつかの組織中で検出できた。配列決 定された多くのｃＤＮＡおよびＥＳＴは部分的なスプライシングを示唆するコー ディング領域中の挿入を含むが、ウェスタンブロットでは１つの大きなタンパク 質のみが検出され、このことは、これらが異なるタンパク質をコードする場合、 我々が調べた細胞中にはこれらが明らかでないことを示唆した。より大きな分子 量のｍＲＮＡが多いことは、ＴＲ２がｍＲＮＡ変異のレベルで部分的に調節され ている可能性を示唆する。 表３ 種々の組織および細胞種におけるＴＲ ２ＲＮＡの相対数（ＲＡ）１Ｐ３６．２−Ｐ３６．３のＴＲ２マップ ＦＩＳＨマッピング方法を適用して、ＴＲ２遺伝子を特定のヒト染色体領域に 局在させた。染色体１のショートアームへのハイブリダイゼーションシグナルの 整列が、ＤＡＰＩバンディングの助けにより得られた。全部で１０のメタティッ クな形状(metatic figure)を写真に撮り、これは、ＴＲ２遺伝子が、染色体１の ｐ３６．２〜ｐ３６．３の領域上に位置することを示した。ＴＲ２位置は、ＣＤ ３０(Smith，C．A．et al.，Cell 73:1349-1360(1993)、４−１ＢＢ(Kwon，B．S ．et al.，J．Immunol．152:2256-2262(1994);Goodwin，R．G．et al.，Eur． J．Immunol．23:2631-2641(1993))、ＯＸ−４０(Birkeland，M．L．et al.，Eur ．J．Immunol．25:926-930(1995))、およびＴＮＦＲ−ＩＩ(Baker，E．et al.， Cytogenet．& Cell Genet．57:117-118(1991))と極めて近接しており、局在化遺 伝子複製を通して発達したことが示唆される。興味深いことに、アポトーシスを 刺激するＦａｓおよびＴＮＦＲ−１と対照的に、これらのすべてのレセプターは 、同種のリガンド結合に応答してＴ細胞において刺激性の表現型を有している。 このため、ＴＲ２がリンパ球刺激に関与するかどうかを調べることとした。 ＴＲ２−Ｆｃは、ＰＢＭＣのＭＬＲ−媒介増殖と調和する。 リンパ球増殖におけるそのリガンドとの細胞表面ＴＲ２の可能な関与を調べる ために、同種のＭＬＲ増殖性応答を調べた。ＴＲ２−Ｆｃを培養物に添加すると 、最大応答の有意な減少が観察された(ｐ＜０．０５)。１００μｇ／ｍｌでのＴ Ｒ２−Ｆｃの添加は、増殖を５３％まで阻害した。対照のＩＬ−５Ｒ−Ｆｃでは 、有意な増殖の阻害は観察されなかった。驚くべきことに、高濃度（１０〜１０ ０μｇ／ｍｌ）のＩＬ−５Ｒ−Ｆｃは増殖を増強することが示された。アッセイ した抗−ＣＤ４ｍＡｂは、ＭＬＲ−媒介増殖を同時に６０％まで阻害したが、対 照の抗−ＩＬ−５ｍＡｂは、増殖を阻害しなかった。ＭＬＲ増殖応答の主な成分 はＴ−細胞依存性であることは周知である；それゆえ、ＴＲ２のそのリガンドと の相互作用の阻害は、至適Ｔリンパ球活性化および増殖を妨げることは明らかで ある。１〜１００μｇ／ｍｌの濃度でのＴＲ２−ＦｃによるＭＬＲ増殖の阻害は 、ＣＤ４０−Ｆｃなどの他のＴＮＦＲ−Ｆｃスーパーファミリーメンバーで見ら れる生物学的作用に比べて優れている(発行されていない結果、Jeremy Harrop) 。 それゆえ、本発明者等は、Ｔ細胞刺激において直接役割を担うか、または、Ｔ Ｒ２を含んでもよい、１またはそれ以上のレセプターを介してＴ細胞増殖を刺激 できるリガンドに結合する、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのさらなるメ ンバーを同定した。ＴＲ２に対する直接の役割は、ＣＤ４０および４−１ＢＢと の細胞質ドメインの類似性と一致する。本発明者等は現在、その役割を明らかに するために、ＴＲ２が結合するこのリガンドの同定を試みている。 本発明がこれまでの記載および実施例において特に記載したものと別の方法で 実行できることは明らかであろう。 本発明の多くの修飾および変形は、上記の技術に基づいて可能であり、それゆ え、添付する請求の範囲の範囲内である。 本明細書で引用した、すべての刊行物（特許、特許出願、ジャーナル記事、実 験室マニュアル、本、または他の文書を含む）は、出典明示により本明細書に含 める。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                   Human tumor necrosis factor receptor-like 2 Field of the invention   The present invention relates to a novel member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family. Related. More specifically, a mouse with considerable homology to murine CD40 TNF-receptor-related proteins (herein the TR of FIGS. 1A-1B) 2 (meaning 2 receptors) is provided. TR Two different TR2 splice variants, designated 2-SV1 and TR2-SV2 Variants are also provided. Suitable for human type 2 TNF receptor (TNF-RII) Homosexual TR2 polypeptides are also provided. In addition, vectors, host cells And recombinant methods for producing them. The present invention also provides TR2 Both inhibition and enhancement of the activity of receptor polypeptides and TR2 receptors The present invention relates to a diagnostic method for detecting a target gene expression. Related fields   Human tumor necrosis factor α (TNF-α) and β (TNF-β or lymphotoxy) Are interferons, interleukins, generally called cytokines Related to a broad class of polypeptide mediators, including growth factors (Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625-65) 5 (1985)).   Tumor necrosis factor (TNF-α and TNF-β) originally had its anti-tumor activity. However, it has now been discovered as a result of Recognized as a pleiotropic cytokine that plays an important role in ing. To date, TNF-α, TNF-β (Lymphotoxin-α), LNF T-β, TRAIL and Fas receptor, CD30, CD27, CD40 TNF-related ligands for OX40 and 4-1BB receptors The cytokine family is known. These proteins contain conserved C-terminal End sequence and variable except for TNF-β, often used as a membrane anchor It has a sex N-terminal sequence. Both TNF-α and TNF-β are TNF receptors When bound to a protein, it functions as a homotrimer.   TNF refers to monocytes, fibroblasts, T-cells, natural killer (NK) cells. It is produced by many cell types, mainly activated macrophages. TNF -Α indicates rapid necrosis of tumors, immune promotion, autoimmune disease, graft rejection, anti-c During the production of ills response, septic shock, cerebral malaria, cytotoxicity, chemotherapy Adverse effects of ionizing radiation produced, such as denaturation of enzymes, lipid peroxidation and D Protection against NA damage and the like (Nata et al., J. Immunol. 136 (7): 2483 (1987)), increased Has been reported to play a role in growth regulation, vascular endothelial and metabolic effects . TNF-α also stimulates endothelial cells, causing PAI-1, IL-1, GM-CSF And secrete various factors including IL-6 to promote cell proliferation. In addition, T NF-α is available in various cells such as E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1. Upregulate cell adhesion molecules. TNF-α and Fas ligand It has also been shown to induce programmed cell death.   TNF-β induces antiviral status and tumor necrosis, activates polymorphonuclear leukocytes Induction of class I major histocompatibility complex antigens on endothelial cells; It has many activities, including induction of deposition molecules and growth hormone stimulation (Ruddle, N.an d Homer, R., Prog. Allergy 40: 162-182 (1988)).   TNF-α and TNF-β are both involved in growth regulation and some of the differentiation Interacts with hematopoietic cells in stages and inhibits the growth of various types of precursor cells, Induces proliferation of metastatic bone marrow mononuclear cells. Porter, A., Tibtech 9: 158-162 (1991).   Recent studies using “knockout” mice have shown that TNF-β production was deficient. Mice show abnormal development of peripheral lymphoid organs and morphological changes in spleen structure (Aggarwal et al., Eur Cytokine Netw, 7 (2): 93-124 (1996) )). For lymphoid organs, popliteal, inguinal, para-aortic, mesenteric, axillary And cerebral lymph nodes did not develop in TNF-β − / − mice. in addition , T Peripheral blood from NF-β − / − mice contains leukocyte cytoplasm as compared to normal mice. The vesicles had decreased by 3 times. However, peripheral blood from TNF-β − / − mice Contained 4 times more B cells than their normal controls. Furthermore, TNF-β Has been shown to induce the proliferation of EBV-infected B cells, in contrast to TNF-α I have. These results indicate that TNF-β is involved in lymphocyte development .   First in eliciting various cellular responses mediated by TNF-α or -β The steps are their binding to specific cell surfaces or soluble receptors. About 5 Two distinctions, 5-KDa (TNF-RI) and 75-KDa (TNF-RII) TNF receptors have been identified (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989)), human and mouse CDs corresponding to both receptor types. NA has been isolated and analyzed (Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990)). Both TNF-R is a cell surface receptor containing extracellular, transmembrane and intracellular regions Share the typical structure.   These molecules are not only cell-bound forms, but also truncated cells of the complete receptor. Extracellular domain (Nophar et al., EMBO Journal, 9 (10): 3269-76 (1990)), and Soluble form consisting of an intact receptor otherwise lacking the transmembrane domain It also exists in a state. The extracellular domains of TNF-RI and TNF-RII are 28 % Repeats with 4% identity and significant sequence homology between subunits Cysteine-rich motifs. Cell type and pair The majority of the tissues appear to express both TNF receptors and both receptors Putter is active in signal transduction, however, Different cellular responses can be mediated. Furthermore, TNF-RII is PCT WO94 As shown in WO 09/09137, TNF exclusively inhibits human T-cell proliferation. Was shown to mediate.   TNF-RI dependent responses include C-FOS, IL-6 and manganese super Oxidum dismutase mRNA accumulation, prostaglandin E2 synthesis, IL-2 Receptor and MHC class I and II cell surface antigen expression, growth inhibition, And cytotoxicity. TNF-R1 is also phospholipase ATwo, PROTE Inkinase C, phosphatidylcholine-specific phospholipase C and sphere Stimulates second messenger systems such as Ngomyelinase (Pfefferk et al., Cell, 73: 457-467 (1993)).   Some interferons and other drugs modulate TNF receptor expression. It is shown to be knotting. For example, retinoic acid is present in some cell types. Induces TNF receptor production in other cells, but reduces production in other cells. It is shown to regulate. In addition, TNF-α is Have been shown to act on the localization of the receptor for the protein. TNF-α is TNF -Induces internalization of RI and secretion of TNF-RII (Aggar wal et al., supra). Therefore, both TNF-R production and Localization is regulated by various agents.   The yeast two-hybrid system and both co-precipitation and purification Used to identify ligands that bind to the TNF-R type (Aggarwa l et al., supra and Vandenabele et al., Trends in Cell Biol., 5: 392-399. (1995)). Interacts with the cytoplasmic domain of murine TNF-R Several proteins have been identified. Two of these proteins are It appears to be related to the baculovirus inhibitor of potosis, which Suggests a direct role for TNF-R in regulating programmed cell death.                                Summary of the Invention   The present invention relates to FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) and FIGS. The amino acid sequence shown in 7A-7B (SEQ ID NO: 8), or the ATCC accession number Bacteria as 97059, 97058 and 97057 (February 13, 1995) With the cDNA clone encoding the TR2 receptor deposited in the host TR2 receptor and splice thereof having an encoded amino acid sequence Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the variant. Book The invention also relates to a recombinant vector comprising the isolated nucleic acid molecule of the invention, A host cell containing the vector, and a method of making the vector and the host cell; And for producing TR2 polypeptides or peptides by recombinant techniques. Regarding how to use them.   The present invention further provides an antigen encoded by a polynucleotide described herein. An isolated TR2 polypeptide having a amino acid sequence is provided.   The invention also provides for enhancing or inhibiting the cellular response elicited by the TR2 receptor. CLAIMS 1. A screening method for identifying compounds having the ability to harm, comprising: Contacting cells expressing the 2 receptor with a candidate compound and assaying the cellular response Compare the standard cellular response to the cellular response, where the standard contacts the candidate compound Performed in the absence; this results in an increased cellular response over the standard when the compound Cell response, indicating that the compound is Provide a way to indicate that you are a nyst.   In another embodiment, a candidate for binding a cell ligand to the TR2 receptor Agonists and antagonists, including investigating the effects of the compounds All screening assays are provided. In particular, the method comprises a TR2 receptor. Contacting the receptor with the ligand peptide and the candidate compound, and binding to the TR2 receptor. To determine whether gand binding is increased or decreased by the presence of a candidate compound including.   The present invention further relates to the consequences of abnormal cell growth due to changes in TR2 receptor expression. Provided are diagnostic methods useful for diagnosing or predicting consequent medical conditions.   A further aspect of the present invention provides for increased levels of TR2 receptor activity in the body. A method of treating an individual in need thereof, comprising administering to said individual a therapeutically effective amount of a subject of the invention. Administering a composition comprising the isolated TR2 polypeptide or an agonist thereof. And a method comprising:   Yet another aspect of the invention relates to reduced levels of TR2 receptor activity in the body. A method of treating an individual in need thereof, comprising administering to said individual a therapeutically effective amount of the present invention. Comprising administering a composition comprising a TR2 receptor antagonist of the invention. I do.   The present invention further provides soluble forms of the polypeptides of the present invention. Soluble pep Tides are defined by amino acid sequence, including polypeptide sequences lacking the transmembrane domain. Is defined. Such a soluble form of the TR2 receptor comprises a membrane-bound form of the receptor. Useful as antagonists.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1A-FIG. 1B show the nucleotides (SEQ ID NO: 1) of the TR2 receptor and deductions Shows the constant amino acid (SEQ ID NO: 2) sequence. The protein has about 36 amino acid residues (below Line) (having the predicted leader sequence of (amino acid residues -36 to -1 of SEQ ID NO: 2) , Estimated molecular weight is about 30,417 kDa. In addition, about 37 to about 200 Noic acid residues (amino acid residues 1-164 of SEQ ID NO: 2) constitute the extracellular domain; About 201 to about 225 (amino acid residues 165 to 189 of SEQ ID NO: 2) Main (underlined); about 226 to about 283 (amino acid residues 190 to 247 of SEQ ID NO: 2) ) Is presumed to constitute the intracellular domain. Two potential asparagine- The binding glycosylation sites are located at amino acids 110 and 173 (sequence No. 2 amino acid residues 74-137).   FIG. 2 shows the TR2 receptor protein and murine CD4 of FIGS. 1A-1B. 0 shows the region of similarity between the amino acid sequences of protein 0 (SEQ ID NO: 3).   FIG. 3 shows an analysis of the amino acid sequence of the TR2 receptor of FIGS. 1A-1B. Al Fa, beta, turn and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; Variable region; shows antigen index and surface probability. "Antigenic Index-Jameso In the “n-Wolf” graph, amino acid residues 39 to 70, 10 in FIGS. 6 to 120, 142 to 189 and 276 to 283 (amino acid residues of SEQ ID NO: 2) 3-34, 70-84, 106-153 and 240-247) are TR2 It corresponds to the indicated highly antigenic region of the puter protein.   4A-4B show the nucleotides (SEQ ID NO: 4) and TR2-SV1 receptor. And the deduced amino acid (SEQ ID NO: 5) sequence. Protein has about 36 amino acids remaining Predicted leader sequence of group (underlined) (amino acid residues -36 to -1 of SEQ ID NO: 5) And the estimated molecular weight is about 19.5 kDa.   FIG. 5 shows the full length TR2-SV1 receptor protein and human type 2TNF. The region of similarity between the amino acid sequences of the receptor (SEQ ID NO: 6) is shown.   FIG. 6 shows analysis of the amino acid sequence of the TR2-SV1 receptor. Alpha, Ba Data, turn and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; variable regions; Shows antigen index and surface probability. `` Antigenic Index-Jameson-Wolf '' group Roughly, amino acid residues 39-70, 99-136 and FIG. And 171-185 (amino acid residues 3-34, 63-100 and SEQ ID NO: 5) 135-149) are indicated high antigens of the TR2-SV1 receptor protein. Corresponding to the sexual region.   Figures 7A-7B show the nucleotides (SEQ ID NO: 7) and the TR2-SV2 receptor. And the deduced amino acid (SEQ ID NO: 8) sequence. This protein is a putative leader Lacking the sequence, the estimated molecular weight is about 14 kDa.   FIG. 8 shows TR2-SV2 receptor protein and human type 2 TNF receptor. The region of similarity between the amino acid sequences of Puter (SEQ ID NO: 9) is shown.   FIG. 9 shows analysis of TR2-SV2 receptor amino acid sequence. Alpha, Ba Data, turn and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; variable regions; Shows antigen index and surface probability. `` Antigenic Index-Jameson-Wolf '' group Roughly, amino acid residues 56-68 and 93-13 in FIGS. 7A-7B. No. 6 (SEQ ID NO: 8) is the indicated high antigen of the TR2-SV2 receptor protein Corresponding to the sexual region.   FIG. 10 shows the TR2 receptor protein of FIGS. 1A-1B and FIGS. 4A-4B. The region of similarity between the amino acid sequences of the TR2-SV1 receptor protein is shown.   FIG. 11 shows the TR2 receptor protein of FIGS. 1A-1B and FIGS. 7A-7B. The region of similarity between the amino acid sequences of the TR2-SV2 receptor protein is shown.   FIG. 12 shows the TR2-SV1 and TR2-SV2 receptor protein amino acids. The region of similarity between the noic acid sequences is shown.   13A-13C show the TR2 receptor protein of FIGS. 1A-1B and FIG. Nucleotide sequence encoding TR2-SV1 receptor protein of A-4B The area of similarity between   14A-14C show the TR2 receptor protein of FIGS. 1A-1B and FIG. Nucleotide sequence encoding the TR2-SV2 receptor protein of A-7B The area of similarity between   FIGS. 15A-15E show TR2-SV1 and TR2-SV2 receptor proteins. The region of similarity between the nucleotide sequences encoding quality is indicated.   FIG. 16 shows the TR2 receptor of FIG. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) and other TNFR receptors. 1 shows the amino acid sequence alignment of family members. The amino acid sequence of TR2 is changed to TN FR-1 (SEQ ID NO: 10), TNFR-II (SEQ ID NO: 11), CD40 (SEQ ID NO: 12) and those of 4-IBB (SEQ ID NO: 13) with sequence homology and conserved cis Alignment based on tein residues.                        Detailed description of the preferred embodiment   The present invention relates to TR2 polypeptides (FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2)) and spurs thereof. Rice mutant, amino acid sequence determined by sequencing cloned cDNA TR2-SV1 (FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5)) and TR2-SV2 (FIG. An isolated nucleic acid comprising a polynucleotide encoding 7A-7B (SEQ ID NO: 8) Provide molecules. The TR2 protein shown in FIGS. 1A-1B is a murine CD4 0 receptor (FIG. 2 (SEQ ID NO: 3)). February 13, 1995 On the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville , Maryland 20852, accession number 97059. 1A-1B (array The nucleotide sequence shown in No. 1) corresponds to the nucleotide sequence in ATCC Accession No. 97059. CDNA clone containing a sequence encoding the same amino acid slightly different from the Region ID HLHAB49). 1A-1B ( The cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 1) has 5 'and 3' non-coding nucleotides. The otide sequence and three nucleotides differ from those of the ATCC depository.   The clone deposited under ATCC Accession No. 97059 has a TR2 start codon of 5 ’ 8 nucleotides and 21 nucleotides 3 'to the TR2 stop codon Including In contrast, the HLHAB49 shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) The TR2 cDNA sequence is located at both the 5 'and 3' ends of the TR2 coding sequence. , Including non-coding nucleotide sequences that are quite long. Further, FIGS. 1A-1B ( The TR2 receptor nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) has nucleotide 3 Adenine at 14; cytosine at nucleotide 386; cytosine at nucleotide 627. Including In contrast, the clone with ATCC accession number 97059 has the nucleotide sequence Guanine at 314, thymine at nucleotide 386, thymine at nucleotide 627 including.   The TR2 receptor of the present invention comprises at least these three nucleotides and Includes several allelic variants, including changes in two amino acids. Identified nucleotide sequence variants are shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1). Guanine or adenine at nucleotide 314 and thymine at nucleotide 386 Or cytosine, containing either thymine or cytosine at nucleotide 627 . The change identified at nucleotide 627 is silent, but not at nucleotide 627. The change at 386 changes the codon at nucleotides 385-387 to serine or Encodes for any of the phenylalanines and has a change at nucleotide 314 Thus, the codons at nucleotides 313 to 315 encode lysine or arginine Will do.   The nucleotide sequence shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) and FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7) The otide sequence was also added to the American Type Culture Collecti on February 13, 1995. on, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, respectively Deposited as 97058 (TR2-SV1) and 97057 (TR2-SV2) The obtained cDNA clone was obtained by sequencing. The deposited clone was pBl UsuscriptSK (-) contained in plasmid (Stratagene, LaJolla, CA) It is.   As used herein, the term "splice variant" refers to the same RNA molecules transcribed from DNA sequences and undergo different RNA splicing? Means a cDNA molecule produced therefrom. Different RNA splicing is the primary R NA transcripts are generally spliced to remove introns and If more than one mRNA, each encoding a different amino acid sequence, is produced It happens when. The term “splice variant” is also described by the cDNA molecule described above. Means the protein to be loaded.   As used herein, "TR2 protein", "TR2 receptor", "TR2 “Receptor protein” and “TR2 polypeptide” have amino acid sequence identity 1A-1B (SEQ ID NO: 2), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) or The receptor activity corresponding to the protein shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) Of different splicing of genomic DNA sequences encoding proteins having Means all proteins. TR2 protein shown in FIGS. 1A-1B 4A-4B and the TR2-SV1 protein shown in FIGS. 7A-7B. The TR2-SV2 protein is an example of such a receptor protein. Nucleic acid molecule   Unless otherwise specified, any DNA determined herein by sequencing a DNA molecule is used. All nucleotide sequences were obtained using an automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Id.). nc. Using the DNA molecule determined herein. All amino acid sequences of the encoded polypeptide are to be determined as described above Predicted by translation of some DNA sequences. Therefore, this automated approach Determined herein, as known in the art for the DNA sequence to be determined. Any nucleotide sequence made may contain some errors. Decided by automation The nucleotide sequence defined is the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule. Typically at least about 90% identical to the row, more typically at least about 95% ~ At least about 99.9% identical. The actual sequence can be translated into manuals known in the art. More accurate determinations can be made by other approaches, including DNA sequencing. The As also known in the art, in a nucleotide sequence determined relative to the actual sequence A single insertion or deletion of Occurs and the expected amino acid encoded by the determined nucleotide sequence acid The sequence is, in terms of such insertions or deletions, actually Will be completely different from the amino acid sequence encoded by   1A-1B, 4A-4B or 7A-7B. Using the information provided herein, cD using mRNA as starting material Standard cloning and screening, such as those used for NA cloning Using the Leaning Method to Obtain a Nucleic Acid Molecule of the Invention Encoding a TR2 Polypeptide be able to. As an example of the present invention, the nucleus described in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) The acid molecule is found in a cDNA library from activated human T-lymphocytes. Was done. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) and FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7) The resulting nucleic acid molecules are derived from human fetal heart and human stimulated monocytes, respectively. Found in the DNA library.   As described in Example 6, TR2 mRNA includes lung, spleen and thymus Is detected in many tissues and is expressed everywhere in human cells It seems. TR2 RNA also contains B lymphocytes (CD19+), CD4+(TH1You And TH2Clone) and CD8+Both T lymphocytes, monocytes and endothelial cells Was found to be expressed.   As also shown in Example 6, production of TR2 mRNA is associated with TNFα. It was more inducible in MG63 cells. In addition, TR2 mRNA accumulation HL60, U937 and THP1 cells when treated with PMA or DMSO Was observed. PMA and DMSO induce differentiation of these three cell types It is a known drug.   1A-1B (SEQ ID NO: 1) Determined nucleotide sequence of TR2 cDNA Has a predicted leader sequence of about 283 amino acid residues and about 36 amino acid residues. Having a predicted molecular weight of about 30,417 kDa Includes reading frame. Expected amino acid sequence of mature TR2 receptor The columns are from about amino acid residue 37 to about 283 of FIGS. 1A-1B (amino acid residue of SEQ ID NO: 2). Groups 1 to 247). As shown in Example 6, leader sequence cleavage The location of the cleavage site was confirmed for the TR2-Fc fusion protein and is shown in FIGS. Between amino acids 36 and 37 (amino acid residues -1 to 1 of SEQ ID NO: 2) Was found. TR2 protein shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) The protein is approximately 29% identical to the murine CD40 protein shown in SEQ ID NO: 3. About 47% similar (see FIG. 2).   Similarly, the determined cDNA nucleus of the TR2-SV1 splice variant of TR2 The reotide sequence (FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4)) contains about 185 amino acid residues, about 3 It has a predicted leader sequence of 6 amino acid residues and a predicted molecular weight of about 19. 5kD a) an open reading frame encoding a protein. Expected The amino acid sequence of the mature TR2-SV1 receptor shown in FIGS. 5) about 37 to about 185 (amino acid residues 1 to 149 of SEQ ID NO: 5) Is shown in TR2-SV1 protein shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) Has about 25% of the human type 2 TNF receptor protein shown in SEQ ID NO: 6. Identical and about 48% similar (see FIG. 5).   Determined cDNA nucleotides of TR2-SV2 splice variant of TR2 The sequence (FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7)) has a predicted sequence of about 136 amino acid residues. Encoding a protein having a predicted molecular weight of about 14 kDa without a leader sequence. Open reading frame. Putative TR2-SV2 receptor Has the amino acid residues of about 1 to about 136 of FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8). Is shown in TR2-SV2 protein shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) Has about 27% of the human type 2 TNF receptor protein shown in SEQ ID NO: 9. Identical and about 45% similar (see FIG. 8).   TR2, TR2- shown in FIGS. 1A-1B, 4A-4B and FIGS. 7A-7B. Nucleotides and amino acids of SV1 and TR2-SV2 receptor proteins Both comparisons of the acid sequence show some closely identical regions. 1A-1B (distribution The amino acid sequence of the TR2 receptor protein shown in FIG. 4B (SEQ ID NO: 5) and about 60 % Identical, about 73% similar, to the first about 100 amino acids of each sequence The two proteins differ at one position (FIG. 10).   Similarly, the amino acids of the TR2 receptor protein of FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) The acid sequence is the TR2-SV2 receptor type shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8). About 60% identical and about 71% similar to the amino acid sequence of the protein; Et al., Two proteins are 60 A in the central part of the TR2-SV2 protein. Almost identical over the length of the amino acid (FIG. 11).   In contrast, the TR2-SV1 and TR2-SV2 proteins are amino acids of each other. At the acid level, they are about 20% identical and only about 38% similar. 1A-1B Unlike the comparison between the TR2 protein shown in (SEQ ID NO: 2) and these proteins, These proteins have the entire 136 amino acid sequence of the TR2-SV2 protein. And its homology (Figure 12).   In its nucleotide sequence of the cDNA encoding the disclosed TR2 protein In comparison, comparison of these sequences indicates that TR2 cDNA has close identity at the nucleic acid level. 13A to 13C, 14A to 14C and FIG. 15A-15E). For example, the TR2 and TR2-SV1 proteins The cDNA sequence to be coded has a large region almost identical in its nucleotide sequence. This is due to the N-terminus of each protein and its 5 'and 3' non-coding. Coding both coding regions (FIGS. 13A-13C). Furthermore, TR2-SV The nucleotide sequences of cDNAs encoding 1 and TR2-SV2 proteins are Have considerable homology, but this identity is greater than the respective coding sequence. It is limited to the obtained 3 'region (FIGS. 15A to 15E).   Such a nearly identical region between two different cDNA sequences is an extended region of the sequence. When maintained on an enclosure, each molecule is originally from the same genomic DNA sequence. The transcript is indicated to those skilled in the art. Further, one skilled in the art will recognize that more than one codon is the same. Can encode amino acids, so the identity between two proteins at the amino acid level Indicates that the DNA sequence encoding the protein has similar regions of identity. Is not necessarily meant. The above data is based on the TR2 receiver of the present invention. Puters are transcribed from a single genomic DNA sequence and produce a single initial RNA transcript Are a plurality of splice variants.   Associations produced from alternatively spliced RNA, called splice variants Such proteins are known in the art. For example, the transcript of the src gene is Undergo different RNA splicing to produce cell type specific products. Almost Src protein consists of 533 amino acids, In the vesicle, an even shorter exon is contained in the mRNA, containing 539 amino acids. Protein. Alberts, B .; et al. , MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL (3r d Edition, Garland Publishing, Inc. , 1994), 455. Similarly, Different mRNA transcripts have been identified in Drosophila, in which case Due to different mRNA splicing, males can reach around 550 amino acids in length. In females, a protein called Dsx of about 430 amino acids in length is obtained. This These two splice variant proteins share a common core sequence of about 400 amino acids. Having. See id. 457.   In the present invention, the TR2 receptor shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) The protein is encoded by the RNA into which the TR2 receptor protein is translated. Is considered to be a full-length polypeptide. As shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) RNA encoding the TR2-SV1 splice variant is shown in FIGS. 1A-1B. 1 includes an insertion in the region encoding amino acid residue 102 of the amino acid sequence of FIG. A deletion in the region encoding amino acid residue 184 of the amino acid sequence shown in A-1B It is considered to include loss. TR2-SV2 splice shown in FIGS. 7A-7B The RNA encoding the mutant has the amino acid sequence of the amino acid sequence shown in FIGS. 1A-1B. Starting with the nucleotide sequence encoding residue 102, the DNA sequence shown in FIGS. Contains insertions in the region encoding amino acid residues 184 and 243 of the amino acid sequence It is considered something.   As shown, the invention also provides mature forms of the TR2 receptors of the invention. I do. According to the signal hypothesis, proteins secreted by mammalian Signal or leader sequence, which is the protein chain that grows once Begins to be pumped out of the rough endoplasmic reticulum and is cleaved from the mature protein. Hoton Every mammalian cell and even insect cells produce secreted proteins with the same specificity. Disconnect. However, in some cases, cleavage of the secreted protein may not be complete. Non-uniform, resulting in two or more mature types of protein . In addition, the cleavage specificity of the secreted protein depends on the primary structure of the complete protein. Is ultimately determined by the amino acid sequence of the polypeptide . Therefore, the present invention is compatible with ATCC Accession Nos. 97059 and 97058. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) and the cDNA clones shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5). Encoding a mature TR2 polypeptide having an amino acid sequence to be encoded Provide a code array. Identified as ATCC accession numbers 97059 and 97058 Has the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in the host The mature TR2 polypeptide is a clone contained in a vector in a deposited host. Of the complete open reading frame encoded by the human DNA sequence of Produced by expression in mammalian cells (eg, COS cells as shown below) Means the mature form of the TR2 receptor.   The present invention also provides a secretory leader sequence contained in ATCC Accession No. 97057. FIG. 7A, without the amino acid sequence encoded by the cDNA clone Nucleic acid encoding TR2-SV2 receptor protein of -7B (SEQ ID NO: 8) Provide an array.   Whether the protein has a secretory leader and a cleavage point for the leader sequence There is a method available to predict whether For example, McGeoch (Virus Res. 3: 271-286 (1985)) and von Heinje (Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)) Can be. Known mammalian secretory proteins of each of these methods The accuracy of the cut point prediction is in the range of 75-80%. von Heinje, supra . However, the two methods do not necessarily use the same cleavage point for a given protein. It does not always predict int.   In the case of the present invention, the intracellular position of a protein is predicted based on the amino acid sequence. Computer program ("PSORT") which is an excellent system for Naka i and M. According to Kanehisa, Genomics 14: 897-911 (1992)), FIG. No. 2), shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) and FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8). The predicted amino acid sequence of the completed TR2 polypeptide was analyzed. This station As part of the computer prediction of localization, McGeoch and von Heinje Insert. Analysis by the PSORT program showed that SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 The cleavage site between amino acids -1 and 1 was predicted. Then the complete amino acid sequence And apply a simple form of von Heine's (-1, -3) rule to Analyzed by speculation. von Heinje, supra. Thus, TR2 shown in SEQ ID NO: 2 The leader sequences of the protein and TR2-SV1 protein are SEQ ID NO: 2 and And SEQ ID NO: 5 are predicted to consist of both amino acid residues -36 to -1. The mature TR2 protein shown is the TR2 protein shown in SEQ ID NO: 2. The TR2-SV1 tag represented by SEQ ID NO: 5 The protein consists of residues 1-149.   As shown in Example 6, cleavage of the leader sequence of the TR2-Fc fusion protein The cleavage site was confirmed using amino acid analysis of the expressed fusion protein. This fusion The combined protein comprises the amino acids corresponding to amino acids 1 of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 37, which indicates that the cleavage site of the leader sequence is Between amino acids 36 and 37 (amino acid residues of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5) -1 to 1).   However, sequencing errors as well as different known protein leaders Due to the diversity of cleavage sites, those skilled in the art will recognize that the cDNA at ATCC accession no. The encoded TR2 receptor polypeptide contains about 283 amino acids May be anywhere from 250 to 316 amino acids; The leader sequence is about 36 amino acids, but ranges from about 30 to about 42 amino acids. It will be appreciated that any of the boxes may be used. Similarly, ATCC accession number 97 The TR2-SV1 receptor polypeptide encoded by the 058 cDNA is Containing about 185 amino acids, but within the range of 163-207 amino acids The leader sequence of this protein is about 36 amino acids, but It can be anywhere from 30 to about 42 amino acids. In addition, ATCC accession number issue TR2-SV2 receptor polypeptide encoded by 97057 cDNA Contains about 136 amino acids, but within the range of 120 to 152 amino acids. Either may be used.   As shown, the nucleic acid molecules of the invention are in the form of RNA, such as mRNA. For example, cDNA and genomic DNA produced by cloning or synthesis It may be in the form of DNA containing NA. DNA can be double-stranded or single-stranded Good. Single-stranded DNA or RNA is the coding strand, also known as the sense strand Non-coding strand, also known as the antisense strand. You may.   An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule, DNA, or the like that has been removed from its natural environment. Or RNA. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector The invention considers it isolated. In addition, examples of isolated DNA molecules include heterologous lodgings. (Partially or substantially) in a recombinant DNA molecule or solution maintained in a primary cell. ) Includes purified DNA molecules. The isolated RNA molecule includes a D of the present invention. In vivo or in vitro RNA transcripts of the NA molecule are included. Isolation of the present invention The synthesized nucleic acid molecules further include such synthesized molecules.   The isolated nucleic acid molecules of the present invention include those shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1). DNA molecule containing open reading frame (ORF); FIGS. 1A-1B (sequence No. 2) chordin of mature TR2 receptor shown at (last 247 amino acids) DNA molecule containing a sequence that is substantially different from the above-described sequence, The TR2 receptor shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) Includes DNA molecules that encode proteins. Of course, the genetic code Well known in the art. Therefore, it is conventional for those skilled in the art to make such degenerate mutations. It is for.   Similarly, isolated nucleic acid molecules of the invention include those shown in FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4). 4A-4 DNA molecule containing open reading frame (ORF) B (SEQ ID NO: 5) (last 149 amino acids) mature TR2-SV1 receptor A DNA molecule comprising the coding sequence of the promoter; But encodes the TR2-SV1 receptor due to the degeneracy of the genetic code, DNA molecules are included.   In addition, the isolated nucleic acid molecules of the present invention include the open readout shown in FIG. 7A1. Molecule comprising a coding frame (ORF) and a sequence substantially as described above Although containing different sequences, due to the degeneracy of the genetic code, the TR2-SV2 receptor Contain DNA molecules.   In another aspect, the present invention relates to the subject of the ATCC on February 13, 1995, respectively. In the plasmids deposited under accession numbers 97059, 97058 and 97057 TR2 having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in Isolated nucleic acids encoding TR2-SV1 and TR2-SV2 polypeptides Provide molecules. In a further embodiment, the nucleic acid molecules are mature polypeptides. Encodes a full-length polypeptide lacking a tide or N-terminal methionine. The present invention Further, FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) and FIG. An isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence set forth in -7B (SEQ ID NO: 7); The nucleotide sequence of the cDNA contained in the above-mentioned deposited clone; A nucleic acid molecule having a sequence complementary to one of the columns is provided. Such an isolated molecule, In particular, DNA molecules are obtained by in situ hybridization using chromosomes. As a probe for gene mapping, e.g., by Northern blot analysis. For detecting the expression of the TR2 receptor gene of the present invention in human tissues. Useful as a probe.   The invention further relates to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. I do. Nucleotide sequence of the deposited cDNA or FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) 4A-4B (SEQ ID NO: 4) or FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7). Fragments of an isolated nucleic acid molecule having a nucleotide sequence are referred to herein as At least about 15 nucleotides useful as diagnostic probes and primers as described Nucleotides, more preferably at least about 20 nucleotides, even more preferred At least about 30 nucleotides, and more preferably about 40 nucleotides. Means a fragment of length. Of course, the deposited cDNA or Figure 1 A 1B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) or FIGS. No. 7) correspond to most, if not all, of the nucleotide sequences shown. Longer fragments, such as fragments, of 50-400 nucleotides in length. Also, it is more useful in the present invention. For example, a file at least 20 nucleotides in length. The fragment may be the nucleotide sequence of the deposited cDNA or the nucleotide sequence of FIGS. Column No. 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) and FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7). A fragment containing 20 or more contiguous bases from the nucleotide sequence shown. Implied.   Preferred nucleic acid fragments of the invention include the TR of FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2). 2 receptor protein extracellular domain (about 37 to about 200 Predicted to constitute amino acid residues (amino acid residues 1-164 of SEQ ID NO: 2) A polypeptide comprising the TR2 receptor transmembrane domain (amino acids of FIGS. 1A-1B) A polypeptide comprising residues 201-225 (amino acid residues 165-189 of SEQ ID NO: 2) Peptide; TR2 receptor intracellular domain (about 22 amino acid residues in FIGS. 1A-1B) 6 to about 283 (amino acid residues 190 to 24 of SEQ ID NO: 2). Figure 7)) a polypeptide comprising all or part of the transmembrane domain deleted 1A-1B (SEQ ID NO: 2) TR2 receptor protein extracellular and intracellular Nucleic acid molecules encoding the polypeptides comprising the mains are included.   Preferred nucleic acid fragments of the invention also include the mature TR2-SV1 receptor (It is predicted to constitute about 37 to about 185 amino acid residues in FIGS. 4A-4B ( SEQ ID NO: 5 amino acid residues 1-149)) and complete TR2-SV2 receptor (It is predicted to comprise from about 1 to about 136 amino acid residues of FIGS. 7A-7B (sequence Nucleic acid molecules encoding polypeptides comprising No. 8)) are included.   Extracellular, transmembrane and intracellular domains as described above for the leader sequence Were predicted by computer analysis. As a result, Vendors know that the amino acid residues that make up these domains determine each domain. May vary slightly (e.g., from about 1 to about 15 (Amino acid residues).   Preferred nucleic acid fragments of the invention also include the TR2 receptor protein. Nucleic acid molecules encoding the epitope-bearing moiety are included. In particular, the present invention The nucleic acid fragment comprises about 39 to about 70 amino acid residues (sequences of FIGS. 1A-1B). A polypeptide comprising amino acid residues 3-34) of No. 2; A polypeptide comprising the following amino acid residues (amino acid residues 70 to 84 of SEQ ID NO: 2): About 142 to about 189 amino acid residues in FIG. 106-153); polypeptides of about 276 to about 283 of FIGS. 1A-1B. A polypeptide comprising a amino acid residue (amino acid residues 240 to 247 of SEQ ID NO: 2); 4A-4B of about 39 to about 70 amino acid residues (amino acid residues 3 to 34); about 99 to about 136 amino acid residues of FIGS. 4A-4B ( Amino acid residues 63-100 of SEQ ID NO: 5); Amino acid residues (amino acid residues 135 to 149 of SEQ ID NO: 5); 6 to about 68 amino acid residues (SEQ ID NO: 8); Nucleic acid molecules encoding amino acid residues (SEQ ID NO: 8) are included. The present inventors, Determined that the polypeptide fragment is an antigenic region of a TR2 receptor. Solid. Methods for determining such epitope-bearing portions of other TR2 proteins are: Are described in detail below.   In another aspect, the invention relates to, for example, ATCC deposits 97059, 97058 and And nucleic acid molecules of the invention as described above, such as the cDNA clones contained in 97057 Of a single polynucleotide under stringent conditions Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide of interest. "Stringers "Stable hybridization conditions" refers to 50% formamide, 5 × SSC ( 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate Um (pH 7. 6) 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, 20 g / m Incubate overnight at 42 ° C. in a solution containing denatured sheared salmon sperm DNA; Then set the filter to 0. This means washing at about 65 ° C. with 1 × SSC.   Contrast with polynucleotide that hybridizes to a "portion" of the polynucleotide At least about 15 nucleotides, more preferably at least about 15 nucleotides of the polynucleotide About 20 nucleotides, even more preferably about 30 nucleotides, even more preferably More preferably, a polynucleotide (D NA or RNA). These are described above and below. Useful as diagnostic probes and primers, as described in more detail .   For example, a portion of a polynucleotide that is "at least 20 nucleotides in length" Control polynucleotides (eg, the deposited cDNA or FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) 4A-4B (SEQ ID NO: 4) or FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7). 20 or more consecutive nucleotides from the nucleotide sequence Means creotide.   Of course, poly A sequences (eg, FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B ( SEQ ID NO: 4) or the TR2 receptor shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7) the 3'-terminal poly (A) region of the cDNA sequence) or of the T (or U) residue. Polynucleotides that hybridize only to complementary extensions are those polynucleotides. Otides are nucleic acid molecules containing poly (A) extensions or nucleic acid molecules complementary thereto (eg, Hybridizes with virtually any double-stranded cDNA clone). Therefore, the polynucleotide of the present invention used to hybridize with a part of the nucleic acid of the present invention. Not included in Otide.   As described, nucleic acid molecules of the invention encoding a TR2 polypeptide include, but are not limited to: Encodes the amino acid sequence of the mature polypeptide itself A mature polypeptide and a leader or secretory sequence of about 36 amino acids; Encodes additional sequences such as play, pro or pre-pro protein sequences Sequences with or without the additional coding sequences described above, -Coding sequences, such as, but not limited to, introns and non- Coding 5 'and 3' sequences, transcription, mRNA processing (splicein And polyadenylation signals, such as -ribosome binding and mRNA safety. Transcripts, non-translated sequences, etc. that play a role in Peptide coding sequence; additional amino acids such as amino acids that provide additional functions Additional coding sequences encoding amino acids are included. Therefore, poly The sequence encoding the peptide encodes a peptide that facilitates purification of the fusion polypeptide. May be fused to a marker sequence such as a sequence to be loaded. Identification of this aspect of the invention In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is, inter alia, a pQE vector ー (Qiagen, Inc. A) a hexa-histidine peptide such as tag provided in And many are commercially available. Gentz et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA  86: 821-824 (1989), for example, hexa-histidine is a fusion tag. Provides convenient purification of proteins. The “HA” tag is useful for other peptides useful for purification. Corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein, lson et al. , Cell 37: 767 (1984). Other as described below Such fusion proteins were fused to IgG-Fc at the N- or C-terminus. TR2 receptors are included.   In addition, the invention relates to encoding a part, analog or derivative of the TR2 receptor. To a variant of the nucleic acid molecule of the present invention. Variants are natural allelic variants Such can occur naturally. An "allelic variant" is a defined locus on an organism's chromosome. Means one of several different forms of the gene occupying. Genes II, Lewin, B . , Ed. , John Wiley & Sons, New York (1985). Non-naturally occurring variants are known in the art. It can be produced using known mutagenesis techniques.   Such variants include those that may include one or more nucleotides. Included are those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. Mutants are , Coding regions, non-coding regions, or both No. Conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or Can add. Particularly preferred of these are silent substitution and addition. And deletions, which are the properties and activities of the TR2 receptor or portions thereof. Does not change. In this regard, conservative substitutions are also particularly preferred.   Further embodiments of the present invention include (a) Figure 1A-1B (amino acid residue of SEQ ID NO: 2). 4A-4B (amino acid residues -36 to 149 of SEQ ID NO: 5). ) Or as shown in FIGS. 7A-7B (amino acid residues 1-136 of SEQ ID NO: 8). Naa A nucleotide sequence encoding a TR2 polypeptide having a amino acid sequence; (b) 1A-1B (amino acid residues -35 to 247 of SEQ ID NO: 2), FIGS. 4A-4B (sequence No. 5 amino acid residues-35-149) or FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8 amino acid residues). Amino acids, but lacking the N-terminal methionine Nucleotides encoding an acid sequence; (c) positions from about 37 to about 283 of FIGS. 1A-1B. 4A-4B (amino acid residues 1-247 of SEQ ID NO: 2) The amino acid sequence at positions 7 to about 185 (amino acid residues 1 to 149 of SEQ ID NO: 5); Or has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) at about position 1 to about 136 of FIGS. 7A-7B. Mature TR2 receptor (full-length polyprotein with any associated leader sequences removed) (D) ATCC accession number 9 each 7059, 97058 and 97057 contained cDNA clones. TR2, TR2-SV1 having the complete amino acid sequence including the leader Is the nucleotide sequence encoding the TR2-SV2 polypeptide; (e) The cDNA clones contained in ATCC accession numbers 97059 and 97058 Mature TR2 or TR2-SV1 receptor having an encoded amino acid sequence (F) TR2 or TR2-SV1 receptor -Nucleotide sequence encoding extracellular domain; (g) transmembrane of TR2 receptor (H) TR2 receptor intracellular domain (I) all or part of the transmembrane domain Nucleic acid encoding a TR2 receptor extracellular and intracellular domain from which the fraction has been removed A leotide sequence; and (j) (a), (b), (c), (d), (e), (f) A nucleotide complementary to any of the nucleotide sequences in (g), (h) or (i) At least 90% identity to the reotide sequence, more preferably at least 95% Having a nucleotide sequence that is 96%, 96%, 97%, 98% or 99% identical An isolated nucleic acid molecule containing nucleotides is encompassed.   For example, at least a control nucleotide sequence encoding a TR2 polypeptide may have A polynucleotide having a 95% "identity" nucleotide sequence is a polynucleotide 100 nucleotides of the control nucleotide sequence whose otide sequence encodes the TR2 receptor Polynucleoside except that it may contain up to 5 point mutations per leotide It means that the nucleotide sequence of the tide is identical to the control sequence. Change Have a nucleotide sequence at least 95% identical to the control nucleotide sequence To obtain a polynucleotide, up to 5% of the nucleotides in the control sequence May be deleted or substituted with other nucleotides, or Up to 5% of the total nucleotides in the sequence are inserted in the control sequence Is also good. These mutations in the control sequence correspond to the 5 'or 3' end of the control nucleotide sequence. It may occur at the end portions or anywhere between these end portions, May be interspersed individually between nucleotides in the sequence, or one or It may be in more adjacent groups.   In practice, individual nucleic acid molecules are shown, for example, in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1). Nucleotide sequence or the deposited cDNA clone encoding the protein At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% Or 99% identity, using the Bestfit program (Wisconsin Sequence A nalysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Reserch Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Can be routinely checked using a data program. Bestfit is Smith and  Waterman, local homo of Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981) Find the largest segment of homology between two sequences using the algorithm put out. Whether an individual sequence has 95% identity to a control sequence of the invention Using Bestfit or any other sequence alignment program to check for Of course, the percentage identity is calculated over the entire length of the control nucleotide sequence. At a homology of up to 5% of the total number of nucleotides in the control sequence. Set the parameters so that the loop is acceptable.   The present invention relates to a method for encoding a polypeptide having TR2 receptor activity. 1A-1B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) or FIG. 7A-7B (SEQ ID NO: 7) or nucleic acid sequence of the deposited cDNA At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity in a row Of nucleic acid molecules. Because a specific nucleic acid molecule has TR2 receptor activity Even if they do not encode a polypeptide, those skilled in the art , Hybridization probe or polymerase chain reaction (PCR) This is because they know how to use nucleic acid molecules as immersers. TR2 receptor Use of the nucleic acid molecules of the present invention that do not encode an active polypeptide involves the use of: (1) TR2 receptor gene or allele in cDNA library Isolation of a gene or splice variant; (2) Verma et al. ， Human Chromosome s: A Manual of Basic Techniquies, Pergamon Press, New York (1988) To determine the exact chromosomal location of the TR2 receptor gene In situ hybridization to chromosome extension (eg, "FISH"); (3 ) Northern blot for detecting TR2 receptor mRNA expression in specific tissues Analysis.   However, FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) and Is the nucleic acid sequence shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7) or the nucleus of the deposited cDNA At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the acid sequence Encodes a polypeptide having a unique sequence and actually having TR2 receptor activity Preferred nucleic acid molecules are: "Polypeptide having TR2 receptor activity" The TR2 receptor of the present invention (full length protein) as measured in a particular biological assay Protein, splice variant or, preferably, the mature protein) A polypeptide that exhibits, but need not be, similar activity is meant. For example, TR 2 Receptor activity was measured using a polypeptide as described below in Example 6. It can be measured by examining the ability of the Fc fusion protein to inhibit lymphocyte proliferation. You. TR2 receptor activity can also be induced by free or expressed on the cell surface. Proliferation in intact cells expressing receptors for polypeptides such as triligands It may be measured by examining the ability to confer activity.   Naturally, due to the degeneracy of the genetic code, the nucleic acid sequence of the deposited cDNA or FIG. B (SEQ ID NO: 1), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 4) or FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 7). ) At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% Ma Or a majority of nucleic acid molecules having a sequence of 99% identity It will be appreciated by those skilled in the art that they encode polypeptides having ". Actual Degenerate variants of these nucleotide sequences all encode the same polypeptide. Therefore, this is clear to the skilled person, even without performing the comparative assay described above. Will. Furthermore, for nucleic acid molecules that are not degenerate variants, a considerable number One skilled in the art will recognize that it encodes a polypeptide having protein activity. U. These are amino acids that have little or no effect on protein function For substitutions, as is known to those skilled in the art (eg, a first aliphatic amino Replacing the acid with a second aliphatic amino acid).   For example, guidance on how to create phenotypically silent amino acid substitutions Bowie, J .; U. etal. , "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tole rance to Amino Acid Substitutions ", Science 247: 1306-1310 (1999). Where the authors find that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions. Is shown. Vectors and host cells   The present invention relates to a vector comprising the isolated DNA molecule of the present invention, a recombinant vector. Genetically modified host cells and TR2 polypeptides or It also concerns the production of the fragment.   Linking the polynucleotide to a vector containing a selectable marker for propagation in a host It may be tied. In general, plasmid vectors are Introduce in any precipitate or complex with charged lipids and the like. Vector If it is a virus, package it in vitro using a suitable packaging cell line. Then, it may be introduced into a host cell.   The DNA insert is, for example, a phage lambda PL promoter, e. Cori (E . E. coli) lac, trp and tac promoters, SV40 early and after Suitable promoters such as the early promoter and the retroviral LTR promoter Should be functionally linked to the Other suitable promoters will be known to those of skill in the art. La Have been. In addition, the expression construct translates into transcription start and stop sites, and transcribed regions. Contains a ribosome binding site for translation. A copy of the mature transcript expressed by the construct The coding part preferably starts at the beginning of the protein to be translated. Codons and stop codons (UAA, UGA or U AG).   As described, the expression vector preferably comprises at least one selectable marker. including. Such markers include dihydrofolate reducers for eukaryotic cell culture. Ze or neomycin resistance, e. Tetracycling for cultivation of E. coli and other bacteria Phosphorus or ampicillin resistance genes are included. Representative examples of suitable heterologous hosts include , But without limitation, e. Coli, Streptomyces and Bacterial cells such as and Salmonella typhimurium cells Fungal cells such as yeast cells; Drosophila S2 and Spodoptera Insect cells such as Sf9 cells; CHO, COS and Bowes black seed cells Animal cells such as vesicles; and plant cells. Culture media suitable for the above host cells Culture media and conditions are known in the art.   Among the vectors, those preferred for use in bacteria are pQE70, pQE70, QE60 and pQE-9 (available from Qiagen); pBS vector, phage Crypt vector, Blue script vector, pNH8A, pNH16a, p NH18A, pNH46A (available from Stratagene); and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Available from Co., Ltd.). Preferred eukaryotic vectors are pWL NEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (from Stratagene And pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia) Available from Co., Ltd.). Other suitable vectors will be readily recognized by those of skill in the art. Will be.   Introduction of the construct into host cells can be accomplished by calcium phosphate transfection, DE AE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfer Electroporation, transduction, infection or other methods Can be performed. Such a method is described in Davis et al. , Basic Methods In Mol It is described in many standard laboratory manuals, such as ecular Biology (1986).   The polypeptide may be expressed in a modified form, such as a fusion protein, and may be secreted. Not only signals but also additional heterologous functional regions may be included. For example, Additional regions of amino acids, particularly charged amino acids, are added to the N- In addition to the ends, during purification or during subsequent handling and storage, The stability and the retention in storage may be improved. In addition, the peptide Purification may be facilitated in addition to the tide. Such regions are intended for the final production of the polypeptide. It may be removed before building. Peptide moieties are added to the polypeptide to secrete and exclude To produce, improve stability, and facilitate purification. It is a conventional technique well known in the art. Preferred fusion proteins are Heterologous regions derived from immunoglobulins useful for solubilizing proteins are included. For example, EP-A-O 465 533 (Canadian Patent 2045869) includes immunoglobulins. Another human protein or part thereof together with various parts of the constant part of the Disclosed are fusion proteins. Often, the Fc portion of the fusion protein is It is very useful in therapy and diagnostics and therefore, for example, has pharmacokinetic characteristics. Improve the properties (EP-A 0232262). On the other hand, in some uses, The fusion protein is expressed, detected and purified in the advantageous manner described. It is desirable that the Fc portion be able to be deleted after the operation. This is because the Fc region Treatment and diagnostics, such as when the fusion protein is used as an antigen for immunization This is a case where it may hinder the use of the connection. In drug discovery, for example, human Human proteins, such as the IL-5 receptor, are also antagonists of hIL-5. It has been fused with an Fc portion for the purpose of defining high throughput screening assays. D. Bennett et al. , Journal of Molecular Recognition, Vol. 8: 52-58 (1995) and And K. Johanson et al. , The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No . 16: 9459-9471 (1995).   TR2 receptor was purified by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, On or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography , Hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, Hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography And can be recovered and purified from recombinant cell culture by well-known methods, including: High sex Most preferably, high performance liquid chromatography (HPLC) is used for purification. Departure Light polypeptides include purified natural products, products of chemical synthesis, such as Prokaryotic or eukaryotic cells, including bacteria, yeast, higher plants, insects and mammalian cells Includes products produced by recombinant techniques from the cells. For use in recombinant production Depending on the host, the polypeptide of the present invention may be glycosylated or glycosylated. It need not be cosylated. In addition, polypeptides of the invention may May contain an initial modified methionine residue as a result of a host-mediated process. Good. TR2 polypeptides and fragments   The present invention further provides an amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, 1A-1B (SEQ ID NO: 2), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) and FIGS. An isolated TR2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8), or A peptide or polypeptide comprising a portion of the polypeptide of   The polypeptide of the present invention may be in a membrane-bound form or in a soluble circulating form. You may. Soluble peptides are polypeptide sequences whose sequences lack the transmembrane domain. Including, but not limited to, the amino acid sequence. The soluble form of such TR2 receptor One example has a secretory leader sequence but has both intracellular and transmembrane domains. Lack of a TR2-SV1 splice variant. Therefore, TR2-SV1 The puter protein is secreted in soluble form from cells that express this protein. You.   The polypeptide of the present invention comprises a transmembrane region, an intracellular region and an extracellular region. Soluble form, which may be present as an avid receptor, or lack a transmembrane domain May exist in a state. One example of such a form of the TR2 receptor includes a leader sequence. In addition, FIGS. 1A-1B (including SEQ ID NOs: 1) including transmembrane, intracellular and extracellular domains. It is the TR2 receptor shown in 2). Thus, this form of the TR2 receptor The state is located in the cytoplasmic membrane of cells that express this protein.   For those skilled in the art, some amino acid sequences of the TR2 receptor are It will be appreciated that quality can be altered without significant effect on structure or function. Or When considering the differences in these sequences, there are important regions on the protein that determine activity. You have to remember that you are. Therefore, the present invention further provides a A protein moiety which exhibits TR2 receptor activity or as described below And mutants of the TR2 receptor comprising a region of the TR2 protein. Heel Variants include types of deletions, insertions, inversions, repeats, and substitutions. As noted above, it is important to know which amino acid changes are likely to be phenotypically silent. Guidance is provided by Bowie, J .; U. et al. , "Deciphering the Message in Prote in Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions ", Science 247: 1306-13 10 (1999).   Therefore, FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2), FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) and FIG. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) or a polypeptide encoded by the deposited cDNA. The fragment, derivative or analog of the polypeptide may comprise (i) one or more Are conserved or non-conserved amino acid residues (preferably conserved amino acid residues). Group), and such a substituted amino acid residue is encoded by the genetic code. (Ii) having one or more amino acid residues Those having substituents, (iii) the mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide Fused with other compounds such as a compound to be added (eg, polyethylene glycol) Or (iv) an IgG Fc fusion region peptide or leader or Is the secretory sequence, the sequence used to purify the mature polypeptide, or the An additional amino acid, such as an in sequence, fused to the mature polypeptide, Is also good. Such fragments, derivatives and analogs are useful from the teachings herein. It is considered to be within the scope of the trader.   Of particular importance are the charged amino acids and other charged amino acids and medium It is a substitution with a sex or negatively charged amino acid. In the protein, the latter Are reduced, resulting in improved characteristics of the TR2 protein. Coagulation Collection defense is particularly desirable. Protein aggregation is not only a matter of loss of activity, Can be immunogenic, which can also be problematic when preparing pharmaceutical formulations (Pin ckard et al. , Clin Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al. , Diabete s 36: 838-845 (1987); Cleland et al. , Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier S ystems 10: 307-377 (1993)).   Amino acid substitutions may also alter binding selectivity for cell surface receptors. Osta de et al. , Nature 361: 266-268 (1993) states that due to a mutation, TNF-α Selectively binds to only one of two known types of NF receptors Is described. Therefore, the TR2 receptor of the present invention One or more amino acid substitutions, deletions, either by foreign or human manipulation Or it may include additions.   Does not significantly affect protein folding or activity as described Small changes, such as conservative amino acid substitutions, are preferred (see Table 1).                                   Table 1                             Conserved amino acid substitution  Amino acids in the TR2 protein of the present invention that are essential for function Mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, S cience 244: 1081-1085 (1989)). The latter method introduces a single alanine mutation at each residue of the molecule. The resulting mutant molecule can then be used for receptor binding, or in vivo or in vivo. Test for biochemical activity, such as in vitro proliferative activity. Ligand-receptor binding Essential sites are identified by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance or photoaffinity labeling. (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de V os et al., Science 255: 306-312 (1992)).   Preferably, the polypeptide of the present invention is provided in an isolated form. "Isolated Was "Polypeptide" means a polypeptide that has been removed from its natural environment. Soy sauce In addition, polypeptides produced and contained in recombinant host cells are referred to in the present invention as "simple". Released. " Also, “isolated polypeptide” is a recombinant host It also refers to a partially or substantially purified polypeptide. For example, recombination The TR2 receptor produced by Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (19 It can be substantially purified by the one-step method described in 88).   The polypeptide of the present invention is encoded by a deposited cDNA containing a leader. Polypeptide; polypeptide encoded by the leader-free deposited cDNA (Ie, the mature protein); FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2), including the leader. Or the polypeptide of Figures 4A-4b (SEQ ID NO: 5); 1A-1B (SEQ ID NO: 2) or FIGS. 4A-4b (SEQ ID NO: 5) lacking thionin 1A-1B (SEQ ID NO: 2) or FIG. 4A- 4B (SEQ ID NO: 5); polypeptides of FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) C: extracellular domain and membrane of TR2 receptor shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) A transduction domain and an intracellular domain; At least 80% identity, more preferably at least 90% or 95% identity. And more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99% identity. Having at least 30 amino acids, more preferably less than 30 amino acids of such a polypeptide. Polypeptides comprising a portion of at least 50 amino acids are included.   For example, at least 95% "relative to a reference amino acid sequence of a TR2 polypeptide. A polypeptide having an amino acid sequence of “identity” is the amino acid sequence of the polypeptide. Indicates that the polypeptide sequence has 100 amino acids equivalent to the control amino acid of the TR2 receptor. Must be identical to the reference sequence except that it may contain up to 5 amino acid changes. Means In other words, at least 95% identity to the control amino acid sequence. In order to obtain a polypeptide having a amino acid sequence, the amino acid residue in the control sequence must be Up to 5% may be deleted or substituted with other amino acids, or Up to 5% of all amino acid residues in the reference sequence are inserted into the control sequence May be. These mutations in the control sequence correspond to amino or Boki It may occur at the end portions or anywhere between these end portions, It may be interspersed individually between residues in the control sequence, or one or more of the residues in the control sequence. It may be in the above adjacent groups.   In practice, the individual polypeptides are, for example, shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2), A-4B (SEQ ID NO: 5) or amino acids shown in FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) A sequence or amino acid sequence encoded by one of the deposited cDNA clones; At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity Check whether the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versio n 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Scien ce Drive, Madison, WI 53711) It can be checked idiomatically. For example, an individual sequence may be compared to a control sequence of the invention. Bestfit or any other to determine if they have 95% identity When using a sequence alignment program, the percentage identity should, of course, Calculated over the entire length of the acid sequence, up to 5% of the total number of amino acid residues in the control sequence. Set the parameters so that gaps are allowed in homology.   The polypeptides of the present invention can be purified by SDS-PAGE using methods well known to those skilled in the art. On molecular or molecular sieve gel filtration columns as molecular weight markers be able to.   In another aspect, the invention relates to an epitope-bearing site of a polypeptide of the invention. Or a peptide or polypeptide comprising: E of these polypeptide moieties The pitopes may be immunogenic or antigenic of the polypeptides described herein. Is an epitope. "Immunogenic epitope" refers to the case where all proteins are immunogens. Is defined as the part of the protein that elicits an antibody response. On the other hand, the antibody binds The resulting region of the protein molecule is defined as an "antigenic epitope." General In addition, the number of immunogenic epitopes on a protein is less than the number of antigenic epitopes. No. See, for example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983 ).   A peptide or polypeptide carrying an antigenic epitope (ie, an antibody (Including those of the protein molecules capable of binding) A relatively short synthetic peptide that mimics part of a It is well known in the art that antisera that react with proteins can be induced. For example, Sutc liffe, J .; G., Shinnick. T. M., Green, N.M. and Learner, R. A. (1983) Antibo dies that react with predetermined sites on proteins. Science 219: 660-66 See 6. Peptides capable of inducing protein-reactive serum are often proteins. Can be characterized in the primary sequence of quality and characterized by a simple set of chemical rules. The immunodeterminant region of the complete protein (ie, an immunogenic epitope) or It is not limited to either the amino or carboxy terminus.   The antigenic pepitope-carrying peptides and polypeptides of the present invention are therefore Produce antibodies, including monoclonal antibodies, that specifically bind to a polypeptide of the present invention. Useful to grow. For example, see Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984) 777. Teru. The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention Preferably at least 7, more preferably contained within the amino acid sequence of the polypeptide. Preferably at least 9, most preferably between about 15 to about 30 amino acids Contains an acid sequence.   Without limitation, used to produce TR2 receptor-specific antibodies Examples of antigenic polypeptides or peptides that can be identified include about 39 to about 39 in FIG. A polypeptide comprising 70 amino acid residues (amino acid residues 3-34 of SEQ ID NO: 2); 1A-1B (amino acid residues 70-84 of SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising amino acid residues; from about 142 to about 189 of FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: No. 2 polypeptide comprising the amino acid residues 106 to 153); FIG. About 276 to about 283 (amino acid residues 240 to 247 of SEQ ID NO: 2) 4A-4B (amino acid of SEQ ID NO: 5). Polypeptides comprising amino acid residues of acid residues 3-34); Polypeptide comprising about 136 amino acid residues (amino acid residues 63 to 100 of SEQ ID NO: 5) 4A-4B (amino acid residue 13 of SEQ ID NO: 5); 5 to 149); about 56 to about 6 in FIGS. 7A to 7B. 8 comprising the amino acid residue of SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 8); Polypeptides comprising about 136 (SEQ ID NO: 8) amino acid residues. Up As noted, the inventors have determined that the above polypeptide fragment is a TR2 receptor. -Determined to be an antigenic region of the protein.   The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention may also be prepared by conventional means. May be manufactured. Houghten, R.A. A. (1985) General method for the rapid s olid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen -antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl . Acad. Sci. USA 82: 5131-5135. This "Simultaneous Multiple Peptide Synth The “esis (SMPS)” process is further described in US Pat. No. 4,631,211 to Houghten et al. 1986).   TR2 polypeptides of the invention and epitope-bearing fragments thereof as described above With a portion of the constant domain of an immunoglobulin (IgG) It will be appreciated by those skilled in the art that it can be a peptide. Fusion of these Proteins facilitate purification and increase half-life in vivo. This means For example, the first two domains of a human CD4-polypeptide and a mammal Chimeras comprising various domains of long or short constant regions of immunoglobulins Protein (EPA 394827; Traunecker at al., N ature 331: 84-86 (1988)). Has a disulfide-linked dimer structure due to the IgG moiety The fusion protein can be a monomeric TR2 receptor protein or a protein Are more efficient at binding and neutralizing other molecules than fragments alone (Fountou lakis et al. Biochem 270: 3958-3964 (1995)). Detection of medical conditions   TNF family ligands, including the TR2 receptor of the present invention, include TNF-F Triggers various cellular responses by binding to family receptors. TN TNF-β, a potent ligand for the F receptor protein, is involved in lymphocyte development, Tumor necrosis, induction of antiviral status, activation of polymorphonuclear leukocytes, class on endothelial cells Induction of I major histocompatibility complex antigen, induction of adhesion molecules on endothelial cells and It is known to be involved in many biochemical processes, including long hormone stimulation (R uddle and Homer, Prog. Allergy, 40: 162-182 (1988)). In addition, TNF receptor TNF-α, a ligand for proteins, is responsible for the rapid necrosis of tumors, immunostimulation, Autoimmune disease, graft rejection, production of anti-viral response, septic shock, brain Malaria, cytotoxicity, adverse effects of ionizing radiation produced during chemotherapy, eg For example, protection against enzyme denaturation, lipid peroxidation and DNA damage (Nata et al. , J. et al. Immunol. 136 (7): 2483 (1987)), growth regulation, vascular endothelial action and metabolic action Has been reported to play a role in TNF-α also stimulates endothelial cells Secretes various factors, including PAI-1, IL-1, GM-CSF and IL-6 To promote cell proliferation. In addition, TNF-α is E-selectin, ICAM Upregulates various cell adhesion molecules such as -1 and VCAM-1 You. TNF-α and Fas ligand also trigger programmed cell death It has been shown.   Cells that express TR2 polypeptide and are potent for TR2 receptor ligand Cells suspected of having a sexual response include B lymphocytes (CD19+), CD4+and CD8+Both T lymphocytes, monocytes, endothelial cells, and are shown in Tables 2 and 3. Other cell types. "Cellular response to TNF-family ligands" Are cells, cell lines, tissues, tissues induced by TNF-family ligands Means genotype, phenotype, and / or morphological changes to culture or patient I do. As described, such cellular responses include normal TNF-family ligas. Cell proliferation due to inhibition of apoptosis as well as physiological response to Diseases associated with increased proliferation or inhibition of increased cell proliferation are also included. Apot -Programmed cell death involves deletion of peripheral T lymphocytes in the immune system Is a physiological mechanism whose dysregulation causes many different pathogenic processes (Ameisen, J.C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Krammer, PH. et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 279-289 (1994)).   Certain tissues in mammals with certain disease states that are associated with abnormal cell survival A "standard" mammal, i.e., a mammal of the same species without a medical condition. If TR2 receptor protein and TR2 receptor protein It is thought that the mRNA to be expressed is expressed at significantly altered levels. Furthermore, this Certain forms of the protein are secreted, so they are derived from mammals of the same species without pathology Enhanced levels of the TR2 receptor protein indicate that Detected in body fluids (eg, serum, plasma, urine, and spinal fluid) from mammals with It is considered possible. Therefore, the present invention provides a diagnostic method useful for diagnosing a medical condition. Encodes a TR2 receptor protein in a mammalian cell or body fluid The gene expression level is assayed and compared to the standard TR2 receptor gene expression level. Compare gene expression levels, thereby increasing gene expression levels relative to the standard. Or wherein the reduction comprises indicating a condition associated with abnormal cell survival. .   Diagnosis of a disease state involving the TR2 receptor of the present invention has already been performed by a conventional method. The present invention is useful as a prognostic indicator, Patients with abnormal TR2 receptor gene expression may have lower levels of the gene There will be poor clinical results compared to the developing patient.   "Assay the expression level of the gene encoding the TR2 receptor protein Is directly (eg, measuring absolute protein or mRNA levels). Relative or (eg, by determining or estimating) a second biological sample Comparing to TR2 receptor protein levels or mRNA levels in The TR2 receptor protein level in the first sample. Or the level of mRNA encoding the TR2 receptor protein Means quantitatively measured or estimated.   Preferably, the TR2 receptor protein level in the first biochemical sample is Or mRNA levels were measured or estimated and obtained from individuals without the condition. A standard TR2 receptor protein level obtained from a second biochemical sample And mRNA levels. As recognized in the art, once the standard Once the TR2 receptor protein level or mRNA level is known, It can be used repeatedly as a standard for comparison.   A “biochemical sample” includes a TR2 receptor protein or mRNA. Biochemical sample obtained from an individual, cell line, tissue culture or other source. To taste. Biochemical samples include secreted mature TR2 receptor protein Mammalian fluids including serum, plasma, urine, synovial fluid and spinal fluid, thymus, prostate , Heart, placenta, muscle, liver, spleen, lung, kidney and other tissues. Organization Methods for obtaining biopsies and body fluids from mammals are well known in the art. Biochemical If the sample includes mRNA, a tissue biopsy is the preferred source.   Diseases associated with increased cell survival or inhibition of apoptosis include cancer (vesicular Autoimmune tumors, carcinomas with p53 mutations, and hormone-dependent tumors); Epidemics (systemic lupus erythematosus, and immune-related glomerulonephritis, rheumatoid arthritis Gusset) and viral infections (herpes virus, poxvirus and Adenovirus), information graft-versus-host disease, acute graft rejection, and Sex graft rejection is included. Associated with decreased cell survival or increased apoptosis Associated diseases include AIDS; neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease) Disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration); myelodysplastic syndrome (regeneration) Caused by ischemic injury (myocardial infarction, stroke and reperfusion injury) Toxin-induced liver disease (such as that caused by alcohol) ), Septic shock, cachexia and anorexia.   Assays available to detect soluble receptor levels, e.g. Immunoassays, competition-binding assays, and Western blot analysis are available to those of skill in the art. It is well known and preferably an ELISA assay may be used.   Complete TR2 receptor protein or carrier protein such as albumin With or if long enough (at least about 25 amino acids) without carrier The antigenic polypeptide may be presented to an animal system (such as a rabbit or mouse) Antibody to TR2 receptor-protein specific antibody It is.   As used herein, "antibody" (Ab) or "monoclonal antibody" (mAb) ) Is specific for the complete molecule as well as for the TR2 receptor protein Yes Antibody fragments (eg, Fab and F (ab '))TwoFragment) Include. Fab and F (ab ')TwoFragments contain the Fc fragment of the complete antibody. Lacking antibodies, clearing faster from circulation, and reducing non-specific tissue binding of intact antibodies (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Therefore, these hula Are preferred.   The antibodies of the present invention may be prepared by any of a variety of methods. For example, TR Cells expressing the two-receptor protein or an antigenic fragment thereof are To induce the production of serum containing polyclonal antibodies. Like In a new method, a preparation of a TR2 receptor protein is prepared and purified. And be substantially free of natural mixtures. The preparation is then transferred to an animal To produce a polyclonal antiserum with higher specific activity.   In the most preferred method, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody (or Its TR2 receptor protein binding fragment). Such monochrome Null antibodies are obtained using the hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); r et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6 : 292 (1976); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrid omas, Elsevier, N .; Y., (1981) pp. 563-681). In general, Such a method may be a TR2 receptor protein antigen or, more preferably, a TR2 receptor. Immunizing an animal (preferably a mouse) with sceptor protein-expressing cells Including. Appropriate cells are identified by their ability to bind anti-TR2 receptor protein antibodies. Can be recognized. Such cells may be cultured in a suitable tissue culture medium; 10% fetal bovine serum (inactivated at 56 ° C.) and approximately 10 g / l Amino acid, about 1000 U / ml penicillin, and about 100 μg / ml Earle's modified Eagle's medium supplemented with streptomycin s medium). Extracting the spleen cells of such mice And fused with a suitable myeloma cell line. According to the present invention, any suitable bone A myeloma cell line may be used; however, the American Type Culture Collection Parental myeloma cell line (SP) available from Rockville, MarylandTwoO) Preferably, it is used. After fusion, the resulting hybridoma cells are placed in HAT medium. Selectively maintained, then Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-262 (1981)) Clone by limiting dilution as described. Gained through such choices The hybridoma cells were then assayed for TR2 receptor protein antigen A clone secreting an antibody capable of binding to is identified. Agonists and antagonists of TR2 receptor function   In one aspect, the invention relates to TNF-family ligand induced T A method of inhibiting the activity of R2 (eg, cell proliferation, hematopoietic development, etc.) Reduces TR2 receptor-mediated signals in cells expressing 2 polypeptides With a TR2 receptor ligand, analog or antagonist A method comprising administering an effective amount. Preferably, the TR2 receptor mediated system To treat diseases that increase the signal and increase cell proliferation. Antagonists Blocks soluble forms of TR2 receptor and TR2 receptor-mediated signals Antibodies to any TR2 polypeptide can be included. Preferably, the TR2 receptor -Reduce mediated signals and treat disease.   In a further aspect, the present invention relates to a method for inducing a TNF-family ligand. A method for increasing cell proliferation, which comprises administering to a cell that expresses a TR2 polypeptide , An effective amount of an agonist capable of increasing a TR2 receptor-mediated signal A method comprising administering Preferably, TR2 receptor mediated signal To treat diseases that show decreased cell proliferation. The agonists of the present invention , A monoclonal antibody against a TR2 polypeptide that stimulates a TR2 receptor-mediated signal Lonal antibodies are included. Preferably, increase TR2 receptor-mediated signal And treat the disease.   “Agonist” refers to cell proliferation and differentiation mediated by a TR2 polypeptide And natural and synthetic compounds capable of enhancing Such agonists Increases TR2 receptor expression or sensitizes the expressed receptor Drugs that increase sex are included. "Antagonists" refer to TR2-mediated cell proliferation and Yo And natural and synthetic compounds capable of inhibiting differentiation and differentiation. Such anta The gonist may be required to reduce the expression of the TR2 receptor or to express the expressed receptor. Agents that reduce the sensitivity of the putter are included. Candidate "agonists" of the present invention Or "antagonists" can enhance or inhibit cell proliferation and differentiation Are known in the art, including those described in more detail below. -Can be determined using a ligand / receptor cellular response assay.   One such screening technique is described, for example, in Science 246: 181-296 (1989, 10 Month), extracellular pH changes caused by receptor activation In a system for measuring activation, cells expressing a receptor (eg, trans Infected CHO cells). For example, the compound may be a receptor of the present invention. -Contact with a cell expressing the polypeptide and respond to a second messenger response, e.g. Measurement of signal transduction or pH changes to detect potential compounds One may determine whether to activate or inhibit the putter.   Another such screening technique is to acquire RNA encoding the receptor. Transfection into a frog Xenopus oocyte and transient expression of the receptor Including. Receptor oocytes, then receptor ligands and screening Contact with a compound that is likely to inhibit receptor activity. Detect calcium signal inhibition or activation for product screening May be.   Other methods include inhibiting the binding of a labeled ligand to cells having the receptor on the surface. A compound that inhibits the activity of the receptor polypeptide of the present invention by examining , Including screening for antagonists. Such methods involve eukaryotic cells as receptors. Transfected with DNA encoding the gene and expressing the receptor on its surface And contacting the cells with the compound in the presence of a labeled form of the known ligand Including. The ligand can be labeled, for example, by radioactivity. Binds to the receptor The amount of labeled ligand is measured, for example, by measuring the radioactivity of the receptor. Set. Compounds as determined by reduced labeled ligand binding to the receptor When the substance binds to the receptor, the binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited. You.   Soluble forms of the polypeptides of the invention may be used in the ligand binding assays described above. May be used. These forms of TR2 receptors, after they are secreted, Contact ligand in extracellular medium. Then, the secreted protein is TR2 Investigate whether it binds to the receptor ligand.   Additional Screening Assays for Agonists and Antagonists of the Invention Is Tartaglia. L. A., and Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-430 7 (1992).   Thus, in a further aspect, the candidate agonist or antagonist is T Whether the cellular response to NF-family ligand can be enhanced or inhibited A screening method is provided to determine The method comprises a TR2 polypeptide. Contacting cells expressing the peptide with a candidate compound and a TNF-family ligand Assay the cellular response and contact with the ligand in the absence of the candidate compound. Performing the assay, including comparing the cellular response to a standard cellular response, The increased cellular response to the standard indicates that the candidate compound is a ligand / receptor -Attenuated cellularity as compared to a standard, indicating an agonist of the signaling pathway The response is that the candidate compound is an antagonist of the ligand / receptor signaling pathway. Indicates that “Assaying a cellular response” refers to a candidate compound and / or Measures qualitatively or quantitatively cellular responses to TNF-family ligands (E.g., an increase in T cell proliferation or tritiated thymidine labeling). Or measuring or estimating the decrease). According to the present invention, the TR2 polypeptide Cells expressing the peptide can be administered to an endogenous or exogenous administered TNF-family. It can be contacted with any of the ligands.   In a further embodiment, a thymic proliferation assay is used to determine ligand and potential Both drug candidates may be identified. For example, separating thymocytes from tissue Grow in.ThreeH-thymidine or 5-bromo-2'-deoxyuridine ( The incorporation of DNA precursors such as BrdU) is Monitor as a parameter. Cells with BrdU integrated in DNA Is detected using a monoclonal antibody against Brdl and the enzyme or fluorescent dye -Conclusion It can be measured by a second antibody. The reaction is quantified with a fluorimeter or spectrophotometer. Two control wells and experimental wells were set as described above and either TNF-β or Binding ligand is added to all wells and the soluble receptor polypeptide of the invention is added. Should be added individually to a second control well and the experimental wells should be screened Add compound. Stimulate or block the interaction of the compound to be screened The ability to harm may then be quantified.   The agonist of the present invention includes, for example, a TNF-family ligand peptide peptide. , Transforming growth factor beta and neurotransmitters (glutamate , Dopamine, N-methyl-D-aspartate, etc.). You. Preferred agonists include those against the TR2 polypeptide or a fragment thereof. And polyclonal and monoclonal antibodies prepared by the method. TNF -Such agonistic antibodies raised against family receptors are Tartagli a, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292-9296 (1991) and Tartaglia, L. . A., and Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992) ing. See also PCT application WO 94/09137. More preferred Agonists include, for example, cisplatin, doxorubicin, bleomycin, Tosin, arabinoside, nitrogen mustard, methotrexate and Chemotherapeutic agents such as vincristine are included. Others include ethanol and β- Amyloid peptides are included (Science 267: 1457-1458 (1995)).   Antagonists of the present invention include soluble forms of the TR2 receptor ( For example, FIG. 1 includes a ligand binding domain from the extracellular region of the full-length receptor. A fragment of the TR2 receptor shown in A-1B). Natural or synthetic Such soluble forms of the receptor, which can be -By competing for binding to the ligand with the cell surface bound form of the receptor, Antagonize TR2, TR2-SV1 or TR2-SV2 mediated signals You. The antagonists of the present invention include antibodies specific for TNF-family ligands. And a TR2-Fc fusion protein as described in Examples 5 and 6 below Included. "TNF-family ligands" bind to the TNF receptor family, A natural, recombinant, capable of triggering a ligand / receptor signaling pathway And synthetic ligands. Limited to TNF ligand family group Although TNF-α, lymphotoxin-α (LT-α, TNF-β Also known), LT-β (found in the complex heterotrimer-LT-α2-β), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L and And nerve growth factor (NGF).   The experiment shown in Example 6 shows that the TR2 receptor of the present invention can induce lymphocyte proliferation. Show that you can. In addition, such growth is due to TR fusion with the Fc antibody fragment. It can be inhibited by two protein fragments.   TNFα was isolated from herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection in mice. Has been shown to defend against. Rossol-Voth, R et al. Gen. Virol. 72: 143-147 (1991). Although the mechanism of the protective action of TNFα is not known, Neither ferron nor NK cell killing appears to be involved. TNFR fa One member of Millie has been shown to mediate HSV-1 entry into cells I have. Montgomery, R. et al., Eur. Cytokine Newt. 7: 159 (1996). In addition, Antibodies specific for the extracellular domain of TNFR block HSV-1 entry into cells. Refuse. Therefore, TR2 receptors of the present invention include TNFR-mediated viral cells Includes both TR2 amino acid sequences and antibodies that can protect against invasion. Such distribution Columns and antibodies compete for binding to the virus with cell surface-localized TNFRs. Or directly block the binding of the virus to cell surface receptors. It can work with this.   The antibodies of the invention can be used in any of a variety of methods using the TR2 receptor immunogens of the invention. It may be prepared therefrom. Such TR2 receptor immunogens include FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2), and TR2-SV1 (FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 5) and TR2-SV2 (FIGS. 7A-7B (SEQ ID NO: 8) polypeptides (both with and without a leader sequence) ) And TR2 receptor ligand binding, extracellular, transmembrane, intracellular domains Or a polypeptide fragment of a receptor comprising any combination of these. Event is included.   Polyclonal and monoclonal antibodies, agonists or anta of the invention Gonists are described in Tartag1ia and Goeddel, J.M. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992) ; Tartaglia et al., Cell 73: 213-216 (1993) and PCT application WO 94/091. 37. As used herein, “antibody” (A The term b) or "monoclonal antibody" (mAb) refers to a complete molecule as well as an antibody. Fragments thereof (eg, Fab and F (ab ')TwoFragment Etc.). Fab and F (ab ')TwoThe fragment is the F of the complete antibody Non-specific tissue of intact antibodies lacking the c-fragment and disappearing faster from circulation Low binding (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).   In a preferred method, the antibodies of the invention are mAbs. Such mAbs are high Bridoma technology (Kohler and Millstein, Nature 256: 495-497 (1975) and US Patent No. 4376110; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Co. ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Monoclon al Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Ple num Press, New York, NY, 1980; Campbell, "Monoclonal Antibody Technology" , In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume  13 (Burdon et al., Eds.), Elsevier, Amsterdam (1984)).   Proteins and other compounds that bind to the TR2 receptor domain also Are clear candidate agonists and antagonists. Such binding compounds are yeast -Using a hybrid system (Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989)) And "capture". Deformed barge of yeast two-hybrid system Has been described by Roger Brent and his co-workers (Gyuris, J.e. t al., Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A .; S. et al., Cell 72: 223-232 (1993 )). Preferably, a yeast two-hybrid system is used according to the invention, Ligand binding of TR2 receptor, binding to extracellular, intracellular and transmembrane domains Search for the compound you want. Such compounds are excellent candidate agonists of the invention and Ann He is a tagonist.   Using the two-hybrid assay described above, the intracellular Cellular proteins that interact with receptors in vivo using in or a part thereof The protein may be identified. Using such an assay, the TR2 receptor Identify ligands with potential agonist or antagonist activity Is also good. This screening assay has previously been used in the cytoplasm of mature TNF-RII. Identify proteins that interact with domains and identify two receptor binding proteins Have been used to identify Rothe, M .; et al., Cell 78: 681 (1994). T Such proteins and amino acid sequences that bind to the cytoplasmic domain of the R2 receptor The columns are excellent candidate agonists and antagonists of the present invention.   Other screening techniques are described, for example, in Science 246: 181-296 (1989). Measure extracellular pH changes caused by receptor activation, such as In a system, cells expressing a polypeptide of the invention (eg, transfected cells). CHO cells). In other examples, potential agonists or Contacting the antagonist with cells expressing the polypeptide of the invention, Measure messenger responses, such as signal transduction, One may determine whether the antagonist or agonist is effective.   Inhibition of tumor growth and certain metastatic tumors using TR2 receptor agonists It can stimulate ligand activity such as tumor necrosis. Using an agonist, for example, T-cell Cell differentiation can also be stimulated, such as vesicle, fibroblast and hematopoietic cell differentiation. T Agonists for the R2 receptor also play a role in host defense against microorganisms. Increased role of TR2 and related diseases (Listeria monocytogen (Listeri a monosytogenes) to protect against infectious diseases and chlamydia. Agonist The adverse effects of ionizing radiation produced during radiotherapy, such as the use of enzymes It can also protect against denaturation, lipid peroxidation and DNA damage.   Using an agonist for the receptor polypeptide of the present invention, It can increase the role of TNF in host defense and protect against related diseases. Agoni Adverse effects of ionizing radiation produced during radiation therapy, such as enzymes It can also protect against elemental denaturation, lipid peroxidation and DNA damage.   By using agonists to increase the rate of lymphocyte proliferation and differentiation, -Mediates viral response, regulates proliferation, mediates immune response, is associated with diseases such as HIV Immune deficiencies can also be treated.   Use of antagonists to the polypeptides of the invention to stimulate tumor growth and Ligand activity can be inhibited, such as necrosis of certain metastatic tumors. You Using gonists, for example, cells such as T-cells, fibroblasts and hematopoietic cell differentiation Sexual differentiation can also be inhibited. Graft-versus-host rejection using antagonists Treats T-cell mediated autoimmune diseases such as allograft rejection, and AIDS You can also. T-cell proliferation is stimulated through the type 2 TNF receptor It is also shown. Therefore, by antagonizing the receptor, Protect T-cell proliferation and treat T-cell mediated autoimmune diseases.   The immunodeficient condition referred to as AIDS is CD4+The number and function of T-lymphocytes This is the second period of decline. From a recent report, CD4+T-cell loss per day Is 3.5 × 107And 2 × 109It is estimated to be between cells (WeiX., Et al. , Nature 373: 117-122 (1995)). CD4 in HIV infection+T-cell reduction One cause is believed to be HIV-induced apoptosis. In fact, HIV- Induced apoptotic cell death is not only in vitro, but more importantly, infection (Ameisen, J.C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Fi nkel, T .; H., and Banda, N.M. K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605-615 (1995); Muro -Cacho, C. A., etal., J. Immunol. 154: 5555-5566 (1995)). Furthermore, Apoto Cis and CD4+T-lymphopenia is observed in different animal models of AIDS Are also closely related (Brunner, T., et al., Nature 373: 441-444 (1995); Gouge on, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)), Apot In these animal models where viral replication has not been AIDS. Is not observed (Gougeon, ML et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553- 563 (1993)). In addition, data is uninfected but primed or activated T-lymphocytes from infected HIV-infected individuals are TNF-family ligands 2 shows that apoptosis undergoes apoptosis after encountering FasL. Die after HIV infection Infection of U937 cells with HIV using a monocytic cell line De novo expression of L occurs and FasL mediates HIV-induced apoptosis (Badley, AD et al., J. Virol. 70: 199-206 (1996)). further , TNF-family ligands are detectable in uninfected macrophages Its expression is up-regulated after HIV infection, resulting in uninfected CD 4+T-lymphocytes resulted in selective death (Badley, AD et al., JV irol. 70: 199-206 (1996)).   As shown in Example 6, the TR2 receptor shown in FIGS. D4+It is expressed in T-lymphocytes and can induce lymphocyte proliferation. therefore, According to the present invention, HIV+A method for treating an individual, comprising administering an agonist of the present invention. Give, CD4+Including increasing the rate of proliferation and differentiation of T-lymphocytes A law is provided. Such agonists include TR2 receptors (eg, TNFα , PMA and DMSO) or induce lymphocyte proliferation and Agents that can enhance the signal of such receptors to induce differentiation are included. Throw Methods and dosages for administration are described in detail below.   For the most part in allograft rejection, the immune system is an environmental antigen The immune system of the recipient animal is only primed by Im not impressed. Tissues from other members of the same species are, for example, viruses and And bacteria are not presented as they are. Allograft rejection In some cases, immunosuppressive controls are designed to prevent the immune system from reaching the effector stage . However, the immunological profile of xenograft rejection is It may resemble disease recurrence rather than response. In case of disease recurrence, the immune system It is already activated, as evidenced by cell destruction. therefore, In disease recurrence, the immune system is already at the effector stage. Antago of the present invention By reducing the rate of TR2-mediated lymphocyte proliferation and differentiation, The immune response to both allografts and xenografts can be suppressed. Such ann Tagonists include the TR2-Fc fusion protein described in Examples 5 and 6. quality Is included. Thus, the present invention further provides a method for suppressing an immune response. .   In addition, TNFα is present in animal species susceptible to diabetes resulting from autoimmunity. Have been shown to protect against diabetes. Porter, A., Tibtech 9: 158-162 (1991 ). Thus, the agonists and antagonists of the present invention may comprise a type I sugar It may be useful in treating autoimmune diseases such as urine.   In addition, the role played by the TR2 receptor in cell proliferation and differentiation is The agonists or antagonists of the present invention are abnormal cells of these receptors It shows that it can be used to treat conditions involving sexual expression. In an environment Thus, TR2 receptors can elicit an inflammatory response, and antagonists block this response. It can be a useful reagent for cleavage. Therefore, TR2 receptor antagonist (Eg, the soluble form of the TR2 receptor; neutralizing antibodies) Useful for the treatment of inflammatory diseases such as osteoarthritis, psoriasis, sepsis and inflammatory bowel disease possible.   Antagonists to the TR2 receptor remain serious clinical conditions, It can be used to treat and / or prevent blood shock. Sepsis Occasionally, rather than directly from pathogens, proteins such as TNF and IL-1 Occurs as a result of an excessive host response mediated by cytoplasmic factors. For example, Lipopo Resaccharides cause the release of TNF and strongly transiently increase their serum concentrations. Add. TNF causes shock and tissue damage when administered in overdose Rub Thus, antagonists to the TR2 receptor may be affected by the effects of TNF And to treat / prevent septic shock. These antagonies Strikes to treat meningococcal bacteremia in children associated with elevated serum levels of TNF Can also be used.   Other diseases that can be treated by antagonists to the TR2 receptor include T Inflammation mediated by NF receptor ligands, bacterial infections, cachexia and Cerebral malaria is included. TR2 receptor antagonists include TNF and the like. Also used to treat inflammation mediated by ligands for the receptor Can be. Administration method   An agonist or antagonist described herein can be administered in vitro, It can be administered to cells expressing the receptor of the invention in vivo or in vivo. A Administration of an "effective amount" of a gonist or antagonist refers to a TNF-family family. A compound in an amount sufficient to enhance or inhibit a cellular response to gand , Polypeptides. In particular, an "effective amount" of an agonist or antagonist Administration refers to an amount useful for enhancing or inhibiting TR2 receptor-mediated activity. To taste. Of course, when enhancing cell proliferation and / or differentiation, An agonist can be administered with a TNF-family ligand. Those skilled in the art The effective amount of a gonist or antagonist can be determined empirically and is in pure form or Can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, ester or prodrug It will be appreciated that Agonist or antagonist, one or more It can be administered as a composition in combination with more than one pharmaceutically acceptable auxiliary.   When administered to human patients, the total daily usage of the compounds and compositions of the present invention will be It will be understood that within the scope of drug decisions will be determined by your physician . The specific therapeutically effective dose level for a particular patient will depend on factors well known in the pharmaceutical arts. Depends on the child.   As a general plan, a parenterally administered TR2 polypeptide The total pharmaceutically effective amount is about 1 μg / day to 10 mg / day / kg of patient weight. Within range, but as noted above, is left to therapeutic discretion. More preferably , At least 0.01 mg / kg / day, most preferably for humans , Between about 0.01 and 1 mg / kg / day for hormones. Continuous throw When given, TR2 polypeptides are typically administered one to four times per day. Or by continuous subcutaneous infusion (e.g., using a mini-pump). The dose is administered at a dose rate of from μg / kg / hour to about 50 μg / kg / hour. Vein bag Solution can also be used.   Pharmaceutical compositions comprising the TR2 receptor polypeptides of the present invention can be administered orally, rectally, Oral, intracisternal, vaginal, intraperitoneal, topical (powder, ointment, drops or transdermal patch Etc.), buccal administration, or oral or nasal spray. `` Pharmaceutical "Acceptable carriers" include non-toxic solid, semisolid or liquid fillers, diluents, encapsulated Chemical compound or any type of formulation aid. As used herein, The term `` oral '' includes intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and Means of administration including injection and infusion.   Having generally described the invention, the invention will be more readily described with reference to the following examples. You will understand. This example is merely illustrative and is intended to limit the invention. is not.                                 Example 1 E. Expression and purification of TR2 in E. coli   In this example, the bacterial expression vector pQE6O is used for bacterial expression. ( QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91 311) pQE is Syrin antibiotic resistance ("Amp"r"), The bacterial origin of replication (" ori "), IP TG-inducible promoter, ribosome binding site ("RBS"), QIAGEN, Inc. (supra) ) -Nitrilo-triacetic acid ("Ni-NTA") affinity sold by 6 encoding histidine residues that enable affinity purification using resin And an appropriate single restriction enzyme cleavage site. These elements are The DNA fragment encoding the polypeptide is Has six His residues covalently attached to the terminus (ie, “6 × His tag”) Aligned to produce a new polypeptide. However, In this example, the polypeptide coding sequence was modified to include six His codons. Translation is disrupted, thus producing a polypeptide without the 6 × His tag. To be introduced.   DN encoding desired portion of TR2 protein lacking a hydrophobic leader sequence A sequence is the amino-terminal sequence of the desired portion of the TR2 protein and the sequence of the deposited construct. PCR oligonucleotide that anneals to the sequence 3 'to the cDNA coding sequence Amplify from the deposited cDNA clone using otide primers. pQE60 Additional nuclei containing restriction sites to facilitate cloning in the Otides are added to each of the 5 'and 3' sequences.   For cloning of the mature protein, the 5 'primer 5 'CGCCCATGGCCCCAGCTCTGCCGTCCT3 '(SEQ ID NO: 14) Of the NcoI restriction site underlined, followed by the mature TR2 sequence in FIGS. 1A-1B Has a sequence containing 18 nucleotides complementary to the amino-terminal coding sequence of the row You. Those skilled in the art will, of course, understand that the protein coding sequence Replace the middle point with the desired portion of the complete protein that is shorter or longer than the mature form. You will recognize that minutes can be amplified.   The 3 'primer is 5 'CGCAAGCTTATTGTGGGGAGCTGCTGGTCCC3 '(distribution Column number 15) HindIII restriction site, underlined, followed by TR2 receptor cells Nucleotide shown in SEQ ID NO: 1A-1B (SEQ ID NO: 1) encoding an ectodomain It has a sequence that contains 18 nucleotides complementary to the 3 'end of the sequence.   The amplified TR2 DNA fragment and the vector pQE were Digest with indIII and then ligate the digested DNA together. TR2 Insertion of the DNA into the restricted pQE vector results in its associated stop code. The TR2 protein coding region, which contains the IPTG-inducible promoter From downstream and in the frame with the starting AUG. Stop codon to connect Prevents translation of the six histidine codons downstream of the insertion point.   In the ligation mixture, competent e. E. coli cells were isolated from Sambrook et al. , Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. ; Cold Spring Harbor Lab oratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) Transform using an appropriate method. Lac repressor expresses Kanama Isin resistance ("Kamr") Containing multiple copies of plasmid pREP4 E. E. coli strain M15 / rep4 was used to carry out the examples described herein. Used. This strain, which is one of many suitable for expressing the TR2 protein, , QIAGEN, Inc. (Supra). Transformants, Ampicie Identified by the ability to grow on LB plates in the presence of phosphorus and kanamycin You. Plasmid DNA was isolated from resistant colonies and cloned. Confirmation was confirmed by restriction analysis, PCR and DNA sequencing.   Clones containing the desired constructs were cloned into ampicillin (100 μg / ml) and Overnight (“O / O”) in liquid culture of LB medium containing both mycin (25 μg / ml). n ") grow. Using O / N cultures, a dilution of about 1:25 to 1: 250 Ingest into a fresh culture. Cells were treated with an optical density at 600 nm ("OD600") of 0. Grow to between 4 and 0.6. Isopropyl-β-D-thiogalactopy Lanoside ("IPTG") was then added to a final concentration of 1 mM and the lacI Inactivation of the lac repressor promotes lac repressor-sensitive promoter. Induces a photo. Subsequently, the cells are cultured for a further 3-4 hours. Then centrifuge the cells Collect by separation.   The cells were then agitated in 6M guanidine-HCl, pH 8, at 4 ° C. for 3-4 hours. Mix. Cell debris was removed by centrifugation and the supernatant containing TR2 was washed with 200 mM N Dialyze against 50 mM Na-acetate buffer, pH 6, containing aCl. Separately, The protein was washed with 500 mM NaCl, 20% glycerol containing a protease inhibitor. Dialysis against 25 mM Tris / HCl, pH 7.4, Can be reproduced. After reconstitution, ion exchange proteins, hydrophobic interactions and size It can be purified by exclusion chromatography. Alternatively, use an antibody column or other Pure TR2 protein can be obtained using an initial chromatography step it can. Store purified protein at 4 ° C or freeze at -80 ° C.                                 Example 2 Example 2 (a): Soluble flag of TR2 protein in baculovirus expression system Cloning and expression of fragments   In this example, the plasmid shuttle vector pA2GP was used to 1A-1B lacking the binding secretory signal (leader) sequence. Cloned DNA encoding mature extracellular domain of sceptor protein Was inserted into the baculovirus. This protein is And Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vector s and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental St ation Bulltein No. Expression using standard methods as described in 1555 (1987) I let it. This expression vector was obtained from Autographa califonica. ifornica) Strong polyhedrin promoter of nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) -Followed by a secretory signal peptide of the baculovirus gp67 protein (Leader) and conventional restrictions such as BamHI, XbaI and Asp718 Including the site. Efficient use of Simian virus 40 ("SV40") polyadenylation sites Used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant virus, The Smids, in the same direction, under the control of the weak Drosophila promoter, e. Stiff Beta-galactosidase gene, followed by polyhedrin gene Contains an adenylation signal. Cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA Place the viral sequences on either side of the inserted gene and clone Create a viable virus that expresses the isolated polynucleotide.   Construct is properly located for transcription, translation secretion, etc., including the signal peptide As long as it is in the frame of the AUG, if necessary. For easy recognition, pAc373, pVL941 and pAcIM1 Any number of other baculovirus vectors can be used in place of the above vectors. Can be. Such vectors are described, for example, in Luckow et al., Virology 170: 31-39. It is described in.   TR2 receptor protein in the deposited clone (ATCC accession number 97059) The mature mature extracellular domain (amino acids 37-200 shown in FIGS. 1A-1B) is essentially Correspond to the relevant 5 'and 3' sequences of the gene. Amplification was performed using PCR oligonucleotide primers. The above 5 'primer Is 5 'CGCGGATCCCGGAGCCCCCTGCTAC3 '(SEQ ID NO: 16) BamHI restriction enzyme site, underlined, Kozak, M., J. Am. Mol. Biol. 196: 947 Efficient sig for translation initiation in eukaryotic cells as described in -950 (1987) Null, followed by TR2, beginning at nucleotide 354, shown in FIGS. 1A-1B. It has a sequence that contains 15 bases of the coding sequence of the protein. 3 'primer ー is 5 'CGCGGTACCATTGTGGGAGCTGCTGGTCCC3 ’(SEQ ID NO: 17) Asp718 restriction site underlined, followed by the code of FIGS. 1A-1B A sequence containing 17 nucleotides complementary to the signaling sequence.   The amplified fragment was prepared using a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) was used to isolate from a 1% agarose gel. Then fragment the Bam Digested with HI and Asp718 and purified on a 1% agarose gel. This hula The fragment is referred to herein as “F1”.   The plasmid was digested with the restriction enzymes BamHI and Asp718 and the calf intestine was digested. Dephosphorylated using phosphatase. The DNA was then transferred to a commercial kit ("Genecl ean "BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). This vector DNA is referred to herein as "VI".   Fragment F1 and dephosphorylated plasmid V1 were ligated with T4 DNA ligase. And ligated together. E. coli HB101 cells in ligation mixture Transformed and plated on culture plates. XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) and other suitable e. E. coli host No. Bacteria containing plasmids with human TR2 sequences were identified using PCR . In this PCR, the primer and second used for amplifying the gene were used. One of the primers is from within the vector and has a TR2 gene fragment Only bacterial colonies containing were shown to show DNA amplification. Cloned The sequence of the fragment was confirmed by DNA sequencing. The plasmid is described herein as Is referred to as "pBacTR2-T".   Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987) 5 μg of pBacTR2-T was replaced with 1.0 μg of Commercially available linear baculovirus DNA ("BaculoGoldTMbaculovirus DNA ”, Pharming en, San Diego, CA.). 1μg BaculoGoldTMC Irs DNA and 5 μg of plasmid pBacTR2-T were added to 50 μl of serum Microphones containing Grace's medium without media (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) Mixing in sterile wells of a rotiter plate. Then, 10 μl of Lipofect Tin + 90 μl Grace's medium is added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. I was vate. The transfection mixture was then added to 1 ml of serum free Sf9 insect cells seeded in 35 mm tissue culture plates containing Grace's medium (ATCC CRL 1711). Shake the plate back and forth to add a new The added solutions were mixed. The plates were then incubated for 5 hours at 27 ° C. 5 hours later Remove the transfection solution from the plate and include 10% fetal calf serum One ml of Grace's insect medium was added. Return the plate to the incubator and allow C. for 4 days.   Four days later, supernatants are collected and as described by Summers and Smith (supra). A plaque assay was performed. "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaihersb urg), a gal-expressing gel forming a blue stained plaque was obtained. Facilitated identification and isolation of loans. (This type of “plaque assay” Detailed description is insects distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg, p9-10 It can be found in user guides for cell culture and baculovirology. Suitable After appropriate incubation, the blue stained plaque is transferred to a micropipettor (eg, Eppendorf) chips. Then, agar containing the recombinant virus was added for 20 minutes. Resuspend in a microcentrifuge tube containing 0 μl Grace's medium, Sf9 cells seeded in 35 mm dishes were infected with the suspension containing the urovirus. I let you. Four days later, the supernatants of these culture dishes were collected and then stored at 4 ° C. . The recombinant virus is called V-TR2-T.   To confirm the expression of the used gene, Sf9 cells were heat-inactivated with 10% FBS. Grace's medium was grown. Cells were recombined at a multiplicity of infection ("MOI") of 2 Baculovirus V-TR2-T. After 6 hours, remove the medium and SF900II medium excluding thionine and cysteine (Life Technologies Inc. , Available from Rockville, MD). 42 hours later, 5 μCi35S- Methionine and 5 μCi35Add S-cysteine (available from Amersham) The protein was radiolabeled. Incubate the cells for another 16 hours, then , Collected by centrifugation. SD in supernatant and intracellular protein The analysis was performed by S-PAGE followed by autoradiography. Purified protein Microsequencing of the amino-terminal amino acid sequence of Determine the end sequence of the protein network and the breakpoint and length of the secretory signal peptide. Specified. Example 2 (b): Cloning of TR2 protein in baculovirus expression system And expression   Cloning of the truncated version of the TR2 receptor described in Example 2 (a) 1A-1B (SEQ ID NO: 2) as well as A recombinant baculovirus expressing a sceptor protein was created.   In this example, the plasmid shuttle vector pA2 was used to bind naturally. Encoding a complete protein, including the secretory signal (leader) sequence Insert the cloned DNA into baculovirus to generate mature TR2 protein It was revealed. Another feature of the pA2 vector is the pA2 vector used in Example 2 (a). As described for the GP vector.   The AUG start codon shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 2) Encoding full-length TR2 protein in the deposited clone containing the leader sequence The sequences were converted to PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene. Amplification was performed using an immer. The 5 'primer is 5 'GCGCGGATCCACCATGGAGGCCTCCTGGAGACTGG 3 '(SEQ ID NO: 18) BamHI restriction enzyme site, underlined, Kozak, M., J. Am. Mol. Biol. 196: 947 -950 Efficient signal for translation initiation in eukaryotic cells as described in (1987) Followed by the complete TR2, beginning with the AUG start codon, shown in FIGS. 1A-1B. It has a sequence containing 21 bases of the protein sequence. The 3 'primer is 5 'GCGCGGTACCTCTACCCCAGCAGGGGCGCCA3 '( (SEQ ID NO: 19) Asp718 restriction site underlined, followed by non-coding of FIGS. 1A-1B Has a sequence that includes 21 nucleotides complementary to the signaling sequence.   The amplified fragment was isolated and restricted as described in Example 2 (a). The plasmid pBacTR2 was prepared.   5 μg of pBacTR2 was replaced with 1 μg of BaculoGoldTM(Pharmingen) virus DN A and 10 μl of LipofectinTM(Life Technologies, Inc.) Transfected in a volume of 200 μl serum-free medium. After infection with primary virus (pi) Collected in 4-5 days and used for plaque assay. Plaque purified virus Amplified and frozen as described in Example 2 (a).   To radiolabel the expressed protein, Sf9 cells were grown at 0.5 x 106 Seed in a 12-well dish with 2.0 ml of cell suspension containing cells / ml for 4 hours Attached. Using recombinant baculovirus, infect cells at MOI of 1-2 Was. After 4 hours, the medium was replaced with 1.0 ml of serum without methionine and cysteine. The medium was replaced with a non-containing medium (-Met / -Cys). Three days after infection, the culture medium was changed to [35S ]-Met and [35S] -Cys, each containing 2 μCi, 0.5 ml of -M et / -Cys. The cells were labeled for 16 hours, after which the medium was removed. And clarified by centrifugation (supernatant). Cells are lysed in 0.2 ml lysis buffer (20 mM  HEPES, pH 7.9; 130 mM NaCl; 0.2 mM EDTA; Add 5 mM DTT and 0.5% vol / vol NP-40) and dissolve in the dish. And then dH to 1.0 ml.TwoDiluted with O (cell extract). 30 μl Each of the supernatant and the cell extract was separated by 15% SDS-PAGE. Tan The protein gel is stained, destained, amplified, dried and autoradiographed. Attached. The labeled band corresponding to the recombinant protein is 16-72 after exposure. time Later visualized.                                 Example 3 Cloning and expression of TR2 in mammalian cells   A typical mammalian expression vector is a promoter that mediates the initiation of mRNA transcription. Elements, protein coding sequences, and transcription termination and transcript Contains signals required for polyadenylation. Further elements include enhancers , Kozak sequence and donor and acceptor part of RNA splicing Adjacent intervening sequences are included. Early and late promoters from SV40 Long, eg, from retroviruses such as PSV, HTLVI, HIVI, etc. ・ Terminal repeat (LTRS) and cytomegalovirus (CMV) Very efficient transcription can be carried out by using the early promoter of (3). I However, cellular elements can also be used (eg, human activators). Promoter). Suitable expression vectors used to carry out the invention include, for example, For example, PSVL and PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat ( ATCC37152), pSV2dhfr (ATCC37146) and pBC Vectors such as 12MI (ATCC 67019) are included. Because it uses Human host cells include He1a293, H9 and Jurkat cells. , Mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1, Quail QC1-3 cells, mouse L cells and Chinese hamster ovaries (CH O) cells are included.   Alternatively, the gene can be transferred to a stable cell line containing the gene integrated into the chromosome. Can be expressed. Choice of dhfr, gpt, neomycin or hygromycin Transfected by transfection with marker Identification and isolation of the cells.   Amplify transfected genes and produce large amounts of encoded protein It can also be expressed. DHFR (dihydrofolate reductase) marker Can be used to establish cell lines that carry hundreds or thousands of copies of the gene of interest. It is for. Another useful selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al., Bio / Tech. nology 10: 169-175 (1992)). Selective culture of mammalian cells using these markers Grow in the ground and select cells with the highest resistance. These cell lines are Includes amplified genes integrated in chromosomes. Chinese Hamster Ovary (CHO ) And NSO cells are often used for production of proteins.   Expression vectors pC1 and pC4 are strong promoters of Rous sarcoma virus -(LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985) , March)) and fragments of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-). 530 (1985)). For example, restriction enzyme cleavage sites, BamHI, Xbal and A The multiple cloning site with sp718 allows cloning of the gene of interest. Make it easier. The vector additionally contains the 3 'gene of the rat preproinsulin gene. Includes anthrone, polyadenylation and termination signals. Example 3 (a): Cloning and expression in COS cells   Expression plasmid, pTR2HA, cDNA encoding TR2, expression vector -PcDNAI / Amp or pcDNAIII (obtained from Invitrogen, Inc.) (Possible) by cloning.   The expression vector pcDNAI / Amp is as follows: Coli and other prokaryotic cells E. Effective for proliferation in E. coli origin of replication; (2) Selection of plasmid-containing prokaryotic cells (3) SV40 for growth in eukaryotic cells Origin of replication; (4) CMV promoter, polylinker, SV40 intron; (5) c DNA is properly placed under the control of CMV promoter expression and polylinker restriction Site operably linked to SV40 intron and polyadenylation signal Codons encoding the hemagglutinin fragment Followed by a stop codon and a polyadenylation signal. HA tag is Wils influenza hemagglutinin tan described by on et al., Cell 37: 767 (1984). Corresponds to an epitope derived from protein. Fusion of HA tag to target protein Detection of recombinant proteins using antibodies that recognize the HA epitope and Collection becomes easy. pcDNAIII additionally contains a selectable neomycin marker. Including cars.   The DNA fragment encoding TR2 is ligated into the polylinker region of the vector. Roaming and recombinant protein expression is regulated by the CMV promoter To do. The plasmid construction method is as follows. E. TR in coli 2 as described above for the construction of the vector for expression of the deposited clone. The TR2 cDNA is amplified using primers containing convenient restriction sites. This embodiment Suitable primers for use in include the following: BamH underlined I site, Kozak sequence, AUG start codon and complete TR2 5 ' The 5 'primer containing the six additional codons of the signaling region has the following sequence: 5 'GCGCGGATCCACCATGGAGGCCTCCTGGAGACTGG 3 '(SEQ ID NO: 20) Having. Underlined XbaI site, stop codon, HA tag, and 3 ' A 3 'primer containing 19 base pairs of the coding sequence has the following sequence (at the 3' end): 5 'GCGCCTTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTA TGGGTAGGTGGTTTGGGCTCCTCCC3 '(SEQ ID NO: 21) Having.   PCR amplified DNA fragment and vector, pcDNAI / Amp Digest with BamHI and XbaI and then ligate. Ligation blend The compound is e. E. coli SURE strain (Stratagene Coloning Systems, 11099 North Tor) rey Pines Road, available from La Jolla, CA 92037) The transformed culture is plated on an ampicillin medium plate and then plated. Incubate them to grow ampicillin resistant colonies. Plasmid D NA was isolated from the resistant colonies and the presence of the TR2-coding fragment was determined. And by restriction analysis or other means.   For expression of recombinant TR2, see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: aL. aboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) using DEAE-DEXTRAN, as described above. Transfect COS cells with the vector. Cells are transformed into TR2 by vector Incubate under conditions for expression.   Expression of the TR2-HA fusion protein is determined by, for example, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed .; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S Radiolabeling and immunization using methods described in Spring Harbor, New York (1988). Detected by sedimentation. For this purpose, two days after transfection, the cells To35Labeling by incubation for 8 hours in medium containing S-cysteine I do. Wilson et al. Cells and media are harvested as described in (cited above). Harvest, wash cells, detergent-containing RIPA buffer: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH Dissolve at 7.5. Using an HA-specific monoclonal antibody, cell lysates and And precipitate the protein from the culture medium. Then, the precipitated protein was subjected to SDS. -Analyze by PAGE and autoradiography. Expected size The expression product is found in the cell lysate, which is not found in the negative control. Example 3 (b): Cloning and expression in CHO cells   The vector pC4 is used for the expression of the TR2 protein. Plasmid pC4 contains Derivative of plasmid pSV2-dhfr (ATCC accession number 37146) . The plasmid contains the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter. including. Dihydrofolate activity transfected with these plasmids Hamster ovary-or other cells-lacking chemotherapeutic methotrex Cells in selective medium containing Sate (Alpha minus MEM, Life Technologies) Can be selected by growing. Cells resistant to methotrexate (MTX) Amplification of the DHFR gene in E. coli is well documented (eg, Alt. F. . W., Kellems, R.A. M., Bertino, J .; R., and Schimke, R .; T., 1978, J.A. Biol . Chem. 253: 1357-1370, Hamlin, J .; L. and Ma, C.E. 1990, Biochem. et Biophy s. Acta, 1097: 107-143, Page, M. J. and Sydenham, M .; A. 1991, Biotechnolo gy 9: 61-68 See). Cells proliferating at high concentrations of MTX will show the results of DHFR gene amplification and Establishes drug resistance by overproducing the target enzyme, DHFR I do. When the second gene is linked to the DHFR gene, this is usually increased together. Broad and overexpressed. Using this method, more than 1000 copies of the amplified gene It is known in the art that a carrying cell line can be established. Then methot When rexate is recovered, it integrates into one or more chromosomes of the host cell. A cell line containing the amplified gene is obtained.   Plasmid pC4 contains the Rous sarcoma virus long plasmid for expression of the gene of interest. ・ Terminal repeat (LTR) strong promoter (Cullen et al., Mole) cular and Cellular Biology, 438-447 (1985, March)) and human cytomegaloino Fragment (B) isolated from the immediate early gene enhancer of oshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)). Downstream of the promoter is Ba mHI, XbaI and Asp718 restriction enzyme cleavage sites, Only possible. Behind these coding sequences, plasmids are Contains the 3 'intron and polyadenylation site of the reproinsulin gene. For example, human β-actin promoter, SV40 early or late promoter Or long term from other retroviruses such as HIV and HTLVI Other highly efficient promoters, such as terminal repeats, are also used for expression. Can be Clontech's Tet-Off and Tet-On gene expression systems and TR2 protein in a regulated manner in mammalian cells using and similar systems Quality (Gossen, M., & Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci, USA  89: 5547-5551). For polyadenylation of mRNA, for example, human growth hormone Alternatively, other signals derived from the globin gene can be used. Group in chromosome A stable cell line carrying the incorporated gene of interest is identified as gpt, G418 or human. Select by transfection with a selectable marker such as glomycin. Can also be. For example, G418 and methotrexate, more than one initially It is advantageous to use a selection marker.   Plasmid pC4 was ligated with the restriction enzymes BamHI and BamHI by methods known in the art. And Asp718, followed by dephosphorylation using calf intestinal phosphatase. I do. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.   The DNA sequence encoding the complete TR2 protein, including the leader sequence, is Using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the And amplify. The 5 'primer is 5 'GCGCGGATCCACCATGGAGGCCTCCTGGAGACTGG 3 '(SEQ ID NO: 22) BamHI restriction enzyme site underlined, followed by Kozak, M., J. Mol. Biol. 96: 947-950 (1987), effects for translation initiation in eukaryotic cells Signal and the TR2 protein shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) It has a sequence containing 21 bases of the coding sequence. The 3 'primer is 5' GCGCGGTACC TCTACCCCAGCAGGGGCGCCA3 '(SEQ ID NO: 1 9) Of the Asp718 restriction site underlined, followed by FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: It contains 21 nucleotides complementary to the non-coding sequence of the TR2 gene shown in 1). It has an array.   The amplified fragment was digested with the endonucleases BamHI and Asp718. And then purified on a 1% agarose gel. The isolated fragments and The dephosphorylated vector is then ligated using T4 DNA ligase. E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells are then transformed For example, the fragment inserted into plasmid pC4 using restriction enzyme analysis. Identify bacteria containing   Transfer of Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR gene Used for action. 5 μg of the expression plasmid pC4 was transferred to Lipofectin (Felgner).  et al., supra) with 0.5 μg of plasmid pSV2-neo. Transfect. Plasmid pSV2-neo contains the predominant selectable marker, G4 Tn5 encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including Contains the neo gene. Cells were alpha-minus containing 1 mg / ml G418 Seed in MEM. Two days later, the cells are trypsinized and 10, 25 or 50 ng / Min Methotrexate + 1 mg / ml G418 Seed into EM hybridoma cloning plates (Greiner, Germany). 10 〜14 days later, single clones were trypsinized and then placed in 6-well Petri dishes. Or 10 ml flasks with different concentrations of methotrexate (50 nM, 100 (nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Maximum concentration of met Clones that grow in trexate are then treated with higher concentrations of methotrexate New 6-well plates containing (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM) Transfer to Clones growing at a concentration of 100-200 μM using the same method are obtained. Repeat until Expression of the desired gene product is determined, for example, by SDS-PAGE and And Western blot or by reverse phase HPLC analysis.                                 Example 4 Tissue distribution of TR2 mRNA expression   Above all, using methods described by Sambrook et al. Lot analysis is performed to examine TR2 gene expression in human tissues. TR2 tampa A cDNA probe containing the entire nucleotide sequence of the protein (SEQ ID NO: 1) was prepared. According to the instructions of the rediprimeTMDNA labeling system (Amersham Life Scienc Using e),32Label with P. After labeling, the probe is replaced with the manufacturer's protocol number P According to T1200-1, CHROMA SPIN-100TMColumn (Colntech Laboratori es, Inc.). The purified labeled probe was then used for TR2 mRNA Used to examine various human tissues.   Multiple tissues containing various human tissues (H) or human immune system tissues (IM) Zan (MTN) blots were obtained from Clonthech and were provided with the manufacturer's protocol number P ExpressHyb according to T1190-1TMHybridization solution (Clont ech) and probe with a labeled probe. Subsequent to hybridization and washing The blot was fixed, exposed to film overnight at -70 ° C, and subjected to standard procedures. Therefore establish the film.                                 Example 5 Example 5 (a): TR2-Fc (TR2-Ig fusion protein) and truncated Expression and purification of TR2   Translated putative transmembrane domain of TR2 receptor into non-polar Goldman et al. To identify ear helices. (Ann. Rev. of Biophys . Biophys. Chem. 15: 321-353 (1986)). Push Above this transmembrane domain, encoding the constant leader peptide and extracellular domain The flow region was selected for production of the Fc fusion protein. BglII site (single Underlined), Factor Xa protease site and Asp718I site (double underlined) ) At the 3 'end with the corresponding coding region from HTXBS40 Primers were designed and subjected to PCR. 18 nucleotides of TR2 coding sequence This primer pair (Ofide 35-mer: 5 'CAGGAATTCGCAGCCATGGAGGCCTCCTGGAGACT G3 '(SEQ ID NO: 23), reverse primer 53-mer: GCCTTCGTCACCAGCCAGC3 '(SEQ ID NO: 24)) PCR yielded one band of the expected size. This is CO Cloning into SFclink yielded the TR2-Fclink plasmid. The PCR product was digested with EcoRI and Asp718I and the COSFclink Raismid (Johansen, et al., J. Biol. Chem. 270: 9459-9471 (1995)). Then, TR2-Fclink was prepared.   COS cells were transiently transfected with TR2-Fclink and obtained. The supernatant was immunoprecipitated with protein A agarose. Using goat anti-human Fc antibody Western blot analysis of immunoprecipitates revealed that glycosylated TR2-Fc A strong band consistent with the expected size (greater than 47.5 kD) Was done. COS transfection was performed for 15 L-hour, and the obtained supernatant was purified. (See below). Mice are immunized with the purified protein and then mAb production Was injected for DNA.   Transfect CHO cells with TR2-Fclink to create stable cell lines Done. Five lines were selected for extension by dot blot analysis and shake I put it in Ko. The system showing the highest level of TR2-Fc protein expression was Identified by blot analysis. TR2-Fc protein purified from the supernatant of this system Protein as intact protein or Factor Xa cleavage and biotinylation At any later time, they were used for cell binding studies by flow cytometry (see below).   Clone HTXBS40 contains the sequence shown in FIGS. 1A-1B (SEQ ID NO: 1) and HT XBS40 is guanine at nucleotide 314, thymine at nucleotide 386, An allelic variant of TR2 that differs in that it contains cytosine in nucleotide 627. You.   A plasmid suitable for expression of the extracellular domain of TR2 was constructed as follows, Mice were immunized for generation of TR2 mAb. The Fc fragment was converted to BglII. / XbaI digestion to remove from TR2-Fclink and abruptly using Klenow The outlet was filled in and the blunt ends of the plasmid were ligated again. The resulting frame The shift is immediately after the amino acid originally introduced into TR2-Fclink. Later, a stop codon was introduced by the addition of a BglII site. Therefore, T The C-terminus of the extracellular domain of R2 is included in this construct (TR2exlink). Followed by only two amino acids (RS). Example 5 (b): Purification of TR2-Fc from CHO EIA conditioned medium followed by T Cleavage and biotinylation of R2 Assay   Product purity through purification is determined by running 15% L under reducing and non-reducing conditions. Monitored on aemmli SDS-PAGE gel. Protein concentration A280 , An absorbance of 0.7 for the receptor, calculated from the sequence, An absorbance of 1.28 was assumed for mela. The absorbance was confirmed by AAA. Protein G chromatography of TR2-Fc fusion protein   All steps described below were performed at 4 ° C. 15 L of CHO conditioned medium (C M) (recovered in cell culture and then passed through a 0.2μ filter) at 199 cm / hr The sample was applied to a 5 × 10 cm column of protein G at a line flow rate. Remove the column from the sump Wash with 100 mM glycine, pH 2.5 before applying 20 mM sodium phosphate Equilibrated with lium, 150 mM sodium chloride, pH 7. After loading the CM, The ram was loaded with 5 column volumes of 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, Washed at pH 7 and eluted with 100 mM glycine, pH 2.5. 435 ml of solution The effluent was immediately neutralized with 3M Tris, pH 8.5 and applied to a 0.2μ filter. . A280Based on the extinction coefficient 1.28, 65 mg of protein was 0.15 mg / m l. Concentration / dialysis   385 ml of the Protein G eluate was added to an Amicon stirring cell fitted with a 30K membrane. In the reactor to a final concentration of 1.7 to 34 ml. Allow concentrate to buffer Was analyzed. Factor Xa cleavage and purification to generate free receptors   Add 6 ml (10.2 mg) of TR2-Fc to 50 μg of Factor Xa, The e: s ratio was 1: 200. The mixture was incubated overnight at 4 ° C. Protein G column chromatography of free TR2 receptor   A 1 ml column of Protein G was placed in a disposable column for 20 m using gravity flow. Equilibrated with M sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 6.5. Off The disrupted receptor is passed through the column three times, and then the column is280Absorbance can be seen 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 6 . Washed with 5. Elute the column with 2.5 ml of 100 mM glycine, pH 2.5 And neutralized with 83 μl of 3M Tris, pH 8.5. TR2 is the unbound flag Eluted during the reaction. concentrated   The unbound fraction from the approximately 12 ml Protein G column was centrifuged About 1 ml in a con10K cell (Amicon), A2803.5m according to the extinction coefficient 0.7 Concentrated to a final concentration estimated to be g / ml. Mono S column chromatography   Dilute the concentrated sample to 5 ml with 20 mM sodium phosphate, pH 6, 0.5x5cm Mono S column equilibrated with 20mM sodium phosphate, pH6 At a linear flow rate of 300 cm / h. Column is 20 mM sodium phosphate, p Wash with H6, 20 column volumes of 20 mM sodium phosphate, pH 6-20 m Eluted with a linear gradient of M sodium phosphate, 1M sodium chloride, pH6. TR Two proteins eluted in the unbound fraction. Concentration / dialysis   3 ml of the unbound fraction from the Mono S column was centricon 10 Concentrate to 1 ml as above using a K cell and add 20 mM sodium phosphate, 15 mM Dialysis was performed against 0 mM sodium chloride, pH 7. The concentration after dialysis is 2.1 mg / Ml. Biotinylation   0.5 mg of 2.1 mg / ml TR2 was added to 100 mM borate, pH 8.5. Dialyzed against. A 20-fold molar excess of NHS-LC biotin was added and the mixture was It was left at 4 ° C. on a rotator overnight. Transfer biotinylated TR2 to 20 mM sodium phosphate Dialysis against 150 mM sodium chloride, pH 7, sterile filtered, and -70. Stored at ° C. Biotinylation probed with streptavidin HRP Shown on stump blots and subsequently established with ECL reagent.                                 Example 6 Membrane-bound form of TR2 receptor induces TNFR to induce lymphocyte proliferation and differentiation It is.   Tumor necrosis factor (TNFR) / nerve growth factor receptor (NGFR) The members of the family are cis-comprising about 30-40 amino acids of the extracellular portion of the molecule. Characterized by the presence of three to six repeats of the tein-rich motif (Malle tt, S.M. and Barclay, A. N., Immunol. Today 12: 220 (1991)). TNFR-I The crystal structure shows that the cysteine-rich motif (TNFR domain) Consists of three elongated chains of residues connected by a twisted ladder (Banner, DW et al., Cell 73: 431 (1993)). These receptions Pters have deletions of cysteine residues and serine, threonine and proline Characterized by a high percentage, likely glycosylated with O-linked sugars And a hinge-like region immediately adjacent to the transmembrane domain. Cytoplasm of these molecules Portions have limited sequence homology-justification for different cellular signals. Deaf knowledge is shown. To date, members identified from human cells include: , CD40 (Stamenkovic, I. et al., EMBO J. 8: 1403 (1989)), 4-1BB (Kwo n, B. S. and Weissman, S.M. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963 (1989)) OX-40 (Mallett, S. et al., EMBO J. 9: 1063 (1990)), TNFR-I (Loe tscher, H .; et al., Cell 61: 351 (1990); J. et al., Cell 61: 361 (1 990)), TNFR-II (Smith, CA et al., Science 248: 1019 (1990)), CD 27 (Van Lier, RA et al., J. Immunol. 139: 1589 (1987)), Fas (Itoh, N. . et al., Cell 66: 233 (1991)), NGFR (Johnson, D. et al., Cell 47: 545 (1) 986)), CD30 (Durkop, H. et al., Cell 68: 421 (1992)) and LTBR (Bean s, M. et al., Genomics 16: 214 (1993)). SFV-T2 (Smith, CA, et al., Science 248: 1019 (1990)), Va53 (How ard, S .; T. et al., Virology 180: 633 (1991)), G4RG (Hu, F.-Q. et al., V irology 204: 343 (1994)) and crmB (Smith, GL, J. Gen. Viol. 74: 1725). (1993)) and other viral open reading frames encoding a soluble TNFR. Lame too It has also been identified.   Recent intensive studies have shown that these molecules can be used for cell proliferation (Banchereau, J. et al. , Science 251: 70 (1991); E. et al., J. Amer. Immunol. 150: 771 (1993); B aum, P .; R. et al., EMBO J .; 13: 3992 (1994)), cell survival (Grass, H.-J. et al. , Blood 83: 2045 (1994); Torcia, M .; et al., Cell 85: 345-356 (1996)) and Cell death (Tartaglia, LA et al., Cell 74: 845 (1993); Gillette-Ferguson, I. an d Sidman, C.E. L., Eur. J. Immunol. 24: 1181 (1994); Krammer, P .; H. et al., C urr. Opin. Immunol. 6: 279 (1994)). e, R. J., Curr. Opin. Immunol. 6: 407 (1994); Smith, C.E. A. et al., Cell 75: 959 (1994)).   Their biological importance and the members of the various members of this superfamily. Thus, we anticipated the presence of additional members of the superfamily. E By examining the ST-database, we found that the TNFR superfamily A new member of Lee was identified. Here, about the initial analysis of a molecule called TR2, Report.                              Materials and methods Identification and cloning of new members of the TNFR superfamily   Expressed sequence tags (ESTs) obtained from over 500 different cDNA libraries cDNA database (Adams, MD et al., Science 252: 1651 (1991); Adams, M. D. et al., Nature 355: 632 (1992)) by blastn and tblastn. Algorithm (Altschul, SF et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). The sequence similarity with the cysteine-rich motif of the TNFR superfamily And screened. Amino acid levels in human T cell line libraries One EST (HTISB5) showing significant identity to TNFR-II 2-ATCC accession number 97059) was identified. Using this sequence, human lymph Spherical 5'-RACE-ready cDNA (Clontech, PT1155-1. Cat. # 7301- Using 1), delete by RACE (rapid amplification of cDNA ends) The 5 'end to be cloned was cloned. This sequence contains four additional ESTs (HTO BH42, HTOAU65, HLHA49 and HTXBS40) . By complete sequencing of these and other cDNAs, these Contain identical open reading frames homologous to the parfamily And these were named TR2. Of several other ESTs and cDNAs Analysis showed that some of the cDNAs were open readings identified above. Various partially spliced, with additional sequences inserted into the frame It was shown to represent mRNA. cell   The bone marrow and B-cell lines studied exhibit cell types at different stages of the differentiation pathway . KG1a and PLB985 (Koeffler, H. et al., Blood 56: 265 (1980); Tuc ker, K. et al., Blood 70: 372 (1987)), Phillip Koeffler (UCLA School of M edicine), BJA-B is described in Z. Obtained from Jonak (SmithKline Beecham) and A stromal cell line, TF274, which is characteristic of osteoblasts, is used in healthy male donors. Made from bone marrow (Tan & Jonak, not published). All other cell lines Obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD). Monocytes are peripheral Prepared by different centrifugation of blood mononuclear cells (PBMC) and attachment to tissue culture dishes did. CD19+, CD4+And CD8+With immunomagnetic beads (Dynal, Lake Suc cess, NY). Clonetic endothelial cells from human coronary artery s (Clonetics, CA). RNA and DNA blot hybridization   Adult tissue total RNA can be purchased from Clontech (Palo Alto, CA) or TriReagent ( Primary cells and cell lines at Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) Extracted. Five to 7.5 μg of total RNA was described as described (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)), 1% agar containing formamide Fractionated in Loose gel, Zeta-probe nylon membrane (Biorad, Hercules, CA) Were quantitatively transferred by vacuum-blotting. Blot,32P-labeled The XhoI / EcoRI fragment of TR2 or the OX-40 probe Hybridized, hybridized, washed under stringent conditions, X-ray Exposure to film.   High molecular weight human DNA is digested with various restriction enzymes and placed in a 0.8% agarose gel. Fractionated. Denature DNA, neutralize, transfer to nylon membrane,32P-labeled TR- 2 or its mutant cDNA. In situ hybridization and FISH detection   In situ hybridization and F at position TR2 in human chromosome ISH detection was described previously (Heng, HHQ et al., Proc. Natl. . Acad. Sci. USA 89: 9509 (1992); Heng, H .; H. Q. et al., Human Molecular Ge netics 3:61 (1994)). FISH signal and DAPI banding pattern The chromosome bands and FISH mapping were recorded separately by taking pictures. Assignment of the FISH signal to the DAPI banded chromosome (Heng, HHQ and Tsui, L-C., Chromosama, 102: 325 (1993)). Production of recombinant TR2-Fc fusion protein   TR2 containing the entire putative open reading frame of the extracellular domain 5 ′ portion was subjected to the polymerase chain reaction (Saiki, RK et al., Science 239: 487 (198 Amplified by 8)). Forward ply for accurate cloning HindIII site on the 5 'end of the mer, and the 5' end of the reverse primer A BglII site was created above. Human IgG1The Fc portion of ARH-77 (AT CC) PCR-amplified from cellular RNA, pGem7 vector (Promega) Sma Cloned into the I site. Hinge, CHTwoAnd CHThreeF containing domain sequence The c fragment has a BglII site at its 5 'end and an XhoI site at its 3' end. Have a rank. The HindIII-BglII fragment of the TR2 cDNA was Ig G1Inserted upstream of Fc, in-frame fusion was confirmed by sequencing. TR2 Digestion of the plasmid with HindIII-XhoI And cloned into the pcDNA3 expression plasmid.   The TR2-Fc plasmid linearized with PvuI was subjected to calcium phosphate coprecipitation. And transferred into NIH3T3. After selection in G418 at 400 μg / ml, Mycin-resistant colonies were picked and expanded. Anti-human IgG1ELI using SA and32Northern analysis using the P-labeled TR2 probe was performed on the supernatant. It was used to select clones that produced high levels of TR2-Fc. A few In this experiment, it was produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. TR2-Fc, which was manipulated slightly differently, was used. TR2-Fc to protein G Purified by chromatography, the N-terminal of the TR2-Fc fusion protein The amino acid sequence was determined by an automatic peptide sequencer (ABI). TR2-F c was used to produce a polyclonal rabbit anti-TR2 antibody. Blocking MLA-mediated PBMC proliferation   PBMC were obtained from three healthy adult volunteers at 400 × g for 30 minutes. Isolated by icoll gradient centrifugation. Collect PBMC, 10% FBS, 300 RPM containing μg / ml L-glutamine and 50 μg / ml genetomycin Wash in 11640 (GIBCO-BRL), 1 × for 2 donors 106Cells / ml, 2 × 10 3 for third donorFiveAdjusted to cells / ml .   50 μl of each cell suspension was added to 50 μl of TR2-Fc, IL-5R-Fc, -96-well (round bottom) plate (Falcon) with CD4 mAb or control mAb , Franklin Lakes, NS). Plate at 37 ° C with 5% COTwoMedium, 96 hours Incubated. Then, 1 μCi [ThreeH] -methylthymidine (ICN Biomedic als, Costa Mesa, CA) for an additional 16 hours. Collect cells and measure radioactivity Measured.                             Results and Discussion TR2 is a new member of the TNFR superfamily.   1A-1B (SEQ ID NO: 2) show one of the isolated cDNAs (HLHAB49 ) Of TR2 estimated from the longest open reading frame of 2 shows the amino acid sequence. Other sequenced cDNA and E in the database Comparison with ST was performed at position 17 (Arg or Arg) of the protein sequence shown in FIGS. 1A-1B. Lys) and 41 (either Ser or Phe) (SEQ ID NO: 2). Potential pairs that cause amino acid changes at amino acid residues -20 and 5) A progenitor mutant was indicated.   The open reading frame has a calculated molecular weight of 30,417, Encodes 283 amino acids. TR2 protein is predicted to be a receptor Was. Therefore, potential signal sequences and transmembrane domains were examined. C terminal Hydrophobic extension of 23 amino acids to the side (amino acids 201-225) (FIGS. 1A-1B) , This is a transmembrane domain, potentially creating a single helical span However, the signal sequence was not clear. Potential outer domain TR2 is expressed as an Fc-fusion protein in NIH3T3 and CHO cells The N-terminal amino acid sequence of the recombinant TR2-Fc protein was determined in both cases. Specified. The N-terminal sequence of processed mature TR2 starts at amino acid 37; This indicates that the first 36 amino acids form the signal sequence (FIG. 1A- 1B).   Using a polyclonal rabbit antibody raised against TR2, native TR2 Was determined to be 38 kD by Western analysis. Process The TR2 protein backbone consists of 247 amino acids with a molecular weight of 26,000. This protein must be post-translationally modified. Two potential The asparagine-linked glycosylation sites are at amino acid positions 110 and 173 (Fig. 1A-1B). Like other members of the TNFR family, TR2 Are characteristic features indicated by X-ray crystallography (Banner, et al., Cell 73: 431 (1993)). Containing a unique cysteine-rich motif and showing repeating structural units (Banner, DW . et al., Cell 73: 431 (1993)). FIG. 16 shows TR2 (SEQ ID NO: 2), TNFR-I (SEQ ID NO: 10), TNFR-II (SEQ ID NO: 11), CD40 (SEQ ID NO: 12) and And potential TNFR domains aligned with 4-1BB (SEQ ID NO: 13). TR2 contained two complete TNFR domains and two incomplete ones.   TR2 cytoplasmic tail (TR2cy) contains CD40cy and 4-1Bbcy. Appear to be more closely related to those of Fas and TNFR-I cells. It does not include the cell death-inducing region found in the main. Homology is moderate, but TR Thr of 2266Is Thr of 4-1BB233And Thr of CD40254Align with . This has been reported by Inui et al. (Inui, S et al., Eur. J. Immunol. 20: 1747 (1990)). , Thr254Is essential for CD40 signal transduction, THR254Mutates, CD40bd does not bind to CD40cy (Hu, H.M. et al., J. Amer. Biol. Chem. 269: 30069 (1994)). There may be. The signals via 4-1BB and CD40 are T Have been found to stimulate both cells and B cells (Banchereau, J and R ousset, F., Nature 353: 678 (1991); et al., J. Amer. Immunol. 155: 33 60 (1995)).                                   Table 2       Gene expression of TR2 and OX40 in tissues and cells TR2 RNA expression   Tissue distribution of TR2 RNA expression was examined using human tissue RNA blots. TR2 RNA was detected in some tissues and relatively high in lung, spleen and thymus Levels (Table 2), but were not detected by this method in brain, liver or skeletal muscle. None (Table 2). TR-2 is also a monocyte, CD19+B cells, and resting or PMA + PHA- treated CD4+Or CD8+It was also expressed on T cells. this Was only weakly expressed in bone marrow and endothelial cells (Table 2 and 3), expression was also observed in the hematopoietic cell line KG1a (Table 2). For comparison Investigated the tissue distribution of OX-40, another member of the TNFF superfamily Solid (Table 2). Unlike TR2, OX-40 was expressed in any of the tissues tested. Was not detected, but only in activated T-cells and KG1a. TF274 (bone marrow stromal), MG63 and TE85 (osteosarcoma), RL95-2 ( Endometrial sarcoma), MCF-7 and T-47D (breast cancer cells), BE, HT29 (colon) Cancer cells), HTB-11 and IMR-32 (neuroblastoma). TR2 expression was not seen in the vesicle system, but TR2 was expressed in rhabdomyosarcoma HTB-82. (Data not shown).   Several cell lines were examined for inducible TR2 expression. Belongs to the bone marrow monocytic lineage HL60, U937 and THP1 are all different agents PMA or DMS Increased TR2 expression in response to O. Increased expression in response to these drugs is It was observed in G1a and Jurkat cells. In contrast, PMA is MG Although it did not induce TR2 expression at 63, unexpectedly, TNF-α did not. Emitted.   In almost all cases, the predominant mRNA is approximately 1.7 kb in size. However, some larger molecular weight species could be detected in some tissues. Arrangement Many of the cDNAs and ESTs that have been defined have coding suggesting partial splicing. Western blot, which contains one large protein Only quality is detected, which means that if they encode different proteins, These suggested that these were not apparent in the cells we examined. Larger molecules High amounts of mRNA indicate that TR2 is partially regulated at the level of mRNA mutation. Suggest the possibility.                                   Table 3       Relative number of TR 2 RNA (RA) in various tissues and cell typesTR2 map of 1P36.2-P36.3   Apply the FISH mapping method to map the TR2 gene to a specific human chromosomal region Localized. Of the hybridization signal to the short arm of chromosome 1 Alignment was obtained with the aid of DAPI banding. A total of 10 meta tips The meta2 figure is photographed, which shows that the TR2 gene p36.2 to p36.3. TR2 position is CD 30 (Smith, CA et al., Cell 73: 1349-1360 (1993), 4-1BB (Kwon, BS . et al., J. Amer. Immunol. 152: 2256-2262 (1994); Goodwin, R .; G. et al., Eur. J. Immunol. 23: 2631-2641 (1993)), OX-40 (Birkeland, M.L. et al., Eur. . J. Immunol. 25: 926-930 (1995)), and TNFR-II (Baker, E. et al., Cytogenet. & Cell Genet. 57: 117-118 (1991)). It is suggested that it developed through gene replication. Interestingly, apoptosis In contrast to stimulating Fas and TNFR-1, all these receptors are Have a stimulatory phenotype in T cells in response to cognate ligand binding. Therefore, it was determined whether TR2 was involved in lymphocyte stimulation. TR2-Fc coordinates with MLR-mediated proliferation of PBMC.   Investigate possible involvement of cell surface TR2 with its ligand in lymphocyte proliferation To this end, the homologous MLR proliferative response was examined. When TR2-Fc is added to the culture , A significant decrease in maximal response was observed (p <0.05). T at 100 μg / ml Addition of R2-Fc inhibited growth by 53%. In the control IL-5R-Fc No significant growth inhibition was observed. Surprisingly, high concentrations (10-10 0 μg / ml) of IL-5R-Fc was shown to enhance proliferation. Assay Anti-CD4 mAb simultaneously inhibited MLR-mediated proliferation by up to 60%, whereas Light anti-IL-5 mAb did not inhibit proliferation. Major components of the MLR proliferative response Is well known to be T-cell dependent; therefore, its ligand for TR2 It is clear that inhibition of the interaction of TGF prevents optimal T lymphocyte activation and proliferation. is there. Inhibition of MLR proliferation by TR2-Fc at a concentration of 1-100 μg / ml Seen in other TNFR-Fc superfamily members such as CD40-Fc Better than the biological effects (Jeremy Harrop, unpublished result) .   We therefore have a direct role in T cell stimulation, or Stimulates T cell proliferation via one or more receptors, which may include R2 Additional members of the TNF receptor superfamily that bind to potential ligands A member was identified. Direct roles for TR2 are CD40 and 4-1BB Is consistent with the similarity of the cytoplasmic domains of The present inventors have now clarified their role. To identify this ligand to which TR2 binds.   The invention is described in an alternative manner to that specifically described in the foregoing description and examples. It should be clear that it can be done.   Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, And it is within the scope of the appended claims.   All publications (patents, patent applications, journal articles, actual publications) cited herein Laboratory manuals, books, or other documents) are hereby incorporated by reference. Confuse.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ニ，ジャン アメリカ合衆国20853メリーランド州 ロ ックビル、マナーフィールド・ロード5502 番 (72)発明者 ローゼン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者 ジェンツ，ライナー・エル アメリカ合衆国20904メリーランド州 シ ルバー・スプリング、フェアランド・パー ク・ドライブ13404番 (72)発明者 リン，サリー・ドリーン・パトリシア アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州 ウエスト・チェスター、ハンプトン・コー ト 134―ビー番 (72)発明者 ハール，マーク・ロバート アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州 ノリスタウン、ストーニーブルック・ドラ イブ105番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12N 1/21 5/10 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12Q 1/02 C12Q 1 / 02 C12P 21/08 // C12P 21/08 C12N 5/00 A (72) Inventor D, Jean United States 20853 Manorfield Road, Rockville, MD 5502 (72) Inventor Rosen, Craig A United States 20882 Rolling Hill Road, Raytonsville, MD 22400 (72) Inventor Genz, Rainer Elm United States 20904 Silver Spring, Maryland Fairland Park Drive 13404 (72) Inventor Lin, Sally・ Dean Patricia United States 19380 Hampton Court, West Chester, PA 134-Bee No. 72 (72) Inventor Haar, Mark Robert United States 19403 Norristown, Pennsylvania Stony Brook Drive 105

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号２の約−３６〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴ Ｒ２レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の約−３５〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２レ セプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２の約１〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２レセプ ターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５９中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有するＴＲ２レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５９中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２レセプターをコードするヌクレオチド配 列； （ｆ）ＴＲ２細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｇ）ＴＲ２膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｈ）ＴＲ２細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｉ）配列番号５の約−３６〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２− ＳＶ１レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｊ）配列番号５の約−３５〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２− ＳＶ１レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｋ）配列番号５の約１〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ １レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５８中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードするヌクレオチ ド配列； （ｍ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５８中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードするヌクレ オチド配列； （ｎ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ２レセプターをコードす るヌクレオチド配列； （ｏ）配列番号８の約２〜約１３６の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ ２レセプターをコードするヌクレオチド配列； （ｐ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５７中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ２レセプターをコードするヌクレオチ ド配列； （ｑ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）または（ｐ）のポリヌ クレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列 からなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％同一性のヌクレオチド 配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ２．ポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号４または配列番号７のヌクレオ チド配列を有する、請求項１記載の核酸分子。 ３．ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを コードする配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号５のアミノ酸配列を有する ポリペプチドをコードする配列番号４のヌクレオチド配列、または、配列番号８ のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号７のヌクレオチド配 列を有する、請求項１記載の核酸分子。 ４．ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２レセ プターをコードする配列番号１のヌクレオチド配列、または、配列番号５のアミ ノ酸配列を有する成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードする配列番号４のヌク レオチド配列を有する、請求項１記載の核酸分子。 ５．ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９、９７０５８または９ ７０５７のいずれか１つに含まれるｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列 を有する、請求項１記載の核酸分子。 ６．ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９、９７０５８または９ ７０５７のいずれか１つに含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ 酸配列を有するＴＲ２レセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求 項１記載の核酸分子。 ７．ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号９７０５９または９７０５８のい ずれかに含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成 熟ＴＲ２レセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の核 酸分子。 ８．請求項１記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ ）または（ｑ）のヌクレオチドと同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ チドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであ って、ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基またはＴ残基のみからな るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハ イブリダイズしない、ポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ９．請求項１記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ ）または（ｑ）のアミノ酸配列を有するＴＲ２レセプターのエピトープ−坦持部 分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。 １０．配列番号２の約３〜約３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ２の約７０〜約８４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１０６ 〜約１５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約２４０〜約２４ ７のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号５の約３〜約３４のアミノ酸残 基を含むポリペプチド；配列番号５の約６３〜約１００のアミノ酸残基を含むポ リペプチド；配列番号５の約１３５〜約１４９のアミノ酸残基を含むポリペプチ ド；配列番号８の約５６〜約６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ８の約９３〜約１３６のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択さ れるＴＲ２レセプターのエピトープ−坦持部分をコードする、請求項９記載の単 離された核酸分子。 １１．ＴＲ２レセプター細胞外ドメインをコードする請求項１記載の単離された 核酸分子。 １２．ＴＲ２レセプター膜貫通ドメインをコードする請求項１記載の単離された 核酸分子。 １３．ＴＲ２レセプター細胞内ドメインをコードする請求項１記載の単離された 核酸分子。 １４．請求項１記載の単離された核酸分子をペクター中に挿入することを含む、 組換えベクターの作成方法。 １５．請求項１４の方法により製造された組換えベクター。 １６．請求項１５記載の組換えベクターを宿主細胞中に導入することを含む、組 換え宿主細胞の作成方法。 １７．請求項１６記載の方法により製造された組換え宿主細胞。 １８．請求項１７記載の組換え宿主細胞をポリペプチドが発現される条件下で培 養し、該ポリペプチドを回収することを含む、ＴＲ２ポリペプチドを製造するた めの組換え方法。 １９．ヌクレオチド３１４がグアニンまたはアデニンのいずれかであり、ヌクレ オチド３８６がチミンまたはシトシンのいずれかであり、ヌクレオチド６２７が チミンまたはシトシンのいずれかである、配列番号１のヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ２０．アミノ酸番号−２０がリジンまたはアルギニンのいずれかであり、アミノ 酸番号５がセリンまたはフェニルアラニンのいずれかである、配列番号２のアミ ノ酸配列を有するＴＲ２レセプターをコードするヌクレオチド配列を有するポリ ヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ２１．（ａ）配列番号２の約−３６〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴ Ｒ２ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２の約−３５〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２ポ リペプチドのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２の約１〜約２４７の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２ポリペ プチドのアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５９中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有するＴＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５９中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＴＲ２レセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）ＴＲ２レセプター膜貫通ドメインのアミノ酸配列； （ｈ）ＴＲ２レセプター細胞内ドメインのアミノ酸配列； （ｉ）配列番号５の約−３６〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２− ＳＶ１レセプターをコードするアミノ酸配列； （ｊ）配列番号５の約−３５〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２− ＳＶ１レセプターをコードするアミノ酸配列； （ｋ）配列番号５の約１〜約１４９の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ １レセプターをコードするアミノ酸配列； （ｌ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５８中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード される完全なアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードするアミ ノ酸配列； （ｍ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５８中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ２−ＳＶ１レセプターをコードするアミノ 酸配列； （ｎ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ２レセプターをコードす るアミノ酸配列； （ｏ）配列番号８の約２〜約１３６の位置のアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ ２レセプターをコードするアミノ酸配列； （ｐ）ＡＴＣＣ受託番号９７０５７中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード されるアミノ酸配列を有するＴＲ２−ＳＶ２レセプターをコードするアミノ酸配 列； （ｑ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）または（ｐ）のポリペ プチドのいずれか１つのエピト ープ−坦持部分のアミノ酸配列 からなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列 を有する単離されたＴＲ２ポリペプチド。 ２２．配列番号２の約３〜約３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ２の約７０〜約８４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１０６ 〜約１５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約２４０〜約２４ ７のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号５の約３〜約３４のアミノ酸残 基を含むポリペプチド；配列番号５の約６３〜約１００のアミノ酸残基を含むポ リペプチド；配列番号５の約１３５〜約１４９のアミノ酸残基を含むポリペプチ ド；配列番号８の約５６〜約６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ８の約９３〜約１３６のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択さ れる、ＴＲ２レセプタータンパク質のエピトープ−坦持部分を含む単離されたポ リペプチド。 ２３．請求項２１記載のＴＲ２レセプターポリペプチドに特異的に結合する単離 された抗体。 ２４．単純ヘルペスウイルス感染症の治療方法であって、有効量のＴＲ２ポリペ プチドの可溶性フラグメントを、医薬上許容される担体との混合物として、治療 すべき個体に導入することを含む方法。 ２５．異常な細胞生存に関連する病状の治療方法であって、有効量のＴＲ２タン パク質、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、医薬上許容される担 体との混合物として、治療すべき個体に導入することを含む方法。 ２６．ＴＲ２活性のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法 であって： （ａ）ＴＲ２ポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させ、 （ｂ）細胞性応答をアッセイし、 （ｃ）候補化合物の非存在下で作られる標準の細胞性応答と、該細胞性応答を比 較し；それにより標準よりも増加した細胞性応答は、化合物がアゴニストである ことを示し、標準よりも減少した細胞性応答は、化合物がアンタゴニストである ことを示す、方法。[Claims]   1. (A) T having the amino acid sequence at about position -36 to about 247 of SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding the R2 receptor; (B) a TR2 gene having an amino acid sequence of about −35 to about 247 of SEQ ID NO: 2; A nucleotide sequence encoding a sceptor polypeptide; (C) a TR2 receptor having the amino acid sequence of about 1 to about 247 of SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding a ter polypeptide; (D) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97059 A nucleotide sequence encoding a TR2 receptor having the amino acid sequence shown; (E) Coded by cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97059 Nucleotide sequence encoding a mature TR2 receptor having the amino acid sequence Column; (F) a nucleotide sequence encoding the TR2 extracellular domain; (G) a nucleotide sequence encoding a TR2 transmembrane domain; (H) a nucleotide sequence encoding a TR2 intracellular domain; (I) TR2- having the amino acid sequence of about −36 to about 149 of SEQ ID NO: 5 A nucleotide sequence encoding the SV1 receptor; (J) TR2- having the amino acid sequence of about -35 to about 149 of SEQ ID NO: 5 A nucleotide sequence encoding the SV1 receptor; (K) TR2-SV having the amino acid sequence of about 1 to about 149 of SEQ ID NO: 5 A nucleotide sequence encoding one receptor; (L) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97058 Encoding a TR2-SV1 receptor having the amino acid sequence of Array; (M) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97058 Encoding a mature TR2-SV1 receptor having a defined amino acid sequence Otide sequence; (N) encodes a TR2-SV2 receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 A nucleotide sequence; (O) TR2-SV having the amino acid sequence of about 2 to about 136 of SEQ ID NO: 8 A nucleotide sequence encoding two receptors; (P) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97057 Encoding TR2-SV2 receptor having the amino acid sequence of Array; (Q) (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ( i), (j), (k), (l), (m), (n), (o) or (p) Nucleotide sequence complementary to any of the nucleotides Nucleotides at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a sequence.   2. The polynucleotide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7; The nucleic acid molecule according to claim 1, which has a peptide sequence.   3. The polynucleotide comprises a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 4 encoding the polypeptide, or SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 7 encoding a polypeptide having the amino acid sequence of 2. The nucleic acid molecule of claim 1 having a sequence.   4. The polynucleotide is a mature TR2 receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the SEQ ID NO: 4 encoding a mature TR2-SV1 receptor having a noic acid sequence 2. The nucleic acid molecule of claim 1 having a reotide sequence.   5. The polynucleotide has ATCC accession number 97059, 97058 or 9 Complete nucleotide sequence of a cDNA clone contained in any one of 7057 The nucleic acid molecule according to claim 1, comprising:   6. The polynucleotide has ATCC accession number 97059, 97058 or 9 Amino acid encoded by the cDNA clone contained in any one of 7057 Having a nucleotide sequence encoding a TR2 receptor having an acid sequence. Item 7. The nucleic acid molecule according to Item 1.   7. The polynucleotide is ATCC accession number 97059 or 97058; A component having an amino acid sequence encoded by a cDNA clone contained in any of the components; 2. The nucleus of claim 1, having a nucleotide sequence encoding a mature TR2 receptor. Acid molecule.   8. (A), (b), (c), (d), (e), (f), (g) according to claim 1 ), (H), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p ) Or a polynucleotide having a nucleotide sequence identical to that of (q) Polynucleotides that hybridize under stringent conditions to Therefore, the polynucleotide to be hybridized is composed of only A residues or T residues. Under stringent conditions to a polynucleotide having a nucleotide sequence An isolated nucleic acid molecule, including a polynucleotide, that does not hybridize.   9. (A), (b), (c), (d), (e), (f), (g) according to claim 1 ), (H), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p ) Or an epitope-carrier of a TR2 receptor having the amino acid sequence of (q) An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of E. min. 10. A polypeptide comprising about 3 to about 34 amino acid residues of SEQ ID NO: 2; A polypeptide comprising about 70 to about 84 amino acid residues of SEQ ID NO: 2; A polypeptide comprising from about 240 to about 153 amino acid residues; A polypeptide comprising 7 amino acid residues; about 3 to about 34 amino acid residues of SEQ ID NO: 5; A polypeptide comprising about 63 to about 100 amino acid residues of SEQ ID NO: 5. Polypeptide comprising about 135 to about 149 amino acid residues of SEQ ID NO: 5 A polypeptide comprising about 56 to about 68 amino acid residues of SEQ ID NO: 8; 8 selected from the group consisting of polypeptides comprising from about 93 to about 136 amino acid residues. 10. The method of claim 9, wherein said coding for an epitope-bearing portion of a TR2 receptor. Isolated nucleic acid molecule. 11. 2. The isolated of claim 1, which encodes a TR2 receptor extracellular domain. Nucleic acid molecule. 12. 2. The isolated of claim 1, which encodes a TR2 receptor transmembrane domain. Nucleic acid molecule. 13. 2. The isolated of claim 1, which encodes a TR2 receptor intracellular domain. Nucleic acid molecule. 14． Inserting the isolated nucleic acid molecule of claim 1 into a vector. A method for producing a recombinant vector. 15. A recombinant vector produced by the method of claim 14. 16. A method comprising introducing the recombinant vector of claim 15 into a host cell. A method for producing a recombinant host cell. 17． A recombinant host cell produced by the method of claim 16. 18. 18. culturing the recombinant host cell of claim 17 under conditions in which the polypeptide is expressed. Culturing, and recovering the polypeptide, producing a TR2 polypeptide. Recombination method. 19. Nucleotide 314 is either guanine or adenine; Otide 386 is either thymine or cytosine and nucleotide 627 is Has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which is either thymine or cytosine An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide. 20. Amino acid number -20 is either lysine or arginine, The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein acid number 5 is either serine or phenylalanine. Polynucleotide having a nucleotide sequence encoding a TR2 receptor having a noic acid sequence An isolated nucleic acid molecule comprising nucleotides. 21. (A) T having the amino acid sequence at about position -36 to about 247 of SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence of the R2 polypeptide; (B) a TR2 polypeptide having an amino acid sequence of about -35 to about 247 of SEQ ID NO: 2; The amino acid sequence of the polypeptide; (C) a TR2 polypeptide having the amino acid sequence of about 1 to about 247 of SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence of the peptide; (D) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97059 An amino acid sequence of a TR2 polypeptide having the amino acid sequence shown; (E) Coded by cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97059 An amino acid sequence of a mature TR2 polypeptide having the amino acid sequence of (F) the amino acid sequence of the TR2 receptor extracellular domain; (G) the amino acid sequence of the TR2 receptor transmembrane domain; (H) the amino acid sequence of the TR2 receptor intracellular domain; (I) TR2- having the amino acid sequence of about −36 to about 149 of SEQ ID NO: 5 An amino acid sequence encoding an SV1 receptor; (J) TR2- having the amino acid sequence of about -35 to about 149 of SEQ ID NO: 5 An amino acid sequence encoding an SV1 receptor; (K) TR2-SV having the amino acid sequence of about 1 to about 149 of SEQ ID NO: 5 An amino acid sequence encoding one receptor; (L) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97058 Encoding a TR2-SV1 receptor having the complete amino acid sequence No acid sequence; (M) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97058 Amino acid encoding mature TR2-SV1 receptor having the amino acid sequence Acid sequence; (N) encodes a TR2-SV2 receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence; (O) TR2-SV having the amino acid sequence of about 2 to about 136 of SEQ ID NO: 8 An amino acid sequence encoding two receptors; (P) Coded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97057 Amino acid sequence encoding TR2-SV2 receptor having the amino acid sequence Column; (Q) (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ( i), (j), (k), (l), (m), (n), (o) or (p) Any one epitome of the peptide Amino acid sequence of loop-bearing moiety An amino acid sequence at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: An isolated TR2 polypeptide having the formula: 22. A polypeptide comprising about 3 to about 34 amino acid residues of SEQ ID NO: 2; A polypeptide comprising about 70 to about 84 amino acid residues of SEQ ID NO: 2; A polypeptide comprising from about 240 to about 153 amino acid residues; A polypeptide comprising 7 amino acid residues; about 3 to about 34 amino acid residues of SEQ ID NO: 5; A polypeptide comprising about 63 to about 100 amino acid residues of SEQ ID NO: 5. Polypeptide comprising about 135 to about 149 amino acid residues of SEQ ID NO: 5 A polypeptide comprising about 56 to about 68 amino acid residues of SEQ ID NO: 8; 8 selected from the group consisting of polypeptides comprising from about 93 to about 136 amino acid residues. Isolated polypeptide containing an epitope-bearing portion of a TR2 receptor protein Ripeptide. 23. 22. An isolation that specifically binds to the TR2 receptor polypeptide of claim 21. Antibodies. 24. A method for treating herpes simplex virus infection, comprising an effective amount of a TR2 polypeptide. The soluble fragment of the peptide can be treated as a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier, A method comprising introducing into an individual to be performed. 25. A method of treating a condition associated with abnormal cell survival, comprising administering to a subject an effective amount of a TR2 protein. The protein, or an agonist or antagonist thereof, with a pharmaceutically acceptable carrier. A method comprising introducing into a subject to be treated as a mixture with the body. 26. Method for screening for agonists and antagonists of TR2 activity And: (A) contacting a cell expressing the TR2 polypeptide with a candidate compound; (B) assaying the cellular response; (C) the ratio of a standard cellular response produced in the absence of the candidate compound to the cellular response A cellular response thereby increased over the standard, indicating that the compound is an agonist A cellular response that is less than the standard indicates that the compound is an antagonist A way to show that.
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