JP2001502884A

JP2001502884A - Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression

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Publication number: JP2001502884A
Application number: JP10500237A
Authority: JP
Inventors: ボーンライン・エルンスト; エスケーシュ・ソニア; イルベス・ハイニ; ベレス・ゲイバー
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシヤフト; システミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2001-03-06
Also published as: CA2254819A1; WO1997046673A3; AU717233B2; IL127038A0; NZ333190A; EP0914423A2; AU3255897A; WO1997046673A2

Abstract

(57)【要約】ＨＩＶ−１プロウイルスからのｍＲＮＡ転写物のスプライスされていないか、又は一回スプライスされた部分に対する新規なアンチセンスであり、適宜、阻害性トランスドミナント突然変異ＨＩＶ−１蛋白質と共に発現されるものが、ＨＩＶ−１感染の治療に有用であることが発見された。 (57) [Summary] Novel antisense to unspliced or once-spliced portions of mRNA transcripts from HIV-1 provirus, optionally expressed with inhibitory transdominant mutant HIV-1 protein Have been found to be useful in the treatment of HIV-1 infection.

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスＲＮＡ発現によるＨＩＶ−１複製の阻害技術分野本発明は、アンチセンスＲＮＡ発現を利用したＨＩＶ−１複製の阻害に関する。背景技術ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１感染は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主な原因であると考えられている。ＨＩＶ−１は、完全長ＲＮＡの二つのコピーから成るゲノムを有するレトロウイルスである。特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、ＣＤ４＋宿主細胞における該ウイルスの複製は以下のようにして起こる、と仮定されている。宿主細胞が感染すると、ウイルスのゲノムＲＮＡは逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転写される。この二本鎖ＤＮＡは次いで宿主細胞の染色体に組み込まれる。この二本鎖ＤＮＡが宿主細胞の遺伝的物質にに組み込まれたとき、それはプロウイルスと呼ばれる。宿主細胞の活性化に続いて、プロウイルスは二つの異なる段階を経てＲＮＡに転写される。感染の初期段階においては、核内で生産されたプロウイルスのＲＮＡ転写物は細胞のスプライシング酵素によって短い配列の複数コピーに変換される。これらの短いＲＮＡ転写物は、例えば、それ以降の転写を調節するｔａｔ、及び後期転写段階への移行を媒介するｒｅｖのような蛋白質をコードしている。この初期段階は約２４時間要する。細胞の活性化の約２４時間後に、転写は後期段階に移動する。この後期段階の転写では、スプライスされていない約９２００塩基の長いＲＮＡ転写物及びシングル−スプライスされた約４５００塩基の中程度の長さのＲＮＡ転写物が核から細胞質中に移動する。これらのスプライスされていない又はシングル−スプライスされた転写物はウイルスの構造蛋白質又は酵素蛋白質をコードしている。これらのスプライスされていない又はシングル−スプライスされた転写物には、特に、ウイルスコア蛋白質をコードするｇａｇ、ウイルス酵素をコードするｐｏｌ、二種類のエンベロープ蛋白質をコードするｅｎｖが含まれている。図４はＨＩＶ−１のゲノム構造を示している。これらの遺伝子にはいくつかのオーバーラップが見られることに注目されたい。これは或る遺伝子は幾つかの塩基配列を共有しているからである。これらのスプライスされていない又はシングル（１回）−スプライスされた転写物は更にスプライスされ、その結果得られるｍＲＮＡが翻訳されて新たなウイルスを生産するのに必要な蛋白質を産生する。ｇａｇ及びｐｏｌ領域は翻訳されてポリ蛋白質であるｇａｇ及びｇａｇ−ｐｏｌを産生し、これらはプロテアーゼによって切断され、ウイルスに見られる成熟蛋白質が形成される。ｅｎｖはスプライスされて、ｅｎｖポリ蛋白質をコードするサブゲノムメッセンジャーを生じ、これも同様に切断されて成熟エンベロープ蛋白質を産生する。二本のウイルスＲＮＡはその後にコアに包まれ、キャプシド蛋白質で囲まれ、こうして得られたウイルスは細胞から該細胞膜の一部分と共に放出される。ＨＩＶ−１感染を阻止する為の様々なアンチセンス戦略が試みられてきた。その中には、トランスドミナント蛋白質(Bevec,D.,et al.1992.Proc.Acad.Sci.USA 89:9870-9874,レトロウイルス媒介ドミナントネガティブｒｅｖトランスアクチベーターの遺伝子移入によるヒトＴ細胞内の１型ヒト免疫不全ウイルス複製阻害、及びTrono,D.,et al.1989，Cell 59:113-120,ＨＩＶ−１ｇａｇ突然変異体は野生型ウイルスの複製を優性（ドミナント）に干渉することがある。)、単鎖抗体(Levy-Mintz,P.，et al.,1996，J.Virol．70:8821 -8832，１型ヒト免疫不全ウイルスインテグラーゼを標的とすることによる、ウイルスライフサイクルの初期段階を阻害する為の単鎖抗体可変断片の細胞内発現 )、アンチセンスＲＮＡｓ（Chatterjee,S.，et al.,1992，Science 258:1485-14 88,アデノ関連ウイルスアンチセンスベクターによるインビトロでのＨＩＶ−１の二重標的阻害；Choli.H.，et al.,1994,Antisense Res.及びDev.4:19-29,ＨＩＶ−１パッケージングシグナル及びｒｅｖ応答エレメントを含むアンチセンス及びセンスＲＮＡを発現するヒトＣＤ４＋リンパ球セルラインにおけるＨＩＶ−１増殖の阻害；Joshi,S.，et al.，1991,J.Virol．65:5524-5530,アンチセンス及びセンスＲＮＡ発現による１型ヒト免疫不全ウイルス増殖の阻害；Kim,J.H.,et al.，1996，J.Acquir.lmmune Defic.Syndr．12:343-351,ＨＩＶ−１に基づくレトロウイルスベクターにおけるセンス及びアンチセンスＲｅｖ応答配列によるＨＩＶ複製の阻害；Mever,J.，et al.，1993,Gene129:263-268,逆転写酵素に対するアンチセンスＲＮＡを発現する高いコピー数のベクターによるＨＩＶ複製の阻害;Renneisen,K.,et al.,1990,J.Biol.Chem.265:16337-16342，ｅｎｖ領域に対するアンチセンスＲＮＡを含有する、抗体で標的（標識）されている(antibody- targeted)リポソームによるインビトロにおける１型ヒト免疫不全ウイルスの発現の阻害；Rhodes,A.，et al.，1990,J.Gen.Virol.71:1965-1974,内因性合成されたアンチセンスＲＮＡによる培養細胞内におけるヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害）、ＲＮＡデコイ（おとり）(Lee,T.，et al.,1994,J.Virol.68:8254-8 264，１３個のヌクレオチド最小Ｒｅｖ結合ドメインから成る強力なＲｅｖ応答エレメントデコイによるヒトＴ細胞内の１型ヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害；Sullenger,B.A.，et al.,1990,Cell 63:601-608，ＴＡＲ配列の過剰発現によるヒト免疫不全ウイルス複製に対する細胞耐性の付与)、及びリボザイム(Ojwang ,J.0.,et al.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10802-10806,ヘアーピンリボザイムによる１型ヒト免疫不全ウイルスの発現の阻害；Zhou,C..l.Bahner，et al. ，1994,Gene 149:33-39，レトロウイルスにより形質導入された抗−ｔａｔ及び抗−ｒｅｖハンマーヘッド型リボザイムによるヒトＴリンパ球におけるＨＩＶ− １の阻害)を使用する方法がある。トランスドミナントＨＩＶ−１蛋白質ＲｅｖＭ１０が、遺伝子工学的に.修飾された抹消血リンパ球を使用して最初に臨床試験で評価されたが(Woffendin，C ．et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:2889-2894,保護遺伝子の発現によるヒト免疫不全ウイルス感染患者におけるＴ細胞生存の延長)、最近では、リボザイム(Leavitt,MC.，et al.，1996，Gene Ther．3:599-606.ＨＩＶ＋ドナーからのＣＤ４＋リンパ球の生体外での形質導入及び増加：リボザイム遺伝子治療試験への前兆)、及びトランスドミナントＲｅｖ及びアンチセンスＴＡＲに基づく( Morgan R.A.，et al.，1996,Hum.Gene Ther.7:1281-1306,臨床プロトコール：ＨＩＶ−１に感染した一卵性双生児内の同系リンパ球へＨＩＶ−１アンチセンスＴＡＲ及びトランスドミナントＲｅｖ蛋白質遺伝子を届ける為の、レトロウイルス媒介遺伝子移入を用いたＡＩＤＳの遺伝子治療)方法がＲＡＣ及びＦＤＡによって承認された。アンチセンスＲＮＡｓの細胞内発現は、ＨＩＶ−１複製を阻害する為の魅力的なもう一つの遺伝子治療手段を提供する。アンチセンスＲＮＡｓは原核細胞及び真核細胞システムの両方において、非常に特異的で効率の良い阻害剤とされてきた。インビトロで合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又は細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡｓを添加することによって、ウイルスの複製を阻害することに成功している。ＨＩＶ−１複製の阻害はこれまでに、幾つかのウイルス調節を標的とするアンチセンスＲＮＡｓを使用する方法(Chatterjee．et al.，1 992;Joshi,et al.，1991;Kim．et al.，1996:Sczakliel，G．et al.，1991，J.V irol.65:468-472，安定的にアンチセンスＲＮＡを発現するヒトＴ細胞における１型ヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害、及びSczakliel，G．et al.，1992，J. Virol．66:5576-5581，Ｔａｔ−及びＲｅｖ−に対するアンチセンスＲＮＡの発現による、１型ヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害及び破棄：時間的（一時的）分析)、及び構造遺伝子産物を標的とするアンチセンスＲＮＡｓを使用する方法( Choli，et al.，1994;Gyotoky，etal.，1991;Meyer，et al.，1993;Rhodes，et al.．1990)がある。レトロウイルスベクターを使用して細胞内で発現された長いアンチセンス配列(Choli，et al.，1994;Gyotoky，et al.，1991;Rhodes，et al .，1990)又は抗体で標的（標識）されたリポソーム輸送で発現された長いアンチセンス配列(Renneisen，et al.)に関する幾つかの報告がある。これらの報告において観察された阻害レベルの差は、アンチセンスＲＮＡ発現レベル、又は、二つの相補的なＲＮＡｓ間のハイブリダイゼーション動力学に影響を及ぼしうる二次及び三次ＲＮＡ構造における変動（バリエーション）を反映したものであって (Sczakiel，G.，M．Homann，K.Rittner，1993，Antisense Res．And Dev．3:45- 52，１型ヒト免疫不全ウイルスに対する効果的なアンチセンスＲＮＡ標的配列のコンピューターを利用した探索)、生物学的活性に影響を及ぼす。一般的に、これらの試みは、初期段階の転写を標的としたもの（例えばｔａｔ又はｒｅｖ遺伝子)、又は、後期段階の翻訳開始又はＲＮＡプロセッシングを標的としたものであった。アンチセンス配列が畳み込まれてそれ自身で二次構造を形成するという危険性が予想されるので、従来は、短いアンチセンス配列が好まれていた。今日まで、これらの試みは未だ十分な成功を収めていない。今回、驚くべきことに、アンチセンス治療の為の最も良い標的は、完全長、又はシングルスプライスされたＲＮＡ転写物であることが見出された。或る遺伝子に対する複数スプライスされた転写物に結合するアンチセンス配列はあまり効果的ではなく、これはおそらく、より小さい転写物への結合では、完全長又はシングルスプライスされた転写物への結合に対するより、利用できるアンチセンス分子の数が少ないことが理由であると思われる。更に、完全長転写物に対するより長い配列（例えば、６００塩基対、好ましくは１０００塩基対より長い配列）は驚くべきことに効果的であり、当業界での予想に反して、望ましくない二次構造を形成しないようである。以下、ヒトＣＤ４⁺Ｔセルライン（ＣＥＭ−ＳＳ）及び末梢血ＣＤ４⁺Ｔリンパ球（ＰＢＬｓ）を使用したＨＩＶ−１感染試験における、ｐｏｌ，ｖｉｆ，ｅｎｖ遺伝子及び３’ＬＴＲに相補的な配列の抗ウイルス活性の結果について示す。レトロウイルスベクターは１１００−１４００ヌクレオチド（ｎｔ）長の相補的ＨＩＶ−１配列を含有するキメラＲＮＡｓを発現するように構築される。ＨＩＶ −１複製の最も効果的な阻害は、ＣＥＭ−ＳＳセルライン及びＰＢＬｓの両者において、ＨＩＶ −１のｅｎｖ遺伝子に対する相補的なアンチセンス配列を用いたときに観察された。この強力な抗ウイルス活性は、更に、高接種用量感染試験においても示され、そこでは、ＨＩＶ−１ｍＲＮＡｓの減少が低レベルのＧａｇ及びＴａｔ蛋白質生産と相関があり、これはアンチセンスＲＮＡがＨＩＶ−１の複製間の初期に作用していることを意味するものである。これらアンチセンスＲＮＡの抗ＨＩＶ− １効果を、良く知られている文献に記載されているトランスドミナントＲｅｖＭ１０（Bevec,D.,et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89:9870-9874，ドミナントネガティブｒｅｖトランスアクチベーターのレトロウイルス媒介遺伝子移入によるヒトＴ細胞における１型ヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害;Escaich ，S.，et al.，1995，Hum.Gene Ther.，6:625-634,慢性感染Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の複製のＲｅｖＭ１０媒介阻害;Malim,M.H.,et al.，1992，J.Exp.Med.， 176:1197-1201，ヒトＴ細胞におけるトランスドミナントｒｅｖ蛋白質の安定発現によるヒト免疫不全ウイルスの複製の阻害；及びNabel，G.J.，et al.，1995 ，Hum.Gene Ther.，5:79-92,ＡＩＤＳ効果に対するＲｅｖのトランスドミナントネガティブフォームの分子遺伝的介在）と比較すると、アンチセンスを媒介としたＨＩＶ−１の複製の阻害の可能性（有効性）が示される。更に、完全長転写物のｇａｇ，ｅｎｖ，及びｐｏｌ部分、特にｅｎｖ及びｐｏｌの部分に対するアンチセンス配列がとりわけ効果的であることが発見された。以上に述べたアンチセンス構築物は、ＨＩＶ−１感染患者に対する遺伝子治療、例えば、このような患者のＨＩＶ−１感受性細胞(susceptable cell)、例えば、ＣＤ４＋細胞又はその前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋／Ｔｈｙ−１＋細胞のような造血幹細胞）に本発明のアンチセンスを形質導入して、形質導入された細胞及びその前駆細胞を、ＨＩＶ−１感染に対して耐性にする，ことから成る治療法に、特に有用である。本発明のアンチセンス構築物は、野生型ＨＩＶ−１遺伝子又は遺伝子断片（フラグメント）をそのプロモーターに対して逆方向にベクター内に挿入し、該遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれ転写されたときに、ＤＮＡの裏返しの鎖(opp osite strand)が転写されて、野生型遺伝子又は遺伝子断片からのｍＲＮＡに対して相補的なメッセンジャーＲＮＡ転写物を産生し、これが野生型遺伝子又は遺伝子断片からのｍＲＮＡとアニールして不活性なＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成し、この二重鎖は細胞ＲＮａｓｅによって分解される。アンチセンス構築物を使用するＨＩＶ−１感受性細胞への形質導入は生体内（ in vivo）又は生体外（ex vivo）で行うことが出来るが、患者から血液を取り、標的細胞を選択し、本発明のアンチセンス構築物を有するベクターと共に外細胞を接種し、そして該標的細胞を再び体内に戻す、という生体外の方法で行う方が適当である。自然選択によって、形質導入されたＨＩＶ−１耐性細胞が野生のＨＩＶ−１感受性細胞にとって代り、こうして患者が感染を克服し、免疫能力を回復することを可能ならしめる。或いは、患者は適合ドナーから、本発明のアンチセンス構築物で形質導入された非自己ＣＤ４＋細胞又はその前駆細胞を受ける。発明の開示従って、本発明は、１．ヒト細胞内に安定的に組み込まれたときに、ｅｎｖ，ｅｎｖ及びｐｏｌ，又はｅｎｖ，ｐｏｌ及びｇａｇをコードするＨＩＶ−１プロウイルスからのｍＲＮＡ転写物と、例えば、生体内（in vivo）条件下でアニールするｍＲＮＡを生成することができ、少なくとも０．６ｋｂ、好ましくは１ｋｂ、最も好ましくは１−２ｋｂ、例えば、１．１ｋｂから１．５ｋｂの長さであり、以下の群より選択される核酸配列：（ｉ）ＨＩＶ−１プロウイルスの約２００４番目の塩基におけるＡｐａ１切断部位からＨＩＶ−１プロウイルスの約３４００番目の塩基におけるＰｆｌｍ１切断部位までの１．４ｋｂ断片に対するアンチセンス、例えば、図１の配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）に対するアンチセンスである配列；（ii）ＨＩＶ−１プロウイルスの約３４００番目の塩基におけるＰｆｌｍ１切断部位からＨＩＶ−１プロウイルスの約４６４６番目の塩基におけるＥｃｏＲ１切断部位までの１．２ｋｂ断片に対するアンチセンス、例えば、図２の配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）に対するアンチセンスである配列； (iii)ＨＩＶ−１プロウイルスの約６６１５番目の塩基におけるＡｐａＬ１切断部位からＨＩＶ−１プロウイルスの約８０５３番目の塩基におけるＢｓｍ１切断部位までの１．３ｋｂ断片に対するアンチセンス、例えば、図３の配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）に対するアンチセンスである配列；及び (iv)(i)、(ii)又は(iii)における配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９９％の相同性を有し、(i)、(ii)又は(iii)により生成されるｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡ転写物と同じｍＲＮＡ転写物とアニールするｍＲＮＡを生成することができる配列、を提供するものである。上記１において記載した核酸は、レトロウイルスベクターにあってはＲＮＡであり、標的細胞内に組み込まれたプロウイルスにあってはＤＮＡであるものと理解されたい。構築物のＲＮＡおよびＤＮＡの両形態ともに本発明の範囲である。更に、本発明は、２．上記１のアンチセンス配列を含むベクターを提供する。ベクターは、ヒト造血細胞に形質導入することの出来るベクターであれば任意のもので良く、例えば、同種指向性、異種指向性、両指向性又は偽型レトロウイルス(pseudotyped)、アデノ関連ウイルス(ＡＡＶ)、アデノウイルス(ＡＶ)のベクターで有り得る。好ましくは、本発明のベクターはレトロウイルスベクターであり、好ましくは、長い末端反復配列（ＬＴＲ）を有することを特徴とするベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭＬＶ)、骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)、又はマウス胎児幹細胞ウイルス(ＭＥＳＶ)、又はMiler及びR osman(1980)BioTechniques 7,pp.980-986に記載されているｐＬＮシリーズから選ばれたベクターである。アンチセンス配列は、レトロウイルスのｅｎｖ，ｐｏｌ及び／又はｇａｇにとって代わる。アンチセンスの発現を調節するプロモーターは、例えば、ＭｏＭＬＶＬＴＲのような強力なウイルスプロモーターであり得る。レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによって感染される宿主細胞の範囲は、一般的にウイルスのｅｎｖ蛋白質によって決定される。パッケージング細胞から生産された組換えウイルスは、該パッケージング細胞によって提供されるｅｎｖ蛋白質が認識する事実上如何なる型の細胞をも感染させる為に使用することが出来る。感染によって、ウイルスゲノムが形質導入された細胞内に組み込まれ、その結果、外来性遺伝子産物の安定的な発現が行われる。感染効率は、標的細胞上での受容体の発現レベルにも関連する。一般的には、ＭｏＭＬＶのマウス同種指向性ｅｎｖは齧歯類細胞に感染出来る一方で、両指向性ｅｎｖは、齧歯類、鳥類、ヒトを含む幾つかの霊長類の細胞に感染する。異種指向性ベクター系はマウス異種指向性ｅｎｖを利用し、これも同様にヒトへの感染が可能である。レトロウイルスベクターの宿主範囲は、基本となるウイルスのｅｎｖ蛋白質を二番目のウイルスのそれと置換することによって変化させることが可能である。この結果得られる偽型ウイルスは、エンベロープ蛋白質を支配し、パッケージング細胞によって発現されるウイルスの宿主範囲を有する。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）由来のＧ−糖蛋白質でＭＭＬＶｅｎｖ蛋白質を置換することによって、宿主範囲を拡大することが出来る。好ましくは、本発明のベクター及びパッケージング細胞（セルライン）はヒト細胞の形質導入に適するように採用される。好ましくは、ベクターは両指向性レトロウイルスベクター、例えば、以下の実施例に記載されているようなベクターである。適宜、ベクターは、上記１に示された一つ以上のアンチセンス配列、例えば、以下の実施例に示されるように、ｐｏｌ及びｅｎｖを含有することが出来る。好ましくは、構築物はレトロウイルスのｇａｇ，ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ配列を欠いている為、ｇａｇ，ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの機能はパッケージング細胞によってトランスで（in trans）付与されなければならない。即ち、ベクター構築物がパッケージング細胞に導入されたときに、該細胞によって生産されたｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖ蛋白質がベクターＲＮＡと集合して、複製欠損又は形質導入ビリオンを生産し、培地に分泌される。このようにして生産されたウイルスは標的細胞に感染しそのＤＮＡに組み込まれることが可能であるが、一般的に、必須のウイルス配列を失っている為に感染性ウイルス粒子は生産しない。パッケージングセルラインはｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをコードする別個のプラスミドでトランスフェクションされるのが好ましく、その結果、複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）生産されるには複数回の組換えが必要とされる。適当なレトロウイルスベクターパッケージングセルラインには、マウスＮＩＨ／３Ｔ３セルラインに基づくもの及びＰＡ３１７(Miller & Buttimore（1986）Mol．Cell Biol.，6:2895;Miller & Ro sman(1989)BioTechniques 7:980)、ＣＲｌＰ（Danos & Mulligan(1988 )Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85:6460）及びｇｐ＋ａｍ１２(Markowitz，et al.,( 1998)Virology 167:400)及びヒト２９３細胞又はサルＣＯＳ細胞に基づく全てのセルライン、例えば、Pear et al.，(1993)Proc.Nad.Acad.Sci.USA 90:8392-839 6;Rigg et al.，(1996)Virology 218;Finer，et al.，(1994)Blood 83:43-50;La ndau，et al.,（1992）J.Virol．66:5110-5113に記載されているようなＰｒｏＰａｋＡパッケージングセルがある。レトロウイルスベクターＤＮＡは、安定的又は過渡的トランスフェクションによってパッケージング細胞に導入され、レトロウイルスベクター粒子を生産する。本発明のアンチセンス構築物は更に、例えば、ｔａｔ又はｒｅｖの突然変異体のような初期段階の短いｍＲＮＡ転写物に対応するトランスドミナント突然変異蛋白質のような、ＨＩＶ阻害蛋白質の発現を干渉しない、という利点を有している。このようなトランスドミナント突然変異蛋白質は野生型のＨＩＶ蛋白質の機能に干渉しＨＩＶ複製を阻止するので、これらの発現はＨＩＶ感染の治療に大変有効である。特に注目されるトランスドミナント突然変異蛋白質はＲｅｖＭ１０である。この使用に関しては、例えば、Escaich，et al.，Hum.Gene Ther.(1995)6:625-634及び WO90/14427に記載されている。以前には、ＨＩＶアンチセンス及びトランスドミナント突然変異蛋白質の共発現は、アンチセンスがトランスドミナント突然変異蛋白質の発現を邪魔するために、実用的ではないと考えられていた。本発明のアンチセンス構築物を使用すれば、ＨＩＶアンチセンス及びトランスドミナント突然変異蛋白質の共発現が可能となるばかりではなく、ウイルスの複製サイクルの異なる段階でウイルスに干渉できる為に、ＨＩＶの相乗的阻害を奏効し得る。従って、本発明は更に以下の態様を提供する。３．ＨＩＶ−１阻害蛋白質の遺伝子、例えば、ｔａｔ又はｒｅｖのトランスドミナント突然変異形態の遺伝子、特にＲｅｖＭ１０遺伝子、を更に含む、上記２（即ち、上記１のアンチセンス配列を有する）のレトロウイルスベクター。上記２又は３のベクターを有する、例えば、上記のような、パッケージングセルラインも本発明の範囲である。本発明は更に以下の態様を提供する。４．上記１のアンチセンスで安定的に形質導入され、更に適宜ｔａｔ又はｒｅｖのトランスドミナント突然変異形態の遺伝子、特にＲｅｖＭ１０遺伝子で形質導入された、例えば、上記２又は３のベクターによって形質導入された、少なくとも一つのヒト造血細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞又はその前駆体、例えば、幹細胞、例えば、ＣＤ３４+/Ｔｈｙ-１＋細胞）を含む細胞組成物であって、以下の５の方法に使用するもの。本発明は更に以下の態様を提供する。５．治療を必要とする対象物（患者）におけるＨＩＶ−１感染の治療方法であって、造血細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞又はその前駆体、例えば、幹細胞、例えば、ＣＤ３４+/Ｔｈｙ-１＋細胞）を患者から単離し、上記１のアンチセンス配列を上記細胞に形質導入し、適宜更に同時に、ｔａｔ又はｒｅvのＨＩＶ−１阻害トランスドミナント突然変異形態、特にＲｅｖＭ１０の遺伝子を形質導入し、例えば、上記２又は３のベクターで上記細胞に形質導入し、そして形質導入された細胞を再び患者に戻す、ことから成る前記方法。本発明は、更に以下の態様を提供する。６．上記１のアンチセンス配列又は上記２又は３のベクターの、上記４の細胞組成物の製造の為の使用、又は上記５の治療方法の為の使用。図面の簡単な説明図１は、センス方向のＨＩＶ−１ＨＸＢ２株ポリメラーゼ遺伝子領域１（２００４−３４００ｂｐ）の配列を示す。図２は、センス方向のＨＩＶ−１ＨＸＢ２株ポリメラーゼ遺伝子領域２（３４００−４６５０ｂｐ）の配列を示す。図３は、センス方向のＨＩＶ−１ＨＸＢ２株エンベロープ遺伝子領域（６６１５−８０５３ｂｐ）の配列を示す。図４は、ＨＩＶ−１のゲノム構造を示す。ベクター構築に使用したアンチセンス断片の位置も示している。各断片において、制限酵素切断（開裂）部位が記載されている。図５は、実施例のアンチセンスベクターの模式的構造を示している。親ベクターｐＬＮ−１はA．Dusty Miller & Guy J．Rosman(1989)BioTechniques 7.980-9 86に開示されている。Ｎｅｏ遺伝子からのマルチクローニング部位３'を使用してアンチセンス断片を挿入する。結合ベクターｐＬＭＴＮＬ−１用の親ベクターはEscaich，S.Kalfoglu,C.;Plavec,l.；et al ．Human Gene Therapy 1995.6.625-634に開示されている。図６は、ＨＩＶｇａｇ配列の一連の欠失を示している。欠失断片の構築は以下に記載されている。１．５ｋｂのＳａｃＩ−ＢｇｌII ｐｓｉ−ｇａｇ断片（Ψ −ｇａｇ）を使用して、ＰＣＲ増幅又は制限酵素消化によって欠失断片を作成する。図７は、欠失断片のＨＩＶチャレンジを示している。ｐＬＮ−ｇａｇ（Ｓ）及びｐＬＮ−ｇａｇ（ＡＳ）は、完全長の１．５ｋｂｐｓｉ−ｇａｇ断片の、それぞれ、センス及びアンチセンス方向に対応している。ｐＬＮ−ｇａｇ−５００は、ＨＩＶ−１のｐｓｉ（パッケージングシグナル）配列にほぼ対応する上記断片の５'末端である。ｐＬＮ−ｇａｇ１０００構築物は１．５ｋｂ断片のｇａｇ領域に対応している。図８は、アンチセンスｇａｇ欠失断片の抗ＨＩＶ−１活性をそれらの長さの関数として示している。即ち、サイズ（長さ）と抗ＨＩＶ−１活性の関連がグラフに示されている。ｐ２４生産（ｐｇ／１０Ｅ６細胞）に対する塩基対で表された断片の長さがグラフにプロットされている。図９は、アンチセンスｇａｇ及びＶｉｆ構築物のＨＩＶチャレンジを示している。完全長である１．５ｋｂアンチセンスｇａｇ（ｐＬＮ１Ｐｓｉセンス及びアンチセンス）及び類似の長さのＶｉｆ断片（ｐＬＮ１Ｖｉｆセンス及びアンチセンス）を比較している。図１０は、ｇａｇ−ｐｏｌ／ＡＳ構築物と高用量（high dose）のウイルス（４００００ＴＣＩＤ５０）によるＨＩＶチャレンジを示している。１．５ｋｂのｐｓｉ−ｇａｇ断片（ｐＬＮ−ｇａｇ／ＡＳ及びＳ）とｐｏｌ−１断片（ｐＬＭ−ｐｏｌ／ＡＳ及びＳ）を比較している。図１１は、アンチセンスｐｏｌ，ｅｎｖ及びＬＴＲ構築物のＨＩＶチャレンジを示している。ｐｏｌ−１断片(ｐＬＮ−ｐｏｌ（ＡＳ）／１及び（Ｓ）／１)、第二アンチセンスｐｏｌ−２（ｐＬＮＤｐｏｌ（ＡＳ）／２）エンベロープ（ｐＬＮＤＥｎｖ(ＡＳ)）及び３'ＬＴＲ(ｐＬＮＤＬＴＲ(ＡＳ))断片を有するＣＥＭＳＳ細胞に４００ＴＣＩＤＨＩＶ−１をチャレンジさせた。図１２は、ｐＬＮｐｏｌ１／ｅｎｖアンチセンスベクター、及びＨＩＶ−１チャレンジに対するｐｏｌ１(Ｓ)，ｐｏｌ１(ＡＳ)，ｐｏｌ１（ＡＳ）／ｅｎｖ( Ｓ)，ｐｏｌ（ＡＳ）／ｅｎｖ（ＡＳ）の効果を示しており、二重アンチセンス構築物がもっとも効果的である。図１３は、結合ベクターのＨＩＶ−１チャレンジを示している。コントロールとしてＲｅｖＭ１０遺伝子を有するＬＭＴＮＬ及びＡＴＧless ＲｅｖＭ１０遺伝子を有するＬＡＭＴＮＬの二つの親ベクター、及び完全長である１．５ｋｂのｐｓｉ−ｇａｇ配列をアンチセンス方向に有する、対応する結合ベクターであるＬＭＴＮＬ−Ｙ及びＬＡＭＴＮＬ−Ｙと４００ＴＣＩＤ５０ＨＩＶ−１をチャレンジする。図１４は、末梢血リンパ球におけるＨＩＶ複製のｐｏｌアンチセンスによる阻害を示している。図１５Ａは、アンチセンス配列をコードするレトロウイルスベクターの構造を示している。Ｎｅｏ及びＬｙｔ２を選択マーカー遺伝子として使用する。アンチセンス配列及びマーカー遺伝子はＭｏＭＬＶＬＴＲプロモーターから発現される。矢印は挿入されたＨＩＶ−１配列のアンチセンス方向を示している。図１５Ｂは、形質導入されたＣＥＭ−ＳＳ細胞におけるアンチセンスＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を示している。アンチセンス配列を有する組換え転写物はＮｅｏ特異的プローブを用いて検出される。下側のパネルは、内部標準としてＧＡＰＤＨ特異的プローブとハイブリダイズした同じブロットを示している。レーン１：ｐＬＮベクター、レーン２：ｐＬＮ−ｐｏｌ１／ＡＳベクター、レーン３：ｐＬＮ−ｐｏｌ２／ＡＳベクター、レーン４：ｐＬＮ−ｖｉｆ／ＡＳベクター、レーン５：ｐＬＮ−ｅｎｖ／ＡＳベクター、レーン６：ｐＬＮ−３'ＬＴＲ／ＡＳベクター、レーン７：ｐＬＮ−ｐｏｌ１２／ＡＳベクター、である。図１６は、形質導入されたＣＥＭ−ＳＳ細胞におけるＨＩＶ−１複製の阻害を示している。Ａ：ＣＥＭ−ＳＳ細胞集団（１ｘ１０⁶細胞/ml）にＨＩＶ−１ＨＸＢ３株（４ｘ１０²ＴＣＩＤ₅₀／ml）を接種する。Ｂ：ＨＩＶ−１用量を増加し、形質導入されたＣＥＭ−ＳＳ細胞集団に４ｘ１０⁴ＴＣＩＤ₅₀／mlで感染させる。ｐ２４抗原生産に関して培養上清をＥＬＩＳＡによって試験する。実験は二回ずつ行われる。図１７は、異なる長さの相補的ｐｏｌ配列をコードするベクターの抗ＨＩＶ− １効果の評価である。Ａ．ｐｏｌ１_欠失構築物の抗ＨＩＶ−１効果。１４００ｎｔｐｏｌ１及び７９０ｎｔｐｏｌアンチセンス並びにセンスｐｏｌ１構築物を発現するＣＥＭ−ＳＳ細胞にＨＩＶ−１ＨＸＢ３株を４ｘ１０³ＴＣＩＤ₅₀／m lで感染させる。Ｂ．１４００ｎｔｐｏｌ１及び２６００ｎｔｐｏｌ１２アンチセンス配列をを発現するＣＥＭ−ＳＳ細胞にＨＩＶ−１ＨＸＢ３株を４ｘ１０³ＴＣＩＤ₅₀／mlで感染させる。対応するセンス配列をコントロールとして使用する。図１８は、形質導入ＰＢＬｓ内におけるアンチセンスＲＮＡの発現及びＨＩＶ −１複製の阻害を示す。Ａ．ｐＬ−Ｌｙｔ−ｐｏｌ１／ＡＳ，ｐＬ−Ｌｙｔ２／ｐｏｌ１／Ｓ，ｐＬ−Ｌｙｔ−ｅｎｖ／ＡＳ，ｐＬ −Ｌｙｔ２／ｅｎｖ／Ｓベクターで形質導入された、活性化されたＣＤ４⁺が多いＰＢＬｓから全細胞ＲＮＡを分離して、Ｌｙｔ２発現の為に選択する。放射標識したＬｙｔ２特異的プローブを使用したノーザンブロットでアンチセンス転写物を分析する。ＧＡＰＤＨ特異的プローブを供したＲＮＡの量をモニターする為に使用する。レーン１：ｐＬ−Ｌｙｔ−ｐｏｌ１／ＡＳ，レーン２：ｐＬ−Ｌｙｔ２／ｐｏｌ１／Ｓ，レーン３：ｐＬ−Ｌｙｔ２−ｅｎｖ／ＡＳ，レーン４：ｐＬ−Ｌｙｔ２／ｅｎｖ／Ｓ，レーン５：ｐＬ−Ｌｙｔ２−ｐｏｌ１／ＡＳ。Ｂ．形質導入されＣＤ４⁺，Ｌｙｔ２⁺で選択されたＰＢＬｓを同種支持細胞で活性化し、臨床ＨＩＶ−１単離物ＪＲ−ＣＳＦを感染させる。５ｘ１０⁴個の細胞を三重に接種して、ｐ２４抗原生産を測定する。図１９は、高接種用量ＨＩＶ−１感染試験における、トランスドミナントＲｅｖＭ１０と細胞内発現したｖｉｆ，ｐｏｌ１及びｅｎｖアンチセンスＲＮＡとの比較である。ＣＥＭ−ＳＳ細胞（１ｘ１０⁶／ml）にＨＩＶ−１ＨＸＢ３株（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ml）を接種し、培養上清中のｐ２４抗原生産を測定することでウイルス複製をモニターする。図２０は、ＨＩＶ−１ＨＸＢ３株（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ml）を接種したＣＥＭ−ＳＳ細胞内のＨＩＶ−１，アンチセンス及びＲｅｖＭ１０転写物の検出を示す。感染後、第４日、第６日、第８日にＣＥＭ−ＳＳ細胞から全細胞ＲＮＡを分離する。放射標識されたＴＡＲ特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用したノーザンブロットでＨＩＶ−１特異的転写物を分析する。アンチセンス又はＲｅｖＭ１０転写物の発現は、それぞれＮｅｏ及びＲｅｖ特異的プローブを使用して検出する。ＧＡＰＤＨ特異的プローブを供したＲＮＡの量をモニターする為に使用する。レーン１：ＲｅｖＭ１０，レーン２：ＤＲｅｖＭ１０，レーン３：ｐＬＮ(ベクターコントロール)，レーン４：ｐＬＮ−ｖｉｆ／ＡＳ，レーン５：ｐＬＮ−ｐｏｌ１／ＡＳ，レーン６：ｐＬＮ−ｅｎｖ／ＡＳ。パネルＡ：第４日、パネルＢ：第６日、パネルＣ：第８日。第２１図は、ＨＩＶ−１感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞内のｐ２４及びＴａｔ発現の分析を示す。Ａ．感染後第８日にｐ２４の細胞内発現を測定する。平均蛍光強度が相対的なｐ２４細胞内発現を反映している。Ｂ．形質導入されＨＩＶ−１感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞内のＴａｔ蛋白質の検出を示す。感染後第８日に感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞のアリコートをメタノールで固定し、Ｔａｔ特異的抗体で染色し、ＦＡＣＳスキャン(FACScan)で分析する。実施例１：アンチセンスＨＩＶ−１配列を有するレトロウイルスベクターの構築 A.Dusty Miller & Guy J．Rosman（1989）BioTechniques 7．980-986に記載のように、親ベクターとしてｐＬＮを使用し、異なるアンチセンスＨＩＶ−１配列を有するレトロウイルスベクターを以下の様にして作成した。ａ）ｐＬＮ−ｇａｇ／ＡＳベクター：ＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から１４２０ｂｐのＳａｃＩ−ＢｇＩII（675bp-2095 bp）断片を分離し、ｐＬＮ−１ベクターの平滑末端ＨｉｎｄIII部位にアンチセンス方向で平滑末端断片として挿入した。断片の方向はＣｌａＩによる消化で決定した。ｂ）３’欠失ｐＬＮ−ｇａｇ／ＡＳベクター：１４２０ｂｐのＳａｃＩ−ＢｇｌII（675bp-2095bp）断片から一連の欠失断片をＰＣＲ増幅によって作成した。該断片の５’末端は、プライマーとして（675b p-695bp）：を使用した。３’末端としては、プライマー３．６（位置1897−1900）：プライマー３．５（位置1677−1700）：プライマー３．４（位置1479−1500）：プライマー３．３（位置1280−1300）：プライマー３．２（位置1079−1100）：プライマー３．１（位置884−904）：を使用した。ＢａｍＨＩ及び平滑末端を有するＰＣＲ断片をｐＬＮベクターのＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ部位にクローニングした。作成した断片は、約１２００ｂｐ ,１０００ｂｐ,８００ｂｐ,６００ｂｐ,４００ｂｐ,２００ｂｐの長さであった。ｃ）ｇａｇ断片からのｐｓｉ配列の除去：１４２０ｂｐのＳａｃＩ−ＢｇｌII（65bp-2095bp）断片をＰｖｕII 制限エンドヌクレアーゼで消化し、該断片の５’末端からｐｓｉパッケージングシグナルに対応する４９４ｂｐを除去した。得られた断片（ｇａｇ５００／ＡＳ及びｇａｇ１０００／ＡＳ）をｐＬＮベクターのＨｉｎｄIIに平滑末端断片としてクローニングした。ｄ）ｐＬＮ−Ｖｉｆ／ＡＳベクター：ウイルスのＶｉｆ−Ｖｐｒ遺伝子に対応する１１０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（4646bp-5742bp）をＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から分離し、ｐＬＮベクターのＨｉｎｄII部位にアンチセンス方向で挿入した。ｅ）ｐＬＮ−ｐｏｌ１／ＡＳベクター：ウイルスのＰｏｌ遺伝子の５’末端に対応する１４８０ｂｐのＡｐａＩ-ＰｆｌｍＩ断片（2005bp-3485bp）をＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から分離し、ｐＬＮベクターのＨｉｎｄII部位にアンチセンス方向で挿入した。ｆ）ｐＬＮ−ｐｏｌ２／ＡＳベクター：ウイルスのＰｏｌ遺伝子の３’末端に対応する１２５０ｂｐのＰｆｌｍＩ−ＥｃｏＲＩ断片（3485bp-4646bp）をＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から分離し、ｐＬＮベクターのＨｉｎｄII部位にアンチセンス方向で挿入した。ｇ）ｐＬＮ−ｅｎｖ／ＡＳベクター：ウイルスのＥｎｖ遺伝子のイントロン領域に対応する１４４０ｂｐのＡｐａＬＩ-ＢｓｍＩ断片（6615bp-8053bp）をＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から分離し、ｐＬＮベクターのＨｉｎｄII部位にアンチセンス方向で挿入した。ｈ）ｐＬＮ−ｐｏｌ１（ＡＳ）−ｅｎｖ（ＡＳ）ベクター：ｅ）のｐｏｌ１断片をｇ）のｅｎｖ構築物の５’に挿入し、これらの両者をｐＬＮベクターのＨｉｎｄII部位にアンチセンス方向で挿入した(図１２) 。ｉ）ｐＬＮ３’ＬＴＲ／ＡＳベクター：ウイルスの３’ＬＴＲに対応する１２６０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片（8474bp-9615bp）をＨＩＶ−１のＨＸＢ２株から分離し、ｐＬＮベクターのＸｈｏＩ部位にアンチセンス方向で挿入した。ｊ）２６４２ｂｐのＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を逆方向でｐＬＮベクターに挿入して完全長ｐｏｌ配列を有するレトロウイルスベクターｐＬＮ−ｐｏｌ１２／ＡＳを作成した。センスコントロールベクターｐＬＮ−ｐｏｌ１／Ｓ及びｐＬＮ −ｐｏｌ１２／Ｓの為に、１４００ｂｐのＡｐａＩ−ＰｆｌｍＩｐｏｌ断片及び２６４２ｂｐのＤＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩｐｏｌ断片をセンス方向でｐＬＮベクターに挿入した。ｐＬＮ−７９Ｏｐｏｌ１／ＡＳベクターは、ｐｏｌ遺伝子の７９０ｂｐＢｇｌII−ＮｓｉＩサブ断片をｐＬＮベクターのＸｈｏＩ部位に挿入して構築した。レトロウイルスベクター（ｐＬＬｙｔ２−ｐｏｌ１／ＡＳ，ｐＬＬｙｔ２−ｐｏｌ１／Ｓ，ｐＬＬｙｔ２−ｅｎｖ／ＡＳ，及びｐＬＬｙｔ２−ｅｎｖ／Ｓ）はＮｅｏ遺伝子をトランケートされた(truncated)マウスＣＤ８（Ｌｙｔ２）細胞マーカー(Forestell，S.P.，etal.，1997，Gene Ther．4:19-28．新規なレトロウイルスパッケージングセルライン：相補的な指向性及び効率的な遺伝子移入の為の改良されたベクター生産)に代えて構築し、初代Ｔ細胞ＨＩＶ感染試験に使用した。ｋ）結合ベクター：トランスドミナントＲｅｖＭ１０遺伝子を有するＬＭＴＮＬ及びＬΔＭＴＮＬ及びそのＡＴＧ−ｌｅｓｓ形態(ΔＭ)(Escaich，S.，Kalfoglou,C.；Lavec，l. ；et al.，Human Gene therapy 1995．6 625-634)をＣｌａｌで消化し、ＨＩＶ−１のＨＸＢ２株からのＧａｇ遺伝子領域に対応する１２００ｂｐのＣｌａＩ−ＢｇｌII断片を挿入した。ｌ）レトロウイルスベクター生産：リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールを用いて、同種指向性ＢＯＳＣパッケージングラインに１０μｇのレトロウイルスＤＮＡをトランスフェクトさせた。一過性の（過渡的）同種指向性ウイルス上清を使用して両種指向性ＰＡ３１７パッケージングセルラインに形質導入した。ｐＬＮベクターはＮｅｏ遺伝子を有しているので、これらの細胞はＧ４１８で選択される。選択後に、安定した細胞集団をＲＮＡ発現に関してノーザンブロットにより分析した。適当なレトロウイルス構築物を有する、選択されたＰＡ３１７セルラインからのウイルス上清を回収し、形質導入ウイルス力価について分析し、ヒトＣＤ４＋ＴセルラインＣＥＭＳＳに形質導入した。パッケージングラインとして、ＢＯＳＣに代えてＧＰ４７（Rigg，R.J.，et al 1996.Virology 218:290-295,新たなヒト両種指向性パッケージングセルライン：高力価、補体抵抗性、及び改良された安全性）も使用した。ＧＰ４７パッケージングセルラインからの上清を使用して、以前に記載された(Forestell，S.P et al.,1997 Gene Ther.4:19-28,新規なレトロウイルスパッケージングセルライン：相補的な指向性及び効率的な遺伝子移入の為の改良されたベクター生産)ように、スピノキュレーション(spinoculation)によって、両種指向性ＰｒｏＰａｋＡセルライン(Rigg，R.J．et al.，1996)に形質導入した。レトロウイルスのエンドポイント力価は、薬剤選択(８００mg/mlＧ４１８)後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定し、Ｌｙｔ２ベクター（Forestell，S. P．et al.．1997）の形質導入効率はＦＡＣＳ分析で測定した。 m)標的細胞形質導入：５mlＤＭＥＭ＋１０ＦＣＳ＋８μｇ/mlポリブレン中、４−６時間で、アンチセンスベクター構築物を有する両種指向性ウイルスからの上清でヒトＣＤ４＋ＴセルラインＣＥＭＳＳ細胞（２ｘ１０⁶個）に形質導入した。４８時間後に細胞をＧ４１８（４００mg/ml)で選択した。このＧ４１８選択後（７-１０日後）に、抵抗性のある細胞を増殖し、アンチセンスＲＮＡ発現をノーザンブロットにより分析した。選択したＣＥＭＳＳ細胞集団は、ＣＤ４細胞表面マーカーの存在に関しても分析された。実施例２：ＣＥＭクローン又は集団のＨＩＶ−１チャレンジ形質導入されたＣＥＭ細胞のＨＩＶ複製及び該ウイルスの細胞変性効果に対する抵抗性は以下の様にして決定した。該細胞をインビトロでＨＩＶ−１（ＨＸＢ３）に感染させた。抗ウイルス効果は細胞生存率、上清中に生産されるｐ２４Ａｇのレベル、及び細胞表面のＣＤ４発現レベルによって測定した。感染はＨＩＶ配列に対するＰＣＲによって測定した。感染対象となるクローンに加えて、ベクターコントロールを有するＣＥＭＳＳもＨＩＶ−１に感染させた。 −１日目：感染（チャレンジ）に先立ち、クローンのＣＤ４発現をＦＡＣＳ分析によって試験した。０日目：１．細胞を計数した。２．ＣＥＭ（２ｘ１０⁶個）を５分間１２００rpmで遠心し沈降させた。３．上清を注ぎ出して細胞と分離した。４．培地中でウイルスストックを４０００又は４００ＴＣＩＤ₅₀／mlに希釈した。（培地：ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＣＣＳ，Ｐｅｎｉ１００U/ml，Ｓｔｒｅｐｔｏ１００mg/ml) ５．ウイルス希釈液（２ml）に細胞ペレット（２ｘ１０⁶個）を再び懸濁させた。非感染コントロール用には培地（２ml）を使用した。６．室温にて２時間、ローテーター（低速１８rpm）上でインキュベートした。７．細胞を遠心して沈降させた。８．ウイルス上清を注意深く吸引した。９．培地（７ml）を使用し、１２００rpm、１０分間の遠心で細胞を２回洗浄した。１０．培地（１０ml）に細胞を再び懸濁させた（ＣＥＭ最終濃度：２ｘ１０⁵/ml )。１１．３７℃、５％ＣＯ₂で４日間インキュベートした。４日目１２．−細胞を計数した。 −ｐ２４力価の為に１mlの遠心上清を−７０℃で凍結した。１３．細胞の継代：新鮮な培地中で最終濃度：２ｘ１０⁵/mlに希釈した。８日目：１４．８日目における分析 −細胞の計数をした。 −ｐ２４力価の為に１mlの遠心上清を−７０℃で凍結した。 −ＣＤ４染色の為に１０⁶の細胞を取得した(任意)。 −ＤＮＡＰＣＲの為に４００μｌに２ｘ１０⁶の細胞を溶菌させ、 −２０℃で凍結した。 −ＲＮａｚｏｌを使用して４ｘ１０⁶の細胞からＲＮＡを抽出し、 −７０℃で凍結した。（任意）１５．細胞の継代：新鮮な培地中で最終濃度：２ｘ１０⁵/mlに希釈した。１６．１６日目又はコントロールが死滅するまで、細胞は４日又は５日毎に植え継ぎ、対数増殖期に維持した。各継代毎に、細胞を計数し、上清を凍結した。実施例３：細胞内Ｔａｔ及びｐ２４の検出ＲｅｖＭ１０及びアンチセンスＨＩＶ−１配列を発現する、形質導入されたＣＥＭＳＳ細胞にＨＩＶ−１（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／１０⁶細胞／ml）を感染させた。４日目、６日目、８日目に、細胞を培地から除去し、洗浄し、冷たいＰＢＳ中に再び懸濁させ、氷冷メタノール中で３０分間固定した。固定した細胞を、細胞内ｐ２４検出の為にＦＩＴＣ結合抗ｐ２４モノクローナル抗体(Coulter KC57) で染色し、細胞内Ｔａｔ検出の為にマウス抗ＴａｔｌｇＧ１抗体(Repligen)で染色した(Rigg,R.J.，et al.,1995 J.lmmun.Methods188:187-195，フローサイトメトリーによる細胞内ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白質の検出)。Becton-Dickinson ＦＡＣＳｃａｎを用いて試料を分析した。実施例４：細胞内のアンチセンスＲＮＡの検出ＣＥＭ−ＳＳ細胞及び活性化ＰＢＬｓから全細胞ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ(Cinna/B iotecx)で抽出した。１０mgＲＮＡを1.2％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ＨｙｂｏｎｄＮメンブラン(Amersham)上に移し、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液(Amersham)中でハイブリダイズさせた。³²Ｐ−ｄＡＴＰを比活性（３ｘ１０⁸cpm／mg）で使用して、ターミナルトランスフェラーゼ(Boehringer MA)でオリドヌクレオチド（１００ng）を放射標識した。メンブランは標識されたプローブ（５ｘ１０⁶cpm／ml）で６５℃、１時間ハイブリダイズさせ、６５℃、１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄し、Ｘ線フィルム上に感光させるか、又は、Phos phorlmager（Molecular Dynamics）上で分析した。実施例５：ＰＢＬｓにおけるＨＩＶ−１複製のＰｏｌアンチセンス媒介阻害ヒトＰＢＬｓの形質導入及びＨＩＶ−１感染：健康な提供者から勾配遠心分離によってバフィーコートを分離した。ビオチニル化αＣＤ８＋及びαＣＤ１９＋抗体でＰＢＬのバルクを標識し、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ(Dynabeads M -280，Dynal A.S.，Norway)で消耗（depletion）させることで、ＣＤ４＋細胞が濃縮された（enriched）ものを得た。この濃縮されたＣＤ４＋ＰＢＬｓをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，５μｇ/ml）を用いて、イスコフ修飾ＤＭＥＭ培地中のｒ−放射化同種支持細胞上で７２時間刺激した。ＰＢＬｓ（２ｘ１０⁶）を８ μｇ/mlポリブレンの存在下で、スピノキュレーションによって形質導入した。４８時間後に、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ８−ＰＥ結合モノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって、該細胞のＣＤ４＋及びＬｙｔ２＋発現について分析した。Ｌｙｔ２＋を発現しているＰＢＬｓを、再び磁気ビーズ選択によって濃縮した。最初の濃縮後に、ＰＢＬｓを増殖させ、蛍光活性化セルソーティングFACS，Beckton-Dickinson,Vantage)を使用してＣＤ４＋／Ｌｙｔ２＋細胞を分離した。二回目の濃縮後には、細部集団の９０％以上がＣＤ４＋及びＬｙｔ２＋であった。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞（５ｘ１０⁴）に、該細胞を最後に再刺激した４日後に、６００ＴＣＩＤ₅₀／mlＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ（５）を４重で感染させた。９日間に亘って、培養上清の半分を毎日交換し、上清を−７０℃で保存して、ｐ２４ＡｇをＥＬＩＳＡで測定した。接種後７日目に生存細胞の数をトリパンブルー染色で計測した。実施例６：ＣＥＭ−ＳＳ細胞におけるＨＩＶ−１複製の阻害アンチセンス配列の効果を比較する為に、相補的転写物を発現する、形質導入されたＣＥＭ−ＳＳ細胞にＨＩＶ−１ＨＸＢ３ウイルス（４ｘ１０²ＴＣＩＤ₅₀／m l）を感染させた。培養上清中のｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡで測定することによってＨＩＶ−１複製を監視した。陰性コントロールとして、ｐｏｌ配列をセンス方向でコードするベクター（ｐＬＮ−ｐｏｌ／Ｓ）を使用した。図１６Ａは低ＨＩＶ−１接種用量における異なるアンチセンス配列の相対的効果を示している。ｅｎｖアンチセンスＲＮＡを発現するＣＥＭ−ＳＳ細胞は接種後１８日目にｐ２４を５０pg／１０⁶細胞放出し、ＨＩＶ−１複製をほぼ完全に抑制した。ｐｏｌ１及びｐｏｌ２アンチセンス配列によってｐ２４抗原生産が３．０ｌｏｇ₁₀ 減少し、ｖｉｆアンチセンス配列によってｐ２４抗原生産が１．０ｌｏｇ₁₀減少した。３’ＬＴＲアンチセンス構築物はコントロールベクターとの差が見られなく、これはノーザンブロット(図１５Ｂ)で観察されたアンチセンス転写物の発現レベルが低いことと関連する。以下の実験において、我々は、ＨＩＶ−１接種用量を１００倍増加させて４ｘ１０⁴ＴＣＩＤ₅₀／mlにし、ｐｏｌ１，ｐｏｌ２，ｖｉｆ及びｅｎｖアンチセンス構築物についてのみ試験した(図１６Ｂ)。全体的に、低ＭＯＩ試験に比べて、ＨＩＶ−１複製の開始は非常に早まり、複製速度論は非常に早くなった。１０日目に、コントロールＣＥＭ−ＳＳ細胞（ｐＬＮ−ｐｏｌ１／Ｓ）は高レベルのｐ２４抗原（２ｘ１０⁶pgp２４／１０⁶細胞）を培養上清中に放出した。しかしながら、この段階において、全てのアンチセンスＣＥＭ−ＳＳではコントロールに比べて、依然として実質的にＨＩＶ−１複製は阻害されていた。ＨＩＶ−１複製レベルは前の実験よりも高かったが、細胞内ｅｎｖ発現は再び最も強力な阻害剤（３．０ｌｏｇ₁₀減少）であり、続いて、ｐｏｌ１及びｐｏｌ２（２．０ｌｏｇ₁₀減少）で，アンチセンスｖｉｆ配列が最も弱い抗ウイルス阻害剤（１．０ｌｏｇ₁₀減少）であった。アンチセンスＲＮＡ発現ＣＥＭ−ＳＳを細胞変性作用がより弱いＳＦ２ＨＩＶ−１株を使用して感染させた場合でも同様の結果が得られた(データは示さず)。実施例７：ＨＩＶ阻害に関するアンチセンスＲＮＡの長さの影響我々の観察がＹ−ｇａｇアンチセンスＲＮＡに特異的ではないことを確認する為に、材料と方法に記載したように、より短いｐｏｌアンチセンス断片をコードするベクターを構築した。７９０ｎｔ長のアンチセンスｐｏｌ断片と１４００ｎｔのｐｏ１Ｉ断片の抗ウイルス活性を、ＨＩＶ−１ＨＸＢａウイルス（４ｘ１０³ ＴＣＩＤ₅₀／ml）で比較した。１４００ｎｔのｐｏｌ１断片に対して、抗ＨＩＶ−１効果における約５０％の減少がより短いｐｏｌ１断片で観察された(図１７Ａ)。この実験は、レトロウイルスによって発現されるアンチセンスＲＮＡの長さは抗ウイルス活性にとって重要な因子であることを更に証明している。アンチセンスＲＮＡの長さが１４００ｎｔ以上に長くなったときに抗ウイルス効果が増大するか否かの疑問に答える為に、完全なｐｏｌ遺伝子読み取り枠のアンチセンス転写物をコードするベクターも作成した。図１７Ｂによれば、１４００ｎｔのｐｏｌＩアンチセンス配列は、ＨＩＶ−１複製阻害に関して、２６００ｎｔのｐｏｌ１２アンチセンスＲＮＡ配列と同等の効果があった。ｐｏｌ１とｐｏｌ２アンチセンスＲＮＡの双方は同等の阻害レベルを示したので、発現レベル及び転写物の長さに加えて他の因子が、アンチセンスＲＮＡの効果に影響を及ぼす可能性があることをこの実験は示唆している。実施例８：ＲｅｖＭ１０及びアンチセンスＲＮＡの抗ＨＩＶ−１効果の比較高ＨＩＶ−１接種用量におけるアンチセンスｖｉｆ，ｐｏｌ１，及びｅｎｖ配列の抗ウイルス能力（効果）を、ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白質からのトランスドミナントであるＲｅｖＭ１０と比較した。ＲｅｖＭ１０は転写後に作用し、完全長ＨＩＶ−１転写物が核から細胞質に輸送されるのを阻止する。アンチセンスＲＮＡがＨＩＶ−１生活サイクルのどの段階で干渉するのかを調べる目的で、ＲｅｖＭ１０とアンチセンスＲＮＡが、ＨＩＶ−ＩＲＮＡ定常状態レベル及び構造蛋白質（ｐ２４）及び調節蛋白質（Ｔａｔ）発現に及ぼす影響を分析した。ＲｅｖＭ１０，ＤＲｅｖＭ１０(Plavec，l.，et al.，1977 Gene T her．4:128-139，トランスドミナントＲｅｖＭ１０蛋白質の高いレベルがセルライン及び初代Ｔ細胞内のＨＩＶ−１複製を阻害する為に要求される。ＡＩＤＳの遺伝子治療に対する意味合い)及びアンチセンスｖｉｆ，ｐｏｌ１，及びｅｎｖ配列を発現するポリクローナルＣＥＭ−ＳＳ細胞集団にＨＩＶ−１ＨＸＢ３ウイルス（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／１０⁶細胞）を感染させた(ＭＯＩ：０．１)。細胞上清中へ放出された分泌ｐ２４抗原を分析することによって、コントロール培養 (ｐＬＮ及びＤＲｅｖＭ１０)、並びにＲｅｖＭ１０及びｖｉｆ／ＡＳ細胞集団におけるウイルス複製の迅速な進展が示された(図１９)。対照的に、ｐ２４生産が２．０ケタ減少した様子がｐｏｌ／ＡＳ及びｅｎｖ／ＡＳＲＮＡ発現セルラインに観察された。感染後第４日目、第６日目、第８日目にＨＩＶ−１感染細胞から分離した全ＲＮＡ試料を分析した。第４日目の試料のノーザンブロット分析によって、全ての培養物において低レベルのＨＩＶ−１転写物が示された(図２０Ａ)。この時点では、全ての組み換え転写物の定常状態の発現レベルは同等であった。感染６日目では(図２０Ｂ)、コントロールベクター（レーン３）及びＤＲｅｖＭ１０（レーン２）で形質導入された細胞は高定常状態レベルのＨＩＶ−１転写物を発現していた。ＲｅｖＭ１０（レーン１）及びｖｉｆ／ＡＳ（レーン４）ベクターで形質導入された細胞は、それぞれのコントロール細胞集団の３分の一ないし５分の一の発現であり、ｐｏｌ／ＡＳ（レーン５）及びｅｎｖ／ＡＳ（レーン６）ベクターで形質導入された細胞は、依然非栄に低いレベルでＨＩＶ−１ＲＮＡを発現していた(図２０Ｂ)。この時点では、依然として、全ての組み換え転写物の定常状態の発現レベルは同等であった。下段のパネルを参考のこと。第８日目のＲＮＡ試料の分析によれば(図２０Ｃ)、おそらくは培養におけるＨＩＶ−１に誘発された大量の細胞死滅が原因で、コントロール細胞集団において、分析された３種全てのＲＮＡ転写物（ＨＩＶ−１，ベクター及びＧＡＰＤＨ）が分解されその量が減少していることが示された。ＲｅｖＭ１０及びｖｉｆ／ＡＳ発現細胞では高レベルのＨＩＶ−１ＲＮＡが検出され、それはｐｏｌ／ＡＳ発現細胞では５倍に増加していたが、ｅｎｖ／ＡＳＲＮＡ発現細胞では依然非常に低レベルであった。これと同時点おいて、感染細胞集団における細胞内ｐ２４Ｇａｇ及びＴａｔ蛋白質レベルを分析した。ＦＡＣＳで第８日目の試料を分析したところ、ｐｏｌ／ＡＳＲＮＡ発現細胞の２７％、ｅｎｖ／ＡＳＲＮＡ発現細胞のたった５％が、検出可能な量のｐ２４を発現していた(図２１Ａ)。このことは、低レベルのＨＩＶ転写物が観察されたことと関係がある。この時点において、ＲｅｖＭ１０遺伝子又はｖｉｆ／ＡＳＲＮＡを発現しているＣＥＭ−ＳＳ細胞のほぼ１００％が細胞内ｐ２４Ｇａｇ蛋白質に関して陽性であった。但し、ｖｉｆ／ＡＳ集団はより低レベルのｐ２４抗原を生産していた(平均蛍光強度１３５)。細胞内Ｔａｔ蛋白質レベルに関しても同様な結果が得られた。但し、このアッセイの感度はｐ２４Ｇａｇ蛋白質に対するものより低かった。図２１Ｂによれば、アンチセンスｐｏｌ及びｅｎｖＲＮＡ発現細胞のたった３−５％しか、検出可能なＴａｔ蛋白質を生産しておらず、これは、全体のＲＮＡ転写物レベルが低いという観察結果を説明できるものである。本発明ベクターのＨＩＶ阻害効果は図７から図２１に示されている。ｇａｇ，ｐｏｌ及び／又はｅｎｖに対するアンチセンスを有するベクターのように、より長いアンテセンス断片を有するベクターは効果のより優れた阻害剤である。ＲｅｖＭ１０及びアンチセンス構築物を有する結合（combination）ベクターは、ＲｅｖＭ１０又はアンチセンスを単独で有するベクターに比べてより有効である。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expressionTechnical field The present invention relates to the inhibition of HIV-1 replication using antisense RNA expression. .Background art Human immunodeficiency virus (HIV) -1 infection is associated with acquired immunodeficiency syndrome (AID). It is considered to be the main cause of S). HIV-1 is the two full-length RNA It is a retrovirus having a genome consisting of copies. Bound by a particular theory Without intending that, replication of the virus in CD4 + host cells It is assumed to occur as follows. When host cells are infected, the virus Is transcribed into double-stranded DNA by reverse transcriptase. This double-stranded D The NA is then integrated into the chromosome of the host cell. This double-stranded DNA is When incorporated into genetic material, it is called a provirus. Of host cells Following activation, the provirus is transcribed into RNA through two different steps. In the early stages of infection, proviral RNA transcripts produced in the nucleus are It is converted to multiple copies of short sequences by the vesicle splicing enzyme. these Short RNA transcripts include, for example, tat that regulates subsequent transcription, and late transcription. Like rev mediates the transition to the stage Encodes a unique protein. This initial stage takes about 24 hours. Cell activation After about 24 hours, the transcript moves to a late stage. In this late stage transcription, Long 9200 base long RNA transcript and single-splice without chair Transcribed RNA transcript of about 4500 bases moves from the nucleus into the cytoplasm You. These unspliced or single-spliced transcripts are Encodes a structural or enzymatic protein of the virus. These splices Untranscribed or single-spliced transcripts include, inter alia, viral core proteins. Gag encoding white matter, pol encoding viral enzyme, and two types of envelope And an env encoding a hoop protein. FIG. 4 shows the genome structure of HIV-1. Is shown. These genes show some overlap Please pay attention. This is because some genes share several base sequences . These unspliced or single (single) -spliced turns The transcript is further spliced, and the resulting mRNA is translated into a new window. Produces the proteins needed to produce ruth. The gag and pol regions are translated To produce the polyproteins gag and gag-pol, which are And forms the mature protein found in the virus. env is sp Rice to produce a subgenomic messenger encoding the env polyprotein , Which are similarly cleaved to produce the mature envelope protein. Two viruses The RNA is then wrapped in a core and surrounded by capsid proteins, thus obtained Virus is released from the cell along with a portion of the cell membrane. Various antisense strategies have been attempted to prevent HIV-1 infection. So Among them, transdominant proteins (Bevec, D., et. al.1992.Proc.Acad.Sci.USA 89: 9870-9874, retrovirus mediated dominant negative Type 1 human in T cells by gene transfer of the active rev transactivator Immunodeficiency virus replication inhibition, and Trono, D., et al. 1989, Cell 59: 113-120, H IV-1 gag mutants dominantly (dominant) interfere with wild-type virus replication May be. ), Single chain antibodies (Levy-Mintz, P., et al., 1996, J. Virol. 70: 8821). -8832, by targeting human immunodeficiency virus type 1 integrase Intracellular expression of single-chain antibody variable fragments to inhibit early stages of the ills life cycle ), Antisense RNAs (Chatterjee, S., et al., 1992, Science 258: 1485-14). 88, HIV-1 in vitro with adeno-associated virus antisense vector H., et al., 1994, Antisense Res. And Dev. 4: 19-29, HI V-1 packaging signal and antisense including rev response element -1 in a human CD4 + lymphocyte cell line expressing RNA and sense RNA Inhibition of growth; Joshi, S., et al., 1991, J. Virol. 65: 5524-5530, Antisense and Of human immunodeficiency virus type 1 proliferation by expression of RNA and sense RNA; Kim, J.H., et. al., 1996, J. Acquir. lmmune Defic. Syndr. 12: 343-351, based on HIV-1 H by the sense and antisense Rev response elements in torovirus vectors Inhibition of IV replication; Mever, J., et al., 1993, Gene129: 263-268, against reverse transcriptase Inhibition of HIV replication by high copy number vectors expressing antisense RNA Harm; Renneisen, K., et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337-16342, against env region. Targeted (labeled) with an antibody containing antisense RNA Targeted) In Vitro Production of Human Immunodeficiency Virus Type 1 by Liposomes Current inhibition; Rhodes, A., et al., 1990, J. Gen. Virol. 71: 1965-1974, endogenous synthesis. Of Human Immunodeficiency Virus in Cultured Cells by Selected Antisense RNA RNA decoy (Decoy) (Lee, T., et al., 1994, J. Virol. 68: 8254-8 Strong Rev response consisting of a minimal 264,13 nucleotide Rev binding domain Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human T cells by element decoys Sullenger, B.A., et al., 1990, Cell 63: 601-608, due to overexpression of the TAR sequence. Conferring cellular resistance to human immunodeficiency virus replication) and ribozymes (Ojwang , J. 0., et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10802-10806, Hairpin Riboza Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Expression by Im; Zhou, C..l. Bahner, et al. , 1994, Gene 149: 33-39, anti-tat transduced by retrovirus and HIV- in human T lymphocytes by anti-rev hammerhead ribozyme 1 inhibition). Transdominant HIV-1 protein RevM10 has been genetically engineered. Was first evaluated in clinical trials using isolated peripheral blood lymphocytes (Woffendin, C . et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 2889-2894. Prolonged T cell survival in patients with human immunodeficiency virus infection), Zyme (Leavitt, MC., Et al., 1996, Gene Ther. 3: 599-606. Transduction and expansion of their CD4 + lymphocytes in vitro: a ribozyme gene therapy trial ) And based on transdominant Rev and antisense TAR ( Morgan R.A., et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7: 1281-1306, clinical protocol: H HIV-1 antisense T to syngeneic lymphocytes in identical twins infected with IV-1 Retroviruses for delivering AR and transdominant Rev protein genes Gene therapy of AIDS using vector-mediated gene transfer) Approved. Intracellular expression of antisense RNAs is attractive for inhibiting HIV-1 replication Another means for gene therapy is provided. Antisense RNAs are prokaryotic and Very specific and efficient inhibitors in both eukaryotic systems Was. In vitro synthesized antisense oligonucleotides or expressed in cells Virus replication by adding antisense RNAs Have been successful. Inhibition of HIV-1 replication has so far been described by several viruses. Methods using antisense RNAs that target regulation (Chatterjee. Et al., 1 992; Joshi, et al., 1991; Kim. et al., 1996: Sczakliel, G. et al. et al., 1991, J.V. irol.65: 468-472, in human T cells stably expressing antisense RNA Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication and Sczakliel, G. et al. et al., 1992, J. Virol. 66: 5576-5581, Generation of antisense RNA against Tat- and Rev- Inhibition and destruction of human immunodeficiency virus type 1 replication: temporal (temporary) Analysis), and methods using antisense RNAs targeting structural gene products ( Choli, et al., 1994; Gyotoky, et al., 1991; Meyer, et al., 1993; Rhodes, et. al. 1990). Long expressed in cells using retroviral vectors Antisense sequences (Choli, et al., 1994; Gyotoky, et al., 1991; Rhodes, et al. , 1990) or a long antibody expressed by liposome delivery targeted (labeled) with an antibody. There are several reports on sense sequences (Renneisen, et al.). In these reports The difference in the level of inhibition observed in Two that can affect the hybridization kinetics between two complementary RNAs That reflects variations in the secondary and tertiary RNA structures (Sczakiel, G., M. Homann, K. Rittner, 1993, Antisense Res. And Dev. 3: 45- 52, type 1 human immunodeficiency Use of computer for effective antisense RNA target sequence against virus Search), affecting biological activity. Generally, these attempts are targeted at early-stage transcription (eg, tat Or rev gene), or late stage translation initiation or RNA processing. It was a target. The antisense sequence is folded and forms a secondary structure by itself. Conventionally, short antisense sequences are preferred due to the risk of formation. Had been. To date, these attempts have not been successful enough. Now, surprisingly, the best targets for antisense therapy are full length and Was found to be a single spliced RNA transcript. A certain gene Antisense Sequences That Bind Multiple Spliced Transcripts Are Not Effective This is probably not true for binding to smaller transcripts, Available antisense components for binding to glu-spliced transcripts This may be due to the small number of children. In addition, for full-length transcripts Long sequences (eg, sequences longer than 600 base pairs, preferably longer than 1000 base pairs) Surprisingly effective, and contrary to expectations in the industry, undesirable secondary structures Does not appear to form. Hereinafter, human CD4⁺T cell line (CEM-SS) and peripheral blood CD4⁺T lymph Pol, vif, en in HIV-1 infection test using spheres (PBLs) The results of the antiviral activity of the v gene and the sequence complementary to the 3 'LTR are shown. Retroviral vectors are 1100-1400 nucleotide (nt) long complementary It is constructed to express chimeric RNAs containing HIV-1 sequences. HIV The most effective inhibition of -1 replication is in both CEM-SS cell lines and PBLs. And HIV Observed when using a complementary antisense sequence to the -1 env gene Was. This potent antiviral activity has also been demonstrated in high-dose infection studies. Wherein the reduction of HIV-1 mRNAs has low levels of Gag and Tat proteins. Correlated with production, which indicates that antisense RNA is produced early during HIV-1 replication. It means that it is used. The anti-HIV- 1 The effect of the transdominant RevM described in the well-known literature 10 (Bevec, D., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 9870-9874, de. Retrovirus-mediated gene for the minant negative rev transactivator Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human T cells by transfer; Escaich , S., et al., 1995, Hum. Gene Ther., 6: 625-634, HI in chronically infected T cells. RevM10-mediated inhibition of replication of V-1; Malim, M.H., et al., 1992, J. Exp. 176: 1197-1201, Stable development of transdominant rev protein in human T cells Inhibition of human immunodeficiency virus replication by now; and Nabel, G.J., et al., 1995. , Hum. Gene Ther., 5: 79-92, Transdominant of Rev for AIDS effect. Compared to the negative form (molecular genetic intervention) Inhibition of HIV-1 replication is shown. In addition, the gag, env, and pol portions of the full-length transcript, especially env and po Antisense sequences to the l moiety have been found to be particularly effective. The antisense construct described above can be used for gene therapy in HIV-1 infected patients. For example, HIV-1 susceptable cells of such patients, for example, , CD4 + cells or their precursor cells (eg, CD34 + / Thy-1 + cells). Hematopoietic stem cells) to form the antisense of the present invention. Transduced cells and their progenitor cells against HIV-1 infection. It is particularly useful for treatments that consist of making it resistant. The antisense construct of the present invention comprises a wild-type HIV-1 gene or Fragment) into the vector in the opposite direction to its promoter, When the offspring are integrated into the host cell genome and transcribed, the inverted strand of DNA (opp osite strand) is transcribed and binds to mRNA from the wild-type gene or gene fragment. To produce complementary messenger RNA transcripts that are Anneals with mRNA from the gene fragment to form an inactive RNA-RNA duplex This duplex is degraded by cellular RNase. Transduction of HIV-1 sensitive cells using an antisense construct is performed in vivo ( in vivo) or ex vivo (ex vivo), taking blood from the patient, Select target cells and add extracellular cells with the vector having the antisense construct of the present invention. And then the target cells are returned to the body again. Appropriate. By natural selection, the transduced HIV-1 resistant cells are transformed into wild type H Replaces IV-1 susceptible cells, thus helping patients overcome infection and restore immune competence. Make it possible to recover. Alternatively, the patient can obtain an anti- Receive non-self CD4 + cells or progenitor cells transduced with the sense construct. Disclosure of the invention Therefore, the present invention 1. When stably integrated into human cells, env, env and pol, Or HIV-1 pro which encodes env, pol and gag An mRNA transcript from a virus can be annealed, for example, under in vivo conditions. At least 0.6 kb, preferably 1 kb b, most preferably 1-2 kb, for example, 1.1 kb to 1.5 kb in length. A nucleic acid sequence selected from the following group: (I) Apa1 cleavage site at about the 2004th base of HIV-1 provirus Pflm1 cleavage at about position 3400 of HIV-1 provirus from position Antisense to the 1.4 kb fragment up to the site, eg, the sequence of FIG. 1 (SEQ. . ID. NO. Sequences that are antisense to 1); (Ii) Pflm1 cleavage at about base 3400 of HIV-1 provirus EcoR1 cleavage at about base 4646 of HIV-1 provirus from the site Antisense to the 1.2 kb fragment up to the cleavage site, for example, the sequence of FIG. 2 (SE Q. ID. NO. A sequence that is antisense to 2); (iii) ApaL1 cleavage at about base position 6615 of HIV-1 provirus Bsm1 cleavage at about base 8053 of the HIV-1 provirus from the cleavage site Antisense to the 1.3 kb fragment up to the cleavage site, for example, the sequence of FIG. 3 (SE Q. ID. NO. A sequence that is antisense to 3); and (iv) at least 80%, preferably 90%, of the sequence in (i), (ii) or (iii) %, Most preferably 99%, produced by (i), (ii) or (iii) MRNA transcripts and annies that are the same as the mRNA transcript that hybridizes to the mRNA A sequence capable of producing mRNA that Is provided. The nucleic acid described in 1 above is an RNA in a retrovirus vector. Yes, it is considered that DNA is used for provirus integrated into target cells. I want to be understood. Both RNA and DNA forms of the construct are within the scope of the invention. Further, the present invention provides 2. A vector comprising the antisense sequence of 1 is provided. The vector may be any vector that can transduce human hematopoietic cells. Such as homo-directional, hetero-directional, bi-directional or pseudo-type retro Virus (pseudotyped), adeno-associated virus (AAV), adenovirus (AV) Can be a doctor. Preferably, the vector of the invention is a retroviral vector And preferably has a long terminal repeat (LTR). For example, Moloney murine leukemia virus (MoMLV), myeloproliferative sarcoma Ils (MPSV), or mouse fetal stem cell virus (MESV), or Miler and R osman (1980) From the pLN series described in BioTechniques 7, pp. 980-986 This is the vector of choice. The antisense sequence is based on the retrovirus env, po Replaces 1 and / or gag. Promoters that regulate antisense expression Can be a strong viral promoter such as, for example, MoMLVLTR. You. The range of host cells infected by the retrovirus or retroviral vector The box is generally determined by the env protein of the virus. Packaging details Recombinant virus produced from the vesicle is provided by the packaging cell It can be used to infect virtually any cell type recognized by the env protein. Can be. Infection integrates viral genome into transduced cells As a result, Stable expression of the offspring product is performed. The efficiency of infection depends on the level of receptor expression on the target cells. Related to the bell. Generally, MoMLV mouse allotropes env are rodents While capable of infecting cells, the amphotropic env has some effects, including rodents, birds and humans. Infect primate cells. The heterotrophic vector system uses the mouse heterotrophic env And this can also infect humans. Inn of retrovirus vector Main range replaces env protein of base virus with that of second virus It is possible to change by doing. The resulting pseudotyped virus Controls the envelope proteins and is expressed by packaging cells. Has a host range of Lus. For example, derived from vesicular stomatitis virus (VSV-G) Extending host range by replacing MMLVenv protein with G-glycoprotein You can do it. Preferably, the vector of the present invention and a packaging cell (cell) are used. Is employed as appropriate for transduction of human cells. Preferably, Bek The vector is an amphotropic retroviral vector, for example, as described in the Examples below. Vector. Optionally, the vector comprises one or more antisense sequences as set forth in 1 above, eg, As shown in the following examples, pol and env can be contained. Preferably, the construct comprises a retroviral gag, pol and / or env sequence. Gag, pol and / or env functions in packaging cells Must be granted in trans. That is, the vector structure The ga produced by the cell when it was introduced into the packaging cell The g-pol and env proteins assemble with the vector RNA and become replication defective or transduced. Produces incoming virions and is secreted into the medium. The virus produced in this way is Infect target cells It can be integrated into the DNA, but generally it is an essential viral vector. No infectious virus particles are produced due to the loss of rows. Packaging cellulite Transfection with separate plasmids encoding gag-pol and env. Preferably resulting in replication-competent retrovirus (RCR) production This requires multiple rounds of recombination. Appropriate retrovirus vector package Caging cell lines include those based on the mouse NIH / 3T3 cell line and PA317 (Miller & Buttimore (1986) Mol. Cell Biol., 6: 2895; Miller & Ro sman (1989) BioTechniques 7: 980), CR lp (Danos & Mulligan (1988 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460) and gp + am12 (Markowitz, et al., ( 1998) Virology 167: 400) and all based on human 293 cells or monkey COS cells Cell lines, for example, Pear et al., (1993) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 90: 8392-839. 6; Rigg et al., (1996) Virology 218; Finer, et al., (1994) Blood 83: 43-50; La ndau, et al., (1992) J. Virol. ProP as described in 66: 5110-5113 There is an akA packaging cell. Retroviral vector DNA is stable or Is introduced into packaging cells by transient transfection and Produce viral vector particles. The antisense constructs of the present invention may further comprise, for example, tat or rev mutants. Transdominant mutations corresponding to early mRNA transcripts such as Has the advantage of not interfering with the expression of HIV inhibitory proteins, such as proteins. You. Such a transdominant mutein may be a feature of the wild-type HIV protein. Their expression is very important in the treatment of HIV infection, since it interferes with HIV capacity and blocks HIV replication. It is valid. The transdominant mutein of particular interest is RevM10 It is. This use For use, for example, Escaich, et al., Hum. Gene Ther. (1995) 6: 625-634 and It is described in WO90 / 14427. Previously, HIV antisense and transdominance The co-expression of the mutated protein is antisense It was considered impractical to interfere with protein expression. A of the present invention HIV antisense and transdominant bursts can be used with antisense constructs. Not only can the mutant protein be co-expressed, but also the replication cycle of the virus The ability to interfere with the virus at different stages can exert synergistic inhibition of HIV. Therefore, the present invention further provides the following aspects. 3. Transgene of HIV-1 inhibitory protein gene, eg, tat or rev The above-mentioned 2 further comprising a gene in the form of a mutant mutant, particularly the RevM10 gene. (That is, having the antisense sequence of 1). A packaging cell having the vector of 2 or 3 above, for example, as described above. Lines are also within the scope of the present invention. The present invention further provides the following aspects. 4. It is stably transduced with the antisense of the above 1 and further, if necessary, tat or re. v, especially the RevM10 gene Introduced, for example, transduced by the vector of 2 or 3 above, And at least one human hematopoietic cell (eg, a CD4 + cell or a precursor thereof, eg, a stem cell). Cells, eg, CD34 + / Thy-1 + cells, comprising: The method used in method 5. The present invention further provides the following aspects. 5. A method for treating HIV-1 infection in a subject (patient) in need of treatment What Hematopoietic cells (eg, CD4 + cells or precursors thereof, eg, stem cells, eg, CD34 + / Thy-1 + cells) from a patient, The above-mentioned cell is transduced with the above-mentioned one antisense sequence, and tat Or an HIV-1 inhibiting transdominant mutant form of rev, in particular RevM1 0, and transduced into the cells with, for example, the vector 2 or 3. Enter, and Returning the transduced cells back to the patient. The present invention further provides the following aspects. 6. The cell of the above 4, wherein the antisense sequence of the above 1 or the vector of the above 2 or 3 is used Use for the manufacture of a composition or use for the method of treatment of the above 5.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the sense gene orientation of HIV-1 HXB2 strain polymerase gene region 1 (20 04-3400 bp). FIG. 2 shows that the HIV-1HXB2 strain polymerase gene region 2 (34 00-4650 bp). FIG. 3 shows the HIV-1HXB2 strain envelope gene region (661) in the sense direction. 5-8053 bp). FIG. 4 shows the genome structure of HIV-1. Antisense used in vector construction The location of the fragment is also shown. Restriction enzyme cleavage (cleavage) site is described in each fragment Have been. FIG. 5 shows a schematic structure of the antisense vector of the example. Parent vector -PLN-1 is A. Dusty Miller & Guy J. Rosman (1989) BioTechniques 7.980-9 86. Mal from Neo gene An antisense fragment is inserted using the chicloning site 3 '. Binding vector The parent vector for pLMNNL-1 is Escaich, S. Kalfoglu, C .; Plavec, l .; et al. . Human Gene Therapy 1995.6.625-634. FIG. 6 shows a series of deletions of the HIV gag sequence. The construction of the deletion fragment is as follows It is described in. A 1.5 kb SacI-BglII psi-gag fragment (Ψ -Gag) to create deleted fragments by PCR amplification or restriction enzyme digestion. You. FIG. 7 shows HIV challenge of the deleted fragment. pLN-gag (S) and And pLN-gag (AS) are those of a full-length 1.5 kbpsi-gag fragment. These correspond to the sense and antisense directions, respectively. pLN-gag-500 is Fragment corresponding substantially to the psi (packaging signal) sequence of HIV-1 At the 5 'end. The pLN-gag1000 construct is the gag region of the 1.5 kb fragment. It corresponds to the area. FIG. 8 shows the anti-HIV-1 activity of antisense gag deletion fragments as a function of their length. It is shown as a number. That is, the relationship between the size (length) and the anti-HIV-1 activity is shown in the graph. Is shown in Expressed in base pairs for p24 production (pg / 10E6 cells) Fragment lengths are plotted on the graph. FIG. 9 shows HIV challenge of antisense gag and Vif constructs. You. Full length 1.5 kb antisense gag (pLN1 Psi sense and Antisense) and similar length Vif fragments (pLN1Vif sense and antisense). Sense). FIG. 10 shows gag-pol / AS constructs and high dose of virus ( 40000 TCID50). 1.5 kb Psi-gag fragment (pLN-gag / AS and S ) And a pol-1 fragment (pLM-pol / AS and S). FIG. 11 shows HIV challenge of antisense pol, env and LTR constructs. Is shown. pol-1 fragments (pLN-pol (AS) / 1 and (S) / 1), The second antisense pol-2 (pLNDpol (AS) / 2) envelope (p CE with LNDEnv (AS)) and 3 'LTR (pLNDLTR (AS)) fragments MSS cells were challenged with 400 TCID HIV-1. FIG. 12 shows pLNpol1 / env antisense vector and HIV-1 Pol1 (S), pol1 (AS), pol1 (AS) / env ( S), pol (AS) / env (AS) effects, indicating double antisense Constructs are most effective. FIG. 13 shows the HIV-1 challenge of the ligation vector. Control LMTNL and ATGless RevM10 with RevM10 gene The two parental vectors of LAMTNL with the gene and the full length 1.5 kb A corresponding ligation vector having the psi-gag sequence in the antisense orientation. LMTNL-Y and LAMTNL-Y with 400 TCID50 HIV-1 Change. FIG. 14 shows inhibition of HIV replication in peripheral blood lymphocytes by pol antisense. Indicates harm. FIG. 15A shows the structure of the retroviral vector encoding the antisense sequence. Is shown. Neo and Lyt2 are used as selectable marker genes. Anti The sense sequence and marker gene are expressed from the MoMLV LTR promoter You. The arrow indicates the antisense direction of the inserted HIV-1 sequence. FIG. B shows the absence of antisense RNA expression in transduced CEM-SS cells. Show Zan blot analysis I have. Recombinant transcripts with antisense sequences were detected using Neo-specific probes. Is detected. The lower panel shows a GAPDH-specific probe and a high The same blot that was hybridized is shown. Lane 1: pLN vector, lane 2: pLN-pol1 / AS vector, lane 3: pLN-pol2 / AS vector Lane 4: pLN-vif / AS vector, lane 5: pLN-env / AS vector, lane 6: pLN-3′LTR / AS vector, lane 7: pL N-pol12 / AS vector. FIG. 16 shows inhibition of HIV-1 replication in transduced CEM-SS cells. Is shown. A: CEM-SS cell population (1 × 10⁶Cells / ml) to HIV-1H XB3 strain (4 × 10^TwoTCID₅₀/ Ml). B: HIV-1 dose increased The transduced CEM-SS cell population was^FourTCID₅₀Infected with / ml Let Culture supernatants are tested by ELISA for p24 antigen production. The experiment is It is performed twice. FIG. 17 shows that the vectors encoding the complementary pol sequences of different lengths Evaluation of 1 effect. A. Anti-HIV-1 effect of pol1_deletion construct. 1400 nt pol1 and 790 nt pol antisense and sense pol1 constructs HIV-1HXB3 strain was added to CEM-SS cells expressing^ThreeTCID₅₀/ M Infect with l. B. 1400nt pol1 and 2600nt pol12an HIV-1 HXB3 strain was added to CEM-SS cells expressing the chisense sequence in 4 × 1 0^ThreeTCID₅₀/ Ml. Use the corresponding sense sequence as a control To use. FIG. 18. Expression of antisense RNA in transduced PBLs and HIV -1 shows inhibition of replication. A. pL-Lyt-pol1 / AS, pL-Lyt2 / pol1 / S, pL-Lyt-env / AS, pL Activated CD4 transduced with Lyt2 / env / S vector⁺Many Total cellular RNA is isolated from the new PBLs and selected for Lyt2 expression. Radiation target Antisense transcription by Northern blot using a Lyt2 specific probe Analyze the object. To monitor the amount of RNA provided with a GAPDH-specific probe Used for Lane 1: pL-Lyt-pol1 / AS, Lane 2: pL-Ly t2 / pol1 / S, lane 3: pL-Lyt2-env / AS, lane 4: p L-Lyt2 / env / S, lane 5: pL-Lyt2-pol1 / AS. B. Transduced CD4⁺, Lyt2⁺Activates selected PBLs in allogeneic feeder cells And infect the clinical HIV-1 isolate JR-CSF. 5x10^FourThree cells P24 antigen production is measured by double inoculation. FIG. 19 shows the transdominant Re in the high inoculation dose HIV-1 infection test. between vM10 and vif, pol1 and env antisense RNA expressed in cells It is a comparison. CEM-SS cells (1 × 10⁶/ Ml) to the HIV-1 HXB3 strain ( 1x10^FiveTCID₅₀/ Ml) and measure p24 antigen production in the culture supernatant To monitor virus replication. FIG. 20 shows the HIV-1HXB3 strain (1 × 10^FiveTCID₅₀/ Ml) inoculated C Detection of HIV-1, antisense and RevM10 transcripts in EM-SS cells Show. On days 4, 6 and 8 after infection, total cellular RNA was obtained from CEM-SS cells. To separate. A radiolabeled TAR-specific oligonucleotide probe was used Analyze HIV-1 specific transcripts by Northern blot. Antisense or Re Expression of the vM10 transcript was determined using Neo and Rev specific probes, respectively. To detect. Used to monitor the amount of RNA provided with a GAPDH-specific probe. To use. Lane 1: RevM10, Lane 2: DRevM10, Lane 3: pLN (vector Lane 4: pLN-vif / AS, lane 5: pLN-p ol1 / AS, lane 6: pLN-env / AS. Panel A: Day 4, Panel B : Day 6, Panel C: Day 8. FIG. 21 shows p24 and Tat expression in HIV-1 infected CEM-SS cells. 2 shows the analysis. A. On day 8 after infection, the intracellular expression of p24 is measured. Average fluorescence intensity The degree reflects relative p24 cell expression. B. Transduced HIV-1 sensation Fig. 4 shows detection of Tat protein in stained CEM-SS cells. On the 8th day after infection An aliquot of the CEM-SS cells was fixed with methanol and stained with a Tat-specific antibody. Color and analyze by FACSScan.Example 1 Construction of a retroviral vector having an antisense HIV-1 sequence A. Dusty Miller & Guy J. Rosman (1989) BioTechniques 7. 980-986 Thus, using pLN as parent vector, different antisense HIV-1 sequences Was prepared as follows. a) pLN-gag / AS vector: 1420 bp SacI-BgIII (675 bp-2095) from HIV-1 HXB2 strain bp) The fragment was isolated and an antiserum was placed at the blunt-ended HindIII site of the pLN-1 vector. In the sense direction. The direction of the fragment was determined by digestion with ClaI. Specified. b)3 'deleted pLN-gag / AS vector: A series of deletion fragments from a 1420 bp SacI-BglII (675 bp-2095 bp) fragment Was made by PCR amplification. The 5 'end of the fragment was used as a primer (675b p-695bp): It was used. As the 3 'end, Primer 3.6 (pos. 1897-1900): Primer 3.5 (pos. 167-1700): Primer 3.4 (positions 1479-1500): Primer 3.3 (positions 1280-1300): Primer 3.2 (positions 1079-1100): Primer 3.1 (positions 884-904): It was used. The PCR fragment with BamHI and blunt ends was It was cloned into the amHI-HpaI site. The created fragment is about 1200 bp , 1000bp, 800bp, 600bp, 400bp, 200bp . c)Removal of psi sequence from gag fragment: The 1420 bp SacI-BglII (65 bp-2095 bp) fragment was converted to PvuII. Digest with restriction endonuclease and psi package from the 5 'end of the fragment 494 bp corresponding to the signal were removed. The obtained fragment (gag500 / AS) And gag1000 / AS) as blunt-ended fragments in HindII of the pLN vector. And cloned. d)pLN-Vif / AS vector: 110 bp EcoRI-Eco corresponding to the Vif-Vpr gene of the virus The RI fragment (4646bp-5742bp) was isolated from the HIV-1 HXB2 strain and At the HindII site in the antisense orientation. e)pLN-pol1 / AS vector: Apal-Pf of 1480 bp corresponding to the 5 'end of the Pol gene of the virus The lmI fragment (2005 bp-3485 bp) was isolated from the HIV-1 HXB2 strain and At the HindII site of the vector in the antisense orientation. f)pLN-pol2 / AS vector: 1250 bp PflmI-E corresponding to the 3 'end of the viral Pol gene The coRI fragment (3485 bp-4646 bp) was isolated from the HXB2 strain of HIV-1 and The vector was inserted into the HindII site in the antisense orientation. g)pLN-env / AS vector: ApaL of 1440 bp corresponding to the intron region of the virus Env gene The I-BsmI fragment (6615 bp-8053 bp) was isolated from the HIV-1 HXB2 strain and pL It was inserted into the HindII site of the N vector in the antisense orientation. h)pLN-pol1 (AS) -env (AS) vector: The pol1 fragment of e) was inserted 5 'of the env construct of g) and these were Both were inserted into the HindII site of the pLN vector in the antisense direction (FIG. 12). . i)pLN3'LTR / AS vector: A 1260 bp BamHI-HindIII fragment corresponding to the 3 'LTR of the virus Fragment (8474 bp-9615 bp) was isolated from the HIV-1 HXB2 strain and the pLN vector It was inserted in the antisense orientation at the XhoI site. j) Insert the 2642 bp ApaI-EcoRI fragment in the reverse direction into the pLN vector Retroviral vector pLN-pol12 / containing the full-length pol sequence AS was created. Sense control vectors pLN-pol1 / S and pLN -A 1400 bp ApaI-PflmIpol fragment for pol12 / S and The 2642 bp DApaI-EcoRIpol fragment was inserted into the pLN vector in the sense direction. Inserted in The pLN-79Opol1 / AS vector contains the pol gene 79 The 0 bp BglII-NsiI subfragment was inserted into the XhoI site of the pLN vector. It was constructed. Retrovirus vector (pLLyt2-pol1 / AS, pLLy t2-pol1 / S, pLLyt2-env / AS, and pLLyt2-env / S) is a mouse CD8 (Lyt) truncated with the Neo gene. 2) Cell markers (Forestell, S.P., et al., 1997, Gene Ther. 4: 19-28. New Retrovirus Packaging Cell Line: Complementary Directivity and Efficient Genetics Primary T cell HIV infection constructed in place of (improved vector production for offspring transfer) Used for testing. k)Binding vector: LMTNL and LΔMTNL having transdominant RevM10 gene And its ATG-less form (ΔM) (Escaich, S., Kalfoglou, C .; Lavec, l. Et al., Human Gene therapy 1995. 6 625-634) al and digested with 12 corresponding to the Gag gene region from the HXB2 strain of HIV-1. A 00 bp ClaI-BglII fragment was inserted. l)Retroviral vector production: Using the calcium phosphate transfection protocol, allotropin B Transfer 10 μg of retroviral DNA to OSC packaging line I did it. Amphotropic using transient (transient) amphotropic viral supernatant The PA317 packaging cell line was transduced. pLN vector is Neo These cells are selected for G418 because they carry the gene. After selecting, The defined cell population was analyzed by Northern blot for RNA expression. Appropriate Virus from selected PA317 cell line with retroviral construct Supernatant supernatant was collected and analyzed for transduced virus titer and human CD4 + T cellular In CEMSS was transduced. Instead of BOSC as packaging line GP47 (Rigg, R.J., et al 1996. Virology 218: 290-295, a new human bispecific finger) Directional packaging cell line: high titer, complement resistance, and improved safety) Was also used. Using supernatant from the GP47 packaging cell line, (Forestell, S.P et al., 1997 Gene Ther. 4: 19-28, a new retrovirus Lus packaging cell line: for complementary directivity and efficient gene transfer Spinoculation (as in improved vector production). And transduced into the amphotropic ProPakA cell line (Rigg, R.J. et al., 1996). Entered. The endpoint titer of the retrovirus was determined by drug selection (800 mg / ml G41 8) Later, it was measured in NIH3T3 cells, and the Lyt2 vector (Forestell, S. P. et al. 1997) was measured by FACS analysis. m)Target cell transduction: 4-5 hours in 5 ml DMEM + 10FCS + 8 μg / ml polybrene Human CD4 + T with supernatant from amphotropic virus with sense vector construct Cell line CEMSS cells (2 × 10⁶Were transduced. Cells after 48 hours Was selected with G418 (400 mg / ml). After this G418 selection (after 7-10 days) Proliferate resistant cells and measure antisense RNA expression by Northern blot. Analysis. The selected CEMSS cell population is dependent on the presence of CD4 cell surface markers. Was also analyzed. Example 2: HIV-1 challenge of CEM clones or populations HIV replication of transduced CEM cells and cytopathic effect of the virus Resistance was determined as follows. The cells were infected with HIV-1 (HXB3) in vitro. Antiviral effect Cell viability, level of p24Ag produced in supernatant, and CD4 expression on cell surface Measured by current level. Infection was measured by PCR for HIV sequences . CEMSS with vector control in addition to the clone to be infected Were also infected with HIV-1. Day -1: FACS analysis of CD4 expression of clones prior to infection (challenge) Tested by Day 0: 1. Cells were counted. 2. CEM (2x10⁶Were centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes to sediment. 3. The supernatant was poured out and separated from the cells. 4. 4000 or 400 TCID of virus stock in medium₅₀/ Ml . (Medium: RPMI 1640, 10% CCS, Peni 100 U / ml, Strep to 100mg / ml) 5. Cell pellet (2 × 10 5) in virus dilution (2 ml)⁶Was resuspended . Medium (2 ml) was used for uninfected controls. 6. Incubate for 2 hours at room temperature on a rotator (low speed 18 rpm). 7. The cells were spun down and spun down. 8. The virus supernatant was carefully aspirated. 9. The cells were washed twice by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes using the medium (7 ml). Was. 10. The cells were resuspended in medium (10 ml) (CEM final concentration: 2 × 10^Five/ ml ). 11.37 ° C, 5% CO_TwoFor 4 days. 4th day 12. -The cells were counted. One ml of the centrifuged supernatant was frozen at -70 ° C for -p24 titer. 13. Cell passage: final concentration in fresh medium: 2x10^Five/ ml. Day 8: 14.8 Analysis at Day 8 -The cells were counted. One ml of the centrifuged supernatant was frozen at -70 ° C for -p24 titer. -10 for CD4 staining⁶Cells were obtained (optional). -2x10 in 400 μl for DNA PCR⁶Lyse the cells, Frozen at -20 ° C. 4x10 using RNazol⁶Extract RNA from cells of Frozen at -70 ° C. (Any) 15. Cell passage: final concentration in fresh medium: 2x10^Five/ ml. 16. Cells are plated every 4 or 5 days on day 16 or until control is killed. And maintained in exponential growth phase. At each passage, cells were counted and the supernatant was frozen.Example 3: Detection of intracellular Tat and p24 Transduced CE expressing RevM10 and antisense HIV-1 sequence HIV-1 (1 × 10^FiveTCID₅₀/ 10⁶Cells / ml) Was. On days 4, 6 and 8, cells were removed from the medium, washed and cold PBS. In ice-cold methanol for 30 minutes. Remove the fixed cells FITC-conjugated anti-p24 monoclonal antibody (Coulter KC57) for intracellular p24 detection With mouse anti-Tat IgG1 antibody (Repligen) for intracellular Tat detection Stained (Rigg, R.J., et al., 1995 J. lmmun. Methods 188: 187-195, flow site Detection of intracellular HIV-1 Rev protein by metrology). Becton-Dickinson FA Samples were analyzed using CScan. Example 4:Detection of antisense RNA in cells Total cellular RNA was obtained from CEM-SS cells and activated PBLs using RNAzol (Cinna / B iotecx). 10 mg RNA on 1.2% agarose / formaldehyde gel And transferred onto Hybond N membrane (Amersham), followed by Rapid-hy Hybridized in b buffer (Amersham).³²P-dATP with specific activity (3x 10⁸cpm / mg) and use terminal transferase (Boehringer MA) Orido nucleotides (100 ng) were radiolabeled. The membrane is a labeled professional Bead (5x10⁶cpm / ml) at 65 ° C for 1 hour. Wash with SSC, 0.1% SDS and expose on X-ray film or Phos Analysis was performed on a phorlmager (Molecular Dynamics). Example 5: Pol antisense-mediated inhibition of HIV-1 replication in PBLs Transduction of human PBLs and HIV-1 infection: Gradient centrifugation from healthy donors Therefore, the buffy coat was separated. Biotinylated αCD8 + and αCD19 + anti Label the bulk of the PBLs with streptavidin-conjugated magnetic beads (Dynabeads M -280, Dynal A.S., Norway) depletion of CD4 + cells An enriched one was obtained. This concentrated CD4 + PBLs is Using hemagglutinin (PHA, 5 μg / ml) in Iscove-modified DMEM medium Was stimulated on r-activated allogeneic feeder cells for 72 hours. PBLs (2x10⁶) To 8 Transduction was performed by spinoculation in the presence of μg / ml polybrene. 48 After hours, anti-CD4-FITC and anti-CD8-PE conjugated monoclonal antibodies were used. CD4 + and Lyt2 + expression of the cells by flow cytometry Was analyzed. PBLs expressing Lyt2 + were again used for magnetic bead selection Therefore, it was concentrated. After initial enrichment, PBLs are grown and a fluorescence activated cell sorter CD4 + / Lyt2 + cells using a scanning FACS, Beckton-Dickinson, Vantage) Was isolated. After the second enrichment, more than 90% of the fine population had CD4 + and Lyt 2+. Primary CD4 + T cells (5 × 10^Four), The cells are finally restimulated 4 days later, 600 TCID₅₀/ Ml HIV-1 JR-CSF (5) in quadruplicate I let it. Change half of the culture supernatant daily for 9 days and store the supernatant at -70 ° C Then, p24Ag was measured by ELISA. Seven days after inoculation, the number of surviving cells was It was measured by Pan Blue staining. Example 6: Inhibition of HIV-1 replication in CEM-SS cells To compare the effects of the antisense sequences, transduced cells expressing complementary transcripts were used. HIV-1HXB3 virus (4 × 10^TwoTCID₅₀/ M l) infected. Measuring p24 antigen level in culture supernatant by ELISA To monitor HIV-1 replication. Pol sequence as a negative control A vector encoding in the sense direction (pLN-pol / S) was used. FIG. 16A Figure 7 shows the relative effect of different antisense sequences at low HIV-1 inoculation doses. You. CEM-SS cells expressing env antisense RNA were 18 days after inoculation p24 to 50 pg / 10⁶Cells were released and HIV-1 replication was almost completely suppressed. p The p24 antigen production was 3.0 log with the ol1 and pol2 antisense sequences._Ten The vif antisense sequence reduces p24 antigen production by 1.0 log._TenDecrease did. The 3 'LTR antisense construct shows no difference from the control vector. This is the expression of the antisense transcript observed in the Northern blot (FIG. 15B). Associated with lower levels. In the following experiments we used HIV-1 inoculation. 4x10 with 100x increase in volume^FourTCID₅₀/ Ml, pol1, pol2, Only tested for vif and env antisense constructs (FIG. 16B). Overall, compared to the low MOI test, the onset of HIV-1 replication is much faster, Kinetics have become very fast. On day 10, control CEM-SS cells (pL N-pol1 / S) has high levels of p24 antigen (2 × 10⁶pgp24 / 10⁶cell) Was released into the culture supernatant. However, at this stage, all antisense SEM-SS still substantially replicates HIV-1 compared to controls Was inhibited. HIV-1 replication levels were higher than in previous experiments, but intracellular env expression is again the most potent inhibitor (3.0 log_TenDecrease) followed by p ol1 and pol2 (2.0 log_TenDecrease), the antisense vif sequence is the most Weak antiviral inhibitor (1.0 log_TenDecrease). From antisense RNA The current CEM-SS was infected using a less cytopathic SF2 HIV-1 strain. A similar result was obtained with this (data not shown). Example 7: Effect of antisense RNA length on HIV inhibition Confirm our observations are not specific for Y-gag antisense RNA Code a shorter pol antisense fragment, as described in Materials and Methods. Vector was constructed. 790 nt long antisense pol fragment and 1400n The antiviral activity of the po1I fragment of HIV-1HXBa virus (4 × 10^Three TCID₅₀/ Ml). Anti-HI against 1400 nt pol1 fragment Approximately 50% reduction in V-1 effect was observed with the shorter pol1 fragment (FIG. 1). 7A). This experiment demonstrates the use of antisense RNA expressed by retroviruses. Length further proves to be an important factor for antiviral activity. When the length of antisense RNA becomes longer than 1400 nt, To answer the question of whether the effect will be increased, a complete pol gene open reading frame Vectors encoding antisense transcripts were also created. According to FIG. The 0 nt pol I antisense sequence is 2600 for HIV-1 replication inhibition. It was as effective as the nt pol12 antisense RNA sequence. pol1 and p Because both ol2 antisense RNAs showed comparable levels of inhibition, And other factors in addition to transcript length affect the effectiveness of antisense RNA. This experiment suggests that it may be possible. Example 8: Comparison of anti-HIV-1 effect of RevM10 and antisense RNA Antisense vif, pol1, and env sequences at high HIV-1 inoculation doses Antiviral ability (effect) of HIV-1 Rev protein from transdominan And RevM10. RevM10 turns Acts post-transcriptionally, preventing full-length HIV-1 transcripts from being transported from the nucleus to the cytoplasm You. At what stage of the HIV-1 life cycle does antisense RNA interfere? For the purpose of investigation, RevM10 and antisense RNA were Effect on expression level and expression of structural protein (p24) and regulatory protein (Tat) Was analyzed. RevM10, DRevM10 (Plavec, l., Et al., 1977 Gene T her. 4: 128-139, High levels of transdominant RevM10 protein are cellular It is required to inhibit HIV-1 replication in inn and primary T cells. AIDS Implications for gene therapy) and antisense vif, pol1, and env The polyclonal CEM-SS cell population expressing the sequence was added to the HIV-1HXB3 Luz (1x10^FiveTCID₅₀/ 10⁶Cells) were infected (MOI: 0.1). cell Control cultures were analyzed by analyzing the secreted p24 antigen released into the supernatant. (pLN and DRevM10), and RevM10 and vif / AS cell populations Rapid progression of virus replication was demonstrated (FIG. 19). In contrast, p24 production A 2.0 digit decrease is observed in pol / AS and env / AS RNA expression cell lines. Was observed. On day 4, day 6 and day 8 after infection, Total RNA samples separated from the samples were analyzed. For Northern Blot analysis of day 4 samples Thus, all cultures showed low levels of HIV-1 transcript (FIG. 20). A). At this point, the steady state expression levels of all recombinant transcripts are comparable. Was. On day 6 of infection (FIG. 20B), control vector (lane 3) and DR Cells transduced with evM10 (lane 2) have high steady state levels of HIV-1 Transcripts were expressed. RevM10 (lane 1) and vif / AS (lane 4) ) The cells transduced with the vector represent 3 min of each control cell population At least one One-fifth of the expression, pol / AS (lane 5) and env / AS (lane 6). ) The cells transduced with the vector still have non-negligibly low levels of HIV-1 RNA. Was expressed (FIG. 20B). At this point, all recombinant transcripts are still Were equivalent in steady-state expression levels. See the lower panel. Day 8 Analysis of the RNA samples (FIG. 20C) suggests that HIV-1 Analyzed in control cell populations due to induced massive cell killing All three RNA transcripts (HIV-1, vector and GAPDH) are degraded The amount was shown to decrease. RevM10 and vif / AS expressing cells High levels of HIV-1 RNA are detected in pol / AS expressing cells Although it was increased 5-fold, it was still at a very low level in env / ASRNA-expressing cells. there were. At the same time, intracellular p24Gag and T in the infected cell population At protein levels were analyzed. When the sample on the eighth day was analyzed by FACS, p ol / ASRNA-expressing cells 27%, env / ASRNA-expressing cells only 5% Expressed a detectable amount of p24 (FIG. 21A). This is a low level Related to the observation of HIV transcripts. At this point, RevM10 Almost 100% of CEM-SS cells expressing gene or vif / ASRNA Was positive for intracellular p24Gag protein. However, the vif / AS population is It produced lower levels of p24 antigen (mean fluorescence intensity 135). Similar results were obtained for intracellular Tat protein levels. However, this The sensitivity of Say was lower than that for p24Gag protein. According to FIG. 21B Only 3-5% of cells expressing antisense pol and envRNA are detectable Does not produce a functional Tat protein, This may explain the observation that total RNA transcript levels are low. The HIV inhibitory effect of the vector of the present invention is shown in FIGS. gag, like vectors with antisense to pol and / or env Vectors with long antisense fragments are better inhibitors. Re The combination vector with vM10 and the antisense construct is R It is more effective than evM10 or a vector having antisense alone.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者エスケーシュ・ソニアフランスパリエフ―75013，リュ・ヴェルグニョー 19番 (72)発明者イルベス・ハイニアメリカ合衆国カリフォルニア州 94306，パロアルト，カリフォルニア・アヴェニュ 730エス番 (72)発明者ベレス・ゲイバーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94031，パロアルト，ハーカー・アヴェニュ 1350番──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE) , DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL , AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU , IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Eské Sonia France Paris F-75013, Lu Vergno 19 (72) Inventor Irbeth Haini United States 94306, Palo Alto, California Avenue 730 Es S. No. 730 (72) Inventor Beles Gay Bar United States 94031, Palo Alto, Harker Avenue 1350

Claims

[Claims] 1. When stably integrated into human cells, env, env and pol, or Shows mRN from HIV-1 provirus encoding env, pol and gag A mRNA that anneals to the A transcript can be generated and is selected from the following group: Nucleic acid sequence: (I) Apa1 cleavage site at about the 2004th base of HIV-1 provirus Pflm1 cleavage at about position 3400 of HIV-1 provirus from position A sequence that is antisense to a 1.4 kb fragment up to the site; (Ii) Pflm1 cleavage at about base 3400 of HIV-1 provirus EcoR1 cleavage at about base 4646 of HIV-1 provirus from the site A sequence that is antisense to a 1.2 kb fragment up to the cleavage site; (Iii) ApaL1 at about base position 6615 of HIV-1 provirus Bsm1 at about base 8053 of the HIV-1 provirus from the cleavage site A sequence that is antisense to the 1.3 kb fragment up to the cleavage site; and (iv) at least 80% homology with the sequence in (i), (ii) or (iii), ), (Ii) or mRNA transcription that hybridizes with the mRNA produced by (iii) A sequence capable of producing an mRNA that anneals to the same mRNA transcript as the product. 2. 4. An antisense to the sequence shown in FIG. 1, FIG. 2 or FIG. 1 nucleic acid sequence. 3. A retroviral vector having at least one of the nucleic acid sequences according to claim 1 or 2. Tar. 4. 4. The retrograde of claim 3, further comprising at least one HIV inhibitory protein gene. Will vector. 5. The retroviral vector according to claim 4, wherein the HIV inhibitory protein is RevM10. . 6. A stable transduction with the antisense sequence of claim 1 or 2, and At least one human hematopoietic cell stably transduced with an IV inhibitor protein gene A cell composition having vesicles. 7. The human hematopoietic cells are hematopoietic stem cells, and the HIV inhibitory protein is RevM10. 7. The cell composition of claim 6, wherein 8. A method for treating HIV-1 infection in a subject (patient) in need of treatment What Isolating hematopoietic cells from the patient; Transducing the cells with the vector of claim 3, 4 or 5, and Returning the transduced cells back to the patient. 9. The antisense sequence according to claim 1 or 2, or the antisense sequence according to claim 3, 4, or 5. Use of the vector for the production of the cell composition according to claim 6 or 7, or treatment according to claim 8. Use for treatment. 10. All novel compounds, methods, and Uses.