JP2001502549A - ヘルパーウイルス配列を含有するａａｖ ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＡＡＶ−ウイルス粒子を形成させるために必要であるヘルパーウイルス配列を有するＡＡＶ−ＤＮＡ、かかるＤＮＡを含む系および両者の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルパーウイルス配列を含有するＡＡＶ ＤＮＡ 本発明は、ヘルパーウイルス配列を有するＡＡＶ ＤＮＡ、かかるＤＮＡを含 む系およびその使用に関する。 ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）は、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウ イルスである。それらの複製のため、すなわち、ウイルス粒子を形成するため、 ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、具体的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイル スを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、宿主細胞のゲノ ム、具体的には、第１９染色体の特異的な部位に組み込む。 ＡＡＶのゲノムは直鎖状であり、約４６８０ヌクレオチドの長さを有する。そ れは、構造遺伝子および非構造遺伝子をコードする２つの読み枠を含有する。該 構造遺伝子をｃａｐ遺伝子という。それは、Ｐ４０プロモーターにより制御され 、３つのキャプシドタンパク質をコードする。該非構造遺伝子をｒｅｐ遺伝子と いい、Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅ ｐ４０をコードする。前者２つのタンパク質は、Ｐ５プロモーターの制御下で発 現し、一方、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現は、Ｐ１９プロモーターにより 制御されている。Ｒｅｐタンパク質の機能は、とりわけ、ＡＡＶゲノムの複製と 転写の制御により代表される。 組換え（ｒ）ＡＡＶウイルス粒子の標品は、例えばアデノウイルスまたはヘル ペスウイルスなどのヘルパーウイルスが頻繁に混入していることが知られている 。この混入は、遺伝子治療のためのｒＡＡＶウイルス粒子の使用を著しく限定す る。ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離または濾過法によりヘルパーウイルスを除去する ためになされた努力は、これまで、ほとんど成功をおさめず、とりわけ、これら の方法は、コストおよび収率の点で消極的であることを証明するステップを含む 。 したがって、本発明の目的は、ｒＡＡＶウイルス粒子がヘルパーウイルスの混 入なしに提供されうる産物を提供することにある。 本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。 したがって、本発明の主題は、ＡＡＶウイルス粒子の生成に必要なヘルパーウ イルス配列を有するＡＡＶ ＤＮＡに関する。 本発明は、本発明のＡＡＶ ＤＮＡが細胞に一般に存在するｒＡＡＶベクター を誘導し、かつｒＡＡＶウイルス粒子を生じさせる目的のヘルパーウイルスの添 加を必要とすることなく同じ目的の外来ＤＮＡを含むために役に立つという出願 人の知見に基づく。 「ＡＡＶ ＤＮＡ」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要なヘル パーウイルス配列を含んでもよいいかなるＡＡＶ ＤＮＡ配列をも含有する。 「ヘルパーウイルス配列」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要 なヘルパーウイルスのいかなる配列にも関する。かかる配列は、具体的には、ヘ ルペスウイルスおよび／またはアデノウイルス由来であり、より具体的にはアデ ノウイルス５由来である。該配列は、ウイルスゲノム全体またはその断片を含有 してもよい。 「ｒＡＡＶべクター」の語は、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要であ る、ヘルパーウイルスのＤＮＡを除く外来ＤＮＡを含んでもよい、いかなるＡＡ Ｖウイルス粒子およびそのＤＮＡをも含有する。 前記例外において、「外来ＤＮＡ」の語は、ＡＡＶベクターに組み込まれうる いかなるＤＮＡにも関する。該外来ＤＮＡは、非コードまたはコードであっても よい。前者の場合、該外来ＤＮＡは、ＤＮＡ複製および／または転写の制御エレ メントであってもよい。後者の場合、外来ＤＮＡが発現可能であることが好まし く、発現が、組織特異的なプロモーターなどの誘導可能なプロモーターにより制 御されることが特に有利である。さらに、該外来ＤＮＡは診断用および／または 治療用タンパク質をコードしてもよい。治療用タンパク質の例示は、腫瘍壊死因 子、血漿タンパク質およびレセプターなどである。さらに、該外来ＤＮＡは、Ａ ＡＶベクターのいかなる部位にも挿入してもよい。 本発明のＡＡＶ ＤＮＡは一般の方法により調製されうる。補遺として、ザン ブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら，モレキュラー・クローニング，ア・ラ ボラトリー・ハンドブック〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ〕（１〜３巻），コールドスプリングハーバ ー，ニューヨーク（１９８９）が参照される。さらに、実施例１において、本発 明のｐＴＧ９５８５ ＡＡＶ ＤＮＡの調製が参照される。このＡＡＶ ＤＮＡ は、ヘルパーウイルス配列として、Ｅ１領域を除く完全なアデノウイルス５配列 を含有する。ｐＴＧ９５８５が好ましい。それは、ＤＳＭ〔Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ〕，ブラウンシュヴェーグに、ＤＳＭ １１２４８の番号の 下、プラスミドｐＴＧ９５８５として、１９９６年１０月１８日に寄託された。 また、本発明のＡＡＶ ＤＮＡは、アデノウイルス５配列の構造遺伝子Ｌ１、具 体的には１６６１４〜１８６６９のヌクレオチドの領域における欠失を有するｐ ＴＧ９５８５とは異なるものが好ましい。このＡＡＶ ＤＮＡを、ｐＴＧ９５８ ５Δ１６６１４〜１８６６９という。なお、本発明のＡＡＶ ＤＮＡは、全１８ ３２３塩基対から、一方の欠失がアデノウイルスのキャプシド遺伝子の大部分に 関し、他方の欠失がアデノウイルスのＥ３領域に関する２つの欠失を含有する点 でｐＴＧ９５８５とは異なるものが好ましい。このＡＡＶ ＤＮＡをｐＤＧとい い、ＤＳＭに、プラスミドｐＤＧとして、ＤＳＭ １１８１７の番号の下、１９ ９７年１０月１５日に寄託された。 本発明のさらなる主題は、前記の成分、すなわち、ＡＡＶ ＤＮＡ、ｒＡＡＶ ベクターおよび任意に細胞を含有する系に関する。該ＡＡＶ ＤＮＡおよび／ま たは該細胞は、ｒＡＡＶベクターのＡＡＶ配列に関して、相補体を表わす。「細 胞」の語は、ＡＡＶの吸着および増殖を可能にする、いかなる細胞、特に哺乳類 細胞にも関する。 本発明により、ヘルパーウイルスを使用することがないｒＡＡＶウイルス粒子 標品を提供することが可能である。したがって、該ｒＡＡＶウイルス粒子標品も ヘルパーウイルスを含まない。これは、特に本発明のｐＤＧ ＡＡＶ ＤＮＡが 使用されるときに示される。さらに、該ｒＡＡＶウイルス粒子標品は、ＡＡＶ野 生型を含まない点が特徴的である。それらも本発明の主題を表わす。 本発明のｒＡＡＶウイルス粒子標品は、細胞の形質導入に完全に適する。それ らの使用に先立って該標品をＤＮアーゼで遊離のＡＡＶ ＤＮＡが分解されるよ うに処理することが好ましい。考慮される細胞は、身体に存在する、あるいは身 体から単離されるあらゆる細胞である。それゆえ、本発明により、エクス・ビボ およびイン・ビボ遺伝子治療用の処置を講ずることが可能である。 図面の説明 図１は、本発明のｐＴＧ９５８５ ＡＡＶ ＤＮＡを得るためのクローニング ストラテジーを示す。 図２は、本発明のｐＤＧ ＡＡＶ ＤＮＡを得るためのクローニングストラテ ジーを示す。 本発明を下記実施例により説明する。 実施例１： 本発明のＡＡＶ ＤＮＡ ｐＴＧ９５８５の調製 ｐＴＧ９５８５を得るためのクローニングストラテジーを図１に示す。ＰＵＣ ８ＭＭＴＶ〔ファゼル（Ｆａｓｅｌ）ら，（１９８２），ＥＭＢＯ Ｊ．１，３ 〜７頁〕由来のＭＭＴＶ ＬＴＲ断片をプラスミドｐＢＳＳＫＩＩ（＋）〔スト ラタジーン社〕のマルチクローニング部位に挿入する。ついで、完全なｒｅｐ 遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶ２プロモーターであるｐ１９およびｐ ４０を含む、ｐＡＶ２由来の４２３５ｐｂのＡＡＶ２配列〔Ｇｅｎｅ ２３，６ ５−７３（１９８３）〕を、合成オリゴヌクレオチドアダプターにより該プラス ミドに挿入する。したがって、得られたプラスミドｐＢＭＡ２において、Ｒｅｐ ７８タンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現をそれぞれ制御するＡＡＶ２プロ モーターｐ５が、ＭＭＴＶプロモーターにより置き換えられる。ついで、ＭＭＴ Ｖ−ＬＴＲならびにＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子からなる完全な 発現カセットを、ベクターｐＡｄＲＳＶｆ３ｇａｌ〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ．９０，６２５−６３０〕にＲＳＶ−βｇａｌ断片の代わりに挿入する。この ように得られたプラスミドｐＡＭＡ２中において、該ＭＭＴＶ−ＡＡＶ２断片は 、アデノウイルスの配列が両側に隣接する〔５’：０−１．０マップ単位；３’ ：９．４−１８マップ単位〕。 相同組換え〔シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０， ４８０５−４８１０頁（１９９６）〕により、ｐＡＭＡ２由来のＭＭＴＶ−ＡＡ Ｖ２断片をプラスミドｐＴＧ３６０２〔前記、シャルティエ（Ｃｈａｒｔｉｅｒ ）らを参照〕に挿入する。したがって、得られたプラスミドｐＴＧ９５８５は、 ＭＭＴＶ−ＡＡＶ２断片により置き換えられるＥ１領域を除き、完全なアデノウ イルス５配列を含む。ｐＴＧ９５８５は、本発明のＡＡＶ ＤＮＡを表す。 実施例２： 本発明のｐＴＧ９５８５Δ１６６１４−１８６６９ ＡＡＶ ＤＮ Ａの調製 ＲｓｒＩＩを用いる制限消化により、ヌクレオチド１０９８３−１８６７０の 欠失（値はアデノウイルス５配列に関する）を実施例１で調製したＡＡＶ ＤＮ Ａ ｐＴＧ９５８５に挿入する。その後、欠失させたＤＮＡ分子にヌクレオチド １０９６３−１６６１３を含むサブフラグメントを再び挿入する。したがって、 該欠失は、アデノウイルス５の構造遺伝子Ｌ１由来の２０５６ｂｐ（ヌクレオチ ド１６６１４−１８６６９）の範囲を含有する。本発明のｐＴＧ９５８５Δ１６ ６１４−１８６６９ ＡＡＶ ＤＮＡが得られる。 実施例３： 本発明のｐＤＧ ＡＡＶ ＤＮＡの調製 ＣｌａＩおよびＳｇｆＩを用いる制限消化により、実施例１で調製したＡＡＶ ＤＮＡ ｐＴＧ９５８５に、ヌクレオチド５５２８−２３６７７の欠失を挿入 する。この欠失（１８１４９塩基対）は、ｒＡＡＶウイルス粒子の形成に重要な アデノウイルス５キャプシド遺伝子およびＶＡ領域の大部分を含有する。この領 域（１７０４塩基対）を、ｐＴＧ９５８５の残りのＣｌａＩ／ＳｇｆＩ断片に再 び付加する。この目的のために、アデノウイルスのＶＡ領域っをＰＣＲにより増 幅し、前記ＣｌａＩ／ＳｇｆＩ断片と連結しうるＶＡ断片を得るように、それぞ れ、ＣｌａＩおよびＳｇｆＩに和合可能な５’末端および３’末端それぞれとと もに提供する。１６４４５塩基対の欠失を含むＡＡＶ ＤＮＡ ｐＴＧ９５８５ が得られる。このＡＡＶ ＤＮＡをｐＴＧ９５８５Δ１６４４５という。 さらなる欠失をｐＴＧ９５８５Δ１６４４５に挿入する。それはアデノウイル ス５−Ｅ３領域に関連し、１８７８塩基対（３０８２７−３２７０５）を含有す るＸｂａＩ断片として存在する。この目的のために、ｐＴＧ９５８５をＢｇｌＩ 消化に供し、アデノウイルス５−Ｅ３領域を含有するＢｇｌＩ断片（２７０９７ −３．４４５）を単離し、ｐＢＳＳＫＩＩ（ストラタジーン）にクローン化する 。得られたＤＮＡ分子は、前記ＸｂａＩ断片を分離しうるように、ＸｂａＩ消化 に供される。該ＤＮＡ分子の残りを再連結し、ＢｇｌＩ消化後、アデノウイルス ５−Ｅ３領域を欠く得られたＢｇｌＩ断片を相同組換えによりｐＴＧ９５８５Δ １６４５５に挿入する。本発明のｐＤＧ ＡＡＶ ＤＮＡが得られる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月７日（１９９８．１２．７） 【補正内容】 請求の範囲 １． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１２４８の下、１９９６年１０月１８日に寄 託された、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要であるヘルパーウイルス配 列を有するＡＡＶ ＤＮＡ。 ２． ＡＡＶ ＤＮＡがアデノウイルス５配列の構造遺伝子Ｌ１における欠失を 含有してなる、請求項１記載のＡＡＶ ＤＮＡ。 ３． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１８１７の下、１９９７年１０月１５日に寄 託された、請求項２記載のＡＡＶ ＤＮＡ。 ４． 請求項１〜３のいずれか記載のＡＡＶ ＤＮＡ、ｒＡＡＶベクターおよび 任意に細胞を含有してなる系。 ５． ヘルパーウイルスが混入していないｒＡＡＶウイルス粒子標品の生産のた めの、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要であるヘルパーウイルス配列を 有するＡＡＶ ＤＮＡの使用。 ６． ヘルパーウイルスが混入していないｒＡＡＶウイルス粒子標品の生産のた めの、ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要であるヘルパーウイルス配列を 有するＡＡＶ ＤＮＡ、ｒＡＡＶベクターおよび任意に細胞を含有する系の使用 。 ７． ヘルパーウイルス配列がヘルペスウイルスに由来する、請求項５または６ 記載の使用。 ８． ヘルパーウイルス配列がアデノウイルスに由来する、請求項５または６記 載の使用。 ９． アデノウイルスがアデノウイルス５である、請求項８記載の使用。 １０． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１２４８の下、１９９６年１０月１８日に 寄託された、請求項６、８または９いずれか記載の使用。 １１． ＡＡＶ ＤＮＡがアデノウイルス５配列の構造遺伝子Ｌ１における欠失 を含有してなる、請求項１０記載の使用。 １２． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１８１７の下、１９９７年１０月１５日に 寄託された、請求項１１記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グリム，ディルク ドイツ連邦共和国 ルードヴィヒスハーフ ェン デー―67059 カイザー―ウィルヘ ルム―シュトラーセ 88 (72)発明者 リットネ，カローラ フランス国 ストラスブール エフ― 67000 リュ ド ブッシーニョ，17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＡＡＶウイルス粒子を生じさせるのに必要であるヘルパーウイルス配列を 有するＡＡＶ ＤＮＡ。 ２． ヘルパーウイルス配列がヘルペスウイルスに由来する、請求項１記載のＡ ＡＶ ＤＮＡ。 ３． ヘルパーウイルス配列がアデノウイルスに由来する、請求項１記載のＡＡ Ｖ ＤＮＡ。 ４． アデノウイルスがアデノウイルス５である、請求項３記載のＡＡＶ ＤＮ Ａ。 ５． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１２４８の下に寄託された、請求項１記載の ＡＡＶ ＤＮＡ。 ６． ＡＡＶ ＤＮＡがＤＳＭ １１８１７の下に寄託された、請求項１記載の ＡＡＶ ＤＮＡ。 ７． 請求項１記載のＡＡＶ ＤＮＡ、ｒＡＡＶベクターおよび任意に細胞を含 有してなる系。 ８． ヘルパーウイルスが混入していないｒＡＡＶウイルス粒子標品の生産のた めの請求項１記載のＡＡＶ ＤＮＡおよび請求項７記載の系の使用。