【発明の詳細な説明】
免疫不全ウイルス感染の治療方法発明の分野
本発明は抗ウイルス療法およびペプチド化学の分野に関する。よく詳しくは、
本発明は顕著な抗ウイルス活性を有する細胞溶解性ペプチド(lytic peptide)に
関する。発明の背景
天然に現れる細胞溶解性ペプチドは、決定的でないにしろ昆虫において免疫的
作用物質として重要な役割を果たし、同様に、ある範囲の動物においても防御機
能を与えているようである。これらのペプチドは細胞膜を破ることによって原核
細胞および他の非宿主細胞を破壊し、これにより細胞溶解を促進する。これらの
天然に現れる細胞溶解性ペプチドの共通の特徴には、全体としての塩基性電荷、
サイズの小さいこと(23〜30アミノ酸残基)、両親媒性α−ヘリックスまたはβ−
プリーツシートが含まれる。いくつかの細胞溶解性ペプチドに見られる他の特徴
は、疎水性の尾部、すなわち、ペプチドの末端に位置する種々の長さの疎水性ア
ミノ酸の非両親媒性配列である。
両親媒性ペプチドのいくつかのグループが同定されており、セクロピン(cecro
pins)(Hultmarkらに与えられた米国特許第4,355,104号および4,520,016号に最初
に記載された)、ディフェンシン(defensins)、ザルコトキシン(sarcotoxins)、
メリチンおよびマゲイニン（Zasloffに与えられた米国特許第4,810,777号に記載
された）が含まれる。これらのグループの各ペプチドは配列および２次構造の特
徴で区別される。
ペプチド誘導細胞溶解のメカニズムはペプチドの定められた２次構造と正電荷
密度に依存している。これらのペプチドがその効果を発揮するメカニズムの説明
に関するいくつかの仮説が提出されてきた。例えば、このペプチドはイオンチャ
ンネルまたは細胞膜を通る孔を形成し、浸透圧的に誘導される細胞溶解を引き起
こすかもしれない。
天然に現れる細胞溶解性ペプチドの活性合成アナログが作り出され、種々の原
核細胞および真核細胞に対してin vitroでテストされてきた（例えばArrowoodら
、J．Protozool.，38:161s(1991);Jaynesら、FASEB J.，2:2878(1988))。それら
には、グラム陽性およびグラム陰性バクテリア、真菌、酵母、原虫および腫瘍性
または形質転換哺乳動物細胞が含まれる。これらの研究により、合成ペプチドア
ナログは種々のタイプの細胞に対して天然に現れるペプチドよりも高い溶解活性
レベルを有し得ることが明らかになった。細胞溶解性ペプチドに関する議論は、
天然に現れる、または合成の双方について、Jaynesの“Lytic peptides，use fo
r growth，infection and cancer”WO 90/12866に見ることができる(この文献は
本明細書に含まれるものとする)。これらの文献は細胞溶解性ペプチドの明確な
性質を述べ、活性な合成細胞溶解性ペプチドの幾つかの配列を述べている。
このペプチド作用の特異性は両親媒性ペプチドの濃度とペプチドが相互作用す
る膜のタイプに依存している。Jaynes，J.M．ら、Peptide Research，2:157(198
9)では、このようなペプチドに対して溶解しやすくする、形質転換または腫瘍性
哺乳動物細胞の変化した細胞骨格的特徴について議論している。正常な、ヒトの
非形質転換細胞は、任意のペプチド濃度で影響を受けないままだが、形質転換細
胞は溶解した；しかしながら、正常細胞は細胞骨格阻害剤、サイトカラシンDま
たはコルヒチンで処理されると、溶解に対する感受性が増加する。実験により両
親媒性ペプチドの正常哺乳動物細胞に対する作用は限られていることが示された
。この溶解に対する耐性は正常細胞のよく発達した細胞骨格ネットワークのため
であることが最も考えられる。これに対して、形質転換細胞株は、細胞骨格上の
欠陥を有することが知られているが、溶解感受性である。溶解に対する細胞の感
受性が異なるために、細胞溶解性ペプチド濃度を生体内の同じ部位において一つ
の細胞タイプに対しては溶解を起こさせ他のタイプに対してはそうでないように
操作することが出来る。
AIDS（後天性免疫不全症候群）の原因ウイルス、一般にHIV（ヒト免疫不全ウ
イルス）と呼ばれているウイルスはヒトＴ細胞白血病HTLVIIIと呼ぶのがより適
切であり、従って、最近ある種の白血病の原因として記載されている幾つかのレ
トロウイルスの一つである。AIDSは1981年以来、珍しい症候群として臨床的に認
識されてきた。この疾病の顕著な特徴はＴヘルパー細胞集団の量的な低下であり
、感染性疾患に対する感受性が極めて増大する結果を引き起こし、ウイルス感染
の宿命的な結果である日和見感染による死という最終的な結末を伴うものである
。このウイルスはレトロウイルスとしてRNAを含み、ウイルスゲノムをDNAの形で
最終的には宿主の遺伝へ組み込むことを可能とする幾つかの特別な酵素を有して
いる。このウイルスは何年もの間「サイレント」であり続けることができ、ある
種の条件下で、ウイルスゲノムが活性化され感染性ウイルスが多量に作り出され
、犠牲者のＴヘルパー細胞集団の最終的な枯渇を生じさせる。免疫系のこの構成
要素は日々出会う感染と戦うために絶対に必要なものである。HIV感染は、一つ
には、従来のワクチン処置を無効にする非常に多様で変異しやすいコート特性の
ために非常に治療が難しい。発明の概要
本発明は、レトロウイルスまたはエンベロープウイルスに感染した動物を治療
する方法に関するものである。本方法は感染した動物を、細胞溶解性ペプチドに
よりウイルスまたはウイルス感染細胞に対して致死であるが、健全な細胞には致
死量以下である濃度で治療することを含む。本発明のさらなる実施態様は、レト
ロウイルスまたはエンベロープウイルスに感染した動物をウイルスまたはウイル
ス感染細胞に対して致死量以下であるが、非感染性のウイルス粒子を産生する感
染細胞を生じさせる用量の細胞溶解性ペプチドで治療することである。図面の簡単な説明
図１は細胞溶解性ペプチド単一処理(single lytic peptide treatment)された
、慢性感染CrFK細胞のｐ２６レベルを示すものである。
図２は細胞溶解性ペプチド処理によるFIV-Petalumaの感染性低下を示すもので
ある。
図３は２種類の異なる濃度における細胞溶解性ペプチド単一処理された、慢性
感染CrFK細胞のｐ２６レベルを示すものである。
図４は細胞溶解性ペプチド処理によるFIV-Petalumaの感染性の低下を示す第２
の実験を示すものである。発明の詳細な説明
適当な用量において、ペプチジルMIM(膜相互作用分子(Membrane Interactive M
olecule))、すなわち、天然または合成起源の細胞溶解性ペプチドは免疫不全ウ
イルスFIV、SIVおよびHIVのようなレトロウイルスおよびエンベロープウイルス
全般を除去し、感染細胞を殺すであろう。ウイルス感染細胞はしばしばシンチシ
ウム形成および細胞骨格異常を示す。細胞骨格異常が存在することは感染細胞が
細胞溶解性ペプチドによる溶解に対して感受性が増大しているであろうことを示
唆するものである。実際、本発明者等により、ある種の両親媒性ペプチドで処理
したヘルペス単純ウイルスII型（HSV II）感染細胞において細胞溶解の増加とウ
イルス力価の減少が起こることが証明されている。これは正常細胞に対して毒性
であるよりもずっと低い濃度、好ましくは患者の体重(kg)あたり、１日に0.05mg
から15mgで起こる。
しかしながら、欠陥のある細胞骨格を有する細胞に対する細胞溶解性ペプチド
の既知の効果による感染細胞の単なる破壊のみがこの細胞溶解性ペプチドの抗ウ
イルス効果に関与しているようには見えず、実際、他の細胞タイプに対して見ら
れる効果と根本的に異なっている。細胞溶解性ペプチドは、非感染細胞にとって
致死量以下であるペプチド濃度において現実にHIVの細胞間伝搬を阻害する。実
際、免疫不全ウイルス感染細胞が、ウイルスを完全に排除しない量のペプチドで
処理された場合、それらの処置培養物からその後に生ずるウイルスは完全に非感 染性である
。このことは、細胞溶解性ペプチドのウイルスおよびウイルス感染細
胞に対する完全に予想外の効果を示すものであり、おそらく細胞レベルの溶解に
よるのではなくDNAレベルでの抑制により機能するのであろう。レトロウイルス
、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはエンベロープウイルス一般について
この効果が期待される。
これらのタイプのウイルスに対するペプチジル-MIMの活性に関して非常に注目
すべきことは、ウイルスの減少の説明となる細胞の損失が観察されるために必
要とされるよりもずっと低い濃度でその効果を表すことである。上述したように
、このことは、これらのペプチドの既知の特性として知られている溶解活性以上
のものを意味する。また、同時に、われわれがウイルス数を減少させ実際に非感
染性ウイルスを生成させたように、HIVに感染した個体の死について実際の原因
の実体である疾病起因日和見感染を抑制することが可能であろう。なぜなら、全
てのこのような主要病原体に対してこのペプチジルMIMは極めて活性だからであ
る。このようにペプチジルMIMはレトロウイルス感染の抑制に深い関わりをもっ
ている。
この効果の医療上の可能性は非常に大きい。免疫不全ウイルス感染に関する実
施態様においては、細胞溶解性ペプチドで治療された感染個体では欠損ウイルス
が産生され、次にそれが免疫刺激要因として機能するであろう。このウイルスは
非感染性であるためそれ以上全然広がらないであろうし、残存している、重要か
つ免疫系の協働に関与している免疫細胞をもはや殺さないであろう。このことは
感染した個体に細胞性防御を身に付ける時間を与えるであろうし、かれらは事実
上ウイルスに対して自らを免疫し、最終的にはウイルスに対して耐性になるであ
ろう。このペプチドの適正な使用は、ウイルスまたは感染細胞にとって致死量以
下の用量で人々は非感染性ウイルス粒子を産生するようになり、そのため個体間
の病気の伝染を制限又は防ぐことで人々を感染から守るであろう。また、このペ
プチドはin vitro法によるワクチン開発のための非感染性ウイルスを作るために
使用することが出来る。
FIVまたはHIVのような免疫不全状態を引き起こすレトロウイルスに感染した患
者、または感染する危険のある患者、特に哺乳動物またはヒト患者をペプチジル
MIMにより、これを毎日投与することによって治療することが出来る。好ましい
実施態様では、選択したペプチドを体重１kgあたり１〜10mgの濃度で注射に適し
た製剤型中に含む組成物が、治療される患者におけるウイルスのin vivo複製を
低下させるために１日に１回投与されるであろう。ペプチジルMIMの好ましいク
ラスはβプリーツシート２次構造を有し疎水性尾部（すなわち、末端疎水性領域
）を有しないものである。こうした種類の構造を有するペプチジルMIMは特に高
い抗ウイルス活性を有することが分かってきた。このクラスの好ましいペプ
チドはD4E1であり、アミノ酸配列FKLRAKIKVRLRAKIKL[配列番号１]を有するペプ
チドである。しかしながら、他のペプチドクラスもまたこの方法に用いるのに有
用である。α−ヘリックス構造およびカルボキシル末端に疎水性尾部を有する好
ましいペプチジルMIMはD2A21であり、アミノ酸配列FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF[配
列番号２]である。本発明はなんら特定のペプチドの使用に対して限定するもの
ではなく、当技術分野において通常の技術を有するものはクレームされている方
法の使用に適切なペプチドを選択することが出来るであろう。患者が肺感染のよ
うな日和見感染も受けている場合には、ペプチドの他の投与経路（エーロゾルの
ような）がさらに利益をもたらすであろう。
このペプチドは慢性的に感染した細胞に非感染性ウイルスを産生を引き起こす
ので、初期の治療が特定の患者のウイルス負荷を大きく軽減するであろう。加え
て、慢性的に感染した細胞によって産生される欠損ウイルスは、抗体を作り出す
ための患者の免疫システムが利用できるであろう抗原の供給源を提供するであろ
う。
この方法の別の応用はワクチンのための弱毒化ウイルスの産生に関するもので
ある。適当な濃度の活性なペプチジルMIM（すなわち、ウイルスおよび感染細胞
の双方にとって致死量以下の濃度）とウイルス感染細胞をin vitroでインキュベ
ーションすると培養細胞が非感染性ウイルスを産生するようになるであろう。こ
の非感染性ウイルスはワクチンとして使用することができ、または免疫血清とし
て有用な抗体産生を引き起こすための免疫攻撃として利用できる。
実施例１
細胞溶解性ペプチドによるHIVの抑制
子宮頚部上皮細胞株、ME180細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから入手した。これらの細胞を液体窒素から溶かし、10％ウシ胎仔血清、
グルタミン及び抗生物質を添加したRPMI 1640培地中で増殖させた。この細胞は
接着性で、継代のため及びアッセイに使用するためトリプシン処理して（HBSS中
0.5％トリプシン）フラスコから外した。マイクロタイター伝搬阻害アッセイ
(microtiter transmission inhibition assay)で使用するために、ME180細胞を
トリプシン処理し、洗浄し、１ウェルあたり５ｘ１０3細胞の密度で96ウェル平
底マイクロタイタープレート(COSTAR)にまいた。この細胞を37℃にて24時間イン
キュベーションしてからアッセイを開始した。HIV-1の分離株SK1に慢性感染した
H9細胞を200μｇ/mlのマイトマイシンＣで37℃にて60分間処理した。処理後細胞
を組織培養用培地で３回洗浄した。慢性的に感染したリンパ細胞を、１ウェルあ
たり2x104の細胞密度で各ウェルに加えた。リンパ細胞の処理に使用するマイト
マイシンＣの濃度は、未感染のME180細胞にウイルスが伝搬するために必要な期
間リンパ細胞が生存できるが、終了点として使用するp24シグナル(以下を参照せ
よ)に寄与しないようにアッセイ時点の前には死滅するように選んだ。伝搬アッ
セイにおいて細胞溶解性ペプチドD4E1およびD2A21は、150μｇ/mlのブタ・ムチ
ンと共に又は無しで、慢性感染細胞の添加に先立って、または、慢性感染細胞を
加える前にその慢性感染細胞と混合して、ME180細胞の単層に加えた。ムチンを
含めたのは、ムチンはヒトの通常の膣分泌物の多量成分であって、従って、HIV
を標的とするいかなる化学療法剤も、臨床的価値を有するべきならばその存在下
で活性でなければならないからである。デキストランおよび硫酸デキストランも
（ブタ・ムチンと共に，または無しで）それそれ陰性または陽性対照としてテス
トした。リンパ細胞とペプチドをME180細胞と６時間共培養し、次に、PBSでME18
0単層を４回洗浄してこれらを除いた。次にプレートを37℃にて６日間インキュ
ベーションした。インキュベーション期間中、培地を48時間ごとに取り除いて交
換した。最初の投与の後はそれ以上ペプチドを加えなかった。共培養６日後、上
清をウェルから取り、ELISAによってp24抗原の量を評価した。ELISAは業者の推
奨に従って行なった。種々の濃度のペプチドで処理したウェル中のウイルス産生
量を適当な細胞及びウイルス対照で評価した。データは各薬剤濃度におけるウイ
ルス対照に対するパーセントとして報告した。伝搬阻害剤のIC25、IC30およびIC95
濃度を計算するために直線回帰分析を使用した。結果は以下の表Ｉ〜表IXおよ
び図１〜９に示した。50％の細胞が死滅する濃度TC50を％ＣＣデータからの内挿
により決定した。TIは毒性インデックス、TC50／IC50の比を表し、効力と毒性の
間に存在する相対濃度ウインドウの指標である。
表Ｉ． D4E1による細胞−細胞伝搬の阻害表II． 150μｇ/mlのブタ・ムチンを伴うD4E1による細胞−細胞伝搬の阻害
表III． D2A21による細胞−細胞伝搬の阻害表IV． 150μｇ/mlのブタ・ムチンを伴うD2A21による細胞−細胞伝搬の阻害
表V． 硫酸デキストランによる細胞−細胞伝搬の阻害表VI．150μｇ/mlのブタ・ムチンを伴う硫酸デキストランの細胞−細胞伝搬阻害
表VII．デキストランによる細胞−細胞伝搬の阻害表VIII． 150μｇ/mlのブタ・ムチンを伴うデキストランによる細胞−細胞伝搬
の阻害
表IX． ブタ・ムチンによる細胞−細胞伝搬の阻害 このデータからペプチドD4E1およびペプチドD2A21の両方とも正常な非感染細
胞に毒性であるよりずっと低い濃度で、ウイルスレベルの指標であるp24の顕著
な低下を引き起こすことが分かる。ムチンの添加はこの活性を増強することが実
際に示され、このことは、in vitroで見られる効果と同等かまたはそれ以上の効
果がin vivoで期待できることを示すものである。
実施例２
細胞溶解性ペプチドによるFIV伝搬阻害
実験計画と方法：D4E1単一処理の長期的効果を調べるために、FIV-Petalumaで慢
性感染したCrFK細胞を２μＭのD4E1で処理し、上清を第１日、３日、５日、７日
および12日に集めた。これらの上清中のP26レベルをELISAによって測定した。D4
E1処理後のウイルス感染性を調べるために、FIV感染CrFK細胞のD4E1処理後第７
日の上清をTCID50アッセイでテストした。上清の対数希釈を行ない、
標的細胞であるE細胞またはFet-J細胞に加えた。ウイルス複製の頂点（種々のウ
イルスおよび標的細胞タイプに依存する日数）において、ウイルス感染を調べた
。ウイルス感染の証拠および感染性ウイルス力価は特定の希釈ウェルにおけるp2
6陽性によって示された。TCID50をReed-Muench法に従って計算した。
結果と考察：FIVp26レベルに対するD4E1単一処理の長期的影響を表Ｘ、図１に示
した。この実験では、CrFK細胞を２μＭのD4E1と共に１日、３日、５日および７
日間インキュベーションし、TCID50アッセイのために上清を集めた。対数希釈を
行ない、E細胞およびFet-J細胞と共に培養した。E細胞感染については、上清のp
26レベルをＤ０、Ｄ１５、Ｄ２１でテストした。第１日おいて、p26は劇的に減
少した(陽性対照の57％)。しかしながら、p26レベルは培養が長くなると次第に
回復し、５日後には未処理培養物と同程度であった。この実験により、２μＭの
D4E1単一処理は３日後にはウイルスを抑制できないことが示された。
表Ｘ：D4E1単一処理した、FIV-Petaluma慢性感染CrFK細胞の上清のp26レベルの
時間経過
第７日の上清におけるウイルスが感染性であるかどうか調べるためにTCID50ア
ッセイを行なった。D4E1処理した培養物からの上清は、同等のp26レベルである
にもかかわらず、未処理の培養物からの上清に比べてほとんど２対数分低いTCID50
を示した(表XIおよび図２)。この結果は興味深いものであり、D4E1処理
感染細胞からのFIVが欠損株かもしれないことを示すものである。
表XI． D4E1処理又は未処理の、FIV-Petaluma慢性感染CrFK細胞からの第７日上
清のTCID50 第２の実験において、CrFK細胞を0.5μＭまたは２μＭのD4E1とともに１日、
３日、５日、７日および12日間インキュベーションし、TCID50アッセイのために
上清を集めた。対数希釈を行ない、E細胞およびFet-J細胞と共に培養した。E細
胞感染については、上清のp26をＤ０、Ｄ１４およびＤ２１においてテストした
。Fet-J細胞感染については、第４日および第８日において上清のp26をテストし
た。結果は第１の実験と類似していたが(表XIIと表XIII、および図３と図４)、D
4E1の活性はこの実験においては第１の実験におけるよりも低いようであった。
これは細胞の生物学的変異またはペプチドの分解のいずれかによる人為的なもの
と思われる。
表XII. D4E1単一処理した、FIV-Petaluma慢性感染CrFK細胞の上清のp26レベル
の時間経過
表XIII．D4E1で処理または未処理の、FIV-Petaluma慢性感染CrFK細胞からの第７
日目上清のTCID50 The present invention relates to the field of antiviral therapy and peptide chemistry. More particularly, the present invention relates to a lytic peptide having significant antiviral activity. BACKGROUND OF THE INVENTION Naturally occurring cytolytic peptides appear to play an important, if not critical, role as immunological agents in insects, as well as confer protective functions in a range of animals. These peptides destroy prokaryotic and other non-host cells by breaking cell membranes, thereby promoting cell lysis. Common features of these naturally occurring cytolytic peptides include overall basic charge, small size (23-30 amino acid residues), amphipathic α-helix or β-pleated sheet . Another feature found in some cytolytic peptides is the hydrophobic tail, a non-amphiphilic sequence of hydrophobic amino acids of various lengths located at the ends of the peptide. Several groups of amphipathic peptides have been identified, and cecro pins (first described in U.S. Patent Nos. 4,355,104 and 4,520,016 to Hultmark et al.), Defensins, sarcotoxins ( sarcotoxins), melittin and magainin (described in US Pat. No. 4,810,777 to Zasloff). Each peptide in these groups is distinguished by sequence and secondary structure characteristics. The mechanism of peptide-induced cell lysis depends on the defined secondary structure of the peptide and the positive charge density. Several hypotheses have been proposed for an explanation of the mechanism by which these peptides exert their effects. For example, the peptide may form pores through ion channels or cell membranes and cause osmotically induced cell lysis. Active synthetic analogs of naturally occurring cytolytic peptides have been created and tested in vitro on various prokaryotic and eukaryotic cells (eg, Arrowood et al., J. Protozool., 38: 161s (1991); Jaynes et al., FASEB J., 2: 2878 (1988)). They include gram-positive and gram-negative bacteria, fungi, yeast, protozoa and neoplastic or transformed mammalian cells. These studies have revealed that synthetic peptide analogs can have higher lytic activity levels than peptides that occur naturally on various types of cells. A discussion of cytolytic peptides, both naturally occurring or synthetic, can be found in Jaynes, "Lytic peptides, use for growth, infection and cancer," WO 90/12866, which is hereby incorporated by reference. Included). These documents state the distinct nature of cytolytic peptides and describe some sequences of active synthetic cytolytic peptides. The specificity of this peptide action depends on the concentration of the amphipathic peptide and the type of membrane with which the peptide interacts. Jaynes, JM. Et al., Peptide Research, 2: 157 (1989), discuss the altered cytoskeletal characteristics of transformed or neoplastic mammalian cells that render them more soluble for such peptides. Normal, non-transformed human cells remain unaffected at any peptide concentration, but transformed cells lyse; however, normal cells are treated with cytoskeletal inhibitors, cytochalasin D or colchicine. , Increased sensitivity to lysis. Experiments have shown that the effect of amphipathic peptides on normal mammalian cells is limited. Most likely, this resistance to lysis is due to the well-developed cytoskeletal network of normal cells. In contrast, transformed cell lines are known to have cytoskeletal defects, but are sensitive to lysis. Due to the different susceptibility of cells to lysis, the concentration of cytolytic peptide can be manipulated to lyse one cell type and not the other at the same site in the body. . The virus responsible for AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome), commonly called HIV (Human Immunodeficiency Virus), is more appropriately referred to as human T-cell leukemia HTLVIII, and thus has recently been the cause of certain leukemias. One of several retroviruses described as AIDS has been clinically recognized as a rare syndrome since 1981. A prominent feature of the disease is the quantitative decline of the T helper cell population, which results in a tremendous increase in susceptibility to infectious diseases, with the ultimate consequence of death from opportunistic infection, the fatal consequence of viral infection. It is accompanied by. This virus contains RNA as a retrovirus and has several special enzymes that allow the viral genome to eventually be integrated into the host's inheritance in the form of DNA. This virus can remain "silent" for many years, and under certain conditions, the viral genome is activated, infectious virus is produced in large quantities, and the final T helper cell population of the victim Causes depletion. This component of the immune system is absolutely necessary to fight the infections we encounter every day. HIV infection is very difficult to treat, in part because of the very diverse and mutable coat properties that render conventional vaccine treatment ineffective. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to a method of treating an animal infected with a retrovirus or an enveloped virus. The method involves treating the infected animal with a cytolytic peptide at a concentration that is lethal to the virus or virus-infected cells, but sub-lethal to healthy cells. A further embodiment of the present invention provides a method of producing an animal infected with a retrovirus or enveloped virus that produces a sub-lethal dose of virus- or virus-infected cells, but produces infected cells that produce non-infectious viral particles. Treatment with a soluble peptide. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows p26 levels of chronically infected CrFK cells treated with single lytic peptide. FIG. 2 shows a decrease in infectivity of FIV-Petaluma by treatment with a cytolytic peptide. FIG. 3 shows p26 levels of chronically infected CrFK cells treated with cytolytic peptide alone at two different concentrations. FIG. 4 shows a second experiment showing a decrease in the infectivity of FIV-Petaluma by treatment with a cytolytic peptide. DETAILED DESCRIPTION Suitable dosages of the invention, peptidyl MIM (film interacting molecule (M embrane I nteractive M olecule) ), i.e., cytolytic peptide natural or synthetic origin, such as immunodeficiency virus FIV, SIV and HIV It will remove retroviruses and enveloped viruses in general and kill infected cells. Virus-infected cells often show scintillation and cytoskeletal abnormalities. The presence of cytoskeletal abnormalities suggests that the infected cells may be more sensitive to lysis by cytolytic peptides. Indeed, the inventors have demonstrated that herpes simplex virus type II (HSV II) infected cells treated with certain amphipathic peptides result in increased cell lysis and reduced virus titers. This occurs at a much lower concentration than is toxic to normal cells, preferably 0.05 mg to 15 mg per day per kg of patient weight. However, the mere destruction of infected cells by the known effects of cytolytic peptides on cells with defective cytoskeletons does not appear to be involved in the antiviral effect of this cytolytic peptide, and indeed other It is fundamentally different from the effect seen on cell types. Cytolytic peptides actually inhibit HIV cell-to-cell transmission at sub-lethal peptide concentrations for uninfected cells. Indeed, immunodeficiency virus-infected cells, when treated with an amount of a peptide that does not completely eliminate the virus, the virus that occurs subsequent from their treatment culture is completely Hikan dyeable. This demonstrates the completely unexpected effect of cytolytic peptides on viruses and virus-infected cells, and probably functions by suppression at the DNA level rather than by lysis at the cell level. This effect is expected for retroviruses, lentiviruses, herpes viruses or envelope viruses in general. A very noteworthy note on the activity of peptidyl-MIM against these types of viruses is that their effects are demonstrated at much lower concentrations than required for cell loss to be observed, which accounts for virus reduction That is. As noted above, this means more than the known lytic activity of these peptides. At the same time, it is possible to suppress disease-induced opportunistic infections, the actual substance of the death of HIV-infected individuals, just as we have reduced the number of viruses and actually produced non-infectious viruses. There will be. This is because the peptidyl MIM is extremely active against all such major pathogens. Thus, peptidyl MIM is closely related to the control of retroviral infection. The medical potential of this effect is very large. In embodiments relating to immunodeficiency virus infection, the infected individual treated with the cytolytic peptide will produce a defective virus, which will then function as an immunostimulator. This virus will be non-infectious and will not spread any further, and will no longer kill remaining immune cells that are important and involved in immune system cooperation. This will give infected individuals time to develop cellular defenses, and they will effectively immunize themselves against the virus and eventually become resistant to the virus. Proper use of this peptide will result in people producing non-infectious viral particles at sub-lethal doses for the virus or infected cells, thereby limiting or preventing the transmission of disease between individuals, thereby infecting people from infection. Will protect you. This peptide can also be used to make non-infectious viruses for vaccine development by in vitro methods. Patients infected with or at risk of infection with a retrovirus causing an immunodeficiency condition such as FIV or HIV can be treated by peptidyl MIM by daily administration with peptidyl MIM. In a preferred embodiment, a composition comprising the selected peptide at a concentration of 1 to 10 mg / kg body weight in a formulation suitable for injection comprises one day per day to reduce in vivo replication of the virus in the treated patient. Will be administered once. A preferred class of peptidyl MIMs are those having a β-pleated sheet secondary structure and no hydrophobic tail (ie, a terminal hydrophobic region). Peptidyl MIMs having this type of structure have been found to have particularly high antiviral activity. A preferred peptide of this class is D4E1, a peptide having the amino acid sequence FKLRAKIKVRLRAKIKL [SEQ ID NO: 1]. However, other peptide classes are also useful for use in this method. A preferred peptidyl MIM having an α-helical structure and a hydrophobic tail at the carboxyl terminus is D2A21 and has the amino acid sequence FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF [SEQ ID NO: 2]. The present invention is not limited to the use of any particular peptide, and those having ordinary skill in the art will be able to select the appropriate peptide for use in the claimed method. If the patient also has an opportunistic infection, such as a pulmonary infection, other routes of administration of the peptide (such as an aerosol) may provide additional benefits. Since this peptide causes the production of non-infectious virus in chronically infected cells, early treatment will greatly reduce the viral load in certain patients. In addition, the defective virus produced by chronically infected cells will provide a source of antigen that the patient's immune system will be able to utilize to produce antibodies. Another application of this method concerns the production of attenuated viruses for vaccines. In vitro incubation of virus-infected cells with an appropriate concentration of active peptidyl MIM (ie, a sublethal concentration for both virus and infected cells) will result in cultures producing non-infectious virus . This non-infectious virus can be used as a vaccine or as an immune attack to elicit antibody production useful as an immune serum. Example 1 HIV Inhibition by Cytolytic Peptide The cervical epithelial cell line, ME180 cells, was obtained from the American Type Culture Collection. These cells were lysed from liquid nitrogen and grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, glutamine and antibiotics. The cells were adherent, trypsinized (0.5% trypsin in HBSS) and removed from the flask for passage and use in assays. For use in a microtiter transmission inhibition assay, ME180 cells were trypsinized, washed, and plated at a density of 5 × 10 3 cells per well in 96-well flat-bottom microtiter plates (COSTAR). The cells were incubated at 37 ° C. for 24 hours before starting the assay. H9 cells chronically infected with the HIV-1 isolate SK1 were treated with 200 μg / ml mitomycin C at 37 ° C. for 60 minutes. After the treatment, the cells were washed three times with a tissue culture medium. Chronicly infected lymphocytes were added to each well at a cell density of 2 × 10 4 per well. The concentration of mitomycin C used to treat the lymphocytes can contribute to the p24 signal (see below) used as an endpoint, although the lymphocytes can survive for the time needed for the virus to spread to uninfected ME180 cells We chose to die before the time of the assay so as not to. In the propagation assay, the cytolytic peptides D4E1 and D2A21 were mixed with or without the chronically infected cells, with or without 150 μg / ml porcine mucin, prior to adding the chronically infected cells. , Added to a monolayer of ME180 cells. Included is that mucin is a major component of normal human vaginal secretion, and therefore any chemotherapeutic agent targeting HIV is active in its presence if it should have clinical value. Because it must be. Dextran and dextran sulfate (with or without porcine mucin) were also tested as negative or positive controls, respectively. Lymphocytes and peptides were co-cultured with ME180 cells for 6 hours, then the ME180 monolayer was washed four times with PBS to remove them. The plate was then incubated at 37 ° C. for 6 days. During the incubation period, the medium was removed and replaced every 48 hours. No further peptide was added after the first dose. Six days after co-culture, supernatants were removed from the wells and the amount of p24 antigen was assessed by ELISA. ELISA was performed according to the manufacturer's recommendations. Virus production in wells treated with various concentrations of peptide was assessed with appropriate cells and virus controls. Data was reported as a percentage of the virus control at each drug concentration. Linear regression analysis was used to calculate the IC 25 , IC 30 and IC 95 concentrations of the propagation inhibitors. The results are shown in Tables I to IX below and FIGS. 50% of the cells were determined by interpolation from the concentration TC 50% CC data die. TI represents the ratio of the toxicity index, TC 50 / IC 50, is indicative of the relative concentration window that exists between efficacy and toxicity. Table I. Inhibition of cell-cell propagation by D4E1 Table II. Inhibition of cell-cell propagation by D4E1 with 150 μg / ml porcine mucin Table III. Inhibition of cell-cell propagation by D2A21 Table IV. Inhibition of cell-cell propagation by D2A21 with 150 μg / ml porcine mucin Table V. Inhibition of cell-cell propagation by dextran sulfate Table VI. Inhibition of cell-cell propagation of dextran sulfate with 150 μg / ml porcine mucin Table VII. Inhibition of cell-cell propagation by dextran Table VIII. Inhibition of cell-cell propagation by dextran with 150 μg / ml porcine mucin Table IX. Inhibition of cell-cell propagation by porcine mucin The data show that both peptides D4E1 and D2A21, at much lower concentrations than are toxic to normal, uninfected cells, cause a significant reduction in p24, an indicator of viral levels. The addition of mucin has indeed been shown to enhance this activity, indicating that effects in vivo that are equal to or greater than those seen in vitro can be expected. Example 2 Inhibition of FIV Propagation by Cytolytic Peptide Experimental Design and Method: To investigate the long-term effects of D4E1 single treatment, CrFK cells chronically infected with FIV-Petaluma were treated with 2 μM of D4E1, and the supernatant was purified. Collected on days 1, 3, 5, 7, and 12. P26 levels in these supernatants were measured by ELISA. To determine viral infectivity after D4E1 treatment, supernatants of FIV infected CrFK cells 7 days after D4E1 treatment were tested in a TCID 50 assay. The supernatant was subjected to logarithmic dilution and added to target cells, E cells or Fet-J cells. Viral infection was examined at the apex of virus replication (days dependent on various viruses and target cell types). Evidence of viral infection and infectious virus titer was indicated by p26 positive in specific dilution wells. TCID 50 was calculated according to the Reed-Muench method. Results and discussion: The long-term effects of D4E1 single treatment on FIVp26 levels are shown in Table X, FIG. In this experiment, CrFK cells were incubated with 2 μM D4E1, for 1, 3, 5, and 7 days, and the supernatant was collected for the TCID 50 assay. Log dilutions were performed and cultured with E cells and Fet-J cells. For E-cell infection, p26 levels in the supernatant were tested at D0, D15, D21. At day 1, p26 was dramatically reduced (57% of positive controls). However, p26 levels gradually recovered with longer cultures and were comparable to untreated cultures after 5 days. This experiment showed that 2 μM D4E1 single treatment failed to suppress the virus after 3 days. Table X: Time course of p26 level of supernatant of FIV-Petaluma chronically infected CrFK cells treated with D4E1 alone A TCID 50 assay was performed to determine if the virus in the supernatant on day 7 was infectious. Supernatants from D4E1-treated cultures showed almost two log lower TCID 50 compared to supernatants from untreated cultures, albeit at comparable p26 levels (Table XI and FIG. 2). ). This result is interesting and indicates that FIV from D4E1-treated infected cells may be defective. Table XI. TCID 50 of day 7 supernatant from chronically infected FIV-Petaluma CrFK cells, with or without D4E1 treatment In a second experiment, CrFK cells were incubated with 0.5 μM or 2 μM of D4E1 for 1, 3, 5, 7 and 12 days and the supernatant was collected for TCID 50 assay. Log dilutions were performed and cultured with E cells and Fet-J cells. For E-cell infection, supernatant p26 was tested at D0, D14 and D21. For Fet-J cell infection, supernatant p26 was tested on days 4 and 8. The results were similar to the first experiment (Tables XII and XIII, and FIGS. 3 and 4), but the activity of D4E1 appeared to be lower in this experiment than in the first experiment. This appears to be an artifact due to either biological mutations of the cell or degradation of the peptide. Table XII. Time course of p26 levels in the supernatant of chronically infected FIV-Petaluma CrFK cells treated with D4E1 alone Table XIII. TCID 50 of day 7 supernatant from chronic FIV-Petaluma infected CrFK cells, treated or untreated with D4E1
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