JP2001500859A

JP2001500859A - グリコーゲン代謝を調節するヒト組織からの炭水化物含有シクリトール

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Publication number: JP2001500859A
Application number: JP10513410A
Authority: JP
Inventors: ウイリアムラーデマーカー，トーマス; カロ，ヒューゴ
Original assignee: ラーデマーカーグループリミテッド
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2001-01-23
Also published as: ATE192160T1; EP0925304A1; AU713100B2; US20040022782A1; WO1998011117A1; DE69701811D1; DK0925304T3; CA2264825A1; ES2147988T3; AU4310197A; EP0925304B1; US6271204B1; DE69701811T2; GB9618929D0

Abstract

(57)【要約】本出願は、ヒトの肝臓と胎盤からのＰ型イノシトールホスホグリカン(IPGs)のファミリーの精製と特徴付けに関する。これら物質はＰ型生物学的活性、例えばピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼ活性化を有することを示す。該化合物の特徴はそれが金属イオン、特にＭｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を、さらに任意にホスファターゼを含むことを実証する。該化合物とそれの類似体は、製薬学的、例えば糖尿病の治療のために、及び合成相似体のためのスクリーニングにおいて使用される。

Description

【発明の詳細な説明】グリコーゲン代謝を調節するヒト組織からの炭水化物含有シクリトール発明の分野本発明は、グリコーゲン代謝を調節するインスリンと他の成長因子(growth fa ctors)の第２のメッセンジャーの特徴付けに関する。特に、本発明は、炭水化物 (carbohydrates)を含有するシクリトール(cyclitol)である物質(substances)に、上記物質は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含み、ヒト肝臓又はヒト胎盤から得ることができるような炭水化物を含むシクリトールに、これらの物質を含む組成物に、及ひこれら物質の使用に関する。発明の背景細胞についての成長因子の多くの作用は、イノシトールホスホグリカン(ＩＰＧ)第２メッセンジャーのファミリーによって取り次がれると思われる(TW Radem acherら，Brazilian J．Med．Biol．Res.，27，327-341，(1994))。それは、ＩＰＧｓのソースが、細胞膜中にあるグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)の「遊離」型であるためと思われる。ＩＰＧｓは、細胞表面上のレセプターへの成長因子の結紮に続いてホスファチジルイノシトール-特異性ホスホリパーゼの作用によって放出されると思われる。ＩＰＧｓは、インスリン、神経成長因子、肝細胞成長因子、インスリン−様成長因子Ｉ(IGF-I)、繊維芽細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子β、Ｂ細胞とＴ細胞に関するＩＬ−２の作用、副腎皮質細胞のＡＣＴＨシグナリング、顆粒膜細胞のＩｇＥ、ＦＳＨとＨＣＧ刺激、甲状腺細胞の甲状腺刺激ホルモン刺激、耳とラット乳腺の早期発達における増殖を含む非常に多数の作用を仲介することの証拠がある。しかしながら、今日まで、この分野における最も多くのリサーチは、インスリンに応答する細胞によって放出される第２メッセンジャーに関して集中している。例えば、インスリンは、筋細胞、脂肪細胞、肝腫瘍細胞中の膜-結合ＧＰＩ分子の急速な加水分解によって放出される。最近、少なくともインスリンに関して放出されたＩＰＧｓが第２メッセンジャーとして必須の役割を演じること、及びホルモンの不存においてインスリンの多くの効果を実際上真似できることが明確にされている。可溶性ＩＰＧ分画は、ラット組織(肝臓、腎臓、筋肉、脳、脂肪、心臓)及びウシ肝臓を含む各種の動物組織から得られている。ＩＰＧ生物学的活性もまた、マラリア寄生ＲＢＣとミコバクテリア中に検出されている。ヒト胎盤栄養膜細胞及びＢＣ３Ｈ１筋細胞に関するインスリン作用又はラット横隔膜及びニワトリ神経節に関するウシ-誘導ＩＰＣ作用を抑制するための抗イノシトールグリカン抗体の能力は、何れかの三次元的特徴の交差-種保存を示唆する。しかしながら、それは種-特異的複合糖質が共通の特徴であり且つ非-ヒト誘導ＩＰＧについて決定された構造的な特徴がヒトで誘導したマラリアで見出されたものとは言えないことにより申し分なく確立される。我々は、それらの生物学的活性の基礎に関してまるで異なったＡとＰ型のサブファミリーの中にＩＰＧ第２メッセンジャーのファミリーを分割している。ラットにおいて、ＡとＰ型のメディエイタの放出が組織特異性であることが示されている(Kunjaraら，Biopolymers and Bioproducts：構造、機能及び適用、J．Svas tら，(ed)，Dokya Publications，301-306，(1995))。従来、構造的特徴付けを与えるために十分な量に遥かに劣る、組織誘導化ＩＰＧ分画から単一精製した化合物を分離することが可能とされていないとしても、分画に含まれるＩＰＧの生物学的活性の研究、及び代謝標識と切断技術からの間接的な証拠に基づく分画の非-ヒトソースからの活性成分の同一性のついて推論がされている。生物学的な研究は、Ａ型メディエイタがアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(活性化する)、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ(抑制する)、アデニル酸サイクラーゼ(抑制する)及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ(刺激する)のような多くのインスリン依存代謝作用の活性を調節することが示されている。これに対して、Ｐ型メディエイタは、ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼ(刺激する)及びグリコーゲン合成酵素ホスファターゼ(刺激する)の様な酵素の活性を調節する。Ａ型メディエイタは、脂肪細胞におけるインスリンの脂質生成活性に似ているのに対して、Ｐ型メディエイタは筋肉におけるインスリンの糖質生成活性に似ている。Ａ及びＰ型メディエイタは、血清フリー媒体中、繊維芽細胞に加えた隋にマイトジェンとなる。繊維芽細胞増殖を刺激するためのそのメディエイタの能力は、その細胞がＥＧＦレセプターにより移入されるなら、増大される。Ａ型メディエイタは、ニワトリ雛蝸牛前庭の神経節中での細胞増殖を刺激できる。これらの研究にもかかわらず、ヒトにおけるインスリン作用の最初の標的器官中の可溶性ＩＰＧ型メディエイタのファミリーの存在のための証拠は、まだ確立されていない。さらに、この分野のリサーチは、哺乳動物組織から得た分画中のＡとＰ型ＩＰＧｓの制限された有用性によって厳しく妨げられている。特に、Ａ及びＰ型の生物学的活性を有するＩＰＧフラクションの活性成分の同定、分離及び特徴付けにおいて実験的な困難性が存在している。かくして、カイロ及びミオイノシトールの尿中の測定に関する研究は、内因性ＩＰＧの故障と糖の食物ソースの両方が存在するであろうとの事実により複雑化している。従って、Ｐ型メディエイタがカイロイノシトールを含むこと及びＰ型メディエイタがミオイノシトールを含むと仮定したこの分野における従来の研究は、ピニトールであり、カイロイノシトールではないＰ型メディエイタにおいてイノシトールを不正確に同定した著者らの報告において、Fonteles，MC，Huang ，LC，Larner，J，Diabetologia，39:731-734，(1996)を参照、注意して解釈する必要がある。ピニトールが、炭水化物の分析において使用した酸性条件によってカイロイノシトールに転換されないように、これは誤った同定化のケースである。さらに、抽出した材料の放射性核種による代謝標識化又は分離後標識化によって分離した材料の分析は、材料を標識化した後でのみ及び現実に活性な物質のみが共分離できるが、それを標識化できないことから、化学的に活性な物質に関しては分析することができない。加えて、構造的特徴を測定するために使用する化合物の各種の酵素的又は化学的処理は、それがもはや活性と構造を関連づけることができないことから、不可能な更なる構造的な工程を作ることでその化合物を不活性化する。さらに、Ａ及ひＰ型ＩＰＧ分画の活性成分がタンパク質と言うよりはむしろ炭水化物であると確信されるように、それらは組換えＤＮＡ枝術によって生産することができない。かくして、これらの化合物の化学的同一性について当該分野で推論されてはいたが、今日まで、活性成分の分離はなされておらず、且つそれがＡ-又はＰ型生物学的活性を有することが実証されてもいない。発明の概要ここに報告したヒト組織からの我々の精製は、Ｄｉｏｎｅｘクロマトグラフィーで及び質量分析によって視覚化することができる非-放射性標識化合物を生成する。ラットにおいて、我々は、その組織のインスリン刺激を与える化合物の量における変更を関連付けることができる。ラットの化合物がヒトの化合物を分離するために用いたと同じプロトコールによって相似体として分離されるように、ここに記載したヒトの物質は、インスリン刺激に応答して放出される。これは、インスリン応答化合物としてそれを定義する。我々は、ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いてＰ型フラクションをまた精製し、且つ得られた化合物がＰ型生物学的活性を有することを示した。概して、本発明は、初めて、このＰ型物質を特徴付けるために十分な量をヒト肝臓又は胎盤から得たＰ型分画の活性成分の分離に基づくものである。特に、この特徴付けは、この物質が金属イオン、特にＭｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含み、Ｐ型ＩＰＧ分画と結合する生物学的活性、すなわちピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ) ホスファターゼを活性化する生物学的活性を有する。従って、一つの態様において、本発明は、炭水化物を含むシクリトールである分離Ｐ型物質、上記物質は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を、及び任意にリン酸を含む、を提供する。この発見は、リン酸を含まないがしかし生物学的に活性とされたＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて分離したいずれかのＰ型フラクションとして得られ、リン酸が生物学的活性に必須でないことを示す。従って、本出願において、「イノシトールホスホグリカン」又は「ＩＰＧｓ」の表すものはリン酸の存在しない化合物を含む。これらの化合物は代替的に、イノシトールグリカン(ＩＧｓ)と称される。我々は、そのＰ型物質が以下の特徴と有することを、さらに見出した：１．溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いる下降ペーパークロマトグラフィーにおいて基点に近い場所へ移動する。２．幾つかのＰ型物質は活性に直接関係付けされるリン酸を含有する。３．遊離ＧＰＩプレカーサーは細菌ソースからＧＰＩ-ＰＬＣによる切断に対して抵抗性である。４．それらはＣ-１８アフィニティ樹脂上に部分的に保持される(表１)。５．それらはＤｏｗａｘＡＧ５０(Ｈ+)カチオン交換樹脂上に結合する(表１ )。６．それらはＡＧ３Ａアニオン交換樹脂上に結合する(表１)。７．その活性はプロナーゼに耐性がある。８．それらはＤｉｏｎｅｘアニオン交換クロマトグラフィー又はＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて検出される(図７から９参照)。その物質はまた、Ｐ型ＩＰＧ分画と結合する次の活性の１又はそれ以上をも有し得る：（ａ）グリコーゲン合成酵素ホスファターゼの活性を刺激する；（ｂ）血清フリー媒体中の繊維芽細胞に加えた際にマイトジェンである；（ｃ）ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼを刺激する。かくして、従来技術は、Ｐ型ＩＰＧと結合するその生物学的活性が、ウシ又はラット組織から得た分画中で検出され得ると開示する一方で、その分画からのその成分の分離又は特徴付けはできておらず、且つそれがＰ型ＩＰＧ生物学的活性を有することも実証されていない。更なる態様において、本発明は、炭水化物を含むシクリトールである物質を提供し、上記物質は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含み、ヒトの肝臓又は胎盤から：（ａ）肝臓ホモジネートの加熱と酸処理により抽出物を作製すること、該ホモジネートは液体窒素中で即時凍結した組織から加工される；（ｂ）速心分離及び活性炭処理の後、ＡＧ１-Ｘ８(ギ酸型)アニオン交換樹脂と一晩相互作用させることを得られた溶液に与えること；（ｃ）１０ｍＭ塩酸によるカラムの溶離によって得られるＰ型ＩＰＧ活性を有する分画を採集すること；（ｄ）ｐＨ４．０に中性化すること(ｐＨ７．８を越えない)、及び該物質を分離するために該分画を凍結乾燥すること；（ｅ）溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いて下降ペーパークロマトグラフィーを使うこと；（ｆ）ピリジン／酢酸／水中での高電圧紙電気泳動を用いて精製すること；（ｇ）分離Ｐ型物質を得るためにＤｉｏｎｅｘアニオン交換クロマトグラフィーを用い精製すること、又はＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて精製及び分離すること、によって得られる。更なる態様において、本発明は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含む炭水化物を含むシクリトールであり且つ活性化ピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼの生物学的活性を有する分離Ｐ型物質であり、該物質は、ネガティブモデルＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて測定した図１１中に示した通りの分子量を、又は約２３６ｍ／ｚの１又はそれ以上の構成単位の添加又は削除によって図１１中に示す分子量の一つに関連した分子量を有する、分離Ｐ型物質を提供する。更なる態様において、本発明は、上述した通りのＰ型物質を、同時に又は連続的に投与するためのインスリン又はＡ型物質との任意の組合せにおいて含む製薬組成物を提供する。これら組成物は、何らかの点で悪化している患者、例えばＡ型生産と比べて、十分なＰ型ＩＰＧを生産できない患者、すなわちこれらの患者中のＡとＰ型ＩＰＧｓの比率が釣り合っていない肥満のＮＩＤＤＭ患者の糖生成活性における疾患の治療において使用することができる。成長因子に応答するＩＰＧ第２メッセンジャーの細胞シグナル化配列と放出についての詳細な論考は、２０／０３／９６提出の我々の同時継続国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９６／００６６９号中に与えられる。更なる態様において、本発明は、上記した物質に対するアンタゴニスト及びこれらアンタゴニストを含む製薬組成物を提供する。これら組成物は、Ｐ型ＩＰＧｓが過剰生産した及び／又はＰ型ＩＰＧｓの活性の一つに拮抗するための条件の治療において有用とされ得る。そのようなアンタゴニストは、Ｐ型ＩＧＰと競合できるが、それ自身の要求において生物学的な活性を有さない関連したＩＰＧとされ得る。例えば、生物活性が減じられている脱リン酸化Ｐ型ＩＰＧは、細胞内への取り込みのため活性リン酸化Ｐ型と競合できる。更なる態様において、本発明は内科療法の方法において使用するための上記した通りの物質又はアンタゴニストを提供する。Ｐ型ＩＰＧの活性置換基の全て又は一部を含む合成の化合物が治療学的に有効利用できることが予期される。図面の簡単な説明図１は、ヒト肝臓からのＩＰＧメディエーターの精製したＰ型ファミリーのＤＸ５００ＨＰＬＣを示す。図２は、ＥＧＦＲＴ１７繊維芽細胞とＰＤＨホスファターゼの刺激を示す。パネルＡ：Ａ型とＰ型を得たヒト肝臓ストックの連続希釈物は、増殖を刺激するその能力について分析した。コントロールはＩＰＧを添加する血清フリー媒体中の繊維芽細胞の増殖を表す。パネルＢ：ウシ心臓から得たＰＤＨホスファターゼの刺激はヒトとラットから得たＰ型メディエイタの両方に関して直線的であった。使用したメディエイタの量はストックの容量とした(材料と方法参照)。図３は、下降ペーパークロマトグラフィーによるＩＰＧの精製化を示す。下降ペーパークロマトグラフィーは、リン酸含量の分析に続いて、コントロールとプロナーゼＥ処理したＩＰＧのＡ型とＰ型、パネルＡとＢそれぞれをプロフィールする。パネルＣとＤは、同じクロマトグラフィック分画における遊離アミノ基分析を示す。明瞭化のため、最初の１０分画のみをプロナーゼ処理したサンプルの各パネル中に表示した。非処理メディエイタのプロフィールは同一であった。溶媒前方は＋３５ｃｍであった。図４ａと４ｂは、ＩＰＧＡ型とＰ型メディエイタの高電圧電気泳動を示す。図４ａは、リン酸の検出の後にＩＰＧＰ型(ブラック)ＨＶＥの標本電気泳動図を示す。図４ｂは、プロナーゼ処理、下降ペーパークロマトグラフィー及びＨＶＥ精製工程の後の細胞増殖についてのＩＰＧＰ型の選択した分画の効果を示す。図４ｂは、ＥＧＦＲＴ１７繊維芽細胞内への[³Ｈ]チミジン混入について1/80の最終希釈でＩＰＧＡ型とＩＰＧＰ型の粗調製品の効果を示す。ブロモフェノールブルー(ＢＢ)、イノシトール一リン酸(ＩＰ１)及びイノシトール二／三リン酸の移動位置は、矢印によって示した。図５は、[³Ｈ]チミジン混入、ＰＨＤホスファターゼ刺激活性とＨＶＥ電気泳動から選択した分画のリン酸含量との間の相関関係を示す。パネルＡ：ＨＶＥ分画は、ＰＤＨホスファターゼを刺激するそれの能力が分析された。両方の作用の間の相関関係はｒ＝0.87であった。パネルＢは、ＥＧＦＲＴ１７繊維芽細胞内への[³Ｈ]チミジン取込みの同じ分画によるリン酸含量とその刺激の間の相関関係(ｒ＝0.87)を示す。図６は、インスリンの注入の後のＩＰＧ放出の増加量を示す。図７は、ＤＸ５００アニオン交換クロマトグラフィーによって検出したインスリンに応答するＩＰＧｓのファミリー。☆を付したピークは予備インスリン刺激したラット肝臓中に存在しない。図８は、ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用い分離した及び精製した、選択したＰ型物質のリン酸含量を示す。図９は、ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用い分離した及び精製した、選択したＰ型物質の生物活性を示す。図１０は、図１と７中に示したピーク２３に一致するこの分画を示す、ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用い分離したＰ型物質のＤｉｏｎｅｘピークを示す。図１１は、Ｐ型ＩＰＧｓのファミリーのＭＡＬＤＩ質量分析(陰性モード)を示す。詳細な説明模擬のデザイン周知の製薬学的活性化合物に模擬の設計は「リード」化合物に基づく製薬学的な発展への周知のアプローチである。これは、その活性化合物が合成することが困難であるか又は費用がかさむ場合、或いはそれが投与の特有な方法のために好ましくない、例えばペプチドは消化管中のプロテアーゼによって急速に消化される傾向にあるように、経口組成物のためには好適でない活性剤である、ような場合に望まれるであろう。模擬デザイン、合成及び試験は、目指す特性のために膨大な分子のランダムなスクリーニングを避けるために一般に用いられる。与えられた目指す特性を有する化合物からの模擬のデザインを通例的に得る幾つかの工程がある。最初に、目指す特性を決定している臨界的及び／又は重要な化合物の特有の部分が決定される。その活性領域を構成している化合物のこれら部分はそれの「ファーマコフォア」として知られる。一度該ファーマコフォアが見出されると、その構造が、それの物理的性質、例えば分光法枝術、Ｘ線回折データ及びＮＭＲのようなソースの範囲からのデータを用い、立体化学、結合、サイズ及び／又は電荷に従ってモデル化される。コンピューター的分析、類似性マッピング(原子間結合よりむしろファーマコフォアの電荷及び／又は容量をモデル化する)及び他の技術がこのモデル化プロセスにおいて使用できる。この各種のアプローチにおいて、そのリガンドの三次元構造とそれの結合対がモデル化される。これは、そのリガンド及び／又は結合対が結合で構造が変化する場合、模擬のこれのデザインを考慮に入れるためにそのモデルを与えることに特に有用とすることができる。テンプレート分子は、グラフト化することができるファーマコフィアを模した化学基について選択される。そのテンプレート分子と化学基は、その模擬体の合成が容易であり、製薬学的に許容されると思われ、且つインビボで、そのリード化合物の生物活性を保持している間に分解されないように、通常的に選択され得るそれにグラフト化される。このアプローチによって見出した一又は複数の模擬体は、それらが目指す特性を有するかどうか、又はそれらがそれを示す程度がどれほどかを見るために、スクリーンされ得る。更なる追補又は修正が、インビトロ又は臨床的試験のために一又はそれ以上の最終模擬体を至らしめるために実施され得る。本ケースにおいて、Ｐ型ＩＰＧの活性置換体の全て又は一部を含む合成化合物が治療剤として有用とされ得ることが予期される。アンタゴニストＰ型物質に対するアンタゴニストは、以下の特性の一又はそれ以上を有する物質を含む：（ａ）Ｐ型メディエイタの放出を抑制することができる物質；（ｂ）結合物質を経てＰ型メディエイタのレベルを減じることができる物質(例えば抗体又は特異的結合タンパク質)；及び／又は（ｃ）Ｐ型メディエイタの作用を減じることができる物質。一つの実施態様において、ＩＰＧアンタゴニストは、特異的結合化タンパク質である。自然に発生した特異的結合タンパク質は、ＩＰＧｓに結合するタンパク質の生物学的サンプルをスクリーニングすることによって得ることができる。更なる実施態様において、アンタゴニストは、Ｐ型ＩＰＧｓに特異的に結合することができる抗体である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生産は、当該分野において良く確立している。モノクローナル抗体は、オリジナルの抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生産するために組換えＤＮＡ技術の方法を受けることができる。そのような方法は、定常領域に対するその抗体の免疫グロブリン可変領域、又は相補的な袂定化領域、又は異なる免疫グロブリンの定常領域プラスフレームワーク領域をコードする導入ＤＮＡを含め得る。例えば特許出願公開EP-A-184187号、GB-A-2188638号又はEP-A-239400号を参照。モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、生産される抗体の結合特異性を改修し得る又はしない、遺伝変異又は他の変更を受けさせ得る。抗体は、当該分野において標準的である技法を用いて得ることができる。抗体を生産するための方法は、タンパク質又はそれのフラグメントによる哺乳動物( 例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル)の免疫化を含む。抗体は、当該分野で周知の各種の技法のいずれかを用いる免疫化、及びスクリーン化から、好適には関係のある抗原に対する抗体の結合を用いて得ることができる。例えば、ウエスタンブロッティング技法又は免疫沈殿が使用され得る(A rmitageら，Nature，357:80-82，1992)。動物からの抗体及び／又は抗体生産細胞の分離は、その動物を屠殺する工程によって成立され得る。ペプチドによる哺乳動物の免疫化の代替又は補填として、タンパク質に特異的な抗体が、発現した免疫グロブリン可変ドメインの組換えにより作製したライブラリー、例えば、それらの表面上の機能性免疫グロブリン結合ドメインをディスプレイするランバダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージ；例えばＷＯ９２／０１０４７参照、から得ることができる。そのライブラリーは、固有、いずれかのタンパク質(又はフラグメント)によって免疫化されていない生物から得られた配列から構成され、又は関連の抗原にさらされている生物から得られた配列を用いて構成され得る。本発明に従う抗体は、複数の手段で修正され得る。実のところ用語「抗体」は、望まれる特異性を持つ結合ドメインを有するいずれかの結合物質をカバーするとして解釈すべきである。かくして、本発明は、抗体フラグメント、誘導体、合成分子又は抗体又はエピトープと結合することができる抗体のその形状に似た分子を含む抗体の機能的均等物と相同物をカバーする。抗原又は他の結合対と結合できる抗体フラグメントの実例は、ＶＬ，ＶＨ，Ｃｌ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；分離したＣＤＲ領域とＦ(ａｂ')₂フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである。単鎖Ｆｖフラグメントもまた含まれる。典型的には、親の非-ヒト抗体よりも免疫性が劣る抗体を提供するために、フレームワークアミノ酸残基の幾つかの代替化によって、ヒトフレームワーク領域上にグラフトされる非-ヒトソースからのＣＤＲｓにおいて人体適応化した抗体もまた、本発明の範囲内に包含される。本発明に従うモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝的変異又は他の変更を受けさせ得る。モノクローナル抗体が、オリジナル抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作製するための組換えＤＮＡ技術の技法を受けさせ得ることは、当業者によって更に理解されるだろう。そのような方法は、免疫グロブリン可変領域、又は相補的な決定化領域、又は異なる免疫グロブリンの定常領域プラスフレームワーク領域をコードする導入ＤＮＡを含め得る。例えば特許出願公開EP-A-184187号、GB-A-2188638号又はEP-A-239400号を参照。キメラ抗体のクローン化と発現は、EP-A-0120694とEP-A-0125023中に記載される。望ましい結合特性を持った抗体を作製できるハイブリドーマは、抗体コード化拡散(抗体フラグメントを含む)を含み且つそれらの発現が可能な、真核性又は原核性宿主細胞として、本発明の範囲内である。本発明はまた、その抗体が生産され、且つ好ましくは分泌される条件の下で抗体を生産できる細胞の培養を含む、その抗体の作製方法も提供する。上記抗体はまた、直接又は間接的に検出可能とし得る、好適にはシグナルの測定可能な、標識又はレポーター分子でそれをタグ化することによって、本発明の診断の態様において利用され得る。レポーター分子の結合は、直接又は間接的に、共有的に、例えばペプチド結合を経て又は非共有的になされ得る。ペプチド結合を経る結合は、コード化抗体とレポーター分子と融合した遺伝子の組換え体発現の結果とされ得る。好適な形態の一つは、分光的に分離した吸収又は発光特性を持つ蛍光色素、リン光体又はレーザー染料の個々と各抗体の共有結合による。好適な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドを含む。好適な色素の染料はジアミノベンジジンを含む。他のレポータは、マクロ分子コロイダル粒子又は着色したラテックスビーズ、視覚的に観測され、塩基的に検出され又は他で記録されるための検出可能なシグナルの直接的又は間接的な原因となり得る、磁性又は常磁性、及び生物学的又は化学的活性剤のような粒状材料を含む。これらの分子は、例えば、発色又は変色又は電気的特性における変化の原因となる反応を触媒する酵素としてよい。それらは、分光的な吸収又は発光を特徴付ける結果となるエネルギー段階間の電子の移動により分子の励起を可能とし得る。それらはバイオセンサーとの結合において用いる化学的本質を含み得る。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系が利用され得る。更なる実施態様において、ＩＰＧアンタゴニストは、合成化合物である。これらは、通常の化学技術又は無作為配列化学の使用によって作製され、次いでＩＰＧアンタゴニスト活性がスクリーンされる。これらの化合物は、それら自身において有用であり、或いは製薬学的な発展のためのリード化合物の候補を提供する、模擬のデザインにおいて使用し得る。合成化合物は、それの合成化が相対的に容易であるか、又はそれが製薬として投与するために、例えばペプチドであるアンタゴニストは、それが消化管中のプロテアーゼによって消化されるならば、経口組成物として好適でない活性剤とされ、それが好適となる特性を有する場合に望ましいであろう。模擬デザイン、合成及び試験は、目指す特性のために膨大な分子のランダムなスクリーニングを避けるために一般に用いられる。製薬組成物本発明のメディエイタとアンタゴニストは、製薬組成物中に調製することができる。これらの組成物は、メディエイタ又はアンタゴニストの一又はそれ以上に加えて、製薬学的に許容される賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定化剤又は当業者において良く知られた他の材料を含み得る。そのような材料は無毒性とすべきであり且つ該活性成分の有効性に影響を及ぼすべきでない。キャリア又は他の材料の本質は、投与の形態、例えば経口、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内ルートに依存され得る。経口投与のための製薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液状形として良い。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントのような固体キャリアを含み得る。液体製薬組成物は、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油のような液状キャリアを一般に含む。生理塩溶液、デキストロース又は他の糖溶掖又はエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールのようなグリコールを含み得る。静脈内、皮膚又は皮下注射又は痛みのある部位での注入のため、その活性成分は、発熱物質フリーであり且つ好ましいｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形とされるだろう。当業者であれば、例えば食塩注射、リンゲル注射、乳酸化リンゲル注射のような等張性媒体を用いて好適な溶液を良好に調製することができる。保存薬、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が、要望に応じて包含され得る。それがポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子又は、個人に与えるべき本発明に従う他の製薬学的に有用な化合物の何れにせよ、投与は「予防的に有効な量」又は「治療的に有効な量」(予防的であったにせよ治療を考慮し得るケースでも良いように)において好適であり、これは個人に有益性を示すに十分な量とされる。投与される実際の量及び比率及び投与の時間経過は、どのように治療されるかの本質と厳格性に基づくであろう。治療の規定、例えば投薬量に関する決定等は、一般開業医及び他の医者の応答性の範囲内であり、典型的には治療すべき疾患、患者の状態、搬送の部位、投与の方法及び開業医に周知の他のファクターが考慮に入れられる。上述した技法とプロトコールの実施例は、レミントンの薬の科学、16版、Osol，A.(ed)，1980中に見出すことができる。好適な実施態様において、投薬量のレベルは、新生グリカエミック(euglycaemic)条件の作製として決定される。組成物は、単独で又は他の治療薬との組合せにおいて、治療するべき状態に依存して同時に又は連続してのいずれかで投与され得る。診断方法個人からの生物学的サンプル中の分析物の濃度を測定するための方法は、当該分野で周知であり、且つ患者からの生物学的サンプル中のＰ型とＡ型イノシトールホスホグリカン(ＩＰＧｓ)の比率を測定するための本発明の状況において用いることができる。これは、もしＰ型とＡ型ＩＰＧｓの比率又はレベルがその患者及び試験している間の条件に関してバランスを失ったならば、医者が測定することができる。診断方法の実例は、後述の実験セクションに記載される。好適な診断方法は、Ｐ及びＡ型ＩＰＧｓの比率の測定に関する。その方法は、血液、血清、組織サンプル又は尿のような生物学的サンプルを利用できる。Ｐ及びＡ型ＩＰＧｓの濃度を測定するための分析方法は典型的には、他の分子への指向においてＰ及びＡ型ＩＰＧｓの一又はそれ以上に特異的に結合することができる結合サイトを有する結合性剤を利用する。結合性剤の実例は、抗体、レセプター及びＩＰＧｓを特異的に結合することができる他の分子を含む。通常、該結合性剤は、例えば分析の間、容易に操作することをなすために定義した場所で、固体支持体上に固定化される。そのサンプルは一般に、サンプル中に存在するＰ及びＡ型ＩＰＧｓが結合性剤と結合できるように適当な条件の下で結合性剤と接触させる。その結合性剤の結合サイトの機能的な占有は、現像剤を用いて測定することができる。典型的に、その現像剤は、当該分野において周知の技法を用いてそれを測定可能なように標識化(放射能、蛍光又は酵素標識によって)される。かくして、放射能標識はシンチレーションカウンター又は他の放射能計数装置を用い、蛍光標識はレーザーと共焦顕微鏡を用いて、及び酵素標識は、基質における酵素標識の作用によって、典型的には変色を作り出すことで測定できる。現像剤は、結合性剤の占有した結合サイトで現像剤が分析物と競合する競合的な方法、又は標識した現像剤が結合性剤によって結合した分析物と、又は占有した結合サイトに結合する、非競合的な方法において使用され得る。両方の方法は分析物によって占有された結合サイトの数の指示、及び、故にサンプル中の分析物の濃度を、例えば分析物の既知の濃度を含むサンプルを用いて得られた検量線と比べることによって、提供する。好適な実施態様において、これはＰ：Ａ型比率を測定するために使用され得る。方法イノシトールホスホグリカンの分離と特徴付け。イノシトールホスホグリカン(ＩＰＧ)を、凍結ヒト肝臓から以下の通り精製した。凍結組織(90g)は、液体窒素下で粉末化し、１ｍＭＥＤＴＡと１ｍＭ２- メルカプトエタノールを含む沸騰している５０ｍＭギ酸内に直接入れた(組織のグラム(湿重量)当たり緩衝液３ｍＬ)。１分後、ポリトンミキサー(Kinematica,L ittau，スイス)によって均質化し、その溶液を更に５分間煮沸した。次いでその溶液を氷上で冷やし、４℃で２時間、29,500gで速心分離した。その上清は、４ ℃で撹拌しつつ１０ｍｇ／ｍＬの活性炭によって３０分間処理した。その活性炭懸濁液を４℃で１時間、29,500gで遠心分離し、透明な上清を回収した。その溶液は次いで蒸留水で１０倍に希釈し、１０％アンモニア水でｐＨ６．０に調整し、次いでＡＧ１-Ｘ８(ギ酸型)樹脂と共に室温で一晩優しく撹拌した(溶液ｍＬ当たり０.３ｍＬ樹脂)。その樹脂は、クロマトグラフィーカラム(2.5x60cm)に注入し、水(床の２容量)と１ｍＭ塩酸(床の２容量)で連続的に洗浄した。次いで、その材料は、ＩＰＧＰ型分画を得るため、１０ｍＭ塩酸(床の５容量)で溶離した。この分画は１０％アンモニア水でｐＨ４．０に調整し、次いでロータリーエバポレーター中で乾燥した。乾燥した材料は、蒸留水中に再溶解し、２回親液化し、化学的及び生化学的分析の両方のために５つのアリコートに分割した。分析のため、調製物の各タイプのアリコートをハンクス培地２００μＬ中に溶解し、１ＭＫＯＨによってｐＨ７．０に調整した。１６ｇ(湿重量)相当の組織から抽出したメディエイタを２００μＬ(ストック溶液)の最終濃度に溶解した。それ故、ストックの１０μＬは、出発組織の８００ｍｇから回収したＰ型メディエイタの量を表す。プロナーゼ処理ＩＰＧは、他の場合に記載した通り、プロナーゼにより処理した。簡単には、酵素のストック溶液(１０ｍｇ／ｍＬ)は、存在するであろう不純な酵素を不活性化するため、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０中、６０℃で３０分間予備インキュベーションした。サンプルの消化は、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液の２００ｍＬ中のＩＰＧサンプルに３７℃、ｐＨ７．８でプロナーゼ溶液(３０μＬ)を加えることによって開始した。２時間後、その反応は３分間の煮沸によって終結し、酸性析出により回収した。ペーパークロマトグラフィーによるＩＰＧ精製ＩＰＧは、最小量の水に溶かし、３ＭＭクロマトグラフィー紙(3ｘ50cm、8.5c mでの基点)に適用した。ｎ-ブタノール／エタノール／水(４：４：１，ｖ／ｖ／ｖ)を用いて下降ペーパークロマトグラフィーを実施し、そのクロマトグラムは９時間展開した。乾燥後、その紙をセンチメートル毎に切断した(基点から−１から＋３５ｃｍ)、その材料は水で溶離した分画(６０μＬ、５回洗浄)と会合した。その分画は乾固するまで蒸発し、水又はハンクス溶液(６０μＬ）中のいずれかに再溶解し、遊離アミノ基、リン酸含量の測定又は生物学的活性分析の前に１ＮＫＯＨにより中性化した。高電圧紙電気泳動ペーパークロマトグラフィーの後の分画１から６から溶離し、プールした材料は、少量の水で再溶解し、３ＭＭ電気泳動紙に適用した。ブロモフェノールブルーと三重水素化イノシトールリン酸混合物を標準として加えた。そのサンプルは、ピリジン／酢酸／水(３：１：387ｖ／ｖ／ｖ)、ｐＨ５．４中、８０Ｖｃｍ^-1 で３０分間電気泳動した。中性化合物が適用した点に保持される一方、陰性電荷化合物はアノードに向け移動した。紙が乾燥した後、分画は１ｃｍ毎に切り離され、且つ水で溶離した。ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーこの技法は、メディエイタを含む個々の分画の分離及び精製のために用いた。Ｐ型ＩＰＧは、Ｖｙｄａｃ３０１ＰＬＸ５７５ＨＰＬＣカラムに適用した。そのカラムは以下の通り溶離した：溶媒：酢酸アンモニウム５００ｍＭｐＨ５．５、勾配条件：０−５％１２分にわたり、５−２１％次の１３分にわたり、２１−８０％２５分にわたり、８０−１００％５分にわたり。その分画は、次いでリン酸とＥＧＦ-移入繊維芽細胞を用いた成長刺激活性を分析した。遊離アミノ基の測定遊離アミノ基の測定は後述の通り実施した。サンプルと標準(０-１００ｎｍｏｌのＤ-(+)-グルコサミン塩酸、Sigma)は、ホウ酸ナトリウム(0.14M、ｐＨ９)とフルオレサミン(乾燥アセトン中0.75mg/mLに調製した)の連続添加の前に超純水( ５０μＬ)に溶かした。４７５ｎｍでの発光蛍光を、蛍光分光計を用いて３９０ｎｍで励起後に観測した。リン酸含量の測定トータルのリン酸レベルは、後述した通り分析した。サンプルと標準(０-１００ｎｍｏｌのＮａ₂ＨＰＯ₄)は乾固するまで濃縮し、過塩素酸(70%)によって１８０℃で３０分間加水分解した。室温に冷却後、超純水(２５０μＬ)、(ＮＨ₄)₂ＭｏＯ₄(２．５％溶液の１００μＬ)とアスコルビン酸(１０％溶液の１００μＬ) を連続して加えた。発色は、９５℃で１５分間サンプルを加熱することによって達成した。吸光度はミクロプレートリーダー中、６５５ｎｍで測定した。イオン交換樹脂及びSep-Pak Ｃ１８カートリッジによるＩＰＧの相互作用ストック溶液(上記参照)の３０マイクロリッターを、ＡＧ３-Ｘ４(ＨＯ^-)、ＡＧ５０-Ｘ１２(Ｈ⁺)又はＳｅｐＰａｃｋＣ１８カートリッジ上のいずれかの６００μＬを含むカラム上にロードし、次いで水(床の５容量)によって溶離した。その溶液は乾固するまで濃縮し、得られた残分を３０μＬのハンクス中に溶解し且つｐＨ７．０に調節した。ｃＡＭＰ-依存タンパク質キナーゼ活性の評価サイクリックＡＭＰ-依存タンパク質キナーゼの活性を抑制するＩＰＧ分画の能力を、基質としてヒストンＩＩＡを用いることによって評価した。その反応混合物(１００μＬ)は、２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７．６)、１０μＭＭｇＡＴＰ(１０⁶ｃｐｍ[γ-³²Ｐ]ＡＴＰ)、ヒストンＩＩＡ(５０μｇタンパク質) 、及びＰＫＡの触媒的サブユニット(６０単位／ｍＬ)を含む。全ての測定において、１０μＬのＩＰＧ溶液(上記参照)を反応溶液に加えた。３７℃で１０分間インキュベーションの後、その反応を停止し、タンパク質を１０％トリクロロ酢酸（１００μＬ)と２％ウシ血清アルブミン(１０μＬ)によって沈殿させ、さらにタンパク質内への³²Ｐの混入を測定した。ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼ(ＰＤＨ)活性の評価ピルビン酸脱水素酵素複合体(ＰＤＣ)とＰＤＨホスファターゼを調製し、使用まで−８０℃に保管した。インスリンメディエイタの存在又は不在においての両方のＰＤＨホスファターゼの分析は、不活性化した、リン酸化したＰＤＨ複合体の活性化の最初の割合に基づいた。ＰＤＣの最初の活性は８−１３単位／ｍＬ( 酵素の１単位は１μｍｏｌＮＡＤＨ／分を作製する)であり、ＡＴＰによる不活性化の後、０．３-０．５単位／ｍＬ(不活性化ＰＤＣ)であった。２段階分析を、ホスファターゼ活性を定量化するために用いた。不活性化ＰＤＣ(５０μＬ)のサンプルは、１ｍｇ／ｍＬ脂肪フリーＢＳＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭＣａＣｌ₂及び１ｍＭＤＴＴと共に、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨ７．０(トータル容量２５０μＬ)で３分間、３０℃で予備インキュベートした。この時点で、ＰＤＨホスファターゼの１０μＬとＩＰＧの１０μＬを加え、更に２分間インキュベーションを続けた。この時間の終了時点で、その混合物の２００μ Ｌを取り出し、１００μＬの３００ｍＭＮａＦを加えた。活性化したＰＤＨは、ＮＡＤＨの生成率の測定によって第２段階分光分析で測定した。反応停止した１００マイクロリットルに、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０、２．５ｍＭ β-ＮＡＤ+、０．２ｍＭＴＰＰ、０．１３ｍＭコエンチームＡ、０．３２ｍＭＤＴＴ及び２ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む反応混合液１μＬを加えた。ＮＡＤＨ生成は、その後に３４０ｎｍで５分間行った。グリコーゲン合成活性の評価グリコーゲン合成活性は、以下の通り分析した。脂肪細胞は、140-150gラット (Wistar種)を用い、副睾丸の脂肪組織から調製した。３ラットからの脂肪パッドを小片に切断し、２％アルブミンプラス２４ｍｇのコラゲナーゼを含むクレブスリンガー重炭酸塩の８ｍｌ中、３７℃で２５分間インキュベートした。分離した細胞を濾過し、３０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン(Fraction v，Sigma)を含み、アルブミン添加の後にＮａＯＨで７．４にｐＨ調整したクレブスリンガー重炭酸塩媒体３ｘ１０ｍｌ中で洗浄した。洗浄した細胞はまた、クレブスリンガー重炭酸塩(オリジナル組織の媒体／ｇの１０ｍｌ）中に再懸濁した。酵素活性の測定のため、それぞれ２ｍｌ細胞を含んだ３つのインキュベーション容器をセットした。第１のものはなにも加えず、第２のものはインスリン(２５ｍＵ／ｍｌ)を、第３のものは１０ｍｌ胎盤ＩＰＧを含有させた。インキュベーションは空気中で５分間行った。その試験管は次いで1500rpmで３０秒間回転し、上層を捨てた。その反応は０．５ｍｌ冷緩衝液(１００ｍＭＫＦ／１０ｍＭＥＤＴＡ／１ｍＭベンザミジン(4)、ｐＨ７．０)によって停止し、細胞を均質化し、エッペンドルフ管に移した。これらを10,000gで１５分間回転させ、その中層を酵素分析のために採集した。全ての管は全く同一に始動し、７．２ｍＭグルコース６-リン酸を含有した極大の活性化グリコーゲン合成酵素管を除き、０．０１ｍＭグルコース６-リン酸の存在中で測定した。サンプル(３０μＬ)は、５０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ７．８)、２０ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭＫＦ、１０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン、及び６．７ｍＭＵＤＰ-[Ｕ-¹⁴Ｃ]グルコース(ほぼ200,000cpm)を含んだ溶渣６０μｌを加え、３０℃で１５分間インキュベートした。グリコーゲン合成活性はトータルの合成酵素活性のパーセンテージとして表した(Ｇ６Ｐ最大値) 。繊維芽細胞中の細胞増殖の測定ＥＧＦＲＴ１７繊維芽細胞は、１０％v/vウシ胎児血清、２ｍＭＬ-グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む、Dulbeccoの修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)中、３７℃で５％ＣＯ₂湿雰囲気下でルーチン的に培養した。細胞は、それらが８０％交会に達した時に維体培養した。そのＥＧＦＲＴ１７細胞は、ヒト表皮成長因子レセプターによってＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞にトランスフェクションされた[32,35]。繊維芽細胞の細胞増殖を評価するため、細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、ウエル当たり１０⁴ 細胞の濃度で９６−ウエルのマイクロタイターのウエル内に配した。２４時間後、培地を取り除き、その細胞を、ハンクス培地で２回洗浄し、血清フリー培地を加え、その細胞を更に２４時間ピリオドでインキュベートした。この時点で細胞は血清、ＩＰＧ調整品又は適当な制御によって刺激された。１８時間後、[³Ｈ ]チミジン(１μＣｉ／ウエル)を各ウエルに４時間加えた。この処理の終了時点で、その細胞はハンクス溶液で２回洗浄し、トリプシン化し、さらにセルハーベスターを用いて細胞のＤＮＡに結合した放射能を測定した。細胞増殖分析のため、その希釈液は最終希釈物とした。例えば、２．５μＬのストック溶液は、１００μＬの最終容量、又は１／４０希釈となるまで増量した。サンドウイッチＥＬＩＳＡのためのプロトコール下記のプロトコールは、ヒト血清のような生物学的液体中のイノシトールホスホグリカン(ＩＰＧｓ)の定量分析のために、間接的に、非競合的に、固相酵素イムノアッセイ(サンドウイッチＥＬＩＳＡ)を始動する。そのアッセイにおいて、モノクローナルＩｇＭ抗体を固相上に固定化した。組織培養上清、腹膜内にハイブリドーマ細胞を注入することによって誘発した腹膜腫瘍に罹ったマウスからの腹水及び生成したモノクローナル抗体を、該イムノアッセイにおいて使用している。Ｆ９６マキシソープNunc-Immunoプレートをこれら分析に使用した。タンパク質、抗体のような特有のグリコプロテインが託されるマキシソープ表面は、プラスチックと結合した。固定化した抗体は、試験サンプル(ヒト血清又は同様に用いた陽性コントロール)から抗原を捕捉する。架橋化抗体(ウサギからの精製したポリクローナルＩＰＧ抗体)は、抗原にビオチニル化した抗体を結合するために必要とされる。その検出方法は、抗ウサギＩｇ、ビオチニル化種特異的全抗体(ロバから)及びストレプトアビジン-ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体( Amersham)、ＡＢＴＳとＡＢＴＳ用緩衝液(Boehringer Mannheim)を利用した。該ＥＬＴＳＡ分析は以下の通り実施できる：１．全ての工程において１００μｌ／ウエル加える。２．Ｆ９６マキシソープNunc-Immunoプレート中に、ＰＢＳで１：１００に希釈したモノクローナル抗体を加える。４℃で少なくとも２日間インキュベートする。３．ＰＢＳで３回洗浄する。４．蒸留水中(１：９)ＥＬＩＳＡ用のブロック化試薬(Boehringer Mannheim) を室温で２時間加える。５．ＰＢＳ-Tween２０(0.1%)により３回洗浄する。６．精製したポリクローナル抗体(ＰＢＳ中1:100に希釈した)を４℃で一晩加える。７．ＰＢＳ-Tween２０(0.1%)により３回洗浄する。８．ＰＢＳ中で1:1000に希釈した抗ウサギＩｇ、ビオチニル化種特異的全抗体 (ロバから)(Amersham)を、室温で１時間３０分加える。９．ＰＢＳ-Tween２０(0.1％)により３回洗浄する。１０．ＰＢＳ中で1:500に希釈したストレプトアビジン-ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(Amersham)を、室温で１時間３０分加える。１１．ＰＢＳで３回洗浄する。１２．ＡＢＴＳ用緩衝液(ＢＭ)に2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンズチアゾリンスルホナート(6))二アンモニウム塩結晶(ＡＢＴＳ)(Boehringer Mannheim)を加える：ＡＢＴＳ用緩衝液は蒸留水(1:9v/v)に加えた。１３．５−１５分内に４０５ｍｍフィルターを用いてマルチスキャンプラスＰ２．０１における吸光度を読む。結果ＩＰＧ分離及び生物学的活性ＩＰＧｓは、ヒト肝臓及び胎盤から下記の通り抽出した。簡単には、抽出液は、患者取り出した後液体窒素中で直接凍結した組織から加工した組織ホモジネートの加熱及び酸処理によって調製し、それ故にホスファターゼの作用を防いでいる。遠心分離及び活性炭処理の後、その溶液はアニオン交換樹脂(ＡＧ１-Ｘ８，ギ酸型)と共に一晩相互作用させた。その樹脂は水と希釈塩酸で連続的に洗浄した。１０ｍＭの塩酸による溶離は、ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼとグリコーゲン合成を刺激し、且つＲＧＦレセプターをトランスフェクションした繊維芽細胞の増殖を刺激することにおいて作用したＰ型ＩＰＧ分画を生成した。この分画は、溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いる下降ペーパークロマトグラフィーを行い、ピリジン／酢酸／水中の高電圧紙電気泳動を用いる精製の後、Ｄｉｏｎｅｘ(商標)アニオン交換クロマトグラフィーを用い最終的に精製した。図１は、主要なＰ型物質を表すシャープなスパイク(分画ｎｏ．１０)を示した。金属分析金属イオン分析は、５２０ｎｍでの視覚的検出によってＤＸ５００系に関して実行した。分離は、ピリジン-2,6-ジカルボン酸溶離液とピリジアルアゾレソルシノールによるカラム後反応によって、IonPac混合床イオン交換カラムを用いて達成した。そのＰ型サンプル(Ｐ１とＰ２)は、１００μｌの水中に再構成した。この溶液の１０μｌを採り、１０μｌの濃塩酸を加え、そのサンプルを一晩放置した。次いで、８０μｌの水をその混合物に加え、この溶液の１０μｌを分析した。ブランクＨＣｌサンプルをコントロールとして用いた。 μｇ/ml zn μｇ/ml Mn μｇ/ml Fe 平均値Ｐ１＃１ 12.31 3.10 14.04 2.27μｇ/ml Zn ＃２ 2.22 3.17 14.10 3.14μｇ/ml Mn 14.07μｇ/ml Fe Ｐ２＃１ 2.49 3.35 15.28 2.45μｇ/ml Zn ＃２ 2.38 3.41 15.49 3.36μｇ/ml Mn ＃３ 2.47 3.33 15.10 15.29μｇ/ml Fe ブランク＃１ - - 10.24 ＃２ - - 10.26 10.28μｇ/ml Fe ＃３ - - 10.33 ＃３ブランク＃１ - - 8.42 8.32μｇ/ml Fe ＃２ - - 8.21 ブランク１と２の平均＝9.3μｇ/ml Fe これは、ヒト肝臓から分離したＰ型ＩＰＧがＭｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺イオンを含むことを最初に示す。ｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼの阻害ｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼを阻害するＩＰＧの能力は、洗浄したヒストンＩＩＡ内への³²Ｐの混入を測定することによって試験した。1/10に希釈したＰ型ＩＰＧ分画の添加は、キナーゼ活性の56.7±16.4(n=4)パーセント阻害を生じた。この効果が投薬量依存である一方、Ｐ型ＩＰＧはキナーゼ活性の顕著な阻害を与えていない。これらの実験は、ラット誘導ＩＰＧｓによる我々の以前のデータと一致している。Ｐ型ＩＰＧ分画に対し、我々が他に記載しているＡ型分画はｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼに対する優勢な阻害活性を含有する。ＰＤＨホスファターゼの刺激ウシ心臓から分離したピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼを刺激するＰ型ＩＰＧ分画の能力を測定した。表１は、両方のヒト肝臓がＰ型溶離液におけるＰＤＨホスファターゼ刺激活性を含んでいたことを示す。再生した活性の量は、インスリン刺激の不在におけるラット肝臓から再生したそれに類似する(表１)。ラット肝臓のインスリン刺激は、インスリン融合後２分の活性において２倍増加する結果となる(図６参照)。我々は、この活性を強調するために、１０ｍＭ分画中に存在する化合物のＩＰＧファミリーを表すのに名称Ｐ型を先に用いている。ＩＰＧはインビトロでＭｎ²⁺と置換できるＰ型インスリンＩＰＧは、ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼを含む各種のＭｎ-依存性酵素の活性においてマンガンと完全に置換できる。カルシウムの不在中での遊離マンガンは酵素を活性化できない(２行と比較して６行参照)。しかしなから、ＩＰＧＭｎ補因子は、カルシウムの不在中で活性を刺激することができる(４行参照)。補因子結合化の効果はカルシウムに応答するＰＤＨホスファターゼを作ることである(３行参照)。ＩＰＧの放出はそれ故に、ＰＤＨホスファターゼを活性化し、且つその酵素は、カルシウムが細胞内でも放出される事実によって更なる活性化が現に用意される。相同的形態においてカルシウムはＰＤＨホスファターゼに活性化することができ(１行)、その酵素はＩＰＧの放出に応答することが現に用意される(３行)。ＰＤＨホスファターゼ（活性）＋Ｍｇ²⁺＋Ｃａ²⁺ Δ0.334O D/分(1) ＋Ｍｇ²⁺＋Ｃａ²⁺＋Ｍｎ^2+(sat) Δ0.680 OD/分(2) ＋Ｍｇ²⁺＋Ｃａ²⁺＋ＩＰＧ Δ0.833 OD/分(3) ＋Ｍｇ²⁺＋ＩＰＧ Δ0.130 OD/分(4) ＋Ｍｇ²⁺ Δ0.000 OD/分(5) ＋Ｍｇ²⁺＋Ｍｎ^2+(sat) Δ0.000 OD/分(6) グリコーゲン合成酵素活性以下の結果は、先の結果に従って、ラット組織からの特徴付けしていない分画に関して実施した、Ｐ型ＩＰＧを含むＭｎ²⁺がグリコーゲン合成酵素活性を刺激することを示す。インキュベーションＧ６Ｐ最大の％としての刺激無添加、+7.2mM G6P １００インスリン６．５４胎盤Ｐ型（１）２．８２胎盤Ｐ型（２）４．０５胎盤(１)は、前に試験してから凍結乾燥して保存してあった５ｇ相当の胎盤を用いて抽出した。胎盤(２)は、同じ抽出物からであるが、2.5、1.0及び0.5ｇである量の組織の −２０℃で溶液において保存していた、同じ日の３つのサンプルの混合物とした。脂質生成に関する効果Ｐ型ＩＰＧを含む分画は、ラット脂肪細胞に加え、脂質生成刺激に対するこれら分画の能力を測定した。表１は、脂質生成活性の無いことが、ヒト肝臓からのＰ型分画において見出されたことを示す。ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞増殖についての効果Ｐ型ＩＰＧ分画は、血清の不在において繊維芽細胞の増殖を支持するその能力について分析した。ラット組織に関しＰ型メディエイタがその分析において活性であったことから、相対的に多量のメディエイタを評価するために用いている。ヒト肝臓からのＰ型分画は、血清フリー培地中、ＥＧＦレセプターによってトランスフェクションした繊維芽細胞に加えた際にマイトジェンであることが見出された。図２は、その分画について得られた投与量依存効果を示す。飽和は、最も高い使用濃度でもまだ得られていなかった。両方の分画は、しかしながら、１０％ＦＣＳ単独よりも少なくとも２-２．５倍大きな増力を誘導することができた。下降ペーパークロマトグラフィーＰ型物質の一部はプロナーゼＥによって処理し、次いで酸性析出によってプロナーゼを取り出した。残した溶液は濃縮し、水に再溶解し、ｎ-ブタノール／エタノール／水を用いて下降ペーパークロマトグラフィーによって精製した。９時間の展開後、リン酸と遊離アミノ酸の存在を検出した。図３は、リン酸の分析の後の推定のＰ型メデイエイタのクロマトグラムプロファイルを示した。リン酸を含む化合物は、基点と５ｃｍの間に移動することが見出された。ペーパークロマトグラムはまた、図３ｃ及びｄ中に示した通り遊離アミノ基の存在のためにも分析した。再度遊離アミノ基を含む化合物は、基点と５ｃｍの移動間隔の間の存在した。プロナーゼによるインキュベーションは、図３ＡとＢ中に示した通り、リン酸分析によって見られたように化合物の移動に相違はなかった。イオン交換樹脂とＳｅｐ-ＰａｋＣ１８カートリッジ２つの異なるイオン交換樹脂と逆相Ｃ１８カラムによるそれの相互作用におけるＩＰＧの振る舞いは、ＥＧＦＴＲ１７ＤＮＡ細胞内へのチミジン混入を誘導することの溶離液の能力によって実証される。その結果は表２中に示した。逆相のケースにおいて、活性の５０−６０％がＰ型ＩＰＧのために回復された。これらの結果は、Ｐ型メディエイタが増殖活性を有する親水性と疎水性化合物療法の混合物のいずれかであること、又はＰ型メディエイタが物理的状態に基づいて分割する結果となる幾つかのタイプの平衡複合体を形成することを実証する。表２は、カチオン交換カラム(ＡＧ５０-Ｘ１２)またはアニオン交換カラム(ＡＧ３-Ｘ４)の一方からはＰ型メディエイタが回収できないことも示した。これは、図３中に見出されたような遊離アミノ及びリン酸部分のような２つの官能基の存在と対称をなしている。活性は金属イオンを要求する該ＩＰＧは、全ての金属イオンを取り除くためにジチゾン(追補１，セクション２参照)によって抽出した。抽出に続いて、Ｐ型ＩＰＧがＰＤＨホスファターゼ分析において不活性化された。炭水化物含有ＩＰＧヒト肝臓からの精製したＩＰＧＰ型のクロマトグラムは、パルス-電流検出(追補１、セクション４中に与えられた条件)によって検出した。イノシトールの各種の型(ミオイノシトール、カイロイノシトール、ピニトール)の存在は、ＤＸ５００系及びＣａｒｂｏＰａｃＭＡ１カラムとパルス化電流検出(追補１、セクション４中に与えられた方法)を用いて立証した。高電圧電気泳動(ＨＶＥ)による精製下降クロマトグラフィー後の紙から溶離した材料は、ｐＨ５．４で高電圧紙電気泳動にかけた。これらの条件の下で、リン酸、カルボキシ又は硫酸基を含んでいる化合物は、アノードに向け移動する。２つの独立した実験の典型的な紙電気泳動を図４ａに示し、その後リン酸の分析を行った。リン酸は、基点で及び５ｃｍから２０ｃｍ移動距離まで延びている広い未定のピークとして検出された。Ｐ型メディエイタのためのプロフィールは顕著に類似した。基点でのリン酸の存在は、この位置に置いて回収した化合物が、全般的に電荷を中性化した陽性に電荷した部分に等しい数を有する必要があることを実証する。移動をするそれら化合物のいずれかは、陽性に電化した部分(例えば、アミノ、金属)を越える過剰の陰性電荷基(例えばリン酸)を有する。図４ｂは、推定のＰ型メディエイタの細胞増殖活性か、プロナーゼ処理、ペーパークロマトグラフィー及びＨＶＥ精製工程の後にもなお存在することを実証する。ＨＶＥの後の活性プロフィールは、基点に及び２０ｃｍの移動距離まで延びた広いバンドにおける活性の存在についての図４ａに示したリン酸分析と非常に密接に反映される。次いで該分画は、ＰＤＨホスファターゼを刺激するそれの能力を分析し、この活性は、図５ａ中に示したように細胞増殖を刺激する分画の能力と非常に強い(Ｒ＝０．９７)相関関係にある。図５ｂは、紙電気泳動から分離した推定のＰ型メディエイタのリン酸含量と、細胞増殖を刺激することの電気泳動から得た幾つかの分画の能力との間に強い相関関係（Ｒ＝０．８７）があることを実証する。リン酸含量とＰＤＨホスファターゼ刺激活性の間の相関関係もまた強かった(Ｒ＝０．７３、データは示さず)。ヘキソースとヘキソサミンの存在は、ＤＸ５００系及びＣａｒｂｏＰａｃＭＡ１カラムとパルス化電流検出を用いて立証した。ＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィー図１中に示した化合物のファミリーを含んでいるサンプルからＰ型メディエイタを分離及び精製することができることを実証するために、分画をＶｙｄａｃ３０１ＰＬＸ５７５ＨＰＬＣカラムから得て、リン酸及び成長助長活性を分析した。図８は、異なる分画のリン酸レベルを示し、図９は、７，１７，２５，３８と４２を含む選択した分画の生物活性を示す。優勢な成長助長活性がフラクション２３−２５において見出された。主要活性分画のＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣプロフィールを図１０中に示した。このフラクションは図１と７中に示す優勢なピーク２３を含む。肝臓Ｐ型のジチゾン処理肝臓Ｐ型の３つのサンプルを用いた。その全てを、１０μｌの水の中に肝臓１ｇの割合で使用の日に懸濁した。３つの調製品の全ては、ジチゾンによる処理の前と後で試験する一方、一つの調製品はその反応性について試みるためにジチゾンの後でＭｎによっても処理した。反応方法は、不活性化したＰＤＨ混合物にそれが加えられるより前に、２．７ｍＭMnにより脱ミネラル化したサンプルを１５分間予備インキュベーシヨンすることとした。番号処理使用容量％刺激化単位／ｇ１．オリジナルP-1 5μｌ +58 2.32 ２．処理したP-1 5μｌ 0 0 ３． 2.7mM Mn 5μｌ -11 0 ４．処理したP-1 +2.7mM Mn 5μｌ +30 1.20 ５．オリジナルP-2 5μｌ +66 2.64 ６．処理したP-2 5μｌ +53 2.12 ７．クロロホルムで抽出したP-3 5μｌ +91 3.64 ８．クロロホルムで抽出した水 5μｌ -2 0 ９．オリジナルP-3 5μｌ +30 1.20 １０．処理したP-3 5μｌ +12 0.48 この実験を下記に示す：１．ジチゾンによる処理は、試した３つの試験品全ての活性を減じた；Ｐ− １で１００％、Ｐ−２で６０％及びＰ−３で２０％。２．Ｍｎによる予備インキュベーションは、ほぼ半分の活性を回復した。３．クロロホルム単独によるＰ−２の抽出は、ほとんど４９％だけ活性を増加した。これはクロロホルム可溶性インヒビターの存在を暗示し得る。４．１０^-4ＭＭｎ(分析番号：３)は、先の結果が、この濃度でＰ'アーゼに関して顕著な刺激的な作用を有することを明確に示したにもかかわらず、Ｐ' アーゼ活性に関して効果を有していないとの例外がある。かくして、金属の除去はＩＰＧからの全ての活性を取り除くが、しかしこの活性は再構成され得る。ジチゾン処理したＰ型ＩＰＧの再活性化に関するＭｎとＺｎの効果前の実験において、Ｍｎはジチゾンによる処理によってそれの金属の剥ぎ取りがなされているＰ型ＩＰＧを一部のみ再活性化した。これは、そのＩＰＧが３：２のラフな割合においてＭｎとＺｎの両方を含むことを示すだろう。本実験は、両方の金属で活性化したかどうか及びそれらは添加剤かどうかを検査するために行った。ここで使用したＰ−１サンプルは、その成分サンプルの第２の管であろうと、前の実験において使用したそれと同じとした。ジチゾン処理したサンプルは、先に使用したそれと同じとした。再活性化のため、その脱金属サンプルは、２．７ｍＭＭｎ、１．８ｍＭＺｎＮ又は２．７ｍＭＭｎ−１．８ｍＭＺｎのいずれかによって１５分間予備インキュベートした。全てのサンプルは１０μｌＰ'アーゼと５μｌのサンプルを用いる通常の分析系で試験した。番号サンプル％刺激化１．オリジナル未処理P-1 ＋４３２．処理したP-1 ０３． P'アーゼ+2.7mm Mn ＋１２４． P'アーゼ+1.8mm Zn ＋１２２５． P'アーゼ+Mn+Zn ＋１１１６．処理したP-1+Mn+Zn ＋２６２この実験は以下のことを示した：１．Ｚｎは、、Ｍｎでなしたより大きい程度にＰ'アーゼを刺激した。２．Ｐ'アーゼについてのＭｎとＺｎの効果は補足的でない。３．不活性化したＩＰＧに結合した金属の効果は、オリジナル活性＋Ｍｎ+Ｚｎの総計(43+12+122=177)から予期することができる値よりもかなり大きな値、２６２の値に、不活性化ＩＰＧを刺激することである。かくして、この実験は、Ｐ型ＩＰＧがいずれかの環境において活性化のためにＭｎ²⁺とＺｎ²⁺の混合物を要求するであろうことを立証する。ＭＡＬＤＩ質量分析Ｐ型分子のファミリーの高分解能ＭＡＬＤＩ質量分析(ネガティブモード)が図１１中に示される。構造のファミリーは、２３６又は２３７ｍ／ｚの添加により関連付けされる、３つのマークを付したピークを参照。ネガティブモードＭＡＬＤＩ質量分析により測定したその分子量は、Ｈ⁺原子の除去によってＰ型物質の現実の分子量と異なり、すなわちその現実の分子量は、図１１中に示すピークの分子量に＋１の加入により得ることができる。かくして、その図中の結果に基づく分子量を測定するために容易である。モノクローナル抗体連続的な薄層クロマトグラフィーによってラット肝臓から精製したイノシトールホスホグリカン(ＩＰＧ)は、通常の方法を用いてニュージーランドウサギとＢａｌｂ／ｃマウスを免疫するために用いた。免疫化の後、モノクローナル抗体は、変異骨髄腫細胞(１０⁶細胞／ｍｌ)によりマウス脾臓細胞の融合のアプローチを用いて調製した。使用した骨髄腫細胞ラインは、それのヒポキサンチン-グアニンホスホリボジルトランスフェラーゼを欠いている。そのハイブリドーマ細胞のスクリーニング法は、抗原(ＩＰＧ)が固相上に固定化された、非競合的固相酵素イムノアッセイに基づいた。培養上清を加え、陽性ハイブリドーマ細胞を選択した。単細胞クローン化は、制限希釈によってなされた。３つのモノクローナル抗体 (２Ｄ１，５ＨＧおよび２Ｐ７)を得るためにハイブリドーマを選択した。全てのモノクローナル抗体は、ＥＫ-５０５０キット(Hyclone)を用いるＩｇＭで測定される。全てのモノクローナル抗体がＩＰＧｓを識別することを試験するため、非競合的な固相酵素イムノアッセイを用いた。Ｆ９６ポリソーブ(Polysorb)Nunc-Immun oプレートを分析のために用いた。そのポリソーブの表面は、ある種の抗原が固定化されることが分析のために推奨される。１：８００に希釈した固定化した抗原(ＩＰＧ)は、組織培養上清、腹水液から、及び精製したモノクローナル抗体が使用される際に、モノクローナル抗体を捕捉する。その検出方法は、抗マウスＩｇＭ、ビオチニル化全抗体(ヤギから)及びビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(Amersham)、ＡＢＴＳとＡＢＴＳ用緩衝液(Boehringer Mannheim)を用いた。同じイムノアッセイは、ポリクローナル抗体を評価するために用いた。このアッセイにおいて、その検出方法は、抗ウサギＩｇ、ビオチニル化種-特異性全抗体(ロバから)を利用した。その抗体は、以下の方法を用いて精製することができる。グラジエントプログラマーＧＰ-２５０プラスと高精度ポンプＰ−５００を持つ高速タンパク質液体クロマトグラフィー(Pharmacia FPLC system)を、ポリクローナルＩＰＧ抗体を精製するために用いた。ハイトラッププロテインＡアフィニティカラムを、ウサギ血清からのポリクローナルＩＰＧの精製用に用いた。タンパク質定量分析は、ミクロＢＣＡプロテインアッセイ試薬キット(Pierce)を用いて行った。モノクローナル抗体は、２つの工程で精製した。硫酸アンモニウム沈澱は、最初の工程として選択した方法である。組織培養上清は、硫酸アンモニウムによって処理した(５０％飽和)。ＰＢＳ中で希釈したペレットは、第２工程の前に透析チューブに移される。硫酸アンモニウム沈澱が単一工程精製化のために好適でないことから、その後にゲル濾過クロマトグラフィーを行い−ＰＢＳ中の抗体溶液を、ファーマシアセファロース４Ｂカラム内を移動させた。タンパク質定量分析は、パーキンラムダ２ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計中で２２０−２８０ｎｍでの吸光度を読みとってなされた。かくして、この実施例は、Ａ及びＰ型物質へのモノクローナル及びポリクローナル抗血清の生成が可能であることを示した。解説１０ｍＭ塩酸によりＡＧ１-Ｘ８樹脂からの溶離によって分離した材料は、ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼを刺激した。この分画はまた、ＥＧＦ-レセプター移入３Ｔ３細胞の増殖及び脂肪細胞中のグリコーゲン合成を刺激した。ヒト肝臓から分離したＰ型ＩＰＧ分画の生物学的特性は、プロナーゼによって処理した後に回復され、その活性がタンパク質又はペプチドのいずれか一方によるものでないことを示した。リン酸と遊離アミノ基の存在は、これら化合物が、それらの構造中にヘキソースとヘキソサミンを含むとのそれらの報告に類似させ得る。リン酸含量と細胞増殖を刺激するメディエイタの能力(図５ａ)及びＰＤＨホスファターゼ刺激活性(図５ｂ)の間の強い相関関係は、リン酸がその推定上のメディエイタの鍵成分であることを強く示唆する。これら化合物の炭水化物の本質は、下降ペーパークロマトグラフィーにおけるそれの挙動、炭水化物含有化合物の特徴及びインスリン刺激したラット組織から分離したＩＰＧのそれとの類似性によって支持される。Ｄｉｏｎｅｘプロフィールは、炭水化物の存在を立証する。全ての実験は、アニオン交換樹脂から溶離した１０ｍＭ分画におけるＰ型インスリン-模擬イノシトールホスホグリカンの存在と一致した。ヒトにおいて、グルコース代謝のレセプター後組織インスリン耐性は、非インスリン依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)及び多くの他の疾患の特徴である。耐性は、インスリンシグナル化通路における固有の欠陥に起因させることでき、又はインスリン作用の循環性インヒビターの存在によって、又は両方にもたらされるとすることができる。ＩＰＧ結合メディエイタ通路における欠陥はそれ故に、ＮＩＤＤＭの病因論における研究のためのキーターゲットである。インスリンシグナル化におけるＩＰＧの重要性は、インビボでの及びインビトロでのデータの両方からもたらされる。例えば、変異細胞は、代謝効果なしには、チロシンリン酸化によってインスリンに応答するＩＰＧを作製できない[１]、及び細胞生成キナーゼ欠落インスリンレセプターは、インスリン刺激の後ＧＰＩを加水分解しない[２]。またインスリン作用とＧＰＩの故障の両方を持つインスリンレセプターレベルとの相関関係もある[３]。ＧＰＩ合成と放出における欠陥を有する糖尿病ＧＫラットからの細胞のインスリン耐性は、ウシ肝臓からのＩＰＧによって克服され得る[４]。酵素的及び化学的に修飾したイノシトールリン酸グリカンに類似した抗体は、インスリンの効果をブロックするトリパノゾーマブルセイ(Trypanosoma brucei)から分離された[５，６，７，８]。ストレプトゾトシン-糖尿病ラットからの脂肪細胞中のＧＰＩのインスリン刺激した加水分解物の悪化があり、ピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)のインスリン活性化及びグルコース利用性を悪化する[５]。ＮＺＯマウスのＰＤＨ活性は、グルコース輸送及び利用性の顕著な刺激の存在においてインスリン刺激に対応せず、この酵素のインスリン刺激のレベルでレセプター後欠陥を示唆する。インスリンは脂肪の少ないＮＺＣマウスの脂肪細胞中のＰ型メディエイタの生産を刺激するが、しかし、メディエイタ生産又はＮＺＯマウスの脂肪細胞中の活性における減少を逆説的に引き起こす[９]。アンタゴニストのないことか見出された。これらの結果は、ＮＺＯマウスにおけるピルビン酸脱水素酵素活性化のレベルでのインスリン作用のレセプター後欠陥を実証する (すなわちＰ型メディエイタ)欠点のあるメディエイタ(又はメディエイタに応答する)は、インスリン耐性、タイプＩＩ糖尿病後藤-柿崎ラット似脂肪細胞において報告されている[１０]。タイプＩＩ糖尿病に罹った患者において見出される減少した尿のカイロイノシトール(Ｐ型メディエイタの加水分解生成物)分泌[１１，１２]は、たとえ全てではない研究がこれらの観測を立証することができているとしても[１３]、ヒトの患者において類似のレセプター後欠陥を示唆する。自然発生的な糖尿病(脂肪)アカゲザルにおける尿のカイロイノシトール減少化 [１４]、及びそのようなサル及びストレプトゾトシン処理ラットにおいてカイロイノシトールが血漿グルコースを低下すること及びグリコーゲン合成の活性化[ １５]がある。ストレプトゾトシン処理ラットにおけるメディエイタの静脈内注入は、血清インスリン濃度における変化なしに血漿グルコースを減じ、且つｉｐ注入は横隔膜における糖原生成性の変更の結果となる。参考文献以下に列記した又は上記説明中に記載した参考文献の全ての内容は参考によってここに併合される。追補１：１．ＩＰＧ加水分解１ラット肝臓から得られた材料に関する、ＩＰＧｓ(ＬＩＡ、ＬＣＡ、ＬＩＰ、ＬＣＰ及びブランク)は、２Ｎ塩酸によって１１０℃で９０分間処理した(Pier ce、後述の通りジチゾンにより抽出した)@。加水分解の後、そのサンプルは２回凍結乾燥し、水に再溶解し(200μｌ)、且つもう一度凍結乾燥した。得られた材料は２００μｌ中に再溶解し(水)、そして１０μｌサンプルは、上記の通りイノシトール、モノサッカリド及び金属の存在を研究するために用いた。２．塩酸のジチゾン処理ジフェニルチオカルバゾン(Aldrich)は、記載の通りクロロホルムから再結晶化した(ZiefとMitchel、p127)。その結晶質の精製したジチゾンは、Ｃｌ₃ＣＨ中 @１０ｍｇ／１０ｍｌに溶解し、定常沸点の６Ｎ塩酸から金属不純物を抽出するために用いた(Pierce)。ＨＣｌの１ｍｌは、５００μｌのジチゾン溶液によって３回抽出し、上記の通りＩＰＧｓを加水分解するために用いた。３．胎盤ＩＰＧｓ。ジチゾンによる抽出ストックＩＰＧｓ溶液の５０μｌを、水で２００μｌに希釈し、次いでクロロホルム中のジチゾン溶液(0.1g/l)の２００μｌにより抽出した。（使用したクロロホルムはジチゾン溶液を調製する直前にＨ₂Ｏ／１ＮＮａＯＨ／Ｈ₂Ｏによって抽出した。）ジチゾンによるＩＰＧ溶液の抽出の後、その水相をＣｌ₃ＣＨによって抽出した(200μｌ、３回)。その有機相はプールし、水で洗浄し、乾燥し、Ｃｌ₃ＣＨ中に再溶解した(２００μｌ)。その溶液は、金属を測定するために３Ｎ塩酸(１００μｌ)によって抽出した。オリジナル水性ＩＰＧ溶液は、ＤｉｏｎｅｘプロファイルとＰＤＨ分析の変化を測定するために用いた。４．Ｄｉｏｎｅｘ法ＩＰＧｓカラムとガードカラム：ＰＡ１００溶離液：Ａ＝１００ｍＭＮａＯＨＢ＝５００ｍＭＮａＯＡｃ＋１００ｍＭＮａＯＨ濃度勾配：＠開始：１００％Ａ、０％Ｂ＠３０分：２５％Ａ、７５％Ｂ＠30.1分：１００％Ｂを１０分間維持した流速：１ｍｌ／分検出器：ＥＤ４０５．金属分析カラムとガードカラム：ＨＰＩＣ−ＣＳ５溶離液：ＰＤＣＡ(６ｍｍＰＣＤＡ、５０ｍＭＡｃＯＨ、５０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５７) 流速：１ｍｌ／分カラム後試薬：０．３ｍＭＰＡＲ、１ＭＡｃＯＨ、３ＭＮＨ₄ＯＨ試薬流速：〜０．８ｍｌ／分検出器ＡＤ４０＠５２０ｍｍ６．イノシトール分析カラムとガードカラム＝ＣａｒｂｏＰａｃＭＡ１溶離液：Ａ＝５００ｍＭＮａＯＨＢ＝Ｈ₂Ｏ条件：時間流速％Ａ％Ｂ開始 0.25 25 75 0.00 0.25 25 75 15.10 0.25 25 75 20 0.40 100 0 25 0.40 100 0 34 0.40 25 0 35 0.40 25 75 40 0.40 25 75 検出器：ＥＤ４０７．モノサッカリド分析検出器：ＥＤ４０カラムとガードカラム＝ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１溶離液：Ａ＝１００ｍＭＮａＯＨ；Ｂ＝Ｈ₂Ｏ条件：流速：１ｍｌ／分時間％Ａ％Ｂ開始 16 84 ０ 16 84 １７ 16 84 １８ 100 0 ２３ 100 0 ２４ 16 84 ３０ 16 84 表１組織重量当たりのメディエイタの生物活性表１の脚注。 †活性の単位(ユニット)：活性の１ユニットは、試験系の基本的なレベルにおいて５０％活性化を生じる量として表される。 ‡ラット肝臓データのためにそのｎ値は分離肝臓調製物の異なる独立した抽出物で表す。通常の２匹の動物(肝臓)は、抽出の前にプールされた。各脂質生成アッセイは３つ組でじっしした。２つの分離した値が、コントロール又は擬注入ラット用又はインスリンの５０分の注入後の２動物の抽出した肝臓用に与えられた。両方の群は一晩絶食させた。￥インスリンの値は、1994年10月から1995年10月の期間にわたって実施した、２０の独立した脂質生成アッセイ(各々３つ組で測定した)用である。 §ヒトの肝臓のためのその値は、２つの分離肝臓からのものである、[N]は通常及び[D]は病気。その病気にかかった肝臓は、肝臓移植の時点で獲得した。通常の肝臓は、若い健康な事故の犠牲者からのものである。そのｎ値は脂質生成圧せｉＯ繰り返しに関する。−８０℃で凍結保存された病気の肝臓の分離抽出液は、一年の期間にわたり分析した。活性における変化が無いことが見られた。表２アフィニティー支持体からのＩＰＧの回収脚注 † 3Ｈ-チミジンをEGFR移入繊維芽細胞内に混入した。Ａ及びＰ型メディエイタは異なる支持体から水によって溶離した。ＩＰＧの最終濃度はストックの１／４０とした(材料と方法を参照)。類似の結果が1/80の希釈によって得られた。全てのＩＰＧ刺激は投薬量依存性であった。＃Ｐ型の部分回収率はＣ-１８上で普遍的に観測された。試みのないものは結合材料を回収するために作られた。 ∫ ブランク−ＩＰＧの溶離の前のカラム溶離物。 ☆ コントロール−培養培地のみ、ＦＣＳ無し。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月１７日（１９９８．８．１７）【補正内容】請求の範囲１．ヒトの肝臓又は胎盤から得られる分離Ｐ型物質であり、該物質はＭｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含む炭水化物を含むシクリトールであり且つピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼ活性化の生物学的活性を有する、分離Ｐ型物質。２．炭水化物を含むシクリトールである分離Ｐ型物質であり、上記物質は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含み、ヒトの肝臓又は胎盤から：（ａ）肝臓ホモジネートの加熱と酸処理により抽出物を作製すること、該ホモジネートは液体窒素中で即時凍結した組織から加工される；（ｂ）遠心分離及び活性炭処理の後、ＡＧ１-Ｘ８(ギ酸型)アニオン交換樹脂と一晩相互作用させることを得られた溶渣に与えること；（ｃ）１０ｍＭ塩酸によるカラムの溶離によって得られるＰ型ＩＰＧ活性を有する分画を採集すること；（ｄ）ｐＨ４．０に中性化すること(ｐＨ７．８を越えない)、及び該物質を分離するために該分画を凍結乾燥すること；（ｅ）溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いて下降ペーパークロマトグラフィーを使うこと；（ｆ）ピリジン／酢酸／水中での高電圧紙電気泳動を用いて精製すること；（ｇ）分離Ｐ型物質を得るためにＤｉｏｎｅｘアニオン交換クロマトグラフィーを用い精製すること、又はＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて精製及び分離すること、によって得られる分離Ｐ型物質。３．Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含む炭水化物を含むシクリトールであり且つピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼ活性化の生物学的活性を有する分離Ｐ型物質であり、該物質は、ネガティブモデルＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて測定した図１１中に示した通りの分子量を、又は約２３６ｍ／ｚの１又はそれ以上の構成単位の添加又は削除によって図１１中に示す分子量の一つに関連した分子量を有する、分離Ｐ型物質。４．該物質がリン酸塩を含む請求項１から３のいずれか１項記載の物質。５．該物質が以下の特徴：（ａ）それは、溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いる下降ペーパークロマトグラフィーにおいて基点に近い場所へ移動する；（ｂ）それは、Ｃ-１８アフィニティ樹脂上に部分的に保持される；（ｃ）それはＤｏｗａｘＡＧ５０(Ｈ+)カチオン交換樹脂上に結合する；（ｄ）それはＡＧ３Ａアニオン交換樹脂上に結合する；及び（ｅ）該物質の活性はプロナーゼに耐性がある、の１又はそれ以上を有する請求項１から４のいずれか１項記載の物質。６．該物質が以下の特徴：（ａ）グリコーゲン合成酵素ホスファターゼの活性を刺激する；又は（ｂ）血清フリー媒体中の繊維芽細胞に加えた際にマイトジェンである、を有する、請求項１から５のいずれか１項記載の物質。７．製薬的に許容されるキャリアとの組合せにおいて、請求項１から６のいずれか１項記載のＰ型物質を含んだ製薬組成物。８．Ａ型物質又はインスリンをさらに含む、請求項８記載の製薬組成物。９．内科療法の方法において使用するための請求項１から６のいずれか１項記載の物質。１０．請求項１から６のいずれか１項記載の物質のアンタゴニストで、該アンタゴニストは、上記物質に特異的に結合できるモノクローナル抗体であるアンタゴニスト。１１．該アンタゴニストが：（ａ）P型物質の放出を抑制する；（ｂ）それのレベルを減少するためにＰ型物質に結合する；及び／又は、（ｃ）Ｐ型物質の生物学的活性を減じる、の特性を有する請求項１０のアンタゴニスト。１２．該アンタゴニストが、該物質に特異的に結合することができる抗体又は該物質に特異的に結合することができる結合タンパク質である請求項１０又は１１記載のアンタゴニスト。１３．請求項１０から１２のいずれか１項記載のアンタゴニストを含む製薬組成物。１４．内科療法の方法において使用するための請求項１から６のいずれか１項記載の物質のアンタゴニストであり、該アンタゴニストは、上記物質に特異的に結合できるモノクローナル抗体であるアンタゴニスト。１５．請求項１から６のいずれか１項記載のＰ型物質を特異的に結合することができるモノクローナル抗体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ａ６１Ｋ 37/26 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトの肝臓又は胎盤から得られる分離Ｐ型物質であり、該物質はＭｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含む炭水化物を含むシクリトールであり且つビルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼ活性化の生物学的活性を有する、分離Ｐ型物質。２．炭水化物を含むシクリトールである分離Ｐ型物質であり、上記物質は、Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含み、ヒトの肝臓又は胎盤から：（ａ）肝臓ホモジネートの加熱と酸処理により抽出物を作製すること、該ホモジネートは液体窒素中で即時凍結した組織から加工される；（ｂ）速心分離及び活性炭処理の後、ＡＧ１-Ｘ８(ギ酸型)アニオン交換樹脂と一晩相互作用させることを得られた溶液に与えること；（ｃ）１０ｍＭ塩酸によるカラムの溶離によって得られるＰ型ＩＰＧ活性を有する分画を採集すること；（ｄ）ｐＨ４．０に中性化すること(ｐＨ７．８を越えない)、及び該物質を分離するために該分画を凍結乾燥すること；（ｅ）溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いて下降ペーパークロマトグラフィーを使うこと；（ｆ）ピリジン／酢酸／水中での高電圧紙電気泳動を用いて精製すること；（ｇ）分離Ｐ型物質を得るためにＤｉｏｎｅｘアニオン交換クロマトグラフィーを用い精製すること、又はＶｙｄａｃＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて精製及び分離すること、によって得られる分離Ｐ型物質。３．Ｍｎ²⁺及び／又はＺｎ²⁺を含む炭水化物を含むシクリトールであり且つピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)ホスファターゼ活性化の生物学的活性を有する分離Ｐ型物質であり、該物質は、ネガティブモデルＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて測定した図１１中に示した通りの分子量を、又は約２３６ｍ／ｚの１又はそれ以上の構成単位の添加又は削除によって図１１中に示す分子量の一つに関連した分子量を有する、分離Ｐ型物質。４．該物質がリン酸塩を含む請求項１から３のいずれか１項記載の物質。５．該物質が以下の特徴：（ａ）それは、溶媒として４／１／１ブタノール／エタノール／水を用いる下降ペーパークロマトグラフィーにおいて基点に近い場所へ移動する；（ｂ）それは、Ｃ-１８アフィニティ樹脂上に部分的に保持される；（ｃ）それはＤｏｗａｘＡＧ５０(Ｈ+)カチオン交換樹脂上に結合する；（ｄ）それはＡＧ３Ａアニオン交換樹脂上に結合する；及び（ｅ）該物質の活性はプロナーゼに耐性がある、の１又はそれ以上を有する請求項１から４のいずれか１項記載の物質。６．該物質が以下の特徴：（ａ）グリコーゲン合成酵素ホスファターゼの活性を刺激する；又は（ｂ）血清フリー媒体中の繊維芽細胞に加えた際にマイトジェンである、を有する、請求項１から５のいずれか１項記載の物質。７．製薬的に許容されるキャリアとの組合せにおいて、請求項１から６のいずれか１項記載のＰ型物質を含んだ製薬組成物。８．Ａ型物質又はインスリンをさらに含む、請求項８記載の製薬組成物。９．内科療法の方法において使用するための請求項１から６のいずれか１項記載の物質。１０．請求項１から６のいずれか１項記載の物質のアンタゴニスト。１１．該アンタゴニストが：（ａ）Ｐ型物質の放出を抑制する；（ｂ）それのレベルを減少するためにＰ型物質に結合する；及び／又は、（ｃ）Ｐ型物質の生物学的活性を減じる、の特性を有する請求項１０のアンタゴニスト。１２．該アンタゴニストが、該物質に特異的に結合することができる抗体又は該物質に特異的に結合することができる結合タンパク質である請求項１０又は１１記載のアンタゴニスト。１３．請求項１０から１２のいずれか１項記載のアンタゴニストを含む製薬組成物。１４．内科療法の方法において使用するための請求項１から６のいずれか１項記載の物質のアンタゴニスト。