JP2001333800A - Method of comparing and detecting rna amount and dna amount - Google Patents
Method of comparing and detecting rna amount and dna amountInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡ量およびＤ
ＮＡ量の比較検出方法に関し、特に、３’末端側の配列
が不明でもＡＴＡＣ法の適応が可能なＲＮＡ量およびＳ
ＮＰを含む配列領域のＤＮＡ量の比較検出方法に係わ
る。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to the amount of RNA and D
Regarding the method for comparatively detecting the amount of NA, in particular, the amount of RNA and S which can be applied to the ATAC method even if the sequence at the 3 ′ end is unknown.
The present invention relates to a method for comparatively detecting the amount of DNA in a sequence region containing NP.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、各組織間での遺伝子の発現情報を
得る方法として、遺伝子発現のレベルを測定する技術と
されるノーザン・ブロッティング法が信頼性も高く一般
的であるが、測定に時間がかかり、少量のＲＮＡには不
向きであり、コストが高い等の点から、多量の遺伝子に
対する場合は利用が困難である。2. Description of the Related Art Conventionally, Northern blotting, which is a technique for measuring the level of gene expression, is a highly reliable and general method for obtaining information on the expression of genes between tissues. However, it is not suitable for a small amount of RNA and its cost is high.
【０００３】これに比して遺伝子の発現頻度を測定する
方法の一つであるＡＴＡＣ法（Adaptor tagged competi
tive ＰＣＲ（Kato，K．（1997）Nucleic Acid Re
s．，25，4694−4696）は、ＰＣＲ（Polymerase chain
reaction）を用いた技術であるため、ノーザン・ブロ
ッティング法と比較して高感度であると共に、複数のア
ダプターを用いた場合、段階的に濃度差を考慮した内部
標準向けのアダプター付加ｃＤＮＡの設定により、高精
度での遺伝子発現頻度が定量化でき、大量の遺伝子につ
いて、比較的短時間で微量のＲＮＡから発現プロファイ
ルの収集が可能な方法である。[0003] In contrast, the ATAC method (Adaptor tagged competi), which is one of the methods for measuring the expression frequency of a gene,
tive PCR (Kato, K. (1997) Nucleic Acid Re
s. , 25, 4694-4696) is a PCR (Polymerase chain).
reaction), it is more sensitive than the Northern blotting method, and when multiple adapters are used, by setting the adapter-added cDNA for the internal standard in consideration of the concentration difference step by step This method is capable of quantifying the gene expression frequency with high accuracy and collecting expression profiles of a large number of genes from a small amount of RNA in a relatively short time.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかし、ＡＴＡＣ法
は、検出にはＲＮＡから合成したｃＤＮＡのうち、６個
以上の連続するアデニル酸を含む配列であるポリアデニ
ル酸テイル様の配列由来の部分（以下、ポリＡ配列と称
する）を含む３’末端側のｃＤＮＡ断片を用いるので、
３’末端側の配列が不明の場合には制限酵素による認識
部位が不明であることに加え、遺伝子特異的プライマー
が設計できずＡＴＡＣ法を利用することが困難であっ
た。However, in the ATAC method, a portion derived from a polyadenylate tail-like sequence, which is a sequence containing six or more consecutive adenylic acids, of a cDNA synthesized from RNA for detection (hereinafter referred to as the "ATAC method"). , Referred to as a poly A sequence).
When the sequence at the 3′-terminal side is unknown, the recognition site by the restriction enzyme is unknown, and gene-specific primers could not be designed, so that it was difficult to use the ATAC method.
【０００５】ＡＴＡＣ法は、少なくとも２種類の試料に
含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプター
を付加し、該アダプターが付加されたｃＤＮＡを含む各
試料を適当な量比で混合した後ｃＤＮＡを増幅し、得ら
れる増幅産物の量比を求めることを特徴とする検出法で
ある。アダプターの付加時には、各試料にアダプターが
過剰に混合されるため、これを取り除く目的で、例えば
予めｃＤＮＡの３’末端側であるポリＡ配列部にビオチ
ンを付加しておき、アビジンを結合させたマグネットビ
ーズなどを用いて洗浄を行う。このため、３’末端側以
外のアダプター付加ｃＤＮＡは、ＰＣＲ前に取り除かれ
ることになる。したがって、ポリＡ配列に至る３’末端
側の配列が明確でない場合は、ＡＴＡＣ法を有効に用い
ることができなかった。このような場合には、３’末端
側の配列を決定する解析が必要であった。[0005] In the ATAC method, different types of adapters are added to each of the cDNAs contained in at least two types of samples, and the samples containing the cDNAs to which the adapters are added are mixed at an appropriate ratio, and then the cDNA is amplified. And a quantitative ratio of the amplification products obtained. When the adapter was added, the adapter was excessively mixed with each sample. For the purpose of removing the adapter, for example, biotin was previously added to the polyA sequence portion on the 3 ′ end side of the cDNA, and avidin was bound. Washing is performed using magnet beads or the like. Therefore, the adapter-added cDNA other than the 3 'end side is removed before PCR. Therefore, the ATAC method could not be used effectively when the sequence at the 3 ′ end leading to the poly A sequence was not clear. In such a case, analysis for determining the sequence at the 3 'end was necessary.
【０００６】また、３’末端側の配列が明確であって
も、ポリＡ配列と制限酵素の認識する最も３’末端側に
近い配列部分の間の領域について、３０塩基程度以内
と短い場合、この部分が他の遺伝子と相同性が高い場
合、繰り返し配列を含む場合、には遺伝子特異的プラ
イマーの設計ができないためにＡＴＡＣ法の実行が困難
であった。このような場合には、別の制限酵素を用いて
ｃＤＮＡの断片化を行い、これに適合するアダプター群
を用意して、ＡＴＡＣ法を行うことが考えられる。Even if the sequence at the 3 'end is clear, the region between the poly A sequence and the sequence closest to the 3' end recognized by the restriction enzyme is as short as about 30 bases or less. When this portion has a high homology with another gene or contains a repetitive sequence, it is difficult to perform the ATAC method because gene-specific primers cannot be designed. In such a case, it is conceivable that the ATAC method is performed by fragmenting the cDNA using another restriction enzyme, preparing a group of adapters suitable for the fragmentation.
【０００７】しかし、多量の遺伝子における検出を行う
場合には、用いる制限酵素の種類が増えることや、それ
ぞれの制限酵素に対応したアダプター付加ｃＤＮＡの準
備など検出全体が煩雑なものになることが問題点とな
る。However, in the case of detecting a large number of genes, there is a problem that the types of restriction enzymes to be used are increased, and the whole detection becomes complicated, such as preparation of an adapter-added cDNA corresponding to each restriction enzyme. Points.
【０００８】また、ヒトゲノム研究の進展に伴い、１塩
基多型（Single Nucleotide Polymorphism、以下ＳＮ
Ｐ）が注目されており、例えば、既知となったＤＮＡ配
列の１塩基の違いを、個々人に対して高速に検出する方
法が求められている。ＰＣＲにおいては、プライマーの
１塩基の違いがその増幅効率に差を与えうることを考慮
すると、ＡＴＡＣ法において遺伝子特異的プライマー中
の１塩基の違いはＰＣＲ産物量の差異を与えることが期
待される。このことから、ｃＤＮＡのようなポリＡ配列
をもたないゲノムＤＮＡへのＡＴＡＣ法の拡張が課題と
なっていた。[0008] With the progress of human genome research, Single Nucleotide Polymorphism (hereinafter referred to as SN)
P) has attracted attention, and for example, a method for rapidly detecting a single base difference in a known DNA sequence for each individual has been required. In PCR, considering that a single base difference between primers can give a difference in amplification efficiency, it is expected that a single base difference in a gene-specific primer will give a difference in PCR product amount in the ATAC method. . For this reason, extension of the ATAC method to genomic DNA having no poly A sequence such as cDNA has been a problem.
【０００９】本発明は、上記従来の難点を解決し、ポリ
Ａ配列をもたない遺伝子群についてもＡＴＡＣ法を利用
可能とし、また、ゲノムＤＮＡの量比の測定にもＡＴＡ
Ｃ法を用いることができるＲＮＡ量およびＤＮＡの比較
検出法を提供することを目的とする。[0009] The present invention solves the above-mentioned conventional problems, makes it possible to use the ATAC method for a group of genes having no poly A sequence, and also to measure the amount ratio of genomic DNA by the ATA method.
It is an object of the present invention to provide a method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA, which can use Method C.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
鋭意研究を行った結果、通常のＡＴＡＣ法で用いられる
アダプター群に加え、ポリＡ配列と類似性の高い配列か
らなる新規のアダプターを加えて用いることで、特に
３’末端側の配列が不明の場合であっても、従来のＡＴ
ＡＣ法による検出を十分に含んだまま拡張して適用でき
ることを見出し、またゲノムＤＮＡの量比の測定も可能
となることを含む本検出法を発明するに至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, in addition to a group of adapters used in the normal ATAC method, a novel adapter consisting of a sequence highly similar to the polyA sequence was added. By using the conventional AT, even when the sequence at the 3′-terminal side is unknown, the conventional AT
The present inventors have found that the method can be extended and applied while sufficiently including the detection by the AC method, and have also invented the present detection method including the possibility of measuring the quantitative ratio of genomic DNA.
【００１１】すなわち、請求項１に記載の本発明は、
（ａ）２つ以上の組織ＲＮＡからそれぞれ逆転写させて
得たｃＤＮＡを同一の制限酵素を用いてそれぞれ断片化
し、（ｂ）（ａ）により得られた同一または異なる組織
由来のｃＤＮＡ断片ごとに、それぞれ種類の異なるアダ
プターおよび各組織間で共通なアダプターを付加し、
（ｃ）（ｂ）により得られたアダプター付加ｃＤＮＡを
混合し、（ｄ）種類の異なるアダプターと共通の配列を
もつアダプタープライマー及び遺伝子特異的プライマー
を用いて、（ｂ）のアダプター付加ｃＤＮＡのうち、ア
ダプター付加前にｍＲＮＡのポリアデニル酸由来の領域
を含んでいなかったアダプター付加ｃＤＮＡを増幅し、
（ｅ）多組織間のｃＤＮＡの量比を測定し、（ｆ）測定
結果からＲＮＡを検出するＲＮＡ量の比較検出方法であ
る。That is, the present invention described in claim 1 provides:
(A) cDNA obtained by reverse transcription from two or more tissue RNAs is fragmented using the same restriction enzyme, and (b) cDNA fragments derived from the same or different tissues obtained in (a) are fragmented. , Add different types of adapters and common adapters between organizations,
(C) The adapter-added cDNA obtained in (b) is mixed, and (d) the adapter-added cDNA of (b) is mixed with an adapter primer having a common sequence with a different kind of adapter and a gene-specific primer. Amplifying the adapter-added cDNA that did not contain the region derived from polyadenylic acid of the mRNA before the addition of the adapter,
(E) A method for comparatively detecting the amount of RNA by measuring the ratio of the amount of cDNA between multiple tissues and (f) detecting RNA from the measurement results.
【００１２】請求項２に記載の本発明は、（ｂ）におい
て、各組織間に共通なアダプターが、ポリアデニル酸テ
イル様の配列である。[0012] In the present invention according to claim 2, in (b), the adapter common to each tissue is a polyadenylate tail-like sequence.
【００１３】請求項３に記載の本発明は、（ｂ）におい
て、各組織間で共通なアダプターが、その末端を化学的
に修飾したものであり、これを用いてアダプター付加ｃ
ＤＮＡを選別する工程を含む。According to a third aspect of the present invention, in (b), an adapter common to each tissue is obtained by chemically modifying the end of the adapter, and using this, the adapter is added.
And a step of selecting DNA.
【００１４】請求項４に記載の本発明は、（ｄ）におけ
る増幅は、アダプター付加ｃＤＮＡをＰＣＲ用の増幅器
に固定して行うＲＮＡ量の比較検出方法である。The present invention according to claim 4 is a method for comparatively detecting the amount of RNA, wherein the amplification in (d) is performed by fixing the adapter-added cDNA to a PCR amplifier.
【００１５】更に、請求項５に記載の本発明は、（ｇ）
同一または異なる個体由来のゲノムＤＮＡ断片ごとに、
それぞれ種類の異なるアダプターおよび各個体間で共通
なアダプターを付加し、（ｈ）（ｇ）により得られたア
ダプター付加ゲノムＤＮＡを混合し、（ｉ）種類の異な
るアダプターと共通の配列をもつアダプタープライマー
及び配列特異的プライマーを用いてアダプター付加ゲノ
ムＤＮＡを増幅し、（ｊ）個体間のゲノムＤＮＡの増幅
量比を測定するＤＮＡ量の比較検出方法である。Further, the present invention according to claim 5 provides (g)
For each genomic DNA fragment from the same or different individuals,
(H) mixing the adapter-added genomic DNA obtained in (h) and (g), adding an adapter common to each individual, and (i) an adapter primer having a common sequence with the different adapters And (j) a method of comparatively detecting the amount of DNA by measuring the ratio of the amount of amplification of genomic DNA between individuals by amplifying genomic DNA with an adapter using sequence-specific primers.
【００１６】請求項６に記載の本発明は、（ｇ）におい
て、各個体間に共通なアダプターが、ポリアデニル酸テ
イル様の配列である。[0016] In the present invention according to claim 6, in (g), the adapter common to each individual is a polyadenylate tail-like sequence.
【００１７】請求項７に記載の本発明は、（ｇ）におい
て、各個体間に共通なアダプターが、その末端を化学的
に修飾したものであり、これを用いてアダプター付加ゲ
ノムＤＮＡを選別する工程を含む。According to a seventh aspect of the present invention, in (g), the adapter common to each individual is obtained by chemically modifying the terminal, and the adapter-added genomic DNA is selected using the adapter. Process.
【００１８】請求項８に記載の本発明は、（ｉ）におけ
る増幅は、アダプター付加ゲノムＤＮＡをＰＣＲの増幅
器に固定して行うＤＮＡ量の比較検出方法である。The present invention according to claim 8 is a method for comparatively detecting the amount of DNA, wherein the amplification in (i) is performed by fixing the adapter-added genomic DNA to a PCR amplifier.
【００１９】請求項９に記載の本発明は、（ｉ）におけ
る配列特異的プライマーが、ＳＮＰを含む配列領域にお
いて設計されており、その塩基の置換をアダプター付加
ゲノムＤＮＡの増幅量の差異により検出するＤＮＡ量の
比較検出方法である。According to a ninth aspect of the present invention, the sequence-specific primer in (i) is designed in a sequence region containing an SNP, and the substitution of the base is detected by a difference in the amount of amplification of the genomic DNA with an adapter. This is a comparative detection method for the amount of DNA to be used.
【００２０】[0020]
【発明実施の形態】以下に、本発明によるＲＮＡ量およ
びＤＮＡの比較検出法について詳細に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA according to the present invention will be described below in detail.
【００２１】本発明は、ＡＴＡＣ法における断片化され
たｃＤＮＡのうちポリＡ配列をもたない断片に対してポ
リＡ配列と類似性の高いアダプターを、通常のＡＴＡＣ
法において用いられるアダプターに加えて用いるもので
ある。According to the present invention, an adapter having a high similarity to the polyA sequence with respect to a fragment having no polyA sequence among the fragmented cDNAs in the ATAC method is used.
It is used in addition to the adapter used in the method.
【００２２】図１に示されるような制限酵素Ｍｂｏ−Ｉ
でｃＤＮＡを断片化した遺伝子断片のうちポリＡ配列を
含まないものに対して、に示されるような通常のＡＴ
ＡＣ法で用いられるアダプターに、同図に示されるよ
うなアダプター（以下、ポリＡアダプターと称する）を
加えて同時にライゲーションを行う。The restriction enzyme Mbo-I as shown in FIG.
In the gene fragment obtained by fragmenting the cDNA in the above, a gene fragment not containing the poly A sequence was compared with a normal AT as shown in
An adapter as shown in the figure (hereinafter referred to as poly-A adapter) is added to the adapter used in the AC method, and ligation is performed simultaneously.
【００２３】この結果、図１（ア）〜（エ）に示される
ような４種類のアダプター付加ｃＤＮＡが得られる。As a result, four types of adapter-added cDNAs as shown in FIGS. 1A to 1D are obtained.
【００２４】これらのうち、（ア）が新たにＡＴＡＣ法
において測定の対象となるアダプター付加ｃＤＮＡで、
従来のＡＴＡＣ法が適用できる形状と同様の構造をもっ
たアダプター付加ｃＤＮＡとなっている。したがって、
３’末端を含むアダプター付加ｃＤＮＡに限らずに、Ａ
ＴＡＣ法の遺伝子特異的プライマーを設計することがで
きるようになる。Among these, (a) is a new adapter-added cDNA to be measured in the ATAC method,
This is an adapter-added cDNA having a structure similar to the shape to which the conventional ATAC method can be applied. Therefore,
Not limited to the adapter-added cDNA containing the 3 'end,
It becomes possible to design gene-specific primers for the TAC method.
【００２５】なお、アダプターのライゲーション以後の
操作を従来のＡＴＡＣ法と同様に進めると、（イ）は洗
浄の段階で消え、（ウ）および(エ)は、ＰＣＲにより増
幅されたとしても、その産物は（ア）に比較して無視で
きるほど微量である。すなわち３５サイクルのＰＣＲを
行った場合、(ア)は単純計算では、２の３５乗倍程度に
なるのに対し、（ウ）、（エ）は３５倍である。When the operation after the ligation of the adapter proceeds in the same manner as in the conventional ATAC method, (a) disappears at the washing stage, and (c) and (d), even if amplified by PCR, The product is negligible in comparison with (a). That is, when PCR is performed for 35 cycles, (a) is about 2 to the 35th power by simple calculation, whereas (c) and (d) are 35 times.
【００２６】また、本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡ
の比較検出法によれば、本来ｃＤＮＡのもつようなポリ
Ａ配列構造をもたないゲノムＤＮＡに対しても、ゲノム
ＤＮＡを制限酵素で断片化した後、上述と同様のアダプ
ター群をライゲーションすることで個体間のゲノムＤＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物の量比を検出することが可能となる。Also, the amount of RNA and DNA according to the present invention
According to the comparative detection method described above, even for genomic DNA which does not originally have a poly A sequence structure as in cDNA, after fragmenting the genomic DNA with a restriction enzyme, the same adapter group as described above is ligated. Genome DN between individuals
It becomes possible to detect the quantitative ratio of the A-derived PCR product.
【００２７】以下、本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡ
の比較検出法の各工程について説明する。以下に記述の
方法は、ｃＤＮＡに対してのものであるが、ゲノムＤＮ
Ａに対しても公知の抽出法を用いた抽出のち、制限酵素
を用いて断片化すればアダプター付加以下の工程は同様
である。 （１）ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製 各種臓器の細胞または組織などから逆転写酵素を用いて
それぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成する。ｃＤ
ＮＡの合成は公知のいずれかの手法により行うことがで
きる。例えば、ポリＡ＋ＲＮＡを調製して逆転写酵素を
作用させる方法、市販のキット（ライフテックオリエン
タル社など）により調製する方法等があげられる。Hereinafter, the amount of RNA and DNA according to the present invention will be described.
Each step of the comparative detection method will be described. The method described below is for cDNA,
If A is extracted using a known extraction method and then fragmented using a restriction enzyme, the steps following addition of an adapter are the same. (1) Preparation of RNA and cDNA cDNAs corresponding to each RNA are synthesized from cells or tissues of various organs using reverse transcriptase. cD
The synthesis of NA can be performed by any known technique. For example, there are a method of preparing polyA + RNA and allowing it to act on reverse transcriptase, a method of preparing it using a commercially available kit (such as Lifetech Oriental), and the like.
【００２８】ポリＡ＋ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成時に
は、３’末端側の選別ができるようにしておくこともで
きる。例えば、ビオチン付きのオリゴｄＴプライマーを
用い、ストレプトアビジンによる結合を用いたマグネッ
トビーズにより、３’末端側のみを選択できるようにし
ておくことが好ましいが、この方法に制限されない。 （２）アダプター付加ｃＤＮＡの調製 各組織より合成されたｃＤＮＡを、同一の制限酵素を用
いて、個々に断片化する。これらから、５〜７種類、好
ましくは６種類の組織由来の断片を選び、これに断片化
されたｃＤＮＡとのライゲーションを可能とするような
末端をもつ種類の異なるアダプターを個々にライゲーシ
ョンする。At the time of cDNA synthesis from poly A + RNA, it may be possible to select the 3 'end. For example, it is preferable to use an oligo dT primer with biotin and to select only the 3 'terminal side by magnet beads using binding with streptavidin, but this method is not limited. (2) Preparation of cDNA with Adapter The cDNA synthesized from each tissue is fragmented individually using the same restriction enzymes. From these, fragments derived from 5 to 7, preferably 6 types of tissues are selected, and different types of adapters having ends that enable ligation with the fragmented cDNA are individually ligated thereto.
【００２９】このライゲーションの際には、同時にポリ
Ａ様配列をもった、各組織に対して共通に用いるアダプ
ター（ポリＡアダプター）も同時に用いる。このポリＡ
アダプターにはビオチンを付けるなど前述の（１）にお
けるｃＤＮＡのポリＡ部分を用いた選択法と同様の処置
を施すことが望ましい。At the time of the ligation, an adapter having a polyA-like sequence and commonly used for each tissue (polyA adapter) is also used. This poly A
It is desirable to perform the same treatment as the selection method using the polyA portion of the cDNA in (1) described above, such as attaching biotin to the adapter.
【００３０】なお、種類の異なるアダプターが長さの異
なるものである場合には、これら長さの異なるアダプタ
ーには、２０〜２５塩基程度の連続して共通であるよう
な配列を設計しておく。 （３）アダプター付加ｃＤＮＡの混合 ６種類のアダプター付加ｃＤＮＡを適当な量比で混合す
る。６種類の異なる組織由来のものを等量ずつ混合する
場合、また、同一組織由来のｃＤＮＡに長さの異なるア
ダプターを付加し、濃度を段階的に変えて混合すること
で標準組織とみる場合等が考えられる。ここで、組織の
種類は６に限定されるものではない。When adapters of different types have different lengths, a sequence of about 20 to 25 bases that is continuously common is designed for these adapters having different lengths. . (3) Mixing of adapter-added cDNAs Six types of adapter-added cDNAs are mixed at an appropriate ratio. Equal amounts of 6 different types of tissues are mixed, or adapters of different lengths are added to cDNAs from the same tissue, and the concentration is changed step by step to mix them as a standard tissue. Can be considered. Here, the type of organization is not limited to six.
【００３１】なお、ビオチイン付のオリゴｄＴプライマ
ーを使用している場合は３’末端配列を含むアダプター
付加ｃＤＮＡおよびポリＡアダプターの付加されたアダ
プター付加ｃＤＮＡのみを選別することもできる。 （４）増幅 上記の通り調製したアダプター付加ｃＤＮＡにアダプタ
ープライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて増幅
反応（ＰＣＲ）を行う。When an oligo dT primer with biotin is used, only the adapter-added cDNA containing the 3 'terminal sequence and the adapter-added cDNA to which the polyA adapter is added can be selected. (4) Amplification An amplification reaction (PCR) is performed on the adapter-added cDNA prepared as described above using an adapter primer and a gene-specific primer.
【００３２】ここで、アダプタープライマーとは、アダ
プターと共通の配列をもつオリゴヌクレオチドである。
長さの異なるアダプターの場合には、そのすべてのアダ
プターがもつ、共通の配列の部分と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドである。Here, the adapter primer is an oligonucleotide having a sequence common to the adapter.
In the case of adapters having different lengths, these are oligonucleotides having a sequence complementary to a part of the common sequence which all the adapters have.
【００３３】ＰＣＲの条件については、公知のＡＴＡＣ
法の設定（例えば、Kato，K．（1997）Nucleic Acid
Res．，25，4694−4696）によればよい。 （５）検出 増幅により得られた産物の検出は、公知の方法により行
うことができる。例えば、ＰＣＲに用いるアダプタープ
ライマーに予め蛍光色素を標識しておくことで、蛍光強
度の測定により行うことができる。Regarding the conditions for PCR, a known ATAC
Method settings (eg, Kato, K. (1997) Nucleic Acid
Res. , 25, 4694-4696). (5) Detection The product obtained by the amplification can be detected by a known method. For example, by labeling the adapter primer used for PCR with a fluorescent dye in advance, the measurement can be performed by measuring the fluorescence intensity.
【００３４】長さの異なるアダプターを用いている場合
は、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルゲル泳動等
を行い、染色の後に増幅産物のバンドの強度を測定する
こともできる。増幅産物は、所定の測定機器（ＰＥバイ
オシステムズ社製ＤＮＡアナライザー、同社製シークエ
ンサーなど）で測定することもできる。When adapters having different lengths are used, agarose gel electrophoresis, polyacryl gel electrophoresis, or the like is performed, and the intensity of the band of the amplified product can be measured after staining. The amplification product can also be measured with a predetermined measuring device (a DNA analyzer manufactured by PE Biosystems, a sequencer manufactured by the company, etc.).
【００３５】増幅産物のバンド強度を蛍光強度として測
定した場合には、その強度の比が増幅前のアダプター付
加ｃＤＮＡ量、すなわち各組織におけるＲＮＡ量の比を
表すことになるので、これをもってＲＮＡ量の比較検出
が行える。When the band intensity of the amplified product is measured as the fluorescence intensity, the ratio of the intensity indicates the amount of the adapter-added cDNA before amplification, that is, the ratio of the amount of RNA in each tissue. Can be compared and detected.
【００３６】[0036]
【発明の効果】本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡの比
較検出法によれば、通常のＡＴＡＣ法で用いられるアダ
プター群に加え、ポリＡ配列と類似性の高い配列からな
る新規のアダプターを加えて用いることで、従来のＡＴ
ＡＣ法を用いた場合に対して、３’末端側の配列情報が
未知の場合でもＡＴＡＣ法が適用でき、また、遺伝子特
異的プライマーの設計に当たり、配列を選定する自由度
が増大するので、ＡＴＡＣ法の利用範囲が拡大し、大量
の遺伝子に対して発現プロファイルを取得することを容
易にする。また、従来ｃＤＮＡの量比の測定に限定され
ていたＡＴＡＣ法がゲノムＤＮＡを対象とすることがで
きるように拡張される。According to the method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA according to the present invention, a novel adapter consisting of a sequence highly similar to the polyA sequence is used in addition to the adapter group used in the normal ATAC method. The conventional AT
In contrast to the case where the AC method is used, the ATAC method can be applied even when the sequence information on the 3 ′ terminal side is unknown, and the degree of freedom in selecting a sequence in designing gene-specific primers is increased. The range of use of the method is expanded, facilitating the acquisition of expression profiles for large numbers of genes. In addition, the ATAC method, which was conventionally limited to measuring the quantitative ratio of cDNA, is extended so that genomic DNA can be targeted.
【図１】本発明におけるアダプター付加ｃＤＮＡの形態
を示す。FIG. 1 shows the form of an adapter-added cDNA according to the present invention.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１３年２月１３日（２００１．２．１
３）[Submission date] February 13, 2001 (2001.2.1)
3)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【書類名】 明細書[Document Name] Statement
【発明の名称】ＲＮＡ量およびＤＮＡ量の比較検出方法Patent application title: Method for comparative detection of RNA amount and DNA amount
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡ量およびＤ
ＮＡ量の比較検出方法に関し、特に、３’末端側の配列
が不明でもＡＴＡＣ法の適応が可能なＲＮＡ量およびＳ
ＮＰを含む配列領域のＤＮＡ量の比較検出方法に係わ
る。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to the amount of RNA and D
Regarding the method for comparatively detecting the amount of NA, in particular, the amount of RNA and S which can be applied to the ATAC method even if the sequence at the 3 ′ end is unknown.
The present invention relates to a method for comparatively detecting the amount of DNA in a sequence region containing NP.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、各組織間での遺伝子の発現情報を
得る方法として、遺伝子発現のレベルを測定する技術と
されるノーザン・ブロッティング法が信頼性も高く一般
的であるが、測定に時間がかかり、少量のＲＮＡには不
向きであり、コストが高い等の点から、多量の遺伝子に
対する場合は利用が困難である。2. Description of the Related Art Conventionally, Northern blotting, which is a technique for measuring the level of gene expression, is a highly reliable and general method for obtaining information on the expression of genes between tissues. However, it is not suitable for a small amount of RNA and its cost is high.
【０００３】これに比して遺伝子の発現頻度を測定する
方法の一つであるＡＴＡＣ法（Adaptor tagged competi
tive ＰＣＲ（Kato，K．（1997）Nucleic Acid Re
s．，25，4694−4696）は、ＰＣＲ（Polymerase chain
reaction）を用いた技術であるため、ノーザン・ブロ
ッティング法と比較して高感度であると共に、複数のア
ダプターを用いた場合、段階的に濃度差を考慮した内部
標準向けのアダプター付加ｃＤＮＡの設定により、高精
度での遺伝子発現頻度が定量化でき、大量の遺伝子につ
いて、比較的短時間で微量のＲＮＡから発現プロファイ
ルの収集が可能な方法である。[0003] In contrast, the ATAC method (Adaptor tagged competi), which is one of the methods for measuring the expression frequency of a gene,
tive PCR (Kato, K. (1997) Nucleic Acid Re
s. , 25, 4694-4696) is a PCR (Polymerase chain).
reaction), it is more sensitive than the Northern blotting method, and when multiple adapters are used, the adapter-added cDNA for the internal standard can be set by considering the concentration difference step by step. This method is capable of quantifying the gene expression frequency with high accuracy and collecting expression profiles of a large number of genes from a small amount of RNA in a relatively short time.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかし、ＡＴＡＣ法
は、検出にはＲＮＡから合成したｃＤＮＡのうち、６個
以上の連続するアデニル酸を含む配列であるポリアデニ
ル酸テイル様の配列由来の部分（以下、ポリＡ配列と称
する）を含む３’末端側のｃＤＮＡ断片を用いるので、
３’末端側の配列が不明の場合には制限酵素による認識
部位が不明であることに加え、遺伝子特異的プライマー
が設計できずＡＴＡＣ法を利用することが困難であっ
た。However, in the ATAC method, a portion derived from a polyadenylate tail-like sequence, which is a sequence containing six or more consecutive adenylic acids, of a cDNA synthesized from RNA for detection (hereinafter referred to as the "ATAC method"). , Referred to as a poly A sequence).
When the sequence at the 3′-terminal side is unknown, the recognition site by the restriction enzyme is unknown, and gene-specific primers could not be designed, so that it was difficult to use the ATAC method.
【０００５】ＡＴＡＣ法は、少なくとも２種類の試料に
含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプター
を付加し、該アダプターが付加されたｃＤＮＡを含む各
試料を適当な量比で混合した後ｃＤＮＡを増幅し、得ら
れる増幅産物の量比を求めることを特徴とする検出法で
ある。アダプターの付加時には、各試料にアダプターが
過剰に混合されるため、これを取り除く目的で、例えば
予めｃＤＮＡの３’末端側であるポリＡ配列部にビオチ
ンを付加しておき、アビジンを結合させたマグネットビ
ーズなどを用いて洗浄を行う。このため、３’末端側以
外のアダプター付加ｃＤＮＡは、ＰＣＲ前に取り除かれ
ることになる。したがって、ポリＡ配列に至る３’末端
側の配列が明確でない場合は、ＡＴＡＣ法を有効に用い
ることができなかった。このような場合には、３’末端
側の配列を決定する解析が必要であった。[0005] In the ATAC method, different types of adapters are added to each of the cDNAs contained in at least two types of samples, and the samples containing the cDNAs to which the adapters are added are mixed at an appropriate ratio, and then the cDNA is amplified. And a quantitative ratio of the amplification products obtained. When the adapter was added, the adapter was excessively mixed with each sample. For the purpose of removing the adapter, for example, biotin was added in advance to the poly A sequence portion on the 3 'end side of the cDNA, and avidin was bound thereto. Washing is performed using magnet beads or the like. Therefore, the adapter-added cDNA other than the 3 'end side is removed before PCR. Therefore, the ATAC method could not be used effectively when the sequence at the 3 ′ end leading to the poly A sequence was not clear. In such a case, analysis for determining the sequence at the 3 'end was necessary.
【０００６】また、３’末端側の配列が明確であって
も、ポリＡ配列と制限酵素の認識する最も３’末端側に
近い配列部分の間の領域について、３０塩基程度以内
と短い場合、この部分が他の遺伝子と相同性が高い場
合、繰り返し配列を含む場合、には遺伝子特異的プラ
イマーの設計ができないためにＡＴＡＣ法の実行が困難
であった。このような場合には、別の制限酵素を用いて
ｃＤＮＡの断片化を行い、これに適合するアダプター群
を用意して、ＡＴＡＣ法を行うことが考えられる。Even if the sequence at the 3 'end is clear, the region between the poly A sequence and the sequence closest to the 3' end recognized by the restriction enzyme is as short as about 30 bases or less. When this portion has a high homology with another gene or contains a repetitive sequence, it is difficult to perform the ATAC method because gene-specific primers cannot be designed. In such a case, it is conceivable that the ATAC method is performed by fragmenting the cDNA using another restriction enzyme, preparing a group of adapters suitable for the fragmentation.
【０００７】しかし、多量の遺伝子における検出を行う
場合には、用いる制限酵素の種類が増えることや、それ
ぞれの制限酵素に対応したアダプター付加ｃＤＮＡの準
備など検出全体が煩雑なものになることが問題点とな
る。However, in the case of detecting a large number of genes, there is a problem that the types of restriction enzymes to be used are increased, and the whole detection becomes complicated, such as preparation of an adapter-added cDNA corresponding to each restriction enzyme. Points.
【０００８】また、ヒトゲノム研究の進展に伴い、１塩
基多型（Single Nucleotide Polymorphism、以下ＳＮ
Ｐ）が注目されており、例えば、既知となったＤＮＡ配
列の１塩基の違いを、個々人に対して高速に検出する方
法が求められている。ＰＣＲにおいては、プライマーの
１塩基の違いがその増幅効率に差を与えうることを考慮
すると、ＡＴＡＣ法において遺伝子特異的プライマー中
の１塩基の違いはＰＣＲ産物量の差異を与えることが期
待される。このことから、ｃＤＮＡのようなポリＡ配列
をもたないゲノムＤＮＡへのＡＴＡＣ法の拡張が課題と
なっていた。[0008] With the progress of human genome research, Single Nucleotide Polymorphism (hereinafter referred to as SN)
P) has attracted attention, and for example, a method for rapidly detecting a single base difference in a known DNA sequence for each individual has been required. In PCR, considering that one base difference between primers may give a difference in amplification efficiency, it is expected that one base difference in gene-specific primers will give a difference in PCR product amount in ATAC method. . For this reason, extension of the ATAC method to genomic DNA having no poly A sequence such as cDNA has been a problem.
【０００９】本発明は、上記従来の難点を解決し、ポリ
Ａ配列をもたない遺伝子群についてもＡＴＡＣ法を利用
可能とし、また、ゲノムＤＮＡの量比の測定にもＡＴＡ
Ｃ法を用いることができるＲＮＡ量およびＤＮＡの比較
検出法を提供することを目的とする。[0009] The present invention solves the above-mentioned conventional problems, makes it possible to use the ATAC method for a group of genes having no poly A sequence, and also to measure the amount ratio of genomic DNA by the ATA method.
It is an object of the present invention to provide a method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA, which can use Method C.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
鋭意研究を行った結果、通常のＡＴＡＣ法で用いられる
アダプター群に加え、ポリＡ配列と類似性の高い配列か
らなる新規のアダプターを加えて用いることで、特に
３’末端側の配列が不明の場合であっても、従来のＡＴ
ＡＣ法による検出を十分に含んだまま拡張して適用でき
ることを見出し、またゲノムＤＮＡの量比の測定も可能
となることを含む本検出法を発明するに至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, in addition to a group of adapters used in the normal ATAC method, a novel adapter consisting of a sequence highly similar to the polyA sequence was added. By using the conventional AT, even when the sequence at the 3′-terminal side is unknown, the conventional AT
The present inventors have found that the method can be extended and applied while sufficiently including the detection by the AC method, and have also invented the present detection method including the possibility of measuring the quantitative ratio of genomic DNA.
【００１１】すなわち、請求項１に記載の本発明は、
（ａ）２つ以上の組織ＲＮＡからそれぞれ逆転写させて
得たｃＤＮＡを同一の制限酵素を用いてそれぞれ断片化
し、（ｂ）（ａ）により得られた同一または異なる組織
由来のｃＤＮＡ断片ごとに、それぞれ種類の異なるアダ
プターおよび各組織間で共通なアダプターを付加し、
（ｃ）（ｂ）により得られたアダプター付加ｃＤＮＡを
混合し、（ｄ）種類の異なるアダプターと共通の配列を
もつアダプタープライマー及び遺伝子特異的プライマー
を用いて、（ｂ）のアダプター付加ｃＤＮＡのうち、ア
ダプター付加前にｍＲＮＡのポリアデニル酸由来の領域
を含んでいなかったアダプター付加ｃＤＮＡを増幅し、
（ｅ）多組織間のｃＤＮＡの量比を測定し、（ｆ）測定
結果からＲＮＡを検出するＲＮＡ量の比較検出方法であ
る。That is, the present invention described in claim 1 provides:
(A) cDNA obtained by reverse transcription from two or more tissue RNAs is fragmented using the same restriction enzyme, and (b) cDNA fragments derived from the same or different tissues obtained in (a) are fragmented. , Add different types of adapters and common adapters between organizations,
(C) The adapter-added cDNA obtained in (b) is mixed, and (d) the adapter-added cDNA of (b) is mixed with an adapter primer having a common sequence with a different kind of adapter and a gene-specific primer. Amplifying the adapter-added cDNA that did not contain the region derived from polyadenylic acid of the mRNA before the addition of the adapter,
(E) A method for comparatively detecting the amount of RNA by measuring the ratio of the amount of cDNA between multiple tissues and (f) detecting RNA from the measurement results.
【００１２】請求項２に記載の本発明は、（ｂ）におい
て、各組織間に共通なアダプターが、ポリアデニル酸テ
イル様の配列である。[0012] In the present invention according to claim 2, in (b), the adapter common to each tissue is a polyadenylate tail-like sequence.
【００１３】請求項３に記載の本発明は、（ｂ）におい
て、各組織間で共通なアダプターが、その末端を化学的
に修飾したものであり、これを用いてアダプター付加ｃ
ＤＮＡを選別する工程を含む。According to a third aspect of the present invention, in (b), an adapter common to each tissue is obtained by chemically modifying the end of the adapter, and using this, the adapter is added.
And a step of selecting DNA.
【００１４】請求項４に記載の本発明は、（ｄ）におけ
る増幅は、アダプター付加ｃＤＮＡをＰＣＲ用の増幅器
に固定して行うＲＮＡ量の比較検出方法である。The present invention according to claim 4 is a method for comparatively detecting the amount of RNA, wherein the amplification in (d) is performed by fixing the adapter-added cDNA to a PCR amplifier.
【００１５】更に、請求項５に記載の本発明は、（ｇ）
同一または異なる個体由来のゲノムＤＮＡ断片ごとに、
それぞれ種類の異なるアダプターおよび各個体間で共通
なアダプターを付加し、（ｈ）（ｇ）により得られたア
ダプター付加ゲノムＤＮＡを混合し、（ｉ）種類の異な
るアダプターと共通の配列をもつアダプタープライマー
及び配列特異的プライマーを用いてアダプター付加ゲノ
ムＤＮＡを増幅し、（ｊ）個体間のゲノムＤＮＡの増幅
量比を測定するＤＮＡ量の比較検出方法である。Further, the present invention according to claim 5 provides (g)
For each genomic DNA fragment from the same or different individuals,
(H) mixing the adapter-added genomic DNA obtained in (h) and (g), adding an adapter common to each individual, and (i) an adapter primer having a common sequence with the different adapters And (j) a method of comparatively detecting the amount of DNA by measuring the ratio of the amount of amplification of genomic DNA between individuals by amplifying genomic DNA with an adapter using sequence-specific primers.
【００１６】請求項６に記載の本発明は、（ｇ）におい
て、各個体間に共通なアダプターが、ポリアデニル酸テ
イル様の配列である。[0016] In the present invention according to claim 6, in (g), the adapter common to each individual is a polyadenylate tail-like sequence.
【００１７】請求項７に記載の本発明は、（ｇ）におい
て、各個体間に共通なアダプターが、その末端を化学的
に修飾したものであり、これを用いてアダプター付加ゲ
ノムＤＮＡを選別する工程を含む。According to a seventh aspect of the present invention, in (g), the adapter common to each individual is obtained by chemically modifying the terminal, and the adapter-added genomic DNA is selected using the adapter. Process.
【００１８】請求項８に記載の本発明は、（ｉ）におけ
る増幅は、アダプター付加ゲノムＤＮＡをＰＣＲの増幅
器に固定して行うＤＮＡ量の比較検出方法である。The present invention according to claim 8 is a method for comparatively detecting the amount of DNA, wherein the amplification in (i) is performed by fixing the adapter-added genomic DNA to a PCR amplifier.
【００１９】請求項９に記載の本発明は、（ｉ）におけ
る配列特異的プライマーが、ＳＮＰを含む配列領域にお
いて設計されており、その塩基の置換をアダプター付加
ゲノムＤＮＡの増幅量の差異により検出するＤＮＡ量の
比較検出方法である。According to a ninth aspect of the present invention, the sequence-specific primer in (i) is designed in a sequence region containing an SNP, and the substitution of the base is detected by a difference in the amount of amplification of the genomic DNA with an adapter. This is a comparative detection method for the amount of DNA to be used.
【００２０】[0020]
【発明実施の形態】以下に、本発明によるＲＮＡ量およ
びＤＮＡの比較検出法について詳細に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA according to the present invention will be described below in detail.
【００２１】本発明は、ＡＴＡＣ法における断片化され
たｃＤＮＡのうちポリＡ配列をもたない断片に対してポ
リＡ配列と類似性の高いアダプターを、通常のＡＴＡＣ
法において用いられるアダプターに加えて用いるもので
ある。According to the present invention, an adapter having a high similarity to the polyA sequence with respect to a fragment having no polyA sequence among the fragmented cDNAs in the ATAC method is used.
It is used in addition to the adapter used in the method.
【００２２】図１?に示されるような制限酵素Ｍｂｏ−
ＩでｃＤＮＡを断片化した遺伝子断片のうちポリＡ配列
を含まないものに対して、に示されるような通常のＡ
ＴＡＣ法で用いられるアダプターに、同図に示される
ようなアダプター（以下、ポリＡアダプターと称する）
を加えて同時にライゲーションを行う。The restriction enzyme Mbo- as shown in FIG.
In the gene fragments obtained by fragmenting the cDNA with I, those containing no poly A sequence, the normal A
The adapter used in the TAC method is an adapter as shown in the figure (hereinafter referred to as a poly A adapter).
And perform ligation at the same time.
【００２３】この結果、図１（ア）〜（エ）に示される
ような４種類のアダプター付加ｃＤＮＡが得られる。As a result, four types of adapter-added cDNAs as shown in FIGS. 1A to 1D are obtained.
【００２４】これらのうち、（ア）が新たにＡＴＡＣ法
において測定の対象となるアダプター付加ｃＤＮＡで、
従来のＡＴＡＣ法が適用できる形状と同様の構造をもっ
たアダプター付加ｃＤＮＡとなっている。したがって、
３’末端を含むアダプター付加ｃＤＮＡに限らずに、Ａ
ＴＡＣ法の遺伝子特異的プライマーを設計することがで
きるようになる。Among these, (a) is a new adapter-added cDNA to be measured in the ATAC method,
This is an adapter-added cDNA having a structure similar to the shape to which the conventional ATAC method can be applied. Therefore,
Not limited to the adapter-added cDNA containing the 3 'end,
It becomes possible to design gene-specific primers for the TAC method.
【００２５】なお、アダプターのライゲーション以後の
操作を従来のＡＴＡＣ法と同様に進めると、（イ）は洗
浄の段階で消え、（ウ）および(エ)は、ＰＣＲにより増
幅されたとしても、その産物は（ア）に比較して無視で
きるほど微量である。すなわち３５サイクルのＰＣＲを
行った場合、(ア)は単純計算では、２の３５乗倍程度に
なるのに対し、（ウ）、（エ）は３５倍である。When the operation after the ligation of the adapter proceeds in the same manner as in the conventional ATAC method, (a) disappears at the washing stage, and (c) and (d), even if amplified by PCR, The product is negligible in comparison with (a). That is, when PCR is performed for 35 cycles, (a) is about 2 to the 35th power by simple calculation, whereas (c) and (d) are 35 times.
【００２６】また、本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡ
の比較検出法によれば、本来ｃＤＮＡのもつようなポリ
Ａ配列構造をもたないゲノムＤＮＡに対しても、ゲノム
ＤＮＡを制限酵素で断片化した後、上述と同様のアダプ
ター群をライゲーションすることで個体間のゲノムＤＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物の量比を検出することが可能となる。Also, the amount of RNA and DNA according to the present invention
According to the comparative detection method described above, even for genomic DNA which does not originally have a poly A sequence structure as in cDNA, after fragmenting the genomic DNA with a restriction enzyme, the same adapter group as described above is ligated. Genome DN between individuals
It becomes possible to detect the quantitative ratio of the A-derived PCR product.
【００２７】以下、本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡ
の比較検出法の各工程について説明する。以下に記述の
方法は、ｃＤＮＡに対してのものであるが、ゲノムＤＮ
Ａに対しても公知の抽出法を用いた抽出のち、制限酵素
を用いて断片化すればアダプター付加以下の工程は同様
である。 （１）ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製 各種臓器の細胞または組織などから逆転写酵素を用いて
それぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成する。ｃＤ
ＮＡの合成は公知のいずれかの手法により行うことがで
きる。例えば、ポリＡ＋ＲＮＡを調製して逆転写酵素を
作用させる方法、市販のキット（ライフテックオリエン
タル社など）により調製する方法等があげられる。Hereinafter, the amount of RNA and DNA according to the present invention will be described.
Each step of the comparative detection method will be described. The method described below is for cDNA,
If A is extracted using a known extraction method and then fragmented using a restriction enzyme, the steps following addition of an adapter are the same. (1) Preparation of RNA and cDNA cDNAs corresponding to each RNA are synthesized from cells or tissues of various organs using reverse transcriptase. cD
The synthesis of NA can be performed by any known technique. For example, there are a method of preparing polyA + RNA and allowing it to act on reverse transcriptase, a method of preparing it using a commercially available kit (such as Lifetech Oriental), and the like.
【００２８】ポリＡ＋ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成時に
は、３’末端側の選別ができるようにしておくこともで
きる。例えば、ビオチン付きのオリゴｄＴプライマーを
用い、ストレプトアビジンによる結合を用いたマグネッ
トビーズにより、３’末端側のみを選択できるようにし
ておくことが好ましいが、この方法に制限されない。 （２）アダプター付加ｃＤＮＡの調製 各組織より合成されたｃＤＮＡを、同一の制限酵素を用
いて、個々に断片化する。これらから、５〜７種類、好
ましくは６種類の組織由来の断片を選び、これに断片化
されたｃＤＮＡとのライゲーションを可能とするような
末端をもつ種類の異なるアダプターを個々にライゲーシ
ョンする。At the time of cDNA synthesis from poly A + RNA, it may be possible to select the 3 'end. For example, it is preferable to use an oligo dT primer with biotin and to select only the 3 'terminal side by magnet beads using binding with streptavidin, but this method is not limited. (2) Preparation of cDNA with Adapter The cDNA synthesized from each tissue is fragmented individually using the same restriction enzymes. From these, fragments derived from 5 to 7, preferably 6 types of tissues are selected, and different types of adapters having ends that enable ligation with the fragmented cDNA are individually ligated thereto.
【００２９】このライゲーションの際には、同時にポリ
Ａ様配列をもった、各組織に対して共通に用いるアダプ
ター（ポリＡアダプター）も同時に用いる。このポリＡ
アダプターにはビオチンを付けるなど前述の（１）にお
けるｃＤＮＡのポリＡ部分を用いた選択法と同様の処置
を施すことが望ましい。At the time of the ligation, an adapter having a polyA-like sequence and commonly used for each tissue (polyA adapter) is also used. This poly A
It is desirable to perform the same treatment as the selection method using the polyA portion of the cDNA in (1) described above, such as attaching biotin to the adapter.
【００３０】なお、種類の異なるアダプターが長さの異
なるものである場合には、これら長さの異なるアダプタ
ーには、２０〜２５塩基程度の連続して共通であるよう
な配列を設計しておく。 （３）アダプター付加ｃＤＮＡの混合 ６種類のアダプター付加ｃＤＮＡを適当な量比で混合す
る。６種類の異なる組織由来のものを等量ずつ混合する
場合、また、同一組織由来のｃＤＮＡに長さの異なるア
ダプターを付加し、濃度を段階的に変えて混合すること
で標準組織とみる場合等が考えられる。ここで、組織の
種類は６に限定されるものではない。When adapters of different types have different lengths, a sequence of about 20 to 25 bases that is continuously common is designed for these adapters having different lengths. . (3) Mixing of adapter-added cDNAs Six types of adapter-added cDNAs are mixed at an appropriate ratio. Equal amounts of 6 different types of tissues are mixed, or adapters of different lengths are added to cDNAs from the same tissue, and the concentration is changed step by step to mix them as a standard tissue. Can be considered. Here, the type of organization is not limited to six.
【００３１】なお、ビオチイン付のオリゴｄＴプライマ
ーを使用している場合は３’末端配列を含むアダプター
付加ｃＤＮＡおよびポリＡアダプターの付加されたアダ
プター付加ｃＤＮＡのみを選別することもできる。 （４）増幅 上記の通り調製したアダプター付加ｃＤＮＡにアダプタ
ープライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて増幅
反応（ＰＣＲ）を行う。When an oligo dT primer with biotin is used, only the adapter-added cDNA containing the 3 'terminal sequence and the adapter-added cDNA to which the polyA adapter is added can be selected. (4) Amplification An amplification reaction (PCR) is performed on the adapter-added cDNA prepared as described above using an adapter primer and a gene-specific primer.
【００３２】ここで、アダプタープライマーとは、アダ
プターと共通の配列をもつオリゴヌクレオチドである。
長さの異なるアダプターの場合には、そのすべてのアダ
プターがもつ、共通の配列の部分と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドである。Here, the adapter primer is an oligonucleotide having a sequence common to the adapter.
In the case of adapters having different lengths, these are oligonucleotides having a sequence complementary to a part of the common sequence which all the adapters have.
【００３３】ＰＣＲの条件については、公知のＡＴＡＣ
法の設定（例えば、Kato，K．（1997）Nucleic Acid
Res．，25，4694−4696）によればよい。 （５）検出 増幅により得られた産物の検出は、公知の方法により行
うことができる。例えば、ＰＣＲに用いるアダプタープ
ライマーに予め蛍光色素を標識しておくことで、蛍光強
度の測定により行うことができる。Regarding the conditions for PCR, a known ATAC
Method settings (eg, Kato, K. (1997) Nucleic Acid
Res. , 25, 4694-4696). (5) Detection The product obtained by the amplification can be detected by a known method. For example, by labeling the adapter primer used for PCR with a fluorescent dye in advance, the measurement can be performed by measuring the fluorescence intensity.
【００３４】長さの異なるアダプターを用いている場合
は、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルゲル泳動等
を行い、染色の後に増幅産物のバンドの強度を測定する
こともできる。増幅産物は、所定の測定機器（ＰＥバイ
オシステムズ社製ＤＮＡアナライザー、同社製シークエ
ンサーなど）で測定することもできる。When adapters having different lengths are used, agarose gel electrophoresis, polyacryl gel electrophoresis, or the like is performed, and the intensity of the band of the amplified product can be measured after staining. The amplification product can also be measured with a predetermined measuring device (a DNA analyzer manufactured by PE Biosystems, a sequencer manufactured by the company, etc.).
【００３５】増幅産物のバンド強度を蛍光強度として測
定した場合には、その強度の比が増幅前のアダプター付
加ｃＤＮＡ量、すなわち各組織におけるＲＮＡ量の比を
表すことになるので、これをもってＲＮＡ量の比較検出
が行える。When the band intensity of the amplified product is measured as the fluorescence intensity, the ratio of the intensity indicates the amount of the adapter-added cDNA before amplification, that is, the ratio of the amount of RNA in each tissue. Can be compared and detected.
【００３６】[0036]
【発明の効果】本発明によるＲＮＡ量およびＤＮＡの比
較検出法によれば、通常のＡＴＡＣ法で用いられるアダ
プター群に加え、ポリＡ配列と類似性の高い配列からな
る新規のアダプターを加えて用いることで、従来のＡＴ
ＡＣ法を用いた場合に対して、３’末端側の配列情報が
未知の場合でもＡＴＡＣ法が適用でき、また、遺伝子特
異的プライマーの設計に当たり、配列を選定する自由度
が増大するので、ＡＴＡＣ法の利用範囲が拡大し、大量
の遺伝子に対して発現プロファイルを取得することを容
易にする。また、従来ｃＤＮＡの量比の測定に限定され
ていたＡＴＡＣ法がゲノムＤＮＡを対象とすることがで
きるように拡張される。According to the method for comparatively detecting the amount of RNA and DNA according to the present invention, a novel adapter consisting of a sequence highly similar to the polyA sequence is used in addition to the adapter group used in the normal ATAC method. The conventional AT
In contrast to the case where the AC method is used, the ATAC method can be applied even when the sequence information on the 3 ′ terminal side is unknown, and the degree of freedom in selecting a sequence in designing gene-specific primers is increased. The range of use of the method is expanded, facilitating the acquisition of expression profiles for large numbers of genes. In addition, the ATAC method, which was conventionally limited to measuring the quantitative ratio of cDNA, is extended so that genomic DNA can be targeted.
【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ ＜110＞ UNITECH CO., Ltd. ＜120＞METHOD FOR COMPARATIVELY DETECTING QUANTITY
OF RNA AND DNA ＜130＞ M0046 ＜140＞ JP 2000-160324 ＜141＞ 2000-05-30 ＜160＞ 2 ＜210＞ 1 ＜211＞ 22 ＜212＞ RNA ＜213＞ HUMAN ＜400＞ 1 GATCAAAAAA AAAAAAAAAA AA 22 ＜210＞ 2 ＜211＞ 18 ＜212＞ RNA ＜213＞ HUMAN ＜400＞ 2 TTTTTTTTTT TTTTTTTT 18[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> UNITECH CO., Ltd. <120> METHOD FOR COMPARATIVELY DETECTING QUANTITY
OF RNA AND DNA <130> M0046 <140> JP 2000-160324 <141> 2000-05-30 <160> 2 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> HUMAN <400> 1 GATCAAAAAA AAAAAAAAAA AA 22 <210> 2 <211> 18 <212> RNA <213> HUMAN <400> 2 TTTTTTTTTT TTTTTTTT 18
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】本発明におけるアダプター付加ｃＤＮＡの形態
を示す。FIG. 1 shows the form of an adapter-added cDNA according to the present invention.
Claims (9)
逆転写させて得たｃＤＮＡを同一の制限酵素を用いてそ
れぞれ断片化し、（ｂ）前記（ａ）により得られた同一
または異なる組織由来のｃＤＮＡ断片ごとに、それぞれ
種類の異なるアダプターおよび各組織間で共通なアダプ
ターを付加し、（ｃ）前記（ｂ）により得られたアダプ
ター付加ｃＤＮＡを混合し、（ｄ）前記種類の異なるア
ダプターと共通の配列をもつアダプタープライマー及び
遺伝子特異的プライマーを用いて、前記（ｂ）のアダプ
ター付加ｃＤＮＡのうち、アダプター付加前にｍＲＮＡ
のポリアデニル酸由来の領域を含んでいなかった前記ア
ダプター付加ｃＤＮＡを増幅し、（ｅ）多組織間のｃＤ
ＮＡの量比を測定し、（ｆ）測定結果からＲＮＡを検出
することを特徴とするＲＮＡ量の比較検出方法。1. (a) cDNA obtained by reverse transcription from two or more tissue RNAs is fragmented using the same restriction enzyme, and (b) the same or different tissues obtained by the above (a) are fragmented. (C) mixing the adapter-added cDNA obtained in (b) above, adding an adapter of a different type to each derived cDNA fragment and an adapter common to each tissue, and (d) mixing the adapters of the different types Using the adapter primer and the gene-specific primer having a sequence common to
The adapter-added cDNA which did not contain the region derived from polyadenylic acid was amplified, and
(F) detecting the RNA from the measurement result, and measuring the amount ratio of NA;
ダプターが、ポリアデニル酸テイル様の配列であること
を特徴とする請求項１記載のＲＮＡ量の比較検出方法。2. The method according to claim 1, wherein in (b), the adapter common to each tissue is a polyadenylate tail-like sequence.
ダプターが、その末端を化学的に修飾したものであり、
これを用いてアダプター付加ｃＤＮＡを選別する工程を
含むことを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ量の比較検
出方法。(3) In the above (b), the adapter common to each tissue has its terminal chemically modified,
2. The method for comparatively detecting the amount of RNA according to claim 1, further comprising a step of selecting an adapter-added cDNA using this.
ー付加ｃＤＮＡをＰＣＲ用の増幅器に固定して行うこと
を特徴とする請求項１記載のＲＮＡ量の比較検出方法。4. The method according to claim 1, wherein the amplification in (d) is carried out by fixing the adapter-added cDNA to a PCR amplifier.
ＤＮＡ断片ごとに、それぞれ種類の異なるアダプターお
よび各個体間で共通なアダプターを付加し、（ｈ）前記
（ｇ）により得られたアダプター付加ゲノムＤＮＡを混
合し、（ｉ）種類の異なるアダプターと共通の配列をも
つアダプタープライマー及び配列特異的プライマーを用
いて、前記アダプター付加ゲノムＤＮＡを増幅し、
（ｊ）個体間のゲノムＤＮＡの増幅量比を測定すること
を特徴とするＤＮＡ量の比較検出方法。(G) adding an adapter of a different type and an adapter common to each individual for each genomic DNA fragment derived from the same or different individual, and (h) adding the adapter obtained by the above (g). Mixing the genomic DNA and (i) amplifying the adapter-added genomic DNA using an adapter primer having a common sequence with a different adapter and a sequence-specific primer,
(J) A method for comparatively detecting the amount of DNA, comprising measuring the ratio of the amount of amplification of genomic DNA between individuals.
ダプターが、ポリアデニル酸テイル様の配列であること
を特徴とする請求項５記載のＤＮＡ量の比較検出方法。6. The method according to claim 5, wherein in (g), the adapter common to each individual is a polyadenylate tail-like sequence.
ダプターが、その末端を化学的に修飾したものであり、
これを用いて前記アダプター付加ゲノムＤＮＡを選別す
る工程を含む請求項５記載のＤＮＡ量の比較検出方法。(7) In the above (g), an adapter common to each individual has its terminal chemically modified,
The method according to claim 5, further comprising a step of selecting the genomic DNA with the adapter using the DNA.
ー付加ゲノムＤＮＡをＰＣＲの増幅器に固定して行うこ
とを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ量の比較検出方
法。8. The method according to claim 5, wherein the amplification in (i) is performed by fixing the adapter-added genomic DNA to a PCR amplifier.
が、ＳＮＰ（SingleNucleotide Polymorphism）を含む
配列領域において設計されており、その塩基の置換をア
ダプター付加ゲノムＤＮＡの増幅量の差異により検出す
ることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ量の比較検出
方法。9. The method according to claim 1, wherein the sequence-specific primer in (i) is designed in a sequence region containing SNP (Single Nucleotide Polymorphism), and the substitution of the base is detected by a difference in the amplification amount of the genomic DNA with an adapter. The method for comparatively detecting the amount of DNA according to claim 5, characterized in that:
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP6997773B2 (en) | 2016-09-15 | 2022-01-18 | アーチャーディーエックス， エルエルシー | Method for preparing nucleic acid sample for analysis of cell-free DNA |
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-
2000
- 2000-05-30 JP JP2000160324A patent/JP2001333800A/en not_active Withdrawn
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| JP6997773B2 (en) | 2016-09-15 | 2022-01-18 | アーチャーディーエックス， エルエルシー | Method for preparing nucleic acid sample for analysis of cell-free DNA |
| JP6997772B2 (en) | 2016-09-15 | 2022-01-18 | アーチャーディーエックス， エルエルシー | Nucleic acid sample preparation method |
| US11390905B2 (en) | 2016-09-15 | 2022-07-19 | Archerdx, Llc | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of DNA |
| US11795492B2 (en) | 2016-09-15 | 2023-10-24 | ArcherDX, LLC. | Methods of nucleic acid sample preparation |
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