JP2001292800A - アポトーシス調節物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞死受容体の活性化によるアポトーシスに
おけるｒＲＮＡの役割を解明すること。 【解決手段】 ２８ＳｒＲＮＡの切断を検出することを
含む、アポトーシス調節物質のスクリーニング方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アポトーシス調節
物質のスクリーニング方法、より詳細には２８ＳｒＲＮ
Ａの特定の部位における切断を検出することを含む、ア
ポトーシス調節物質のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞死受容体(death receptors)は、細
胞外刺激物質が引き金となる細胞死を直接媒介する膜通
過タンパク質の一グループである（Ashkenazi, A. et a
l. (1998) Science 281, 1305-1308）。Ｆａｓ（ＣＤ９
５）、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１、ＣＤ１２０
ａ）、およびｐ７５ニューロトロフィン(neurotrophin)
受容体は細胞死受容体である。これらの受容体は、細胞
死ドメイン(death domain)と呼ばれる相同な細胞質配列
と、非常に類似したシステインに富む細胞外領域とを有
する。

【０００３】最近、細胞死受容体の下流にあり、細胞固
有のアポトーシス機構の引き金となるシグナル伝達分子
(signal transducing molecules)が研究されている。Ｆ
ａｓを含む２つのシグナル経路、すなわちミトコンドリ
ア依存性経路およびミトコンドリア非依存性経路が報告
されている（Scaffidi, C. et al. (1998) EMBO J. 17,
1675-1687; Los, M. et al. (1999) Immunity 10, 629
-639）。これらの経路では何れも、カスパーゼ(caspas
e)−３などの下流プロテアーゼが活性化されて、アポト
ーシスが開始する。これら２つの経路の活性は細胞の種
類や組織で異なる。細胞内環境によるが、ＴＮＦＲ１受
容体の活性化によってアポトーシス、壊死様細胞死また
は炎症後(pro-inflammatory)反応が起こる可能性がある
ので、ＴＮＦＲ１より下流の経路は、Ｆａｓより下流の
経路よりも複雑と考えられている。また、細胞死受容体
に関係するＦＡＰ−１は、細胞死シグナル伝達を調節し
（Sato, T. et al. (1995) Science 268, 411-415; Iri
e, S. et al. (1999) FEBSLett. 460, 191-198）、ＦＡ
ＤＤは壊死様の組織化された細胞死を開始することがで
きる（Kawahara, A. et al. (1998) J. Cell Biol. 14
3, 1353-1360）。細胞死受容体によるアポトーシスは発
生、恒常性、疾病および癌において重要な役割を演じる
ので、細胞死受容体による細胞死を分子レベルで分析す
ることによって、これらの現象が解明されつつある（Va
ux, D. L. et al. (1999) Cell 96,245-254; Thompson,
C. B. (1995) Science 267, 1456-1462; Williams, G.
T.(1991) Cell 65, 1097-1098）。

【０００４】細胞は、アポトーシス(apotosis)による損
傷後、ある特別な時点で、アポトーシスから回復するこ
とが不可能な時点に到達する（Samejima, K. et al. (1
998)J. Cell Biol. 143, 225-239）。この時点を通過す
ると、アポトーシスは実行期(execution phase)と呼ば
れる期間に入る。実行期の特徴の一つは、細胞成分が不
可逆的に分解され、その間に、カスパーゼ−３活性化デ
オキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）がゲノムＤＮＡを消
化し（Enari, M. et al. (1998) Nature 391, 43-5
0）、カスパーゼ−６が核細胞骨格ラミンを消化する（N
icholson, D. W.et al. (1997) Trends Biochem. Sci.
22, 299-306）。これらが原因となって、アポトーシス
の特徴である核内の最終的な形態学的変化が生じる。さ
らに、カスパーゼ−３はある種のシグナルタンパク質を
消化する（Nicholson, D. W. et al. (1997) Trends Bi
ochem. Sci. 22, 299-306）。このような不可逆的分解
は細胞死を加速する。従って、アポトーシスの全体像を
完全に解明するためには、実行期の開始時点の事象を詳
しく解明することが重要である。

【０００５】タンパク合成は細胞生存能力の一つの特徴
である。アクチノマイシン−Ｄなどの薬物によるタンパ
ク合成阻害は、ある種の細胞においてアポトーシスを引
き起こす（Wertz, I. E. et al. (1996) Trends Bioche
m. Sci. 21, 359-364）。リボソームはタンパク合成に
必須の大型のタンパク質−ＲＮＡ複合体である。ヒトに
おいて、リボソーム（８０Ｓ）は、４６個のタンパク質
と２８Ｓ、５．８Ｓおよび５ＳのＲＮＡ種を含む大サブ
ユニットと、３３個のタンパク質および１８ＳのＲＮＡ
を含む小サブユニットからなる（Wool, I. G. et al.
(1995) Biochem.Cell Biol. 73, 933-947）。de novoタ
ンパク合成におけるリボソーム調節は多くの研究の焦点
であったが、アポトーシスにおけるその役割を検討する
研究は報告されていない。超微細構造分析によって、あ
る組織のアポトーシスの間に、リボソームが粗面小胞体
から解離することが示された（Pilar, G. et al. (197
6)J. Cell Biol. 68, 339-356; Clarke, P. G. H. (199
0) Anat. Embryol. 181, 195-213）。このような形態学
的研究の結果から、本発明者らはアポトーシスにおける
リボソームの分子解析を行うことにした。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】リボソームＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）はタンパク合成に必須の成分であるので（Wils
on, K. S. et al. (1998) Cell 92, 337-349）、本発明
者らは、細胞死受容体の活性化によるアポトーシスにお
けるｒＲＮＡの役割を検討した。即ち、本発明は、細胞
死受容体の活性化によるアポトーシスにおけるｒＲＮＡ
の役割を解明することを解決すべき課題の一つとした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ｃＡＭＰアナログによっ
て誘導されるアポトーシスは、ｒＲＮＡの分解を特徴と
する（Houge, G. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15,
2051-2062）。ｃＡＭＰアナログなどのいくつかの小さ
な薬物はアポトーシスを強力に誘発するが、それら薬物
の効果が多面的に発現することから、薬物の副作用で刺
激される異常な副次的な経路から生理学的死経路を分離
する試みは困難となる可能性がある。ｒＲＮＡにおける
変化の分子メカニズムおよび生物学的重要性はこれまで
検討されていない。本発明者らは、ジャーカット細胞系
およびＵ９３７細胞系において、２８ＳのｒＲＮＡが同
一の（または非常に類似した）リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）によって選択的に分解されることを実証した。
さらに、本発明者らは、ｒＲＮＡ分解とタンパク合成と
の関係を研究することによって、タンパク合成機構の機
能不全にｒＲＮＡ分解が関与する可能性があることを示
した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したもので
ある。

【０００８】即ち、本発明によれば、２８ＳｒＲＮＡの
切断を検出することを含む、アポトーシス調節物質のス
クリーニング方法が提供される。本発明によれば、好ま
しくは、２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド３２５１から３
７１０の間における切断を検出することを含む、アポト
ーシス調節物質のスクリーニング方法、さらに好ましく
は、２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド３５２９から３５４
２の間における切断を検出することを含む、アポトーシ
ス調節物質のスクリーニング方法が提供される。

【０００９】切断部位の一例は具体的には、２８ＳｒＲ
ＮＡのヌクレオチド３５３５と３５３６の間である。本
発明のアポトーシス調節物質のスクリーニング方法で
は、好ましくは、切断部位での切断を検出できるように
修飾されている２８ＳｒＲＮＡを使用する。

【００１０】本発明の別の側面によれば、切断部位での
切断を検出できるように修飾されている、修飾２８Ｓｒ
ＲＮＡが提供される。好ましくは、本発明の修飾２８Ｓ
ｒＲＮＡは、２８ＳｒＲＮＡが切断部位で切断された場
合に検出できる標識で標識されている。

【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、タンパ
ク質合成を阻害してアポトーシスを誘導できる、２８Ｓ
ｒＲＮＡのヌクレオチド１−３５３５の断片又はヌクレ
オチド３５３６−５０２５の断片の何れか片方又は両方
の部分断片が提供される。

【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、２８Ｓ
ｒＲＮＡのヌクレオチド１−３５３５の断片又はヌクレ
オチド３５３６−５０２５の断片の何れか片方又は両方
をアポトーシス誘導のために使用する方法が提供され
る。

【００１３】本発明のさらに別の側面によれば、切断部
位での切断を検出できるように修飾されている修飾２８
ＳｒＲＮＡ、又は２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド１−３
５３５の断片又はヌクレオチド３５３６−５０２５の断
片の何れか片方又は両方の部分断片を、２８ＳｒＲＮＡ
のヌクレオチド３２５１から３７１０の間における切断
を検出することを含むアポトーシス調節物質のスクリー
ニング方法において使用する方法が提供される。

【００１４】本発明のさらに別の側面によれば、２８Ｓ
ｒＲＮＡのヌクレオチド３２５１から３７１０の間にお
ける切断を検出することを含む、アポトーシス調節物質
のスクリーニング方法により得ることができる、アポト
ーシス調節物質が提供される。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明のアポトーシス調
節物質のスクリーニング方法は、２８ＳｒＲＮＡのヌク
レオチド３２５１から３７１０の間における切断を検出
することを特徴とする。アポトーシス調節物質とは、ア
ポトーシスを誘導する物質でもアポトーシスを阻害する
物質でも何れでもよい。

【００１６】アポトーシスは古典的細胞死である壊死
（ネクローシス、necrosis）とは形態学的に異なる細胞
死として最初に発見され定義され、その後の研究からア
ポトーシスの誘導および抑制は遺伝子によって支配され
るいわゆるプログラムされた細胞死であることが判って
きた。アポトーシスでは細胞の活性化に伴い、複雑な生
化学反応が起こり、種々のタンパク質やDNAの分解酵素
が産生され、これが自身の細胞に作用して細胞死がもた
らされる。アポトーシスは正常な発生・分化に不可欠な
生理的細胞死であり、正常な生体組織のホメオスタシス
に大変重要である。

【００１７】そのため、アポトーシスが過剰に抑制され
ると多くの機能障害の原因になることが判明している。
例えば、アポトーシスの減少に起因する疾患としては悪
性腫瘍（癌）、白血病、自己免疫性疾患、ウイルス感染
疾患（ＨＩＶ感染など）、増殖性皮膚疾患、慢性関節リ
ウマチ、自己免疫疾患、肝炎、腎疾患等を挙げることが
できる。従って、アポトーシスを誘導する物質は、これ
らのアポトーシスの減少に起因する疾患の治療及び／又
は予防剤として使用できる可能性がある。

【００１８】また、アポトーシスが過剰に促進された場
合にも多くの機能障害の原因になることが判明してい
る。例えば、アポトーシスの増大に起因する疾患として
は、ウイルス疾患（例、エイズ、劇症肝炎など）、神経
変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋
萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、脊
髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患
（例、心筋梗塞、脳卒中など）、肝疾患（例、アルコー
ル性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、関節疾患（例、
変形性関節症など）、アテローム動脈硬化症等が挙げら
れる。従って、アポトーシスを阻害する物質は、これら
のアポトーシスの増大に起因する疾患の治療及び／又は
予防剤として使用できる可能性がある。

【００１９】本発明のスクリーニング方法では、２８Ｓ
ｒＲＮＡのヌクレオチド３２５１から３７１０の間にお
ける切断を検出する。２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド３
２５１から３７１０の間における切断は、例えば、アポ
トーシスを評価するのに適当な細胞系に被験物質（アポ
トーシス調節物質の候補物質）を投与して、該細胞系に
おける２８ＳｒＲＮＡの動態を分析することにより検出
できる。アポトーシスを評価するのに適当な細胞系とし
ては、以下の実施例に記載するような、抗Ｆａｓ抗体Ｃ
Ｈ−１１で処理し、Ｆａｓを活性化したヒトＴ細胞白血
病細胞株ジャーカット（Ｆａｓ−ジャーカット系）、お
よびＴＮＦ−αで処理し、ＴＮＦＲ１を活性化したヒト
単芽球白血病細胞株Ｕ９３７（ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系）
などが挙げられる。

【００２０】これらの培養細胞系に投与する被験物質と
しては、アポトーシス調節物質の候補物質であればその
種類は特に限定されない。スクリーニングの被験物質と
しては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、
微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、
又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらの
ライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合
成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリー
など）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライ
ブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングの被
験物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる
単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補と
なる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）につ
いて試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合
物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画
を重ねて、最終的にアポトーシスを調節する物質を単離
することも可能である。

【００２１】これらの被験物質に含まれる物質はアポト
ーシスを調節することが予想される物質であり、さらに
好ましくは、２８ＳｒＲＮＡを切断することによってア
ポトーシスを調節する物質である。

【００２２】被験物質が２８ＳｒＲＮＡを切断するかど
うかは、例えば、被験物質を細胞アッセイ系に投与した
後の一定時間経過後に、細胞アッセイ系から全ＲＮＡを
回収し、ポリアクリルアミド−アガロースゲル電気泳動
などで分析することにより２８ＳｒＲＮＡの切断を検出
することができる。あるいは、細胞アッセイ系から細胞
質ポリソーム分画を回収した後に、この分画から回収さ
れたＲＮＡをポリアクリルアミド−アガロースゲル電気
泳動などで分析してもよい。

【００２３】２８ＳｒＲＮＡが切断されているかどうか
は、２８ＳｒＲＮＡ由来のプローブ又は１８ＳｒＲＮＡ
由来のプローブを用いてノザンハイブリダイゼーション
を行うことにより確認することができる。さらに切断部
位を詳細に分析するためには、２８ＳｒＲＮＡの種々の
部分配列のオリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザ
ンブロット分析を実施すればよい。

【００２４】本発明のスクリーニング方法の好ましい態
様では、特定の切断部位での切断を検出できるように修
飾されている２８ＳｒＲＮＡを使用する。このような修
飾された２８ＳｒＲＮＡとしては、２８ＳｒＲＮＡが切
断部位で切断された場合に検出できる標識で標識されて
いるものが挙げられる。具体的には、切断部位付近に酵
素又は蛍光物質など直接又は間接的に検出可能な物質を
標識しておき、２８ＳｒＲＮＡが切断部位で切断された
場合にのみ該標識が検出可能となるように修飾すること
が挙げられる。

【００２５】さらに本発明によれば、２８ＳｒＲＮＡの
ヌクレオチド１−３５３５の断片又はヌクレオチド３５
３６−５０２５の断片の何れか片方又は両方の部分断片
が提供される。このような２８ＳｒＲＮＡの部分断片
は、タンパク質合成を阻害することによりアポトーシス
を誘導できるので、アポトーシス誘導物質として有用で
ある。以下の実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明は以下の実施例によって限定されることはな
い。

【００２６】

【実施例】（Ａ）実験験方法 （１）細胞株および培養 ヒトＴ細胞白血病細胞株であるジャーカット細胞株（AT
CC, 米国メリーランド州ロックビル）およびヒト単芽球
白血病細胞株Ｕ９３７（DE-4; RIKEN Cell Bank, 茨城
県つくば市）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Sanko
Junyaku, 東京）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲ
ＰＭＩ１６４０（Sigma, 米国ミズーリ州セントルイ
ス）中に維持し、二酸化炭素５％の雰囲気下、３７℃で
培養した。

【００２７】（２）細胞死受容体活性化によるアポトー
シス Ｆａｓ−ジャーカット系において、ジャーカット細胞を
血清を含まないＲＰＭＩ１６４０で一度洗浄し、同じ培
地中に再懸濁した。アポトーシスを誘発するために、マ
ウスモノクローナル抗Ｆａｓ抗体（CH-11; MBL, 名古
屋）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加え、細胞
を様々な時間インキュベートした。対照の細胞は、ＣＨ
−１１を加えない以外は同一の条件下でインキュベート
した。他の対照として、細胞を１００ｎｇ／ｍｌの無関
係のマウスＩｇＭ（No. 02-6800; Zymed, 米国カリフォ
ルニア州サンフランシスコ）と共にインキュベートし
た。

【００２８】ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系において、Ｕ９３７
細胞を血清を含まないＲＰＭＩ１６４０で一度洗浄し、
同じ培地中に再度懸濁した。アポトーシスを誘発するた
めに、組換えヒトＴＮＦ−α（R&D Systems, 米国ミネ
ソタ州ミネアポリス）を３０ｎｇ／ｍｌの濃度になるよ
うに加え、細胞を様々な時間インキュベートした。対照
の細胞は、ＴＮＦ−αを加えない以外は同一の条件下で
インキュベートした。

【００２９】アポトーシスに対するカスパーゼ−３の阻
害効果を調べるために、５０μＭの細胞透過性形態のＺ
−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−３阻害剤ＩＩ；Calb
iochem, 米国カリフォルニア州ラホヤ）を含む血清を含
まないＲＰＭＩ１６４０中、細胞を３７℃で１．５時間
インキュベートした。このＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫは、ジ
メチルスルホキシドに溶解して５０ｍＭの保存溶液を調
製したものを使用した。次いで、ＣＨ−１１またはＴＮ
Ｆ−αを細胞培養液に添加した。対照細胞は、同容量の
ジメチルスルホキシドで処理した。アポトーシスは光学
顕微鏡での形態学的観察およびＤＮＡ断片化アッセイ
（以下参照）によって評価した。

【００３０】（３）ＤＮＡ断片化アッセイ 断片化したＤＮＡをＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝液
（Toyoshima, F. et al. (1997) J. Cell Biol. 139, 1
005-1015）で抽出し、１．４％アガロースゲル電気泳動
に付し、臭化エチジウム染色を行った。

【００３１】（４）ＲＮＡ断片化アッセイおよびノーザ
ンブロット Ｔｒｉｚｏｌ試薬（GibcoBRL, 米国メリーランド州ロッ
クビル）を用いて、全ＲＮＡを細胞から単離した。溶液
の濃度は、２６０ｎｍの吸光度を測定することによって
求めた。ポリアクリルアミド（２．５％）−アガロース
（０．５％）複合ゲル電気泳動は、Ｐｅａｃｏｃｋおよ
びＤｉｎｇｍａｎの方法（Peacock, A. C. et al. (196
8) Biochemistry 7, 668-674）を改変して行った。蒸留
水（１３ｍｌ）を７５ｍｇの電気泳動用のアガロース
（Iwai Chemicals, 東京）に加えた。アガロースの融解
後、ゲル溶液を約４０℃に冷却した。次に、以下の溶液
をゲル溶液に加えて、よく混合した：０．８Ｍトリス／
０．４９Ｍ酢酸／２０ｍＭ ＥＤＴＡ（２０Ｘ ＴＡＥ
緩衝液）０．７５ｍｌ、２９％アクリルアミド／１％
Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド１．２５ｍ
ｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミ
ン２０μｌ、および１０％過硫酸アンモニウム５０μ
ｌ。その後、混合物をゲル型（厚さ１．０ｍｍ、幅８７
ｍｍ、長さ７７ｍｍ）に注ぎ、型の頂部にコームを挿入
した後、室温で３０分間保持してポリアクリルアミドゲ
ルを重合した。次に、アガロースを固化させ、複合ゲル
を冷却するために、４℃で１時間保持した。ＲＮＡ試料
（１レーン当たりＲＮＡ２．５μｇ）を同容量の９０容
量％ホルムアミド／１０容量％グリセリンと混合し、６
５℃で３分間インキュベートし、室温で５分間放冷し、
その後ゲル上に載せた。ゲルは、予め氷上で冷却した１
Ｘ ＴＡＥ緩衝液中、２００Ｖで３０〜４０分泳動し、
その後臭化エチジウムで染色した。

【００３２】複合ゲル電気泳動の後、ノーザンブロット
のために、ＲＮＡを、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ
Ｃｅｌｌ（BioRad, 米国カリフォルニア州ハーキュリー
ズ）を用い、０．１９Ｍグリシンを含む２５ｍＭトリス
中、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham, 英国Buchingham
shire州Little Chalfont）上に０．３Ａで１時間電気ブ
ロットし、ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Stratage
ne, 米国カリフォルニア州ラホヤ）を用いて固定した。
オリゴデオキシリボ核酸プローブをＥＳＰＥＣ−ＯＬＩ
ＧＯサービス（株）（茨城県つくば市）で合成し、［γ
−³²Ｐ］ＡＴＰ（Amersham）およびＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Takara, 滋賀県大津市）を用いて末端を標
識した。ブロットは、ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼ
ーション溶液（Stratagene）中で１５分間プレハイブリ
ダイゼーションし、［³²Ｐ］で標識したオリゴヌクレオ
チドプローブで１時間ハイブリダイゼーションした。ブ
ロットを０．１％ＳＤＳ／２×ＳＳＣ、その後０．１％
ＳＤＳ／０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化
ナトリウムを含む１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で洗浄
し、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴフィルムを用いてオート
ラジオグラフィーに付した。

【００３３】（５）５’ｃＤＮＡ末端の急速増幅（５’
ＲＡＣＥ） アガロースゲル電気泳動と、フェノールを用いる「破砕
浸漬」("crush-and-soak")法とを組み合わせることによ
って、アポトーシスＲＮＡ断片を単離した。５‘ＲＡＣ
Ｅは、５’ＲＡＣＥ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（GibcoB
RL）を使用し、製造元の取扱説明書に従って実施した。
ヒト２８ＳｒＲＮＡ配列（Gonzalez, I.L. et al. (198
5) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7666-7670）を認
識する以下のリバースプライマーを用いた：第一鎖ｃＤ
ＮＡ合成用 ５’−ＧＣＴＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣ
−３’（配列番号１）（ヌクレオチド３８７３−３８８
８のアンチセンス）、およびそれに続くポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）用 ５’−ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡ
ＡＴＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号２）（ヌクレオチド
３６５５−３６７４のアンチセンス）。生成物をアガロ
ースゲル電気泳動によって分析した。ＱＩＡＱｕｉｃｋ
ゲル抽出キット（QLAGEN, 独国Hilden）を用いて増幅し
たｃＤＮＡをゲルから単離し、ＰＣＲ用リバースプライ
マーおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（PE Biosyst
ems, 米国カリフォルニア州Foster City）を用いて直接
配列決定した。配列結果の確認のため、アポトーシスジ
ャーカット細胞由来のｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩ ＫＳ（Stratagene）中にサブクローニングし、
Ｍ１３ユニバーサルプライマーで配列決定した。

【００３４】（６）ポリソームの回収 ポリソームの分解を避けるために、細胞（２×１０
⁸個）を採取の前に、シクロヘキシミド（５μｇ／ｍ
ｌ；Sigma）の存在下、１０分間培養した（Sabatini,D.
D. (1998) Cells: A Laboratory Manual. Vol. 1, pp.
37.1-37.22, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York）。採取した細胞をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％デオキ
シコール酸ナトリウム、０．２５Ｍスクロース、２５ｍ
Ｍ塩化カリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０μｇ／
ｍｌシクロヘキシミド、１０ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールおよび１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを
含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２．５ｍｌで氷上１５分間溶解し、１５，０００×ｇで
１０分間遠心分離して、ポストミトコンドリア(post-mi
tochondrial)分画（上清）を回収した。遠心管（No.349
622; Beckman, 米国カリフォルニア州パロアルト）に、
２．０Ｍスクロース溶液（溶媒、２５ｍＭ塩化カリウ
ム、５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５））０．７５ｍｌおよび０．５Ｍスクロー
ス溶液０．６３ｍｌを入れた。ポストミトコンドリア上
清（遠心管１本当たり０．９ｍｌ）を頂部に加え、１０
５，０００×ｇ、２℃で３時間遠心した。ポリソームは
得られたペレットの９０％以上を占める（Wettstein,
F. O. et al. (1963) Nature 197, 430-435）。２５ｍ
Ｍ塩化カリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭの
２−メルカプトエタノール、および１．６ユニット／μ
ｌのＲＮａｓｉｎ（Promega,米国ウィスコンシン州マデ
ィソン）を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を用いて、ペレットからポリソームを採取した。

【００３５】（７）タンパク質合成の標識化 細胞をメチオニンを欠き血清を含まないＲＰＭＩ１６４
０（Sigma）中に加え、１１０μＣｉ／ｍｌのＬ−［³⁵
Ｓ］−メチオニン（EASYTAG; New England Nuclear, Bo
ston, MA）で２０分間パルスラベルした。その後、細胞
をＰＢＳで３回洗浄し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１
ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で氷上１０分間溶
解し、１５，０００×ｇで５分間遠心分離した。上澄
を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびオートラジ
オグラフィーに付した。オートラジオグラムは、イメー
ジアナライザー（Model ES-8000; Epson, Tokyo, Japa
n）を用いて走査し、バンドの強度はＮＩＨイメージソ
フトウェア（National Institute of Health, Bethesd
a, MD）で評価した。

【００３６】（Ｂ）結果 （１）細胞死受容体の刺激によって細胞質ポリソーム中
のｒＲＮＡが分解する 本実験では以下の２つのアポトーシス系を選択した：抗
Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１で処理し、Ｆａｓを活性化したヒ
トＴ細胞白血病細胞株ジャーカット（Ｆａｓ−ジャーカ
ット系）、およびＴＮＦ−αで処理し、ＴＮＦＲ１を活
性化したヒト単芽球白血病細胞株Ｕ９３７（ＴＮＦＲ−
Ｕ９３７系）。ＦａｓおよびＴＮＦＲ１はこれらの受容
体が欠如したマウスにおいて白血球の発生および機能に
重要であることが示されているので、白血病型細胞株を
含むこれらの系は、合理的であると考えられる（Los,
M. et al. (1999) Immunity 10, 629-639; Yeh, W. C.
etal. (1999) Immunol. Rev. 169, 283-302）。

【００３７】これらのアポトーシス系におけるｒＲＮＡ
の変化を調べるために、Ｔｒｉｚｏｌを用いて全ＲＮＡ
を単離し、ポリアクリルアミド−アガロース複合ゲル電
気泳動で分析した。アポトーシス細胞において、未変化
のｒＲＮＡのバンド以外のバンドが現れた（図１Ａ、レ
ーン１および３）。対照試料ではＲＮＡの変化は検出さ
れず（図１Ａ、レーン２および４）、無関係のマウスＩ
ｇＭで処理したジャーカット細胞には追加のバンドはな
かった（図１Ａ、レーン６）。ここで示された電気泳動
パターンは、ｃＡＭＰアナログにより誘導されるアポト
ーシスの間のパターン（Houge, G. et al. (1995) Mol.
Cell. Biol. 15, 2051-2062）よりもはるかにシンプル
である。より小さなＲＮＡ分子を同定するため、アポト
ーシス試料および対照試料を１２％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分離したが、バンドパターンに差はなか
った（データは示さず）。

【００３８】リボソームは核小体で産生され、成熟形態
として核外に搬出される（Warner,J. R. (1990) Curr.
Opin. Cell Biol, 2, 521-527）。今回同定された余分
のＲＮＡ分子が細胞質リボソームで発生するかどうかを
調べるために、遠心分離によってアポトーシス性ジャー
カット細胞由来の細胞質ポリソーム分画を回収した。こ
の分画から回収されたＲＮＡを、複合ゲル電気泳動で分
析した。ポリソーム分画において、余分のバンドが観察
された（図１Ｂ）。これにより、この余分のＲＮＡ分子
がタンパク合成に関係するリボソーム由来であり、アポ
トーシス核における異常なＲＮＡ合成によるものではな
いことが示された。この余分なＲＮＡ種はポリソーム単
離によって濃縮されなかったので（図１Ｂのレーン１お
よび３を比較のこと）、ｒＲＮＡの変化はポリソームに
特異的ではなかった。

【００３９】（２）可変領域８の２８ＳｒＲＮＡの推定
切断部位は、Ｆａｓ−ジャーカット系およびＴＮＦＲ−
Ｕ９３７系で同一である：これら２つの系は異なる細胞
死受容体を刺激するが、余分のＲＮＡのパターンは非常
に類似している（図１Ａ）。特に、両システムは、１８
ＳｒＲＮＡより若干小さい一本の顕著なバンドを生じ
（図１Ａにおいて三角矢印で示す）、２つの細胞型から
得られたこのバンドが同様の移動度を有することから、
構造が同一であることが示唆される。そこでこのＲＮＡ
種の分子の同一性を調べた。複合ゲル電気泳動の後、ア
ポトーシス性および対照のジャーカット細胞由来のＲＮ
Ａをナイロン膜上にエレクトロブロットし、ブロットを
２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡのプローブでハイブリダイ
ゼーションした。この顕著なバンドは２８ＳｒＲＮＡプ
ローブでハイブリダイゼーションしたが（図２Ａ、左パ
ネル）、１８ＳｒＲＮＡのプローブでは余分なバンドは
検出されなかった（図２Ａ、右パネル）。この知見か
ら、このＲＮＡ種がＲＮａｓｅで分解した２８ＳｒＲＮ
Ａ由来であることが示唆された。

【００４０】切断部位を正確にマッピングするために、
２８ＳｒＲＮＡの種々の部分配列のオリゴヌクレオチド
プローブを用いてノーザンブロット分析を実施した。予
め同定した顕著なＲＮＡバンドは、２８ＳｒＲＮＡの
３’−末端領域からなり（表１）、推定上の開裂部位は
おそらくヌクレオチド３２５１および３７１０の間のい
ずれかであると思われた。次に、このＲＮＡ断片をアポ
トーシスを受けたジャーカット細胞およびＵ−９３７細
胞から単離し、５’ＲＡＣＥを用いて慎重に評価した。
増幅したｃＤＮＡ断片の分析によって、両系から同一の
移動度を有する一本のバンドが得られた（図２Ｂ）。バ
ンドが拡散しているのは、主に鋳型ｃＤＮＡのｄＣ−尾
部の長さが異なるためである。これらのｃＤＮＡ試料の
配列決定により、両系において、ＲＮＡ分子の５’−末
端がヌクレオチド３５３６であること、すなわち定義に
よって（Gorski, J. L. et al. (1987) J. Mol. Evol.
24,236-251; Wakeman, J. A. et al. (1989) Biochem.
J. 258, 49-56）、切断部位が可変領域８に位置するこ
と（図２Ｃ）が明らかになった。この結果から、これら
の系は異なる細胞死受容体を刺激するけれども、切断の
メカニズムは非常に類似しており、おそらく同一のＲＮ
ａｓｅによって行われることが示唆される。さらに、図
１中、星印で示した余分のＲＮＡ種は２８ＳｒＲＮＡの
５’末端領域であることも示唆される（図２Ａ中央のパ
ネルも参照のこと）。

【００４１】表１ ２８ＳｒＲＮＡ由来のプローブを用いたハイブリダイゼ
ーションの概要 プローブを化学的に合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよび［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで末端を標識した。抗Ｆ
ａｓ抗体で処理したジャーカット細胞から全ＲＮＡを単
離し、ポリアクリルアミド−アガロース複合ゲル中で電
気泳動し、標識したプローブを用いてノーザンブロット
法に付した。

【００４２】

【表１】

【００４３】プローブの配列はそれぞれ配列番号６から
１０に示す。ヒト２８ＳｒＲＮＡ（５０２５ヌクレオチ
ド）の構造は、Ｇｏｎｚａｌｅｚらの方法によって決定
した（Gonzalez, I.L. et al.(1985) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 82, 7666-7670）

【００４４】（３）Ｆａｓ−ジャーカット系とＴＮＦＲ
−Ｕ９３７系とのｒＲＮＡ分解のカスパーゼ−３様活性
に対する依存性の相違 カスパーゼはアポトーシス刺激によって特異的に活性化
されるプロテアーゼの一群である（Nicholson, D. W. e
t al. (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 299-306）。
アポトーシスの実行期(execution phase)には、エフェ
クターであるカスパーゼが活性化され、種々の基質が消
化されて細胞死が促進される。特に、カスパーゼ−３は
鍵となるエフェクターであり、細胞中の多数の成分の分
解に関係する。実行期がｒＲＮＡ分解をもたらすとする
と、カスパーゼ−３はｒＲＮＡ分解の上流にある可能性
がある。この可能性を検討するために、ジャーカット細
胞をカスパーゼ−３阻害剤および細胞透過性のＺ−ＤＥ
ＶＤ−ＦＭＫで前処理し、その後モノクローナル抗Ｆａ
ｓ抗体であるＣＨ−１１で処理した。細胞から回収した
ＲＮＡおよびＤＮＡを分析した。Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ
はゲノムＤＮＡの分解（ＤＮＡラダー形成(ladder form
ation)）を阻害したが、これはカスパーゼ−３活性化Ｃ
ＡＤによるものである（図３Ａ、下のパネル）。興味深
いことに、２８ＳｒＲＮＡの分解もカスパーゼ−３阻害
剤によって抑制された（図３Ａ、上のパネル）。これら
の結果から、Ｆａｓ−ジャーカット系において、カスパ
ーゼ−３またはカスパーゼ−３様プロテアーゼが２８Ｓ
ｒＲＮＡの分解に関係していることが示唆される。

【００４５】次に、ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系におけるｒＲ
ＮＡ分解とカスパーゼ−３との関係を調べた。この系で
は、カスパーゼ−３阻害剤はｒＲＮＡ分解に影響を及ぼ
さなかった（図３Ｂ、上のパネル）。この結果は、阻害
剤がこの細胞株で作用しなかったためではなかった。す
なわち、ジャーカット細胞と同様、Ｕ９３７細胞におい
ても、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫがＤＮＡラダー形成を抑制
した（図３Ｂ、下のパネル）。主要なＲＮＡ断片が同一
構造であることを考慮すれば、異なる経路、すなわちカ
スパーゼ−３依存性および非依存性経路がこれらの系に
おいて同一または非常に類似したＲＮａｓｅを活性化し
ている可能性が高く、結局これらの経路は２８ＳｒＲＮ
Ａの開裂に収斂する。

【００４６】（４）細胞死受容体による２８ＳｒＲＮＡ
の分解はタンパク合成阻害と同時進行した：次に、アポ
トーシスにおけるｒＲＮＡ分解の役割を調べた。ｒＲＮ
Ａの不可逆的な断片化が、リボソームの機能、すなわち
タンパク合成を阻害すると仮定した。この仮定を確かめ
るために、２８ＳｒＲＮＡ断片化およびタンパク合成の
動態を調べた。Ｆａｓ−ジャーカット系において、顕著
な２８ＳｒＲＮＡ由来の断片は徐々に強くなり、モノク
ローナル抗Ｆａｓ抗体であるＣＨ−１１の添加４時間後
から再現的に検出された（図４Ａ）。同じ系において、
タンパク合成はｒＲＮＡの断片化開始から減少し始めた
（図４Ｂ）。

【００４７】細胞死受容体の働きによる別のアポトーシ
ス系で、この一致が観察されるかどうかを調べるため
に、ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系において動態分析を行った。
受容体刺激の２時間後からＲＮＡ断片化が検出され始め
た（図５Ａ）。この細胞株は、低血清環境に特に感受性
が高いようであり、このストレスが、アポトーシス刺激
の非存在下でのタンパク合成の緩やかな減少を引き起こ
した（図５Ｂ、右パネル）。しかし、アポトーシスによ
って、さらに劇的なタンパク合成のシャットダウンが起
きた（図５Ｂ、左パネル）。また、ｒＲＮＡの断片化が
タンパク合成阻害と同時に起こった。２つの異なる系で
のこれらの結果から、ｒＲＮＡの断片化がアポトーシス
の早期の実行期の間に起こることが示唆された（断片化
は刺激の２、３時間後に起こった）。さらに、ｒＲＮＡ
断片化は、細胞においてアポトーシスに伴うタンパク合
成の阻害と関係していると思われる。

【００４８】（５）タンパク合成阻害のカスパーゼ−３
様活性への依存性は、アポトーシス中のタンパク合成阻
害へのｒＲＮＡ断片化の関与を支持した：ｒＲＮＡ分解
と蛋白合成阻害との密接で一時的な関係（図４および
５）から、ｒＲＮＡ分解が蛋白合成阻害に関与すること
が示唆される。この可能性を調べるために、カスパーゼ
−３阻害剤であるＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫのタンパク合成
に対する効果を２つのアポトーシス系で調べた。このカ
スパーゼ−３阻害剤は、ジャーカット細胞において、タ
ンパク合成阻害（図６Ａ）およびｒＲＮＡ分解（図３
Ａ）を抑制した。対照的に、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫは、
Ｕ９３７細胞ではタンパク合成を回復できず（図６
Ｂ）、ｒＲＮＡ分解はカスパーゼ−３非依存性であった
（図３Ｂ）。従って、ｒＲＮＡの分解は、本実験で用い
たアポトーシス系において、タンパク合成機構の機能不
全に関する生理学的に重要な細胞シグナルメディエータ
ーである可能性がある。

【００４９】（Ｃ）考察 リボソームの機能不全は、細胞および生物の死を引き起
こす。現在まで、リボソームに特異的に作用する種々の
低分子量化学物質が抗生物質として広く使用されてきた
（Porse, B. T. et al. (1999) Cell 97, 423-426）。
さらに、いくつかの天然の毒物もタンパクリボトキシン
(ribotoxins)である。例えば、リシンおよびα−サルシ
ン(sarcin)は、２８ＳｒＲＮＡの隣接ヌクレオチドにお
ける共有修飾を触媒し、インビトロおよびインビボでリ
ボソームの機能不全を起こす（Wool, I. G. et al. (19
92) Trends Biochem. Sci. 17, 266-269）。コリシンＥ
３は、細菌のリボソームの小サブユニットにおいて、１
６ＳｒＲＮＡ中の単一部位を特異的に切断し、リボソー
ムを不活化して宿主細菌を死滅させる（Bowman, C.M. e
t al. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 964-96
8）。本実施例により、正常細胞中では不活性状態であ
るが、２つの細胞死受容体のいずれかが引き金となるア
ポトーシス中に活性化されてポリソーム中の２８ＳｒＲ
ＮＡを切断する新規なＲＮａｓｅの存在が示唆される。

【００５０】推定される切断部位は、Ｆａｓ−ジャーカ
ット系およびＴＮＦＲ−Ｕ９３７系由来の２８ＳｒＲＮ
Ａにおいて同一であった（図２）。ｒＲＮＡの系統学的
研究によれば、切断部位は細菌中には存在しない可変領
域８中に存在する。この知見は、アミノアシル−ｔＲＮ
Ａの結合およびＧＴＰ加水分解に関与する定常領域（図
２Ｃ）において、α−サルシンおよびリシンがα−サル
シン／リシンループを攻撃するという知見と対照的であ
る（Wool, I. G. et al. (1992) Trends Biochem. Sci.
17, 266-269）。可変領域の機能は、現在は不明であ
る。可変領域８は、脊椎動物では維持され、独特のダブ
ルループ構造を含む（Wakeman, J. A. etal. (1989) Bi
ochem. J. 258, 49-56）。アポトーシスに付随する切断
は、ｒＲＮＡおよびリボソームの高次構造における変化
を引き起こす可能性がある。酵母リボソームの３次元構
造は最近報告された（Verschoor, A. et al. (1998) Nu
cleic Acids Res. 26, 655-661）。今後、真核生物リボ
ソームを構造分析することによって、可変領域の機能に
ついて見通しが立つであろう。

【００５１】完全な２８ＳｒＲＮＡおよび主要なＲＮＡ
断片のバンドの強度を比較した結果から（図１Ｂ）、ポ
リソーム中の多くのリボソームは完全であると考えられ
る。いくつかのリボソームで破壊的消化が起こったとし
ても、そのようにわずかなリボソームの分解が、細胞レ
ベルのタンパク合成阻害の原因になるとは考えにくい。
この矛盾は、タンパクリボトキシンの研究において、２
０年以上も前に報告されている。リシン（Fodstad, O.
et al. (1977) Eur. J. Biochem. 74, 209-215）および
コリシンＥ３（Senior, B. W. et al. (1970) J. Mol.
Biol. 53, 205-220）などのリボトキシンで処理した細
胞において、タンパク合成は一部のリボソームの機能が
不活化されたときに停止した。相互に排他的でない２つ
のメカニズムが提案されている。第１のメカニズムでは
損傷したリボソームがポリソームにおける優性阻害因子
である。この状況では、ポリソーム１個当たり、損傷し
たｒＲＮＡを有するリボソームが１個もしくは２、３個
発生し、ｍＲＮＡに付着し、ペプチド鎖のさらなる伸長
を阻害する。この阻害は特に、大量に構成的に合成さ
れ、細胞の生存に重要であるハウスキーピングタンパク
質の合成を阻害すると考えられる。提案された第二のメ
カニズムでは、ｒＲＮＡの切断がタンパク合成阻害のシ
グナルを生成する。ｒＲＮＡのリシンおよびα−サルシ
ン誘導性の修飾がストレス活性化プロテインキナーゼを
活性化する（Iordanov, M. S. et al. (1997) Mol. Cel
l. Biol. 17, 3373-3381）。従って、この経路は本発明
で用いた系におけるｒＲＮＡ分解の下流で活性化される
可能性がある。ストレス活性化プロテインキナーゼの経
路とタンパク合成阻害との間の関係がごく最近報告され
た（Iordanov, M. S. et al. (2000) Mol. Cell. Biol.
20, 617-627）。

【００５２】ｒＲＮＡ分解によって活性化されるシグナ
ル分子のもう一つの候補は、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテ
インキナーゼ（ＰＫＲ）である。二本鎖ＲＮＡによって
活性化されて、ＰＫＲは自己リン酸化し、真核性翻訳開
始因子−２をリン酸化し、最終的にはタンパク合成を阻
害する（Proud, C. G. (1995) Trends Biochem. Sci.2
0, 241-246）。ＰＫＲは、リボソームタンパク質Ｌ１８
を通じて大サブユニットと会合するリボソーム結合タン
パクである（Kumar, K. U. et al. (1999) Mol. Cell.
Biol. 19, 1116-1125）。ｒＲＮＡは二本鎖ＲＮＡの多
数のループを含む複雑な二次構造を有する（Gorski, J.
L. et al. (1987) J. Mol. Evol. 24,236-251）。２８
ＳｒＲＮＡの切断は、大サブユニットのそのような構造
の一部を露出させ、それによってＰＫＲを刺激する。Ｐ
ＫＲはＴＮＦ−αで処理したＵ９３７細胞において活性
化される（Yeung, M. C. et al. (1996) Proc, Natl. A
cad. Sci. USA 93, 12451-12455）。本発明で用いた培
養細胞系は、見かけ上の矛盾を解決する一助となる可能
性がある。

【００５３】ＲＮＡ断片の構造決定によって（表１及び
図２）、２８ＳｒＲＮＡの切断に関与するＲＮａｓｅを
同定するのに必要な情報の鍵が得られる。この切断に関
係してＲＮａｓｅの種類は不明である。既知のＲＮａｓ
ｅでは、２８ＳｒＲＮＡの選択的切断は説明できない。
ヒトすい臓型ＲＮａｓｅによって優先的に切断されるホ
スホジエステル結合の３’側のヌクレオチド上の塩基は
シトシンである（Nadano, D. et al. (1993) Anal. Bio
chem. 212, 111-116）。ヒトの細胞において、２−５Ａ
依存性ＲＮａｓｅＬ（Zhou, A. et al. (1993) Cell 7
2, 753-765）は、インターフェロン受容体の下流にあっ
て、アポトーシスに関係しており（Zhou, A. et al. (1
997) EMBO J. 16, 6355-6363）、２８ＳｒＲＮＡを異な
る部位、すなわちヌクレオチド３９９９と４０００との
間および４０００と４００１との間で切断する（Iordan
ov, M. S. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 617-6
27）。従って、本アッセイ系で作用したＲＮａｓｅは異
なるものであると思われる。ある種の哺乳類のＲＮａｓ
ｅは、そのＲＮａｓｅ活性に依存した細胞毒性を有する
（D'Alessio, G. et al. (1997) Ribonucleases. Struc
tures and Functions. Academic Press, San Diego）。
しかし、それらの標的はほとんど知られていない。ＣＡ
Ｄはアポトーシスの間に活性化される、詳細に解明され
たヌクレアーゼである（Enari, M. et al. (1998) Natu
re 391, 43-50）。ＣＡＤ活性化が抑制された時でもｒ
ＲＮＡの断片化が起こったが（図３Ｂ）、このことはＣ
ＡＤがＴＮＦＲ−Ｕ９３７系においてｒＲＮＡ分解に必
須ではないことを示す。アポトーシス中にｒＲＮＡ断片
化およびゲノムＤＮＡ断片化の相関関係が報告されてい
るが（Houge, G. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15,
2051-2062）、今回のデータによって、ゲノムＤＮＡの
消化に関係するヌクレアーゼ以外のヌクレアーゼの存在
が示唆される。

【００５４】タンパク合成とアポトーシスとの間の機能
的関係には不明な部分がある。いくつかの系では、タン
パク合成の阻害剤は細胞中のアポトーシスを阻害する
が、別の系ではこの阻害剤が細胞死を促進する（Wertz,
I. E. et al. (1996) TrendsBiochem. Sci. 21, 359-3
64）。細胞死受容体の働きによるアポトーシスは、タン
パク合成阻害が細胞死を促進する系の一例である（Ashk
enazi, A. et al. (1998) Science 281, 1305-1308）。
ｒＲＮＡの断片化とタンパク合成阻害との間の関係（図
４〜６）から、この断片化が細胞死の実行を促進するエ
フェクターであることが示唆される。この分解に関与す
る分子の同定によって、アポトーシスの新たな執行経路
が明らかになるであろう。また、２−５Ａ依存性ＲＮａ
ｓｅＬ以外の細胞内ＲＮａｓｅは細胞外刺激から開始さ
れるシグナル伝達に関与することが示されていないの
で、この同定はシグナル伝達の分野では注目すべきであ
ろう。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、アポトーシス調節物質を
スクリーニングするのに有用なアッセイ系を確立するこ
とが可能になった。

【００５６】

【配列表】<110> RIKEN <120> A method for screening a substance capable o
f controlling apoptosis <130> A01096MA <160> 10

【００５７】<210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 1 gctcaacagg gtcttc 16

【００５８】<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 2 cactgggcag aaatcacatc 20

【００５９】<210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 3 acaaaccctt gtgtcgaggg ctga 24

【００６０】<210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 4 acgtgttaga ctccttggtc cgtg 24

【００６１】<210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 5 tgatccttcc gcaggttcac ctac 24

【００６２】<210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 6 gcccttagag ccaatcctta tccc 24

【００６３】<210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 7 agctggggcg atccacggga ag 22

【００６４】<210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 8 catagttact cccgccgttt accc 24

【００６５】<210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 9 acgatcagag tagtggtatt tcacc 25

【００６６】<210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c DNA <400> 10 acaaaccctt gtgtcgaggg ctga 24

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＦａｓおよびＴＮＦＲ１の作用後のｒ
ＲＮＡの変化を示す図である。図１のＡはアポトーシス
細胞のＲＮＡの電気泳動の結果を示す。 （左のパネル）ジャーカット細胞を抗Ｆａｓ抗体（１０
０ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理した。Ｕ９３７細胞はＴ
ＮＦ−α（３０ｎｇ／ｍｌ）で６時間処理した。対照細
胞は、アポトーシス誘導剤を用いない以外は同条件でイ
ンキュベートした。 レーン１：抗Ｆａｓ抗体で処理したジャーカット細胞； レーン２：対照ジャーカット細胞； レーン３：ＴＮＦ−αで処理したＵ９３７； レーン４：対照Ｕ９３７細胞； 細菌２３Ｓおよび１６ＳｒＲＮＡ（Boehringer Mannhei
m, 独国）の移動位置、およびＲＮＡマーカー（Novage
n, 米国ウィスコンシン州マディソン）の移動位置は右
側に示す。 （右のパネル） レーン５：対照ジャーカット細胞； レーン６：無関係のマウスＩｇＭ（１００ｎｇ／ｍｌ）
で処理したジャーカット細胞； レーン７：マウスモノクローナル抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１
１（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理したジャーカット細胞。 図１のＢはポリソームから単離したＲＮＡの電気泳動の
結果を示す。ポリソーム分画を遠心分離で回収し、この
分画より得られたＲＮＡを電気泳動した。ポリソーム単
離で得られたポストミトコンドリア分画からのＲＮＡも
分析した。 レーン１：アポトーシス性ジャーカット細胞のポリソー
ム； レーン２：対照ジャーカット細胞のポリソーム； レーン３：アポトーシス性ジャーカット細胞より得られ
たポストミトコンドリア分画； レーン４：対照ジャーカット細胞より得られたポストミ
トコンドリア分画；追加されたＲＮＡバンド（２８ＳＲ
ＮＡの切断による）は星印および三角矢印で示す。

【図２】図２はＦａｓ−ジャーカット系およびＴＮＦＲ
−Ｕ９３７系における一次ｒＲＮＡ断片の構造を示す。
図２のＡは、２８ＳｒＲＮＡのプローブ（左および中央
のパネル）および１８ＳｒＲＮＡのプローブ（右のパネ
ル）を用いた全ＲＮＡのノーザンブロットの結果を示
す。全ＲＮＡを抗Ｆａｓ抗体で処理したジャーカット細
胞より単離し、電気泳動し、標識したプローブ：５’−
ＡＣＡＡＡＣＣＣＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＧＣＴＧＡ−
３’（配列番号３）［ヒト２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチ
ド５００１−５０２４のアンチセンス］、５’−ＡＣＧ
ＴＧＴＴＡＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＧＴＧ−３’
（配列番号４）［ヒト２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド１
３０５−１３２８のアンチセンス］、および５’−ＴＧ
ＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣ−ＣＴＡＣ−
３’（配列番号５）［ヒト１８ＳｒＲＮＡのヌクレオチ
ド１８４３−１８６６のアンチセンス］を用いてノーザ
ンブロットに付した。主要なＲＮＡ断片を三角矢印で示
す。図２のＢは２８ＳｒＲＮＡ断片より得られたｃＤＮ
Ａの５’末端の電気泳動の結果を示す。アポトーシスの
誘導については実験方法に記載した。ｃＤＮＡは、逆転
写酵素およびターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて一次ｒＲＮＡ断片から
増幅し、その後ＰＣＲを行った。対照は、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いない以
外は同条件で調製した。試料は全て１．８％アガロース
ゲル中で電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。 レーン１：Ｆａｓ−ジャーカット系 レーン２：Ｆａｓ−ジャーカット系の対照 レーン３：ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系 レーン４：ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系の対照 図２のＣは、ヒト２８ＳｒＲＮＡおよび我々のアポトー
シス系における推定切断部位の模式図を示す。２８Ｓｒ
ＲＮＡの構造は、既に報告されている（Gorski, J. L.
et al. (1987) J. Mol. Evol. 24, 236-251; Wakeman,
J. A. et al. (1989) Biochem. J. 258, 49-56）。 斜線部：定常領域 白地部：可変領域 Ｓ／Ｒ：α−サルシン／リシンループ（Wool, I. G. et
al. (1992) Trends Biochem. Sci. 17, 266-269; Saxe
na, S. K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 3263-3
269） Ｖ８：可変領域８ 矢印：推定切断部位

【図３】図３はｒＲＮＡ断片化およびゲノムＤＮＡに対
するカスパーゼ−３阻害剤の効果を示す図である。図３
のＡは、Ｆａｓ−ジャーカット系におけるｒＲＮＡ断片
化（上のパネル）およびＤＮＡ断片化（下のパネル）の
電気泳動分析の結果を示す。ジャーカット細胞は細胞透
過性Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（５０μＭ）で１．５時間前
処理し、その後抗Ｆａｓ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）で８
時間処理した。断片化したＲＮＡおよびＤＮＡを実験方
法に記載した通りに分析した。図３のＢは、ＴＮＦＲ−
Ｕ９３７系におけるｒＲＮＡ断片化（上のパネル）およ
びＤＮＡ断片化（下のパネル）の電気泳動分析の結果を
示す図である。Ｕ９３７細胞はＺ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ
（５０μＭ）で１．５時間前処理し、その後ＴＮＦ−α
（３０ｎｇ／ｍｌ）で６時間処理した。主要な２８Ｓｒ
ＲＮＡ断片を三角矢印で示す。

【図４】図４はＦａｓ−ジャーカット系におけるｒＲＮ
Ａ断片化とタンパク合成阻害との相関関係を示す図であ
る。アポトーシスの誘導については、実験方法に記載し
た。図４のＡは、ｒＲＮＡ断片化の動態を示す。全ＲＮ
Ａを細胞から単離し、ポリアクリルアミド−アガロース
複合ゲル中で電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。
主要な２８ＳｒＲＮＡ断片を三角矢印で示す。図４のＢ
は、タンパク合成阻害の動態を示す。細胞を［³⁵Ｓ］−
メチオニンで２０分間パルスラベルし、ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００含有緩衝液で溶解した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（１０％ゲル）およびオートラジオグラフィーに付
した。ここに示す結果は３回の独立した実験の代表例で
ある。

【図５】図５は、ＴＮＦＲ−Ｕ９３７系におけるｒＲＮ
Ａ断片化とタンパク合成阻害の相関関係を示す図であ
る。この系におけるアポトーシスの誘導は実験方法に記
載した。その後の実験方法の説明については、図４の説
明を参照。図５のＡは、ｒＲＮＡ断片化の動態を示す。
主要な２８ＳｒＲＮＡ断片を三角矢印で示す。図５のＢ
は、タンパク合成阻害の動態を示す。ここに示す結果は
３回の独立した実験の代表例である。

【図６】図６は、タンパク合成阻害に対するカスパーゼ
−３阻害剤の効果を示す図である。図６のＡは、Ｆａｓ
−ジャーカット系である。ジャーカット細胞をＺ−ＤＥ
ＶＤ−ＦＭＫで前処理した後、抗Ｆａｓ抗体で８時間処
理した。細胞を［³⁵Ｓ］−メチオニンでパルスラベル
し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝液で溶解した。溶
解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
に付した。メチオニンの取り込みをイメージスキャナー
およびＮＩＨイメージソフトウェアで測定した。図６の
ＢはＴＮＦＲ−Ｕ９３７系である。Ｕ９３７細胞はＺ−
ＤＥＶＤ−ＦＭＫで前処理した後、ＴＮＦ−αで３時間
処理した。その後の方法はパネルＡで記載した通りであ
る。対照と相対的なメチオニンの取り込みをここに示
す。データは３回の独立した実験の一つから得られた２
つの試料の平均値±標準偏差を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 FB07 4B024 AA11 CA04 CA09 CA11 GA18 HA08 HA12 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ54 QR07 QR56 QR62 QR77 QR82 QS03 QS16 QS24 QS34 QX01 QX07

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２８ＳｒＲＮＡの切断を検出することを
   含む、アポトーシス調節物質のスクリーニング方法。
2. 【請求項２】 ２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド３２５１
   から３７１０の間における切断を検出することを含む、
   請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 【請求項３】 ２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド３５２９
   から３５４２の間における切断を検出することを含む、
   請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
4. 【請求項４】 切断部位が２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチ
   ド３５３５と３５３６の間である、請求項１から３の何
   れか１項に記載のスクリーニング方法。
5. 【請求項５】 切断部位での切断を検出できるように修
   飾されている２８ＳｒＲＮＡを使用する、請求項１から
   ４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
6. 【請求項６】 切断部位での切断を検出できるように修
   飾されている、修飾２８ＳｒＲＮＡ。
7. 【請求項７】 ２８ＳｒＲＮＡが切断部位で切断された
   場合に検出できる標識で標識されている、請求項６に記
   載の修飾２８ＳｒＲＮＡ。
8. 【請求項８】 タンパク質合成を阻害してアポトーシス
   を誘導できる、２８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド１−３５
   ３５の断片又はヌクレオチド３５３６−５０２５の断片
   の何れか片方又は両方の部分断片。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の部分断片の片方又は両
   方をアポトーシス誘導のために使用する方法。
10. 【請求項１０】 請求項６又は７に記載の修飾２８Ｓｒ
    ＲＮＡ又は請求項８に記載の部分断片の片方又は両方
    を、請求項１に記載の方法において使用する方法。
11. 【請求項１１】 請求項１から５の何れか１項に記載の
    スクリーニング方法により得ることができる、アポトー
    シス調節物質。