JP2001275660A - アントシアニンを生成する新規なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ培養カルス系、およびアントシアニンを生成可能なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ系の製造方法 - Google Patents
アントシアニンを生成する新規なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ培養カルス系、およびアントシアニンを生成可能なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ系の製造方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/04—Plant cells or tissues
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Panax sikkimensis−インドニンジンの培養物
においてアントシアニン産生カルス系開発の新規方法の
提供。 【解決手段】上記アントシアニン産生カルス系であっ
て、(a) 特徴的なピンク−紫の色素を形成し、(b) 約
５０〜８０日の培養期間における成長指数が約２２１〜
４５０であり、(c) 光照射条件下（連続光）での約４
０〜６０日間における、カルスからのアントシアニンの
収率が２〜３mg／gf.wt.であり、及び(d) 特徴的なＤ
ＮＡプロフィールであって、それぞれのゲル（野生系に
ついての上方ゲル及びアントシアニン産生系についての
下方ゲル）におけるレーン１乃至１２が、それぞれ特定
のプライマーを有するそれぞれの鋳型メガベースゲノム
ＤＮＡによって生産されたＰＣＲ増幅断片を表し、レー
ンＭが、１０００ｂｐ下方から１００ｂｐの間隔でのは
しごの標準的なサイズマーカーを示すものである、こと
を含んでなる、前記カルス系。
においてアントシアニン産生カルス系開発の新規方法の
提供。 【解決手段】上記アントシアニン産生カルス系であっ
て、(a) 特徴的なピンク−紫の色素を形成し、(b) 約
５０〜８０日の培養期間における成長指数が約２２１〜
４５０であり、(c) 光照射条件下（連続光）での約４
０〜６０日間における、カルスからのアントシアニンの
収率が２〜３mg／gf.wt.であり、及び(d) 特徴的なＤ
ＮＡプロフィールであって、それぞれのゲル（野生系に
ついての上方ゲル及びアントシアニン産生系についての
下方ゲル）におけるレーン１乃至１２が、それぞれ特定
のプライマーを有するそれぞれの鋳型メガベースゲノム
ＤＮＡによって生産されたＰＣＲ増幅断片を表し、レー
ンＭが、１０００ｂｐ下方から１００ｂｐの間隔でのは
しごの標準的なサイズマーカーを示すものである、こと
を含んでなる、前記カルス系。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、Panax sikkimensis−インドニンジンの培養
物においてアントシアニン産生カルス系を開発する新規
な方法に関する。更に詳しくは、開発したカルス系は、
特徴的な色素形成、成長速度、ＤＮＡプロフィールおよ
びアントシアニン含量を有する。
物においてアントシアニン産生カルス系を開発する新規
な方法に関する。更に詳しくは、開発したカルス系は、
特徴的な色素形成、成長速度、ＤＮＡプロフィールおよ
びアントシアニン含量を有する。
【０００２】背景技術 本発明は、Panax sikkimensis−インドニンジンの培養
物においてアントシアニン産生カルス系を開発する方法
を提供するものであり、この特有の系において、該カル
ス系の成長速度と、健康強壮薬および老化防止薬物製剤
の重要な成分として市場での需要が大きいジンセノシド
をも含むアントシアニンのイン・ビトロでの生産性とを
提供するものである。
物においてアントシアニン産生カルス系を開発する方法
を提供するものであり、この特有の系において、該カル
ス系の成長速度と、健康強壮薬および老化防止薬物製剤
の重要な成分として市場での需要が大きいジンセノシド
をも含むアントシアニンのイン・ビトロでの生産性とを
提供するものである。
【０００３】通常はチョウセンニンジンと呼ばれるPana
x属（ウコギ（Araliaceae）科）は、老化防止、強壮性
(adaptogenic)および免疫調節活性に関与するそのサポ
ニン（ジンセノシド）について以前から知られていた。
本発明者らは、この数年間Panaxのアメリカ種およびイ
ンド種において、生物工学的研究を行ってきた。P. sik
kimensisのインド種のカルス培養物由来の様々なジンセ
ノシド画分が特に豊富な細胞系をスクリーニングをする
一方で、本発明者らはアントシアニンの豊富な細胞クラ
スターを見出し、続いて連続細胞−集塊選抜法によって
クローニングを行った。
x属（ウコギ（Araliaceae）科）は、老化防止、強壮性
(adaptogenic)および免疫調節活性に関与するそのサポ
ニン（ジンセノシド）について以前から知られていた。
本発明者らは、この数年間Panaxのアメリカ種およびイ
ンド種において、生物工学的研究を行ってきた。P. sik
kimensisのインド種のカルス培養物由来の様々なジンセ
ノシド画分が特に豊富な細胞系をスクリーニングをする
一方で、本発明者らはアントシアニンの豊富な細胞クラ
スターを見出し、続いて連続細胞−集塊選抜法によって
クローニングを行った。
【０００４】先行技術文献 アントシアニンは、様々な植物種で形成され、花および
果実の部分によく見られる。アントシアニンは毒性が低
いので、食品添加剤やマーカーとしての可能性が高い。
従って、多くの研究機関や食品製造業者は、Euphorbia
milli (Agri. Biol. Chem., 53: 417-423, 1989); Call
istephus chinensis (Pl. Cell, Rep.5: 435-438, 198
6); Vitis vinifera (Biotech. Agri. Forest. Vol. 2
4, Med.PI. V. ed. Y.P.S. Bajaj, pp. 373-386, 199
3); Srawbeny (J. Sci. Food Agric., 66: 381-388, 19
94); Perilla frutescens (J. Ferment. Bioeng., 76:
530-531, 1993); Aralia cordata (PI. Cell Tiss. Or
g. Cul., 36: 21-26, 1994)などの様々な植物細胞培養
物からこれらの色素を生産する目的で鋭意検討を行って
いる。しかしながら、アントシアニンは、通常は培養植
物細胞に少量しか蓄積されず、またその生産には一般的
に光照射を必要とする。アントシアニン生産の最も優れ
ている報告の一つはGlehnia littoralis (Phytochemist
ry, 48: 279-282, 1998)のカルス培養物であり、１４．
２％ｇ−１Ｄ．Ｗｔ程度のアントシアニン生産が行われ
ている。多くの場合に、イン・ビトロで生産されたアン
トシアニンは、シアニジン型のものであり、これはメチ
ル化アントシアニジン(methylated antrhocyanidins)が
含まれている元の植物のものよりも生化学的に原始的な
ものである(Rev. Can. Biol. Exp., 42: 13-18, 198
3)。次の７種類のアントシアニジンが、検出された：シ
アニジン（１７ｓｐｐ．）、デルフィニジン（５ｓｐ
ｐ．）、マルビニジン（４ｓｐｐ．）、ペチュニジン
（３ｓｐｐ．）、ペラルゴニジン（２ｓｐｐ．）および
ペオニジンおよびヒルスチジンの両者についての１例。
果実の部分によく見られる。アントシアニンは毒性が低
いので、食品添加剤やマーカーとしての可能性が高い。
従って、多くの研究機関や食品製造業者は、Euphorbia
milli (Agri. Biol. Chem., 53: 417-423, 1989); Call
istephus chinensis (Pl. Cell, Rep.5: 435-438, 198
6); Vitis vinifera (Biotech. Agri. Forest. Vol. 2
4, Med.PI. V. ed. Y.P.S. Bajaj, pp. 373-386, 199
3); Srawbeny (J. Sci. Food Agric., 66: 381-388, 19
94); Perilla frutescens (J. Ferment. Bioeng., 76:
530-531, 1993); Aralia cordata (PI. Cell Tiss. Or
g. Cul., 36: 21-26, 1994)などの様々な植物細胞培養
物からこれらの色素を生産する目的で鋭意検討を行って
いる。しかしながら、アントシアニンは、通常は培養植
物細胞に少量しか蓄積されず、またその生産には一般的
に光照射を必要とする。アントシアニン生産の最も優れ
ている報告の一つはGlehnia littoralis (Phytochemist
ry, 48: 279-282, 1998)のカルス培養物であり、１４．
２％ｇ−１Ｄ．Ｗｔ程度のアントシアニン生産が行われ
ている。多くの場合に、イン・ビトロで生産されたアン
トシアニンは、シアニジン型のものであり、これはメチ
ル化アントシアニジン(methylated antrhocyanidins)が
含まれている元の植物のものよりも生化学的に原始的な
ものである(Rev. Can. Biol. Exp., 42: 13-18, 198
3)。次の７種類のアントシアニジンが、検出された：シ
アニジン（１７ｓｐｐ．）、デルフィニジン（５ｓｐ
ｐ．）、マルビニジン（４ｓｐｐ．）、ペチュニジン
（３ｓｐｐ．）、ペラルゴニジン（２ｓｐｐ．）および
ペオニジンおよびヒルスチジンの両者についての１例。
【０００５】イン・ビトロでのアントシアニン生産は、
多くの他の属でほとんどがカルス／懸濁液培養において
報告されているが(Phytochemistry, 29: 2153-2158, 19
90,Biotechnol. Agric. Forest., Vol. 24; Ed. Bajaj,
pp. 373-386, 1993)、本発明者らの知る限りでは、Pan
ax属ではその生産は報告されていない。Panaxは、強壮
剤として用いられる二次代謝産物、すなわちジンセノシ
ド、の重要な群の唯一の供給源であると考えられる。こ
の重要な植物の根の抽出物／粉末は、強壮薬、茶、チュ
ーインガム、（皮膚を若返らせる目的での）顔面クリー
ムなどの形態で市販されている。ジンセノシドと共に同
一カルスにアントシアニンが含まれていれば、その市場
価値は更に増すことになる。ジンセノシドを含む濁りの
ある抽出物は、キャンディー、ケーキ、練り粉菓子、冷
飲料などに用いることができる。
多くの他の属でほとんどがカルス／懸濁液培養において
報告されているが(Phytochemistry, 29: 2153-2158, 19
90,Biotechnol. Agric. Forest., Vol. 24; Ed. Bajaj,
pp. 373-386, 1993)、本発明者らの知る限りでは、Pan
ax属ではその生産は報告されていない。Panaxは、強壮
剤として用いられる二次代謝産物、すなわちジンセノシ
ド、の重要な群の唯一の供給源であると考えられる。こ
の重要な植物の根の抽出物／粉末は、強壮薬、茶、チュ
ーインガム、（皮膚を若返らせる目的での）顔面クリー
ムなどの形態で市販されている。ジンセノシドと共に同
一カルスにアントシアニンが含まれていれば、その市場
価値は更に増すことになる。ジンセノシドを含む濁りの
ある抽出物は、キャンディー、ケーキ、練り粉菓子、冷
飲料などに用いることができる。
【０００６】
【発明の概要】発明の目的 本発明の主目的は、特徴的な色、成長速度、ＤＮＡプロ
フィールおよびアントシアニン含量を有するインドニン
ジンPanax sikkimensisの培養物におけるアントシアニ
ン産生カルス系の開発法を得ることである。これまで本
発明者らの知る限りでは、Panax種、P. sikkimensisの
カルス培養物におけるアントシアニンの存在は報告され
ていない。
フィールおよびアントシアニン含量を有するインドニン
ジンPanax sikkimensisの培養物におけるアントシアニ
ン産生カルス系の開発法を得ることである。これまで本
発明者らの知る限りでは、Panax種、P. sikkimensisの
カルス培養物におけるアントシアニンの存在は報告され
ていない。
【０００７】本発明のもう一つの目的は、高品質のアン
トシアニンを産生することができる新規なP. sikkimens
isカルス系を提供することである。本発明の更にもう一
つの目的は、P. sikkimensisのカルス培養物でのアント
シアニン産生に関する成長速度を検討することである。
本発明の更にもう一つの目的は、アントシアニン産生カ
ルス系からジンセノシドを抽出することである。本発明
の更にもう一つの目的は、アントシアニン生産を増加さ
せるための物理的条件を確定することである。本発明の
更にもう一つの目的は、アントシアニン産生系を分子レ
ベルで特性決定することである。本発明の更にもう一つ
の目的は、アントシアニン色素を特性決定することであ
る。本発明の更にもう一つの目的は、アントシアニンお
よびジンセノシドを同時に回収することである。
トシアニンを産生することができる新規なP. sikkimens
isカルス系を提供することである。本発明の更にもう一
つの目的は、P. sikkimensisのカルス培養物でのアント
シアニン産生に関する成長速度を検討することである。
本発明の更にもう一つの目的は、アントシアニン産生カ
ルス系からジンセノシドを抽出することである。本発明
の更にもう一つの目的は、アントシアニン生産を増加さ
せるための物理的条件を確定することである。本発明の
更にもう一つの目的は、アントシアニン産生系を分子レ
ベルで特性決定することである。本発明の更にもう一つ
の目的は、アントシアニン色素を特性決定することであ
る。本発明の更にもう一つの目的は、アントシアニンお
よびジンセノシドを同時に回収することである。
【０００８】
【発明の具体的な説明】発明の詳しい説明 上記目的および他の目的を満足するため、本発明は、ア
ントシアニンを産生する新規なPanax sikkimensis（ニ
ンジンのインド種）カルス系であって、(a) 特徴的な
ピンク−紫の色素を形成し、(b) 約５０〜８０日の培
養期間における成長指数が約２２１〜４５０であり、
(c) 光照射条件下（連続光）での約４０〜６０日間に
おけるカルスからのアントシアニンの収率が２〜３mg／
gf.wt.であり、および (d) 特徴的なＤＮＡプロフィールであって、それぞれのゲル（野生系について の上方ゲルおよびアントシアニン産生系についての下方ゲル）におけるレーン１ 、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２が、それぞれプライ マー５′ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ Ｃ３′，３′，５′ＴＧＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ａ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧＴ Ｇ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＣＧ ＴＡＡ ＣＧＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＡ Ｃ３′，５′ＧＴＴ ＧＣＧ ＡＴＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＴ Ｃ３′，５′ＣＧＣ ＡＧＴ ＡＣＴ Ｃ３′，５′ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＴＣ Ｇ３′，５′ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ Ｃ３′，および５′ＧＴＣ ＣＴＴ ＡＧＣ Ｇ３′を有するそれぞれの鋳型 メガベースゲノムＤＮＡによって生産されたＰＣＲ増幅断片を表し、レーンＭが 、１０００ｂｐ下方から１００ｂｐの間隔でのはしごの標準的なサイズマーカー を示すものである ことを含んでなる上記カルス系を提供する。
ントシアニンを産生する新規なPanax sikkimensis（ニ
ンジンのインド種）カルス系であって、(a) 特徴的な
ピンク−紫の色素を形成し、(b) 約５０〜８０日の培
養期間における成長指数が約２２１〜４５０であり、
(c) 光照射条件下（連続光）での約４０〜６０日間に
おけるカルスからのアントシアニンの収率が２〜３mg／
gf.wt.であり、および (d) 特徴的なＤＮＡプロフィールであって、それぞれのゲル（野生系について の上方ゲルおよびアントシアニン産生系についての下方ゲル）におけるレーン１ 、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２が、それぞれプライ マー５′ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ Ｃ３′，３′，５′ＴＧＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ａ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧＴ Ｇ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＣＧ ＴＡＡ ＣＧＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＡ Ｃ３′，５′ＧＴＴ ＧＣＧ ＡＴＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＴ Ｃ３′，５′ＣＧＣ ＡＧＴ ＡＣＴ Ｃ３′，５′ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＴＣ Ｇ３′，５′ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ Ｃ３′，および５′ＧＴＣ ＣＴＴ ＡＧＣ Ｇ３′を有するそれぞれの鋳型 メガベースゲノムＤＮＡによって生産されたＰＣＲ増幅断片を表し、レーンＭが 、１０００ｂｐ下方から１００ｂｐの間隔でのはしごの標準的なサイズマーカー を示すものである ことを含んでなる上記カルス系を提供する。
【０００９】本発明は、根の外植片からのP. sikkimens
isのアントシアニン産生系の開発法であって、(a) 改
良Murashige and Skoog培地（培地Ｉ）上でP. sikkimen
sisの根の外植片を無菌培養してカルスを得て、(b) 一
次カルスを、アントシアニンを産生させながら最適成長
させるための培地IIへ移し、(c) 暗および／または明
サイクル、温度２８±３℃、相対湿度７０〜８０％下
で、４〜６週間毎に培地IIで定期的に継代培養すること
によって、カルスを３年以上保持し増殖させ、(d) ア
ントシアニンの存在を示す細胞培養物を、少なくとも５
〜８回引続いて選択的に継代培養することによって、ア
ントシアニン産生カルス系を単離し、(e) 該カルスの
豊富になったカルス系を培地IIを用いて増殖させ、該カ
ルス培養物を特定の明条件（１６時間明／８時間暗、ま
たは２４時間明）下でインキュベーションする段階を含
んでなる上記開発方法、も提供する。
isのアントシアニン産生系の開発法であって、(a) 改
良Murashige and Skoog培地（培地Ｉ）上でP. sikkimen
sisの根の外植片を無菌培養してカルスを得て、(b) 一
次カルスを、アントシアニンを産生させながら最適成長
させるための培地IIへ移し、(c) 暗および／または明
サイクル、温度２８±３℃、相対湿度７０〜８０％下
で、４〜６週間毎に培地IIで定期的に継代培養すること
によって、カルスを３年以上保持し増殖させ、(d) ア
ントシアニンの存在を示す細胞培養物を、少なくとも５
〜８回引続いて選択的に継代培養することによって、ア
ントシアニン産生カルス系を単離し、(e) 該カルスの
豊富になったカルス系を培地IIを用いて増殖させ、該カ
ルス培養物を特定の明条件（１６時間明／８時間暗、ま
たは２４時間明）下でインキュベーションする段階を含
んでなる上記開発方法、も提供する。
【００１０】本発明の新規な点は、下記の通りである。 ａ） 本発明者らの知る限りでは、本発明は、特徴的な
ジンセノシド（０．９〜１．２％Ｆ．Ｗｔ）の他にアン
トシアニン含量（２．１６％ Ｆ．ｗｔ）がかなり高い
P. sikkimensisにおいて、アントシアニン産生カルス系
の開発法を初めて報告するものである。この手順は、P.
sikkimensisの切り取った根の切片からのカルス誘導
法、カルス培養増殖および保持培地（栄養素＋成長補足
剤）、および試験を行った３年以上に亙り持続成長およ
びアントシアニン生産を維持するインキュベーション環
境（物理的条件）を概説するものである。 ｂ） 本発明によれば、同一カルス組織から、色素アン
トシアニンおよびジンセノシドが得られる。
ジンセノシド（０．９〜１．２％Ｆ．Ｗｔ）の他にアン
トシアニン含量（２．１６％ Ｆ．ｗｔ）がかなり高い
P. sikkimensisにおいて、アントシアニン産生カルス系
の開発法を初めて報告するものである。この手順は、P.
sikkimensisの切り取った根の切片からのカルス誘導
法、カルス培養増殖および保持培地（栄養素＋成長補足
剤）、および試験を行った３年以上に亙り持続成長およ
びアントシアニン生産を維持するインキュベーション環
境（物理的条件）を概説するものである。 ｂ） 本発明によれば、同一カルス組織から、色素アン
トシアニンおよびジンセノシドが得られる。
【００１１】ｃ） 本発明によれば、アントシアニン生
産についての、光条件（明−暗サイクル、連続光および
完全な暗）および回収計画、ホルモン濃度および規格な
どのパラメーターのベンチレベルでの同定が行われる。 ｄ） 開発された系は、形態学的に識別可能な特徴を有
し（添付写真（シート１，図１））、野生型のものと比
較して単離した系のカルス細胞で特徴的な暗ピンク紫の
色素を形成する。形態学的外観は、この種類の着色表現
のものとできるだけ真実に近くしている。 ｅ） 開発された系は、特徴的なＤＮＡプロフィールを
有する（シート１，図２）。
産についての、光条件（明−暗サイクル、連続光および
完全な暗）および回収計画、ホルモン濃度および規格な
どのパラメーターのベンチレベルでの同定が行われる。 ｄ） 開発された系は、形態学的に識別可能な特徴を有
し（添付写真（シート１，図１））、野生型のものと比
較して単離した系のカルス細胞で特徴的な暗ピンク紫の
色素を形成する。形態学的外観は、この種類の着色表現
のものとできるだけ真実に近くしている。 ｅ） 開発された系は、特徴的なＤＮＡプロフィールを
有する（シート１，図２）。
【００１２】本発明の方法の好ましい態様においては、
該根を４〜７mmの短い外植片に切断し、１％（v/v）シ
タベロンで約５〜１５分間、次に７０％（v/v）エタノ
ールで３０秒間処理した後、０．１％ＨｇＣｌ２（w/
v）で約１〜２分間処理することによって滅菌する。段
階(ａ)における基本培地は、ミオイノシトール２００mg
/l、チアミン塩酸塩およびピリドキシン塩酸塩をそれぞ
れ１０mg/l、およびニコチン酸５mg/lを補足した改良Mu
rashige and Skoog培地(1962)であり、段階(b)で用いた
培地IIは、カルスの最適成長の目的で基本培地に好まし
く添加される２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．１〜
２．０mg/lおよびＫｎ０．１〜０．５mg/lを添加するこ
とによって得られる。
該根を４〜７mmの短い外植片に切断し、１％（v/v）シ
タベロンで約５〜１５分間、次に７０％（v/v）エタノ
ールで３０秒間処理した後、０．１％ＨｇＣｌ２（w/
v）で約１〜２分間処理することによって滅菌する。段
階(ａ)における基本培地は、ミオイノシトール２００mg
/l、チアミン塩酸塩およびピリドキシン塩酸塩をそれぞ
れ１０mg/l、およびニコチン酸５mg/lを補足した改良Mu
rashige and Skoog培地(1962)であり、段階(b)で用いた
培地IIは、カルスの最適成長の目的で基本培地に好まし
く添加される２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．１〜
２．０mg/lおよびＫｎ０．１〜０．５mg/lを添加するこ
とによって得られる。
【００１３】図面の説明 図１は、本発明の開発されたP. sikkimensiskのカルス
系を示す写真である。図２は、P開発された. sikkimens
isのカルス系のＤＮＡプロフィールを表す写真である。
系を示す写真である。図２は、P開発された. sikkimens
isのカルス系のＤＮＡプロフィールを表す写真である。
【００１４】従って、本発明は、(ａ)特徴的な色（シー
ト１，図１）を有するP. sikkimensisの根の外植片のア
ントシアニン産生カルス系の開発法を提供する。アント
シアニンの他に、上記カルス系は、(b)Panax属に特徴的
な粗製ジンセノシド（０．９〜１．２％）を有する粗製
ジンセノシド０．９〜１．２％Ｆ．Ｗｔ．、(c)図２に
示されるＤＮＡプロフィール、(c)特定の光条件（８時
間明および１６時間暗；１６時間明／８時間暗；２４時
間明、および２４時間暗）および特定のホルモンの組合
せおよび濃度、ＩＡＡ（０．５〜１．５mg/l）；ＮＡＡ
（０．５〜１．５mg/l）であって、いずれもＫｎ（０．
２５〜０．５０mg/l）との組合せにおいて、バイオマス
生産を増加させかつ高アントシアニン含量（２．５mg/
g．ｆ．ｗｔまで）を生じる高成長指数(221.36-433.17
2)、(ｄ)Ｒｆ（０．４０４）を有するアントシアニン色
素の特異的吸収スペクトルも含む。
ト１，図１）を有するP. sikkimensisの根の外植片のア
ントシアニン産生カルス系の開発法を提供する。アント
シアニンの他に、上記カルス系は、(b)Panax属に特徴的
な粗製ジンセノシド（０．９〜１．２％）を有する粗製
ジンセノシド０．９〜１．２％Ｆ．Ｗｔ．、(c)図２に
示されるＤＮＡプロフィール、(c)特定の光条件（８時
間明および１６時間暗；１６時間明／８時間暗；２４時
間明、および２４時間暗）および特定のホルモンの組合
せおよび濃度、ＩＡＡ（０．５〜１．５mg/l）；ＮＡＡ
（０．５〜１．５mg/l）であって、いずれもＫｎ（０．
２５〜０．５０mg/l）との組合せにおいて、バイオマス
生産を増加させかつ高アントシアニン含量（２．５mg/
g．ｆ．ｗｔまで）を生じる高成長指数(221.36-433.17
2)、(ｄ)Ｒｆ（０．４０４）を有するアントシアニン色
素の特異的吸収スペクトルも含む。
【００１５】本発明は、更に２，４−Ｄ（０．０〜５．
０mg/l）またはＮＡＡ（０．１〜２．０mg/l）を単独で
またはＫｎ（０．１〜２mg/l）と組合わせて補足した改
良Murashige & Skoog培地(Physiol. Plant, 15: 473-49
7, 1962)においてP. sikkimensisの根の外植片から無菌
のカルス培養物を得る方法も提供する。該カルスは暗お
よび／または明サイクルで新たな培地へ定期的に移すこ
とによって維持され、次に通常はアントシアニン色素を
含む細胞クラスターを選択的に継代培養することによっ
てアントシアニン産生細胞系を単離し、同様な条件下で
３〜４週間毎に選択処理を繰返し、最後にアントシアニ
ン産生細胞系を静止条件下、接種物対培地比１：１０に
おいて、クローニングして成長測定を行い、回収を１０
日間隔で行う。バイオマス増加は、初期接種量に対する
百分率増加として表され、試料を８０℃の熱気流循環オ
ーブンで一定重量になるまで乾燥させ、乾燥含量を測定
した。
０mg/l）またはＮＡＡ（０．１〜２．０mg/l）を単独で
またはＫｎ（０．１〜２mg/l）と組合わせて補足した改
良Murashige & Skoog培地(Physiol. Plant, 15: 473-49
7, 1962)においてP. sikkimensisの根の外植片から無菌
のカルス培養物を得る方法も提供する。該カルスは暗お
よび／または明サイクルで新たな培地へ定期的に移すこ
とによって維持され、次に通常はアントシアニン色素を
含む細胞クラスターを選択的に継代培養することによっ
てアントシアニン産生細胞系を単離し、同様な条件下で
３〜４週間毎に選択処理を繰返し、最後にアントシアニ
ン産生細胞系を静止条件下、接種物対培地比１：１０に
おいて、クローニングして成長測定を行い、回収を１０
日間隔で行う。バイオマス増加は、初期接種量に対する
百分率増加として表され、試料を８０℃の熱気流循環オ
ーブンで一定重量になるまで乾燥させ、乾燥含量を測定
した。
【００１６】本発明の更にもう一つの態様においては、
回収した新鮮なカルスからジンセノシドをメタノール
（１００％）を用いて（４回）化学抽出し、該乾燥抽出
物を水に再溶解して、この水部分を水で飽和したｎ−ブ
タノールを用いて最終的に（４回）抽出し、該ｎ−ブタ
ノール画分を回収して、これを遠心分離して上清を集め
て、真空乾燥させる。
回収した新鮮なカルスからジンセノシドをメタノール
（１００％）を用いて（４回）化学抽出し、該乾燥抽出
物を水に再溶解して、この水部分を水で飽和したｎ−ブ
タノールを用いて最終的に（４回）抽出し、該ｎ−ブタ
ノール画分を回収して、これを遠心分離して上清を集め
て、真空乾燥させる。
【００１７】更にもう一つの態様においては、アントシ
アニン色素は、新鮮なカルス組織を０．１％（v/v）Ｈ
Ｃｌ−メタノール（１０ml）中でホモジナイズし、これ
を濾過して、この上清を酸性メタノール溶液で３倍に希
釈し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(Perkin Elmer, Lambola
Bio 23)を用いて５２５〜５３５nmの範囲の波長でその
吸光度を測定することによって抽出される。
アニン色素は、新鮮なカルス組織を０．１％（v/v）Ｈ
Ｃｌ−メタノール（１０ml）中でホモジナイズし、これ
を濾過して、この上清を酸性メタノール溶液で３倍に希
釈し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(Perkin Elmer, Lambola
Bio 23)を用いて５２５〜５３５nmの範囲の波長でその
吸光度を測定することによって抽出される。
【００１８】更にもう一つの態様においては、選択され
た系の細胞中のアントシアニンの存在は、０．２mg/lの
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）染色を
用いて非放射性共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）法(Pl. M
ed., 60: 253-259, 1994)によって確認される。
た系の細胞中のアントシアニンの存在は、０．２mg/lの
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）染色を
用いて非放射性共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）法(Pl. M
ed., 60: 253-259, 1994)によって確認される。
【００１９】本発明の更にもう一つの態様においては、
開発されたアントシアニン産生系は、ランダムプライマ
ーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）分析法におい
て細胞系ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、分子レベル
で特性決定される。
開発されたアントシアニン産生系は、ランダムプライマ
ーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）分析法におい
て細胞系ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、分子レベル
で特性決定される。
【００２０】本発明の更にもう一つの態様においては、
培養条件として、明条件（８時間明および１６時間暗、
１６時間明／８時間暗、２４時間明、および２４時間
暗）、特定のホルモンの組合せおよび濃度［ＩＡＡ
（０．５〜１．５mg/l）；ＮＡＡ（０．５〜１．５mg/
l）；２，４−Ｄ（０．５〜１．５mg/l）；いずれもＫ
ｎ（０．２５〜０．５０mg/l）との組合せ］、および明
暗条件が決定されて、アントシアニン産生を最大にし
た。
培養条件として、明条件（８時間明および１６時間暗、
１６時間明／８時間暗、２４時間明、および２４時間
暗）、特定のホルモンの組合せおよび濃度［ＩＡＡ
（０．５〜１．５mg/l）；ＮＡＡ（０．５〜１．５mg/
l）；２，４−Ｄ（０．５〜１．５mg/l）；いずれもＫ
ｎ（０．２５〜０．５０mg/l）との組合せ］、および明
暗条件が決定されて、アントシアニン産生を最大にし
た。
【００２１】本発明の更にもう一つの態様においては、
様々な画分の色素を単離してアントシアニン色素の主画
分を分離する手順を、溶媒系ｎ−ブタノール：酢酸：水
（ＢＡＷ）＝（４：１：５）を用いるペーパークロマト
グラフィーによって行い、有機層（上層）およびアント
シアニン色素の様々な明確な画分のＲｆ値を測定して、
それらを同定した。
様々な画分の色素を単離してアントシアニン色素の主画
分を分離する手順を、溶媒系ｎ−ブタノール：酢酸：水
（ＢＡＷ）＝（４：１：５）を用いるペーパークロマト
グラフィーによって行い、有機層（上層）およびアント
シアニン色素の様々な明確な画分のＲｆ値を測定して、
それらを同定した。
【００２２】以下の説明は、例示の目的で提供されるも
のであり、本発明の範囲を制限するものと理解すべきで
はない。
のであり、本発明の範囲を制限するものと理解すべきで
はない。
【００２３】本発明の簡単な方法としては、下記が包含
される。 (a) 無菌カルス培養物の作成：P. sikkimensis Ban.
(Indian Forester, 109: 840-847)カルスは、インドの
シッキム州、ランチャング地方（標高１５００〜３００
０ｍ）から採取した根の切片から得た(PI. Med., 65: 4
84-486)。外植片（３〜５mm）を十分に洗浄して、土壌
粒子を除去した。次に、それらを１％（v/v）セタベロ
ン溶液で処理した後、表面を７０％（v/v）エタノール
で３０秒間滅菌した後、０．１％（w/v）ＨｇＣｌ２溶
液で２分間処理した。表面を滅菌した後、外植片を様々
な組合せのホルモンを補足した寒天ゲル培地に移植し
た。本研究に用いた基本培地は、Murashige and Skoog
培地[Physiol. Plant., 15: 473-497 (1962)]の無機
塩、３％スクロース、ミオイノシトール２００mg
ｌ−１、チアミン塩酸塩（ＴＨＣｌ）およびピリドキシ
ン塩酸塩（ＰＨＣｌ）をそれぞれ１０mg−１、およびニ
コチン酸５mgｌ−１を配合することによって作成した。
培地の組合せのｐＨを５．８±０．０３に調整した後、
１．０４kg／cm２の圧力（１２１℃）で１５〜２０分間
オートクレープ処理を行った。培養物を、（特に断らな
い限り）散光中６０〜７０％の相対湿度、２５±３℃で
インキュベーションした。カルスを、暗および／または
明サイクル中で新鮮な培地に定期的に移すことによって
保持した。アントシアニン産生細胞系を、通常はアント
シアニン色素を含む細胞クラスターを選択的に継代培養
することによって単離した。選択手順は、同様な条件下
で３〜４週間毎に行った。クローニングの後に、アント
シアニン産生細胞系を、３〜４週間毎に継代培養した。
される。 (a) 無菌カルス培養物の作成：P. sikkimensis Ban.
(Indian Forester, 109: 840-847)カルスは、インドの
シッキム州、ランチャング地方（標高１５００〜３００
０ｍ）から採取した根の切片から得た(PI. Med., 65: 4
84-486)。外植片（３〜５mm）を十分に洗浄して、土壌
粒子を除去した。次に、それらを１％（v/v）セタベロ
ン溶液で処理した後、表面を７０％（v/v）エタノール
で３０秒間滅菌した後、０．１％（w/v）ＨｇＣｌ２溶
液で２分間処理した。表面を滅菌した後、外植片を様々
な組合せのホルモンを補足した寒天ゲル培地に移植し
た。本研究に用いた基本培地は、Murashige and Skoog
培地[Physiol. Plant., 15: 473-497 (1962)]の無機
塩、３％スクロース、ミオイノシトール２００mg
ｌ−１、チアミン塩酸塩（ＴＨＣｌ）およびピリドキシ
ン塩酸塩（ＰＨＣｌ）をそれぞれ１０mg−１、およびニ
コチン酸５mgｌ−１を配合することによって作成した。
培地の組合せのｐＨを５．８±０．０３に調整した後、
１．０４kg／cm２の圧力（１２１℃）で１５〜２０分間
オートクレープ処理を行った。培養物を、（特に断らな
い限り）散光中６０〜７０％の相対湿度、２５±３℃で
インキュベーションした。カルスを、暗および／または
明サイクル中で新鮮な培地に定期的に移すことによって
保持した。アントシアニン産生細胞系を、通常はアント
シアニン色素を含む細胞クラスターを選択的に継代培養
することによって単離した。選択手順は、同様な条件下
で３〜４週間毎に行った。クローニングの後に、アント
シアニン産生細胞系を、３〜４週間毎に継代培養した。
【００２４】(b) アントシアニン産生系の成長速度の
検討：静止条件下で成長を測定するため、カルスの新鮮
重量３mgを新しい培地３０mlに接種し、組織を７日間毎
に回収した。培養した組織の新鮮重量を、付着した寒天
をカルス培養物から慎重に取除くことによって測定し
た。新鮮重量に対するバイオマスの増加は、初期接種物
に対する増加率として表される。試料を８０℃の熱気流
循環オーブン中で一定重量になるまで乾燥し、乾燥含量
を測定した。３回の測定値の最小のものを総ての成長分
析処理に用い、実験を２度繰返した。データは、成長指
数（ＧＩ）に関する総ての繰返しの平均実績として表さ
れる。
検討：静止条件下で成長を測定するため、カルスの新鮮
重量３mgを新しい培地３０mlに接種し、組織を７日間毎
に回収した。培養した組織の新鮮重量を、付着した寒天
をカルス培養物から慎重に取除くことによって測定し
た。新鮮重量に対するバイオマスの増加は、初期接種物
に対する増加率として表される。試料を８０℃の熱気流
循環オーブン中で一定重量になるまで乾燥し、乾燥含量
を測定した。３回の測定値の最小のものを総ての成長分
析処理に用い、実験を２度繰返した。データは、成長指
数（ＧＩ）に関する総ての繰返しの平均実績として表さ
れる。
【００２５】(c) 開発したアントシアニン産生系の分
子特性決定 開発した系並びに野生系は、一般的にランダムプライマ
ーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）分析法におい
てゲノムＤＮＡを鋳型として用いて得た分子マーカーパ
ターンによって特性決定した。最終容積が２５μlの増
幅反応混合物は、それぞれｄＮＴＰ４００μＭ、ＭｇＣ
Ｉａ１．０ｍＭ、プライマー１０ピコモル、Ｔａｑポリ
メラーゼ０．２５単位、およびＴａｑ緩衝液（Bangalor
e Genei,インド）２．５μl、鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを含
んでいた。９４℃（５分）、３５℃（１．５分）および
１０℃（１５分）の単一ｐｒｅ−ＰＣＲサイクルの後、
反応混合物の内容を９４℃（５分）、３５℃（１．５
分）および７２℃（１．０分）の順序からなるサイクル
を４０回繰返し、最後にＰＣＲ装置(Perkin Elmer Mode
l 2400)中７２℃５分間の延長終結インキュベーション
を行った。ＰＣＲ実験の終了後、増幅生成物を１．４％
アガロース／ＩｘＴＡＥ緩衝液上で電気泳動によって分
離した。１０個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ画分のはしごの
１０００〜１００塩基対（ｂｐ）の混合物を同時電気泳
動して、増幅生成物のサイズ（ｂｐ）を測定した。
子特性決定 開発した系並びに野生系は、一般的にランダムプライマ
ーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）分析法におい
てゲノムＤＮＡを鋳型として用いて得た分子マーカーパ
ターンによって特性決定した。最終容積が２５μlの増
幅反応混合物は、それぞれｄＮＴＰ４００μＭ、ＭｇＣ
Ｉａ１．０ｍＭ、プライマー１０ピコモル、Ｔａｑポリ
メラーゼ０．２５単位、およびＴａｑ緩衝液（Bangalor
e Genei,インド）２．５μl、鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを含
んでいた。９４℃（５分）、３５℃（１．５分）および
１０℃（１５分）の単一ｐｒｅ−ＰＣＲサイクルの後、
反応混合物の内容を９４℃（５分）、３５℃（１．５
分）および７２℃（１．０分）の順序からなるサイクル
を４０回繰返し、最後にＰＣＲ装置(Perkin Elmer Mode
l 2400)中７２℃５分間の延長終結インキュベーション
を行った。ＰＣＲ実験の終了後、増幅生成物を１．４％
アガロース／ＩｘＴＡＥ緩衝液上で電気泳動によって分
離した。１０個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ画分のはしごの
１０００〜１００塩基対（ｂｐ）の混合物を同時電気泳
動して、増幅生成物のサイズ（ｂｐ）を測定した。
【００２６】(d) 粗製ジンセノシドの抽出およびＴＬ
Ｃ分析 カルス組織からの粗製ジンセノシドの抽出を、本発明者
らが以前に報告した手順に従って行った(Phytochem., 3
5: 1221-1224; Planta Med., 65: 484-486, 1999)。簡
単に説明すれば、既知量の新鮮なカルス組織をＭｅＯＨ
で一晩抽出し、この処理を４回繰返した。プールしたメ
タノール抽出物を、６０℃で濃縮して乾燥した。残渣を
１０ml水に再溶解し、室温でＥｔ２Ｏで抽出した。水画
分を集めて、水で飽和したｎ−ＢｕＯＨで抽出した。最
後に、ＢｕＯＨ画分を減圧下にて濃縮し、秤量して、粗
製ジンセノシド含量を得た。上記で得られた粗製ジンセ
ノシドを、ＴＬＣによって更に様々な画分に分離した。
このため、粗製混合物を既知量の標準ジンセノシド（Ｒ
ｂ１，Ｒｂ２，Ｒｅ，Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｇ１；Carl
Roth, Germany）と共に60F/254 E. Merckプレコートプ
レートにスポットした。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ
（１３：７：２，下相）により、分離および分解が最良
となった。スポットの検出は、プレートに１０％（v/
v）Ｈ２ＳＯ４を噴霧することによって行った。
Ｃ分析 カルス組織からの粗製ジンセノシドの抽出を、本発明者
らが以前に報告した手順に従って行った(Phytochem., 3
5: 1221-1224; Planta Med., 65: 484-486, 1999)。簡
単に説明すれば、既知量の新鮮なカルス組織をＭｅＯＨ
で一晩抽出し、この処理を４回繰返した。プールしたメ
タノール抽出物を、６０℃で濃縮して乾燥した。残渣を
１０ml水に再溶解し、室温でＥｔ２Ｏで抽出した。水画
分を集めて、水で飽和したｎ−ＢｕＯＨで抽出した。最
後に、ＢｕＯＨ画分を減圧下にて濃縮し、秤量して、粗
製ジンセノシド含量を得た。上記で得られた粗製ジンセ
ノシドを、ＴＬＣによって更に様々な画分に分離した。
このため、粗製混合物を既知量の標準ジンセノシド（Ｒ
ｂ１，Ｒｂ２，Ｒｅ，Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｇ１；Carl
Roth, Germany）と共に60F/254 E. Merckプレコートプ
レートにスポットした。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ
（１３：７：２，下相）により、分離および分解が最良
となった。スポットの検出は、プレートに１０％（v/
v）Ｈ２ＳＯ４を噴霧することによって行った。
【００２７】(e) アントシアニン色素の抽出 カルス組織を、０．１％（v/v）ＨＣｌ−メタノール
（１０ml）中でホモジナイズした。濾過の後、透明な上
清１mlを同じ酸性メタノール溶液で３倍に希釈した。メ
タノール溶液の吸光度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(Per
kin Elms LambolaBio 23)を用いて５３５nmで測定し
た。アントシアニン含量を計算し、アントシアニン収率
をSakamoto et al. (1994)(Pl. Cell Tiss. Org. Cul
t., 36:21-26)の方法に準じて計算した。抽出溶液の総
アントシアニン濃度は、同じ溶媒で抽出したクランベリ
ーアントシアニンについての５３５nmの吸光計数Ｅ１％
＝９８．２を用いて測定する(PI. Cell Tiss. Org. Cul
t., 36: 21-26, 1994)。
（１０ml）中でホモジナイズした。濾過の後、透明な上
清１mlを同じ酸性メタノール溶液で３倍に希釈した。メ
タノール溶液の吸光度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(Per
kin Elms LambolaBio 23)を用いて５３５nmで測定し
た。アントシアニン含量を計算し、アントシアニン収率
をSakamoto et al. (1994)(Pl. Cell Tiss. Org. Cul
t., 36:21-26)の方法に準じて計算した。抽出溶液の総
アントシアニン濃度は、同じ溶媒で抽出したクランベリ
ーアントシアニンについての５３５nmの吸光計数Ｅ１％
＝９８．２を用いて測定する(PI. Cell Tiss. Org. Cul
t., 36: 21-26, 1994)。
【数１】
【００２８】アントシアニンのペーパークロマトグラフ
ィー：回収した新鮮な植物組織を、０．１％ＨＣｌ−Ｍ
ｅＯＨを用いて（３回）抽出した。総抽出物を４０〜４
５℃にて真空濃縮し、Whatman濾紙No. 3に直接装填した
濃縮物を溶媒系ブタノール：酢酸：水＝４：１：５、
（有機層中で室温において下降法で展開する。ペーパー
は、１０〜１５時間展開する。アントシアニンは明確な
分離した着色バンドとして現われ、これを次に乾燥した
ペーパーから切り取り、色素をメタノールで溶出する。
溶出物を集めて濃縮し、この工程を少なくとも３回繰返
す。Ｒｆ値がそれぞれ０．４０および０．７３の２つの
バンドが、上記の溶媒系でペーパー上で分離された。
ィー：回収した新鮮な植物組織を、０．１％ＨＣｌ−Ｍ
ｅＯＨを用いて（３回）抽出した。総抽出物を４０〜４
５℃にて真空濃縮し、Whatman濾紙No. 3に直接装填した
濃縮物を溶媒系ブタノール：酢酸：水＝４：１：５、
（有機層中で室温において下降法で展開する。ペーパー
は、１０〜１５時間展開する。アントシアニンは明確な
分離した着色バンドとして現われ、これを次に乾燥した
ペーパーから切り取り、色素をメタノールで溶出する。
溶出物を集めて濃縮し、この工程を少なくとも３回繰返
す。Ｒｆ値がそれぞれ０．４０および０．７３の２つの
バンドが、上記の溶媒系でペーパー上で分離された。
【００２９】スペクトル特性：酸溶液中のアントシアニ
ンは、２つの主要な最大吸収を有し、１つは４７０〜５
５０nmの可視領域にあり、小さな方の吸収は約２７０〜
２８０nmのＵＶ領域にある。０．１％ＨＣｌ−ＭｅＯＨ
溶媒中の可視およびＵＶピークの位置を、図３として記
録する。Ｒｆ０．４０のバンドは５２８．９９nmに最大
吸収を有する主ピークであり、Ｒｆ０．７３を示すバン
ドは５３６．５１nmに最大吸収を有する。
ンは、２つの主要な最大吸収を有し、１つは４７０〜５
５０nmの可視領域にあり、小さな方の吸収は約２７０〜
２８０nmのＵＶ領域にある。０．１％ＨＣｌ−ＭｅＯＨ
溶媒中の可視およびＵＶピークの位置を、図３として記
録する。Ｒｆ０．４０のバンドは５２８．９９nmに最大
吸収を有する主ピークであり、Ｒｆ０．７３を示すバン
ドは５３６．５１nmに最大吸収を有する。
【００３０】
【実施例】下記の実施例は、本発明の例示の目的で示す
ものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべき
ではない。
ものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべき
ではない。
【００３１】例１ 様々なホルモン濃度および組合せでのバイオマス生産並
びにアントシアニン含量を、８０日の培養期間に亙って
比較した。成長指数およびアントシアニン含量を１０日
間隔で観察し、結果を表１に示す。表は、アントシアニ
ン含量に関する限り（平均３．９１mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ）、ＮＡＡ（０．５）＋Ｋｎ（０．２５）の組合せが
最良であることを明確に示している。また、この量は、
４０日の培養期間の後に達成される。しかし、これにつ
いてのカルス成長の成長指数は極めて低い（５０．１
２）。このホルモンの組合せとは対照的に、バイオマス
生産に関する限り、２，４−Ｄ（１．０）とＫｎ（０．
２５）の方がよい。２，４−Ｄ濃度０．５および１．０
からは、１．０の方がバイオマス生産に関して良好であ
る（ＧＩ＝２２１．３６）。この濃度では、アントシア
ニン含量は、若干低く（２．７６７mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ．）、ＮＡＡ（０．５）＋Ｋｎ（０．２５）含有培地
に含まれる量より少ない。この実験から、ＩＡＡおよび
ＮＡＡはいずれも比較的高率のアントシアニン含量／ｇ
新鮮重量を示すが、バイオマス生産はこれら両者のホル
モンを含む培地では極めて低いことが明らかである。従
って、引続く実験では、２，４−Ｄ（１．０mgｌ−１）
およびＫｎ（０．２５mgｌ−１）を含む培地を用いて、
アントシアニン含量についての最大生産指数を得た。こ
こで極めて重要なことは、このホルモンの組合せが、本
発明者らによって以前に報告されているように(Pl. Me
d., 65: 484-486, 1999)、ジンセノシド産生についても
最適であることである。
びにアントシアニン含量を、８０日の培養期間に亙って
比較した。成長指数およびアントシアニン含量を１０日
間隔で観察し、結果を表１に示す。表は、アントシアニ
ン含量に関する限り（平均３．９１mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ）、ＮＡＡ（０．５）＋Ｋｎ（０．２５）の組合せが
最良であることを明確に示している。また、この量は、
４０日の培養期間の後に達成される。しかし、これにつ
いてのカルス成長の成長指数は極めて低い（５０．１
２）。このホルモンの組合せとは対照的に、バイオマス
生産に関する限り、２，４−Ｄ（１．０）とＫｎ（０．
２５）の方がよい。２，４−Ｄ濃度０．５および１．０
からは、１．０の方がバイオマス生産に関して良好であ
る（ＧＩ＝２２１．３６）。この濃度では、アントシア
ニン含量は、若干低く（２．７６７mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ．）、ＮＡＡ（０．５）＋Ｋｎ（０．２５）含有培地
に含まれる量より少ない。この実験から、ＩＡＡおよび
ＮＡＡはいずれも比較的高率のアントシアニン含量／ｇ
新鮮重量を示すが、バイオマス生産はこれら両者のホル
モンを含む培地では極めて低いことが明らかである。従
って、引続く実験では、２，４−Ｄ（１．０mgｌ−１）
およびＫｎ（０．２５mgｌ−１）を含む培地を用いて、
アントシアニン含量についての最大生産指数を得た。こ
こで極めて重要なことは、このホルモンの組合せが、本
発明者らによって以前に報告されているように(Pl. Me
d., 65: 484-486, 1999)、ジンセノシド産生についても
最適であることである。
【００３２】例２ カルスインキュベーションについての様々な光条件を試
験し、バイオマス生産およびアントシアニン含量に対す
るその効果を９０日の培養期間に亙って検討した。バイ
オマスおよび相当するアントシアニン含量の増加率を１
０日間隔で観察し、結果を表２に示す。バイオマス生産
の増加は、１６時間Ｌ−８時間Ｄ（４３３．１７２）と
連続明条件（４１４．０３２）ではほぼ同じであった
が、最大バイオマス生産は、（１６時間Ｌ−８時間Ｄ）
と比較して連続明条件下で初期（５０日）に達成され
た。しかしながら、培養期間中を通して完全暗条件下で
は、バイオマス生産は、５０日までにのみ最大に達し、
すなわち３９３．２６７であった（表２）。アントシア
ニン産生に関する限り、最大生産は、１６時間Ｌおよび
８時間Ｄ（１．７１６mg/g．ｆｒ．ｗｔ）と比較して連
続明条件（２．１６６mg/g．ｆｒ．ｗｔ）下で観察され
た。連続的に暗条件に保持した培養物は、ごく少量のア
ントシアニンしか生産せず（０．２１５mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ）、連続明条件でインキュベートした培養物の１／１
０であった。これは、P. sikkimensisカルス培養物が光
中でアントシアニン産生量が多くなることを明らかに示
している。
験し、バイオマス生産およびアントシアニン含量に対す
るその効果を９０日の培養期間に亙って検討した。バイ
オマスおよび相当するアントシアニン含量の増加率を１
０日間隔で観察し、結果を表２に示す。バイオマス生産
の増加は、１６時間Ｌ−８時間Ｄ（４３３．１７２）と
連続明条件（４１４．０３２）ではほぼ同じであった
が、最大バイオマス生産は、（１６時間Ｌ−８時間Ｄ）
と比較して連続明条件下で初期（５０日）に達成され
た。しかしながら、培養期間中を通して完全暗条件下で
は、バイオマス生産は、５０日までにのみ最大に達し、
すなわち３９３．２６７であった（表２）。アントシア
ニン産生に関する限り、最大生産は、１６時間Ｌおよび
８時間Ｄ（１．７１６mg/g．ｆｒ．ｗｔ）と比較して連
続明条件（２．１６６mg/g．ｆｒ．ｗｔ）下で観察され
た。連続的に暗条件に保持した培養物は、ごく少量のア
ントシアニンしか生産せず（０．２１５mg/g．ｆｒ．ｗ
ｔ）、連続明条件でインキュベートした培養物の１／１
０であった。これは、P. sikkimensisカルス培養物が光
中でアントシアニン産生量が多くなることを明らかに示
している。
【００３３】例３ P. sikkimensisカルス培養物中の色素を特性決定するた
め、新たに採取したカルス組織を０．１％ＨＣｌ−Ｍｅ
ＯＨで抽出し、４０〜５０℃で濃縮し、濃縮物をWhatma
n濾紙No. 3に直接装填し、溶媒系ブタノール：酢酸：水
＝４：１：５（有機層）を用い、室温にて下降法で展開
する。ペーパーは、１０〜１５時間展開する。アントシ
アニンは明確な分離した着色バンドとして現われ、これ
を次に乾燥したペーパーから切取った。これらの切取っ
たバンドをメタノールで溶出した。溶出物を集めて濃縮
した。Ｒｆ値がそれぞれ０．４０および０．７３の２つ
のバンドが、上記の溶媒系でペーパー上で分離された。
め、新たに採取したカルス組織を０．１％ＨＣｌ−Ｍｅ
ＯＨで抽出し、４０〜５０℃で濃縮し、濃縮物をWhatma
n濾紙No. 3に直接装填し、溶媒系ブタノール：酢酸：水
＝４：１：５（有機層）を用い、室温にて下降法で展開
する。ペーパーは、１０〜１５時間展開する。アントシ
アニンは明確な分離した着色バンドとして現われ、これ
を次に乾燥したペーパーから切取った。これらの切取っ
たバンドをメタノールで溶出した。溶出物を集めて濃縮
した。Ｒｆ値がそれぞれ０．４０および０．７３の２つ
のバンドが、上記の溶媒系でペーパー上で分離された。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【発明の効果】本発明の主要な利点は下記の通りであ
る。 １． 本研究の上記カルス系はアントシアニンを産生す
ることができる（４０〜８０日以内）。 ２． 上記カルス系により、ジンセノシド産生と共にア
ントシアニン産生が実行可能となる。 ３． 本発明に用いた培養手順および条件は、十分に定
義されており、再現性があるものである。 ４． 本発明は、重要な健康強壮薬および老化防止薬物
製剤として世界市場で需要が大きいジンセノシドと共に
アントシアニンを産生する効率的な手段を提供する。 ５． アントシアニンに富むカルス系は、ジンセノシド
をも含むこととなるので、キャンディー、ケーキおよび
冷飲料に商業的に用いることができる。
る。 １． 本研究の上記カルス系はアントシアニンを産生す
ることができる（４０〜８０日以内）。 ２． 上記カルス系により、ジンセノシド産生と共にア
ントシアニン産生が実行可能となる。 ３． 本発明に用いた培養手順および条件は、十分に定
義されており、再現性があるものである。 ４． 本発明は、重要な健康強壮薬および老化防止薬物
製剤として世界市場で需要が大きいジンセノシドと共に
アントシアニンを産生する効率的な手段を提供する。 ５． アントシアニンに富むカルス系は、ジンセノシド
をも含むこととなるので、キャンディー、ケーキおよび
冷飲料に商業的に用いることができる。
【図１】本発明の開発されたP. sikkimensiskのカルス
系を示す写真である。
系を示す写真である。
【図２】開発されたP. sikkimensisのカルス系のＤＮＡ
プロフィールを表す写真である。
プロフィールを表す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アニタ、ガングウォー インド国ウッタル‐プラデシュ、ラクノ ウ、ピー．オー．シマップ、セントラル、 インスティテュート、オブ、メディシナ ル、アンド、アロマティック、プランツ内 (72)発明者 アジェイ、クマール、マシュー インド国ウッタル‐プラデシュ、ラクノ ウ、ピー．オー．シマップ、セントラル、 インスティテュート、オブ、メディシナ ル、アンド、アロマティック、プランツ内 (72)発明者 ラージェンドラ、シンフ、サングウァン インド国ウッタル‐プラデシュ、ラクノ ウ、ピー．オー．シマップ、セントラル、 インスティテュート、オブ、メディシナ ル、アンド、アロマティック、プランツ内 (72)発明者 ダラム、チャンド、ジャイン インド国ウッタル‐プラデシュ、ラクノ ウ、ピー．オー．シマップ、セントラル、 インスティテュート、オブ、メディシナ ル、アンド、アロマティック、プランツ内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA05 QQ09 QQ15 QQ42 QQ67 QR56 QR62 QS14 QS25 QS32 QS36 QX02 4B064 AF41 BG04 BG07 CA11 CC03 CC06 CD04 CD10 CD12 CE08 DA01 DA10 4B065 AA89X AC14 BA25 BB14 BB20 BB35 BC32 BC33 BD16 CA19 CA41 CA44 CA52
Claims (14)
- 【請求項１】Panax sikkimensis（ニンジンのインド
種）の培養物におけるアントシアニン産生カルス系であ
って、(a) 特徴的なピンク−紫の色素を形成し、(b)
約５０〜８０日の培養期間における成長指数が約２２１
〜４５０であり、(c) 光照射条件下（連続光）での約
４０〜６０日間における、カルスからのアントシアニン
の収率が２〜３mg／gf.wt.であり、および (d) 特徴的なＤＮＡプロフィールであって、それぞれのゲル（野生系について の上方ゲルおよびアントシアニン産生系についての下方ゲル）におけるレーン１ 、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２が、それぞれプライ マー５′ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ Ｃ３′，３′，５′ＴＧＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ａ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＧＴ Ｇ３′，５′ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＴ Ｇ３′，５′ＧＣＧ ＴＡＡ ＣＧＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＡ Ｃ３′，５′ＧＴＴ ＧＣＧ ＡＴＣ Ｃ３′，５′ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＴ Ｃ３′，５′ＣＧＣ ＡＧＴ ＡＣＴ Ｃ３′，５′ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＴＣ Ｇ３′，５′ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ Ｃ３′，および５′ＧＴＣ ＣＴＴ ＡＧＣ Ｇ３′を有するそれぞれの鋳型 メガベースゲノムＤＮＡによって生産されたＰＣＲ増幅断片を表し、レーンＭが 、１０００ｂｐ下方から１００ｂｐの間隔でのはしごの標準的なサイズマーカー を示すものである、 ことを含んでなる、前記カルス系。 - 【請求項２】根の外植片からのP. sikkimensisのアント
シアニン産生系の開発法であって、(a) 改良Murashige
and Skoog培地（培地Ｉ）上でP. sikkimensisの根の外
植片を無菌培養してカルスを得て、(b) 該一次カルス
を、アントシアニンを産生させながら最適成長させるた
めの培地IIへ移し、(c) 暗および／または明サイク
ル、温度２８±３℃、相対湿度７０〜８０％下で、４〜
６週間毎に培地IIで定期的に継代培養することによっ
て、カルスを３年以上保持して増殖させ、(d) アント
シアニンの存在を示す細胞培養物を、少なくとも５〜８
回引続いて選択的に継代培養することによって、アント
シアニン産生カルス系を単離し、(e) 該カルスの豊富
になったカルス系を培地IIを用いて増殖させ、該カルス
培養物を特定の明条件（１６時間明／８時間暗、または
２４時間明）下でインキュベーションする段階を含んで
なる、前記開発方法。 - 【請求項３】根を４〜７mmの短い外植片に切断し、１％
（v/v）シタベロンで約５〜１５分間、次に７０％（v/
v）エタノールで３０秒間処理した後、０．１％ＨｇＣ
ｌ２（w/v）で約１〜２分間処理することによってして
滅菌する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】段階(a)で用いた基本培地（培地Ｉ）が、
ミオイノシトール２００mg/l、チアミン塩酸塩およびピ
リドキシン塩酸塩をそれぞれ１０mg/l、およびニコチン
酸５mg/lを補足した、改良Murashige and Skoog培地(19
62)である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】段階(b)における培地IIが、カルスの最適
成長の目的で基本培地に好ましく添加される、２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸０．１〜２．０mg/lおよびＫｎ
０．１〜０．５mg/lを添加することによって得られるも
のである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】アントシアニン産生を高めるための明条件
が、１６時間明／８時間暗または２４時間明である、請
求項２に記載の方法。 - 【請求項７】公知の方法およびさらに抽出したアントシ
アニンの最大吸収を見出すことによって、請求項２に記
載のP. sikkimensisカルス系からジンセノシドおよびア
ントシアニンを検出／抽出する方法。 - 【請求項８】回収した新鮮なカルスからジンセノシド
を、メタノール（１００％）を用いて（４回）化学抽出
し、該乾燥抽出物を水に再溶解して、この水部分を水を
飽和したｎ−ブタノールを用いて（４回）最終的に抽出
し、該ｎ−ブタノール画分を集め、これを遠心分離して
上清を集め、これを真空乾燥する、請求項７に記載の方
法。 - 【請求項９】アントシアニン色素を、新鮮なカルス組織
を０．１％（v/v）ＨＣｌ−メタノール（１０ml）中で
ホモジナイズし、これを濾過し、この上清を酸性メタノ
ール溶液で３倍に希釈して、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(P
erkin Elmer, Lambola Bio 23)を用いて５２５〜５３５
nmの範囲の波長でその吸光度を測定することによって抽
出する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】選択された系の細胞中のアントシアニン
を、０．２mg/lのフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）染色を用いて非放射性共鳴エネルギー移動
（ＲＥＴ）法(Pl. Med., 60: 253-259, 1994)によって
確認する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】アントシアニン産生系を、ランダムプラ
イマーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）分析法に
おいて細胞系ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、分子レ
ベルで特性決定する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】培養条件として、明条件（８時間明およ
び１６時間暗、１６時間明／８時間暗、２４時間明、お
よび２４時間暗）、特定のホルモンの組合せおよび濃度
［ＩＡＡ（０．５〜１．５mg/l）；ＮＡＡ（０．５〜
１．５mg/l）；２，４−Ｄ（０．５〜１．５mg/l）；い
ずれもＫｎ（０．２５〜０．５０mg/l）との組合せ］、
および明暗条件を決定して、アントシアニン産生を最大
にする、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１３】様々な画分の色素を単離してアントシア
ニン色素の主画分を分離する手順を、溶媒系ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水（ＢＡＷ）＝（４：１：５）を用いるペ
ーパークロマトグラフィーによって行い、有機層（上
層）およびアントシアニン色素の様々な明確な画分のＲ
ｆ値を測定して、それらを同定する、請求項７に記載の
方法。 - 【請求項１４】アントシアニンおよびジンセノシドの抽
出を同一組織から行う、請求項７に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/538,425 US6368860B1 (en) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | Anthocyanin producing callus line in cultures of panax sikkimensis and a method of producing panax sikkimensis line capable of producing anthocyanin |
| JP2000092092A JP2001275660A (ja) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | アントシアニンを生成する新規なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ培養カルス系、およびアントシアニンを生成可能なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ系の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/538,425 US6368860B1 (en) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | Anthocyanin producing callus line in cultures of panax sikkimensis and a method of producing panax sikkimensis line capable of producing anthocyanin |
| JP2000092092A JP2001275660A (ja) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | アントシアニンを生成する新規なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ培養カルス系、およびアントシアニンを生成可能なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ系の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001275660A true JP2001275660A (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=26588764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000092092A Pending JP2001275660A (ja) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | アントシアニンを生成する新規なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ培養カルス系、およびアントシアニンを生成可能なＰａｎａｘｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ系の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6368860B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001275660A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1329500A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-07-23 | Council of Scientific and Industrial Research | An anthocyanin producing callus line of Panax sikkimensis and a method for producing the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08502416A (ja) * | 1992-10-30 | 1996-03-19 | シード・キャピタル・インベストメント・（エス・シー・アイ）・ベスローテン・フェンノートシャップ | キラヤ種の培養細胞 |
| AU723170B2 (en) * | 1995-10-19 | 2000-08-17 | Bio-Origyn Llc | Methods and compositions to improve germ cell and embryo survival and function |
-
2000
- 2000-03-29 US US09/538,425 patent/US6368860B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 JP JP2000092092A patent/JP2001275660A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6009055248, Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，１９９９，Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．５，ｐ．４８４−４８６ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1329500A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-07-23 | Council of Scientific and Industrial Research | An anthocyanin producing callus line of Panax sikkimensis and a method for producing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6368860B1 (en) | 2002-04-09 |
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