JP2001245680A - 方 法 - Google Patents

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JP2001245680A
JP2001245680A JP2001010164A JP2001010164A JP2001245680A JP 2001245680 A JP2001245680 A JP 2001245680A JP 2001010164 A JP2001010164 A JP 2001010164A JP 2001010164 A JP2001010164 A JP 2001010164A JP 2001245680 A JP2001245680 A JP 2001245680A
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John Craig Smith
ジョン・クレイグ・スミス
Rakesh Anand
ラケッシュ・アナンド
John Edward Norris Morten
ジョン・エドワード・ノリス・モーテン
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ＰＤＨ（ヒトピルビン酸デヒドロゲナーゼ）
Ｅ１β遺伝子中のアレレ変異の分析のための方法及び材
料、並びに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節が
治療上有益となり得る疾病、例えば糖尿病、喘息、肥
満、敗血症及び末梢血管疾患の診断及び治療におけるPD
H E1β多型性の用途の提供。 【解決手段】 配列番号1中の位置により定義されるPDH
E1β遺伝子の457、1191、1198及び1342位のうち1又は
それ以上の位置にあるヒトの核酸配列を決定し；PDH E1
β遺伝子中の多型性を参照することによりその人間の体
質を決定することを含む、人間のPDH E1β遺伝子中の多
型性の診断のための方法。多型性がさらに以下のように
定義される方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ヒトピルビン酸デヒドロゲナー
ゼE1β（PDH E1β）遺伝子中の多型性に関するものであ
る。本発明はさらに、PDH E1β遺伝子中のアレレ変異の
分析のための方法および材料、ならびに、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性の調節が治療上有益となり得る疾
病、例えば糖尿病、喘息、肥満、敗血症および末梢血管
疾患の診断および治療におけるPDH E1β多型性の用途に
関するものである。
【０００２】複雑な分子の生合成および筋収縮のための
エネルギーの産生は、アデノシン三燐酸（ATP）内部の
高エネルギー燐酸結合の加水分解によって仲介される。
酸化的代謝においてATPはアセチル補酵素A（アセチルCo
A）から生成され、これ自身は脂肪酸のβ酸化によっ
て、または解糖経路によるグルコースの代謝の結果とし
て産生される。グルコースからのアセチルCoAの形成速
度を制御する重要な調節酵素がピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ（PDH）であって、これは、ピルビン酸からアセチ
ルCoAおよび二酸化炭素への酸化および同時にNADからNA
DHへの還元を触媒する。
【０００３】PDHは、ピルビン酸からアセチルCoAへの変
換を完結させるのに要する3つの酵素成分の多数のコピ
ーを含む、糸粒体基質に存在する多酵素複合体である
（PatelおよびRoche、1990；FASEB J.、4:3224-323
3）。E1（ピルビン酸デカルボキシラーゼ、E.C.1.2.4.
1）はピルビン酸からの二酸化炭素の不可逆的離脱を触
媒し；E2（ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラ
ーゼ、E.C.2.3.1.12）はアセチルCoAの生成を触媒し；
そしてE3（ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、E.C.
1.8.1.4）はNADをNADHに還元する。E1酵素は2個のαサ
ブユニットおよび2個のβサブユニットで構成されるヘ
テロ四量体である。E1により触媒されるピルビン酸の脱
炭酸がPDH複合体の働き全体の律速工程である。この工
程はまた、PDH活性を調節するための主要メカニズムの
一つを形成する燐酸化および脱燐酸化のサイクルの標的
でもある。PDH複合体はさらにもう2種類の酵素活性を伴
っている：3つのセリン残基の位置でE1αを燐酸化する
ことのできる特異的キナーゼ（PDK）、および、燐酸化
を逆転させる、緩く結合した特異的ホスファターゼであ
る。E1α上の3つのセリン残基のうち1つが燐酸化される
だけでE1は不活性となる。特異的ホスファターゼにより
燐酸基を除去すると、活性が復帰する。したがって、活
性（脱燐酸化された）状態のPDHの割合は、キナーゼお
よびホスファターゼの活性の均衡によって決定される。
キナーゼの活性はインビボでは、NAD/NADH、CoA/アセチ
ルCoAおよびADP/ATPといった代謝基質の相対濃度によっ
て、ならびにピルビン酸自身の利用可能性によって調節
することができ、故に良好に調節された応答性のPDH活
性の制御が可能となる。
【０００４】PDH複合体の遺伝的異常は、人間の原発性
乳酸アシドーシスの最も一般的な原因である。症例の大
多数はE1αサブユニットの欠陥に連鎖している。PDH複
合体中の欠陥に関連する病理は、新生児の致命的乳酸ア
シドーシスから中枢神経系の甚だしい構造異常を伴う慢
性の神経変性状態の範囲に至る、広範な臨床スペクトル
に従っている。E1αの欠損は、男性および女性の間で異
なったパターンの臨床症状を示す、X連鎖疾患である。
加えて、ヘテロ接合の女性は、主としてX-不活性化のパ
ターンの多様性、ならびに突然変異蛋白の発現、安定性
および活性に及ぼす特異的遺伝子突然変異の影響の相違
のため、この疾患の臨床的重篤度に幅広い多様性を示
す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損につながるPDH遺
伝子の幾つかの突然変異が報告されている（総説につい
てはNIH OMIMデータベース、参照番号312170を参照され
たい）。
【０００５】インシュリン非依存性糖尿病（NIDDM）お
よびインシュリン依存性糖尿病（IDDM）の両者のような
疾病状態では、脂質の酸化が増加し、同時にグルコース
の利用が低下して、高血糖に寄与する。インシュリン依
存性およびインシュリン非依存性糖尿病のいずれにおい
てもPDHの活性は低下する。PDH活性低下のさらなる帰結
はピルビン酸濃度の増加であり、これは肝臓のグルコー
ス新生の基質としての乳酸の利用性を増す結果となる。
糖尿病はさらに、インシュリン分泌の障害によっても悪
化し、これは、膵臓β細胞におけるPDH活性の低下に関
連していることが示されている。PDHの活性を増加させ
ることはグルコースの酸化速度を増加させ、よって全体
としてのグルコース利用を高め、加えて肝臓のグルコー
ス排出量を低下させることになり得ると考えられる。
【０００６】グルコースの酸化は、脂肪酸の酸化よりも
多くの酸素1モル当たりATP分子を産むことができ、故
に、エネルギー需要がエネルギー供給を上回るかも知れ
ない状態、例えば心筋虚血および再灌流、間歇性跛行、
脳虚血および再灌流の際に、基質利用のバランスをグル
コース代謝の方向にシフトさせることは、ATPレベルを
維持する能力、ひいては機能を改善すると期待すること
ができる。PDHの活性化はこの効果を有すると予想され
る。
【０００７】PDHを活性化できる物質は、循環している
乳酸の過剰を示す状態、例えば或る種の敗血症の病態の
治療に有益であると予想される。
【０００８】動物への急性投与後にPDHの活性を増強す
るジクロロ酢酸物質（Vary等、1988；Circ.Shock、24:3
-18）は、血糖の低下（Stacpoole等、1978、N.Engl.J.M
ed.、298、526-530）ならびに心筋虚血（BersinおよびS
tacpoole、1997；AmericanHeart Journal、134:841-85
5）および乳酸血症（Stacpoole等、1983、N.Engl.J.Me
d、309、390-396）の治療に、予想された効果を有する
ことが示されている。
【０００９】PDH E1βをコードしているcDNA配列は、以
下の受理番号：X57778、M34479、J03576、M34055、M340
56、M54788の下に、公的データベースに提出されてい
る。PDH E1βをコードしているゲノムDNA配列は、受理
番号D90086の下に提出されている。本明細書中のヒトPD
H E1β遺伝子のコード化領域および3'非翻訳領域中の全
ての位置は、別途記載のない限り、または文脈上明白で
ない限り、配列番号1（これは本出願の出願時のEMBL受
理番号X57778と等価である）中の位置を意味している。
【００１０】ヒトPDH E1β遺伝子の細胞遺伝学的位置は
3p13-q23とマッピングされている（Olsen等、Am.J.Hum.
Genet.、46、340-349、1990）。
【００１１】DNA多型性はアミノ酸配列の変異を導き、
その結果、変化した蛋白構造および機能活性を導き得
る。多型性はさらに、mRNA合成、成熟、移送および安定
性にも影響を及ぼし得る。アミノ酸変化を惹起しない多
型性（サイレント多型性）または既知のコンセンサス配
列のいずれをも変化させない多型性は、それにも拘わら
ず例えばmRNAの折り畳みまたは安定性を変化させること
による生物学的効果を持っていることがある。
【００１２】多型性の知識は、特定の医薬を用いた治療
に最も適合した患者を同定するのを助けるために使用す
ることができる（これをしばしば「薬理遺伝学」と称す
る）。薬理遺伝学はさらに、薬物選択プロセスを援助す
るため、医薬研究に使用することができる。多型性は、
ヒトゲノムのマッピングの際に、そして疾病の遺伝的要
素を解明するために使用することができる。薬理遺伝学
および多型性検出のその他の用途に関する背景の詳細に
ついて、読者に以下の参考文献を示す：Linder等(199
7)、Clinical Chemistry、43、254；Marchall（199
7）、Nature Biotechnology、15、1249；国際特許出願W
O97/40462、Spectra Biomedical；およびSchafer等、(1
998)、Nature Biotechnology、16、33。
【００１３】臨床試験は、医薬による治療に対する患者
の反応がしばしば不均質であることを示している。した
がって、薬剤の設計および治療に対して改善されたアプ
ローチの必要性が存在する。
【００１４】本発明は、ヒトPDH E1β遺伝子のコード化
領域中の単一ヌクレオチド多型性（SNP）、および、ヒ
トPDH E1β遺伝子の3'非翻訳領域（3'UTR）中の3個の単
一ヌクレオチド多型性の発見に基づくものである。
【００１５】本発明の一つの態様に従うと、配列番号1
中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の457、119
1、1198および1342位のうち1またはそれ以上の位置にあ
るヒトの核酸配列を決定し；そして、PDH E1β遺伝子中
の多型性を参照することによりその人間の体質を決定す
ることを含む、人間のPDH E1β遺伝子中の多型性の診断
のための方法が提供される。
【００１６】人間という語は、PDH仲介疾患を有するま
たは有すると疑われる人間、および、係る疾患に対する
素因または感受性を試験されるかも知れない無症候性の
人間の両者を包含する。各々の位置において、その人間
は或るアレレに関してホモ接合、またはヘテロ接合であ
り得る。
【００１７】「PDH仲介疾患」という語は、PDHのレベル
の変化またはPDHの活性の変化が治療的有益性を有する
であろう任意の疾患を意味する。
【００１８】「PDH薬」という語は、PDHのレベルを変化
させまたはPDHの活性を変化させる任意の薬物を意味す
る。PDHの活性を増強する薬物が好ましい。
【００１９】多型性という語は、単一のヌクレオチド置
換、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド除去を包含
し、挿入および除去の場合には、或る遺伝子の一つの位
置における1またはそれ以上のヌクレオチドの挿入また
は除去、ならびに可変的な数の反復DNA配列の挿入また
は除去を包含する。
【００２０】好ましくは、この多型性は、さらに以下の
ように定義される：
【００２１】好ましい方法は、以下のハプロタイプのう
ち任意の1個の診断を含む： (a) 1191C 1198C 1342A； (b) 1191A 1198C 1342C；または、 (c) 1191C 1198T 1342A。
【００２２】本発明に係る一つの態様では、好ましくは
本明細書に記載の診断方法は、配列番号1中の位置によ
り定義されるPDH E1β遺伝子の457位にある単一ヌクレ
オチド多型性が、Aおよび／またはGの存在である方法で
ある。
【００２３】本発明に係る別の態様では、好ましくは本
明細書に記載の診断方法は、配列番号1中の位置により
定義されるPDH E1β遺伝子の1191位にある単一ヌクレオ
チド多型性が、Aおよび／またはCの存在である方法であ
る。
【００２４】本発明に係る別の態様では、好ましくは本
明細書に記載の診断方法は、配列番号1中の位置により
定義されるPDH E1β遺伝子の1198位にある単一ヌクレオ
チド多型性が、Cおよび／またはTの存在である方法であ
る。
【００２５】本発明に係る別の態様では、好ましくは本
明細書に記載の診断方法は、配列番号1中の位置により
定義されるPDH E1β遺伝子の1342位にある単一ヌクレオ
チド多型性が、Cおよび／またはAの存在である方法であ
る。
【００２６】この診断方法は、好ましくは、当該配列
が、増幅不応突然変異系および制限フラグメント長多型
性から選ばれる方法によって決定される方法である。
【００２７】本発明の別の態様では、本発明者等は、PD
H仲介疾患の診断方法を提供し、この方法は、 i）個体から試料の核酸を取得し、 ii）配列番号1中の位置により定義されるPDH E1β遺伝
子の457、1191、1198および1342位のうち1またはそれ以
上の位置における変異体ヌクレオチドの存在または不在
を検出し；そして、 iii）PDH E1β遺伝子中の多型性を参照することによ
り、この個体の体質を決定する、ことを含む。
【００２８】配列番号1中の位置により定義されるPDH E
1β遺伝子の457位のアレレの変異は、A（公表されてい
る塩基）から、好ましくはGへの単一塩基置換で構成さ
れている。配列番号1中の位置により定義されるPDH E1
β遺伝子の1191位のアレレの変異は、A（公表されてい
る塩基）から、好ましくはCへの単一塩基置換で構成さ
れている。配列番号1中の位置により定義されるPDH E1
β遺伝子の1198位のアレレの変異は、C（公表されてい
る塩基）から、好ましくはTへの単一塩基置換で構成さ
れている。配列番号1中の位置により定義されるPDH E1
β遺伝子の1342位のアレレの変異は、C（公表されてい
る塩基）から、好ましくはAへの単一塩基置換で構成さ
れている。その個体の体質は、任意の1、2、3または4個
全ての位置のアレレ変異を参考にして、所望によりこの
遺伝子の既知の（または既知となる）その他の多型性を
組み合わせて決定することができる。
【００２９】核酸の被験試料は、血液、痰、皮膚、気管
支肺胞洗浄液、または個体から得られるその他の体液ま
たは組織の試料中に存在しているのが簡便である。被験
試料は、被験試料中の配列に対応する核酸配列を等しく
含み得、換言すると試料核酸中の全てまたは一部の領域
を、アレレ変異の分析の前に、任意の簡便な技術、例え
ばPCRを用いて最初に増幅できるという事が理解できる
であろう。
【００３０】本発明に係る1またはそれ以上の多型性位
置に変異ヌクレオチドがあるか無いかを検出するために
使用できる、数多くの分析法が存在するということが、
当業者には明らかであろう。一般に、アレレ変異の検出
は、突然変異判別技術、所望により増幅反応、そして所
望によりシグナル生成系を必要とする。第1表は、幾つ
かの突然変異検出技術を列挙しており、幾つかはPCRを
基礎としている。これらは幾つかのシグナル生成系と組
み合わせて使用することができ、それらから選択したも
のを第2表に列挙する。さらなる増幅技術を第3表に掲げ
る。アレレ変異の検出のための多くの現行法が、Nollau
等、Clin.Chem.、43、1114-1120、1997；および標準的
教科書、例えば「突然変異検出のための研究室プロトコ
ル」、U.Landegren編、Oxford University Press、1996
および「PCR」、第2版、NewtonおよびGraham、BIOS Sci
entific Publishers Limited、1997に総説されている。
【００３１】略語： ALEX（商標） 増幅不応突然変異系線状伸長 APEX 整列させたプライマー伸長 ARMS（商標） 増幅不応突然変異系 b-DNA 分枝DNA CMC 化学的ミスマッチ開裂 bp 塩基対 COPS 競合的オリゴヌクレオチドプライミング系 DGGE 変性勾配ゲル電気泳動 FRET 蛍光共鳴エネルギー転移 IDDM インシュリン依存性糖尿病 LCR リガーゼ連鎖反応 MASDA 多アレレ特異的診断検定 NASBA 核酸配列に基づく増幅 NIDDM インシュリン非依存性糖尿病 OLA オリゴヌクレオチドライゲーション検定 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 PDH ピルビン酸デヒドロゲナーゼ PDK ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ PDK2 ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素2 PTT 蛋白末端切除試験 RFLP 制限フラグメント長多型性 SDA 鎖置換増幅 SNP 単一ヌクレオチド多型性 SSCP 一本鎖コンホメーション多型性分析 SSR 自己持続複製 TGGE 温度勾配ゲル電気泳動3'UTR 3'非翻訳領域
【００３２】第1表 − 突然変異検出技術 一般：DNA配列決定、ハイブリダイゼーションによる配
列決定 スキャン：PTT*、SSCP、DGGE、TGGE、Cleavase、ヘテロ
二本鎖分析、CMC、酵素的ミスマッチ開裂 *注：プロモーター多型性の検出には有用でない。 ハイブリダイゼーションは以下を基礎とする： 固相ハイブリダイゼーション：ドットブロット、MASD
A、逆ドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ（DNA
チップ）。 液相ハイブリダイゼーション：タックマン（商標）- US
-5210015およびUS-5487972(Hoffmann-La Roche)、分子
ビーコン - Tyagi等(1996）、Nature Biotechnology、1
4、303；WO95/13399(Public Health Inst.、ニューヨー
ク)。 伸長は以下を基礎とする：ARMS(商標)、ALEX(商標) -
欧州特許第EP332435号B1(Zeneca Limited)、COPS - Gib
bs等(1989)、Nucleic Acids Research、17、2347。 組み込みは以下を基礎とする：ミニ配列決定、APEX 制限酵素は以下を基礎とする：RFLP、制限部位生成PCR ライゲーションは以下を基礎とする：OLA その他：インベーダー検定
【００３３】第2表 − シグナル生成または検出系 蛍光：FRET、蛍光消光、蛍光分極 - 英国特許第2228998
号(Zeneca Limited) その他：化学ルミネセンス、電気化学ルミネセンス、ラ
マン、放射性、比色、ハイブリダイゼーション保護検
定、質量分析。
【００３４】第3表 − さらなる増幅法 SSR、NASBA、LCR、SDA、b-DNA
【００３５】好ましい突然変異検出技術は、ARMS(商
標)、ALEX(商標)、COPS、タックマン、分子ビーコン、R
FLP、ならびに制限部位に基づくPCRおよびFRET技術を包
含する。
【００３６】特に好ましい方法は、ARMS(商標)およびRF
LPに基づく方法を包含する。ARMS(商標)は特に好ましい
方法である。
【００３７】さらなる態様では、本発明に係る診断法を
使用して、糖尿病、喘息、肥満、敗血症、および末梢血
管疾患といったようなPDH仲介疾患の治療において治療
的化合物の有効性を評価する。
【００３８】1またはそれ以上の上記多型性が転写レベ
ルおよび／またはメッセージの安定性に影響するか否か
を検出する検定、例えばリポーターに基づく検定を考案
することができる。
【００３９】故に、PDH E1β遺伝子の特定のアレレ変異
体を持っている個体は、異なる生理条件の下で蛋白の生
合成を調節する能力に相違を示すかも知れず、そして相
異なる疾病に反応する変化した能力を示すかも知れな
い。さらに、アレレ変異の結果生ずる蛋白調節における
相違は、薬物療法に対する個体の応答に直接的影響を及
ぼし得る。本発明に係る診断方法は、係る物質に対する
臨床的応答の予測、および治療的用量の決定の両者に対
して有用となり得る。
【００４０】さらなる態様において、本発明に係る診断
方法は、PDHにより仲介される疾病に対する個体の素因
を評価するのに使用される。これは、糖尿病、喘息、肥
満、敗血症、および末梢血管疾患ならびにPDHにより仲
介されるその他の疾病の発現に特に関連がある。本発明
は、これらの病態の発現のリスクが特に高い個体を認識
するために使用することができる。
【００４１】低頻度多型性は、後に記載するハプロタイ
プに対して特に有用となり得る。ハプロタイプとは、単
一（父系または母系）の染色体上の連鎖した多型性部位
（例えば一つの遺伝子内）に見出される一組のアレレで
ある。この遺伝子内部での組換えが無作為であるなら
ば、2nものハプロタイプ［ここで2は各々の多型性位置
におけるアレレの数であり、そしてnは多型性位置の数
である］が存在し得る。臨床応答に相関している突然変
異または多型性を同定する一つのアプローチは、関心の
持たれる集団中で同定され得る全てのハプロタイプを使
用して関連試験を実施することである。各ハプロタイプ
の頻度は最も稀なアレレの頻度によって制限を受け、そ
の結果、低頻度のアレレを伴う多型性は低頻度のハプロ
タイプのマーカーとして特に有用である。有害または異
常事象といったような或る臨床上の特徴に関連する特定
の突然変異または多型性は、その集団の中で頻度が低い
傾向があるため、低頻度多型性はこれらの突然変異の同
定の際にとりわけ有用となり得る（例えば、De Stefano
V等、Ann Hum Genet(1998)62:481-90；およびKeightle
y AM等、Blood(1999)93:4277-83）。
【００４２】さらなる態様では、本発明に係る診断方法
を、PDH E1β遺伝子の1またはそれ以上のアレレ変異体
を選択的に標的とする新たな薬物療法の開発に使用す
る。特定のアレレ変異体と、疾病の発現に対する素因ま
たは薬物療法に対する応答との間のつながりを同定する
ことは、新たな薬物の設計上、重要な影響力を有する。
その疾病プロセスに関係する変異体の生物活性を調節
し、一方ではその他の変異体に及ぼす影響を最小化する
薬物を設計することができる。
【００４３】本発明に係るさらなる診断的態様では、制
限酵素により認識される、所望により改変を施された部
位の喪失または獲得を参考にすることによって、変異体
ヌクレオチドの存在または不在を検出する。
【００４４】本発明の別の態様に従い、以下の多型性の
うち任意の一つを含む核酸：配列番号1中の位置により
定義される457位にGを有する、配列番号1の核酸；配列
番号1中の位置により定義される1191位にCを有する、配
列番号1の核酸；配列番号1中の位置により定義される11
98位にTを有する、配列番号1の核酸；配列番号1中の位
置により定義される1342位にAを有する、配列番号1の核
酸；またはその相補鎖またはそれに対するアンチセンス
鎖または少なくとも一つの多型性を含む少なくとも20の
塩基を有するそのフラグメントが提供される。
【００４５】本発明に係る別の態様は、配列番号1中の
位置により定義される1191位にCを有する、配列番号1の
核酸を含む分離された核酸；またはその相補鎖またはそ
れに対するアンチセンス配列または1191位にCを含む少
なくとも20塩基を有するそのフラグメントを提供する。
【００４６】フラグメントは少なくとも17塩基、より好
ましくは少なくとも20塩基、より好ましくは少なくとも
30塩基である。
【００４７】本発明の範囲は自然界に見出される任意の
核酸にまで拡大されるものではない。本発明に係る核酸
は、例えば天然に共存する物質があれば少なくとも部分
的にそれから精製することによって、好ましくは分離さ
れた形態となっている。
【００４８】本明細書に開示する新規な配列を、本発明
に係る別の態様で使用して、アンチセンス組み立て物の
使用により細胞中の遺伝子の発現を調節することができ
る。本発明に係る遺伝子の発現を哺乳動物細胞でダウン
レギュレーションする方法を可能にするため、例示的ア
ンチセンス発現組み立て物を、例えばpREP10ベクター
（Invitrogen Corporation）を使用して、容易に組み立
てることができる。転写物は、このタイプの組み立て物
によりトランスフェクトされた細胞内での遺伝子の翻訳
を阻害すると予想される。アンチセンス転写物は、天然
の遺伝子転写物の翻訳を阻害するのに有効であり、そし
て本明細書に記載した効果（例えば、組織生理の調節）
を誘起することができる。本明細書に開示する新規な遺
伝子mRNAの任意の部分と相補的であり、且つこれとハイ
ブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドは、治
療用途を期待できる。1997年6月17日登録の米国特許第5
639595号、「新規な薬物および試薬の同定」は、インビ
ボ活性を示すオリゴヌクレオチド配列の同定方法を詳述
しているが、これを引用して本明細書の一部とする。既
知のポリヌクレオチドから誘導したランダムオリゴヌク
レオチド配列を含む発現ベクターを細胞中に導入する。
次にこの細胞を、所望のオリゴヌクレオチドの活性に起
因する表現型について検定する。所望の表現型を有する
細胞が同定されたならば、所望の活性を有するオリゴヌ
クレオチドの配列を同定することができる。同定は、ベ
クターの回収またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅
および挿入された核酸材料を含む領域の配列決定によっ
て達成することができる。アンチセンス療法のためのア
ンチセンス分子を合成することができる。これらのアン
チセンス分子は、DNA、モノチオ燐酸塩（エステル）ま
たはメチルホスホン酸塩（エステル）のようなDNAの安
定な誘導体、RNA、2'-O-アルキルRNAのようなRNAの安定
な誘導体、またはその他の擬似オリゴヌクレオチドであ
ってよい。1997年7月29日登録の米国特許第5652355号、
「ハイブリッドオリゴヌクレオチドモノチオ燐酸塩（エ
ステル）」、および1997年7月29日登録の米国特許第565
2356号、「逆転したキメラおよびハイブリッドオリゴヌ
クレオチド」は、生理学的に安定なアンチセンス分子の
合成および効果を記載しており、これらを引用して本明
細書の一部とする。アンチセンス分子は、マイクロ注
入、リポソームカプセル化またはそのアンチセンス配列
を有するベクターからの発現によって、細胞中に導入す
ることができる。
【００４９】本発明はさらに、本発明に係る多型性を検
出することのできるヌクレオチドプライマーを提供す
る。
【００５０】本発明に係る別の態様に従い、配列番号1
中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の457、119
1、1198および1342位のうち1またはそれ以上の位置にPD
H E1β遺伝子の多型性を検出できるアレレ特異的プライ
マーが提供される。
【００５１】アレレ特異的プライマーは、ARMS（商標）
検定のための使用といったように、一般に、特定の配列
位置で1個のアレレを選択的に増幅することによりアレ
レ間の判別を可能にする、不変プライマーと共に、PCR
反応のような増幅反応において使用される。このアレレ
特異的プライマーは、好ましくは17-50ヌクレオチド、
より好ましくは約17-35ヌクレオチド、より好ましくは
約17-30ヌクレオチドである。
【００５２】アレレ特異的プライマーは、好ましくは検
出すべきアレレと正確に対応しているが、3'末端の約6-
8ヌクレオチドが検出すべきアレレに対応し、残りのヌ
クレオチドの10個まで、例えば8、6、4、2、または1個
までが、そのプライマーの性質に有意な影響を及ぼすこ
となく変化している、それらの誘導体もまた意図され
る。
【００５３】プライマーは任意の簡便な合成法を用いて
製造することができる。このような方法の例は、標準的
教科書、例えば「オリゴヌクレオチドおよび類似体のた
めのプロトコル；合成および性質」、Methods in Molec
ular Biology Series；20巻；Sudhir Agrawal編、Human
a ISBN:0-89603-247-7；1993；第1版に見出すことがで
きる。必要ならば検出を容易にするため、プライマーを
標識することができる。
【００５４】本発明に係る別の態様に従い、配列番号1
中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の457、119
1、1198および1342位のうち1またはそれ以上の位置にPD
H E1β遺伝子の多型性を検出できるアレレ特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブが提供される。
【００５５】このアレレ特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブは、好ましくは17-50ヌクレオチド、より好ましく
は約17-35ヌクレオチド、より好ましくは約17-30ヌクレ
オチドである。
【００５６】このようなプローブの設計は、通常の知識
を有する分子生物学者にとっては明らかであろう。この
ようなプローブは、任意の簡便な長さ、例えば50塩基ま
で、40塩基まで、より簡便には30塩基までの長さ、例え
ば8-25または8-15塩基長を有する。一般にこのようなプ
ローブは、当該遺伝子中の対応する野生型または変異体
の座に完全に相補的な塩基配列を含んでいるであろう。
しかしながら、必要とあらば、オリゴヌクレオチドプロ
ーブの判別力に不都合な影響を及ぼさない限り、1また
はそれ以上のミスマッチを導入することもできる。本発
明に係るプローブは、検出を容易にするため1またはそ
れ以上の標識を含んでいてよい。
【００５７】本発明に係る別の態様に従い、本発明に係
るアレレ特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび／ま
たは本発明に係るアレレ特異的プライマーを含む診断キ
ットが提供される。
【００５８】この診断キットは、本発明方法での使用の
ための適当な包装および説明を含むことができる。この
ようなキットはさらに、適当な緩衝剤、ヌクレオチド、
およびポリメラーゼ、例えば熱安定性ポリメラーゼ、例
えばtaqポリメラーゼを含むことができる。
【００５９】本発明に係る別の態様では、本発明に係る
任意の多型性を、連鎖研究の際の遺伝的マーカーとして
使用することができる。これは、それらの相対的に高い
頻度の故に、配列番号1中の位置により定義されるPDH E
1β遺伝子の457、1191および1342位の多型性に特に適用
される（下記実施例を参照されたい）。
【００６０】本発明に係る別の態様に従い、 i) 人間のPDH E1β遺伝子中の多型性の診断であって、
配列番号1中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の4
57、1191、1198および1342位のうち1またはそれ以上の
位置にある核酸の配列を決定し、そしてPDH E1β遺伝子
中の多型性を参照することにより、その人間の体質を決
定することを含む診断；および、 ii）PDH薬の有効量を投与すること、を含む、治療を必
要とする人間をPDH薬で治療する方法が提供される。
【００６１】好ましくは、その人間の体質の決定は、臨
床上有用である。臨床的有用性の例は、どの薬物もしく
は薬物群を投与するかという決定、および／または薬物
もしくは薬物群の有効量の確立を包含する。
【００６２】PDHの活性を増強する薬物は、グルコース
利用の疾病、例えば糖尿病および肥満に関連する疾病状
態、および敗血症の際に遭遇するような乳酸の過剰産生
およびその他の乳酸血症の原因に関連する疾病状態を包
含する、幾つかの疾病状態において価値がある。加え
て、PDHの活性を増強する薬物は、例えば末梢血管疾
患、冠動脈不全および或る種の心筋障害、筋運動失調お
よび脱力のような、組織への高エネルギー基質の供給が
制限されている疾病において用途を有すると期待され得
る。
【００６３】本発明に係る別の態様に従い、配列番号1
中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の457、119
1、1198および1342位のうち1またはそれ以上の位置に多
型性を有すると診断された人間においてPDH仲介疾患を
治療するための医薬を製造する際の、PDH薬の用途が提
供される。
【００６４】本発明に係る別の態様に従い、配列番号1
中の位置により定義されるPDH E1β遺伝子の457、119
1、1198および1342位のうち1またはそれ以上の位置にあ
る多型性について診断のための試験を受ける人間に、当
該薬物を投与するための、PDH薬および説明を含む医薬
のパックが提供される。
【００６５】本発明の別の態様に従い、コンピューター
により読み取り可能な媒体上に保存した、本発明に係る
少なくとも1個の新規なポリヌクレオチド配列を含む、
当該媒体が提供される。このコンピューター読み取り可
能媒体は、例えば相同性探索、マッピング、ハプロタイ
プ決定、遺伝子型決定または薬理遺伝学的分析もしくは
他の任意の生物情報科学的分析に使用することができ
る。生物情報科学、遺伝子および蛋白の分析への実用指
針、A D BaxevanisおよびB F F Ouellette編、John Wil
ey & Sons、1998を参照されたい。任意のコンピュータ
ー読み取り可能媒体、例えばコンパクトディスク、テー
プ、フロッピーディスク、ハードドライブまたはコンピ
ューターチップを使用することができる。
【００６６】本発明に係るポリヌクレオチド配列または
その一部、とりわけ本明細書に定義した多型性に関連し
そしてこれを同定する配列は、例えばハプロタイプおよ
びその他のサブグループ分け、例えば特定の薬物による
治療に対する感受性の調査の点で、個人を特徴付けるた
めの、価値ある情報源である。これらのアプローチは、
その配列情報をコンピューター読み取り可能媒体中に保
存し、次いでこの情報を、標準的生物情報科学プログラ
ム中で、または「GCC」のような現行の探索手段を用い
て配列データベースを探索するために使用することによ
り、最も容易に促進される。したがって、本発明に係る
ポリヌクレオチド配列は、配列同一性およびその他の探
索的分析のために有用なデータベース中の構成要素とし
て特に有用である。本明細書中使用する、コンピュータ
ー読み取り可能媒体中への配列情報の保存、および、
「本発明に係るポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ド配列」に関連する配列データベースにおける使用と
は、有形の媒体、例えば好ましくはコンピューターによ
り読み取り可能な形態の、コンピューターディスクに還
元され、変換されまたはその中に保存され得る、本発明
に係るポリヌクレオチドのいかなる検出可能な化学的ま
たは物理的性質をも包含する。例えば、クロマトグラフ
ィースキャンデータまたはピークデータ、写真スキャン
またはピークデータ、質量分析データ、配列ゲル（また
はその他の）データ。
【００６７】本発明は、1またはそれ以上の本発明に係
るポリヌクレオチド配列をそこに保存した、コンピュー
ター読み取り可能媒体を提供する。例えば、本発明に係
るポリヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド、本
発明に係るポリヌクレオチドで構成されるポリヌクレオ
チド、本発明に係るポリヌクレオチドの一部を含むポリ
ヌクレオチド［ここで、一部とは、本発明に係る多型性
の少なくとも一つを包含する］、一組のポリヌクレオチ
ド配列［ここで、この組は、本発明に係るポリヌクレオ
チド配列の少なくとも1個を包含する］、本発明に係る
ポリヌクレオチド配列を含むまたはこれにより構成され
るデータの組、または本明細書中で定義した多型性の少
なくとも一つを含む、その一部分、より成る群から選ば
れる構成員を含み且つそれを該媒体上に保存している、
コンピューター読み取り可能媒体が提供される。
【００６８】コンピューターに基づく配列同定を行うた
めの方法がさらに提供され、この方法は、コンピュータ
ー読み取り可能媒体中に本発明に係る多型性を含むポリ
ヌクレオチド配列を提供し；そして、この多型性含有ポ
リヌクレオチド配列を、少なくとも1個の他のポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列と比較して、同一性
（相同性）を同定する、即ち多型性の存在についてスク
リーニングする工程を含むものである。
【００６９】本発明に係る別の態様は、以下のもののう
ち任意の一つを、生物情報科学的分析に使用することで
ある： i) 本明細書に定義する任意の多型性； ii) 本明細書に定義する任意のハプロタイプ。 好ましい用途は、相同性探索、マッピング、ハプロタイ
プ決定、遺伝子型決定または薬理遺伝学的分析から選ば
れる生物情報科学的分析を含む。
【００７０】ここで本発明を以下の実施例に言及するこ
とにより説明するが、これは限定的なものではない。温
度は全て摂氏である。
【００７１】下記の実施例において、別途記載のない限
り、以下の方法論および材料を適用した。
【００７２】Perkin-Elmer Cetusより入手可能なAMPLIT
AQ（商標）またはAMPLITAQ GOLD（商標）を熱安定性DNA
ポリメラーゼの原料として使用する。
【００７３】全般的な分子生物学的手法は、「分子クロ
ーニング − 研究室マニュアル」第2版、Sambrook、Fri
tschおよびManiatis（Cold Spring Harbor Laborator
y、1989）に記載の任意の方法に従うことができる。
【００７４】電気泳動図は標準的方法で取得した：デー
タはABI377データ採集ソフトウェアにより採集し、波形
はABI Prism（商標）配列決定分析（2.1.2）によって作
製した。
【００７５】実施例1 多型性の同定 １．方法cDNAの調製 標準的実験プロトコル（ChomczynskiおよびSacchi、Ana
l.Biochem.、162、156-159、1987）を用いて、白人ドナ
ー由来のリンパ芽球セルラインからRNAを調製し、第一
鎖cDNAの作成に使用した（GublerおよびHoffman、Gen
e、25、263-269、1983）。
【００７６】鋳型の調製 鋳型は、下に開示するオリゴヌクレオチドプライマーお
よびアニーリング温度を用いてPCRによって調製した。
伸長温度は72℃、変性温度は94℃であり、各工程は1分
間であった。一般に、各反応においてcDNA 100pgを使用
し、40サイクルのPCRに付した。
【００７７】フラグメント 前進オリゴ 逆オリゴ アニーリング温度 MgCl2 1-420 1-22 397-420 62゜ 2mM 299-791 299-320 770-791 63゜ 1mM 714-1194 714-736 1171-1194 62゜ 2mM999-1410 999-1021 1388-1410 62゜ 2mM 位置は全て配列番号1中の位置を指す。
【００７８】色素−プライマー配列決定のため、前進プ
ライマーを、オリゴヌクレオチドの5'末端にM13前進配
列を含むよう修飾した（ABIプロトコルP/N 402114、App
liedBiosystems）。
【００７９】色素プライマー配列決定 M13前進プライマーを用いる色素−プライマー配列決定
は、「AmpliTaq FS」（商標）DNAポリメラーゼを伴うAB
I Prism（商標）色素プライマーサイクル配列決定コア
キットのためのABIプロトコルP/N 402114に記載の通り
とし、アニーリング温度を45℃とし、そしてDMSOを最終
濃度5%となるまでこのサイクル配列決定混合物に添加す
るという修飾を施した。
【００８０】各塩基のための伸長反応をプールし、エタ
ノール／酢酸ナトリウム沈澱させ、洗浄し、ホルムアミ
ド負荷緩衝液に再懸濁した。
【００８１】自動シークエンサー（ABI377、Applied Bi
osystems）上で4.25%アクリルアミドゲルを稼働させ
た。
【００８２】 2. 結果 新規な多型性 位置 公表されている 変異体 アミノ酸 RFLP アレレ アレレ アレレ 変化 頻度 457 A G サイレントGly +ApaI 30/50 1191 A C 3'UTR 32/54 1198 C T 3'UTR 17/541342 C A 3'UTR 32/54 位置は全て配列番号1中の位置を指す。 頻度は対照患者中の変異体アレレのアレレ頻度である。
【００８３】PDH E1βの3'UTR中の3個の共通のハプロタ
イプ：PDH E1βの3'UTRを27の個体から配列決定した。1
5人は1191、1198および1342位でホモ接合であり、下に
掲げる3つの共通ハプロタイプを示した。 (1) 1191C 1198C 1342A (2) 1191A 1198C 1342C (3) 1191C 1198T 1342A
【００８４】残りの12人は、1191、1198および1342位の
2またはそれ以上の位置でヘテロ接合であったが、全て
上のハプロタイプについてのヘテロ接合性と両立し得
た。
【００８５】推定されるハプロタイプの頻度は、 (1) 15/54 (2) 22/54 (3) 17/54 であった。
【００８６】
【配列表】 <110> AstraZeneca AB Morten, John E Smith, John C Anand, Rakesh <120> Methods <130> PDH E1beta <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1502 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatagaggac acgaccaaga tggcggcggt gtctggcttg gtgcggagac cccttcggga 60 ggtctccggg ctgctgaaga ggcgctttca ctggaccgcg ccggctgcgc tgcaggtgac 120 agttcgtgat gctataaatc agggtatgga tgaggagctg gaaagagatg agaaggtatt 180 tctgcttgga gaagaagttg cccagtatga tggggcatac aaggttagtc gagggctgtg 240 gaagaaatat ggagacaaga ggattattga cactcccata tcagagatgg gctttgctgg 300 aattgctgta ggtgcagcta tggctgggtt gcggcccatt tgtgaattta tgaccttcaa 360 tttctccatg caagccattg accaggttat aaactcagct gccaagacct actacatgtc 420 tggtggcctt cagcctgtgc ctatagtctt caggggaccc aatggtgcct cagcaggtgt 480 agctgcccag cactcacagt gctttgctgc ctggtatggg cactgcccag gcttaaaggt 540 ggtcagtccc tggaattcag aggatgctaa aggacttatt aaatcagcca ttcgggataa 600 caatccagtg gtggtgctag agaatgaatt gatgtatggg gttccttttg aatttcctcc 660 ggaagctcag tcaaaagatt ttctgattcc tattggaaaa gccaaaatag aaaggcaagg 720 aacacatata actgtggttt cccattcaag acctgtgggc cactgcttag aagctgcagc 780 agtgctatct aaagaaggag ttgaatgtga ggtgataaat atgcgtacca ttagaccaat 840 ggacatggaa accatagaag ccagtgtcat gaagacaaat catcttgtaa ctgtggaagg 900 aggctggcca cagtttggag taggagctga aatctgtgcc aggatcatgg aaggtcctgc 960 gttcaatttc ctggatgctc ctgctgttcg tgtcactggt gctgatgtcc ctatgcctta 1020 tgcaaagatt ctagaggaca actctatacc tcaggtcaaa gacatcatat ttgcaataaa 1080 gaaaacatta aatatttagt ttggacttga atatcaagtc gttgaaattt atttgaaata 1140 cttgctggca ctgcacctgg atttgtactg caagacctga ctattcataa aggaaaacga 1200 tttctaaagc aacagcaggt atttttgtac agggaagttt aaatgtgttt gtgtatggaa 1260 aactctccac tctcctcccc tagatgccat gcttcctttt gtctgttacg gttgccatgt 1320 tctttgaata acaaattata tcacatttta tcctctctca ccacaaggac aaagtatgga 1380 tgtggcagag tcctgatgaa agatgtatcc aaacaagata acttatatgt ataaaattaa 1440 agcatataat acacatttac tgttagtttg ttttgataag gaataaagga atttctaact 1500 ag 1502
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ラケッシュ・アナンド イギリス、エスケイ10・４ティジー、チェ シャー、マックルズフィールド、オルダリ ー・パーク (72)発明者 ジョン・エドワード・ノリス・モーテン イギリス、エスケイ10・４ティジー、チェ シャー、マックルズフィールド、オルダリ ー・パーク

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号1中の位置により定義されるPDH
    E1β遺伝子の457、1191、1198および1342位のうち1ま
    たはそれ以上の位置にあるヒトの核酸配列を決定し；そ
    して、PDH E1β遺伝子中の多型性を参照することにより
    その人間の体質を決定することを含む、人間のPDH E1β
    遺伝子中の多型性の診断のための方法。
  2. 【請求項２】 多型性がさらに以下のように定義され
    る： 、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 以下のハプロタイプ： (a) 1191C 1198C 1342A； (b) 1191A 1198C 1342C；または、 (c) 1191C 1198T 1342A のうちいずれか1個の診断を含む、請求項2に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 配列番号1中の位置により定義される119
    1位にCを有する、配列番号1の核酸；またはその相補鎖
    またはそれに対するアンチセンス配列または1191位にC
    を含む少なくとも20塩基を有するそのフラグメントを含
    む、分離された核酸。
  5. 【請求項５】 配列番号1中の位置により定義されるPDH
    E1β遺伝子の457、1191、1198および1342位のうち1ま
    たはそれ以上の位置にPDH E1β遺伝子多型性を検出する
    ことのできる、アレレ特異的プライマー。
  6. 【請求項６】 配列番号1中の位置により定義されるPDH
    E1β遺伝子の457、1191、1198および1342位のうち1ま
    たはそれ以上の位置にPDH E1β遺伝子多型性を検出する
    ことのできる、アレレ特異的オリゴヌクレオチドプロー
    ブ。
  7. 【請求項７】 連鎖研究の際の遺伝子マーカーとして
    の、請求項2に定義される任意の多型性の用途。
  8. 【請求項８】 配列番号1中の位置により定義されるPDH
    E1β遺伝子の457、1191、1198および1342位のうち1ま
    たはそれ以上の位置に多型性を有すると診断された人間
    においてPDH仲介疾患を治療するための医薬の製造にお
    ける、PDH薬の用途。
  9. 【請求項９】 生物情報科学的分析における、下記のも
    の： i) 請求項1または2に定義される任意の多型性；また
    は、 ii) 請求項3に定義される任意のハプロタイプ；のうち
    任意の一つの用途。
  10. 【請求項１０】 相同性探索、マッピング、ハプロタイ
    プ決定、遺伝子型決定または薬理遺伝学的分析から選ば
    れる生物情報科学的分析を含む、請求項9に記載の用
    途。
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