JP2001228147A - ホルモン様作用物質測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課 題】 ホルモン様作用物質を特異的に吸着し、
かつ容易に脱着し、さらにホルモン様作用物質等の測定
妨害物質を含有していない高分子担体を前処理に用いる
ことにより、試料中のホルモン様作用物質を精度良く測
定できる方法を提示することである。 【解決手段】 試料中のステロイドホルモン類またはホ
ルモン様作用物質類を測定する方法において、少なくと
も下記の工程を含む測定方法。 （ａ）高分子担体に試料を接触させて、試料中のステロ
イドホルモン類またはホルモン様作用物質類を該担体に
吸着させる工程、（ｂ）ステロイドホルモン類またはホ
ルモン様作用物質類が吸着された高分子担体と試料媒体
を分離する工程、（ｃ）脱着媒体を高分子担体に接触さ
せて、ステロイドホルモン類または／およびホルモン様
作用物質類を脱着させる工程、（ｄ）脱着液中のステロ
イドホルモン類またはホルモン様作用物質類を免疫法ま
たはクロマト法で測定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のステロイ
ドホルモン類およびホルモン様作用物質類を測定する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】環境中に排出された生物由来のステロイ
ドホルモン類や一部の化学物質は、生体内に取り込まれ
るとホルモン類似作用を示すものがある。これらの化学
物質は内分泌攪乱物質と呼ばれ、動物の生殖機能等に悪
影響を及ぼすことがわかってきた。従ってこれらの物質
の正確な測定は極めて重要である。これらのホルモン様
作用物質は極めて微量であるため、簡便で高精度な測定
法の確立が必須である。従来よりガスクロマトグラフィ
ー（ＧＣ）法、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
法、あるいはこれらの方法とマススペクトル（ＭＳ）分
析法を組み合わせた方法、あるいは抗原抗体反応に基づ
く免疫法などが知られている。

【０００３】これらの高精度分析法は、ほぼ同様の前処
理法により測定試料が調製される。この前処理は、混入
物の非常に多い環境水あるいは環境物質からの抽出水か
ら、目的とするホルモン様作用物質を効率よく抽出し、
測定の妨害となる物質を除去する目的で行われる。従っ
て測定結果は、この前処理操作に大きく影響を受ける。
最も汎用されている前処理方法として、固相抽出法があ
る。これは高分子などの担体に試料を接触させ、測定目
的の成分であるホルモン様作用物質を担体に吸着させ、
他の妨害成分は洗い流して除去する。その後吸着した目
的物質を別の溶媒で脱着させて、上記の測定に供する方
法である。

【０００４】一般に固相抽出に用いられる担体として
は、スチレン−ジビニルベンゼン系の担体や２−ビニル
ピロリドン−ジビニルベンゼン系の担体（LC GC、１５
（２）、１５２−１５８、１９９７）、あるいは、ジビ
ニルベンゼン−アクリル酸エステル共重合体（特開平６
−２５８２０３）などが開示されている。しかしこれら
の固相抽出用担体は、ホルモン様作用物質の抽出に特異
的でなく、吸着能や脱着能が不十分で定量性に問題があ
った。また、微量なホルモン様作用物質を測定する際に
妨害となる成分を溶出してしまう問題があった。これは
高分子担体の原材料としてベンゼン環を有する化合物を
使用していることなどに由来しており、洗浄操作などに
よっても極めて除去されにくい。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、環境中
に存在する微量のホルモン様作用物質を測定するために
は、妨害となる成分の溶出のない前処理用担体が必要で
あるが、現在までにその条件を満たす技術は知られてい
ない。本発明の目的は、ホルモン様作用物質を特異的に
吸着し、かつ容易に脱着し、さらにホルモン様作用物質
等の測定妨害物質を含有していない高分子担体を前処理
に用いることにより、試料中のホルモン様作用物質を精
度良く測定できる方法を提示することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】発明者らは、上記目的を
達成すべく鋭意検討した結果、特定の高分子担体を用い
れば、ホルモン様作用物質のような微量物質の測定時に
妨害となるような成分を溶出せず、かつ、ホルモン様作
用物質を特異的に吸着し、かつ容易に脱着できるという
知見を得た。さらに検討を重ね本発明に至った。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）試料中のステ
ロイドホルモン類またはホルモン様作用物質類を測定す
る方法において、少なくとも下記の工程を含む測定方
法、（ａ）高分子担体に試料溶液を接触させて、ステロ
イドホルモン類またはホルモン様作用物質類を該担体に
吸着させる吸着工程、（ｂ）ステロイドホルモン類また
はホルモン様作用物質類が吸着された高分子担体と試料
を分離する工程、（ｃ）脱着溶媒を担体に接触させて、
ステロイドホルモン類またはホルモン様作用物質類を脱
着させる工程、（ｄ）脱着液中のステロイドホルモン類
またはホルモン様作用物質類を免疫法またはクロマト法
で測定する工程、（２）ステロイドホルモン類またはホ
ルモン様作用物質が、アルキルフェノール類、ビスフェ
ノールＡ、フタル酸エステル類、ダイオキシン類および
エストロジェン類からなる群から選ばれる１又は２種以
上である前記（１）記載の測定方法、（３）高分子担体
が、アクリル酸エステルまたは／およびメタクリル酸エ
ステルである架橋性単量体を重合して得られる架橋重合
体である前記（１）または（２）記載の測定方法、
（４）高分子担体が、平均粒径が０．１μｍ〜１ｃｍで
かつ比重が０．８〜３．０である前記（１）〜（３）い
ずれかに記載の測定方法、および（５）免疫法が酵素免
疫法である前記（１）〜（４）いずれかに記載の測定方
法、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明でいう「ステロイドホルモ
ン類またはホルモン様作用物質類」とは、生物由来のス
テロイドホルモン類、および生体内においてホルモン類
似作用が報告されている物質またはホルモン類似作用が
疑われる物質（以下、まとめてホルモン様作用物質とい
う）であり、いわゆる内分泌攪乱物質と呼ばれる物質を
含む。例えば、ダイオキシン類；ポリ塩化ビフェニール
類；４−ｔ−ブチルフェノール、４−ｎ−ヘプチルフェ
ノール、ノニルフェノール、４−ｔ−オクチルフェノー
ルなどのアルキルフェノール類；ビスフェノールＡ；
２，４−ジクロロフェノール；フタル酸ジ―２−エチル
ヘキシル、フタル酸ジ―ｎ−ブチル、フタル酸ジエチル
などのフタル酸エステル類；アジピン酸ジ―２−エチル
ヘキシル；ベンゾ（ａ）ピレン、ベンゾフェノン、４−
ニトロトルエン、スチレン、スチレン２量体、スチレン
３量体などの芳香族化合物；エストラジオールなどのエ
ストロジェン類などが挙げられる。その他、上記ホルモ
ン様作用物質には、第２６回日本環境化学会講演会予稿
集（２〜３頁、１９９８年）に記載があるような物質も
含まれる。本発明の方法は、特にアルキルフェノール
類、ビスフェノールＡ、フタル酸エステル類、ダイオキ
シン類、エストロジェン類について好適に適用すること
が可能である。

【０００９】本発明方法に用いられる「高分子担体」
は、アクリル酸エステルあるいはメタクリル酸エステル
（以下、「アクリル酸またはメタクリル酸」を「（メ
タ）アクリル酸」と記す）である架橋性単量体を重合し
て得られる架橋重合体よりなる高分子担体が好ましい。
該架橋重合体は、（メタ）アクリル酸エステルである架
橋性単量体を重合開始剤の存在化において重合反応を行
うことにより得られる。

【００１０】本発明方法の高分子担体を構成する（メ
タ）アクリル酸エステルは、公知の（メタ）アクリル酸
エステルが用いてよい。例えば、エチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）
アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、
トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポ
リプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ
テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレートなど
のアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類；ト
リメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメ
チロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメ
チロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメ
チルロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメ
チルロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、ジペン
タエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ジトリ
メチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、１，
３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，
６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９
−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチ
ルグリコールジ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ
ー１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒド
ロキシ−１−アクリロキシ−３−メタクリロキシプロパ
ン、ウレタン（メタ）ジアクリレート、グリセロールジ
（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタ
クリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロシキ−４，
７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ
（メタ）アクリロシキ−４，８−ジオキサウンデカン−
２，６，１０−トリオールなどの（メタ）アクリル酸エ
ステルの架橋性単量体が挙げられる。これらは２種以上
混合して用いてもよい。

【００１１】またこれらの架橋性単量体の他に、非架橋
性の（メタ）アクリル酸エステルを添加してもよい。例
えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メ
タ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ス
テアリル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）
アクリレート類；ヒドロキシメチル（メタ）アクリレー
ト、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシ
ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、グリシ
ジル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。

【００１２】これらの非架橋性（メタ）アクリル酸エス
テルを用いる場合の使用量は、上記架橋性（メタ）アク
リル酸エステル１００重量部に対して０〜２０重量部で
あることが好ましい。またこれらは２種以上混合して用
いてもよい。

【００１３】また本発明方法に用いられる高分子担体を
構成する単量体としては、上記（メタ）アクリル酸エス
テル以外の単量体を（メタ）アクリル酸エステルに混合
して用いてもよい。これらの単量体としては、下記に挙
げられる単量体以外の単量体、例えばトリアリルシアヌ
レート、トリアリルイソシアヌレートなどが挙げられ
る。

【００１４】（メタ）アクリル酸エステル以外の単量体
を用いる場合の使用量は、（メタ）アクリル酸エステル
単量体１００重量部に対して０〜２０重量部であること
が好ましい。またこれらは２種以上混合して用いてもよ
い。

【００１５】本発明方法に用いられる高分子担体は、
（メタ）アクリル酸エステル単量体のみで構成されるこ
とが好ましく、特に（メタ）アクリル酸エステルの架橋
性単量体のみで構成されることがより好ましく、その中
でもアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートのみ
で構成されることが最も好ましい。

【００１６】以下の（イ）〜（ロ）の単量体群は、本発
明方法に用いられる高分子担体の原材料として用いるこ
とを制限することが好ましい。 （イ）スチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼ
ンなどのスチレン系；エチレン、プロピレンなどのオレ
フィン系単量体；ブタジエンなどのジエン系単量体、フ
ェノキシエチル（メタ）アクリレート、フェノキシエチ
レングリコール（メタ）アクリレート、ジメチロールト
リシクロデジカンジ（メタ）アクリレート等の（メタ）
アクリル酸エステルは用いることを制限することが好ま
しい。これらのベンゼン環を有する単量体や直鎖、環状
あるいは分岐脂肪族系単量体からなる重合体は疎水性が
強く、吸着されたホルモン様作用物質の脱着が困難だか
らである。また、これらの重合体は有機溶媒を吸着しや
すいので、有機溶媒による脱着処理の際にこの有機溶媒
を吸着してしまい、脱着が定量的に行われにくい。さら
に、これらの原材料中の不純物質が吸着工程に悪影響を
及ぼすからである。 （ロ）また（メタ）アクリル酸、イタコン酸、２−ジエ
チルアミノエチル（メタ）アクリレートなどのイオン交
換性の官能基を有する単量体も好ましくない。これらの
イオン交換基は、ホルモン様作用物質の吸着を阻害する
からである。 （ハ）さらにホルモン様作用物質と類似の構造を有する
単量体；例えばビスフェノールＡ構造を有する２，２−
ビス｛４−［（メタ）アクリロキシエトキシ］フェニ
ル｝プロパン、２，２−ビス｛４−［（メタ）アクリロ
キシ・ジエトキシ］フェニル｝プロパン、２，２−ビス
｛４−［（メタ）アクリロキシ・ポリエトキシ］フェニ
ル｝プロパン、ノニルフェノキシポリエチレングリコー
ル（メタ）アクリレートなどは、ホルモン様作用物質の
混入が考えられるので使用しない。

【００１７】（イ）および（ロ）については、場合によ
っては、悪影響のでない範囲で添加することも可能であ
るが、その添加量は、上記（メタ）アクリル酸エステル
単量体１００重量部に対して０〜１０重量部であること
が好ましい。（ハ）は用いない。

【００１８】本発明方法に用いられる高分子担体は、上
記単量体あるいは単量体混合物が重合可能な公知の重合
方法により調製することができる。好ましくは分散媒中
に単量体を分散させ、重合開始剤存在下で重合する方
法、例えば懸濁重合法、分散重合法、乳化重合法などの
方法が挙げられる。特に懸濁重合法が簡便で好ましい。
懸濁重合法で行う場合は、例えばポリビニルアルコール
やポリビニルピロリドンなどの分散剤が溶解した水性分
散媒に上記単量体を分散させ、重合開始剤存在下で撹拌
しながら昇温することにより、重合反応を行うことがで
きる。但し分散剤として界面活性剤を使用することは好
ましくない。残存する界面活性剤は、高分子担体として
測定に使用する際に溶出してくる可能性があり、さら
に、高分子担体とホルモン様作用物質との相互作用を阻
害するためである。一方、製造設備が複雑で重合効率が
低く、重合後の溶出物発生が考えられるエネルギー線重
合などは好ましくない。

【００１９】重合時には、公知の添加剤を添加すること
もできる。例えば重合体を大孔径の多孔質体とするため
の多孔質化剤（相分離剤）、連鎖移動剤、ｐＨ調節剤な
どである。このうち多孔質化剤としては、イソアミルア
ルコールやオクタノールなどのアルコール類やヘキサン
などの脂肪族系炭化水素などが好都合に用いられるが、
キシレンやトルエンなどの芳香族系炭化水素およびカプ
リン酸メチル、ラウリン酸メチル、アジピン酸ジイソブ
チルなどのアルキルエステル類は通常は好ましくない。
これらもまた残存すると、これら自体および混入物が測
定時に溶出し、測定の妨害となる可能性があるからであ
る。

【００２０】重合後、得られた架橋重合体を洗浄して乾
燥することにより本発明方法に用いられる高分子担体が
得られる。洗浄は、有機溶媒で複数回洗浄する必要があ
る。また好ましくは複数種の有機溶媒で複数回洗浄す
る。洗浄に使用する有機溶媒は、用いた単量体によって
も異なるが、例えば、メタノール、エタノールなどのア
ルコール類、アセトン、ヘキサン、ジクロロエタンなど
ベンゼン環を含まない公知の有機溶媒が用いられる。ま
た、本発明方法に用いられる高分子担体は、上記単量体
あるいは単量体混合物から重合された重合体を原料とし
て、公知の成形方法、例えば射出成形法、押出成形法、
あるいはブロー成形法などによっても調製することがで
きる。また、本発明に用いられる高分子担体は、その他
の形状、例えばフィルム状、膜状、フィルター状など、
排水と接触できる形状であればよい。さらに、該高分子
担体は、上記単量体の重合体が表面層を形成する被覆構
造体であってもよい。被覆されるコア部分の素材は特に
制限がないが、使用環境下で形状が保持される程度の強
度を有する物質で形成され、かつ、外部に疎水性物質、
特にホルモン様作用物質の溶出がない物質で構成される
必要がある。被覆構造体とされた場合の高分子担体の場
合においても、その形状は特に制限はなく、例えば、粒
子状、フィルム状、膜状、フィルター状など排水と接触
できる形状であればよい。

【００２１】本発明方法に用いられる高分子担体の形状
は特に制限されないが、粒子状が好ましい。またその細
孔分布の制限もなく、使用環境下で形状が維持される強
度を有する程度の多孔性であってもよいし、ミクロポア
構造であってもよい。また発泡体であってもよい。ま
た、粒子状である場合、平均粒径が０．１μｍ〜１ｃｍ
でかつ比重が０．８〜３．０であることが好ましい。こ
れらの範囲を逸脱した場合は取扱いが困難になるためで
ある。

【００２２】本発明方法における吸着工程では、まず上
記高分子担体に試料溶液を接触させ、試料中のホルモン
様作用物質が高分子担体と相互作用を起こすことにより
吸着される。吸着工程に供される試料溶液は、あらかじ
め濃縮・抽出・洗浄などの前処理操作を行ったものでも
よい。該工程は試料に高分子担体を分散させることによ
り行うことが好ましい。分散させる方法は特に制限がな
く、高分子担体を収納した容器に試料を添加してもよい
し、試料を含む容器に高分子担体を添加してもよい。ま
た吸着工程時に撹拌を行ったり、温度制御などを行って
も良い。

【００２３】本発明方法における分離工程とは、吸着工
程を経た試料と高分子担体を分離させる工程であり、そ
の方法は特に制限がないが、濾過または沈降による方法
が好ましい。

【００２４】本発明方法における分離工程として濾過に
よる方法を採用した場合、高分子担体を含む試料溶液
を、試料溶液は通過するが高分子担体は通過しない濾過
装置に導入し、高分子担体をトラップして試料溶液を通
過させることにより分離を行う。濾過装置は、特に制限
がなく公知のものであれば何れでもよいが、フィルター
構造を有するものが好ましい。この場合のフィルターの
材質は、例えば、金属製、樹脂製、布製、紙製またはセ
ラミックス製など、十分な強度があれば公知の材質を使
用できる。但し、ホルモン様作用物質の溶出がないこと
が必要である。またフィルターの構造、形状、大きさに
も特に制限がない。また通液方法にも特に制限はない。

【００２５】本発明方法における分離工程として沈降に
よる方法を採用した場合、試料溶液中の高分子担体を沈
降させることにより、高分子担体と上清である処理済み
の試料を分離する。例えば高分子担体を含む試料を静置
させたり、遠心分離するという方法が挙げられる。

【００２６】また本発明方法に用いられる高分子担体を
カラムに収納することにより、上記吸着工程と分離工程
を連続的に行うこともできる。すなわち、この方法で
は、まず高分子担体が充填されたカラムに、試料溶液を
添加すると、カラム内において試料中のホルモン様作用
物質が高分子担体に接触して吸着されるという吸着工程
を経て、該ホルモン様作用物質が吸着除去された試料は
カラム出口より排出されるため、分離工程も連続的に行
うことになる。

【００２７】本発明方法に用いられるカラムは、高分子
担体を収納する容器であるカラム筐体と、高分子担体は
通過しないが試料溶液は通過するフィルターからなる、
公知の構造のものが用いられる。カラム筐体は、一つ以
上の流入口と、一つ以上の排出口を有し、その内部に高
分子担体が収納される構造であればよく、形状、大きさ
は特に制限がない。密閉構造であっても開放構造であっ
てもよい。また排出側にはフィルターが設置されている
が、その構造、形状、大きさにも特に制限はない。ま
た、流入側にも同様のフィルターを設置してもよい。カ
ラム筐体は、金属製、樹脂製、セラミックス製、または
ガラス製など公知の材質でよいが、上記ホルモン様作用
物質の溶出がないものに限られる。また、フィルターは
紙製、布製、金属製、樹脂製、セラミックス製、または
ガラス製など公知の材質でよいが、上記ホルモン様作用
物質の溶出のないものに限られる。

【００２８】また試料のカラムへの流入・排出方法も特
に制限はなく、送液ポンプで通液しても重力を利用して
通液してもよい。さらに排出側より吸引したり、流入側
より加圧してもよい。試料溶液は常に通液されていても
よいし、カラムに導入後通液を停止して吸着工程を行っ
た後、再び通液を開始して処理済みの試料溶液を排出し
て分離工程を行ってもよい。

【００２９】本発明における脱着工程とは、ホルモン様
作用物質が吸着された高分子担体に、脱着媒体として脱
着溶媒を接触させて、該ホルモン様作用物質を高分子担
体より脱着させることである。脱着溶媒は、ホルモン様
作用物質が溶解しやすく、高分子担体が変性しないもの
であれば特に制限はないが、後処理のしやすい、例え
ば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール
などのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンな
どのケトン類、ジオキサン、ジメチルホルムアミドなど
が好ましい。またこれらの混合物や水溶液、緩衝液でも
よい。

【００３０】これらの脱着溶媒を高分子担体に接触させ
る方法は特に制限がなく、高分子担体が収納された容器
（カラムを含む）に脱着溶媒を添加すればよい。必要に
応じて撹拌、加温などをしてもよい。

【００３１】本発明の測定工程においては脱着溶媒中の
ホルモン様作用物質を免疫法またはクロマト法で測定す
る。必要に応じて、脱着溶媒を高分子担体から分離して
濃縮、濾過などの処理を施してもよい。本発明方法で用
いられる免疫法としては、公知の原理に基づく方法また
はそれに準ずる方法が採用されてよく、例えば測定対象
物質の抗体や抗原を用いて抗原抗体反応を起こさせて凝
集度合いを測定したり、標識抗体を用いて反応させた
後、標識物質を測定する方法が挙げられる。特に標識化
合物に酵素を用いた酵素免疫法が好ましい。

【００３２】本発明方法で用いられるクロマト法は、ガ
スクロマトグラフィー法あるいは液体クロマトグラフィ
ー法が好ましい。またこれらのクロマトグラフィーにマ
ススペクトル分析装置を付属した方法でもよい。

【００３３】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。なお、％は重
量％を示す。 〔実施例１〕トリエチレングリコールジメタクリレート
（新中村化学工業株式会社製）５００ｇに、重合開始剤
として過酸化ベンゾイル（キシダ化学株式会社製）１．
０ｇを溶解した。これを４％ポリビニルアルコール水溶
液２５００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下
で８０℃に昇温した。８０℃で２４時間重合した後、内
容物をイオン交換水で３回、アセトンで１回、メタノー
ルで４回洗浄した。洗浄後乾燥して高分子担体を得た。
平均粒径は３０μｍ、比重は１．２であった。

【００３４】〔実施例２〕エチレングリコールジメタク
リレート（新中村化学工業株式会社製）４００ｇおよび
テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇの混
合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを
溶解した。これを２％ポリビニルアルコール水溶液２５
００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下で８０
℃に昇温した。８０℃で２４時間重合した後、内容物を
イオン交換水で３回、アセトンで１回、エタノールで４
回洗浄した。洗浄後乾燥して高分子担体を得た。平均粒
径は１０μｍ、比重は１．２であった。

【００３５】〔実施例３〕テトラエチレングリコールジ
メタクリレート（新中村化学工業株式会社製）４００ｇ
に、メチルメタクリレート１００ｇ、重合開始剤として
過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。これを１％ポリ
ビニルアルコール水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら分
散させ、窒素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で２
４時間重合した後、内容物をイオン交換水で３回、アセ
トンで１回、エタノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥し
て高分子担体を得た。平均粒径は１００μｍ、比重は
１．２であった。

【００３６】〔比較例１〕スチレン（和光純薬株式会社
製）２００ｇ及びジビニルベンゼン（キシダ化学株式会
社製）３００ｇの混合物に、重合開始剤として過酸化ベ
ンゾイル１．０ｇを溶解した。これを４％ポリビニルア
ルコール水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら分散させ、
窒素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で２４時間重
合した後、内容物をイオン交換水で３回、アセトンで１
回、エタノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥して高分子
担体を得た。平均粒径は３０μｍ、比重は１．２であっ
た。

【００３７】〔比較例２〕２，２−ビス｛４−［（メ
タ）アクリロキシ・ジエトキシ］フェニル｝プロパン
（Ａ−ＢＰＥ−４：新中村化学工業株式会社製）５００
ｇに、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶
解した。これを４％ポリビニルアルコール水溶液２５０
０ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下で８０℃
に昇温した。８０℃で２４時間重合した後、内容物をイ
オン交換水で３回、アセトンで１回、エタノールで４回
洗浄した。洗浄後乾燥して高分子担体を得た。平均粒径
は３０μｍ、比重は１．２であった。

【００３８】〔比較例３〕Ｎ−ビニルピロリドン（和光
純薬株式会社製）２００ｇおよびジビニルベンゼン３０
０ｇの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル
１．０ｇを溶解した。これを４％ポリビニルアルコール
水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲
気下で８０℃に昇温した。８０℃で２４時間重合した
後、内容物をイオン交換水で３回、アセトンで１回、エ
タノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥して高分子担体を
得た。平均粒径は３０μｍ、比重は１．２であった。

【００３９】〔比較例４〕ジビニルベンゼン（三共化成
株式会社製）１００ｇ、エチレングリコールジメタクリ
エート（新中村工業化学株式会社製）１００ｇ、酢酸ブ
チル（和光純薬株式会社製）２００ｇ、イソアミルアル
コール（和光純薬株式会社製）５０ｇ、および重合開始
剤としてアゾビスイソブチロニトリル（和光純薬株式会
社製）１．０ｇの混合液を０．２％のメチルセルロール
水溶液１Ｌに懸濁し、撹拌しながら８０℃で６時間反応
させた。洗浄後乾燥させて吸着剤を得た。平均粒径は６
０μｍ、比重は１．１であった。

【００４０】〔試験例１〕上記実施例および比較例で調
製した高分子担体からの、ホルモン様作用物質などの疎
水性物質の溶出の有無を確認した。各高分子担体１ｇを
メタノール１０ｍＬに分散させてよく撹拌した。この分
散液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上清を
採取し、上清を遠心エバポレータで１ｍＬに濃縮した
後、その１００μＬをＨＰＬＣに注入することにより、
高分子担体から上清メタノール中に溶出した疎水性物質
を測定した。ＨＰＬＣの条件を下記に示す。また得られ
たクロマトグラムを図１〜３に示す。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＨＰＬＣ測定条件 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− カラム ：ＲＰ−１８ＧＰ（和光純薬株式会社製：４．６×２５０ｍｍ） 溶離液 ：Ａ液＝０．０１Ｎ塩酸：アセトニトリル＝７０／３０（容量比） Ｂ液＝０．０１Ｎ塩酸：アセトニトリル＝３０／７０（容量比） 溶出条件：Ａ液１００％からＢ液１００％へのリニアグラジエント（３０分） 検出波長：２１０ｎｍ 注入量 ：１００μＬ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００４１】図１は、ビスフェノールＡ（以下、「ＢＰ
Ａ」という）およびノニルフェノール（以下、「ＮＰ」
という）の標準品（いずれも和光純薬株式会社製）、図
２は、実施例１の高分子担体からの溶出物を測定した結
果である。図２では、ＢＰＡおよびＮＰの溶出位置にピ
ークが確認されず、実施例１からの溶出は確認されなか
った。実施例２および３の高分子担体も同様の結果であ
った。一方比較例１の高分子担体からの溶出物を測定し
た結果を図３に示す。ＮＰおよびＢＰＡの溶出位置にピ
ークが確認されただけでなく、その他にも多くの疎水性
物質の溶出が確認された。また比較例２〜４の高分子担
体からの溶出物を測定した結果も図３と同様に疎水性物
質が多く溶出した。特に、比較例２ではＢＰＡ溶出位置
に大きなピークが出現した。これは比較例２で用いた単
量体（Ａ−ＢＰＥ−４）がＢＰＡ構造を含むため、ＢＰ
ＡあるいはＢＰＡ類似構造の不純物が多く含まれ、溶出
してきたものと思われる。これらのピークは高分子担体
を繰り返し洗浄しても消去できなかった。

【００４２】以上から、実施例１〜３で得られた本発明
方法に用いられる高分子担体は、担体からのホルモン類
作用物質などの疎水性物質溶出がほとんどないので、ホ
ルモン様作用物質の測定に有効である。一方、従来技術
により調製した比較例１〜４の高分子担体は、ホルモン
様作用物質などの疎水性溶出物が多く、ホルモン様作用
物質の測定には使用できない。

【００４３】〔試験例２〕上記実施例および比較例で調
製した高分子担体のホルモン様作用物質の吸着性能を確
認した。 まず実施例１の高分子担体を用いてＢＰＡの
吸着性能を確認した。ＢＰＡ標準原液（和光純薬株式会
社製）からＢＰＡ １００ｎｇ／ｍＬの１０％メタノー
ル水溶液を調製し、これに０.１ｇの高分子担体を分散
させ、よく撹拌した。得られた分散液を３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離した後上清を採取し、上清を遠心エ
バポレータで蒸発乾固させた後、ＥＬＩＳＡ用リン酸緩
衝液に溶解して、ＥＬＩＳＡ系で測定を行った。

【００４４】ＥＬＩＳＡ系での分析は、以下の手法で行
った。抗ＢＰＡ抗体固相化プレート（（株）矢内原研究
所製）に検体５０μＬを添加し、さらにＨＲＰ（Horse
Radish Peroxidase）標識ＢＰＡ５０μＬを添加して室
温で２時間反応させた。プレートを洗浄した後、ｏ−フ
ェニルジアミン（ＯＰＤ）を添加して１５分反応させ、
４９２ｎｍで吸光度を測定した。

【００４５】高分子担体を用いずに同様の操作を行った
場合の上清中のＢＰＡ量を１００とした場合の相対比較
により吸着率を求めた。結果を表１に示す。１００％の
ＢＰＡが吸着された。その他のホルモン様作用物質につ
いても同様に測定を行ったところ、ＢＰＡと同様にその
９９％以上が吸着された（表１）。また実施例２および
３において調製された高分子担体においても、実施例１
の高分子担体と同様に良好な吸着率を示した。一方、比
較例1では、ＢＰＡ吸着率が１５０％以上となった。こ
れは高分子担体自体からの溶出のためと考えられる。一
方、その他の物質に対しては、いずれも７０％以下と吸
着率が極めて低かった。比較例２〜４でも同様の結果で
あった。

【００４６】

【表１】

【００４７】〔試験例３〕高分子担体０．１ｇを容量３
ｍＬのポリプロピレン製のカラムに充填した。これに各
濃度のＢＰＡ標準液（０．１〜２０００ｎｇ／ｍＬの１
０％メタノール水溶液）を添加した。次に脱着液として
メタノールを６ｍＬ通液して吸着物質を脱着した。この
脱着液を遠心エバポレータで蒸発乾固させた後、ＥＬＩ
ＳＡ用緩衝液に溶解して、上記と同様のＥＬＩＳＡ系で
測定を行った。ＢＰＡ濃度と吸光度と関係を図４に示
す。本発明の方法により広範囲の濃度においてＢＰＡが
正確に測定できることがわかった。

【００４８】〔発明の効果〕本発明の測定方法は、高分
子担体自体からホルモン様作用物質のような微量物質の
測定時に妨害となるような成分を溶出せず、かつ、ホル
モン様作用物質を特異的に吸着し、かつ容易に脱着でき
る高分子担体を用いることにより試料または試料を含む
環境水中のステロイドホルモン類あるいはホルモン様作
用物質を精度よく測定できるという効果を有す。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＰＡおよびＮＰの標準品の溶出測定の結果を
示す。

【図２】実施例１の高分子担体からの溶出測定の結果を
示す。

【図３】比較例１の高分子担体からの溶出測定の結果を
示す。

【図４】ＢＰＡ濃度と吸光度との関係を示す。

【符号の説明】

１ ＢＰＡの溶出ピーク ２ ＮＰの溶出ピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川辺 俊樹 山口県新南陽市開成町4560 積水化学工業 株式会社内 (72)発明者 横井 正之 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 矢内原 昇 静岡県富士宮市栗倉2480番地の１ 株式会 社矢内原研究所

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中のステロイドホルモン類またはホ
   ルモン様作用物質類を測定する方法において、少なくと
   も下記の工程を含む測定方法。 （ａ）高分子担体に試料を接触させて、試料中のステロ
   イドホルモンまたはホルモン様作用物質類を該担体に吸
   着させる工程、（ｂ）ステロイドホルモン類またはホル
   モン様作用物質類が吸着された高分子担体と試料媒体を
   分離する工程、（ｃ）脱着媒体を高分子担体に接触させ
   て、ステロイドホルモン類または／およびホルモン様作
   用物質類を脱着させる工程、（ｄ）脱着液中のステロイ
   ドホルモン類またはホルモン様作用物質類を免疫法また
   はクロマト法で測定する工程、
2. 【請求項２】 ステロイドホルモン類またはホルモン様
   作用物質が、アルキルフェノール類、ビスフェノール
   Ａ、フタル酸エステル類、ダイオキシン類およびエスト
   ロジェン類からなる群から選ばれる１又は２種以上であ
   る請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 高分子担体が、アクリル酸エステルまた
   は／およびメタクリル酸エステルである架橋性単量体を
   重合して得られる架橋重合体である請求項１または２記
   載の測定方法。
4. 【請求項４】 高分子担体が、平均粒径が０．１μｍ〜
   １ｃｍでかつ比重が０．８〜３．０である請求項１〜３
   いずれかに記載の測定方法。
5. 【請求項５】 免疫法が酵素免疫法である請求項１〜４
   いずれかに記載の測定方法。