JP2001218596A - 多剤耐性蛋白の活性測定方法 - Google Patents
多剤耐性蛋白の活性測定方法Info
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- JP2001218596A JP2001218596A JP2000029832A JP2000029832A JP2001218596A JP 2001218596 A JP2001218596 A JP 2001218596A JP 2000029832 A JP2000029832 A JP 2000029832A JP 2000029832 A JP2000029832 A JP 2000029832A JP 2001218596 A JP2001218596 A JP 2001218596A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 疎水性基質の脂質二重層中への分配や、基質
の膜を通しての受動的分散による障害を排除し、リアル
タイムで正確に、基質の多剤耐性蛋白への親和性を評価
する。 【解決手段】 多剤耐性蛋白と基質との反応にともなう
ＡＴＰ消費を分析することにより多剤耐性蛋白の基質特
異性を評価する。
の膜を通しての受動的分散による障害を排除し、リアル
タイムで正確に、基質の多剤耐性蛋白への親和性を評価
する。 【解決手段】 多剤耐性蛋白と基質との反応にともなう
ＡＴＰ消費を分析することにより多剤耐性蛋白の基質特
異性を評価する。
Description
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、多剤耐性
蛋白の活性測定方法に関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、種々の医薬品等の生理活性物質
や内分泌かく乱物質等の毒性物質のスクリーニング法と
して有用な、多剤耐性蛋白の活性評価方法に関するもの
である。
蛋白の活性測定方法に関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、種々の医薬品等の生理活性物質
や内分泌かく乱物質等の毒性物質のスクリーニング法と
して有用な、多剤耐性蛋白の活性評価方法に関するもの
である。
【従来の技術とその課題】多薬剤抵抗性関連タンパク
質、すなわちこの出願の発明が対象とする多剤耐性蛋白
（ＭＲＰ）は、多薬剤抵抗性（ＭＤＲ）を与える物質と
して、現在までに知られている２種類の膜内在性タンパ
ク質のうちの１つであり、また、もう１つの物質とは、
Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−gp）である。これら２つの
タンパク質は、構造および機能においてほとんど類似性
を共有しないような化合物を、ＡＴＰ依存性作用により
細胞外に能動的に輸送、排除するＭＤＲに寄与してお
り、このことは、癌の化学療法等の深刻なさまたげとな
っている。多剤耐性蛋白：ＭＲＰは、１９９２年、Cole
等により発見されたが、それ以来、この輸送体のトポロ
ジー、機能特性および臨床的重要性を理解する上で、多
大な進歩がなされてきた。ヒトＭＲＰ（ｈＭＲＰ）は１
９０ｋＤａのタンパク質であり、Ｐ−gpとのアミノ酸配
列相同性はおよそ１５％である。ｈＭＲＰは大部分の組
織および大部分のタイプの細胞に発現されており、腫瘍
細胞中には過剰発現されていることもある。ｈＭＲＰは
おそらく、Ｐ−gpと同様、６＋６膜スパニングヘリック
スのトポロジーを有していると思われるが、ｈＭＲＰは
さらに、Ｐ−gpには対応するものの無い、追加的Ｎ末端
アミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は、５個
または６個のトランスメンブラン(transmembrane、Ｔ
Ｍ）セグメントを形成する、といわれている。ＭＲＰ
は、システイニルロイコトリエンＬＴＣ4 、ＬＴＤ4 、
ＬＴＥ4 およびその他ある種のグルタチオン（ＧＳＨ）
抱合体(conjugate) を輸送できることが示されており、
グルタチオン抱合体（ＧＳ−Ｘ）ポンプである可能性を
示している。このポンプは、動物、植物および微生物の
細胞中に広く存在していると考えられており、ＧＳＨ共
有結合性複合体が形成されることが、ＭＲＰが重金属抵
抗性を付与する理由である可能性がある。ＧＳＨ還元体
それ自体はＭＲＰの基質ではないが、複合体を形成した
り、他の物質とともに共基質のはたらきをしたりする可
能性がある。たとえば、ＧＳＨの存在下で、ピンクリス
チンのＡＴＰ依存性輸送が起こることが示されている。
ＭＲＰはまた、グルタチオン酸化体（ＧＳＳＧ）を輸送
することもでき、多特異性有機陰イオン輸送体（ＭＯＡ
Ｔ）活性に関与している可能性があり、広範な化合物を
基質とする輸送体であると考えられる。化学療法は、癌
の治療に有効であることが立証されているが、化学療法
剤は一種の細胞毒性物質でもあり、色々な細胞毒性物質
を細胞外に送り出すＭＲＰが重大な障害となっている。
したがって、ＭＲＰの基質特異性を評価することが非常
に重要であり、この評価は、これらの悪性疾患に対する
有効な治療法の開発に貢献するものと考えられる。Ｐ−
gpに類似したＭＲＰの基質特異性および基質選択性のこ
の種の分析は、普通、生きた細胞の複雑な環境の影響を
避けるために、膜小胞を用いて行う。そのような実験で
は、ＭＲＰをもった小胞を調製し、基質およびＡＴＰと
混合する。続いて、一定時間輸送作用を進行させた後小
胞を分離し、閉鎖状態の(encloscd)小胞（大部分の場合
は放射性）を定量する。この方法による分析にはいくつ
かの欠点がある。第一に、濃度勾配に沿って基質の受動
的浸透が起こることが避けられないこと、第二に、疎水
性基質が脂質二重層中に浸透すること、そして最後に、
輸送過程におけるバルク(bulk)溶液中の基質濃度が減少
すると、速度論的研究に不正確さが生じること、などで
ある。そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来
の問題点を解消した、新しい多剤耐性蛋白の活性測定方
法を提供することを課題としている。
質、すなわちこの出願の発明が対象とする多剤耐性蛋白
（ＭＲＰ）は、多薬剤抵抗性（ＭＤＲ）を与える物質と
して、現在までに知られている２種類の膜内在性タンパ
ク質のうちの１つであり、また、もう１つの物質とは、
Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−gp）である。これら２つの
タンパク質は、構造および機能においてほとんど類似性
を共有しないような化合物を、ＡＴＰ依存性作用により
細胞外に能動的に輸送、排除するＭＤＲに寄与してお
り、このことは、癌の化学療法等の深刻なさまたげとな
っている。多剤耐性蛋白：ＭＲＰは、１９９２年、Cole
等により発見されたが、それ以来、この輸送体のトポロ
ジー、機能特性および臨床的重要性を理解する上で、多
大な進歩がなされてきた。ヒトＭＲＰ（ｈＭＲＰ）は１
９０ｋＤａのタンパク質であり、Ｐ−gpとのアミノ酸配
列相同性はおよそ１５％である。ｈＭＲＰは大部分の組
織および大部分のタイプの細胞に発現されており、腫瘍
細胞中には過剰発現されていることもある。ｈＭＲＰは
おそらく、Ｐ−gpと同様、６＋６膜スパニングヘリック
スのトポロジーを有していると思われるが、ｈＭＲＰは
さらに、Ｐ−gpには対応するものの無い、追加的Ｎ末端
アミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は、５個
または６個のトランスメンブラン(transmembrane、Ｔ
Ｍ）セグメントを形成する、といわれている。ＭＲＰ
は、システイニルロイコトリエンＬＴＣ4 、ＬＴＤ4 、
ＬＴＥ4 およびその他ある種のグルタチオン（ＧＳＨ）
抱合体(conjugate) を輸送できることが示されており、
グルタチオン抱合体（ＧＳ−Ｘ）ポンプである可能性を
示している。このポンプは、動物、植物および微生物の
細胞中に広く存在していると考えられており、ＧＳＨ共
有結合性複合体が形成されることが、ＭＲＰが重金属抵
抗性を付与する理由である可能性がある。ＧＳＨ還元体
それ自体はＭＲＰの基質ではないが、複合体を形成した
り、他の物質とともに共基質のはたらきをしたりする可
能性がある。たとえば、ＧＳＨの存在下で、ピンクリス
チンのＡＴＰ依存性輸送が起こることが示されている。
ＭＲＰはまた、グルタチオン酸化体（ＧＳＳＧ）を輸送
することもでき、多特異性有機陰イオン輸送体（ＭＯＡ
Ｔ）活性に関与している可能性があり、広範な化合物を
基質とする輸送体であると考えられる。化学療法は、癌
の治療に有効であることが立証されているが、化学療法
剤は一種の細胞毒性物質でもあり、色々な細胞毒性物質
を細胞外に送り出すＭＲＰが重大な障害となっている。
したがって、ＭＲＰの基質特異性を評価することが非常
に重要であり、この評価は、これらの悪性疾患に対する
有効な治療法の開発に貢献するものと考えられる。Ｐ−
gpに類似したＭＲＰの基質特異性および基質選択性のこ
の種の分析は、普通、生きた細胞の複雑な環境の影響を
避けるために、膜小胞を用いて行う。そのような実験で
は、ＭＲＰをもった小胞を調製し、基質およびＡＴＰと
混合する。続いて、一定時間輸送作用を進行させた後小
胞を分離し、閉鎖状態の(encloscd)小胞（大部分の場合
は放射性）を定量する。この方法による分析にはいくつ
かの欠点がある。第一に、濃度勾配に沿って基質の受動
的浸透が起こることが避けられないこと、第二に、疎水
性基質が脂質二重層中に浸透すること、そして最後に、
輸送過程におけるバルク(bulk)溶液中の基質濃度が減少
すると、速度論的研究に不正確さが生じること、などで
ある。そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来
の問題点を解消した、新しい多剤耐性蛋白の活性測定方
法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、多剤耐性蛋白
と基質との反応にともなうＡＴＰ消費を分析することに
より多剤耐性蛋白の基質特異性を評価することを特徴と
する多剤耐性蛋白の活性測定方法を提供する。また、こ
の出願の発明は、第２には、ＡＴＰ消費は分光分析によ
り測定する上記の測定方法を提供し、第３には、多剤耐
性蛋白に対する基質の親和性を評価する測定方法を、第
４には、多剤耐性蛋白をリポソーム包理し、次いで、基
質とともに界面活性剤を添加混合して反応させる上記の
測定方法を提供する。
の課題を解決するものとして、第１には、多剤耐性蛋白
と基質との反応にともなうＡＴＰ消費を分析することに
より多剤耐性蛋白の基質特異性を評価することを特徴と
する多剤耐性蛋白の活性測定方法を提供する。また、こ
の出願の発明は、第２には、ＡＴＰ消費は分光分析によ
り測定する上記の測定方法を提供し、第３には、多剤耐
性蛋白に対する基質の親和性を評価する測定方法を、第
４には、多剤耐性蛋白をリポソーム包理し、次いで、基
質とともに界面活性剤を添加混合して反応させる上記の
測定方法を提供する。
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態に
ついて説明する。この出願の発明においては、多剤耐性
蛋白（以下ＭＲＰと呼ぶ）によるＡＴＰ消費速度の分析
による、ＭＲＰ基質特異性速度論的解析方法を特徴とし
ており、そしてこの方法が、ＭＲＰにより認識可能な細
胞毒性物質のスクリーニングを行うための簡便かつ正確
な方法として提案される。ＡＴＰは、特に好適には、細
胞毒性物質としての抗腫瘍剤等の医薬、あるいは内分泌
かく乱物質のような毒性物質の対ＭＲＰ親和性を評価す
るためのプローブ分子として扱われることになる。この
ようなＡＴＰの消費を、たとえば消費速度や量として分
析することになる。この発明の方法の理論的な基礎は次
のとおりである。この発明の方法においては、下記の反
応式に従ったＡＤＰ生成の測定に対し、たとえば、共役
酵素法(coupled enzyme method) を適用することができ
る。
の特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態に
ついて説明する。この出願の発明においては、多剤耐性
蛋白（以下ＭＲＰと呼ぶ）によるＡＴＰ消費速度の分析
による、ＭＲＰ基質特異性速度論的解析方法を特徴とし
ており、そしてこの方法が、ＭＲＰにより認識可能な細
胞毒性物質のスクリーニングを行うための簡便かつ正確
な方法として提案される。ＡＴＰは、特に好適には、細
胞毒性物質としての抗腫瘍剤等の医薬、あるいは内分泌
かく乱物質のような毒性物質の対ＭＲＰ親和性を評価す
るためのプローブ分子として扱われることになる。この
ようなＡＴＰの消費を、たとえば消費速度や量として分
析することになる。この発明の方法の理論的な基礎は次
のとおりである。この発明の方法においては、下記の反
応式に従ったＡＤＰ生成の測定に対し、たとえば、共役
酵素法(coupled enzyme method) を適用することができ
る。
【化１】 図１に例示したように、ＡＴＰの存在下で、ＭＲＰは、
ＡＴＰ分子をＡＤＰおよび無機リン酸塩（Ｐｉ）に変換
しながら、基質を輸送すると答えられる。ＡＤＰをＡＴ
Ｐに戻す次の反応は、ＮＡＤＨの酸化と共役的に起こ
る。したがって、ＡＴＰ濃度は、ＮＡＤＨが枯渇するま
では、一定値に保たれる。そこで、たとえば、３４０ｎ
ｍにおけるＮＡＤＨの吸光度のモニターにより、ＡＤＰ
生成もしくはＡＴＰ消費に対応するＮＡＤＨ濃度減少の
吸収時間曲線が与えられる。したがって、ＭＲＰによる
輸送作用は、この発明の方法により測定することができ
る。分光測光法測定によりＡＴＰ消費速度値が与えら
れ、この種のデータは、次のミカエリスの式（１）によ
り分析することができる。
ＡＴＰ分子をＡＤＰおよび無機リン酸塩（Ｐｉ）に変換
しながら、基質を輸送すると答えられる。ＡＤＰをＡＴ
Ｐに戻す次の反応は、ＮＡＤＨの酸化と共役的に起こ
る。したがって、ＡＴＰ濃度は、ＮＡＤＨが枯渇するま
では、一定値に保たれる。そこで、たとえば、３４０ｎ
ｍにおけるＮＡＤＨの吸光度のモニターにより、ＡＤＰ
生成もしくはＡＴＰ消費に対応するＮＡＤＨ濃度減少の
吸収時間曲線が与えられる。したがって、ＭＲＰによる
輸送作用は、この発明の方法により測定することができ
る。分光測光法測定によりＡＴＰ消費速度値が与えら
れ、この種のデータは、次のミカエリスの式（１）によ
り分析することができる。
【数１】 ここで、νは、酵素反応速度であり、Ｖmax は最大反応
速度、〔Ｓ〕0 は基質の初期濃度、ミカエリス定数Ｋm
は、ν＝１／２Ｖmax のときの基質濃度を示す。ある与
えられた系において、Ｖmax はＫm と同様定数となる。
ミカエリスの式（１）は、別な形態の次式に変形するこ
とができる。
速度、〔Ｓ〕0 は基質の初期濃度、ミカエリス定数Ｋm
は、ν＝１／２Ｖmax のときの基質濃度を示す。ある与
えられた系において、Ｖmax はＫm と同様定数となる。
ミカエリスの式（１）は、別な形態の次式に変形するこ
とができる。
【数２】 １／νを１／〔Ｓ〕に対してプロットすることにより線
形曲線を描くことができ、この曲線をLineweaverプロッ
トという。この曲線の傾きおよび交差から、ＭＲＰに対
する基質の親和性を表すＫm が得られる。もちろん、Ａ
ＴＰの消費は分光法によらなくてもよい。ただ、分光法
は、リアルタイムでのＡＴＰ消費の分析を可能とするも
のであって、この発明の方法において有効である。ま
た、この発明の方法においては、従来方法の問題点を解
決するために、多剤耐性蛋白をリポソーム包理し、次い
で、基質とともに界面活性剤を添加混合して反応させる
ことが有効である。界面活性剤は各種のものでよいが、
このものはリポソーム開包作用を行うことになる。以下
に、この発明の実施例を説明するが、この発明の方法
は、この例によって限定されるものではない。いずれに
しても、この出願の発明によって、種々の医薬品や内分
泌かく乱物質などの毒性物質のスクリーニング法として
有用な、多剤耐性蛋白の活性評価方法が提供される。
形曲線を描くことができ、この曲線をLineweaverプロッ
トという。この曲線の傾きおよび交差から、ＭＲＰに対
する基質の親和性を表すＫm が得られる。もちろん、Ａ
ＴＰの消費は分光法によらなくてもよい。ただ、分光法
は、リアルタイムでのＡＴＰ消費の分析を可能とするも
のであって、この発明の方法において有効である。ま
た、この発明の方法においては、従来方法の問題点を解
決するために、多剤耐性蛋白をリポソーム包理し、次い
で、基質とともに界面活性剤を添加混合して反応させる
ことが有効である。界面活性剤は各種のものでよいが、
このものはリポソーム開包作用を行うことになる。以下
に、この発明の実施例を説明するが、この発明の方法
は、この例によって限定されるものではない。いずれに
しても、この出願の発明によって、種々の医薬品や内分
泌かく乱物質などの毒性物質のスクリーニング法として
有用な、多剤耐性蛋白の活性評価方法が提供される。
【実施例】以下の態様として、この発明の方法の実施例
を説明する。 ＜１＞材料：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（還元体）（ＮＡＤＨ）、ＡＴＰ、ホスホエノールピル
ビン酸、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＬＤＨ）およびウワバインは、ワコー（大阪、
日本）から購入した。システイニルロイコトリエンＬＴ
Ｃ4 、ＬＴＤ4 、ＬＴＥ4 、グルタチオン（ＧＳＨ）、
グルタチオン酸化体（ＧＳＳＧ）、ダウノルビシン（Ｄ
ａｕ）およびビンクリスチン（Ｖｉｎ）は、シグマ(St
Louis, MO, USA) から入手した。他のすべての試薬は分
析試薬級であり、実験全体を通して Milli−Ｑ水を使用
した。 ＜２＞細胞培養：ＬＬＣ−ＭＲＰ１細胞を、３７℃、５
％ＣＯ2 雰囲気中、Ｍ１９９培地において、１０％（ｖ
／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に保持した。ここで、
Ｍ１９９培地にはEarle の改質塩およびＬ−グルタミン
（Gibco, Paisley、スコットランド）を供給し、ペニシ
リン５０Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／
ｍｌを補足した。細胞は、３日もしくは４日ごとにトリ
プシン処理することによって継代培養した。 ＜３＞形質膜の分離：ＬＬＣ−ＭＲＰ１細胞からの形質
膜の単離は、Priebe等により記述されている方法に従っ
て行ったが、いつくかの変更を行った。冷凍細胞を解凍
し、氷冷したリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で、１，５０
０×ｇで１２分間遠心分離することにより洗浄した。得
られたペレットを低張緩衝液（０．５ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０、0.1 ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭフ
ッ化フェニルメチルスルホニル）に再懸濁し、溶液中の
細胞濃度を、約１×１０7 個／ｍｌのレベルに調製し
た。懸濁物を氷上で６０分間おだやかに攪拌し、均一化
した。細胞溶解物を、１００，０００×ｇで３５分間、
回転させた(spin down) 。得られたペレットを低張緩衝
液に再懸濁し、均一化処理後、懸濁液を１２，０００×
ｇで１０分間遠心分離にかけた。得られたペレットを再
度１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、２
回の操作により生成したpostnuclear 上澄み液を採取
し、１００，０００×ｇで３５分間遠心分離した。得ら
れたペレットを低張緩衝液に懸濁し、均一化した。得ら
れた懸濁液(homogenate)を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４含有の５０％、３０％および２０％のスクロース
からなる密度勾配状に層状化し、１００，０００×ｇで
３５分間遠心分離にした。３０％スクロース層と５０％
スクロース層間の混濁層を採取し、１２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／
ｐＨ７．４含有溶液中で稀釈した。続いて同溶液を１０
０，０００×ｇで３５分間遠心分離にかけた。得られた
ペレットを、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび１０ｍＭＴｒｉｓ／ｐＨ７．４含有溶液に懸
濁し、タンパク質濃度を３−５ｍｇ／ｍｌとした。懸濁
液を−８０℃に保存し、使用期間を１ヶ月以内とした。
タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ(hercules, CA)タンパ
ク質分析キットを使用し、同キットの製造業者実験計画
案に従って測定した。 ＜４＞ＡＴＰ消費の測定：測定は、Scharschmidt等の方
法に従って行った。すなわち、まず、冷凍形質膜懸濁液
を３７℃で解凍し、使用するまで氷上に保持した。長さ
１ｃｍの石英製キュベット中に入れられた最終１ｍｌ測
定液には、懸濁液２０μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，２．５ｍＭ ホスホノエノールピルビン酸、０．
５ｍＭ ＮＡＤＨ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰ
Ｋ、１ｍＭウワバイン、そして０．２％ Triton X-100
を含有させた。Dau およびVin 測定用の溶液には、さら
に１０ｍＭのＧＳＨを含有させた。形質膜懸濁液および
ＰＫ／ＬＤＨ（１０μｌ）混合溶液の添加に先立ち、測
定液を３７℃で９０秒間前培養(pre-incubate)し、測定
を開始した。対照セルには、ＡＴＰ無添加以外の点で
は、測定液と同じ成分を含有させた。 ＮＡＤＨの酸
化を、ＵＶ−１６００ ＵＶ−可視分光光度計（島津、
京都、日本）を用い、３４０ｎｍで連続的にモニターし
た。ＡＴＰase 作用は、２分間進行させた。ＡＴＰ消費
速度（ｖ）は、トレーシングの直線部分（１０秒から９
０秒の間）から次式によって計算した。
を説明する。 ＜１＞材料：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（還元体）（ＮＡＤＨ）、ＡＴＰ、ホスホエノールピル
ビン酸、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＬＤＨ）およびウワバインは、ワコー（大阪、
日本）から購入した。システイニルロイコトリエンＬＴ
Ｃ4 、ＬＴＤ4 、ＬＴＥ4 、グルタチオン（ＧＳＨ）、
グルタチオン酸化体（ＧＳＳＧ）、ダウノルビシン（Ｄ
ａｕ）およびビンクリスチン（Ｖｉｎ）は、シグマ(St
Louis, MO, USA) から入手した。他のすべての試薬は分
析試薬級であり、実験全体を通して Milli−Ｑ水を使用
した。 ＜２＞細胞培養：ＬＬＣ−ＭＲＰ１細胞を、３７℃、５
％ＣＯ2 雰囲気中、Ｍ１９９培地において、１０％（ｖ
／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に保持した。ここで、
Ｍ１９９培地にはEarle の改質塩およびＬ−グルタミン
（Gibco, Paisley、スコットランド）を供給し、ペニシ
リン５０Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／
ｍｌを補足した。細胞は、３日もしくは４日ごとにトリ
プシン処理することによって継代培養した。 ＜３＞形質膜の分離：ＬＬＣ−ＭＲＰ１細胞からの形質
膜の単離は、Priebe等により記述されている方法に従っ
て行ったが、いつくかの変更を行った。冷凍細胞を解凍
し、氷冷したリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で、１，５０
０×ｇで１２分間遠心分離することにより洗浄した。得
られたペレットを低張緩衝液（０．５ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０、0.1 ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭフ
ッ化フェニルメチルスルホニル）に再懸濁し、溶液中の
細胞濃度を、約１×１０7 個／ｍｌのレベルに調製し
た。懸濁物を氷上で６０分間おだやかに攪拌し、均一化
した。細胞溶解物を、１００，０００×ｇで３５分間、
回転させた(spin down) 。得られたペレットを低張緩衝
液に再懸濁し、均一化処理後、懸濁液を１２，０００×
ｇで１０分間遠心分離にかけた。得られたペレットを再
度１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、２
回の操作により生成したpostnuclear 上澄み液を採取
し、１００，０００×ｇで３５分間遠心分離した。得ら
れたペレットを低張緩衝液に懸濁し、均一化した。得ら
れた懸濁液(homogenate)を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４含有の５０％、３０％および２０％のスクロース
からなる密度勾配状に層状化し、１００，０００×ｇで
３５分間遠心分離にした。３０％スクロース層と５０％
スクロース層間の混濁層を採取し、１２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／
ｐＨ７．４含有溶液中で稀釈した。続いて同溶液を１０
０，０００×ｇで３５分間遠心分離にかけた。得られた
ペレットを、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび１０ｍＭＴｒｉｓ／ｐＨ７．４含有溶液に懸
濁し、タンパク質濃度を３−５ｍｇ／ｍｌとした。懸濁
液を−８０℃に保存し、使用期間を１ヶ月以内とした。
タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ(hercules, CA)タンパ
ク質分析キットを使用し、同キットの製造業者実験計画
案に従って測定した。 ＜４＞ＡＴＰ消費の測定：測定は、Scharschmidt等の方
法に従って行った。すなわち、まず、冷凍形質膜懸濁液
を３７℃で解凍し、使用するまで氷上に保持した。長さ
１ｃｍの石英製キュベット中に入れられた最終１ｍｌ測
定液には、懸濁液２０μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，２．５ｍＭ ホスホノエノールピルビン酸、０．
５ｍＭ ＮＡＤＨ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰ
Ｋ、１ｍＭウワバイン、そして０．２％ Triton X-100
を含有させた。Dau およびVin 測定用の溶液には、さら
に１０ｍＭのＧＳＨを含有させた。形質膜懸濁液および
ＰＫ／ＬＤＨ（１０μｌ）混合溶液の添加に先立ち、測
定液を３７℃で９０秒間前培養(pre-incubate)し、測定
を開始した。対照セルには、ＡＴＰ無添加以外の点で
は、測定液と同じ成分を含有させた。 ＮＡＤＨの酸
化を、ＵＶ−１６００ ＵＶ−可視分光光度計（島津、
京都、日本）を用い、３４０ｎｍで連続的にモニターし
た。ＡＴＰase 作用は、２分間進行させた。ＡＴＰ消費
速度（ｖ）は、トレーシングの直線部分（１０秒から９
０秒の間）から次式によって計算した。
【数３】 ３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの減衰係数εmMは６．２２
ＯＤ・ｍｌ／μｍｏｌであった。 ＜５＞結果 時間依存性吸光度変化：図２に示したように、基質シ
ステイニルロイコトリエンＣ4 （ＬＴＣ4 ）の存在下
で、吸光度が減少することが確証されたが、このことは
ＭＲＰのＡＴＰ消費作用を示している。これとは対照的
に、基質が存在しないと、ノイズレベルの吸光度変化し
か観察されなかった。ＭＲＰは、現在まで依然として精
製できていない。調製した形質膜には、さらにＮａ+ ／
Ｋ+ −ＡＴＰase およびＣａ2+−ＡＴＰase が含まれて
いた。Ｎａ+ ／Ｋ+ −ＡＴＰase の作用は、ウワバイン
により阻害され、操作中の関与は避けられており、ま
た、溶液中にＥＧＴＡが添加されていることから、Ｃａ
2+−ＡＴＰase によるＡＴＰ関与の作用が生じた可能性
は排除される。その結果、ＭＲＰが実験におけるＡＴＰ
消費の原因物質であることは確かである。 界面活性剤による開小胞の形成：ＭＲＰ輸送作用分析
の従来の方法では、基質の受動的拡散および疎水性基質
の膜中の残留は避けることができない。さらに、放射性
基質が必要となる。そこで、この発明の方法において
は、Triton X-100を溶液に添加し、これらの障害を克服
した。分離操作で調製した形質膜の大部分は、閉じてリ
ポソームを形成しているにちがいない。しかし、形質膜
がリポソームとして存在しているのか膜パッチ形態で存
在しているのかは問題とならない。温和な界面活性剤Tr
iton X-100を溶液に混合すると、同界面活性剤によりリ
ポソームが開き、したがって、図３に示したように、Ａ
ＴＰや基質のような小さな分子は自由に動くことができ
るようになる。その結果均一な環境が得られ、このこと
は速度論的研究にとっては重要なことである。基質濃度
〔Ｓ〕は、溶液中で常に一定に保たれ、したがって前記
のミカエリスの式（）中のＡ〔Ｓ〕0 の変化による誤
差は、完全に回避することができる。従来の方法では、
リポソーム中のＭＲＰのうち、インサイドアウト(insid
e-out)配向のものだけしか輸送作用に関与しないが、こ
の発明の方法における条件下では、すべてのＭＲＰがＡ
ＴＰ消費に寄与する。ＡＴＰ消費をＭＲＰ輸送作用の指
標として用いるため、基質の脂質二重層中への分配は、
結果に何ら影響を及ぼさない。なぜなら、この分配はエ
ネルギーに依存しないからである。同じ理由により、基
質の膜を通しての受動的分散も実験に影響を与えず、さ
らに言うと、実際、上記のような均一な溶液中では、分
散は生じない。 Ｋm 値の測定：ＬＴＣ4 に対するLineweaverプロット
を図４に示した。このプロットから得られたＬＴＣ4 の
ＭＲＰに対するＫm 値は、０．２９μＭであった。その
他３種類の周知のＭＲＰ基質、ＬＴＤ4 ，ＬＴＥ4 およ
びＧＳＳＧに対するＫm 値も測定した。それらの結果を
次の表に示した。
ＯＤ・ｍｌ／μｍｏｌであった。 ＜５＞結果 時間依存性吸光度変化：図２に示したように、基質シ
ステイニルロイコトリエンＣ4 （ＬＴＣ4 ）の存在下
で、吸光度が減少することが確証されたが、このことは
ＭＲＰのＡＴＰ消費作用を示している。これとは対照的
に、基質が存在しないと、ノイズレベルの吸光度変化し
か観察されなかった。ＭＲＰは、現在まで依然として精
製できていない。調製した形質膜には、さらにＮａ+ ／
Ｋ+ −ＡＴＰase およびＣａ2+−ＡＴＰase が含まれて
いた。Ｎａ+ ／Ｋ+ −ＡＴＰase の作用は、ウワバイン
により阻害され、操作中の関与は避けられており、ま
た、溶液中にＥＧＴＡが添加されていることから、Ｃａ
2+−ＡＴＰase によるＡＴＰ関与の作用が生じた可能性
は排除される。その結果、ＭＲＰが実験におけるＡＴＰ
消費の原因物質であることは確かである。 界面活性剤による開小胞の形成：ＭＲＰ輸送作用分析
の従来の方法では、基質の受動的拡散および疎水性基質
の膜中の残留は避けることができない。さらに、放射性
基質が必要となる。そこで、この発明の方法において
は、Triton X-100を溶液に添加し、これらの障害を克服
した。分離操作で調製した形質膜の大部分は、閉じてリ
ポソームを形成しているにちがいない。しかし、形質膜
がリポソームとして存在しているのか膜パッチ形態で存
在しているのかは問題とならない。温和な界面活性剤Tr
iton X-100を溶液に混合すると、同界面活性剤によりリ
ポソームが開き、したがって、図３に示したように、Ａ
ＴＰや基質のような小さな分子は自由に動くことができ
るようになる。その結果均一な環境が得られ、このこと
は速度論的研究にとっては重要なことである。基質濃度
〔Ｓ〕は、溶液中で常に一定に保たれ、したがって前記
のミカエリスの式（）中のＡ〔Ｓ〕0 の変化による誤
差は、完全に回避することができる。従来の方法では、
リポソーム中のＭＲＰのうち、インサイドアウト(insid
e-out)配向のものだけしか輸送作用に関与しないが、こ
の発明の方法における条件下では、すべてのＭＲＰがＡ
ＴＰ消費に寄与する。ＡＴＰ消費をＭＲＰ輸送作用の指
標として用いるため、基質の脂質二重層中への分配は、
結果に何ら影響を及ぼさない。なぜなら、この分配はエ
ネルギーに依存しないからである。同じ理由により、基
質の膜を通しての受動的分散も実験に影響を与えず、さ
らに言うと、実際、上記のような均一な溶液中では、分
散は生じない。 Ｋm 値の測定：ＬＴＣ4 に対するLineweaverプロット
を図４に示した。このプロットから得られたＬＴＣ4 の
ＭＲＰに対するＫm 値は、０．２９μＭであった。その
他３種類の周知のＭＲＰ基質、ＬＴＤ4 ，ＬＴＥ4 およ
びＧＳＳＧに対するＫm 値も測定した。それらの結果を
次の表に示した。
【表１】 ＬＴＤ4 あるいはＬＴＥ4 のＫm 値については、文献値
を入手できなかった。他の２つの基質、ＬＴＣ4 および
ＧＳＳＧに対するＫm の文献値は、それぞれ０．１μ
Ｍ、９３μＭである。これらの値は、本研究で得られた
結果（０．２９μＭおよび８７．２μＭ）に適合的であ
る。ここで得られた結果は、さらに、一般に知られてい
る４つの基質のＭＲＰに対する親和性の序列、すなわち
ＬＴＣ4 ＞ＬＴＤ 4 ＞ＬＴＥ4 ≫ＧＳＳＧという序列
と一致している。したがって、この発明の方法により測
定されたデータは、信頼できることが確認された。 抗腫瘍剤に対する応用：以上の結果に基づき、２つの
抗腫瘍剤、ダウノルビシン（Ｄau）およびビンクリスチ
ン（Ｖin）に対するＫm 値を測定した。Ｄauは細胞のＤ
ＮＡに損傷を与え、Ｖinは細胞分裂を阻害する。いずれ
の薬剤も癌の化学療法において幅広く使用されており、
ＧＳＨの存在下でＭＲＰにより輸送されることが知られ
ている。Ｄauに対するLineweaverプロットを図５に示し
た。ＤauおよびＶinのLineweaverプロットから導いたＫ
m 値を次の表２に示す。
を入手できなかった。他の２つの基質、ＬＴＣ4 および
ＧＳＳＧに対するＫm の文献値は、それぞれ０．１μ
Ｍ、９３μＭである。これらの値は、本研究で得られた
結果（０．２９μＭおよび８７．２μＭ）に適合的であ
る。ここで得られた結果は、さらに、一般に知られてい
る４つの基質のＭＲＰに対する親和性の序列、すなわち
ＬＴＣ4 ＞ＬＴＤ 4 ＞ＬＴＥ4 ≫ＧＳＳＧという序列
と一致している。したがって、この発明の方法により測
定されたデータは、信頼できることが確認された。 抗腫瘍剤に対する応用：以上の結果に基づき、２つの
抗腫瘍剤、ダウノルビシン（Ｄau）およびビンクリスチ
ン（Ｖin）に対するＫm 値を測定した。Ｄauは細胞のＤ
ＮＡに損傷を与え、Ｖinは細胞分裂を阻害する。いずれ
の薬剤も癌の化学療法において幅広く使用されており、
ＧＳＨの存在下でＭＲＰにより輸送されることが知られ
ている。Ｄauに対するLineweaverプロットを図５に示し
た。ＤauおよびＶinのLineweaverプロットから導いたＫ
m 値を次の表２に示す。
【表２】 この表２からわかるように、ＤauおよびＶinは、ＭＲＰ
に対して高い親和性を有する。かくしてＤauおよびＶin
の速度論的データが簡便に得られた。本法をＭＲＰ基質
スクリーニングに応用することにより、ＭＲＰの基質選
択性に関して有用な情報が得られ、それは癌医学に貢献
するものである。
に対して高い親和性を有する。かくしてＤauおよびＶin
の速度論的データが簡便に得られた。本法をＭＲＰ基質
スクリーニングに応用することにより、ＭＲＰの基質選
択性に関して有用な情報が得られ、それは癌医学に貢献
するものである。
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明により、ＡＴＰを基質（Ｋm ）の対ＭＲＰ親和性を
評価するためのプローブ分子として用い、それにより、
従来の方法において疎水性基質の脂質二重層中への分配
や、基質の膜を通しての受動的分散によりもたらされる
障害を排除する。また、この出願の発明の方法によれば
リアルタイムの正確な分析が可能となり、このことは速
度論的評価においては重要なことであって、この出願の
発明の方法において非常に大切なポイントである。さら
に、放射性基質がこの発明の方法において不要となる。
従来の分離操作も回避可能となる。したがって、速度論
的データを簡便に得ることができる。ＭＲＰは、多薬剤
抵抗性の原因となる重要なタンパク質である。この出願
の発明の方法はＭＲＰ基質スクリーニングに応用可能で
あり、抗腫瘍剤の開発に貢献するものである。
発明により、ＡＴＰを基質（Ｋm ）の対ＭＲＰ親和性を
評価するためのプローブ分子として用い、それにより、
従来の方法において疎水性基質の脂質二重層中への分配
や、基質の膜を通しての受動的分散によりもたらされる
障害を排除する。また、この出願の発明の方法によれば
リアルタイムの正確な分析が可能となり、このことは速
度論的評価においては重要なことであって、この出願の
発明の方法において非常に大切なポイントである。さら
に、放射性基質がこの発明の方法において不要となる。
従来の分離操作も回避可能となる。したがって、速度論
的データを簡便に得ることができる。ＭＲＰは、多薬剤
抵抗性の原因となる重要なタンパク質である。この出願
の発明の方法はＭＲＰ基質スクリーニングに応用可能で
あり、抗腫瘍剤の開発に貢献するものである。
【図１】ＭＲＰによるＡＴＰ依存性基質輸送の模式図(c
artoon) である。 （ａ）：細胞外／細胞内／形質膜 （ｂ）：細胞外／細胞内／基質／脂質二重層
artoon) である。 （ａ）：細胞外／細胞内／形質膜 （ｂ）：細胞外／細胞内／基質／脂質二重層
【図２】ＭＲＰ基質の存在下および非存在下における時
間依存性吸光度変化を示した図である。キュベット中の
１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸濁液２０μｌ、それぞれ１
０単位のＬＤＨおよびＰＫ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭＭｇＣｌ
2 、２．５ｍＭ ホスホエノールピルビン酸、０．５ｍ
Ｍ ＮＡＤＨおよび０．２％ Triton X-100を含有して
いる。温度は３７°に保ち、吸光度は３４０ｎｍでモニ
ターした。
間依存性吸光度変化を示した図である。キュベット中の
１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸濁液２０μｌ、それぞれ１
０単位のＬＤＨおよびＰＫ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭＭｇＣｌ
2 、２．５ｍＭ ホスホエノールピルビン酸、０．５ｍ
Ｍ ＮＡＤＨおよび０．２％ Triton X-100を含有して
いる。温度は３７°に保ち、吸光度は３４０ｎｍでモニ
ターした。
【図３】Triton X-100を、ＭＲＰを有する小胞含有溶液
に添加することにより調製した均一溶液の模式図であ
る。
に添加することにより調製した均一溶液の模式図であ
る。
【図４】ＬＴＣ４に対するLineweaverプロットを示した
図である。キュベット中の１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸
濁液２０μｌ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰＫ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ
ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２．５ｍＭホスホエノ
ールピルビン酸、０．５ｍＭ ＮＡＤＨおよび０．２％
Triton X-100を含有している。温度は３７℃に保ち、吸
光度は３４０ｎｍでモニターした。示したデータは３つ
以上の測定値から得られた±Ｓ．Ｄ．を意味している。
図である。キュベット中の１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸
濁液２０μｌ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰＫ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ
ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２．５ｍＭホスホエノ
ールピルビン酸、０．５ｍＭ ＮＡＤＨおよび０．２％
Triton X-100を含有している。温度は３７℃に保ち、吸
光度は３４０ｎｍでモニターした。示したデータは３つ
以上の測定値から得られた±Ｓ．Ｄ．を意味している。
【図５】ダウノルビシンのLineweaverプロットを示した
図である。キュペット中の１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸
濁液２０μｌ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰＫ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ
ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２．５ｍＭホスホエノ
ールピルビン酸、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、１０ｍＭ グ
ルタチオンおよび０．２％Triton X-100を含有してい
る。温度は３７℃に保ち、吸光度は３４０ｎｍでモニタ
ーした。示したデータは３つ以上の測定値から得られた
±Ｓ．Ｄ．を意味している。
図である。キュペット中の１ｍｌ測定液は、ＭＲＰ膜懸
濁液２０μｌ、それぞれ１０単位のＬＤＨおよびＰＫ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ
ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２．５ｍＭホスホエノ
ールピルビン酸、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、１０ｍＭ グ
ルタチオンおよび０．２％Triton X-100を含有してい
る。温度は３７℃に保ち、吸光度は３４０ｎｍでモニタ
ーした。示したデータは３つ以上の測定値から得られた
±Ｓ．Ｄ．を意味している。
Claims (4)
- 【請求項１】 多剤耐性蛋白と基質との反応にともなう
ＡＴＰ消費を分析することにより多剤耐性蛋白の基質特
異性を評価することを特徴とする多剤耐性蛋白の活性測
定方法。 - 【請求項２】 ＡＴＰ消費は分光分析により測定する請
求項１の測定方法。 - 【請求項３】 多剤耐性蛋白に対する基質の親和性を評
価する請求項１または２の測定方法。 - 【請求項４】 多剤耐性蛋白をリポソーム包理し、次い
で、基質とともに界面活性剤を添加混合して反応させる
請求項１ないし３のいずれかの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000029832A JP2001218596A (ja) | 2000-02-07 | 2000-02-07 | 多剤耐性蛋白の活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000029832A JP2001218596A (ja) | 2000-02-07 | 2000-02-07 | 多剤耐性蛋白の活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001218596A true JP2001218596A (ja) | 2001-08-14 |
Family
ID=18554929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000029832A Pending JP2001218596A (ja) | 2000-02-07 | 2000-02-07 | 多剤耐性蛋白の活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001218596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245342A (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | 細胞中ａｔｐの定量法 |
-
2000
- 2000-02-07 JP JP2000029832A patent/JP2001218596A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245342A (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | 細胞中ａｔｐの定量法 |
| JP4546115B2 (ja) * | 2004-03-05 | 2010-09-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 細胞中ａｔｐの定量法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20040129 |