JP2001161350A - 造血細胞の新規増幅剤 - Google Patents
造血細胞の新規増幅剤Info
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- JP2001161350A JP2001161350A JP35047399A JP35047399A JP2001161350A JP 2001161350 A JP2001161350 A JP 2001161350A JP 35047399 A JP35047399 A JP 35047399A JP 35047399 A JP35047399 A JP 35047399A JP 2001161350 A JP2001161350 A JP 2001161350A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】造血細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）培養する
際に、単一成分で造血細胞を効果的に増幅し得る増幅剤
を提供することにある。また本願発明の他の目的は、単
一成分の増幅剤を用いる造血細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培
養して増幅する方法を提供すること。 【解決手段】ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋
白質からなる、造血細胞の生体外培養における増幅剤。
際に、単一成分で造血細胞を効果的に増幅し得る増幅剤
を提供することにある。また本願発明の他の目的は、単
一成分の増幅剤を用いる造血細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培
養して増幅する方法を提供すること。 【解決手段】ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋
白質からなる、造血細胞の生体外培養における増幅剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術の分野】本発明は、ＩＬ−６レセプ
ター（以下ＩＬ−６Ｒと略記する）とＩＬ−６との融合
蛋白質（以下ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質）からな
る造血細胞の増幅剤に関するものであり、更には前記増
幅剤を使用することを特徴とする造血細胞の生体外培養
（ｅｘ ｖｉｖｏ）における増幅方法に関するものであ
る。
ター（以下ＩＬ−６Ｒと略記する）とＩＬ−６との融合
蛋白質（以下ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質）からな
る造血細胞の増幅剤に関するものであり、更には前記増
幅剤を使用することを特徴とする造血細胞の生体外培養
（ｅｘ ｖｉｖｏ）における増幅方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】造血幹細胞や前駆細胞（巨核球前駆細
胞、白血球前駆細胞、赤血球系前駆細胞）（本明細書で
はこれら細胞を集合的に造血細胞と略記する）の移植に
際して、臍帯血がそのソースとして使用される頻度が増
加してきている。しかし、一人の提供者から得られる臍
帯血は少量であり、造血細胞の移植に必要な大量の臍帯
血を恒常的に確保するのは極めて困難である。この課題
を解決するため、造血細胞の増殖及び分化（以下単に増
幅と略記する）を促進し得る種々の生理活性物質（ファ
クター）を用いて患者から得た骨髄、抹消血或いは臍帯
血画分中の造血細胞を増幅し、再び患者に戻すための、
造血細胞の生体外培養（ｅｘ ｖｉｖｏ）が提案され、
臨床的な応用が試みられている（Ｂｒｕｇｇｅｒら，
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３，２８３頁，１９
９５年、Ｈｏｌｙｏａｋｅら，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９，１０５９頁，１９９７
年、ＭｃＮｉｅｃｅら，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｃｅｌｌ Ｔ
ｈｅｒ．，４１，８２頁，１９９９年）。
胞、白血球前駆細胞、赤血球系前駆細胞）（本明細書で
はこれら細胞を集合的に造血細胞と略記する）の移植に
際して、臍帯血がそのソースとして使用される頻度が増
加してきている。しかし、一人の提供者から得られる臍
帯血は少量であり、造血細胞の移植に必要な大量の臍帯
血を恒常的に確保するのは極めて困難である。この課題
を解決するため、造血細胞の増殖及び分化（以下単に増
幅と略記する）を促進し得る種々の生理活性物質（ファ
クター）を用いて患者から得た骨髄、抹消血或いは臍帯
血画分中の造血細胞を増幅し、再び患者に戻すための、
造血細胞の生体外培養（ｅｘ ｖｉｖｏ）が提案され、
臨床的な応用が試みられている（Ｂｒｕｇｇｅｒら，
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３，２８３頁，１９
９５年、Ｈｏｌｙｏａｋｅら，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９，１０５９頁，１９９７
年、ＭｃＮｉｅｃｅら，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｃｅｌｌ Ｔ
ｈｅｒ．，４１，８２頁，１９９９年）。
【０００３】現在のところ造血細胞を生体外で培養して
増幅するには複数の生理活性物質を組み合わせて使用す
ることが必須であり、従来の研究もいかなる生理活性物
質の組み合わせが前記増幅に効果的であるかを解明しよ
うとするものである。例えば、インターロイキン−３
（以下ＩＬ−３と略記する）、ＩＬ−６及びヒト幹細胞
因子（以下ＳＣＦと略記する）の組み合わせや、この組
み合わせよりも造血細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養時の増幅
効果の高い、ＩＬ−６Ｒの細胞外領域部分のみからなる
可溶性ＩＬ−６Ｒ（以下ｓＩＬ−６Ｒと略記する）、Ｉ
Ｌ−６及びＳＣＦの組み合わせ等が報告されている（Ｓ
ｕｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．，９２，２５８９頁，１９９５年）。またｓＩＬ−
６Ｒ、ＩＬ−６及びＦｌｔ３リガンド（以下ＦＬと略記
する）の組み合わせ（Ｅｂｉｈａｒａら，Ｂｌｏｏｄ，
９０，４３６３頁，１９９７年）も報告されている。こ
れらの報告においてｓＩＬ−６Ｒが必要とされたのは、
多様なコロニーを形成し得る造血細胞はｇｐ１３０蛋白
質及びＩＬ−６Ｒを発現している細胞ではなく、ｇｐ１
３０蛋白質は発現しているもののＩＬ−６Ｒは発現して
いない細胞であるという知見（Ｔａｊｉｍａら，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４，１３５７頁，１９９６年）に
より説明された。近年になり、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｓ
ＣＦ、ＦＬ、トロンボポエチン（以下ＴＰＯと略記す
る）、顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと略記
する）、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記する）と
いった生理活性物質の３種以上を組み合わせることでも
造血細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養が可能であることが報告
され（Ｍｏｂｅｓｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎ
ｇ．，６０，３４１頁，１９９８年、Ｋｏｂａｒｉら，
Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２
１，７５９頁，１９９８年）、その際の増幅効果はｓＩ
Ｌ−６Ｒ、ＩＬ−６及びＳＣＦの組み合わせと同等と考
えられている。
増幅するには複数の生理活性物質を組み合わせて使用す
ることが必須であり、従来の研究もいかなる生理活性物
質の組み合わせが前記増幅に効果的であるかを解明しよ
うとするものである。例えば、インターロイキン−３
（以下ＩＬ−３と略記する）、ＩＬ−６及びヒト幹細胞
因子（以下ＳＣＦと略記する）の組み合わせや、この組
み合わせよりも造血細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養時の増幅
効果の高い、ＩＬ−６Ｒの細胞外領域部分のみからなる
可溶性ＩＬ−６Ｒ（以下ｓＩＬ−６Ｒと略記する）、Ｉ
Ｌ−６及びＳＣＦの組み合わせ等が報告されている（Ｓ
ｕｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．，９２，２５８９頁，１９９５年）。またｓＩＬ−
６Ｒ、ＩＬ−６及びＦｌｔ３リガンド（以下ＦＬと略記
する）の組み合わせ（Ｅｂｉｈａｒａら，Ｂｌｏｏｄ，
９０，４３６３頁，１９９７年）も報告されている。こ
れらの報告においてｓＩＬ−６Ｒが必要とされたのは、
多様なコロニーを形成し得る造血細胞はｇｐ１３０蛋白
質及びＩＬ−６Ｒを発現している細胞ではなく、ｇｐ１
３０蛋白質は発現しているもののＩＬ−６Ｒは発現して
いない細胞であるという知見（Ｔａｊｉｍａら，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４，１３５７頁，１９９６年）に
より説明された。近年になり、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｓ
ＣＦ、ＦＬ、トロンボポエチン（以下ＴＰＯと略記す
る）、顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと略記
する）、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記する）と
いった生理活性物質の３種以上を組み合わせることでも
造血細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養が可能であることが報告
され（Ｍｏｂｅｓｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎ
ｇ．，６０，３４１頁，１９９８年、Ｋｏｂａｒｉら，
Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２
１，７５９頁，１９９８年）、その際の増幅効果はｓＩ
Ｌ−６Ｒ、ＩＬ−６及びＳＣＦの組み合わせと同等と考
えられている。
【０００４】ところで、ヒトの造血細胞の生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ）での増幅を評価する方法はこれまで存在せ
ず、ＣＤ３４陽性細胞の浮遊培養や半固定培養等の生体
外評価が行われてきた。これは、骨髄画分に含まれる造
血細胞がＣＤ３４蛋白質を細胞表面に発現しているとい
う知見に基づくものである。この評価によればＩＬ−
３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及び
ＥＰＯのうちの５種類以上の組み合わせは、造血細胞を
多様なコロニーに分化させ、その数を増やすことが可能
であるが、造血幹細胞の増殖に関しては効果的でないこ
とが示されている。
ｖｉｖｏ）での増幅を評価する方法はこれまで存在せ
ず、ＣＤ３４陽性細胞の浮遊培養や半固定培養等の生体
外評価が行われてきた。これは、骨髄画分に含まれる造
血細胞がＣＤ３４蛋白質を細胞表面に発現しているとい
う知見に基づくものである。この評価によればＩＬ−
３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及び
ＥＰＯのうちの５種類以上の組み合わせは、造血細胞を
多様なコロニーに分化させ、その数を増やすことが可能
であるが、造血幹細胞の増殖に関しては効果的でないこ
とが示されている。
【０００５】上記評価方法に加え、ヒト造血細胞のｅｘ
ｖｉｖｏ培養した場合の増幅結果を、マウスを用いて
ｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が提案された。この方法
は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養したヒト細胞を放射線照射した
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植
し、それらの再定着能を観察することからなる（Ｌａｒ
ｏｃｈｅｌｌら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，１３２９頁，１
９９６年）。そしてこの評価方法を用い、ＦＬ、ＴＰ
Ｏ、ＳＣＦ及びＩＬ−６の組み合わせ（Ｐｉａｃｉｂｅ
ｌｌｏら，Ｂｌｏｏｄ，９３，３７３６頁，１９９９
頁）やＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質、ＳＣＦ及
びＦＬの組み合わせ（Ｋｏｌｌｅｔら，Ｂｌｏｏｄ，９
４，９２３頁、１９９９年）により造血細胞をｅｘ ｖ
ｉｖｏ培養すると、上記免疫不全マウスに再定着する細
胞（以下該細胞をＳＲＣと略記する）を増加させること
ができると報告された。
ｖｉｖｏ培養した場合の増幅結果を、マウスを用いて
ｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が提案された。この方法
は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養したヒト細胞を放射線照射した
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植
し、それらの再定着能を観察することからなる（Ｌａｒ
ｏｃｈｅｌｌら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，１３２９頁，１
９９６年）。そしてこの評価方法を用い、ＦＬ、ＴＰ
Ｏ、ＳＣＦ及びＩＬ−６の組み合わせ（Ｐｉａｃｉｂｅ
ｌｌｏら，Ｂｌｏｏｄ，９３，３７３６頁，１９９９
頁）やＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質、ＳＣＦ及
びＦＬの組み合わせ（Ｋｏｌｌｅｔら，Ｂｌｏｏｄ，９
４，９２３頁、１９９９年）により造血細胞をｅｘ ｖ
ｉｖｏ培養すると、上記免疫不全マウスに再定着する細
胞（以下該細胞をＳＲＣと略記する）を増加させること
ができると報告された。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これまでの知見では、
３種類以上の生理活性物質を用いることが造血細胞をｅ
ｘ ｖｉｖｏ培養により増幅させるための増幅剤として
必須であり、事実、いずれの報告においてもいかなる生
理活性物質を組み合わせて増幅効果を高めるかという点
に注力している。
３種類以上の生理活性物質を用いることが造血細胞をｅ
ｘ ｖｉｖｏ培養により増幅させるための増幅剤として
必須であり、事実、いずれの報告においてもいかなる生
理活性物質を組み合わせて増幅効果を高めるかという点
に注力している。
【０００７】しかし、３種類以上の生理活性物質を用い
ることになれば、生理活性物質間の比率によっても造血
細胞の増幅効果が変化する可能性を否定できない。また
生理活性物質は高価であり、３種類もの生理活性物質を
必須成分として使用するのではコスト的な負担が大き
い。更に各生理活性物質それぞれに純度や活性の均一化
が要求されるため、各生理活性物質の製造及び精製に多
大な労力を必要とするという課題がある。しかも、各生
理活性物質を製造する際には、それぞれの物質について
ロット間格差を生じさせないような厳密さも求められ
る。
ることになれば、生理活性物質間の比率によっても造血
細胞の増幅効果が変化する可能性を否定できない。また
生理活性物質は高価であり、３種類もの生理活性物質を
必須成分として使用するのではコスト的な負担が大き
い。更に各生理活性物質それぞれに純度や活性の均一化
が要求されるため、各生理活性物質の製造及び精製に多
大な労力を必要とするという課題がある。しかも、各生
理活性物質を製造する際には、それぞれの物質について
ロット間格差を生じさせないような厳密さも求められ
る。
【０００８】そこで本願発明の目的は、造血細胞をｅｘ
ｖｉｖｏ培養する際に、単一成分で造血細胞を効果的
に増幅し得る増幅剤を提供することにある。また本願発
明の他の目的は、単一成分の増幅剤を用いる造血細胞を
ｅｘ ｖｉｖｏで培養して増幅する方法を提供すること
にある。
ｖｉｖｏ培養する際に、単一成分で造血細胞を効果的
に増幅し得る増幅剤を提供することにある。また本願発
明の他の目的は、単一成分の増幅剤を用いる造血細胞を
ｅｘ ｖｉｖｏで培養して増幅する方法を提供すること
にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６との融合蛋白質からなる造血細胞の生体外培養におけ
る増幅剤である。本願請求項２の発明は、請求項１の発
明に係り、前記融合蛋白質がＮ末端側からＩＬ−６Ｒ部
分、ＩＬ−６部分の順で融合されたものであることを特
徴とする。本願請求項３の発明は、本願請求項１の発明
に係り、前記融合蛋白質が天然のＩＬ−６Ｒを構成する
アミノ酸残基のＣ末端側に天然のＩＬ−６を構成するア
ミノ酸残基のＮ末端がペプチド結合されたものであるこ
とを特徴とする。
になされた本願請求項１の発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６との融合蛋白質からなる造血細胞の生体外培養におけ
る増幅剤である。本願請求項２の発明は、請求項１の発
明に係り、前記融合蛋白質がＮ末端側からＩＬ−６Ｒ部
分、ＩＬ−６部分の順で融合されたものであることを特
徴とする。本願請求項３の発明は、本願請求項１の発明
に係り、前記融合蛋白質が天然のＩＬ−６Ｒを構成する
アミノ酸残基のＣ末端側に天然のＩＬ−６を構成するア
ミノ酸残基のＮ末端がペプチド結合されたものであるこ
とを特徴とする。
【００１０】そして本願請求項４の発明は、造血細胞の
生体外培養における増幅方法に関し、前記本願請求項１
乃至３の増幅剤を使用することを特徴とする。以下、本
発明を詳細に説明する。
生体外培養における増幅方法に関し、前記本願請求項１
乃至３の増幅剤を使用することを特徴とする。以下、本
発明を詳細に説明する。
【００１１】ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質は、
そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、そのＣ末端側にＩ
Ｌ−６が位置したものと、その逆にＮ末端側にＩＬ−６
が位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６Ｒが位置したもののいず
れでも良い。ＩＬ−６ＲとＩＬ−６とは、適当な長さの
ペプチドリンカーを介して融合されていても良いし、か
かるペプチドリンカーを介することなく直接に融合され
ていても良い。前者の例としては文献に記載された蛋白
質（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，
１５，１４２頁，１９９７年、Ｃｈｅｂａｔｈら，Ｅｕ
ｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．，８，３５９頁，１
９９７年；特開平１１−１９６８９７号）が例示でき、
後者の例としては特願平１１−２１７８８号に記載され
たものが例示できる。
そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、そのＣ末端側にＩ
Ｌ−６が位置したものと、その逆にＮ末端側にＩＬ−６
が位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６Ｒが位置したもののいず
れでも良い。ＩＬ−６ＲとＩＬ−６とは、適当な長さの
ペプチドリンカーを介して融合されていても良いし、か
かるペプチドリンカーを介することなく直接に融合され
ていても良い。前者の例としては文献に記載された蛋白
質（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，
１５，１４２頁，１９９７年、Ｃｈｅｂａｔｈら，Ｅｕ
ｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．，８，３５９頁，１
９９７年；特開平１１−１９６８９７号）が例示でき、
後者の例としては特願平１１−２１７８８号に記載され
たものが例示できる。
【００１２】ＩＬ−６Ｒは、天然には４６８アミノ酸残
基で構成された膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領
域、膜貫通領域及び細胞内領域からなる（Ｙａｍａｓａ
ｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，８２５頁，１９８８
年）。ヒトＩＬ−６Ｒでは、前記シグナル領域はＮ末端
１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残
基付近まで、前記細胞外領域は２０番目のロイシン残基
付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、前
記膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６
番目のロイシン残基付近まで、そして前記細胞内領域は
３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアル
ギニン残基付近までと考えられている。前記細胞外領域
はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領
域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロ
イシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付
近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバ
リン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと
考えられている。ＩＬ−６Ｒにおいて、ＩＬ−６との結
合、即ちＩＬ−６が有する生理活性を細胞に伝達するた
めに必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イ
ムノグロブリン様領域は不要であることが知られてい
る。従ってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成する
ＩＬ−６Ｒとしては、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこ
と、その細胞外領域の全部又は細胞外領域のサイトカイ
ンレセプター領域のいずれかのみからなる、部分的ＩＬ
−６Ｒを用いることもできる。
基で構成された膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領
域、膜貫通領域及び細胞内領域からなる（Ｙａｍａｓａ
ｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，８２５頁，１９８８
年）。ヒトＩＬ−６Ｒでは、前記シグナル領域はＮ末端
１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残
基付近まで、前記細胞外領域は２０番目のロイシン残基
付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、前
記膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６
番目のロイシン残基付近まで、そして前記細胞内領域は
３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアル
ギニン残基付近までと考えられている。前記細胞外領域
はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領
域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロ
イシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付
近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバ
リン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと
考えられている。ＩＬ−６Ｒにおいて、ＩＬ−６との結
合、即ちＩＬ−６が有する生理活性を細胞に伝達するた
めに必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イ
ムノグロブリン様領域は不要であることが知られてい
る。従ってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成する
ＩＬ−６Ｒとしては、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこ
と、その細胞外領域の全部又は細胞外領域のサイトカイ
ンレセプター領域のいずれかのみからなる、部分的ＩＬ
−６Ｒを用いることもできる。
【００１３】ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質中のＩＬ
−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２
アミノ酸残基の分泌型蛋白質である（Ｈｉｒａｎｏら，
Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年）。ＩＬ
−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス
全てが必要であることが知られている。従って、本発明
で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべ
てを有するものであれば良い。
−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２
アミノ酸残基の分泌型蛋白質である（Ｈｉｒａｎｏら，
Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年）。ＩＬ
−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス
全てが必要であることが知られている。従って、本発明
で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべ
てを有するものであれば良い。
【００１４】ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、これ
をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うで
容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６
をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配
列も既に知られている。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白
質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主には特
に制限がなく、大腸菌や、ＣＨＯ細胞等に代表される動
物細胞等の通常の遺伝子組換えで使用されているものを
使用することが可能である。中でも特に、ピキア・パス
トリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で
あることや、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して
安価に培養できることから、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質を製造するにあたり、特に好ましい宿主として例
示できる。
をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うで
容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６
をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配
列も既に知られている。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白
質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主には特
に制限がなく、大腸菌や、ＣＨＯ細胞等に代表される動
物細胞等の通常の遺伝子組換えで使用されているものを
使用することが可能である。中でも特に、ピキア・パス
トリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で
あることや、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して
安価に培養できることから、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質を製造するにあたり、特に好ましい宿主として例
示できる。
【００１５】本発明の造血細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤
は、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質からなり、他の生
理活性物質、例えばＳＣＦ、ＩＬ−３、ＦＬ、ＴＰＯ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等を必要としない増幅剤である。本
願発明は、ＣＤ３４を発現しているか否かを指標として
臍帯血、末梢血又は骨髄から選択した造血細胞を含む画
分を、ｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）にて前記増幅剤を含む
培地中で培養して造血幹細胞を増殖し、造血前駆細胞を
増殖、分化させることを含む。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質は、培地成分とは別個の試薬として提供するこ
ともできるし、予め培地成分に添加した状態で提供する
こともできる。例えばα−ＭＥＭ培地に添加して使用す
るのであれば、２５０μｇ／ｍｌ程度使用すれば良い。
は、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質からなり、他の生
理活性物質、例えばＳＣＦ、ＩＬ−３、ＦＬ、ＴＰＯ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等を必要としない増幅剤である。本
願発明は、ＣＤ３４を発現しているか否かを指標として
臍帯血、末梢血又は骨髄から選択した造血細胞を含む画
分を、ｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）にて前記増幅剤を含む
培地中で培養して造血幹細胞を増殖し、造血前駆細胞を
増殖、分化させることを含む。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質は、培地成分とは別個の試薬として提供するこ
ともできるし、予め培地成分に添加した状態で提供する
こともできる。例えばα−ＭＥＭ培地に添加して使用す
るのであれば、２５０μｇ／ｍｌ程度使用すれば良い。
【００１６】ｅｘ ｖｉｖｏ増幅は、例えばプラスチッ
クバッグのような容器の中で、例えばＩＬ−６Ｒ・ＩＬ
−６融合蛋白質を添加した無血清培地中で前記造血細胞
含有画分を３７℃、数日〜３週間培養することにより実
施できる。なお本願発明により増幅された造血細胞を患
者に戻す操作は、現行の末梢血幹細胞移植と同じ方法を
採用すれば良い。
クバッグのような容器の中で、例えばＩＬ−６Ｒ・ＩＬ
−６融合蛋白質を添加した無血清培地中で前記造血細胞
含有画分を３７℃、数日〜３週間培養することにより実
施できる。なお本願発明により増幅された造血細胞を患
者に戻す操作は、現行の末梢血幹細胞移植と同じ方法を
採用すれば良い。
【００１７】
【発明の実施の形態】本願発明を更に詳細に説明するた
めに実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
めに実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
【００１８】実施例１ 各種ファクターのＣＤ３４陽性
細胞に対するコロニー形成誘導効果 ＣＤ３４陽性細胞（商品名；Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃ
Ｄ３４＋ Ｃｅｌｌｓ、宝酒造（株）製）２０００個
を、４０％メチルセルロース（信越化学（株）製）、３
０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．０１mM２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社
製）、及び以下の１から４のいずれかを含むα−ＭＥＭ
（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用
プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社製）に加え、３７℃、
５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で半固定培養した。
細胞に対するコロニー形成誘導効果 ＣＤ３４陽性細胞（商品名；Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃ
Ｄ３４＋ Ｃｅｌｌｓ、宝酒造（株）製）２０００個
を、４０％メチルセルロース（信越化学（株）製）、３
０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．０１mM２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社
製）、及び以下の１から４のいずれかを含むα−ＭＥＭ
（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用
プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社製）に加え、３７℃、
５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で半固定培養した。
【００１９】１；ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質（Ｆ
Ｐ６；特願平１１−１２３４１１号に１１２ＶＡＤとし
て記載した、ＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリン残
基から３３３番目のアラニン残基のＣ末端側に、ＩＬ−
６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番
目のメチオニン残基が直接ペプチド結合した融合蛋白
質）（２５０ｎｇ／ｍｌ） ２；ＩＬ−６（Ｙａｓｕｋａｗａら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｌｅｔｔ．，１２，４１９頁，１９９０年）（１００ｎ
ｇ／ｍｌ） ３；ＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎ
ｇ／ｍｌ） ４；ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎｇ／
ｍｌ） ２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行
い、顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー
（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（Ｇ
Ｍ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロフ
ァージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロ
ニー（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー（Ｍｋ）の７種類
に分類した。結果を図１に示す。
Ｐ６；特願平１１−１２３４１１号に１１２ＶＡＤとし
て記載した、ＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリン残
基から３３３番目のアラニン残基のＣ末端側に、ＩＬ−
６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番
目のメチオニン残基が直接ペプチド結合した融合蛋白
質）（２５０ｎｇ／ｍｌ） ２；ＩＬ−６（Ｙａｓｕｋａｗａら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｌｅｔｔ．，１２，４１９頁，１９９０年）（１００ｎ
ｇ／ｍｌ） ３；ＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎ
ｇ／ｍｌ） ４；ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎｇ／
ｍｌ） ２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行
い、顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー
（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（Ｇ
Ｍ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロフ
ァージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロ
ニー（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー（Ｍｋ）の７種類
に分類した。結果を図１に示す。
【００２０】図１から明らかなように、１を加えた場合
では、２、３又は４を加えた場合を大きく上回る数のコ
ロニーが形成された。このことは、ＦＰ６はＩＬ−６、
ＩＬ−１１、ＴＰＯと比較して非常に造血細胞の増幅効
果（コロニー形成効果）を有することを示す。
では、２、３又は４を加えた場合を大きく上回る数のコ
ロニーが形成された。このことは、ＦＰ６はＩＬ−６、
ＩＬ−１１、ＴＰＯと比較して非常に造血細胞の増幅効
果（コロニー形成効果）を有することを示す。
【００２１】実施例２ 各種ファクターのＣＤ３４陽性
細胞に対するコロニー形成細胞増幅効果 ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清ア
ルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプトエ
タノール、以下の１から５のいずれかを含むα−ＭＥＭ
（Ｆｌｏｗ社製）３ｍｌを分注した１２穴ウエル（Ｎｕ
nｃ社製）に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の
条件で浮遊培養した。
細胞に対するコロニー形成細胞増幅効果 ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清ア
ルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプトエ
タノール、以下の１から５のいずれかを含むα−ＭＥＭ
（Ｆｌｏｗ社製）３ｍｌを分注した１２穴ウエル（Ｎｕ
nｃ社製）に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の
条件で浮遊培養した。
【００２２】１；ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ） ２；ＦＰ６（１００ｎｇ／ｍｌ） ３；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ） ４；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ） ５；ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ） １週間後、細胞数を計測した。上記のようにして培養し
た細胞それぞれ１０００個及び浮遊培養に使用しなかっ
た前記細胞２０００個を、４０％メチルセルロース、３
０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．０１mM ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社
製）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ
ｈ社製）、ＴＰＯ（４ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍ
ｌ）、ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（２００Ｕ／
ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ
（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα
−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮
遊培養用プラスチック培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ
2、湿度１００％の条件で半固定培養した。結果を図２
に示す。
た細胞それぞれ１０００個及び浮遊培養に使用しなかっ
た前記細胞２０００個を、４０％メチルセルロース、３
０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．０１mM ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社
製）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ
ｈ社製）、ＴＰＯ（４ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍ
ｌ）、ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（２００Ｕ／
ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ
（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα
−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮
遊培養用プラスチック培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ
2、湿度１００％の条件で半固定培養した。結果を図２
に示す。
【００２３】２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニー
の同定を行い全コロニー数およびＭｉｘコロニー数の計
測を行った。コロニー形成細胞の増加率は以下の式１に
より求めた。Ｍｉｘコロニー形成細胞の増加率を以下の
式２により求めた。
の同定を行い全コロニー数およびＭｉｘコロニー数の計
測を行った。コロニー形成細胞の増加率は以下の式１に
より求めた。Ｍｉｘコロニー形成細胞の増加率を以下の
式２により求めた。
【００２４】式１；（Ａ×Ｂ）／Ｃ ただし、Ａ＝一週間浮遊培養した後の全コロニー数 Ｂ＝一週間浮遊培養した後の全細胞数／（１０００×
（６０００／２０００））。
（６０００／２０００））。
【００２５】Ｃ＝浮遊培養する前の全部コロニー数。
【００２６】式２；（Ａ×Ｂ）／Ｃ ただし、Ａ＝一週間浮遊培養した後のＭｉｘコロニー数 Ｂ＝一週間浮遊培養した後の全細胞数／（１０００×
（６０００／２０００））。
（６０００／２０００））。
【００２７】Ｃ＝浮遊培養する前のＭｉｘコロニー数。
【００２８】図２から明らかなように、１又は２を加え
た場合は、３、４又は５を加えた場合を上回るコロニー
形成細胞の増幅率とＭｉｘコロニー形成細胞の増幅率が
認められた。このことは、ＦＰ６がＩＬ−６、ＩＬ−１
１、ＴＰＯと比較して非常に強いコロニー形成細胞増幅
効果および未成熟な造血前駆細胞の増幅効果を有するこ
とを示す。
た場合は、３、４又は５を加えた場合を上回るコロニー
形成細胞の増幅率とＭｉｘコロニー形成細胞の増幅率が
認められた。このことは、ＦＰ６がＩＬ−６、ＩＬ−１
１、ＴＰＯと比較して非常に強いコロニー形成細胞増幅
効果および未成熟な造血前駆細胞の増幅効果を有するこ
とを示す。
【００２９】実施例３ ＦＰ６のＣＤ３４陽性細胞に対
するＭｉｘコロニー形成細胞増幅効果 ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清ア
ルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプトエ
タノール、ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥ
Ｍ１ｍｌを分注した２４穴ウエル（Ｎｕnｃ社製）に加
え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で浮遊培
養した。
するＭｉｘコロニー形成細胞増幅効果 ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清ア
ルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプトエ
タノール、ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥ
Ｍ１ｍｌを分注した２４穴ウエル（Ｎｕnｃ社製）に加
え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で浮遊培
養した。
【００３０】培養開始後３、６、１０、１４日目に細胞
数を計測した。各計測後に、培養した細胞のうちの５０
０個を、４０％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清
アルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプト
エタノール、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（４
ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０
０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−Ｃ
ＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ
社）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック
培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条
件で半固定培養した。
数を計測した。各計測後に、培養した細胞のうちの５０
０個を、４０％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清
アルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM ２−メルカプト
エタノール、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（４
ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０
０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−Ｃ
ＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ
社）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック
培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条
件で半固定培養した。
【００３１】比較のために、浮遊培養する前のＣＤ３４
陽性細胞２０００個についても、同様に半固定培養し
た。
陽性細胞２０００個についても、同様に半固定培養し
た。
【００３２】それぞれ２週間後に、倒立顕微鏡下の観察
でコロニーの同定を行い、Ｍｉｘコロニー数の計測を行
った。更に、ＣＤ３４陽性細胞２０００個を浮遊培養せ
ずに、直ぐに半固定培養した場合（１）、及び、３日間
培養した後に半固定培養した場合（２）、６日間培養し
た後に半固定培養した場合（３）、１０日間培養した後
に半固定培養した場合（４）、１４日間培養した後に半
固定培養した場合（５）のＭｉｘコロニー形成数を下記
式３により算出した。結果を図３に示す。
でコロニーの同定を行い、Ｍｉｘコロニー数の計測を行
った。更に、ＣＤ３４陽性細胞２０００個を浮遊培養せ
ずに、直ぐに半固定培養した場合（１）、及び、３日間
培養した後に半固定培養した場合（２）、６日間培養し
た後に半固定培養した場合（３）、１０日間培養した後
に半固定培養した場合（４）、１４日間培養した後に半
固定培養した場合（５）のＭｉｘコロニー形成数を下記
式３により算出した。結果を図３に示す。
【００３３】式３；[浮遊培養した後のＭｉｘコロニー
数×（浮遊培養した後の全細胞数／５００／（６０００
／２０００））] 図３から明らかなように、２〜３では１と比較して、顆
粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーの増加が
認められた。このことは、ＦＰ６はより未分化な造血幹
細胞の増幅を誘導し、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅に適している
ことを示す。
数×（浮遊培養した後の全細胞数／５００／（６０００
／２０００））] 図３から明らかなように、２〜３では１と比較して、顆
粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーの増加が
認められた。このことは、ＦＰ６はより未分化な造血幹
細胞の増幅を誘導し、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅に適している
ことを示す。
【００３４】
【発明の効果】本願発明により提供されるＩＬ−６Ｒ・
ＩＬ−６融合蛋白質からなる増幅剤は、他の生理活性物
質を併用する必要なしに、それ単独で造血幹細胞や造血
前駆細胞を分化、増殖するための増幅剤としての効果を
有する。この結果、従来の３種類以上の生理活性物質を
用いる増幅剤と比較して、増幅効果に影響を与える生理
活性物質間の比率を考える必要がないという効果があ
る。
ＩＬ−６融合蛋白質からなる増幅剤は、他の生理活性物
質を併用する必要なしに、それ単独で造血幹細胞や造血
前駆細胞を分化、増殖するための増幅剤としての効果を
有する。この結果、従来の３種類以上の生理活性物質を
用いる増幅剤と比較して、増幅効果に影響を与える生理
活性物質間の比率を考える必要がないという効果があ
る。
【００３５】また、高価な生理活性物質を複数種類使用
する必要がないため、安価に増幅剤を提供し得るという
効果もある。
する必要がないため、安価に増幅剤を提供し得るという
効果もある。
【００３６】そして更には、複数種類の生理活性物質を
使用する場合、各生理活性物質それぞれに要求される純
度や活性の均一化についても、本願発明ではＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質一種類しか使用しないため、その
製造及び精製は比較的容易に行い得るという効果があ
り、しかも、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造す
る際には、比較的容易にロット間格差を生じさせないよ
うに管理することも可能である。
使用する場合、各生理活性物質それぞれに要求される純
度や活性の均一化についても、本願発明ではＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質一種類しか使用しないため、その
製造及び精製は比較的容易に行い得るという効果があ
り、しかも、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造す
る際には、比較的容易にロット間格差を生じさせないよ
うに管理することも可能である。
【図１】図１は、実施例１に示す方法で、１；ＦＰ６
（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）、３；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＴＰ
Ｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下でＣＤ３４陽性細胞２０
００個を培養し、各種コロニー数を計測した結果を示す
図である。図中、Ｇは顆粒球コロニーを、Ｍはマクロフ
ァージコロニーを、ＧＭは顆粒球・マクロファージの混
合コロニーを、Ｂｌａｓｔは芽球コロニーを、Ｍｉｘは
顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーを、Ｂ
ＦＵ−Ｅは赤芽球コロニーを、Ｍｋは巨核球コロニーを
それぞれ示す。
（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）、３；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＴＰ
Ｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下でＣＤ３４陽性細胞２０
００個を培養し、各種コロニー数を計測した結果を示す
図である。図中、Ｇは顆粒球コロニーを、Ｍはマクロフ
ァージコロニーを、ＧＭは顆粒球・マクロファージの混
合コロニーを、Ｂｌａｓｔは芽球コロニーを、Ｍｉｘは
顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーを、Ｂ
ＦＵ−Ｅは赤芽球コロニーを、Ｍｋは巨核球コロニーを
それぞれ示す。
【図２】図２は、実施例２に示す方法で、１；ＦＰ６
（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＦＰ６（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）、３；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＩＬ−
１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、５；ＴＰＯ（１００ｎｇ／
ｍｌ）存在下でのＣＤ３４陽性細胞を１週間培養した後
のコロニー形成細胞の増加率とＭｉｘコロニー形成細胞
の増加率を求めた図である。
（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＦＰ６（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）、３；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＩＬ−
１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、５；ＴＰＯ（１００ｎｇ／
ｍｌ）存在下でのＣＤ３４陽性細胞を１週間培養した後
のコロニー形成細胞の増加率とＭｉｘコロニー形成細胞
の増加率を求めた図である。
【図３】図３は、実施例３に示す方法で、ＣＤ３４陽性
細胞を、１；０日間、２；３日間、３；６日間、４；１
０日間、５；１４日間培養した後のＭｉｘコロニー形成
数を求めた図である。
細胞を、１；０日間、２；３日間、３；６日間、４；１
０日間、５；１４日間培養した後のＭｉｘコロニー形成
数を求めた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 保川 清 神奈川県川崎市麻生区上麻生３−22−11− 107 (72)発明者 石黒 敬彦 神奈川県横浜市港北区岸根町490−17 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB19 BB34 4H045 AA10 BA41 CA40 DA02 DA51 EA28 FA74
Claims (4)
- 【請求項１】ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋
白質からなる、造血細胞の生体外培養における増幅剤。 - 【請求項２】前記融合蛋白質は、Ｎ末端側からＩＬ−６
レセプター部分、ＩＬ−６部分の順で融合されたもので
あることを特徴とする、請求項１の増幅剤。 - 【請求項３】前記融合蛋白質は、天然のＩＬ−６レセプ
ターを構成するアミノ酸残基のＣ末端側に天然のＩＬ−
６を構成するアミノ酸残基のＮ末端がペプチド結合され
たものであることを特徴とする、請求項１の増幅剤。 - 【請求項４】請求項１乃至３の造血幹細胞の増幅剤を使
用することを特徴とする、造血幹細胞の生体外培養にお
ける増幅方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35047399A JP4453135B2 (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | 造血細胞の新規増幅剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35047399A JP4453135B2 (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | 造血細胞の新規増幅剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161350A true JP2001161350A (ja) | 2001-06-19 |
| JP4453135B2 JP4453135B2 (ja) | 2010-04-21 |
Family
ID=18410739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35047399A Expired - Lifetime JP4453135B2 (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | 造血細胞の新規増幅剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4453135B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009072635A1 (ja) | 2007-12-06 | 2009-06-11 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | ヘテロ環化合物による造血幹細胞の増幅方法 |
| WO2009113595A1 (ja) | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 独立行政法人理化学研究所 | 造血幹／前駆細胞の特性を有する細胞の製造方法 |
| WO2011158806A1 (ja) | 2010-06-14 | 2011-12-22 | 日産化学工業株式会社 | 造血幹細胞の製造方法 |
| US9212348B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-12-15 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Method for producing hematopoietic stem cells using pyrazole compounds |
| US9328085B2 (en) | 2009-06-04 | 2016-05-03 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Heterocyclic compounds and expansion agents for hematopoietic stem cells |
-
1999
- 1999-12-09 JP JP35047399A patent/JP4453135B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009072635A1 (ja) | 2007-12-06 | 2009-06-11 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | ヘテロ環化合物による造血幹細胞の増幅方法 |
| US9527828B2 (en) | 2007-12-06 | 2016-12-27 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Method for expanding hematopoietic stem cells using heterocyclic compound |
| WO2009113595A1 (ja) | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 独立行政法人理化学研究所 | 造血幹／前駆細胞の特性を有する細胞の製造方法 |
| US9328085B2 (en) | 2009-06-04 | 2016-05-03 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Heterocyclic compounds and expansion agents for hematopoietic stem cells |
| WO2011158806A1 (ja) | 2010-06-14 | 2011-12-22 | 日産化学工業株式会社 | 造血幹細胞の製造方法 |
| US9187728B2 (en) | 2010-06-14 | 2015-11-17 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Method for producing hematopoietic stem cells |
| US9212348B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-12-15 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Method for producing hematopoietic stem cells using pyrazole compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4453135B2 (ja) | 2010-04-21 |
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