JP2001145875A - 食細菌性原生動物を用いたバイオ環境修復方法 - Google Patents

食細菌性原生動物を用いたバイオ環境修復方法

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JP2001145875A JP2000269088A JP2000269088A JP2001145875A JP 2001145875 A JP2001145875 A JP 2001145875A JP 2000269088 A JP2000269088 A JP 2000269088A JP 2000269088 A JP2000269088 A JP 2000269088A JP 2001145875 A JP2001145875 A JP 2001145875A
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Richard Geoffrey Mattison
ジェフリー マチソン リチャード
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Abstract

(57)【要約】 【課題及び解決手段】 本発明は、食細菌性原生動物
（特にべん毛虫類）を使用して、石油由来の炭化水素類
を含む有機汚染物質の生物分解に関わるインサイチュバ
イオ環境修復方法とバイオリアクターバイオ環境修復方
法の両方の効率を増加させるバイオ環境修復方法を提供
する。食細菌性原生動物は、単独又は適当な細菌と組み
合わせて汚染部位又はバイオリアクターに添加してバイ
オ環境修復を促進し且つ高めることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、石油由来の炭化水
素類（油）を含む有機汚染物質の生物分解に関わるイン
サイチュバイオ環境修復方法とバイオリアクターバイオ
環境修復方法の両方の効率を増加させるために、食細菌
性原生動物（特にべん毛虫類）を使用するバイオ環境修
復（バイオレメディエーション：bioremediatoin）方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】この分
野は、商業的な可能性がかなりあり、既に、非常に数多
くの会社が、土壌等の自然環境において油流出物を「ク
リーンアップ」するために細菌の能力を利用し始めてい
る。
【０００３】石油由来の炭化水素類を含む有機汚染物質
による汚染の問題は、陸地（土壌、地表下及び地下水帯
水層）、水中（川及び湖）及び海洋環境において広範囲
に重要性を有している。数多くの比較的可溶な石油由来
の炭化水素類に関連する毒性は、環境のみならずヒトの
健康にとっても危険である。これは、地下水帯水層、川
及び湖が、我々の飲料水を大量に供給しているという事
実による。最も有害且つ頻繁に見られる石油由来の炭化
水素類は、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン及びキ
シレン（ＢＴＥＸ）である。これらの石油由来の炭化水
素類は、水よりもかなり軽く、したがって流出したとき
には、表面から土壌／堆積物マトリックスを介してしみ
込み、地下水面で膜状に沈降することがよくある。この
地下水面は、深さがさまざまで、およそ３〜７メートル
である。
【０００４】汚染部位を処理するためのバイオ環境修復
方法では、典型的には、主要炭素源及びエネルギー源と
して有機汚染物質を利用する細菌を用いる。これらの方
法は、２つの種類、すなわち、（１）インサイチュ（in
situ）法及び（２）エクスサイチュ（ex situ）法に分
類できる。インサイチュバイオ環境修復では、細菌及び
／又は酸素／酸化剤を冒された部位に直接放出する工程
を含む。エクスサイチュバイオ環境修復では、冒された
材料を物理的に掘り出したり、除去した後、続いてバイ
オリアクター容器で処理する工程を含む。インサイチュ
バイオ環境修復は、地下水帯水層における汚染の処理に
ついては環境に優しく且つ経済的な方法であると広く考
えられている。この方法は、冒された領域に可溶性汚染
物質及び酸素／酸化剤が十分に流れることができるべく
十分な導水性を有する最適条件下で、存在する細菌及び
／又は添加する細菌が汚染物質を分解する総合的な能力
に依存するものである。非常に数多くの天然細菌が、石
油由来の炭化水素類を分解及び無毒化することができ
る。特に重要なものに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属
するもの、プロテオバクテリアのベータ亜門、最も顕著
にはＡｚｏａｒｃｕｓ属に属するもの及び数多くの硫酸
塩還元細菌を含むプロテオバクテリアのデルタ亜門に属
するものがある。これらの細菌は、好気性から硝酸塩還
元及び硫酸塩還元の範囲の種々のレドックス条件下で石
油由来の炭化水素類を分解する。
【０００５】インサイチュバイオ環境修復の効率は、２
つの点で制限される、すなわち、（１）細菌の制限され
ない成長により、酸化剤及び他の成長因子が急速に枯渇
する場合、及び／又は（２）細菌の制限されない成長に
より導水性が減少し、バイオクロッギング（biocloggin
g）が生じる場合である。すなわち、数多くの生育細菌
により産生される細菌性バイオマス及び／又はエキソポ
リメリック（exopolymeric）「粘液（slim）」から生じ
るバイオクロッグ（bioclog）は、マトリックス（例え
ば、土壌／堆積物）の水に対する浸透性を減少させる。
両方の現象は、当該分野において言及されている。ま
た、これらは、細菌を捕食する（食細菌性）原生動物の
不存在下での実験条件下でのモデル系でも示された。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従来のバイオ環境修復方
法の問題を解決するために、本発明者は、広範な研究を
実施し、以下の知見を得た。すなわち、有機汚染物質を
利用する細菌とこのような細菌を食べる原生動物とを組
み合わせて有機汚染物質に添加すると、原生動物の食細
菌性特性にもかかわらず、細菌によるバイオ環境修復が
意外にも向上し且つ促進する。このような新規な知見に
基づき、本発明はなされたものである。
【０００７】したがって、本発明は、食細菌性原生動物
（特にべん毛虫類）を使用して、石油由来の炭化水素類
を含む有機汚染物質の生物分解に関わるインサイチュバ
イオ環境修復方法又はエクスサイチュバイオ環境修復方
法の効率が増加したバイオ環境修復方法を提供する。こ
の食細菌性原生動物は、単独又は適当な細菌と組み合わ
せて汚染部位又はバイオリアクターに添加してバイオ環
境修復を簡便且つ促進することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の方法では、食細菌性原生
動物（とりわけべん毛虫類）を単独又は適当な細菌と組
み合わせて汚染部位又はバイオリアクターに添加してバ
イオ環境修復を簡便にするとともに、バイオ環境修復を
促進する。
【０００９】このバイオ環境修復の対象は、有機汚染物
質、とりわけ石油由来の炭化水素（例えば、ベンゼン、
トルエン、エチルベンゼン及びキシレン）である。この
対象物は、水、海水、砂、土壌等の他の成分と混合され
ていてもよい。
【００１０】本発明で使用される細菌は、バイオ環境修
復ができる限りは特に限定されない。一種の細菌を使用
してもよいし、複数種の細菌を組み合わせて使用するこ
ともできる。細菌は、当該汚染物質を分解できるもので
あり且つ食細菌性原生動物（とりわけべん毛虫類）に許
容できる食源でもあるものが適当である。細菌の具体例
を挙げると、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏａｒｃ
ｕｓ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｍａｍｏｎ
ａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ属及び硫酸塩還元細菌に属するもの、とりわ
けＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏａｒｃｕｓ属及び
硫酸塩還元細菌（例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅ
ｒ）に属するものなどがあるが、これらには限定されな
い。細菌は、通常の方法により単離及び培養できる（Ａ
ｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．及びＰａｒｋｓ，Ｌ．Ｃ．１９９
３、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ｍｅｄｉａ、米国フロリダ州Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎにある、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社発行参照）。ま
た、市販の細菌、寄託機関（例えば、ＡＴＣＣ、ＤＳＭ
Ｚ等）から入手できるもの及び自然から単離したものを
使用してもよい。細菌の使用量は、バイオ環境修復がで
きる限りは特に限定されない。
【００１１】本発明で使用する食細菌性原生動物は、上
記した細菌を食べることができる限りは特に限定されな
い。一種の食細菌性原生動物を使用してもよいし、複数
種の食細菌性原生動物を組み合わせて使用することもで
きる。食細菌性原生動物は、繊毛虫類、べん毛虫類及び
アメーバなどであるが、べん毛虫類が好ましい。食細菌
性原生動物の具体例としては、Ｈｅｔｅｒｏｍｉｔａ
属、Ａｄｒｉａｍｏｎａｓ属、Ｂｏｄｏ属、Ｃｅｒｃｏ
ｍｏｎａｓ属及びＳｐｕｍｅｌｌａ属（好ましくはＨｅ
ｔｅｒｏｍｉｔａ属）に属するもの、とりわけＨｅｔｅ
ｒｏｍｉｔａ ｇｌｏｂｏｓａ種、Ａｄｒｉａｍｏｎａ
ｓ ｐｅｒｉｔｏｃｒｅｓｃｅｎｓ種、Ｂｏｄｏ ｓａ
ｌｔａｎｓ種、Ｃｅｒｃｏｍｏｎａｓ ｌｏｎｇｉｃａ
ｕｄａ種及びＳｐｕｍｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ種
（好ましくはＨｅｔｅｒｏｍｉｔａｇｌｏｂｏｓａ種）
に属するものがあるが、これらには限定されない。食細
菌性原生動物の株の具体例としては、Ｈｅｔｅｒｏｍｉ
ｔａ ｇｌｏｂｏｓａ ＡＴＣＣ ５０７８０、Ａｄｒ
ｉａｍｏｎａｓ ｐｅｒｉｔｏｃｒｅｓｃｅｎｓ ＡＴ
ＣＣ ５０３９８、Ｂｏｄｏ ｓａｌｔａｎｓ ＣＣＡ
Ｐ １９０７／２、Ｃｅｒｃｏｍｏｎａｓ ｌｏｎｇｉ
ｃａｕｄａ ＣＣＡＰ １９１０／２及びＳｐｕｍｅｌ
ｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ ＣＣＡＰ ９５５／１などが
あるが、これらには限定されない。食細菌性原生動物
は、通常の方法により単離及び培養できる（Ｋｅｍｐ，
Ｐ．Ｆ．、Ｓｈｅｒｒ，Ｂ．Ｆ．、Ｓｈｅｒｒ，Ｅ．
Ｂ．及びＣｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．１９９３、Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ、米国フロリダ州Ｂ
ｏｃａＲａｔｏｎにある、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社発行参
照）。また、市販の食細菌性原生動物、寄託機関（例え
ば、ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ、ＣＣＡＰ（英国ＬＡ２２０Ｌ
Ｐ、カンブリア州アンブルサイドにある、Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｏｚｏａ）等）から入手できるもの及び自然
から単離したものを使用してもよい。食細菌性原生動物
の使用量は、バイオ環境修復の向上及び促進が可能であ
る限りは特に限定されない。
【００１２】食細菌性原生動物及び細菌の種類の組み合
わせは、細菌が原生動物により食べられることができる
限りは特に限定されない。この組み合わせの具体例に
は、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ（とりわけ、ＤＳＭ１２８７７株）とＨｅｔｅｒ
ｏｍｉｔａ ｇｌｏｂｏｓａ（とりわけ、ＡＴＣＣ５０
７８０株）との組み合わせなどがあるが、これには限定
されない。
【００１３】好ましくは、食細菌性原生動物（例えば、
べん毛虫類）：細菌個数比＝１：１０1〜１０5（より好
ましくは、１０3〜１０4）で添加して、細菌の成長を動
的制御することができる。これにより、（１）バイオク
ロッギングが減少して、帯水層の導水性が向上すること
及び／又は（２）個々の汚染物質分解細菌の代謝率を増
加することにより、バイオ環境修復方法の効率が向上す
るであろう。
【００１４】バイオ環境修復方法自体は、食細菌性原生
動物を添加すること以外は、通常の方法により実施でき
る。また、天然のバイオ環境修復を利用することもでき
る。
【００１５】細菌、原生動物及び炭化水素類を含有する
実験培養物では、原生動物が存在すると、実際に細菌に
よる炭化水素類の分解速度が（減少されずむしろ）加速
されることが判明した。本発明は、したがって、細菌に
よる炭化水素類の分解速度の増加に及ぼす原生動物の効
果に関する。このようなことから、会社が、既存のバイ
オ環境修復方法を向上且つ促進するのに原生動物を利用
することが提案される。炭化水素の流出が、世界的に重
大な問題であるので、バイオ環境修復方法をさらに向上
させることは、極めて重要であろう。
【００１６】本発明に係るバイオ環境修復の向上及び促
進の機構は、十分には解明されていないが、以下の機構
によるものと思われる。
【００１７】食細菌性原生動物は、細菌性バイオクロッ
ギング現象を減少させて、その結果帯水層の導水性が向
上するものと思われる。
【００１８】食細菌性原生動物は、このような有機汚染
物質の生物分解及び無機質化を促進する。
【００１９】食細菌性原生動物は、炭素、窒素及びリン
を生態系に提供することにより、無機質化された有機汚
染物質のバイオアベイラビリティ（bioavailability）
を増加する。
【００２０】有機汚染された地下水帯水層等の部位で
は、食細菌性原生動物とともにこれらの細菌の比較的大
きな集団が発生する。細菌約１０8個／ｇ（土壌／堆積
物）及び原生動物１０5個／ｇ（土壌／堆積物）の大き
な集団が、表面に生じ、通常深さとともに減少する。上
記した有機汚染物質の存在下では、地下水面での細菌と
原生動物の数は、表面で見られる数に匹敵する。これら
の原生動物は、繊毛虫類、べん毛虫類及びアメーバなど
であるが、べん毛虫類が地下水帯水層においては最も数
が多い。ほとんどの繊毛虫類は、約１メートルの深さよ
り下では存在しない。インサイチュバイオ環境修復にお
ける食細菌性原生動物（とりわけべん毛虫類）の役割
は、細菌コミュニティのバイオマスを選択的に食べ且つ
それを制御する能力の間接的な結果であると考えられ
る。制御された細菌性バイオマスにより、バイオクロッ
ギングが減少し、ひいては導水性が向上する。また、原
生動物は、汚染物質分解細菌の代謝率を増加することに
より、バイオ環境修復を高めることもできる。また、原
生動物は、アンモニウム及びリン等の成長制限栄養源を
再無機質化することによりこれを容易にすることもでき
る。
【００２１】
【実施例】実施例１無垢の地下水帯水層が、以下の特性
を有するものと仮定する。すなわち、地下水帯水層は、
砂利（gravel）／粘土（clay）レンズ（lens）を有する
砂質土壌と、その下に位置する不浸透性粘土／岩の基盤
とからなる。地下水の流量は、２メートル／日である。
細菌（約１０7個／ｇ（堆積物））及び原生動物（約１
０4個／ｇ（堆積物））の固有集団が、地下水面で発生
する。原生動物コミュニティは、主として食細菌性べん
毛虫類からなる。
【００２２】この帯水層は、主にトルエンからなる石油
由来の炭化水素類の流出物で汚染されていると仮定する
（図１ａ）。１０3リットルのトルエンが、地下水面よ
り下の飽和帯水層で被膜又は非水性相液（ＮＡＰＬ）を
形成すると仮定する。地下水面での細菌及び原生動物の
固有集団は、それぞれ約１０8個／ｇ（堆積物）及び１
０5個／ｇ（堆積物）に増加する。細菌の固有集団の１
％のみがトルエンを分解できる。
【００２３】ＮＡＰＬのすぐ下流に、４本のある種の坑
井を図１ｂ及び図１ｃに示す設備に取り付けると仮定す
る。これらの坑井は、１平方メートルの領域の角のとこ
ろに位置させ且つ地下水面の下の飽和帯水層に延ばす。
各坑井を、シールドするが、但し、飽和帯水層における
底１メートルのところはシールドをしないままとする。
４本の坑井のシールドをしてない部分は、飽和帯水層に
おける堆積物容積１立方メートルに定める。この立方物
（堆積物約５００ｋｇ）を、フローセルと称する。坑井
Ａ及びＢは圧入井であり、一方、Ｃ及びＤは取り出し坑
井である。
【００２４】トルエンは、地下水で最大飽和（５．６ｍ
Ｍ）に達し、２メートル／日でフローセルを通ってＮＡ
ＰＬの下流のプルーム（plume）に水平に移送されると
仮定する。したがって、約１リットル／日のトルエン
が、フローセルを通過する。
【００２５】（１）未処理帯水層における固有細菌集団
によるトルエンの消費量の評価 トルエンが、約２ミクロモル／ｇ（堆積物）／日の速度
で消費されると仮定する。フローセルでのトルエン消費
量は、約１モル／日であり、これは約１００ミリリット
ル／日に相当する。したがって、未処理帯水層では、フ
ローセルを通過するトルエンの約１０％が消費される。
【００２６】（２）バイオクロッギングなしでのインサ
イチュバイオ環境修復におけるトルエンの消費量の評価 十分な酸化剤、栄養源及びトルエン分解細菌を圧入井Ａ
及びＢに添加して、導入細菌の集団を菌数約１０9個／
ｇ（堆積物）に維持するものと仮定する。導入集団は、
最初は固有集団よりも１０倍多く、且つ増加するものと
予想される。これによりトルエン分解能が最低でも１０
倍増加すると仮定する。したがって、インサイチュバイ
オ環境修復された帯水層では、フローセルを通過するト
ルエンの約１００％が消費される。
【００２７】（３）バイオクロッギングを伴うインサイ
チュバイオ環境修復におけるトルエンの消費量の評価 圧入井からバイオクロッギングが次第に生じ、約３０日
後にフローセルを横断する導水性が約１００倍減少する
と仮定する。地下水の流れが減少し、フローセルにおけ
る導入された細菌集団及び固有細菌集団は、酸化剤、栄
養源及びトルエンについて次第に枯渇する。したがっ
て、バイオクロッギングにより、一ヶ月後に、フローセ
ルを通過するトルエンが約９９％減少する。さらに、短
期間で、バイオクロッギングが、ほとんど回復できない
現象となってしまうであろう。
【００２８】（４）食細菌性原生動物を添加した場合の
インサイチュバイオ環境修復におけるトルエンの消費量
の評価 十分な量の食細菌性原生動物を、圧入井に添加して、導
入された原生動物の集団を約１０6個／ｇ（堆積物）に
維持するものと仮定する。導入集団は、固有集団よりも
１０倍多く、平衡比を約１：１０００（導入細菌）に維
持する。細菌集団についての原生動物による制御によ
り、（３）で記載したようなフローセルにおけるバイオ
クロッギングの発生が顕著に減少する。したがって、イ
ンサイチュバイオ環境修復された帯水層においては、食
細菌性原生動物を添加することにより、（２）で記載し
たようなトルエンの分解に有利な状態が促進される。
【００２９】実施例２ 開発されたモデル食物連鎖により、バッチ培養における
トルエン分解細菌への食細菌性べん毛虫類による採食の
影響を調査した。
【００３０】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ ＤＳＭ１２８７７によるトルエンの消費速度
（最大０．３７フェムトモル／細胞／時間）は、食細菌
性べん毛虫Ｈｅｔｅｒｏｍｉｔａ ｇｌｏｂｏｓａ Ａ
ＴＣＣ５０７８０の存在下で、顕著に速くなった（最大
１．３８フェムトモル／細胞／時間）。このべん毛虫が
指数的に成長している間の、これらの細菌によるトルエ
ンの摂取速度は、最大で約７．５倍の増加が見られた。
【００３１】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓを、スイス国Ｓｔｕｄｅｎ近郊のディーゼルで
汚染された帯水層（深さ４メートル）から堆積物を用い
て単離した。堆積物を、ディーゼル１．０％に濃縮し、
細菌分離株を、希釈したバクトペプトン−トリプチケー
ス−酵母−グルコース寒天培地（１：２０）上で２５℃
で好気的に成長させた（Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｄ．Ｌ．及
びＧｈｉｏｒｓｅ，Ｗ．Ｃ．（１９８５）、Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：５８
０−５８８参照）。分離株を、再培養（ｘ３）して精製
した後、最小塩培地を含有する液体培養に接種し（Ｔｈ
ｏｍａｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｒｕｃｅ，Ｃ．Ｌ．、Ｇｏｒｄ
ｙ，Ｖ．Ｒ．、Ｄｕｓｔｏｎ，Ｋ．Ｌ．、Ｈｕｔｃｈｉ
ｎｓ，Ｓ．Ｒ．、Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｊ．Ｌ．及びＷａ
ｒｄ，Ｃ．Ｈ．（１９９７）Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２１３−
２２１参照）、１ｍＭのベンゼン、エチルベンゼン、ト
ルエン又はキシレン類（ｏ−、ｍ−、ｐ−）を、唯一の
炭素源として供給した。細菌の成長は、細胞混濁度の増
加及び炭素源濃度の減少を測定することにより示され
た。トルエン分解能を有する分離株を、特性付けし、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ（ＤＳＭＺ）（ドイツ国ブラウンシュバイク；ＤＳ
Ｍ１２８７７）に寄託した。
【００３２】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓを、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタ−メ
チルノナン（２０ミリリットル／リットル）に吸着させ
たトルエン（１０％ｖ／ｖ）を含有する鉱物塩培地
（１．８リットル）で成長させた。この培地を、一晩穏
やかに攪拌して、水性平衡濃度（１ｍＭトルエン）に到
達させた。細菌を添加し、培養を攪拌し、ばっき（１
日、２５℃）した後、対数期成長中に採取した。採取し
た細菌を、遠心分離により洗浄（７，５００ｇ×３）し
た後、土壌抽出塩（ＳＥＳ）培地に再懸濁し、直ちに使
用した。細菌を、唯一の炭素源としてＳＥＳ培地で成長
させることができなかった。ＳＥＳ培地は、（ｇ／リッ
トル）で、ＫＨ2ＰＯ4（０．４６）、Ｎａ2ＨＰＯ
4（３．１０）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０２）、Ｋ
ＮＯ3（０．２）及び土壌抽出液（１００ミリリット
ル）を含有するものであった。窒素とリンとを過剰に入
れ、成長抑制をしなかった。ＨＣｌ（１Ｎ）を添加する
ことによりｐＨを７．０に調整してから、オートクレー
ブ処理した。土壌抽出液は、Ｒφｎｎ等（Ｒφｎｎ，
Ｒ．、Ｅｋｅｌｕｎｄ，Ｆ．及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅ
ｎ，Ｓ．（１９９５）Ｐｅｄｏｂｉｏｌｏｇｉａ ３
９、１０−１９参照）にしたがって調製した。
【００３３】ドイツ国ヒュンクセ（Ｈｕｎｘｅ）付近の
廃石油精製所でのＢＴＥＸ汚染帯水層から得た堆積物を
用いて、Ｈｅｔｅｒｏｍｉｔａ ｇｌｏｂｏｓａを単離
した。堆積物を、種々の液状培地（ＳＥＳ培地を含む）
に接種し、微小生態系（ミクロコスム；microcosm）を
２５℃に維持し、１４日後に調査した。べん毛虫類の成
長は、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でカウントするこ
とにより求めた。生細菌を、蛍光色素４，６−ジアミジ
ノ−２−フェニルインドール（１マイクログラム／ミリ
リットル；１０分）で染色し、最小塩培地（３，０００
グラム；１０分）において遠心分離により洗浄（ｘ３）
した。染色細菌をこれらのべん毛虫類に与えた後、取り
込みや消化がないか顕微鏡検査した。
【００３４】成長べん毛虫類を、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓを有する新鮮な培地に再接種し、後で収穫した。
ＳＥＳ培地中でのべん毛虫類の２倍希釈系列をマルチウ
エルプレートにおけるそれらの消衰点まで調製した。成
長を示す最高希釈を使用してクローン培養を確立した。
一つの培養を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国バー
ジニア州マナッサス；ＡＴＣＣ５０７８０）に寄託し
た。
【００３５】テフロン（登録商標）シールを備えた培養
瓶（２５０ミリリットル）を、３つの実験群に分けた。
これらは、２つの処理群と一つの生物対照群であり、各
々６回反復した。処理群では、ＳＥＳ培地に細菌（１ｘ
１０8個／ミリリットル）を接種し、べん毛虫類（１×
１０5細胞／ミリリットル）の有無にしたがって分け
た。生物対照群は、ＳＥＳ培地に細菌とべん毛虫との両
方を接種し、オートクレーブ処理（１２１℃で２０分
間）により殺菌した。トルエンを、最終濃度約１ｍＭま
で添加し、瓶を振とうせずに２５℃でインキュベーショ
ンした。試料を各瓶から取り出し、菌数の測定とトルエ
ン濃度の測定を、定期的に６日間おこなった。得られた
データを、図２に示す。
【００３６】異なる成長段階及びべん毛虫の存在下又は
不存在下での細菌によるトルエン消費速度を、６日まで
の毎日の時間増加について測定した平均トルエン濃度の
変化（生物対照におけるトルエン吸収について補正）及
び平均細菌数の変化から計算した。べん毛虫類の数は、
べん毛虫類の一回の分裂を生じさせるのに必要とする細
菌数に基づいて「細菌当量」に換算した。次に、べん毛
虫の採食がなかったことを前提に、これらの「細菌当
量」を観察された細菌数と合計して、理論総細菌数を計
算により推定した（図３）。
【００３７】「細菌当量」を含めて計算したときのべん
毛虫類の存在下での細菌によるトルエン消費速度と、
「細菌当量」を含めないで計算したときのべん毛虫類の
存在下での細菌によるトルエン消費速度との間には、有
意差は見られなかった（ｐ＝０．７２９）。このこと
は、上記効果が単に細菌数の差異によるものではなく、
恐らくべん毛虫類の存在により誘発された細菌の特異的
な代謝活性の増加によるものであることを示唆してい
る。
【００３８】本発明を詳細且つ特定の実施態様を参照し
て説明したが、当業者には、本発明の思想及び範囲から
逸脱することなく種々の変化及び変更が可能であること
が明らかであろう。
【００３９】本出願は、英国特許出願第９９２０９３
７．１号（出願日１９９９年９月６日）及び英国特許出
願第９９２３０３１．０号（出願日１９９９年９月３０
日）に基づくものであり、これらの両方の出願は言及す
ることにより本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】トルエン汚染地下水帯水層の構造を示し、切断
図（１ａ）と、帯水層の平面図（１ｂ）とをフローセル
の詳細図（１ｃ）とともに示した。
【図２】べん毛虫類の存在下及び不存在下におけるトル
エンによる細菌の成長を示し、べん毛虫類の存在下
（○）及び不存在下（●）におけるトルエン濃度（２
ａ）、細菌数（２ｂ）、べん毛虫数（２ｃ）が、時間に
ついてプロットされた。無菌生物対照（■）も示した。
【図３】べん毛虫類の存在下（□）及び不存在下（■）
での細菌によるトルエンの経時的消費速度を示した。理
論総細菌数（べん毛虫類に相当する「細菌当量」であ
り、観察された細菌数と合計したもの）によるトルエン
の消費速度（■；灰色）とともに示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｆ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:39） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:39） Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ Ｃ１２Ｒ 1:39） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】有機汚染物質を利用できる少なくとも一種
    の細菌と、少なくとも一種の食細菌性原生動物とを、有
    機汚染物質に添加することを特徴とする、バイオ環境修
    復方法。
  2. 【請求項２】前記食細菌性原生動物を、前記細菌とは別
    に添加する、請求項１に記載のバイオ環境修復方法。
  3. 【請求項３】前記食細菌性原生動物を、前記細菌と組み
    合わせて添加する、請求項１に記載のバイオ環境修復方
    法。
  4. 【請求項４】前記食細菌性原生動物が、繊毛虫類、べん
    毛虫類及びアメーバからなる群から選択されたものであ
    る、請求項１に記載のバイオ環境修復方法。
  5. 【請求項５】前記食細菌性原生動物が、べん毛虫類であ
    る、請求項１に記載のバイオ環境修復方法。
  6. 【請求項６】前記食細菌性原生動物が、Ｈｅｔｅｒｏｍ
    ｉｔａ、Ａｄｒｉａｍｏｎａｓ、Ｂｏｄｏ、Ｃｅｒｃｏ
    ｍｏｎａｓ及びＳｐｕｍｅｌｌａからなる群から選択さ
    れる属に属するものである、請求項１に記載のバイオ環
    境修復方法。
  7. 【請求項７】前記食細菌性原生動物が、Ｈｅｔｅｒｏｍ
    ｉｔａに属するのものである、請求項１に記載のバイオ
    環境修復方法。
  8. 【請求項８】前記細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａ
    ｚｏａｒｃｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｃｏｍａ
    ｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏ
    ｂａｃｔｅｒ及び硫酸塩還元細菌からなる群から選択さ
    れる属に属するものである、請求項１に記載のバイオ環
    境修復方法。
  9. 【請求項９】前記細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に
    属するものである、請求項８に記載のバイオ環境修復方
    法。
  10. 【請求項１０】前記細菌が、Ａｚｏａｒｃｕｓ属に属す
    るものである、請求項８に記載のバイオ環境修復方法。
  11. 【請求項１１】前記細菌が、硫酸塩還元細菌である、請
    求項８に記載のバイオ環境修復方法。
  12. 【請求項１２】前記細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
    ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓであり、前記原生動物がＨｅｔ
    ｅｒｏｍｉｔａ ｇｌｏｂｏｓａである、請求項１に記
    載のバイオ環境修復方法。
  13. 【請求項１３】前記食細菌性原生動物と前記細菌との比
    が、約１：１０〜約１：１０5である、請求項１に記載
    のバイオ環境修復方法。
  14. 【請求項１４】前記有機汚染物質が、石油由来の炭化水
    素である、請求項１に記載のバイオ環境修復方法。
  15. 【請求項１５】前記石油由来の炭化水素が、ベンゼン、
    トルエン、エチルベンゼン及びキシレンからなる群から
    選択されたものである、請求項１４に記載のバイオ環境
    修復方法。
  16. 【請求項１６】インサイチュ（in situ）バイオ環境修
    復過程に、食細菌性原生動物を添加することを特徴とす
    る、インサイチュバイオ環境修復方法の効率を増加させ
    る方法。
  17. 【請求項１７】バッチ培養又はバイオリアクターにおけ
    るバイオ環境修復過程に、食細菌性原生動物を添加する
    ことを特徴とする、バッチ培養又はバイオリアクターに
    おけるバイオ環境修復方法の効率を増加させる方法。
  18. 【請求項１８】インサイチュバイオ環境修復方法の効率
    を増加させるための、食細菌性原生動物の使用。
  19. 【請求項１９】バッチ培養又はバイオリアクターにおけ
    るバイオ環境修復方法の効率を増加させるための、食細
    菌性原生動物の使用。
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