JP2001112468A - 組換え胆汁酸塩活性化リパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】ヒト由来胆汁酸塩活性化乳汁リパーゼ（Ｂ
ＡＬ）、これをコードする遺伝子配列の単離及びその発
現による胆汁酸塩活性化乳汁リパーゼの大量生産の方
法。 【効果】ウシ、ヒツジ等通常乳汁中にＢＡＬを含まない
動物のトランスジェニック動物に大量ＢＡＬを生産させ
て乳児用調合乳に利用することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、胆汁酸塩活性化乳
汁リパーゼをコードする遺伝子配列の単離およびその発
現による胆汁酸塩活性化乳汁リパーゼの生産に関する。

【０００２】

【従来の技術】米国政府は、国立衛生研究所の認可によ
り本発明に対して特定の権利を有する。

【０００３】ヒト乳汁は、乳汁タンパク質の0.5〜1%の
非常に高レベルで胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ）を
含有している。これは、Wangの"Fat Absorption"Vol. 1
Kuksis編、83〜117ページ（CRC Press, Inc., Boca Ra
tan, FL 1986）、ならびにOlivacronaおよびBengtsson
の"Lipases"、BorgstromおよびBrockman編、205〜261ペ
ージ（Elsevier, Amsterdam, The Netherlands 1984)に
記載の通りである。ＢＡＬの生理学的役割は、脂肪、特
にトリグリセリドの消化を助けて、脂肪酸および脂肪酸
塩を産生することである。

【０００４】ヒトＢＡＬは、WangおよびJohnsonのAnal.
Biochem. 133, 457-461 (1983)によって報告されてい
るように、精製均質化されている。米国特許第4,944,94
4号に記載のように、このタンパク質は、乳児、特に自
分でＢＡＬを十分産生しない未熟児の脂肪吸収およびこ
れに続く成長における、主たる速度制限因子であること
が現在判明している。また、調合乳にこの精製された酵
素を添加すると、これらの乳児の消化および成長が非常
に向上することも現在判明している。このことは、トリ
グリセリドを比較的高い割合で含有する、植物またはヒ
ト以外の乳汁タンパク質源ベースの乳児用調合乳を調製
する際に、臨床上重要である。なぜならば、ＢＡＬが添
加されていない場合には、これらの調合乳を与えられた
乳児は脂肪を消化できないからである。

【０００５】ＢＡＬの特異性および速度論的特性は、Wa
ngらの、J. Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981); J.
Lipid Res. 26, 824-830 (1985); J. Biol. Chem. 25
8, 9197-9202 (1983);およびBiochemistry 27, 4834-48
40 (1988)によって報告されている。胆汁酸塩のＢＡＬ
への結合は、生理学的基質の特異的加水分解に必要不可
欠である。胆汁酸塩は、ＢＡＬの触媒作用中の基質結合
にも関与する。これらの特性により、ＢＡＬはリポタン
パク質リパーゼおよび他の膵臓リパーゼとは異なる別個
のリパーゼのクラスを起源とすることが示唆される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、 Ｂ
ＡＬをコードする遺伝子配列を単離してヒト以外の乳汁
の乳児用調合乳に含有させるべき大量のＢＡＬを調製す
ることである。

【０００７】本発明のさらなる目的は、リパーゼの構造
および機能の関係をさらに分析し、かつ特徴付けるため
に使用される、ＢＡＬをコードする遺伝子配列を提供す
ることである。

【０００８】本発明のさらに他の目的は、他のリパーゼ
との構造関係を決定し、変異誘発研究のための手段を提
供するために、ＢＡＬをコードする遺伝子配列を提供す
ることである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒト胆
汁酸塩活性化乳汁リパーゼまたはそのポリペプチド部分
をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、こ
のリパーゼまたはその部分が共通配列ＰＶＰＰＴＧＤＳ
ＧＡＰを含むヌクレオチド配列が提供される。

【００１０】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は図２〜４の2353位〜2814位のヌクレオチド
配列に標準条件下でハイブリダイズする。

【００１１】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は胆汁酸塩に結合するアミノ酸配列をコード
する。

【００１２】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は、ＰＶＰＰＴＧＤＳＥＡＴ、ＰＶＰＰＴＧ
ＤＳＥＴＡ、ＰＶＰＰＴＧＤＳＧＡＰ、ＰＶＰＰＴＧＤ
ＡＧＰＰ、ＰＶＴＰＴＧＤＳＥＴＡ、ＰＶＰＰＴＧＤＳ
ＥＡＡ、およびＰＶＰＰＴＤＤＳＫＥＡからなる群から
選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードす
る。

【００１３】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は、開始コドンおよび終止コドンをさらに含
む。

【００１４】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は、発現用プロモーターをさらに含む。

【００１５】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は、トランスジェニック動物を作製するため
に胚に挿入するためのベクターをさらに含む。

【００１６】好ましい実施態様においては、上記ヌクレ
オチド配列は、検出用標識に結合している。

【００１７】本発明によれば、上記ヌクレオチド配列か
ら発現されるポリペプチドが提供される。

【００１８】好ましい実施態様においては、上記ポリペ
プチドは酵母または原核生物において発現される。

【００１９】好ましい実施態様においては、上記ポリペ
プチドは図２〜４の539位から714位までのアミノ酸配列
を有する。

【００２０】

【発明の実施の形態】ヒト乳汁ＢＡＬのｃＤＮＡの完全
な構造が開示されている。ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リ
パーゼ（ＢＡＬ）の18個のｃＤＮＡクローンを、抗体お
よび合成ヌクレオチドをプローブとして用いて、λgt11
およびλgt10中の泌乳しているヒト乳房ｃＤＮＡライブ
ラリーから同定した。４個のクローンを、配列分析のた
めに選択した。２個のクローンのｃＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列は、重なっており、全体で3018個のＢＡＬ
ｃＤＮＡの塩基対を含有し、開始コドンと終止コドンと
の間の722個のアミノ酸残基のオープンリーディングフ
レームをコードする。20個の残基の推定シグナル配列が
存在し、これに続いて成熟ＢＡＬの722個の残基のアミ
ノ末端配列が存在する。ｃＤＮＡ配列は、さらに、678
個の塩基の５'-非翻訳配列、97個の塩基の３'-非翻訳領
域、および14個の塩基のポリ（Ａ）テイルを含有する。
１個のクローンの配列では、66個のアミノ酸残基に対応
する198個の塩基（1966〜2163位）が欠失している。こ
の短い型のｃＤＮＡの原因は、ＢＡＬｍＲＮＡのプロセ
ッシング中の異なるスプライシングによるものと考えら
れる。

【００２１】推定ＢＡＬタンパク質構造は、カルボキシ
ル末端領域に16個の反復単位を含有しており、各反復単
位は11個のアミノ酸で構成されている。これらの反復単
位は、Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Gly-Asp-Ser-Gly-Ala-Pro-
の基本構造に、少数の置換のみを行った構造を有してい
る。

【００２２】このｃＤＮＡは、乳児の栄養摂取の向上に
使用され得るＢＡＬタンパク質の発現、反復単位全体を
含むアミノ酸の構造および機能の研究、あるいはこれら
のアミノ酸の改変、欠失または付加の効果の研究に有用
である。さらに、このｃＤＮＡは、ＢＡＬもしくは関連
リパーゼに関する研究のプローブとして有用である。こ
の関連リパーゼには、ラット膵臓リゾホスホリパーゼ、
コリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ
が含まれる。

【００２３】本発明によれば、胆汁酸塩活性化リパーゼ
をコードする少なくとも２個のｃＤＮＡの同定および特
徴付けを行う。ｃＤＮＡを同定することによって、ヒト
以外の乳汁の調合乳に添加するための大量のＢＡＬを生
産する手段、ｃＤＮＡから発現される遺伝子およびタン
パク質を選択的に改変する手段、ならびにこれらのタン
パク質の構造および機能を研究し、操作する手段が得ら
れる。ヒト乳汁ＢＡＬｃＤＮＡの完全な構造、ならび
に、このｃＤＮＡと、ラット膵臓リゾホスホリパーゼ
（ＲＰＬＬ）、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエ
ステラーゼおよびチログロブリンとの関係が開示されて
いる。

【００２４】1990年7月31日に発行された米国特許第4,9
44,944号は、その教示内容が本明細書中に援用されてお
り、脂肪を含有する栄養調合乳の調製においてＢＡＬが
その脂肪の消化および利用を助けるべくどの様に使用さ
れているかについて記載している。

【００２５】

【実施例】材料．ヒト乳汁ＢＡＬを、WangおよびJohnso
nのAnal. Biochem. 133, 457-461 (1983)に記載のよう
に精製した。ヒトＢＡＬに対するウサギ抗血清を、Wang
のJ. Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981)に報告され
ているように調製した。λgt11およびλgt10中の、泌乳
しているヒト乳房組織からのｃＤＮＡライブラリーを、
Clontechより購入した。ヨードゲン（Iodogen）をPierc
e Chemical Co.より購入した。放射性同位元素即ち¹²⁵
ヨウ素、³²Ｐ-ＡＴＰ、³²Ｐ-ｄＡＴＰおよび³⁵Ｓ-ｄＡ
ＴＰ、ならびにナイロンフィルター（Hybond-N）を、Am
ershamより購入した。組換えＤＮＡ操作に使用する酵素
を、Bethesda Research Laboratoryより入手した。ＤＮ
Ａシーケンシングキットおよび試薬を、United States
Biochemical and Boehringerより入手した。他の各試
薬は市販の最高級のものであり、これらをさらに精製す
ることなく用いた。

【００２６】方法． ヒト乳汁ＢＡＬのアミノ末端ＣＮＢｒ-フラグメントの
単離およびアミノ末端配列決定．ＢＡＬ（70mg）の臭化
シアン分解を、SteersらのJ. Biol. Chem. 240, 2478-2
484 (1965)に記載の条件を用いて行った。 ヘパリン結
合ＣＮＢｒ-ペプチドを、アフィニティークロマトグラ
フィーを用いてヘパリン-セファロースカラム上で精製
した。この精製は、WangおよびJohnsonのAnal. Bioche
m. 133, 457-461 (1983)に記載のように行われた。この
手順では、ＣＮＢｒ-フラグメントを、ｐＨ8.5の50mMの
ＮＨ₄ＯH-ＨＣｌ緩衝液で予め平衡状態としたヘパリン-
セファロースカラム（2 × 10 cm）に負荷した。保持さ
れていない画分を200mLの同じ緩衝液で溶出した。そし
て、ヘパリン結合ペプチドを、280nmでの吸収によりモ
ニターしつつ、0.3MのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で
溶出した。ヘパリン結合ペプチドを含有する画分を溜め
て、凍結乾燥し、これを１mLの蒸留水で再度溶解し、そ
してセファデックスＧ-５０カラム（2 × 25 cm）上で
脱塩した。凍結乾燥したヘパリン結合ペプチドの最終的
な収量は約４mgであった。このヘパリン結合フラグメン
トを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって、純粋であると判断した。その際に
は、WangおよびJohnson (1983)の方法を使用し、12,000
の見掛け分子量を得た。このフラグメントのアミノ末端
配列を、Beckman Sequencer Model 890Cでの自動エドマ
ン分解により決定した。ＰＴＨ-アミノ酸を、逆相5μm
Ｃ-１８カラムのWaters Associates HPLCを用いて同定
した。この同定は、TakahashiらのJ. Biol. Chem. 258,
2819-2830 (1983)に記載のように行われた。ペプチド
の、61個の残基のアミノ末端配列を、ＡＫＬＧＡＶＹＴ
ＥＧＧＦＶＥＧＶＮＫＫＬＧＬＬＧＤＳＶＤＩＦＫＧＩ
ＰＦＡＡＰＴＫＡＬＥＮＰＱＰＨＰＧＷＱＧＴＬＫＡＫ
ＮＦＫと決定した。この配列の最初の23個の残基は、Wa
ngおよびJohnson (1983)により報告されたＢＡＬのアミ
ノ末端配列と同一であるが、ただし、例外としては、11
位の残基が、今回の分析で発見された、リシンの代わり
にグリシンである。上記の結果によってもまた、ヘパリ
ン結合配列がＢＡＬのアミノ末端領域中に位置すること
が分かる。

【００２７】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング．
泌乳中のヒト乳房組織のλgt11ｃＤＮＡライブラリーか
らの約 5 × 10⁵個のプラークを、ヒトＢＡＬに対する
ウサギ抗体を用いて22℃でスクリーニングした。ＢＡＬ
に対するウサギ抗血清を、セファロース４Ｂ上に固定化
されたヒト乳汁ＢＡＬのアフィニティーカラム上で精製
した。この精製には、WangらのAmer. J.Clin. Nutr. 4
9, 457-463 (1983)に記載の方法を用いた。回収した抗
体を、MarkwellらのBiochem. 17, 4807-4817 (1978)に
記載の方法を用いて¹²⁵ヨウ素およびヨードゲンでヨウ
素化し、これらをライブラリーのスクリーニングに使用
した。このスクリーニングには、HuynhらのDNA cloning
Glover, D.M.編, Vol. I, 49〜78ページ (IRL Press,
Oxford 1985)に記載の手順を用いた。λgt10ライブラリ
ーのスクリーニングを行うために、約10⁵個のプラーク
をHybond-Nメンブランに移し、そしてHuynhら(1985)の
プラークハイブリダイゼーション法を用いて、合成オリ
ゴヌクレオチドでプローブした。プローブＲＰはλgt11
ライブラリーのクローンG11-1からの反復単位配列を有
していた。他の数種類のプローブを、アミノ末端ＣＮＢ
ｒフラグメントの61個の残基のアミノ酸配列に基づいて
設計し、合成した。陽性の結果をもたらしたオリゴヌク
レオチドは、プローブＲＰ即ち５'-ＣＣＣＣＧＧＧＣＣ
ＴＣＡＧＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＧＴ-３'およびプローブ
ＮＴ１即ち５'-ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＣ
ＣＣＴＴＧ／ＡＡＡＧ／ＡＡＴＧ／ＡＴＣＣ／ＧＡＣ-
３'（30〜37位のアミノ末端配列残基に基づく）であっ
た。λgt10ライブラリーの 6 × 10⁴個のプラークの第
２のスクリーニングを、クローンG10-4AのSau3AIフラグ
メントを用いて行った。

【００２８】サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定．
スクリーニングによって得た陽性のクローンからのファ
ージＤＮＡを調製した。この調製には、ManiatisらのMo
lecular Cloning, A Laboratory Manual 、63〜66ペー
ジ (Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring H
arbor, NY 1982)に記載のプレートライゼート法を用い
て、その後に、BensenおよびTaylorのBioTechniques 12
6-127 (1984年5月/6月）に記載の手順を用いた。陽性の
クローンからのｃＤＮＡ挿入断片およびこれらの制限フ
ラグメントを、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１
８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターにサブクローニングし
た。その際には、Maniatisら(1982)の150〜178ページに
記載の方法を用いた。一本鎖または二本鎖鋳型を使用す
るＤＮＡ配列分析を行った。その際には、SangerらのPr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5468 (1977)に記
載のジデオキシヌクレオチドチェインターミネーター法
を用いた。

【００２９】合計18個の陽性のクローンを、３回の異な
るスクリーニングによって同定した。５個の陽性のクロ
ーンを、λgt11中のヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから
得た。その際には、ＢＡＬ抗体をプローブとして用い
た。λgt10ライブラリーから、プローブＲＰおよびＮＴ
１が、各々３個および２個の陽性のクローンを産生し
た。８個の陽性のクローンを、同じλgt10ライブラリー
から得た。その際には、プローブとして、上記で得られ
た部分ＢＡＬｃＤＮＡ（クローンG10-4A）の402個の塩
基対のSau3AIフラグメント（1638位から2237位までのヌ
クレオチドであり、以下に記載するように、'ギャップ'
領域を含まない）を使用した。これらのクローンに対し
て、サザンブロットと組み合わせた制限マッピングを行
ったところ、５個のλgt11クローン全てが関連している
ことが示唆された。これらの５個の内の最長のクローン
であるG11-1は、約0.8kbpであった。λgt10ライブラリ
ーの２回のスクリーニングにより、各プローブからの最
長クローンは、GT-2（1.9kbp、プローブＮＴ１で陽性で
あった）、クローンG10-4（4kbp、プローブＲＰで陽性
であった）およびG10-3（1.1kbp、G10-4AのSau3AIフラ
グメントで陽性であった）であった。マッピングおよび
サザンブロットの結果により判断されるように、４個の
クローンは全て互いに重なり合っていた。これらのクロ
ーンおよびその種々のフラグメントをサブクローニング
し、ヌクレオチド配列を決定した。これは、図１にまと
めて示す通りである。クローンG10-2、G10-3、および、
G10-4のEcoRIフラグメントの５'側（G10-4A、1.8kbp）
を完全に配列分析した（図１）。

【００３０】図１は、泌乳中の乳腺からのヒト乳汁の胆
汁酸塩活性化リパーゼクローンのｃＤＮＡ構造の模式図
である。ａ．ＢＡＬｃＤＮＡ構造が、４個のクローン、
即ち、水平線で示されている様に、G11-1、G10-2、G10-
3およびG10-4から決定されている。最上部のバー（プレ
ートＡ）は、ｃＤＮＡ全体を示し、そしてその様々な領
域が記号で示されている：様々な領域とは、５'-非翻訳
領域（５'ＵＴ）、開始コドン、リーダー配列、反復領
域（16の反復）、終止コドンおよび３'-非翻訳領域
（３'ＵＴ）、ポリ（Ａ）テイル（Ａ'ｓ）および"ギャ
ップ"領域である。"ギャップ"領域は、クローンG10-4A
中の欠失部分である。G10-4Aの、他のクローンに対する
関係が、点線で示されている。ヌクレオチド番号および
制限部位は、２番目の線に示されている。制限部位の記
号は次の通りである：TはTaqIを示し、RはRsaIを示し、
HはHhaIを示し、PはPstIを示し、そして、SはSmaIを示
し、FはHinfIを示し、NはNarIを示し、3はSau3AIを示
す。ｂ．配列データの模式図。水平方向の矢印は配列分
析データの方向およびこれによってカバーされる領域を
示す。

【００３１】G10-4の３'EcoRIフラグメント（G10-4B、
2.2kbp）は、ＢＡＬのポリ（Ａ）配列の下流側に存在し
ていた。しかも、このフラグメントは、EcoRIリンカー
配列によってG10-4Aに連結している。G10-4B配列がＢＡ
Ｌの配列とは全く関係無いために、ライブラリー構築の
ライゲーション工程中にG10-4AおよびG10-4Bが共にクロ
ーンG10-4中に挿入されたことが明らかであった。した
がって、G10-4Bの配列に関してはさらに詳しい研究を行
わなかった。G11-1の部分配列は、G10-3の３'-領域配列
と同一であった。後者を完全に配列分析した為に、クロ
ーンG11-1の配列分析を継続しなかった。

【００３２】図２〜４は、ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リ
パーゼのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ヌクレオ
チド配列は、クローンG10-2およびG10-3（図１）由来の
ものである。ヌクレオチド番号は、５'末端からのもの
であり、各行の右空白に示されている。推定アミノ酸配
列は、成熟酵素の既知のアミノ末端位置から番号付けさ
れている。１個の潜在的なＮ-結合グリコシル化部位が
アスタリスクによって示されている。活性部位のセリン
は菱形によって示されている。G10-4A中の、欠失した19
8個のヌクレオチド（1966位から2163位）の領域（図１
の”ギャップ”領域）、およびポリアデニル化シグナル
には下線が引かれている。図２〜４は、その2821位から
2886位までのヌクレオチド配列（695位から716位までの
アミノ酸）に関して、1990年4月4日に最初に開示された
図とは異なるものであり、1990年6月12日に最初に開示
された配列に対応する。

【００３３】配列データによって、ヒトＢＡＬｃＤＮＡ
配列がクローンG10-2およびG10-3を組み合わせた配列中
に含有されていることが分かった（図１〜４）。この配
列（図２〜４）は、オープンリーディングフレームを含
有する。このオープンリーディングフレームは、開始コ
ドン（669〜671位のヌクレオチド）と終止コドン（2905
〜2907位のヌクレオチド）との間の742個のアミノ酸残
基をコードする。この特定のMetコドンを上流の他の可
能な部位に優先して開始部位として選択される理由は、
最適な開始部位にフランキングする配列、即ちＡＣＣＡ
ＴＧＧ（666〜672位のヌクレオチド）の存在に基づくも
のである。しかも、このMet部位と成熟ＢＡＬのアミノ
末端位置（図２〜４の１位の残基）との間には、顕著な
疎水性残基20個が存在する。この20個の残基の領域の長
さは、ＢＡＬのシグナル配列に適切である。エドマン分
解によって決定したアミノ末端の61個の残基は、推定ア
ミノ酸配列（図２〜４、1〜61位の残基）と完全に一致
する。終止コドンと14個の塩基のポリ（Ａ）テイルとの
間の３'非翻訳領域中には、97個の塩基が存在する。

【００３４】ＢＡＬｃＤＮＡ配列は、カルボキシル末端
（2353位および2880位のヌクレオチド）近傍に16個の非
常に類似した内部反復配列の領域を含有する。この領域
の、推定タンパク質構造は、各々11個の残基からなる16
個の非常に類似した反復単位を構成する（図２〜７）。
この領域の約３分の１のアミノ酸はプロリンである。こ
のことは、ＢＡＬのプロリン含有量が高い理由となって
いる。推定ＢＡＬ配列のアミノ酸組成を、表Ｉにおい
て、アミノ酸分析によるアミノ酸組成と比較する。ヒト
ＢＡＬは、糖タンパク質であることが知られている；潜
在的Ｎ-グリコシル化部位が187位の残基に見られる。推
定配列から計算した成熟ＢＡＬの分子量は76,282であ
る。

【００３５】クローンG10-4Aのヌクレオチド配列は、図
２〜４に示されているように、クローンG10-2およびG10
-3を組み合わせた配列の対応する領域と同一であるが、
但し、例外として、198個の塩基（1966〜2163位のヌク
レオチド）の部分が存在していない（図１〜４）。この
ことは、66個のアミノ酸（410位から475位までの残基）
が欠失していることを示す。この短いｃＤＮＡの起源と
して可能性のあるものを幾つか考えた。この欠失部分以
外は、長いｃＤＮＡおよび短いｃＤＮＡのヌクレオチド
配列は同一であるために、これらのヌクレオチド配列は
同じ遺伝子の産物であることが示唆される。「ギャッ
プ」 結合近傍のｍＲＮＡ二次構造を調査したところ、
ｃＤＮＡの構築中に逆転写酵素によって誤った複製が行
われたのではないかと推測する理由は何も得られなかっ
た。さらに、「ギャップ」を短いｃＤＮＡ中に導入する
ことによって、読み取り相は変化しなかった。これらの
事実は、短いｃＤＮＡがクローニングによる産物である
という可能性に反するものであるように思われる。これ
らの二つの型のｃＤＮＡは、おそらくＢＡＬとｍＲＮＡ
前駆体とのスプライシングの差に由来する。ヒトＢＡＬ
の遺伝子構造は知られていないが、「ギャップ」直前の
配列ＡＡＧ（1963〜1965位のヌクレオチド）および'ギ
ャップ'の 末端の結合の両側におけるＧ（2163位および
2164位のヌクレオチド）は、イントロン／エキソン結合
の発生に最も好ましいヌクレオチドである。これは、Pa
dgettらのAnn. Rev. Biochem. 55, 119-1150 (1986)に
記載の通りである。これらの構造は、異なるスプライシ
ングの説明を支持するものである。

【００３６】以下の表はｃＤＮＡ配列によって予測した
ヒトＢＡＬのアミノ酸組成を示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】a 66個のアミノ酸残基の欠失が無いｃＤＮ
Ａ配列に基づく。 b 66個のアミノ酸残基が欠失しているｃＤＮＡ配列に基
づく。 c WangのJ.Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981)から
引用したデータ。

【００３９】ＢＡＬｃＤＮＡ配列と他のリパーゼとの比
較．ヒトＢＡＬ配列は、Han, J.H.、 Stratowa, C.およ
びRutter, W.J.（Biochemistry 26:1617-1625 (1987)）
によって報告されたラット膵臓リゾホスホリパーゼ（Ｒ
ＰＬＬ）の配列に非常に類似している。これらの二つの
酵素のアミノ酸残基間には67％の同一性がある。主たる
相違点は反復領域の長さにある。これらの二つの酵素の
構造的相同性の類似によって、ＲＰＬＬが、膵臓中に存
在する胆汁酸塩活性化リパーゼであることが示唆され
た。ヒト膵臓カルボキシルエステルリパーゼ（ＣＥＬ）
の、限定されたアミノ末端配列によって、これもまたＢ
ＡＬと相同であることが分かる。さらに、異なる種から
のＢＡＬおよびＣＥＬは、抗体交差反応性を有してお
り、これは密接な構造的関係に一致している。アミノ末
端配列データによれば、ブタ膵臓コレステロールエステ
ラーゼ（ＣＨＥ）もまたＣＥＬと同一であるように思わ
れる。これらの構造上の比較によって、膵臓ＣＥＬおよ
びＣＨＥが、ＲＰＬＬと同じ酵素であるという可能性が
示唆される。ＲＰＬＬは、膵臓中に存在する胆汁酸塩活
性化リパーゼと同じであると思われる。構造上の情報に
よってもまた、ＢＡＬおよびＲＰＬＬが、リパーゼの独
特のクラスを代表するものであることが示唆される。な
ぜならば、ＢＡＬおよびＲＰＬＬの構造は、肝臓リパー
ゼ、リポタンパク質リパーゼおよび膵臓リパーゼを含む
他のリパーゼの既知の構造とは関連していないからであ
る。

【００４０】ＢＡＬおよびＲＰＬＬの最も興味深い構造
上の特徴は、これらの酵素のカルボキシル末端近傍にお
ける、プロリンが豊富な配列の11個の残基の反復であ
る。ＢＡＬ中には16個の反復、ＲＰＬＬ中には４個の反
復が存在する（図６）。このタイプの反復構造は、これ
らの二つの酵素に独特であるように思われる。なぜなら
ば、タンパク質データベース中の、他のリパーゼを含む
他のタンパク質には、この反復構造を含有しているもの
が無いからである。ＢＡＬ中の16個の反復の中では、反
復番号３から10が、ＰＶＰＰＴＧＤＳＧＡＰの基本構造
で、高度に保存されている。最初の２個の反復および最
後の４個の内の３個の反復中では、より多くの置換を含
んでいる。さらに、11個の残基からなる各単位のアミノ
末端における配列は、カルボキシル末端における配列に
比べてより高度に保存されている（図６）。この領域の
二次構造予測によって、オープンランダムコイルの強い
傾向が明らかになる。この構造的領域の機能は知られて
いないが、この独特の構造はＢＡＬおよびＲＰＬＬの胆
汁酸塩活性化の独特の機能と関連し得ると思われる。

【００４１】ＢＡＬのアミノ酸配列はまた、アセチルコ
リンエステラーゼ、コリンエステラーゼおよびチログロ
ブリンのアミノ酸配列と関連している。ＢＡＬに対して
コリンエステラーゼを整列させると、27％の同一残基が
得られる（図５）。ＢＡＬとアセチルコリンエステラー
ゼとを整列させると、類似の結果が得られる。これらの
配列比較における最も強い相同性は、エステラーゼの活
性部位近傍の領域中に生じる（図５）。アセチルコリン
エステラーゼ中の活性部位のセリン近傍の配列であるＦ
ＧＥＳＡＧは、ＢＡＬ（残基194位）およびＲＰＬＬ中
で完全に保存されている。これらの比較によって、ＢＡ
ＬおよびＲＰＬＬの双方の194位のセリンが活性部位残
基であることが示唆される；さらに、これらの二つのリ
パーゼの加水分解メカニズムもまたエステラーゼの加水
分解メカニズムに関連し得る。さらに留意すべき重要な
ことは、アセチルコリンエステラーゼの複数のｍＲＮＡ
は異なるスプライシングによって生じたものであり、こ
のことによって、このファミリーの各酵素の活性の調節
において関連している可能性が示唆されるということで
ある。

【００４２】チログロブリンの一領域（396〜967位の残
基）に対してＢＡＬを整列させると、数箇所の短い範囲
で明らかな相同性が得られる（図７）。しかし、二つの
タンパク質をこれらの予測された二次構造に関して比較
すると、ＢＡＬの全長に渡って密接な関係が得られる
（図７）。これらの観察によって、この領域のチログロ
ブリンが三次構造においてＢＡＬと関連していること、
および、これもまた独立して折り畳まれたドメインであ
ることが示唆される。上述の５種類のタンパク質は、お
そらくは進化中に共通の祖先タンパク質からわかれたも
のである。

【００４３】図５〜７は種々のリパーゼのアミノ酸配列
間の比較を示す。図５：ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リパ
ーゼ（ＢＡＬ）、ラット膵臓リゾホスホリパーゼ（ＲＰ
ＬＬ）およびコリンエステラーゼ（ＣＥ）のアミノ酸配
列を整列させたもの。ＢＡＬと同一の残基はＲＰＬＬお
よびＣＥ配列上に点によって示されており、整列された
空白はダッシュによって示されている。図６：ヒト乳汁
ＢＡＬの16個の内部反復配列をこれに対応するＲＰＬＬ
中の４個の内部反復配列と整列させたもの。図７：ヒト
胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ、１位から571位まで
の残基）とラットチログロブリンの一領域（ＴＧ、396
位から967位までの残基）との一次および二次構造の比
較。これらの二つの配列の整列は、コンピュータプログ
ラムによって、最大の類似関係を作成することに基づい
て整列された。このコンピュータプログラムは、Devere
uxらのNucleic Acids Res. 12(1), 387-395(1984)によ
り開発されたものである。二つの配列において対応する
残基間の４段階の関連性がこれらの配列の間に示されて
いる：同一の残基は垂直線により示され；非常に類似し
ているものは２個の点により示され；やや類似している
ものは１個の点により示され；関係無いものには記号は
示されていない。ChouおよびFasmanのAdv. inEnzymolog
y 47, 45-148 (1978)に基づいてコンピュータにより作
成された二次構造の予測が、ＢＡＬ配列の上方およびＴ
Ｇ配列の下方に示されている。二次構造の記号：α-ヘ
リックスは波線により示され、β構造は実線により示さ
れ；折り返し構造は逆向きＶ字により示され；そして、
ランダムコイルは点により示されてる。四角形で囲まれ
た領域は、二つの配列の二次構造が非常に類似している
領域を示す。

【００４４】ヘパリン結合領域の特徴付け．アミノ末端
ＣＮＢｒフラグメントは、上記のように、ＢＡＬのヘパ
リン結合部位を含有するということが明らかにされた。
このフラグメント（1〜101位の残基）のアミノ酸配列の
潜在的なヘパリン結合配列を調べた。これは、Martinら
のJ.Biol. Chem. 263, 10907-10914 (1988)により報告
された、アポリポタンパク質およびリパーゼの既知のヘ
パリン結合共通配列に基づいて行われた。モチーフＢＢ
ＢＸＸＢおよびＢＢＸＢ（Ｂ＝塩基性残基；Ｘ＝非荷電
残基）の直接の適合性は見られなかった。しかし、ＢＸ
ＢＸＸＢＢＢのパターンを有する高度に塩基性の領域
は、56位の残基と63位の残基との間に位置する。これ
が、ＢＡＬの潜在的ヘパリン結合部位であると思われ
る。

【００４５】ＢＡＬｃＤＮＡの２種類の構造変異種の特
徴付け．ヒトＢＡＬｃＤＮＡの２種類の構造変異種が、
異なるスプライシングから得られ、かつｍＲＮＡの二つ
の異なる長さを代表するものである場合には、これらの
構造変異種によって、ヒト乳汁中に二つのサイズのＢＡ
Ｌタンパク質が存在することが予測される。予測された
分子量差に一致する、少量の速く移動するバンドを、個
別のヒト乳汁ＢＡＬのドデシル硫酸ナトリウム-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動において観察した。ブタ膵臓
ＣＥＬもまた、約9kDだけサイズが異なる小分子量型を
含有する。これらの二つの型のブタ酵素は、同じアミノ
末端配列を有しており、これらの違いは、精製された酵
素調製物の炭水化物もしくは脂質含有量によるものでは
ない。これは、RuddらのBiochim. Biophys. Acta 918,
106-114 (1987)によって報告された通りである。したが
って、これらの二つの型のブタＣＥＬの違いは、ＢＡＬ
中に見られる同じ「ギャップ」 によるものであるとい
う可能性がある。

【００４６】ヒトＢＡＬのための単離されたｃＤＮＡの
利用 ｃＤＮＡは、標識されることにより、アッセイにおける
プローブとして、または、関連タンパク質もしくは類似
の配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡのため
のスクリーニングに使用され得る。ＤＮＡを標識する方
法は、当業者に公知のものである。例えば、Maniatisら
のMolecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spr
ing Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY 19
82)に記載のような方法がある。配列を蛍光標識、放射
性標識および酵素標識によって標識するための試薬は全
て商品として購入可能である。

【００４７】ヒトＢＡＬ遺伝子のクローニングおよび構
造決定．ヒトＢＡＬのｃＤＮＡは、１つまたは複数のヒ
トＢＡＬ遺伝子のクローニングおよび配列決定にも使用
され得る。このクローニングおよび配列決定には、当業
者に既知の方法を用いる。これを実施する典型的な手段
は、ヒトゲノムライブラリー（典型的には、λバクテリ
オファージ中のもの、Clontech Laboratories, Inc., P
alo Alto, CAより市販）をスクリーニングすることであ
る。その際には、ヒトＢＡＬｃＤＮＡ配列を含有するオ
リゴヌクレオチドを使用する。プローブは、ヒトＢＡＬ
ｃＤＮＡの制限酵素フラグメントであり得る。膵臓リパ
ーゼまたはコリンエステラーゼなどの、ＢＡＬと相同の
アミノ酸配列を有する数種類のタンパク質が存在する。
したがって、プローブフラグメントは、相同タンパク質
の遺伝子を認識するために使用され得る。これらのほと
んどの相同タンパク質のアミノ酸配列もしくはヌクレオ
チド配列が、図５〜７に関して前述したように、既知の
ものであるために、相同タンパク質の遺伝子との違いが
最大となるＢＡＬｃＤＮＡ配列の領域をプローブとして
選択することが可能である。これらのプローブは、化学
的に合成され、ヒトゲノムλライブラリーに対するプロ
ーブとして使用され得る。陽性のλクローンは、二次ま
たは三次平板培養およびスクリーニングによって精製さ
れ得る。制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定を行う
と、（ａ）ヒトＢＡＬ遺伝子数、（ｂ）ＢＡＬ遺伝子構
造（イントロン、エキソンおよび調節エレメント）、お
よび（ｃ）ＢＡＬｃＤＮＡ中のイントロン／エキソン結
合位置が明らかになる。これらの作業を実施するために
必要な方法の大部分は、Ausubel, F.M.らのCurrent Pro
tocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons,
N.Y. 1987)に記載されている。

【００４８】相同タンパク質または領域をコードするＤ
ＮＡの単離．多くのタンパク質が遺伝子の複数の複写を
有しているために、１つを超えるヒトＢＡＬ遺伝子を発
見し得る。これらの遺伝子は、存在している場合には、
非常に類似した構造および活性を持つ酵素の合成を導
く。単数または複数のＢＡＬ遺伝子はまた、他の幾つか
の遺伝子と相同であり得る。他の幾つかの遺伝子として
は、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラー
ゼ、膵臓ＢＡＬおよびチログロブリンの遺伝子などがあ
り、これらはヒト乳汁ＢＡＬに類似のアミノ酸配列を有
する。しかし、これらのタンパク質の構造は、ＢＡＬ遺
伝子産物の構造とはかなり異なるはずである。

【００４９】まだ記載されていない、ＢＡＬに類似の酵
素が存在し得る。ヒトＢＡＬｃＤＮＡのフラグメントを
プローブとして用いてゲノムライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、これらの新規な酵素のｃＤＮＡま
たは遺伝子の位置を確認することが可能となる。まだ記
載されていない他のタンパク質が、ヒト乳汁ＢＡＬの16
個の反復に非常に類似した断片を含有し、これによっ
て、何らかの未知の生物学的機能を発揮するということ
もまたあり得る。これらのタンパク質のｃＤＮＡおよび
遺伝子もまた、反復領域から生成されたｃＤＮＡフラグ
メントをライブラリーのスクリーニングのためのプロー
ブとして使用することによって、同定され得る。陽性の
クローンを単離して配列分析することによって、そのＢ
ＡＬとの関係を評価することができる。任意の興味深い
タンパク質のｃＤＮＡまたは遺伝子を発現し、これらの
潜在的な生物学的機能を評価することができる。これら
は全て、標準的な組換えＤＮＡ技術の使用を必要とし、
かつ上記の引例に見られるものである。

【００５０】組換えヒトＢＡＬの発現．多くの真核発現
システムにおいてエキソンが正確に除去されるために、
ヒトＢＡＬｃＤＮＡおよびヒトＢＡＬゲノムＤＮＡは、
単数（または複数）種類の組換えヒトＢＡＬタンパク質
の合成を導くために使用され得る。単数（または複数）
のヒトＢＡＬ遺伝子は、その非翻訳領域中に、酵素の発
現を調節する配列を含有していると予想される。これら
の調節配列をトランスジェニック動物発現に直接使用す
ることさえ可能である。

【００５１】組換えＤＮＡおよび遺伝子工学技術を用い
て、組換えＢＡＬタンパク質を、多くの異なる方法によ
りヒトＢＡＬｃＤＮＡまたは遺伝子から生産することが
できる。これらの方法には、E.coli、Bacillus、酵母、
真菌、昆虫細胞、哺乳類細胞およびトランスジェニック
動物などの宿主中におけるＢＡＬの発現が含まれる。原
核宿主が哺乳類のイントロンを除去できないために、遺
伝子よりも、ｃＤＮＡを、適切な改変を行ってから原核
システムで発現することが好ましい。しかし、原核生物
がＢＡＬをグリコシル化することができないために、Ｂ
ＡＬの発現には真核システムを使用することが好まし
い。真核細胞を宿主として使用する場合には、ヒトＢＡ
Ｌ遺伝子またはｃＤＮＡの何れかを、酵素の合成を導く
ために使用することができる。さらに、真核細胞は、新
たに合成されたＢＡＬを粗面小胞体の内部に導入するた
めに「リーダー」配列または「シグナル」配列が存在す
る場合には、ＢＡＬを適切にグリコシル化することもで
きる。天然ＢＡＬが糖タンパク質である（Wang, C.S.,
J. Biol. Chem.256:10198-10202, 1983）ために、タン
パク質を適切にグリコシル化し得る宿主システムを使用
することが重要となり得る。

【００５２】ｃＤＮＡまたは遺伝子の一部のみを発現す
ることによって活性ヒト乳汁ＢＡＬの活性を誘導できる
という可能性がある。タンパク質が、酵素活性を含むそ
の生物学的活性に必要不可欠ではない何らかの構造を含
有していることは公知のことである。ヒト乳汁ＢＡＬ中
のアミノ酸には、変更され得るものがあること、およ
び、その変異型のＢＡＬが類似の酵素活性を依然として
保持するということもまたあり得る。活性フラグメント
は、インタクト（intact）な酵素の活性を測定するため
に使用されるものと同じアッセイを用いることによっ
て、スクリーニングされ得る。フラグメントを合成した
後に、何れのフラグメントが活性を有しているかを決定
することは、慣例的な手順である。配列内でヌクレオチ
ドを変更し、タンパク質を発現し、そして活性を調べる
ためにタンパク質をスクリーニングすることも同様に慣
例的なものである。これは、酵素の商業的用途において
有利となる特性（酵素活性、基質特異性、物理特性、安
定性等）を有するＢＡＬ変異体を作製するための有用な
手段となる。

【００５３】全ての場合において、ヒトＢＡＬｃＤＮＡ
または遺伝子は、発現調節エレメント（例えば、転写開
始シグナル、翻訳開始シグナル、開始コドン、終止コド
ン、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、およ
び他のエレメント）を含有する適切な発現ベクター中に
挿入され得る。適切なベクターは様々な会社から市販さ
れている。ＢＡＬｃＤＮＡもしくは遺伝子を含有する組
換えベクターは、宿主細胞中にトランスフェクトされた
後には、染色体外ＤＮＡとして残留し得るか、あるい
は、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。何れの場合におい
ても、組換えベクターは、宿主細胞中で組換えＢＡＬの
合成を導き得る。異種遺伝子の発現の幾つかの例が、Me
thods in Enzymology, Vol. 153, 23〜34章 (R. Wuおよ
びL. Grossman編、Academic Press, 1987)に記載されて
いる。ＢＡＬ合成宿主細胞を大量培養し、酵素を精製す
ることは、ＢＡＬを生産するための経済的な商業上の手
段となり得る。酵素の大量生産の方法は、当業者に公知
のものである。潜在的に有用なＢＡＬの発現システムの
幾つかの例は以下の通りである： （１）E.coliを宿主とする：多くの哺乳類ｃＤＮＡがE.
coli中で発現されており、異なるプロモーター、オペレ
ーターおよび他の調節エレメントを持つ多くの発現ベク
ターが市販されている。典型的なベクター構築および発
現が、Lin, X.L.およびTang, J.のJ. Biol. Chem. 264:
4482-4489 (1989)に記載されている。E.coliのサイトゾ
ル中で哺乳類タンパク質を発現すると、不溶性の「封入
体」が生産されることが多く、組換えタンパク質の再度
の折り畳みが必要となる。しかし、「リーダー」配列
（例えば、omp, Duffaud, G.D.、March, P.E.、およびI
nouye, M.の、WuおよびGrossman（編）、Methods in En
zymology 153:492-506 (1987)）を使用すると、多くの
場合には、適切な折り畳み、および細菌のペリプラズム
空間への組換えＢＡＬの輸送が導かれる。

【００５４】（２）酵母を宿主とする：酵母中での組換
えＢＡＬの発現の原理は、E.coli中の発現の原理と類似
している。この例が、Bitter, G.A.らによってMethods
in Enzymology (WuおよびGrossman編）153:516-544(198
7))中に提供されている。E.coliと同様に、酵母宿主細
胞は、サイトゾル中に、もしくは分泌されたタンパク質
として、外来遺伝子を発現し得る。E.coli中の発現とは
異なり、酵母中に分泌された発現物は、グリコシル化が
可能である。このことは、ＢＡＬの発現に有利となり得
る。なぜならば、ＢＡＬは糖タンパク質であるからであ
る。

【００５５】（３）真菌（fungi）を宿主とする：異種
遺伝子の発現に使用して成功した真菌発現ベクターの数
は少ない。既存の真菌発現ベクターは、トランスフェク
ションの後に宿主ゲノム中に組み込まれる（A Survey o
f Molecular Cloning Vectors and their Uses 中の、C
ullen, D.、 Gray, G.L.およびBerka, R.M.によるMolec
ular Cloning Vectors for Aspergillus and Neurospor
a (Butterworth Publishers, Stoneham, MA 1986）。リ
ーダーが、発現されるタンパク質コドンの前に存在する
場合には、分泌された組換えタンパク質はグリコシル化
され得る。成功した発現の幾つかの例には、ウシキモシ
ンに関するもの（Cullen, D.らのBio/Technology 5:369
-378 (1987)）、および異なる真菌からの酸プロテアー
ゼに関するもの（Gray, G.L.、 Hayenga, K.、 Cullen,
D.、 Wilson, L.J.およびNorton, S.のGene 48:41-53
(1987)）がある。

【００５６】（４）昆虫細胞を宿主とする：昆虫細胞中
で外来遺伝子を合成するためのバキュロウイルス発現ベ
クターは、多くの哺乳類およびウイルスのタンパク質の
発現に使用され、成功している。このシステムは、グリ
コシル化することができ、また組換えタンパク質を高レ
ベルで発現することもできる。このシステムの使用は、
ある程度詳細に概説されている（Luckow, V.A.およびSu
mmers, M.D.のTrendsin the Development of Baculovir
us Expression Vectors、Bio/Technology、1987年9月11
日）。

【００５７】（５）哺乳類細胞を宿主とする：哺乳類細
胞中での異種遺伝子の発現は、商業用として多数成功し
ている。組換えヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの商業用生産が一つの例である。これらの発現ベクタ
ーの大部分は、哺乳類プロモーター（例えば、メタロシ
アニンもしくは成長ホルモン）またはウイルスプロモー
ター（例えば、SV40初期プロモーターもしくはウイルス
遺伝子のロングターミナルリピート(Long Terminal Rep
eat)）、およびポリアデニル化シグナル、ならびに、抗
生物質耐性遺伝子を含むE.coliクローニングのための適
切な調節エレメントを含有する。プロモーターの下流側
にＢＡＬを挿入した後に、ベクターを、最初にE.coli中
にクローニングし、単離し、そして哺乳動物細胞中にト
ランスフェクトすることができる。ネオマイシンもしく
は類似の耐性選択マーカーを、他のベクターもしくは同
じベクター中に共トランスフェクトすることができる。
高レベルの発現を得るためには、遺伝子増幅システムが
有利である。例えば、発現ベクター（または共トランス
フェクト）は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）
の遺伝子を含有し得る。チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞のｄｈｆｒ株を使用する場合には、クロ
ーニングされた遺伝子を、ｄｈｆｒの遺伝子と共増幅す
ることができる。これは、形質転換された細胞を、メト
トレキセート濃度を増加させているところに入れること
によって、行われる。ＢＡＬを分泌する形質転換体クロ
ーンは、酵素アッセイもしくはウエスタンブロットによ
って同定され得る。この方法の成功例には、グリコシル
化された組換えプロレニンの合成（Poormanら、Protein
s 1:139-145 (1986)）およびヒト免疫インターフェロン
（Scahill, S.J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.
80:4654-4658 (1983)）が含まれる。

【００５８】（６）トランスジェニック動物におけるＢ
ＡＬの発現：ヒトＢＡＬ遺伝子を、組織特異的発現のた
めに他の動物のゲノム中に転移させる技術は、既に存在
している（Jaenisch, R.、Science 240:1468-1474 (198
8); Westphal, H.、FESEB J.3:117-120 (1989)）。トラ
ンスジェニック技術を用いて乳汁の組成を変更するため
の幾つかの作業が既に進行中である（概説書としては、
Bremel, R.D.、Yom,H.C.およびBleck, G.T.のJ.Dairy S
ci. 72:2826-2833 (1989)を参照のこと）。上記の三つ
の概説書に要約されているように、一般的な方法は、分
泌乳腺（乳汁）タンパク質（例えば、カゼインもしくは
乳汁リゾチーム）のプロモーター、ヒトＢＡＬｃＤＮＡ
もしくは遺伝子、および適切な相補エレメントを含有す
るベクターを構築することである。そして、クローニン
グされたベクターを、新たに受精したウシまたはヒツジ
の卵中に顕微注入して、その卵を胎児発生および誕生の
ために「養母」中に移植させる。トランスジェニックし
た子孫を、サザンブロットによる遺伝子転移および乳汁
中のヒトＢＡＬの生産（ウシおよびヒツジは乳汁中にＢ
ＡＬを生産しない）に関して分析する。高収量の株を生
産するために、トランスジェニック動物を交配（interb
red）することができる。

【００５９】組換えヒト乳汁ＢＡＬの商業上の利用．組
換えヒト乳汁ＢＡＬには、種々の用途がある。この酵素
は、米国特許第4,944,944号に記載のように、乳児用食
物を補足するために使用され得る。この酵素は、疾病の
治療に使用され得る。この酵素は、脂質消化に関する工
業用プロセスにおいて使用され得る。この酵素は、脂質
消化に関する医学的または臨床的プロセスにおいて使用
され得る。この酵素は、研究用試薬（化学的）もしくは
研究用手段（脂質消化研究用）として使用され得る。こ
れらの用途の多くは、ヒト乳汁から抽出され得るヒトＢ
ＡＬの量が非常に限られていたために、以前は不可能で
あった。

【００６０】

【発明の効果】本発明により、ヒト以外の乳汁の乳児用
調合乳に含有させるべき大量のＢＡＬが調製される。

【図面の簡単な説明】

【図１】泌乳中の乳腺からのヒト乳汁の胆汁酸塩活性化
リパーゼクローンのｃＤＮＡ構造の模式図である。

【図２】ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リパーゼのｃＤＮＡ
およびアミノ酸配列の一部を示し、さらに図３および図
４に続く。

【図３】ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リパーゼのｃＤＮＡ
およびアミノ酸配列の一部を示し、図２の続きであり、
図４に続く。

【図４】ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リパーゼのｃＤＮＡ
およびアミノ酸配列の一部を示し、図３および図４の続
きである。

【図５】ヒト乳汁の胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡ
Ｌ）、ラット膵臓リゾホスホリパーゼ（ＲＰＬＬ）およ
びコリンエステラーゼ（ＣＥ）のアミノ酸配列を整列さ
せた図である。

【図６】ヒト乳汁ＢＡＬの16個の内部反復配列をこれに
対応するＲＰＬＬ中の４個の内部反復配列と整列させた
図である。

【図７】ヒト胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ、１位か
ら571位までの残基）とラットチログロブリンの一領域
（ＴＧ、396位から967位までの残基）との一次および二
次構造を比較させた図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 594003676 825 Ｎ．Ｅ． 13ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ, Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈ ｏｍａ 73104，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ジョーダン ジェイ．エヌ．タン アメリカ合衆国 オクラホマ 73111 オ クラホマ シティー，ノース エベレスト アベニュー 5600 (72)発明者 チ−スン ワン アメリカ合衆国 オクラホマ 76162 オ クラホマ シティー，オールドウィック サークル 11813

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のアミノ酸配列の少なくとも一部を
   含む胆汁酸塩活性化乳汁リパーゼ： 【化１】 【化２】 【化３】