JP2001108677A - Ｄｎａチップの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡチップの製造時間を短縮し、製造コス
トを低減する。 【解決手段】 鋳型オリゴヌクレオチド２を固定化した
キャピラリーチューブ４（Ａ）を多数準備し、それらの
一端側を二次元的に配列して束ね、キャピラリーチュー
ブ４内に、ビオチン標識プライマーを含むPCR反応液６
を充填し（Ｂ）、ビオチン７で標識された相補的オリゴ
ヌクレオチド８を合成し（Ｃ）、PCR反応液６を除去し
（Ｄ）、鋳型オリゴヌクレオチド２と相補的オリゴヌク
レオチド８を解離させ（Ｅ）、アビジン１４が固定化さ
れたガラス基板表面１０にキャピラリーチューブ４の一
端面を接触させて解離液１２とともに相補的オリゴヌク
レオチド８をガラス基板表面３０に移動させ、ビオチン
７とアビジン１４の選択的な結合によって相補的オリゴ
ヌクレオチド８をガラス基板表面３０に固定化する。
（Ｆ）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多数のオリゴヌク
レオチドが固相表面に整列して固定化されたＤＮＡチッ
プの製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の発現の様子をモニタする方法と
して、ＤＮＡチップを用いる方法がある。ＤＮＡチップ
は、種々遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチド
（ＤＮＡプローブともいう）が固相表面に整列して固定
化されてオリゴヌクレオチドマトリックスが形成された
素子である。通常、１枚のＤＮＡチップ上には、数千か
ら数万のオリゴヌクレオチドが固定化されている。ＤＮ
Ａチップを用いる方法では、PCR反応（Polymerase Chai
n Reaction)を用いて、試料としてのｍＲＮＡ（メッセ
ンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成
し、断片化した後に各断片に蛍光標識をつけて標識断片
とする。これらの標識断片をＤＮＡチップに接触させ、
ＤＮＡチップに固定化されたオリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイゼーションさせる。標識断片は配列が相補的な
オリゴヌクレオチドに保持され、過剰量の標識断片は洗
浄操作で除去される。その後、蛍光顕微鏡を用いて保持
された標識断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴ
ヌクレオチドの種類を調べる。この方法は配列既知の遺
伝子の発現をモニタするのに適している。

【０００３】ＤＮＡチップの製造方法は、大別して次の
３種類がある。第１の方法では、光化学的に除去できる
保護基で修飾した複数のリンカーを、アミノ基を介し
て、固相表面に結合させて配列しておく。半導体製造技
術で使用されているフォトリソグラフィー技術を応用し
て、所望のリンカー固定位置のみを照射できるマスクを
介して光照射し、保護基を除去する。次に、光化学的に
除去できる保護基をもつ単量体を導入して最初のカップ
リング反応を行なう。これによって、その部分だけオリ
ゴヌクレオチドが伸長される。フォトリソグラフィー及
び単量体の導入を繰り返すことにより、所望のオリゴヌ
クレオチドマトリックスを形成する。

【０００４】第２の方法では、固定化するオリゴヌクレ
オチドを予め準備し、そのオリゴヌクレオチドをガラス
やポリマー膜などの固相表面に微量滴下し、その位置に
共有結合によって固定化する。例えば、固相表面にイソ
チオシアネート基を導入しておき、オリゴヌクレオチド
の末端をアミノ基にしておけば、イソチオシアネート基
固定位置にオリゴヌクレオチドを共有結合によって容易
に固定化することができる。第３の方法では、固定化す
るオリゴヌクレオチドを予め準備し、そのオリゴヌクレ
オチドをガラスやポリマー膜などの固相表面に微量滴下
し、その滴下位置に吸着作用によって固定化する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の第１の
方法では、オリゴヌクレオチドを伸長するごとに、フォ
トリソグラフィー及び単量体の導入を繰り返さなければ
ならず、ＤＮＡチップを作製するのに長時間を要し、製
造コストが高くなるという問題があった。上記の第２の
方法及び第３の方法では、いずれの方法においても、PC
R反応などにより増幅した複数種のオリゴヌクレオチド
を専用のスポッティング装置に取り込み、固相表面に順
次配列して滴下するので、ＤＮＡチップを作製するのに
長時間を要し、これらの方法でも製造コストが高くなる
という問題があった。また、上記のＤＮＡチップの製造
方法では、いずれの方法においても、同じオリゴヌクレ
オチドマトリックスをもつＤＮＡチップを大量に製造す
る場合、各ＤＮＡチップごとに同じ操作を繰り返して１
枚ずつ製造する必要があり、その製造コストが下がらな
いという問題があった。

【０００６】本発明の第１の目的は、ＤＮＡチップの製
造時間を短縮することにより、製造コストを低減するこ
とである。本発明の第２の目的は、同じオリゴヌクレオ
チドマトリックスをもつ複数枚のＤＮＡチップを製造す
る場合において、製造時間を短縮し、かつ製造コストを
低減することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様は、
以下の工程を含むＤＮＡチップの製造方法である。 （Ａ）内壁に鋳型オリゴヌクレオチドを固定化した１又
は複数のキャピラリー部材の内部で、ビオチンで標識さ
れたプライマーを少なくとも含む反応液を用いて複製反
応を行ない、上記鋳型オリゴヌクレオチドに相補的であ
り、かつビオチンで標識された相補的オリゴヌクレオチ
ドを合成する工程、（Ｂ）上記キャピラリー部材の一端
側に、アビジン又はストレプトアビジンが修飾された他
の固相表面を配置し、上記相補的オリゴヌクレオチドを
上記他の固相表面に移動させて、上記ビオチンと上記ア
ビジン又は上記ストレプトアビジンの選択的な結合によ
って、上記他の固相表面に固定化する工程。

【０００８】内壁に鋳型オリゴヌクレオチドが固定化さ
れた１又は複数本のキャピラリー部材を準備し、その鋳
型オリゴヌクレオチドを鋳型として複製反応を行なう。
ここで複製反応とは、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的
なオリゴヌクレオチドを合成することをいい、例えばPC
R反応が挙げられる。複製反応では、ビオチンで標識さ
れたプライマー（以下、ビオチン標識プライマーとい
う）を少なくとも含む反応液を用いる。ビオチン標識プ
ライマーとしては、複製反応で合成される相補的なオリ
ゴヌクレオチドの一部分を構成する塩基配列をもつもの
を用いる。複製反応によって、鋳型オリゴヌクレオチド
に相補的であり、かつビオチンで標識された相補的オリ
ゴヌクレオチドを合成した後、その相補的オリゴヌクレ
オチドを、アビジン又はストレプトアビジンが修飾され
た他の固相表面に移動させる。相補的オリゴヌクレオチ
ドは、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの選
択的な結合によって、他の固相表面に強固に固定化され
る。複数のキャピラリー部材を用いた場合、相補的なオ
リゴヌクレオチドを他の固相表面に整列して固定化すれ
ば、所望のオリゴヌクレオチドマトリックスをもつＤＮ
Ａチップを作製することができる。

【０００９】本発明の第２の態様は、以下の工程を含む
ＤＮＡチップの製造方法である。 （Ａ）予め作製されたＤＮＡチップに固定化された複数
の鋳型オリゴヌクレオチドを鋳型として、ビオチン標識
プライマーを少なくとも含む反応液を用いて複製反応を
行ない、上記鋳型オリゴヌクレオチドに相補的であり、
かつビオチンで標識された相補的オリゴヌクレオチドを
合成する工程、（Ｂ）上記相補的オリゴヌクレオチド
を、アビジン又はストレプトアビジンが修飾された他の
固相表面に移動させて、上記ＤＮＡチップにおける上記
鋳型オリゴヌクレオチドの固定位置に対応して、上記ビ
オチンと上記アビジン又は上記ストレプトアビジンの選
択的な結合によって、上記他の固相表面に固定化する工
程。

【００１０】予め作製されたＤＮＡチップ（以下、マス
ターＤＮＡチップという）を準備する。マスターＤＮＡ
チップに固定化された鋳型オリゴヌクレオチドを鋳型と
して複製反応を行なう。複製反応では、ビオチン標識プ
ライマーを少なくとも含む反応液を用いる。ビオチン標
識プライマーとしては、複製反応で合成される相補的な
オリゴヌクレオチドの一部分を構成する塩基配列をもつ
ものを用いる。複製反応によって、鋳型オリゴヌクレオ
チドに相補的であり、かつビオチンで標識された相補的
オリゴヌクレオチドを合成した後、それらの相補的オリ
ゴヌクレオチドを、アビジン又はストレプトアビジンが
修飾された他の固相表面に移動させる。相補的オリゴヌ
クレオチドは、マスターＤＮＡチップのオリゴヌクレオ
チドマトリックスの位置に対応して、ビオチンとアビジ
ン又はストレプトアビジンの選択的な結合によって、他
の固相表面に強固に固定化される。このようにして、マ
スターＤＮＡチップのオリゴヌクレオチドマトリックス
に相補的なオリゴヌクレオチドマトリックスをもつＤＮ
Ａチップ（以下、レプリカＤＮＡチップという）を得る
ことができる。マスターＤＮＡチップとして、所望のオ
リゴヌクレオチドマトリックスに相補的なオリゴヌクレ
オチドマトリックスをもつＤＮＡチップを用いれば、所
望のオリゴヌクレオチドマトリックスをもつレプリカＤ
ＮＡチップを短時間、かつ低コストで大量に製造するこ
とができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】第１の態様において、工程（Ａ）
は、複数のキャピラリー部材を用い、工程（Ｂ）は、他
の固相表面への相補的オリゴヌクレオチドの移動及び固
定化を２以上のキャピラリー部材で同時に行なう操作を
含むことが好ましい。その結果、製造時間を短縮するこ
とができる。複数の相補的オリゴヌクレオチドを、一度
に又は複数回に分けて、他の固相表面に整列して固定化
すれば、ＤＮＡチップを作製することができる。ただ
し、工程（Ａ）の複製反応は、複数のキャピラリー部材
についてそれぞれ行なってもよいし、同時に行なっても
よい。

【００１２】工程（Ａ）は、複数のキャピラリー部材の
一端側を二次元的に配列して用い、すべてのキャピラリ
ー部材で同時に複製反応を行ない、工程（Ｂ）は、他の
固相表面への相補的オリゴヌクレオチドの移動及び固定
化をすべてのキャピラリー部材で同時に行なう操作を含
むことが好ましい。その結果、製造時間をさらに短縮す
ることができる。

【００１３】ビオチンで標識したプライマーは、相補的
オリゴヌクレオチドの合成のみに用いられる塩基配列を
もつものであって、工程（Ａ）は、複数の相補的オリゴ
ヌクレオチドを合成し、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で合
成した相補的オリゴヌクレオチドのうちの一部のみを他
の固相表面に移動及び固定化する操作であり、工程
（Ｂ）の後に、他の固相表面とは異なる、アビジン又は
ストレプトアビジンが修飾された１又は複数の固相表面
に残りの相補的オリゴヌクレオチドを移動させ、固定化
する工程（Ｃ）を含むことが好ましい。その結果、同じ
オリゴヌクレオチドマトリックスをもつＤＮＡチップを
大量に、かつ容易に製造することができる。

【００１４】第２の態様において、工程（Ｂ）で相補的
オリゴヌクレオチドを他の固相表面に移動させる前に、
未反応のビオチンで標識されたプライマーを除去する操
作を含むことが好ましい。その結果、相補的オリゴヌク
レオチドのみを他の固相表面に固定化することができ
る。

【００１５】

【実施例】（実施例１）図１は、第１の態様の一実施例
を示すフロー図である。ただし、この実施例は本明細書
の特許請求の範囲を限定するものではない。 （Ａ）ＤＮＡチップに固定化するオリゴヌクレオチドに
相補的な配列をもつ鋳型オリゴヌクレオチド２を中空の
キャピラリーチューブ（キャピラリー部材）４の内部に
導入し、キャピラリーチューブ４の内壁表面に固定化す
る。鋳型オリゴヌクレオチド２の固定化は、鋳型オリゴ
ヌクレオチド２の末端にアミノ基を導入し、キャピラリ
ーチューブ４の内壁表面にイソチオシアネート基を導入
して、共有結合によって行なった。ただし、固定化の方
法は、オリゴヌクレオチドにアミノ基以外の官能基を導
入し、その官能基に共有結合性を有する物質でキャピラ
リーチューブ４の内壁に表面処理を施して共有結合させ
る方法や、オリゴヌクレオチドの荷電を利用して、ポリ
陽イオンでキャピラリーチューブ４の内壁に表面処理を
施して静電結合させる方法など、他の方法を用いてもよ
い。

【００１６】（Ｂ）それぞれ異なる鋳型オリゴヌクレオ
チド２を内壁に固定化したキャピラリーチューブ４を多
数準備し、それらの一端側を二次元的に配列して束ね
る。ただし、図１では１本のキャピラリーチューブ４の
みを示す。鋳型オリゴヌクレオチド２を鋳型としてPCR
反応を行なう。PCR反応を行なう装置としては、例えばT
he RapidCycler（IDAHO TECHNOLOGY INC.（米国）の製
品）を用いることができる。PCRバッファー、ビオチン
標識プライマー、プライマー、ｄＮＴＰ（デオキシヌク
レオチド・トリフォスフェート）、ＤＮＡポリメラーゼ
など、PCR反応に必要な溶液を混合してPCR反応液６を調
製し、キャピラリーチューブ４内にPCR反応液６を充填
する。ビオチン標識プライマーは、PCR反応によって合
成されるオリゴヌクレオチドの一部分を構成する塩基配
列をもつものである。ビオチン標識プライマーは、PCR
反応中にすべて消費されるように、キャピラリーチュー
ブ４内に供する量を調節しておくことが好ましい。

【００１７】（Ｃ）加熱及び冷却処理を施してPCR反応
を行なわせる。キャピラリーチューブ４内では、鋳型オ
リゴヌクレオチド２に相補的であり、かつビオチン（星
印）７で標識されたオリゴヌクレオチド（相補的オリゴ
ヌクレオチド）８が鋳型オリゴヌクレオチド２にハイブ
リダイゼーションした状態で合成される。 （Ｄ）相補的オリゴヌクレオチド８が形成された後、キ
ャピラリーチューブ４内の洗浄を行なってPCR反応液６
を除去する。このとき、相補的オリゴヌクレオチド８
は、キャピラリーチューブ４の内壁に固定化された鋳型
オリゴヌクレオチド２とともにキャピラリーチューブ２
内に残留する。 （Ｅ）キャピラリーチューブ４内に、尿素やホルムアミ
ドなどの変性剤を含む解離液（図示は省略）を導入し、
ハイブリダイゼーションした鋳型オリゴヌクレオチド２
と相補的オリゴヌクレオチド８を解離させる。鋳型オリ
ゴヌクレオチド２と相補的オリゴヌクレオチド８を解離
させる手段は熱変性でもよい。

【００１８】（Ｆ）キャピラリーチューブ４の一端面に
対向してガラス基板表面１０（他の固相表面）を配置す
る。ガラス基板表面１０には多数のアビジン１４が修飾
されている。アビジン１４の固定化方法は、例えばＤＩ
ＴＣ（p-phenylene diisothiocyanate）をガラス基板表
面１０に修飾してアビジン１４を共有結合によって固定
化する方法など、どのような方法を用いてもよい。キャ
ピラリーチューブ４の一端面をガラス基板表面１０に接
触させる。キャピラリーチューブ４内の解離液１２（工
程（Ｅ）で鋳型オリゴヌクレオチド２と相補的オリゴヌ
クレオチド８が解離して得られた溶液）の一部は、キャ
ピラリーチューブ４外に流出し、ガラス基板表面１０に
付着する。相補的オリゴヌクレオチド８は、キャピラリ
ーチューブ４外に流出した解離液１２とともにガラス基
板表面１０に移動され、ビオチン７とアビジン１４の選
択的な結合によってガラス基板表面１０に固定化され
る。図示は省略されているが、一端側が二次元に配列さ
れた多数のキャピラリーチューブ内でそれぞれ合成され
た相補的オリゴヌクレオチドを同時にガラス基板表面１
０に移動させて、ビオチンとアビジンの選択的な結合に
よって固定化することにより、ＤＮＡチップを作製す
る。

【００１９】工程（Ｆ）の後、鋳型オリゴヌクレオチド
２を除去しないようにキャピラリーチューブ２内を洗浄
し、再度PCR反応６を充填して相補的オリゴヌクレオチ
ド８を合成し、その相補的オリゴヌクレオチド８をアビ
ジンが修飾された他のガラス基板表面に順次固定化する
ようにすれば、同じオリゴヌクレオチドマトリックスを
もつＤＮＡチップを大量に、かつ容易に製造することが
できる。

【００２０】ビオチン標識プライマーとして、相補的オ
リゴヌクレオチドのみにビオチンが標識されるような塩
基配列をもつものを用い、PCR反応によって多数の相補
的オリゴヌクレオチド８を合成し、アビジンが修飾され
た複数のガラス基板表面にキャピラリーチューブ２の一
端側を順次接触させて、相補的オリゴヌクレオチド８を
含むＰＣＲ反応液を複数のガラス基板表面に順次付着さ
せるようにすれば、同じオリゴヌクレオチドマトリック
スをもつＤＮＡチップを大量に、かつ容易に製造するこ
とができる。PCR反応によって鋳型オリゴヌクレオチド
と同じ塩基配列をもつ複製オリゴヌクレオチドも合成さ
れ、その複製オリゴヌクレオチドもPCR反応液とともに
ガラス基板表面に移動されるが、複製オリゴヌクレオチ
ドにはビオチンが標識されていないので、ガラス基板表
面を洗浄することにより除去することができる。

【００２１】相補的オリゴヌクレオチド８をガラス基板
表面１０に移動させる際に、キャピラリーチューブ４の
他端側（ガラス基板表面１０に対向する側とは反対側）
を陰極とし、ガラス基板表面１０を陽極として、キャピ
ラリーチューブ４の他端側、ガラス基板表面１０間に電
圧を印加することによって電気的に移動させてもよい。
また、キャピラリーチューブ４の他端側から加圧して解
離液１２を押し出してもよい。

【００２２】（実施例２）図２は、第２の態様の一実施
例を示すフロー図である。ただし、この実施例は本明細
書の特許請求の範囲を限定するものではない。 （Ａ）所望のオリゴヌクレオチドマトリックスに相補的
なオリゴヌクレオチドマトリックスをもつマスターＤＮ
Ａチップを準備する。そのマスターＤＮＡチップのガラ
ス基板表面２２に鋳型オリゴヌクレオチド２４ａ，２４
ｂが固定化されている。ガラス基板表面２２には鋳型オ
リゴヌクレオチド２４ａ，２４ｂの他にも多数のオリゴ
ヌクレオチドが固定化されているが、図示は省略する。

【００２３】（Ｂ）マスターＤＮＡチップを鋳型とし
て、in situ PCR反応を行なう。In situ PCR反応を行な
う装置としては、例えばTaKaRa PCR Thermal Cycler MP
（宝酒造株式会社製）を用いることができる。PCRバッ
ファー、ビオチン標識プライマー、プライマー、ｄＮＴ
Ｐ、ＤＮＡポリメラーゼなど、in situ PCR反応に必要
な溶液を混合してPCR反応液２６を調製する。ビオチン
標識プライマーは、PCR反応によって合成される相補的
オリゴヌクレオチドの一部分を構成する塩基配列をもつ
ものである。ビオチン標識プライマーは、PCR反応中に
すべて消費されるように、キャピラリーチューブ４内に
供する量を調節しておくことが好ましい。PCR反応液２
６をガラス基板表面２２にPCR反応液２６を接触させ
る。その後、PCR反応液２６の蒸発を防止するために、
ガラス基板表面２２をシーリング部材（図示は省略）に
よって密閉する。

【００２４】（Ｃ）加熱及び冷却処理を施して、in sit
u PCR反応を行なわせる。ガラス基板表面２２では、鋳
型オリゴヌクレオチド２４ａ，２４ｂに相補的であり、
かつビオチン（星印）２７で標識されたな相補的オリゴ
ヌクレオチド２８ａ，２８ｂが鋳型オリゴヌクレオチド
２４ａ，２４ｂにハイブリダイゼーションした状態で合
成される。 （Ｄ）ガラス基板表面２２に固定化された全ての鋳型オ
リゴヌクレオチドについて、相補的オリゴヌクレオチド
が形成された後、ガラス基板表面２２の洗浄を行なって
PCR反応液２６を除去する。このとき、相補的オリゴヌ
クレオチド２８ａ，２８ｂは、鋳型オリゴヌクレオチド
２とともにガラス基板表面２２に残留する。

【００２５】（Ｅ）ガラス基板表面２２に対向してガラ
ス基板表面３０（他の固相表面）を配置する。ガラス基
板表面３０には多数のアビジン３４が修飾されている。
ガラス基板表面２２側を陰極とし、ガラス基板表面３０
を陽極として、ガラス基板表面２２、ガラス基板表面３
０間に電圧を印加する電源装置３２を配置する。尿素や
ホルムアミドなどの変性剤を含む解離液（図示は省略）
をガラス基板表面２２、ガラス基板表面３０間に導入し
て、ハイブリダイゼーションした鋳型オリゴヌクレオチ
ド２４ａと相補的オリゴヌクレオチド２８ａ、鋳型オリ
ゴヌクレオチド２４ｂと相補的オリゴヌクレオチド２８
ｂを解離させると同時に、電源装置３２をオンにしてガ
ラス基板表面２２、ガラス基板表面３０間に電圧を印加
し、相補的オリゴヌクレオチド２８ａ，２８ｂをガラス
基板表面３０に移動させる。ここで、鋳型オリゴヌクレ
オチドと相補的オリゴヌクレオチドを解離させる手段は
熱変性でもよい。

【００２６】（Ｆ）ガラス基板表面３０に接触した相補
的オリゴヌクレオチド２８ａ，２８ｂは、ビオチン２７
とアビジン３４の選択的な結合によって、鋳型オリゴヌ
クレオチド２４ａ，２４ｂに対応する位置に強固に固定
化される。 （Ｇ）ガラス基板表面３０をガラス基板表面２２から離
し、ガラス基板表面３０の洗浄を行なって解離液を除去
し、ガラス基板表面３０に所望のオリゴヌクレオチドマ
トリックスが形成されたレプリカＤＮＡチップを得る。

【００２７】実施例１及び実施例２では、マスターＤＮ
Ａチップ及びレプリカＤＮＡチップを含むＤＮＡチップ
のオリゴヌクレオチドマトリックス形成領域としてガラ
ス基板を用いているが本発明はこれに限定されるもので
はなく、ナイロン膜や他のポリマー膜など、オリゴヌク
レオチドを固定化できる固相であれば如何なるものであ
ってもよい。実施例１及び実施例２では、ガラス基板に
アビジンを固定化しているが、固相表面にストレプトア
ビジンを固定化して、ビオチンとストレプトアビジンの
選択的な結合によって相補的オリゴヌクレオチドを固相
表面に固定化するようにしてもよい。

【００２８】実施例１及び実施例２では、相補的オリゴ
ヌクレオチドを１つのビオチンのみで標識しているが、
本発明はこれに限定されるものではなく、複数のビオチ
ンで標識してもよい。実施例１及び実施例２において、
オリゴヌクレオチドの代わりに、ＤＮＡのホスホジエス
テル結合をペプチド結合に変換した人工核酸（ペプチド
核酸ともいう）を用いてもよい。

【００２９】

【発明の効果】第１の態様におけるＤＮＡチップの製造
方法では、内壁に鋳型オリゴヌクレオチドが固定化され
た１又は複数のキャピラリー部材の内部で、ビオチン標
識プライマーを少なくとも含む反応液を用いて複製反応
を行ない、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的であり、か
つビオチンで標識された相補的オリゴヌクレオチドを合
成し、キャピラリー部材の一端側に、アビジン又はスト
レプトアビジンが修飾された他の固相表面を配置し、相
補的オリゴヌクレオチドを他の固相表面に移動させて、
ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの選択的な
結合によって、他の固相表面に固定化するようにしたの
で、オリゴヌクレオチドが強固に固定されたＤＮＡチッ
プを短時間かつ低コストで製造することができる。

【００３０】第１の態様において、複数のキャピラリー
部材を用い、他の固相表面への相補的なオリゴヌクレオ
チドの移動を２以上のキャピラリー部材で同時に行なう
ようにすれば、製造時間をさらに短縮することができ
る。第１の態様において、複数のキャピラリー部材の一
端側を二次元的に配列して用い、すべてのキャピラリー
部材で同時に複製反応を行ない、他の固相表面への相補
的オリゴヌクレオチドの移動及び固定化をすべてのキャ
ピラリー部材で同時に行なう操作を含むようにすれば、
製造時間をさらに短縮することができる。第１の態様に
おいて、ビオチン標識プライマーは相補的オリゴヌクレ
オチドの合成にのみ用いられる塩基配列をもつものであ
って、複製反応によって多数の相補的オリゴヌクレオチ
ドを合成し、そのうちの一部のみを他の固相表面に移動
及び固定化し、他の固相表面とは異なる、アビジン又は
ストレプトアビジンが修飾された１又は複数の固相表面
に残りの相補的オリゴヌクレオチドを移動及び固定化す
るようにすれば、同じオリゴヌクレオチドマトリックス
をもつＤＮＡチップを大量に、かつ容易に製造すること
ができる。

【００３１】第２の態様におけるＤＮＡチップの製造方
法では、予め作製されたＤＮＡチップに固定化された複
数の鋳型オリゴヌクレオチドを鋳型として、ビオチン標
識プライマーを少なくとも含む反応液を用いて複製反応
を行ない、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的であり、か
つビオチンで標識された相補的オリゴヌクレオチドを合
成し、相補的オリゴヌクレオチドを、アビジン又はスト
レプトアビジンが修飾された他の固相表面に移動させ
て、ＤＮＡチップにおける鋳型オリゴヌクレオチドの固
定位置に対応して、ビオチンとアビジン又はストレプト
アビジンの選択的な結合によって、他の固相表面に固定
化するようにしたので、オリゴヌクレオチドが強固に固
定された、同じオリゴヌクレオチドマトリックスをもつ
ＤＮＡチップを短時間、かつ低コストで大量に製造する
ことができる。第２の態様において相補的オリゴヌクレ
オチドを他の固相表面に移動させる前に、未反応のビオ
チン標識プライマーを除去する操作を含むようにすれ
ば、相補的オリゴヌクレオチドのみを確実に他の固相表
面に固定化することができる。

【００３２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１の態様の一実施例を示すフロー図であ
る。

【図２】 第２の態様の一実施例を示すフロー図であ
る。

【符号の説明】

２，２４ａ，２４ｂ 鋳型オリゴヌクレオチド ４ キャピラリーチューブ ６，２６ PCR反応液 ８，２８ａ，２８ｂ 相補的オリゴヌクレオチド １０，２２，３０ ガラス基板 １２ 解離液 １４，３０ アビジン ３２ 電源装置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 FA02 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QR62 QR82 QS03 QS25 QS34 QX02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程を含むＤＮＡチップの製造方
   法。 （Ａ）内壁に鋳型オリゴヌクレオチドを固定化した１又
   は複数のキャピラリー部材の内部で、ビオチンで標識さ
   れたプライマーを少なくとも含む反応液を用いて複製反
   応を行ない、前記鋳型オリゴヌクレオチドに相補的であ
   り、かつビオチンで標識された相補的オリゴヌクレオチ
   ドを合成する工程、（Ｂ）前記キャピラリー部材の一端
   側に、アビジン又はストレプトアビジンが修飾された他
   の固相表面を配置し、前記相補的オリゴヌクレオチドを
   前記他の固相表面に移動させて、前記ビオチンと前記ア
   ビジン又は前記ストレプトアビジンの選択的な結合によ
   って、前記他の固相表面に固定化する工程。
2. 【請求項２】 前記工程（Ａ）は、複数のキャピラリー
   部材を用い、前記工程（Ｂ）は、前記他の固相表面への
   前記相補的オリゴヌクレオチドの移動及び固定化を２以
   上のキャピラリー部材で同時に行なう操作を含む請求項
   １に記載のＤＮＡチップの製造方法。
3. 【請求項３】 前記工程（Ａ）は、複数のキャピラリー
   部材の一端側を二次元的に配列して用い、すべてのキャ
   ピラリー部材で同時に前記複製反応を行ない、前記工程
   （Ｂ）は、前記他の固相表面への前記相補的オリゴヌク
   レオチドの移動及び固定化をすべてのキャピラリー部材
   で同時に行なう操作を含む請求項２に記載のＤＮＡチッ
   プの製造方法。
4. 【請求項４】 前記ビオチンで標識したプライマーは、
   前記相補的オリゴヌクレオチドの合成のみに用いられる
   塩基配列をもつものであって、前記工程（Ａ）は、複数
   の前記相補的オリゴヌクレオチドを合成し、前記工程
   （Ｂ）は、前記工程（Ａ）で合成した相補的オリゴヌク
   レオチドのうちの一部のみを前記他の固相表面に移動及
   び固定化する操作であり、前記工程（Ｂ）の後に、前記
   他の固相表面とは異なる、アビジン又はストレプトアビ
   ジンが修飾された１又は複数の固相表面に残りの前記相
   補的オリゴヌクレオチドを移動させ、固定化する工程
   （Ｃ）を含む請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡ
   チップの製造方法。
5. 【請求項５】 以下の工程を含むＤＮＡチップの製造方
   法。 （Ａ）予め作製されたＤＮＡチップに固定化された複数
   の鋳型オリゴヌクレオチドを鋳型として、ビオチンで標
   識されたプライマーを少なくとも含む反応液を用いて複
   製反応を行ない、前記鋳型オリゴヌクレオチドに相補的
   であり、かつビオチンで標識された相補的オリゴヌクレ
   オチドを合成する工程、（Ｂ）前記相補的オリゴヌクレ
   オチドを、アビジン又はストレプトアビジンが修飾され
   た他の固相表面に移動させて、前記ＤＮＡチップにおけ
   る前記鋳型オリゴヌクレオチドの固定位置に対応して、
   前記ビオチンと前記アビジン又は前記ストレプトアビジ
   ンの選択的な結合によって、前記他の固相表面に固定化
   する工程。
6. 【請求項６】 前記工程（Ｂ）で前記相補的オリゴヌク
   レオチドを前記他の固相表面に移動させる前に、未反応
   の前記ビオチンで標識されたプライマーを除去する操作
   を含む請求項５に記載のＤＮＡチップの製造方法。