JP2001046086A - ５’及び３’の転写後制御因子のための機能的ゲノミック・スクリーニング - Google Patents
５’及び３’の転写後制御因子のための機能的ゲノミック・スクリーニングInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、5'及び3'の転写後制御因子のため
の機能的ゲノミック・スクリーニング法を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 本発明は、隣接するmRNAコード配列から
分離された異なるmRNA非翻訳領域（UTR）配列に対応す
るcDNA配列から本質的に成るcDNAライブラリーを提供す
る。本発明により、これらのライブラリーを製造するた
めの方法、及び制御UTR配列を同定するための方法も提
供される。
の機能的ゲノミック・スクリーニング法を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 本発明は、隣接するmRNAコード配列から
分離された異なるmRNA非翻訳領域（UTR）配列に対応す
るcDNA配列から本質的に成るcDNAライブラリーを提供す
る。本発明により、これらのライブラリーを製造するた
めの方法、及び制御UTR配列を同定するための方法も提
供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願は、1999年7月2日に出願
された米国仮出願第60/142,217号に基づく優先権を主張
するものである。
された米国仮出願第60/142,217号に基づく優先権を主張
するものである。
【０００２】本発明は、mRNAの翻訳、エクスポート、及
び安定性に影響を与える核酸制御因子の領域に関する。
より具体的には、本発明は、5'及び3'の非翻訳RNA配列
のスクリーニング、これらの配列内のRNA制御因子の同
定、並びにこれらのRNA制御配列の機能をモデュレート
する化合物の同定に関する。
び安定性に影響を与える核酸制御因子の領域に関する。
より具体的には、本発明は、5'及び3'の非翻訳RNA配列
のスクリーニング、これらの配列内のRNA制御因子の同
定、並びにこれらのRNA制御配列の機能をモデュレート
する化合物の同定に関する。
【０００３】
【従来の技術】転写調節は、mRNA産生の速度に影響を与
えることにより、遺伝子発現を制御するが、転写後機構
も、mRNA分子から産生されるタンパク質の量をモデュレ
ートすることにより、遺伝子発現を制御することができ
る。例えば、遺伝子発現は、mRNA翻訳効率を変化させる
ことにより（Izquierdo and Cueza,Mol.Cell Biol.17:5
255-5268,1997; Yang et al.,J.Biol.Chem.272:15466-7
3,1997）、又はmRNA安定性を変化させることにより（Ro
ss,Microbiol.Rev.59:423-50,1995）制御されうる。転
写後調節機構は、熱ショック（Sierra et al.,Mol.Bio
l.Rep.19:211-20,1994）、鉄利用可能性（Hentze et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8175-82,1996）、酸素
利用可能性（Levy et al.,J.Biol.Chem.271:2746-53,19
96;McGary etal.,J.Biol.Chem.272:8628-34,1997）、及
び増殖因子（Amara et al.,Nucleic Acids Res.21:4803
-09,1993）に対する反応のような環境的要因に対する遺
伝子発現反応において特に重要な役割を果たしているよ
うである。
えることにより、遺伝子発現を制御するが、転写後機構
も、mRNA分子から産生されるタンパク質の量をモデュレ
ートすることにより、遺伝子発現を制御することができ
る。例えば、遺伝子発現は、mRNA翻訳効率を変化させる
ことにより（Izquierdo and Cueza,Mol.Cell Biol.17:5
255-5268,1997; Yang et al.,J.Biol.Chem.272:15466-7
3,1997）、又はmRNA安定性を変化させることにより（Ro
ss,Microbiol.Rev.59:423-50,1995）制御されうる。転
写後調節機構は、熱ショック（Sierra et al.,Mol.Bio
l.Rep.19:211-20,1994）、鉄利用可能性（Hentze et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8175-82,1996）、酸素
利用可能性（Levy et al.,J.Biol.Chem.271:2746-53,19
96;McGary etal.,J.Biol.Chem.272:8628-34,1997）、及
び増殖因子（Amara et al.,Nucleic Acids Res.21:4803
-09,1993）に対する反応のような環境的要因に対する遺
伝子発現反応において特に重要な役割を果たしているよ
うである。
【０００４】転写後制御因子は、5'及び3'のmRNA非翻訳
領域（UTR）に存在する可能性がある。5'UTRにおいて
は、mRNAのリボソームへの結合が一般的に翻訳開始にお
ける律速段階となっている（Mathews et al.,In:Transl
ational Control,1-30頁,Hershey et al.編,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,19
96）。3'UTRにおいては、制御因子が、mRNAの翻訳及び
退化、並びにmRNAの輸送及び細胞内局在化をモデュレー
トすることができる（Jackson,Cell 74:9-14,1993）。
しかし、ほとんどのUTR転写後因子の性質は依然として
よく理解されていない。これらのmRNA制御配列を効率よ
く特徴決定するための方法は、制御mRNA部位を介して治
療的に重要なタンパク質の発現をモデュレートする化合
物の発見を、促進すると考えられる。
領域（UTR）に存在する可能性がある。5'UTRにおいて
は、mRNAのリボソームへの結合が一般的に翻訳開始にお
ける律速段階となっている（Mathews et al.,In:Transl
ational Control,1-30頁,Hershey et al.編,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,19
96）。3'UTRにおいては、制御因子が、mRNAの翻訳及び
退化、並びにmRNAの輸送及び細胞内局在化をモデュレー
トすることができる（Jackson,Cell 74:9-14,1993）。
しかし、ほとんどのUTR転写後因子の性質は依然として
よく理解されていない。これらのmRNA制御配列を効率よ
く特徴決定するための方法は、制御mRNA部位を介して治
療的に重要なタンパク質の発現をモデュレートする化合
物の発見を、促進すると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、5'及び3'の
転写後制御因子のための機能的ゲノミック・スクリーニ
ング法を提供することを課題とする。
転写後制御因子のための機能的ゲノミック・スクリーニ
ング法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、RNA制御
部位に特に偏向したライブラリーを構築するための方法
を見出した。第一の局面において、本発明は、隣接する
mRNAコード配列から単離され分離された異なるmRNA非翻
訳領域（UTR）配列に対応する少なくとも100個の異なる
cDNA配列から本質的に成るcDNAライブラリーを特徴とす
る。好ましくは、cDNA配列は、該配列を発現することが
できるベクター系にクローニングされており、そのよう
なベクターもまた本発明の特徴である。このベクター
は、a）プロモーターと機能的に連結された、第一の局
面のcDNAライブラリーに由来するmRNA UTR配列をコード
するヌクレオチド配列、b）UTRコードヌクレオチド配列
の上流又は下流に転写のため位置する第一レポーター遺
伝子、及びc）プロモーターと機能的に連結している
が、該UTRコードヌクレオチド配列とは関連していな
い、第二の異なるレポーター遺伝子を含む。好ましく
は、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は細胞表面
マーカー・タンパク質をコードする。
部位に特に偏向したライブラリーを構築するための方法
を見出した。第一の局面において、本発明は、隣接する
mRNAコード配列から単離され分離された異なるmRNA非翻
訳領域（UTR）配列に対応する少なくとも100個の異なる
cDNA配列から本質的に成るcDNAライブラリーを特徴とす
る。好ましくは、cDNA配列は、該配列を発現することが
できるベクター系にクローニングされており、そのよう
なベクターもまた本発明の特徴である。このベクター
は、a）プロモーターと機能的に連結された、第一の局
面のcDNAライブラリーに由来するmRNA UTR配列をコード
するヌクレオチド配列、b）UTRコードヌクレオチド配列
の上流又は下流に転写のため位置する第一レポーター遺
伝子、及びc）プロモーターと機能的に連結している
が、該UTRコードヌクレオチド配列とは関連していな
い、第二の異なるレポーター遺伝子を含む。好ましく
は、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は細胞表面
マーカー・タンパク質をコードする。
【０００７】本発明の第二の関連する局面は、a）全RNA
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNA中のA
UG配列の調節された非ランダムな酵素消化を実施する工
程、c）5'末端配列を含む断片を得るため消化されたRNA
を精製する工程、及びd）工程（c）において得られた精
製されたRNAからcDNAを合成する工程を含む工程により
構築される、隣接するmRNAコード配列から単離され分離
されたmRNA5'非翻訳領域（UTR）配列に対応するcDNA配
列から本質的に成るcDNAライブラリーを特徴とする。好
ましくは、酵素消化は、RNaseHを用いて実施される。
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNA中のA
UG配列の調節された非ランダムな酵素消化を実施する工
程、c）5'末端配列を含む断片を得るため消化されたRNA
を精製する工程、及びd）工程（c）において得られた精
製されたRNAからcDNAを合成する工程を含む工程により
構築される、隣接するmRNAコード配列から単離され分離
されたmRNA5'非翻訳領域（UTR）配列に対応するcDNA配
列から本質的に成るcDNAライブラリーを特徴とする。好
ましくは、酵素消化は、RNaseHを用いて実施される。
【０００８】第三の局面において、本発明は、a）全RNA
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）開始コドン周辺の
開始コドンを含む領域に優先的にハイブリダイズする縮
重プライマーを用いて、ポリ(A)+RNAから、RNAの5'末端
配列を含む核酸ヘテロ二重鎖を合成する工程、c）5'末
端配列を含む断片を得るため工程（b）において得られ
たヘテロ二重鎖を精製する工程、及びd）工程（c）にお
いて得られた精製されたヘテロ二重鎖からcDNAを合成す
る工程を含む工程により構築される、隣接するmRNAコー
ド配列から単離され分離されたmRNA5'非翻訳領域（UT
R）配列に対応するcDNA配列から本質的に成るcDNAライ
ブラリーを特徴とする。
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）開始コドン周辺の
開始コドンを含む領域に優先的にハイブリダイズする縮
重プライマーを用いて、ポリ(A)+RNAから、RNAの5'末端
配列を含む核酸ヘテロ二重鎖を合成する工程、c）5'末
端配列を含む断片を得るため工程（b）において得られ
たヘテロ二重鎖を精製する工程、及びd）工程（c）にお
いて得られた精製されたヘテロ二重鎖からcDNAを合成す
る工程を含む工程により構築される、隣接するmRNAコー
ド配列から単離され分離されたmRNA5'非翻訳領域（UT
R）配列に対応するcDNA配列から本質的に成るcDNAライ
ブラリーを特徴とする。
【０００９】本発明の上記の三つの局面のうちのいずれ
かの一つの態様において、cDNAライブラリーは、完全な
形態で単離されたmRNA非翻訳領域配列に対応するcDNA配
列から本質的に成る。
かの一つの態様において、cDNAライブラリーは、完全な
形態で単離されたmRNA非翻訳領域配列に対応するcDNA配
列から本質的に成る。
【００１０】本発明の第二又は第三の局面の好ましい態
様において、5'配列精製は、キャップ結合タンパク質、
例えばeIF4E融合タンパク質又は5'キャップに対する抗
体を用いて実施され、cDNA配列は、配列を発現すること
ができるベクター系にクローニングされている。このベ
クターは、a）プロモーターと機能的に連結された、第
二又は第三の局面のcDNAライブラリーに由来するmRNA U
TR配列をコードするヌクレオチド配列、b）UTRコード・
ヌクレオチド配列の上流又は下流に転写のため位置する
第一レポーター遺伝子、及びc）プロモーターと機能的
に連結しているが、UTRコード・ヌクレオチド配列とは
関連していない、第二の異なるレポーター遺伝子を含
む。好ましくは、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質
又は細胞表面マーカー・タンパク質をコードする。
様において、5'配列精製は、キャップ結合タンパク質、
例えばeIF4E融合タンパク質又は5'キャップに対する抗
体を用いて実施され、cDNA配列は、配列を発現すること
ができるベクター系にクローニングされている。このベ
クターは、a）プロモーターと機能的に連結された、第
二又は第三の局面のcDNAライブラリーに由来するmRNA U
TR配列をコードするヌクレオチド配列、b）UTRコード・
ヌクレオチド配列の上流又は下流に転写のため位置する
第一レポーター遺伝子、及びc）プロモーターと機能的
に連結しているが、UTRコード・ヌクレオチド配列とは
関連していない、第二の異なるレポーター遺伝子を含
む。好ましくは、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質
又は細胞表面マーカー・タンパク質をコードする。
【００１１】本発明の関連する第四の局面は、a）全RNA
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNAに対
してランダムな消化を実施する工程、c）断片を含むポ
リ(A)を得るため消化されたRNAを精製する工程、及び
d）工程（c）において得られた精製されたRNAからcDNA
を合成する工程を含む工程により構築される、隣接する
mRNAコード配列から単離され分離された3'UTR配列に対
応するcDNA配列から本質的になるcDNAライブラリーであ
る。
からポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNAに対
してランダムな消化を実施する工程、c）断片を含むポ
リ(A)を得るため消化されたRNAを精製する工程、及び
d）工程（c）において得られた精製されたRNAからcDNA
を合成する工程を含む工程により構築される、隣接する
mRNAコード配列から単離され分離された3'UTR配列に対
応するcDNA配列から本質的になるcDNAライブラリーであ
る。
【００１２】本発明の第五の局面においても、cDNAライ
ブラリーが特徴である。このcDNAライブラリーは、a）
全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNA
にリボソームをロードする工程、及びc）オリゴ(dT)プ
ライマー及びポリメラーゼを用いてロードされたポリ
(A)+RNAに対して逆転写を実施する工程を含む工程によ
り構築され、隣接するmRNAコード配列から単離され分離
された3'UTR配列に対応するcDNA配列から本質的に成
る。好ましくは、第四又は第五の局面のライブラリーの
cDNA配列は、配列を発現することができるベクター系に
クローニングされており、そのようなベクターもまた本
発明の特徴である。これらのベクターは、a）プロモー
ターと機能的に連結された、第四又は第五の局面のcDNA
ライブラリーに由来するmRNA UTR配列をコードするヌク
レオチド配列、b）UTRコード・ヌクレオチド配列の上流
又は下流に転写のため位置する第一レポーター遺伝子、
及びc）プロモーターと機能的に連結しているが、UTRコ
ード・ヌクレオチド配列とは関連していない、第二の異
なるレポーター遺伝子を含む。好ましくは、レポーター
遺伝子は、蛍光タンパク質又は細胞表面マーカー・タン
パク質をコードする。
ブラリーが特徴である。このcDNAライブラリーは、a）
全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、b）ポリ(A)+RNA
にリボソームをロードする工程、及びc）オリゴ(dT)プ
ライマー及びポリメラーゼを用いてロードされたポリ
(A)+RNAに対して逆転写を実施する工程を含む工程によ
り構築され、隣接するmRNAコード配列から単離され分離
された3'UTR配列に対応するcDNA配列から本質的に成
る。好ましくは、第四又は第五の局面のライブラリーの
cDNA配列は、配列を発現することができるベクター系に
クローニングされており、そのようなベクターもまた本
発明の特徴である。これらのベクターは、a）プロモー
ターと機能的に連結された、第四又は第五の局面のcDNA
ライブラリーに由来するmRNA UTR配列をコードするヌク
レオチド配列、b）UTRコード・ヌクレオチド配列の上流
又は下流に転写のため位置する第一レポーター遺伝子、
及びc）プロモーターと機能的に連結しているが、UTRコ
ード・ヌクレオチド配列とは関連していない、第二の異
なるレポーター遺伝子を含む。好ましくは、レポーター
遺伝子は、蛍光タンパク質又は細胞表面マーカー・タン
パク質をコードする。
【００１３】本発明の第四又は第五の局面の一つの態様
において、cDNAライブラリーは、完全な形態で単離され
た3'非翻訳領域配列に対応するcDNA配列から本質的にな
る。
において、cDNAライブラリーは、完全な形態で単離され
た3'非翻訳領域配列に対応するcDNA配列から本質的にな
る。
【００１４】本発明の第六の局面は、a）宿主細胞が異
なるUTR配列で形質転換されるよう、複数の宿主細胞
を、複数の本発明のベクターで形質転換する工程、b）
第一レポーター遺伝子と第二レポーター遺伝子との発現
の比率に基づき細胞を分取する工程、c）工程（a）の細
胞集団全体と比較して、又は第一及び第二のレポーター
遺伝子をコードするが対応するUTR配列を欠如したベク
ターで形質転換された細胞と比較して、非対称な発現比
率を有する工程a）の細胞を同定する工程、並びにd）同
定された細胞において発現したUTRを配列決定する工程
を含む、制御UTR配列を同定する方法を提供する。好ま
しくは、遺伝子発現は、蛍光放出により検出され、細胞
は、蛍光標示式細胞分取器により分取される。
なるUTR配列で形質転換されるよう、複数の宿主細胞
を、複数の本発明のベクターで形質転換する工程、b）
第一レポーター遺伝子と第二レポーター遺伝子との発現
の比率に基づき細胞を分取する工程、c）工程（a）の細
胞集団全体と比較して、又は第一及び第二のレポーター
遺伝子をコードするが対応するUTR配列を欠如したベク
ターで形質転換された細胞と比較して、非対称な発現比
率を有する工程a）の細胞を同定する工程、並びにd）同
定された細胞において発現したUTRを配列決定する工程
を含む、制御UTR配列を同定する方法を提供する。好ま
しくは、遺伝子発現は、蛍光放出により検出され、細胞
は、蛍光標示式細胞分取器により分取される。
【００１５】本発明の第七の最後の局面は、本発明のベ
クターのいずれかで形質転換された細胞を特徴とする。
クターのいずれかで形質転換された細胞を特徴とする。
【００１６】「異なるmRNA非翻訳領域（UTR）配列」又
は「異なるUTR配列」とは、異なるmRNA種に由来する点
で相互に異なっている配列を意味する。本明細書におい
て用いられるように、オルタナティブ・スプライシング
の産物であるmRNA UTR配列は、異なるmRNA UTR配列であ
ると見なされる。
は「異なるUTR配列」とは、異なるmRNA種に由来する点
で相互に異なっている配列を意味する。本明細書におい
て用いられるように、オルタナティブ・スプライシング
の産物であるmRNA UTR配列は、異なるmRNA UTR配列であ
ると見なされる。
【００１７】「AUG配列の調節された非ランダムな酵素
消化」とは、例えば、RNaseの基質認識のため5個より多
い連続塩基対のハイブリダイゼーションを必要とする条
件下で、RNaseH及び縮重AUG相補的オリゴヌクレオチド7
量体の混合物を用いて、AUG配列の部位で優先的にmRNA
を消化することを意味する。mRNA集団中の開始AUG配列
を優先的に消化するため、用いられるAUG相補的オリゴ
ヌクレオチド混合物中の7量体は、あらゆる既知の脊椎
動物mRNA配列における-3位と+4位との間に存在するA、
C、G、及びUの頻度と相補的な、各位置におけるA、C、
G、及びTの頻度を有する（ここで、+1はコード配列の第
一ヌクレオチドである）（例えば表1を参照のこと）。
消化」とは、例えば、RNaseの基質認識のため5個より多
い連続塩基対のハイブリダイゼーションを必要とする条
件下で、RNaseH及び縮重AUG相補的オリゴヌクレオチド7
量体の混合物を用いて、AUG配列の部位で優先的にmRNA
を消化することを意味する。mRNA集団中の開始AUG配列
を優先的に消化するため、用いられるAUG相補的オリゴ
ヌクレオチド混合物中の7量体は、あらゆる既知の脊椎
動物mRNA配列における-3位と+4位との間に存在するA、
C、G、及びUの頻度と相補的な、各位置におけるA、C、
G、及びTの頻度を有する（ここで、+1はコード配列の第
一ヌクレオチドである）（例えば表1を参照のこと）。
【００１８】「隣接するmRNAコード配列から単離され分
離されたUTR配列」とは、以下のものを意味する。1）転
写されたmRNAの5'末端で開始し、翻訳AUG開始部位まで
続く（翻訳AUG開始部位は含まない）5'UTR配列、及び
2）翻訳終結部位の3'側に隣接する位置のmRNA核酸で開
始し、転写されたmRNAのポリ(A)テールまで続く3'UTR配
列。好ましくは、UTR配列は、完全な形態で単離されて
いる。
離されたUTR配列」とは、以下のものを意味する。1）転
写されたmRNAの5'末端で開始し、翻訳AUG開始部位まで
続く（翻訳AUG開始部位は含まない）5'UTR配列、及び
2）翻訳終結部位の3'側に隣接する位置のmRNA核酸で開
始し、転写されたmRNAのポリ(A)テールまで続く3'UTR配
列。好ましくは、UTR配列は、完全な形態で単離されて
いる。
【００１９】ポリ(A)+RNAの「ランダムな消化」とは、
例えば、ランダムな部位においてRNAをより小さな断片
に消化するための、RNaseH及びランダム・プライマーを
用いたRNase消化を意味する。
例えば、ランダムな部位においてRNAをより小さな断片
に消化するための、RNaseH及びランダム・プライマーを
用いたRNase消化を意味する。
【００２０】「ポリ(A)+RNAにリボソームをロードする
こと」とは、リボソームへのRNAのローディングを可能
にするため、例えばウサギ網状赤血球溶解物中のリボソ
ームと、RNA集団を接触させることを意味する。リボソ
ームのローディングを最大にするため、リボソームのラ
ンオフ（runoff）を抑制する化学物質、例えばシクロヘ
キシミドが含まれていてもよい。
こと」とは、リボソームへのRNAのローディングを可能
にするため、例えばウサギ網状赤血球溶解物中のリボソ
ームと、RNA集団を接触させることを意味する。リボソ
ームのローディングを最大にするため、リボソームのラ
ンオフ（runoff）を抑制する化学物質、例えばシクロヘ
キシミドが含まれていてもよい。
【００２１】「複数」とは、1より多いことを意味す
る。
る。
【００２２】「非対称な発現比率」、同一UTRとは関連
していない第一レポーター遺伝子の発現と非UTR関連第
二レポーター遺伝子の発現との比率と比較された、特異
的UTRと関連した第一レポーター遺伝子の発現と非UTR関
連第二レポーター遺伝子の発現との比率の変化を意味す
る。
していない第一レポーター遺伝子の発現と非UTR関連第
二レポーター遺伝子の発現との比率と比較された、特異
的UTRと関連した第一レポーター遺伝子の発現と非UTR関
連第二レポーター遺伝子の発現との比率の変化を意味す
る。
【００２３】本発明のスクリーニング解析、並びに5'及
び3'のmRNA非翻訳領域（UTR）偏向cDNAライブラリー
は、多数の利点を有する。偏向したUTRライブラリー
は、任意の隣接するコード配列から単離され分離された
UTR配列の集合を提供する。従って、これらのライブラ
リーをスクリーニングすることにより、コード配列から
干渉されることなく、本質的に完全なUTR配列をスクリ
ーニングすることが可能となる。さらに、スクリーニン
グされる配列の質及び選出物の特異性を、各細胞に侵入
する異なるプラスミドの数を制御する条件を調節するこ
とによりモデュレートすることができる。ほとんどの場
合において、シグナル希釈及び擬陰性結果の発生が減少
するよう、細胞1個当たりのプラスミドの理想的な数は1
個に限定されると考えられる。
び3'のmRNA非翻訳領域（UTR）偏向cDNAライブラリー
は、多数の利点を有する。偏向したUTRライブラリー
は、任意の隣接するコード配列から単離され分離された
UTR配列の集合を提供する。従って、これらのライブラ
リーをスクリーニングすることにより、コード配列から
干渉されることなく、本質的に完全なUTR配列をスクリ
ーニングすることが可能となる。さらに、スクリーニン
グされる配列の質及び選出物の特異性を、各細胞に侵入
する異なるプラスミドの数を制御する条件を調節するこ
とによりモデュレートすることができる。ほとんどの場
合において、シグナル希釈及び擬陰性結果の発生が減少
するよう、細胞1個当たりのプラスミドの理想的な数は1
個に限定されると考えられる。
【００２４】本発明のその他の特徴及び利点は、本発明
の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなると考
えられる。
の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなると考
えられる。
【００２５】本発明に係るライブラリーにおいては、
（１）隣接するmRNAコード配列から単離され分離された
異なるmRNA非翻訳領域(UTR)配列に対応する少なくとも1
00個の異なるcDNA配列から本質的に構成されるcDNAライ
ブラリーであることを特徴とする。
（１）隣接するmRNAコード配列から単離され分離された
異なるmRNA非翻訳領域(UTR)配列に対応する少なくとも1
00個の異なるcDNA配列から本質的に構成されるcDNAライ
ブラリーであることを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（２）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNA中のAUG配列の調節された非ランダムな
酵素消化を実施する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため該消化されたRNA
を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離されたmRNA5’非翻訳領
域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に構成され
るcDNAライブラリーであることを特徴とする。
は、（２）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNA中のAUG配列の調節された非ランダムな
酵素消化を実施する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため該消化されたRNA
を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離されたmRNA5’非翻訳領
域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に構成され
るcDNAライブラリーであることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（３）酵素消化がRNaseHを用いて実施される、上記
(2)記載のcDNAライブラリーであることを特徴とする。
は、（３）酵素消化がRNaseHを用いて実施される、上記
(2)記載のcDNAライブラリーであることを特徴とする。
【００２８】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（４）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) 開始コドン周辺の開始コドンを含む領域にハイブリ
ダイズする縮重プライマーを用いて、該ポリ(A)+RNAか
ら、該RNAの5’末端配列を含む核酸ヘテロ二重鎖を合成
する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため工程(b)において
得られたヘテロ二重鎖を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたヘテロ二重鎖か
らcDNAを合成する工程を含む工程により構築される、隣
接するmRNAコード配列から単離され分離されたmRNA5’
非翻訳領域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に
構成されるcDNAライブラリーであることを特徴とする。
は、（４）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) 開始コドン周辺の開始コドンを含む領域にハイブリ
ダイズする縮重プライマーを用いて、該ポリ(A)+RNAか
ら、該RNAの5’末端配列を含む核酸ヘテロ二重鎖を合成
する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため工程(b)において
得られたヘテロ二重鎖を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたヘテロ二重鎖か
らcDNAを合成する工程を含む工程により構築される、隣
接するmRNAコード配列から単離され分離されたmRNA5’
非翻訳領域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に
構成されるcDNAライブラリーであることを特徴とする。
【００２９】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（５）5’配列精製が、キャップ結合タンパク質を
用いて実施される、上記(2)又は(4)記載のcDNAライブラ
リーであることを特徴とする。
は、（５）5’配列精製が、キャップ結合タンパク質を
用いて実施される、上記(2)又は(4)記載のcDNAライブラ
リーであることを特徴とする。
【００３０】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（６）cDNA配列が該配列を発現することができるベ
クター系にクローニングされている、上記(1)、(2)、又
は(4)記載のcDNAライブラリーであることを特徴とす
る。
は、（６）cDNA配列が該配列を発現することができるベ
クター系にクローニングされている、上記(1)、(2)、又
は(4)記載のcDNAライブラリーであることを特徴とす
る。
【００３１】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（７）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNAに対してランダムな消化を実施する工
程、 c) 断片を含むポリ(A)を得るため該消化されたRNAを精
製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離された3’UTR配列に対応
するcDNA配列から本質的に構成されるcDNAライブラリー
であることを特徴とする。
は、（７）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNAに対してランダムな消化を実施する工
程、 c) 断片を含むポリ(A)を得るため該消化されたRNAを精
製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離された3’UTR配列に対応
するcDNA配列から本質的に構成されるcDNAライブラリー
であることを特徴とする。
【００３２】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（８）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNAにリボソームをロードする工程、及び c) オリゴ(dT)プライマー及びポリメラーゼを用いて該
ロードされたポリ(A)+RNAに対して逆転写を実施する工
程、を含む工程により構築される、隣接するmRNAコード
配列から単離され分離された3’UTR配列に対応するcDNA
配列から本質的に構成されるcDNAライブラリーであるこ
とを特徴とする。
は、（８）a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工程、 b) ポリ(A)+RNAにリボソームをロードする工程、及び c) オリゴ(dT)プライマー及びポリメラーゼを用いて該
ロードされたポリ(A)+RNAに対して逆転写を実施する工
程、を含む工程により構築される、隣接するmRNAコード
配列から単離され分離された3’UTR配列に対応するcDNA
配列から本質的に構成されるcDNAライブラリーであるこ
とを特徴とする。
【００３３】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（９）cDNA配列が該配列を発現することができるベ
クター系にクローニングされている、上記(7)又は(8)記
載のcDNAライブラリーであることを特徴とする。
は、（９）cDNA配列が該配列を発現することができるベ
クター系にクローニングされている、上記(7)又は(8)記
載のcDNAライブラリーであることを特徴とする。
【００３４】また、本発明に係るライブラリーにおいて
は、（１０）UTR配列が完全な形態で単離されている、
上記(1)、(2)、(4)、(7)、又は(8)記載のcDNAライブラ
リーであることを特徴とする。
は、（１０）UTR配列が完全な形態で単離されている、
上記(1)、(2)、(4)、(7)、又は(8)記載のcDNAライブラ
リーであることを特徴とする。
【００３５】また、本発明に係るベクターにおいては、
（１１）a) プロモーターと機能的に結合した、上記
(1)、(2)、(4)、(7)、又は(8)記載のcDNAライブラリー
に由来する、mRNA UTR配列をコードするヌクレオチド配
列、 b) 該UTRをコードするヌクレオチド配列の上流又は下流
に転写のため位置する第一レポーター遺伝子、及び c) プロモーターと機能的に結合しているが、該UTRをコ
ードするヌクレオチド配列とは関連していない、第二の
異なるレポーター遺伝子を含むベクターであることを特
徴とする。
（１１）a) プロモーターと機能的に結合した、上記
(1)、(2)、(4)、(7)、又は(8)記載のcDNAライブラリー
に由来する、mRNA UTR配列をコードするヌクレオチド配
列、 b) 該UTRをコードするヌクレオチド配列の上流又は下流
に転写のため位置する第一レポーター遺伝子、及び c) プロモーターと機能的に結合しているが、該UTRをコ
ードするヌクレオチド配列とは関連していない、第二の
異なるレポーター遺伝子を含むベクターであることを特
徴とする。
【００３６】また、本発明に係るベクターにおいては、
（１２）レポーター遺伝子が蛍光タンパク質又は細胞表
面マーカー・タンパク質をコードする、上記(11)記載の
ベクターであることを特徴とする。
（１２）レポーター遺伝子が蛍光タンパク質又は細胞表
面マーカー・タンパク質をコードする、上記(11)記載の
ベクターであることを特徴とする。
【００３７】また、本発明に係る方法においては、（１
３）a) 宿主細胞が異なるUTR配列で形質転換されるよ
う、複数の宿主細胞を、上記(11)記載の複数のベクター
で形質転換する工程、 b) 第一レポーター遺伝子と第二レポーター遺伝子との
発現の比率に基づき細胞を分取する工程、 c) 工程(a)の細胞集団全体と比較して、又は第一及び第
二レポーター遺伝子をコードするが対応するUTR配列を
欠如したベクターで形質転換された細胞と比較して、非
対称な発現比率を有する工程(a)の細胞を同定する工
程、並びに d) 該同定された細胞において発現したUTRを配列決定す
る工程を含む、調節UTR配列を同定する方法であること
を特徴とする。
３）a) 宿主細胞が異なるUTR配列で形質転換されるよ
う、複数の宿主細胞を、上記(11)記載の複数のベクター
で形質転換する工程、 b) 第一レポーター遺伝子と第二レポーター遺伝子との
発現の比率に基づき細胞を分取する工程、 c) 工程(a)の細胞集団全体と比較して、又は第一及び第
二レポーター遺伝子をコードするが対応するUTR配列を
欠如したベクターで形質転換された細胞と比較して、非
対称な発現比率を有する工程(a)の細胞を同定する工
程、並びに d) 該同定された細胞において発現したUTRを配列決定す
る工程を含む、調節UTR配列を同定する方法であること
を特徴とする。
【００３８】また、本発明に係る方法においては、（１
４）遺伝子発現が蛍光放出により検出される、上記(13)
記載の方法であることを特徴とする。
４）遺伝子発現が蛍光放出により検出される、上記(13)
記載の方法であることを特徴とする。
【００３９】また、本発明に係る方法においては、（１
５）細胞が蛍光標示式細胞分取器により分取される、上
記(14)記載の方法であることを特徴とする。
５）細胞が蛍光標示式細胞分取器により分取される、上
記(14)記載の方法であることを特徴とする。
【００４０】また、本発明に係る細胞においては、（１
６）上記(11)記載のベクターで形質転換された細胞であ
ることを特徴とする。
６）上記(11)記載のベクターで形質転換された細胞であ
ることを特徴とする。
【００４１】
【発明の実施の形態】本発明の実施は、当業者に既知の
生化学、分子生物学、微生物学、及び関連領域における
通常の技法を使用する。これらの技法は、文献において
十分に説明されている（例えば、Maniatis et al.,Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press(1982);Sambrook et al.,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press(1989);及びAusubel,et al.,Cur
rent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & S
ons(1987-1996版)を参照のこと）。
生化学、分子生物学、微生物学、及び関連領域における
通常の技法を使用する。これらの技法は、文献において
十分に説明されている（例えば、Maniatis et al.,Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press(1982);Sambrook et al.,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press(1989);及びAusubel,et al.,Cur
rent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & S
ons(1987-1996版)を参照のこと）。
【００４２】UTRライブラリーの構築 標準的なプロトコルに従い、全細胞RNAからポリ(A)+RNA
が単離される（Aviv and Leder,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 69:1408-12,1972）。
が単離される（Aviv and Leder,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 69:1408-12,1972）。
【００４３】5'UTR偏向ライブラリーを構築するために
は、ポリ(A)+RNAに対して、調節された非ランダムな酵
素消化を行った後、サイズ選択を行う。ポリ(A)+RNAの
酵素消化は、例えば、7量体オリゴデオキシヌクレオチ
ド混合物の存在下で、大腸菌RNaseHを用いて実施され
る。混合物中のオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、
あらゆる既知の脊椎動物mRNA配列におけるmRNAの-3位と
+4位の間のA、C、G、及びUの存在頻度と相補的な存在頻
度で、A、C、G、及びTを有する（ここで、オリゴデオキ
シヌクレオチドの1位はmRNAの+4位と相補的であり、7位
はmRNAの-3位と相補的である；表1を参照のこと）。
は、ポリ(A)+RNAに対して、調節された非ランダムな酵
素消化を行った後、サイズ選択を行う。ポリ(A)+RNAの
酵素消化は、例えば、7量体オリゴデオキシヌクレオチ
ド混合物の存在下で、大腸菌RNaseHを用いて実施され
る。混合物中のオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、
あらゆる既知の脊椎動物mRNA配列におけるmRNAの-3位と
+4位の間のA、C、G、及びUの存在頻度と相補的な存在頻
度で、A、C、G、及びTを有する（ここで、オリゴデオキ
シヌクレオチドの1位はmRNAの+4位と相補的であり、7位
はmRNAの-3位と相補的である；表1を参照のこと）。
【表１】 5'UTRの単離のための縮重オリゴヌクレオチ
ドの設計
ドの設計
【００４４】大腸菌RNaseHが基質としてDNA/RNA二重鎖
領域を認識するために4個の連続塩基対のハイブリダイ
ゼーションを必要とするのであれば（Donis-Keller,Nuc
l.Acids Res.7:179-192,1979）、前記のオリゴデオキシ
ヌクレオチドを用いた調節されたRNaseH消化は、主に開
始コドンを加水分解するであろうが、オリゴデオキシヌ
クレオチド混合物の縮重、及び生理学的条件下で必要と
される最少の連続塩基対数のため、RNaseHは5'UTR内の
領域を含む多くのその他の位置でRNAを加水分解するこ
とができる。消化を開始コドンにさらに制限するため、
RNaseH認識が5個より多い塩基対のハイブリダイゼーシ
ョンを必要とするよう、条件を修飾することができる
（実施例1を参照のこと）。AUG配列が5'UTR配列内に存
在ことは稀である（Kozak,Nucl.Acids Res.15:8125-48,
1987）。従って、このRNaseH消化により、相接するコー
ド配列から分離された完全な全長5'UTR配列が優先的に
生じると考えられる。
領域を認識するために4個の連続塩基対のハイブリダイ
ゼーションを必要とするのであれば（Donis-Keller,Nuc
l.Acids Res.7:179-192,1979）、前記のオリゴデオキシ
ヌクレオチドを用いた調節されたRNaseH消化は、主に開
始コドンを加水分解するであろうが、オリゴデオキシヌ
クレオチド混合物の縮重、及び生理学的条件下で必要と
される最少の連続塩基対数のため、RNaseHは5'UTR内の
領域を含む多くのその他の位置でRNAを加水分解するこ
とができる。消化を開始コドンにさらに制限するため、
RNaseH認識が5個より多い塩基対のハイブリダイゼーシ
ョンを必要とするよう、条件を修飾することができる
（実施例1を参照のこと）。AUG配列が5'UTR配列内に存
在ことは稀である（Kozak,Nucl.Acids Res.15:8125-48,
1987）。従って、このRNaseH消化により、相接するコー
ド配列から分離された完全な全長5'UTR配列が優先的に
生じると考えられる。
【００４５】mRNA試料中の5'UTR含有断片の集団を濃縮
するため、変性アガロースゲルを用いて、1000ヌクレオ
チドまでの断片が選択される。ほとんどの脊椎動物mRNA
の5'UTRは、20〜100ヌクレオチドの範囲内の大きさであ
る（Kozak、前記）。サイズ選択に続き、mRNA試料を、m
RNA5'キャップ構造と相互作用する組換えeIF4E融合タン
パク質を用いたアフィニティ精製にかける（Sonenberg
and Gingras,Curr.Opin.Cell Biol.10:268-75,1998）。
するため、変性アガロースゲルを用いて、1000ヌクレオ
チドまでの断片が選択される。ほとんどの脊椎動物mRNA
の5'UTRは、20〜100ヌクレオチドの範囲内の大きさであ
る（Kozak、前記）。サイズ選択に続き、mRNA試料を、m
RNA5'キャップ構造と相互作用する組換えeIF4E融合タン
パク質を用いたアフィニティ精製にかける（Sonenberg
and Gingras,Curr.Opin.Cell Biol.10:268-75,1998）。
【００４６】精製されたポリ(A)+RNAから5'UTRを単離す
るための別の方法は、開始コドン周辺の開始コドンを含
む領域に優先的にハイブリダイズする縮重（即ち、混合
配列）プライマーを用いて、ポリ(A)+RNAを逆転写する
ことである。
るための別の方法は、開始コドン周辺の開始コドンを含
む領域に優先的にハイブリダイズする縮重（即ち、混合
配列）プライマーを用いて、ポリ(A)+RNAを逆転写する
ことである。
【００４７】脊椎動物mRNAの開始コドン周辺のコンセン
サス配列は、GCC(G/A)CCAUGG（配列番号：1）である。
ここで、下線付きの配列が開始コドンであり、括弧内の
ヌクレオチドはその位置にほぼ等しい頻度で見出され
る。
サス配列は、GCC(G/A)CCAUGG（配列番号：1）である。
ここで、下線付きの配列が開始コドンであり、括弧内の
ヌクレオチドはその位置にほぼ等しい頻度で見出され
る。
【００４８】プライマー混合物が開始コドン領域に特異
的にハイブリダイズする確率が高くなるよう、各位置に
おけるヌクレオチドの頻度の全ての変動を考慮した、こ
のコンセンサス配列と相補的な縮重プライマーを設計す
ることができる。以下の表2は、数百の脊椎動物mRNAの
既知の配列に基づき、プライマーが設計されうることを
示す。
的にハイブリダイズする確率が高くなるよう、各位置に
おけるヌクレオチドの頻度の全ての変動を考慮した、こ
のコンセンサス配列と相補的な縮重プライマーを設計す
ることができる。以下の表2は、数百の脊椎動物mRNAの
既知の配列に基づき、プライマーが設計されうることを
示す。
【表２】 5'UTRの単離のための縮重プライマーの設計 Kozak,Nucl.Acids Res.15:8125-48,1987及びKozak,Gene
234:187-208,1999に基づくデータ
234:187-208,1999に基づくデータ
【００４９】表2を参照すると、5'から3'へ解読する混
合配列プライマーは、開始コドン周辺のmRNA配列と相補
的である。最上段の+4から-6までの番号付けは、mRNA配
列の番号付けに対応しており、+1位は開始コドンの最初
のヌクレオチドであり、マイナスの数字は全て5'UTR内
のヌクレオチドをさす。パーセンテージは、特定の位置
における特定のヌクレオチドの存在頻度をさす。従っ
て、プライマーは、例えば5位においては、Aが10％、C
が20％、Gが55％、Tが15％の確率で存在する。2位、3
位、及び4位は、開始コドンAUGと相補的であるため不変
であることに注意されたい。上記の組成の縮重プライマ
ーは、開始コドン周辺の開始コドンを含むmRNA領域に優
先的にハイブリダイズすると予想される。
合配列プライマーは、開始コドン周辺のmRNA配列と相補
的である。最上段の+4から-6までの番号付けは、mRNA配
列の番号付けに対応しており、+1位は開始コドンの最初
のヌクレオチドであり、マイナスの数字は全て5'UTR内
のヌクレオチドをさす。パーセンテージは、特定の位置
における特定のヌクレオチドの存在頻度をさす。従っ
て、プライマーは、例えば5位においては、Aが10％、C
が20％、Gが55％、Tが15％の確率で存在する。2位、3
位、及び4位は、開始コドンAUGと相補的であるため不変
であることに注意されたい。上記の組成の縮重プライマ
ーは、開始コドン周辺の開始コドンを含むmRNA領域に優
先的にハイブリダイズすると予想される。
【００５０】mRNAにハイブリダイズしたマイナス鎖cDNA
を作製するためのRT-PCRの後、複合体のアフィニティ精
製によりヘテロ二重鎖を単離することができる。全長5'
UTRを含むRNAを濃縮するため、mRNA/cDNAハイブリッド
は、5'キャップに対するモノクローナル抗体又はキャッ
プ結合タンパク質、例えば固体マトリックスに付着した
eIF4Eタンパク質と共にインキュベートされ、洗浄さ
れ、溶離される。複合体の溶離の後、RNAがRNaseHで消
化され、ポリd(T)でcDNAの3'末端を標識するためターミ
ナルトランスフェラーゼが用いられる。次に、cDNAの第
二鎖の合成をプライムするためポリd(A)が用いられる。
次に、5'UTR濃縮ライブラリーがレポーター遺伝子の5'
側にクローニングされる。
を作製するためのRT-PCRの後、複合体のアフィニティ精
製によりヘテロ二重鎖を単離することができる。全長5'
UTRを含むRNAを濃縮するため、mRNA/cDNAハイブリッド
は、5'キャップに対するモノクローナル抗体又はキャッ
プ結合タンパク質、例えば固体マトリックスに付着した
eIF4Eタンパク質と共にインキュベートされ、洗浄さ
れ、溶離される。複合体の溶離の後、RNAがRNaseHで消
化され、ポリd(T)でcDNAの3'末端を標識するためターミ
ナルトランスフェラーゼが用いられる。次に、cDNAの第
二鎖の合成をプライムするためポリd(A)が用いられる。
次に、5'UTR濃縮ライブラリーがレポーター遺伝子の5'
側にクローニングされる。
【００５１】3'UTR偏向ライブラリーを構築するために
は、例えば、ランダム・プライマー及び大腸菌RNaseHを
用いてポリ(A)+RNAを消化した後、オリゴ(dT)連結樹脂
を用いてポリ(A)含有断片の選択を行う。単離されたポ
リ(A)含有断片が、オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転
写酵素と共にインキュベートされる。又は、排他的に3'
UTRであるmRNAを回収するため、単離されたRNAを、例え
ばウサギ網状赤血球からの溶解物中のリボソームと会合
させる。シクロヘキシミドによりリボソームのランオフ
が阻害されている条件下で、オリゴ(dT)及び低効率ポリ
メラーゼの存在下で、逆転写が実施される（実施例2を
参照のこと）。
は、例えば、ランダム・プライマー及び大腸菌RNaseHを
用いてポリ(A)+RNAを消化した後、オリゴ(dT)連結樹脂
を用いてポリ(A)含有断片の選択を行う。単離されたポ
リ(A)含有断片が、オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転
写酵素と共にインキュベートされる。又は、排他的に3'
UTRであるmRNAを回収するため、単離されたRNAを、例え
ばウサギ網状赤血球からの溶解物中のリボソームと会合
させる。シクロヘキシミドによりリボソームのランオフ
が阻害されている条件下で、オリゴ(dT)及び低効率ポリ
メラーゼの存在下で、逆転写が実施される（実施例2を
参照のこと）。
【００５２】二本鎖cDNAを得るため、精製された5'及び
3'のUTR RNA断片を、5'RACE（cDNA末端の迅速な増幅）
にかける（Frohman,In:PCR Protocols:A Guide to Meth
odsand Application,28-38頁,Innis et al.編,Academic
Press,London）。次に、5'及び3'のUTR cDNAを、選択
された発現ベクター、例えばレトロウイルス・ベクター
にライゲートする。5'及び3'のUTR配列は、レポーター
遺伝子のコード配列のそれぞれ上流又は下流に位置す
る。
3'のUTR RNA断片を、5'RACE（cDNA末端の迅速な増幅）
にかける（Frohman,In:PCR Protocols:A Guide to Meth
odsand Application,28-38頁,Innis et al.編,Academic
Press,London）。次に、5'及び3'のUTR cDNAを、選択
された発現ベクター、例えばレトロウイルス・ベクター
にライゲートする。5'及び3'のUTR配列は、レポーター
遺伝子のコード配列のそれぞれ上流又は下流に位置す
る。
【００５３】スクリーニング解析 宿主細胞の形質転換に用いられる発現ベクターは、UTR
関連第一レポーター遺伝子と連結したUTR、プロモータ
ーと機能的に連結したUTRをそれぞれ一つコードする。
ベクターは、プロモーターと機能的に連結しているが、
UTRとは関連していない第二の異なるレポーター遺伝子
も含む。このUTRとは無関係の第二レポーター遺伝子の
発現は、いずれのUTR効果によっても制御されない。従
って、この第二レポーター遺伝子の発現は、プラスミド
数又は転写効率の変動から生じる発現の差異を調節す
る。さらに、異なるベクターの数を減少させ、従って各
細胞に導入されるUTRの数を減少させるため、条件を変
動させることができる。宿主細胞の形質転換を実施する
ため、形質転換を、好ましくは細胞1個当たり5プラスミ
ド未満に、最も好ましくは細胞1個当たり1プラスミドに
限定するための条件が採用される。通常、ほぼクローン
性のベクターの細胞への輸送を可能にする条件を同定す
ることが好ましい。レトロウイルス形質導入法のため、
各細胞が約1個のウイルスに感染するような感染多重度
（MOI）で細胞を感染させる。MOIは、それぞれの細胞系
及び構築物毎に経験的に決定されうる。又は、プラスミ
ドはプロトプラスト融合を介して細胞に輸送されうる
（Tan and Frankel,Proc.Natl.Acad.Sci.95:4247-52,19
98）。この方法のため、大腸菌がプラスミド・ライブラ
リーで形質転換され、細菌細胞壁が除去され、得られた
プロトプラストがポリエチレングリコールで哺乳動物細
胞と融合させられる。プロトプラストと哺乳動物細胞と
の比率を調整することにより、プラスミド輸送がほぼク
ローン性となり、個々の細胞が単一のプラスミドの1000
コピーを含むことが報告されている。
関連第一レポーター遺伝子と連結したUTR、プロモータ
ーと機能的に連結したUTRをそれぞれ一つコードする。
ベクターは、プロモーターと機能的に連結しているが、
UTRとは関連していない第二の異なるレポーター遺伝子
も含む。このUTRとは無関係の第二レポーター遺伝子の
発現は、いずれのUTR効果によっても制御されない。従
って、この第二レポーター遺伝子の発現は、プラスミド
数又は転写効率の変動から生じる発現の差異を調節す
る。さらに、異なるベクターの数を減少させ、従って各
細胞に導入されるUTRの数を減少させるため、条件を変
動させることができる。宿主細胞の形質転換を実施する
ため、形質転換を、好ましくは細胞1個当たり5プラスミ
ド未満に、最も好ましくは細胞1個当たり1プラスミドに
限定するための条件が採用される。通常、ほぼクローン
性のベクターの細胞への輸送を可能にする条件を同定す
ることが好ましい。レトロウイルス形質導入法のため、
各細胞が約1個のウイルスに感染するような感染多重度
（MOI）で細胞を感染させる。MOIは、それぞれの細胞系
及び構築物毎に経験的に決定されうる。又は、プラスミ
ドはプロトプラスト融合を介して細胞に輸送されうる
（Tan and Frankel,Proc.Natl.Acad.Sci.95:4247-52,19
98）。この方法のため、大腸菌がプラスミド・ライブラ
リーで形質転換され、細菌細胞壁が除去され、得られた
プロトプラストがポリエチレングリコールで哺乳動物細
胞と融合させられる。プロトプラストと哺乳動物細胞と
の比率を調整することにより、プラスミド輸送がほぼク
ローン性となり、個々の細胞が単一のプラスミドの1000
コピーを含むことが報告されている。
【００５４】用いられる細胞型の選択は、いくつかの要
因、例えば目的の生物学的系及び外来DNA形質転換の容
易性によると考えられる。従って、目的の生物学的系が
乳癌関連遺伝子である場合、乳癌細胞系が用いられう
る。さらに、レトロウイルス形質導入がいくつかの細胞
系における唯一の効率のよい形質転換手段であるなら
ば、他の形質転換手段が望ましい場合、これらの細胞の
使用は好ましくないと考えられる。
因、例えば目的の生物学的系及び外来DNA形質転換の容
易性によると考えられる。従って、目的の生物学的系が
乳癌関連遺伝子である場合、乳癌細胞系が用いられう
る。さらに、レトロウイルス形質導入がいくつかの細胞
系における唯一の効率のよい形質転換手段であるなら
ば、他の形質転換手段が望ましい場合、これらの細胞の
使用は好ましくないと考えられる。
【００５５】UTR関連レポーター遺伝子の発現が、非UTR
関連第二レポーター遺伝子の発現と比較される。この発
現比率におけるすべての不均衡が、mRNAの翻訳、エクス
ポート、又は安定性のUTRにより媒介される変化を反映
しうる。発現を検出するため、及び発現を変動させるUT
Rを同定するための多くの可能性のあるスキームが利用
可能である。特に良好に適合する系は、有色生成物又は
さもなければゲル電気泳動、蛍光、化学発光、又は抗体
結合の検出により決定される検出可能な生成物を生成さ
せる系である。例えば、そのようなUTRを発現する細胞
は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）及びレポーター遺伝
子としてのグリーン・フルオレセント・プロテイン（GF
P）を用いて同定され単離されうる（Bierhuizen et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Commun.234:371-375,1997;Gri
gnani et al.,Cancer Res.58:14-19,1998;de Martin et
al.,Gene Ther.4:493-495,1997;Foster et al.,J.Vio
l.Methods 75:151-60,1998）。そのような系は、ハイス
ループット・スクリーニングにとって有利である。遺伝
子発現を追跡するために用いられ得るその他の系は、蛍
光原性基質とカップリングされた、大腸菌lacZによりコ
ードされるβ−ガラクトシダーゼ活性の検出（Flering
et al.,Cytometry 12:291-301,1991）、及び蛍光標識抗
体による外来細胞表面抗原の発現の検出（Planelles et
al.,Gene Ther.2:369-76,1995）である。
関連第二レポーター遺伝子の発現と比較される。この発
現比率におけるすべての不均衡が、mRNAの翻訳、エクス
ポート、又は安定性のUTRにより媒介される変化を反映
しうる。発現を検出するため、及び発現を変動させるUT
Rを同定するための多くの可能性のあるスキームが利用
可能である。特に良好に適合する系は、有色生成物又は
さもなければゲル電気泳動、蛍光、化学発光、又は抗体
結合の検出により決定される検出可能な生成物を生成さ
せる系である。例えば、そのようなUTRを発現する細胞
は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）及びレポーター遺伝
子としてのグリーン・フルオレセント・プロテイン（GF
P）を用いて同定され単離されうる（Bierhuizen et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Commun.234:371-375,1997;Gri
gnani et al.,Cancer Res.58:14-19,1998;de Martin et
al.,Gene Ther.4:493-495,1997;Foster et al.,J.Vio
l.Methods 75:151-60,1998）。そのような系は、ハイス
ループット・スクリーニングにとって有利である。遺伝
子発現を追跡するために用いられ得るその他の系は、蛍
光原性基質とカップリングされた、大腸菌lacZによりコ
ードされるβ−ガラクトシダーゼ活性の検出（Flering
et al.,Cytometry 12:291-301,1991）、及び蛍光標識抗
体による外来細胞表面抗原の発現の検出（Planelles et
al.,Gene Ther.2:369-76,1995）である。
【００５６】蛍光による検出の場合、UTR関連第一レポ
ーター遺伝子及び非UTR関連第二レポーター遺伝子の発
現を追跡するために用いられるフルオロフォアの放出ス
ペクトルは、例えばFACS装置が二色分析を実施し、2つ
のレポーター遺伝子の発現の相関に基づき細胞を分取す
ることができるよう、充分に異なっていなければならな
い。形質転換された細胞集団は、以下のような4つの異
なる発現パターンからなると考えられる。1）形質転換
の失敗を示す、両方の遺伝子マーカーが陰性の細胞、
2）UTRが遺伝子発現に対する効果を有しないことを示
す、UTR連結遺伝子及び対照遺伝子の発現の間のレシオ
メトリック（ratiometric）な関係を有する細胞、3）UT
Rが翻訳効率又はmRNA安定性を増強することを示す、UTR
連結遺伝子の不釣り合いに高い発現を有する細胞、4）U
TRが翻訳効率又はmRNA安定性を減少させることを示す、
不釣り合いに低いUTR連結遺伝子発現を有する細胞。
ーター遺伝子及び非UTR関連第二レポーター遺伝子の発
現を追跡するために用いられるフルオロフォアの放出ス
ペクトルは、例えばFACS装置が二色分析を実施し、2つ
のレポーター遺伝子の発現の相関に基づき細胞を分取す
ることができるよう、充分に異なっていなければならな
い。形質転換された細胞集団は、以下のような4つの異
なる発現パターンからなると考えられる。1）形質転換
の失敗を示す、両方の遺伝子マーカーが陰性の細胞、
2）UTRが遺伝子発現に対する効果を有しないことを示
す、UTR連結遺伝子及び対照遺伝子の発現の間のレシオ
メトリック（ratiometric）な関係を有する細胞、3）UT
Rが翻訳効率又はmRNA安定性を増強することを示す、UTR
連結遺伝子の不釣り合いに高い発現を有する細胞、4）U
TRが翻訳効率又はmRNA安定性を減少させることを示す、
不釣り合いに低いUTR連結遺伝子発現を有する細胞。
【００５７】FACS分取の後、非対称な蛍光シグナルを有
する細胞を、さらなる分析のため収集することができ
る。発現を変化させるUTRの配列が、例えばベクター・
プライマーを用いたPCR又はプラスミド・レスキューを
用いて決定されうる。一方の蛍光色読み出し（readou
t）は、非UTR連結第二レポーター遺伝子の発現レベルに
依存し、他方の色はUTR連結遺伝子の発現レベルに依存
する。FACS装置は、両方の色の発現レベルを同時に決定
し、それぞれの個別の細胞に関する2つのレベルを互い
に対してプロットすることができる。ほとんどのUTRは
遺伝子発現に影響を与えないと予想されるため、形質転
換された細胞の大半は、両方の遺伝子産物を一貫して比
例したレベルで発現することが予想される。この細胞集
団は、二色プロットの特徴的な領域を占めると考えられ
る。この領域外の細胞は、2つのチューブのうちの一方
に自動的に分取される。即ち、一方のチューブには遺伝
子発現を比例してアップレギュレートするUTR連結遺伝
子、もう一方には遺伝子発現をダウンレギュレートする
UTR連結遺伝子が分取される。
する細胞を、さらなる分析のため収集することができ
る。発現を変化させるUTRの配列が、例えばベクター・
プライマーを用いたPCR又はプラスミド・レスキューを
用いて決定されうる。一方の蛍光色読み出し（readou
t）は、非UTR連結第二レポーター遺伝子の発現レベルに
依存し、他方の色はUTR連結遺伝子の発現レベルに依存
する。FACS装置は、両方の色の発現レベルを同時に決定
し、それぞれの個別の細胞に関する2つのレベルを互い
に対してプロットすることができる。ほとんどのUTRは
遺伝子発現に影響を与えないと予想されるため、形質転
換された細胞の大半は、両方の遺伝子産物を一貫して比
例したレベルで発現することが予想される。この細胞集
団は、二色プロットの特徴的な領域を占めると考えられ
る。この領域外の細胞は、2つのチューブのうちの一方
に自動的に分取される。即ち、一方のチューブには遺伝
子発現を比例してアップレギュレートするUTR連結遺伝
子、もう一方には遺伝子発現をダウンレギュレートする
UTR連結遺伝子が分取される。
【００５８】5'及び3'のUTR制御因子の機能に影響を与
える化合物をスクリーニングし同定するため、類似の方
法が用いられ得る。遺伝子発現に対するUTRの効果をモ
デュレートする化合物は、化合物の非存在下での遺伝子
発現と比較してUTR連結遺伝子の発現を非対称にさせる
と考えられる。
える化合物をスクリーニングし同定するため、類似の方
法が用いられ得る。遺伝子発現に対するUTRの効果をモ
デュレートする化合物は、化合物の非存在下での遺伝子
発現と比較してUTR連結遺伝子の発現を非対称にさせる
と考えられる。
【００５９】
【実施例】実施例1：mRNAの選択的なRNaseH消化 mRNAのオリゴデオキシヌクレオチド・プローブとのハイ
ブリダイゼーションが5個又は6個より多い連続ヌクレオ
チドを包含しない限り、RNaseHによる加水分解が抑制さ
れるような、消化のための条件が採用されうる。これ
は、複数の位置において調節mRNA種にハイブリダイズす
るが、5個以下の連続DNA/RNA塩基対を形成するよう7量
体オリゴデオキシヌクレオチドが設計された実験におい
て証明された。このオリゴデオキシヌクレオチドを用い
た場合には加水分解が起こらなかったが、6個又は7個の
連続塩基対のハイブリダイゼーションを可能にする、部
分的に縮重したオリゴデオキシヌクレオチドNNCATNN
（ここで、NはA、C、G、及びTの等モル混合物である）
を用いた場合には起こった（図1を参照のこと）。10mM
トリスHCl、pH8.0、50mM NaCl中で70℃で10分間、0.2μ
gの調節RNA（プロメガ（Promega）ルシフェラーゼ調節
配列）及び70pmolのオリゴデオキシヌクレオチドを変性
させた後、試料を氷中に浸漬した。RNaseH、MgCl2、及
びDTTを、それぞれ0.4ユニット、5mM、及び1mMの最終濃
度で添加した。試料を20℃で60分間インキュベートし
た。EDTAを最終濃度25mMで添加することにより反応を停
止させ、臭化エチジウムで染色された1％TBE非変性アガ
ロースゲル上で、消化産物を分離し可視化した。
ブリダイゼーションが5個又は6個より多い連続ヌクレオ
チドを包含しない限り、RNaseHによる加水分解が抑制さ
れるような、消化のための条件が採用されうる。これ
は、複数の位置において調節mRNA種にハイブリダイズす
るが、5個以下の連続DNA/RNA塩基対を形成するよう7量
体オリゴデオキシヌクレオチドが設計された実験におい
て証明された。このオリゴデオキシヌクレオチドを用い
た場合には加水分解が起こらなかったが、6個又は7個の
連続塩基対のハイブリダイゼーションを可能にする、部
分的に縮重したオリゴデオキシヌクレオチドNNCATNN
（ここで、NはA、C、G、及びTの等モル混合物である）
を用いた場合には起こった（図1を参照のこと）。10mM
トリスHCl、pH8.0、50mM NaCl中で70℃で10分間、0.2μ
gの調節RNA（プロメガ（Promega）ルシフェラーゼ調節
配列）及び70pmolのオリゴデオキシヌクレオチドを変性
させた後、試料を氷中に浸漬した。RNaseH、MgCl2、及
びDTTを、それぞれ0.4ユニット、5mM、及び1mMの最終濃
度で添加した。試料を20℃で60分間インキュベートし
た。EDTAを最終濃度25mMで添加することにより反応を停
止させ、臭化エチジウムで染色された1％TBE非変性アガ
ロースゲル上で、消化産物を分離し可視化した。
【００６０】RNaseH消化のための条件は、7個の連続DNA
/RNA塩基対が形成しうる単一の部位においてのみ、RNas
eHが触媒するRNAの加水分解を配列特異的オリゴデオキ
シヌクレオチド7量体が媒介するよう調節することもで
きる（図2を参照のこと）。これらの条件は、0.2μgの
調節RNA（プロメガ・ルシフェラーゼ調節配列）及び250
nmolのオリゴデオキシヌクレオチドを、10mM トリスHC
l、pH8.0、50mM NaCl中で70℃で10分間変性させた後、
試料を氷中に浸漬することを含んでいた。前記と同様に
RNaseH、MgCl2、及びDTTを添加し、20℃で60分間インキ
ュベートした後、EDTAを最終濃度25mMで添加することに
より消化を停止させた。臭化エチジウムで染色された6
％ポリアクリルアミド・ゲル上で消化産物を分離し可視
化した。
/RNA塩基対が形成しうる単一の部位においてのみ、RNas
eHが触媒するRNAの加水分解を配列特異的オリゴデオキ
シヌクレオチド7量体が媒介するよう調節することもで
きる（図2を参照のこと）。これらの条件は、0.2μgの
調節RNA（プロメガ・ルシフェラーゼ調節配列）及び250
nmolのオリゴデオキシヌクレオチドを、10mM トリスHC
l、pH8.0、50mM NaCl中で70℃で10分間変性させた後、
試料を氷中に浸漬することを含んでいた。前記と同様に
RNaseH、MgCl2、及びDTTを添加し、20℃で60分間インキ
ュベートした後、EDTAを最終濃度25mMで添加することに
より消化を停止させた。臭化エチジウムで染色された6
％ポリアクリルアミド・ゲル上で消化産物を分離し可視
化した。
【００６１】調節mRNAの代わりに、ポリ(A)+RNAの集団
を用いることができ、図3に示されるように、ポリ(A)+R
NAは縮重オリゴデオキシヌクレオチドを用いて部分的に
加水分解されうる。このように、RNaseHによる加水分解
のため7個未満の連続DNA/RNA塩基対の形成を抑制する条
件下では、ポリ(A)+RNAを用いた反応において、部分的
に縮重したオリゴデオキシヌクレオチドを用いることが
でき、インキュベーション時間を延長した後でも、加水
分解部位の数は依然として限定されうる。
を用いることができ、図3に示されるように、ポリ(A)+R
NAは縮重オリゴデオキシヌクレオチドを用いて部分的に
加水分解されうる。このように、RNaseHによる加水分解
のため7個未満の連続DNA/RNA塩基対の形成を抑制する条
件下では、ポリ(A)+RNAを用いた反応において、部分的
に縮重したオリゴデオキシヌクレオチドを用いることが
でき、インキュベーション時間を延長した後でも、加水
分解部位の数は依然として限定されうる。
【００６２】 実施例2：全長3'UTRを構築するためのリボソームの使用 逆転写及びオリゴ(dT)プライマーを用いて、全長3'UTR
配列をcDNAにコピーすることが可能である。逆転写は、
ポリ(A)領域で開始し、3'UTRの5'末端に向かって上流に
進行する。コード配列終結部位において転写を終結させ
るため、転写酵素の立体障害を引き起こす、活動的に翻
訳するリボソームがmRNAに十分にロードされる。リボソ
ームが終止コドンの下流でmRNAに結合しないなら、逆転
写酵素は、全長3'UTR配列をコピーするため妨害される
ことなく進行するが、その後逆転写酵素の活性は停止
し、任意の上流コード配列から全長3'UTRが効率よく分
離される（図4を参照のこと）。
配列をcDNAにコピーすることが可能である。逆転写は、
ポリ(A)領域で開始し、3'UTRの5'末端に向かって上流に
進行する。コード配列終結部位において転写を終結させ
るため、転写酵素の立体障害を引き起こす、活動的に翻
訳するリボソームがmRNAに十分にロードされる。リボソ
ームが終止コドンの下流でmRNAに結合しないなら、逆転
写酵素は、全長3'UTR配列をコピーするため妨害される
ことなく進行するが、その後逆転写酵素の活性は停止
し、任意の上流コード配列から全長3'UTRが効率よく分
離される（図4を参照のこと）。
【００６３】その他の態様 本明細書に言及された全ての出版物が、参照として本明
細書に組み込まれる。
細書に組み込まれる。
【００６４】
【発明の効果】本発明者らは、RNA制御部位に特に偏向
したライブラリーを構築するための方法を見出した。本
発明は、隣接するmRNAコード配列から分離された異なる
mRNA非翻訳領域（UTR）配列に対応するcDNA配列から本
質的に成るcDNAライブラリーを特徴とし、また、本発明
により、これらのライブラリーを製造するための方法、
及び制御UTR配列を同定するための方法も提供された。
したライブラリーを構築するための方法を見出した。本
発明は、隣接するmRNAコード配列から分離された異なる
mRNA非翻訳領域（UTR）配列に対応するcDNA配列から本
質的に成るcDNAライブラリーを特徴とし、また、本発明
により、これらのライブラリーを製造するための方法、
及び制御UTR配列を同定するための方法も提供された。
SEQUENCE LISTING <110> Giordano, Tony Powers, Gordon D. Eder, Paul S. Burnett, Bonnie S. Temeles, Gretchen L. <120> FUNCTIONAL GENOMIC SCREEN FOR POST-TRANSCRIPTIONAL 5' AND 3' REGULATORY ELEMENTS <130> CE-A0016 <150> US 60/142,217 <151> 1999-07-02 <160> 1 ＜１７０＞ ＦａｓｔＳＥＱ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ
（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Based on vertebrate mRNA <221> variation <222> (4)...(4) <223> n = g or a. <400> 1 gccnccaugg 10
（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Based on vertebrate mRNA <221> variation <222> (4)...(4) <223> n = g or a. <400> 1 gccnccaugg 10
【図１】6個以上の連続塩基対がハイブリダイズしてい
る場合にのみ加水分解を可能にする条件下で、特異的
な、又は部分的に縮重したオリゴデオキシヌクレオチド
7量体を用いた、調節RNA配列のRNaseH消化を示す図であ
る（レーン4と5を比較）。
る場合にのみ加水分解を可能にする条件下で、特異的
な、又は部分的に縮重したオリゴデオキシヌクレオチド
7量体を用いた、調節RNA配列のRNaseH消化を示す図であ
る（レーン4と5を比較）。
【図２】7個の連続塩基対がハイブリダイズしている場
合にのみ加水分解を可能にする条件下で、2つの異なる
配列特異的オリゴデオキシヌクレオチドを用いた、調節
配列のRNaseH消化を示す図である（レーン3を参照）。
合にのみ加水分解を可能にする条件下で、2つの異なる
配列特異的オリゴデオキシヌクレオチドを用いた、調節
配列のRNaseH消化を示す図である（レーン3を参照）。
【図３】7個の連続塩基対がハイブリダイズしている場
合にのみ加水分解を可能にする条件下で、部分的に縮重
したオリゴヌクレオチド7量体を用いた、ポリ(A)+RNAの
RNaseH消化を示す図である。加水分解部位の数は、イン
キュベーションを延長した後でも限定されうる（レーン
6と7を比較）。
合にのみ加水分解を可能にする条件下で、部分的に縮重
したオリゴヌクレオチド7量体を用いた、ポリ(A)+RNAの
RNaseH消化を示す図である。加水分解部位の数は、イン
キュベーションを延長した後でも限定されうる（レーン
6と7を比較）。
【図４】3'UTR配列の限定された逆転写を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/66 1/66 1/68 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ゴードン ディー． パワーズ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 マル バーン ロイド アベニュー ９ (72)発明者 ポール エス． エダー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 オレ ランド ウィッシュマン アベニュー 312 (72)発明者 ボニー−アン バーネット アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 マル バーン ヒッコリー レーン ９ (72)発明者 グレッチェン エル． テメレス アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 アー ドモア メイプルシェイド ロード 2925
Claims (16)
- 【請求項１】 隣接するmRNAコード配列から単離され分
離された異なるmRNA非翻訳領域(UTR)配列に対応する少
なくとも100個の異なるcDNA配列から本質的に構成され
るcDNAライブラリー。 - 【請求項２】 a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工
程、 b) ポリ(A)+RNA中のAUG配列の調節された非ランダムな
酵素消化を実施する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため該消化されたRNA
を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離されたmRNA5’非翻訳領
域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に構成され
るcDNAライブラリー。 - 【請求項３】 酵素消化がRNaseHを用いて実施される、
請求項2記載のcDNAライブラリー。 - 【請求項４】 a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工
程、 b) 開始コドン周辺の開始コドンを含む領域にハイブリ
ダイズする縮重プライマーを用いて、該ポリ(A)+RNAか
ら、該RNAの5’末端配列を含む核酸ヘテロ二重鎖を合成
する工程、 c) 5’末端配列を含む断片を得るため工程(b)において
得られたヘテロ二重鎖を精製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたヘテロ二重鎖か
らcDNAを合成する工程を含む工程により構築される、隣
接するmRNAコード配列から単離され分離されたmRNA5’
非翻訳領域(UTR)配列に対応するcDNA配列から本質的に
構成されるcDNAライブラリー。 - 【請求項５】 5’配列精製が、キャップ結合タンパク
質を用いて実施される、請求項2又は4記載のcDNAライブ
ラリー。 - 【請求項６】 cDNA配列が該配列を発現することができ
るベクター系にクローニングされている、請求項1、2、
又は4記載のcDNAライブラリー。 - 【請求項７】 a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工
程、 b) ポリ(A)+RNAに対してランダムな消化を実施する工
程、 c) 断片を含むポリ(A)を得るため該消化されたRNAを精
製する工程、及び d) 工程(c)において得られた精製されたRNAからcDNAを
合成する工程を含む工程により構築される、隣接するmR
NAコード配列から単離され分離された3’UTR配列に対応
するcDNA配列から本質的に構成されるcDNAライブラリ
ー。 - 【請求項８】 a) 全RNAからポリ(A)+RNAを精製する工
程、 b) ポリ(A)+RNAにリボソームをロードする工程、及び c) オリゴ(dT)プライマー及びポリメラーゼを用いて該
ロードされたポリ(A)+RNAに対して逆転写を実施する工
程、を含む工程により構築される、隣接するmRNAコード
配列から単離され分離された3’UTR配列に対応するcDNA
配列から本質的に構成されるcDNAライブラリー。 - 【請求項９】 cDNA配列が該配列を発現することができ
るベクター系にクローニングされている、請求項7又は8
記載のcDNAライブラリー。 - 【請求項１０】 UTR配列が完全な形態で単離されてい
る、請求項1、2、4、7、又は8記載のcDNAライブラリ
ー。 - 【請求項１１】 a) プロモーターと機能的に結合し
た、請求項1、2、4、7、又は8記載のcDNAライブラリー
に由来する、mRNA UTR配列をコードするヌクレオチド配
列、 b) 該UTRをコードするヌクレオチド配列の上流又は下流
に転写のため位置する第一レポーター遺伝子、及び c) プロモーターと機能的に結合しているが、該UTRをコ
ードするヌクレオチド配列とは関連していない、第二の
異なるレポーター遺伝子を含むベクター。 - 【請求項１２】 レポーター遺伝子が蛍光タンパク質又
は細胞表面マーカー・タンパク質をコードする、請求項
11記載のベクター。 - 【請求項１３】 a) 宿主細胞が異なるUTR配列で形質転
換されるよう、複数の宿主細胞を、請求項11記載の複数
のベクターで形質転換する工程、 b) 第一レポーター遺伝子と第二レポーター遺伝子との
発現の比率に基づき細胞を分取する工程、 c) 工程(a)の細胞集団全体と比較して、又は第一及び第
二レポーター遺伝子をコードするが対応するUTR配列を
欠如したベクターで形質転換された細胞と比較して、非
対称な発現比率を有する工程(a)の細胞を同定する工
程、並びに d) 該同定された細胞において発現したUTRを配列決定す
る工程を含む、調節UTR配列を同定する方法。 - 【請求項１４】 遺伝子発現が蛍光放出により検出され
る、請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】 細胞が蛍光標示式細胞分取器により分
取される、請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項11記載のベクターで形質転換さ
れた細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14221799P | 1999-07-02 | 1999-07-02 | |
| US60/142217 | 1999-07-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046086A true JP2001046086A (ja) | 2001-02-20 |
Family
ID=22499026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000201516A Pending JP2001046086A (ja) | 1999-07-02 | 2000-07-03 | ５’及び３’の転写後制御因子のための機能的ゲノミック・スクリーニング |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6448007B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001046086A (ja) |
| CA (1) | CA2311168A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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