JP2001037483A - Linked glucose dehydrogenase - Google Patents

Linked glucose dehydrogenase

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JP2001037483A JP11216459A JP21645999A JP2001037483A JP 2001037483 A JP2001037483 A JP 2001037483A JP 11216459 A JP11216459 A JP 11216459A JP 21645999 A JP21645999 A JP 21645999A JP 2001037483 A JP2001037483 A JP 2001037483A
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Koji Hayade
広司 早出
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Koji Hayade
広司 早出
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new enzyme which is obtained by linking water-soluble glucose dehydrogenase subunits via a linker peptide, requires pyrrolo-quinoline quinone as a coenzyme, has good thermal stability, and can be used for quantitatively determining glucose and the like. SOLUTION: This is a new enzyme (fused protein) which is obtained by linking two water-soluble glucose dehydrogenase (GDH) subunits via the linker peptide having an amino acid sequence, for example, shown by the formula, requires pyrrolo-quinoline quinone (PQQ) as a coenzyme, has improved thermal stability, and is useful for quantitativery determining glucose in clinical diagnosis, food analysis, and so on. This enzyme is obtained by preparing two fragments by PCR using two pairs of primers so as to contain a desired restriction enzyme site using a natural pyrrolo-quinoline quinone glucose dehydrogenase (PQQGDH) gene derived from Acinetobacter calcoaceticum as a template, followed by incorporating both into a vector to express in a host cell.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするグルコース脱水素酵素(G BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention is glucose dehydrogenase for coenzyme pyrroloquinoline quinone (PQQ) (G
DH)のサブユニットが2つタンデムに連結された連結型ダイマーGDHに関する。 Subunits DH) relates linked linked dimer GDH two tandem. 本発明の連結型PQQGD Linked PQQGD of the present invention
Hは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。 H is the clinical examination, food analysis is useful for the determination of glucose in such.

【0002】 [0002]

【従来の技術】PQQGDHは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。 BACKGROUND ART PQQGDH is a glucose dehydrogenase which pyrroloquinoline quinone as a coenzyme and catalyzes a reaction that oxidizes glucose to produce gluconolactone.

【0003】PQQGDHには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。 [0003] PQQGDH is known that there is a membrane-bound enzyme and a water soluble enzyme. 膜結合性PQQGDH Membrane-bound PQQGDH
は、分子量約87kDaのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。 Is a single peptide protein having a molecular weight of about 87 kDa, are widely found in various Gram-negative bacteria. 一方、水溶性PQQGDHはAcinetobac On the other hand, water-soluble PQQGDH is Acinetobac
ter calcoaceticusのいくつかの株においてその存在が確認されており(Biosci.Bi Its presence in some of the strains of ter calcoaceticus has been confirmed (Biosci.Bi
otech. otech. Biochem. Biochem. (1995),59 (1995), 59
(8),1548−1555)、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている(Mo (8), 1548-1555), the structural gene was cloned amino acid sequence has been elucidated (Mo
l. l. Gen. Gen. Genet. Genet. (1989),217:43 (1989), 217: 43
0−436)。 0-436). A. A. calcoaceticus由来水溶性PQQGDHは、ペリプラズムに局在する、分子量約50kDaの2つの同一のサブユニットからなるホモダイマーである。 calcoaceticus derived water-soluble PQQGDH is localized to the periplasm, it is a homodimer consisting of two identical subunits with a molecular weight of about 50 kDa. PQQGDH活性は、ホモダイマー酵素が形成される場合にのみ発現され、サブユニット単独ではPQQGDH活性を示さないことが報告されている。 PQQGDH activity is expressed only when the homodimeric enzyme is formed, the subunit alone has been reported to show no PQQGDH activity. 水溶性PQQGDHの生理学的役割はまだよく解明されていない。 The physiological role of the water-soluble PQQGDH have not been elucidated yet well.

【0004】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。 [0004] Blood glucose concentration is extremely important indicator on clinical diagnosis as an important marker for diabetes. また、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっている。 Further, determination of the glucose concentration in the fermentation production using microorganisms is an important item in the process monitoring. 従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ(GOD)あるいはグルコース6リン酸脱水素酵素(G Traditionally, glucose glucose oxidase (GOD) or glucose-6-phosphate dehydrogenase (G
6PDH)を用いる酵素法により定量されていた。 It was quantified by an enzymatic method using a 6PDH). しかし、GODを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。 However, the method using GOD had to be added to the assay system a catalase or peroxidase in order to quantify the hydrogen peroxide produced with the glucose oxidation reaction. またGODを用いるバイオセンサーの開発も進められてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存することから高濃度のグルコース試料には適さないこと、 Also it has been advanced development of biosensors using GOD, not suitable for high glucose samples from the reaction depends on the concentration of oxygen dissolved in the aqueous solution,
あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可能性があった。 Or there is a possibility that an error occurs in the measured value by the dissolved oxygen concentration. 一方、G6PDHは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素であるNAD(P)を添加しなければならないという煩雑性があった。 Meanwhile, G6PDH has been utilized in the glucose assay based on spectroscopic techniques, there is troublesomeness that must be added NAD (P) is a coenzyme in the reaction system. そこで、これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてP Therefore, P as a new enzyme to replace the enzyme which have been used for glucose enzyme assay method so far
QQGDHの応用が注目されている。 Application of QQGDH has been attracting attention. PQQGDHはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびPQQGDHは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。 PQQGDH is to have a high oxidation activity for glucose, and PQQGDH is because it does not require oxygen as an electron acceptor for an enzyme of the coenzyme-linked, including the recognition element of a glucose sensor, the assay application to the field is expected. しかしながら、PQQGDHはG However, PQQGDH is G
ODと比較して熱安定性が低いという問題点があった。 Thermal stability is disadvantageously low compared with OD.

【0005】 [0005]

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は、改良された熱安定性を有する改変型水溶性PQQG [SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, the present invention provides modified soluble PQQG having improved thermal stability
DHを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a DH.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】本発明者は、2つの水溶性PQQGDHのサブユニットをタンデムに連結した融合蛋白質を形成することにより、酵素のホモダイマー構造を安定化しうることを見いだして、本発明を完成した。 Means for Solving the Problems The present inventors have, by forming the subunits of two water-soluble PQQGDH were linked in tandem fusion protein, and found that may stabilize the homodimeric structure of the enzyme, the present invention It was completed.

【0007】すなわち、本発明は、リンカーペプチドを介して連結された2つの水溶性PQQGDHのサブユニットを含有する融合蛋白質を提供する。 Accordingly, the present invention provides a fusion protein containing a subunit of the two water-soluble PQQGDH linked via a linker peptide. 好ましくは、該リンカーペプチドは5アミノ酸以上の長さである。 Preferably, the linker peptide is more than 5 amino acids long.

【0008】本発明はまた、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体、および該遺伝子が主染色体に組み込まれた生物を提供する。 [0008] The present invention also genes encoding the fusion proteins of the present invention, as well as vectors and transformants containing the gene, and the gene to provide a built-in organisms in the main chromosome. 本発明はまた、本発明の融合蛋白質を含むグルコースアッセイキット、ならびにグルコースセンサーを提供する。 The present invention is also a glucose assay kit comprising the fusion protein of the present invention, as well as a glucose sensor.

【0009】本発明の連結型PQQGDHは、高い熱安定性を有することから、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーにおいて用いるのに有用である。 [0009] connecting PQQGDH of the present invention has a high thermal stability and are useful for use in glucose assay kit and glucose sensor.

【0010】 [0010]

【発明の実施の形態】 連結型GDHの構造本発明の連結型GDHは、2つの水溶性PQQGDHのサブユニットがタンデムに連結された構造を有する融合蛋白質である。 Linked GDH structure present invention DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION linked GDH are subunits of the two water-soluble PQQGDH is a fusion protein having a connecting structure in tandem. 本発明に従う連結型GDHは、改良された熱安定性を有する。 Linked GDH according to the invention have improved thermal stability.

【0011】天然の水溶性PQQGDHは、2つのサブユニットからなるホモダイマー構造を有する。 [0011] Natural water-soluble PQQGDH has a homodimeric structure composed of two subunits. 本発明者は現在のところ、本発明の連結型GDHの増加した熱安定性は、この2つのサブユニットが融合蛋白質として発現されることにより、ダイマーの高次構造が安定化されたためであると考えている。 The present inventors have currently increased thermal stability of the connection type GDH of the present invention, by the two subunits are expressed as a fusion protein, if it is high-order structure of the dimer is stabilized thinking.

【0012】本発明の連結型GDHにおいては、2つのサブユニットはインフレームで融合されたリンカーを介してタンデムに連結されている。 [0012] In connection type GDH of the present invention, the two subunits are tandemly linked through a linker fused in frame. 好ましくは、該リンカーペプチドは5アミノ酸以上の長さである。 Preferably, the linker peptide is more than 5 amino acids in length. より好ましくは10アミノ酸以上、さらに好ましくは13アミノ酸以上の長さである。 More preferably 10 amino acids or more, still more preferably at least 13 amino acids long. リンカー領域は、2つのサブユニットが正しいコンフォメーションで結合するためにある程度の長さを有することが必要であると考えられる。 Linker region is considered to two subunits are bound in the correct conformation are required to have a certain length. リンカーペプチドの長さの上限としては特に制限はないが、 There is no particular restriction on the upper limit of the length of the linker peptide,
本発明の連結型GDHの酵素活性または細胞内局在化に有害な配列を有するものであってはならない。 Be one having a deleterious sequences for enzymatic activity or cellular localization of linked GDH of the present invention should not.

【0013】また好ましくは、リンカー領域のアミノ酸配列は蛋白質加水分解を受けやすいことが知られている部分配列を含まないように設計すべきである。 [0013] Also preferably, the amino acid sequence of the linker region should be designed so as not to include a partial sequence known to be susceptible to proteolysis. 各サブユニットにおいては、アミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。 In each subunit may be a part of the amino acid residues are deleted or substituted, or may be added other amino acid residues. 特定の領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、酵素の熱安定性や基質に対する親和性を改良することができる(たとえば、特開平10−243786、特願平11−101143、特願平11−124285を参照)。 By substituting amino acid residues in the specific region with another amino acid residue, it is possible to improve the affinity for thermal stability and substrate for the enzyme (e.g., JP-A 10-243786, Japanese Patent Application No. 11-101143 , referring to the Japanese Patent Application No. 11-124285). これらの欠失、置換または付加は、サブユニットの一方または両方に導入することができ、これらの改変されたサブユニットが連結された連結型PQQGDHも本発明の範囲内である。 These deletions, substitutions or additions can be introduced in one or both of the subunits, linked PQQGDH these altered subunits are linked also within the scope of the present invention.

【0014】好ましくは、水溶性PQQGDHのサブユニットはAcinetobacter calcoac [0014] Preferably, the subunit of the water-soluble PQQGDH is Acinetobacter Calcoac
eticus由来の水溶性PQQGDHである。 eticus is a water-soluble PQQGDH of origin. 当業者は、他の細菌に由来する水溶性PQQGDHについても、本発明の教示にしたがってサブユニットを連結して発現させることにより、本発明の融合蛋白質を得ることができる。 Those skilled in the art, for the water-soluble PQQGDH derived from other bacteria, by expressing linked subunits in accordance with the teachings of the present invention, it is possible to obtain a fusion protein of the present invention. これらの連結型PQQGDHも本発明の範囲内である。 These linked PQQGDH also within the scope of the present invention. 連結型GDHの製造方法図1は、本発明の連結型GDHの概要およびこれをコードするベクターの構築方法を示す。 Production process Figure 1 of the connection type GDH is shows construction of the vector to overview and encoding the same of the linked GDH of the present invention. 本発明の連結型GD Linked GD of the present invention
Hは、PQQGDHの2つのサブユニットをリンカーペプチドを介して連結させたインフレーム融合を行うことにより作成することができる。 H is the two subunits of PQQGDH can be created by performing an in-frame fusion was ligated via a linker peptide. Acinetobact Acinetobact
er calcoaceticus由来の天然の水溶性PQQGDHをコードする遺伝子の配列は、Mol. Sequence of the gene encoding the naturally occurring water-soluble PQQGDH derived er calcoaceticus is, Mol. G
en. en. Genet. Genet. (1989),217:430−4 (1989), 217: 430-4
36に開示される。 It is disclosed to 36.

【0015】本発明の連結型GDHをコードする遺伝子を、2つの水溶性PQQGDHのサブユニットをコードする遺伝子を、適当な長さのリンカーをコードする遺伝子を介して連結することにより構築する。 [0015] The gene encoding linked GDH of the present invention, the genes encoding the subunits of two water-soluble PQQGDH, constructed by linking through a gene encoding a linker of appropriate length. このとき、各サブユニットとリンカーとがインフレームで融合蛋白質として発現されるように連結する。 At this time, connecting to each subunit and the linker are expressed as a fusion protein in frame. リンカーとしては、 The linker,
天然または合成の任意の配列を用いることができる。 It may be any natural or synthetic sequences. 例えば、ベクター中の適当な配列を用いてもよく、合成遺伝子を調製してもよく、あるいは、適当なプライマーを用いるPCRにより、各サブユニットの上流または下流に所望の配列を伸長させてもよい。 For example, may be used an appropriate sequence in the vector, a synthetic gene may also be prepared, or by PCR using suitable primers, may be extended a desired sequence upstream or downstream of each subunit . このような遺伝子操作のための種々の方法は、当該技術分野において知られている。 Various methods for such gene manipulation are known in the art. このようにして得た連結型GDHをコードする遺伝子を遺伝子発現用のベクター(例えばプラスミド) The gene encoding the thus obtained linked GDH vector for gene expression (e.g., plasmid)
に挿入し、これを適当な宿主(例えば大腸菌)に形質転換する。 Insert, this is transformed into an appropriate host (e.g., E. coli). 外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。 Many vector host systems for the expression of foreign protein are known in the art, as the host for example, may be used bacteria, yeasts, various ones such as cultured cells.

【0016】上述のようにして得られた、連結型GDH [0016] was obtained as described above, linked GDH
を発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕する。 Culturing the transformant expressing, after the cells were collected by centrifugal separation from the culture medium, to disrupt the cells, such as a French press. これを超遠心分離し、PQQGDHを含む水溶性画分を得ることができる。 This was ultracentrifuged, it is possible to obtain a water-soluble fraction containing PQQGDH. あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したPQQGDHを培養液中に分泌させることもできる。 Alternatively, by using a suitable host-vector system, it is also possible to secrete expressed PQQGDH in culture. 得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、HPLCなどにより精製することにより、本発明の連結型GDHを調製する。 The resulting water-soluble fraction, ion exchange chromatography, affinity chromatography, purified by means such as HPLC, to prepare a connection type GDH of the present invention. 酵素活性の測定方法本発明の連結型GDHは、PQQを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。 Linked GDH measurement method invention of enzyme activity, the PQQ as a coenzyme, has an action of catalyzing the reaction by oxidizing glucose to produce gluconolactone.

【0017】酵素活性の測定は、PQQGDHによるグルコースの酸化にともなって還元されるPQQの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。 [0017] Determination of enzyme activity can be quantified by color reaction PQQ amount of redox dye reduction with the oxidation of glucose by PQQGDH. 呈色試薬としては、例えば、PMS(フェナジンメトサルフェート)−DCIP(2,6−ジクロロフェノールインドフェノール)、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。 The color reagent, e.g., PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6- dichlorophenol indophenol), can be used potassium ferricyanide, ferrocene and the like. 熱安定性本発明の連結型GDHの熱安定性は、酵素を高温(例えば55℃)でインキュベートし、一定時間ごとにアリコートを取り出して酵素活性を測定し、時間経過にともなう酵素活性の低下をモニターすることにより評価することができる。 Thermal stability of the connection type GDH thermostable present invention, incubating the enzyme at high temperatures (e.g. 55 ° C.), and an aliquot was measured enzyme activity for each fixed time, a decrease of enzymatic activity over time it can be evaluated by monitoring. あるいは、種々の温度で一定時間インキュベートした後の残存活性を測定することにより評価することができる。 Alternatively, it can be evaluated by measuring the residual activity after predetermined time were incubated at various temperatures.

【0018】本発明の連結型GDHは、野生型PQQG [0018] linked GDH of the present invention, the wild-type PQQG
DHと比較して高い熱安定性を有することを特徴とする。 It characterized in that it has a high thermal stability compared to DH. このため、酵素生産において調製/精製時の失活が少なく収率が高い、溶液中での安定性が高く酵素の保存が容易である、本酵素を用いてアッセイキットあるいは酵素センサーを作成する過程において失活が少なく、本酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーの熱安定性が高いことから、保存性に優れるなどの利点を有する。 Therefore, higher deactivation less yield during the preparation / purification in the enzyme production, it is easy stability highly conserved enzyme in solution, the process of creating an assay kit or an enzyme sensor using the enzyme It has advantages such deactivation is small, since the high thermal stability of the assay kit or enzyme sensors created using the present enzyme is excellent in storage stability at. グルコースアッセイキット本発明はまた、本発明に従う連結型GDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。 Glucose assay kit The present invention is characterized by the glucose assay kit comprising a linked GDH according to the present invention. 本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う連結型GDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。 The glucose assay kit of the present invention in an amount sufficient for at least one assay linked GDH according to the present invention. 典型的には、キットは、本発明の連結型GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。 Typically, the kit includes in addition to the connection type GDH of the present invention, a buffer necessary for the assay, a mediator, glucose standard solutions for preparing a calibration curve, and instructions for use. 本発明に従う連結型GDHは種々の形態で、 Linked GDH according to the present invention in various forms,
例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。 For example, it can be provided as a solution of the freeze-dried reagent or appropriate storage solution. 好ましくは本発明の連結型GDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。 Preferably linked GDH of the present invention is provided in holoenzyme form, provided in the form of apoenzyme can be holoenzyme in use. グルコースセンサー本発明はまた、本発明に従う連結型GDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。 Glucose sensor The present invention is characterized by the glucose sensor using linked GDH according to the present invention. 電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。 As an electrode, using a carbon electrode, gold electrode, a platinum electrode, to immobilize the enzyme of the present invention on the electrode. 固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、 As immobilization method, a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix,
透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。 A method of coating with a dialysis membrane, photocrosslinkable polymers, conducting polymers, include a redox polymer, or ferrocene or may be sucked and fixed onto the fixed or electrode in a polymer together with an electron mediator represented by the derivatives, or it may be used in combination. 好ましくは本発明の連結型GDHはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、PQQ Preferably linked GDH of the present invention is immobilized on an electrode in a form holoenzyme, but immobilized in the form of apoenzyme, PQQ
を別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。 It may also be provided in the or in solution as a separate layer.
典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の連結型GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。 Typically, after immobilizing the linked GDH of the present invention on a carbon electrode using glutaraldehyde, blocking the glutaraldehyde is treated with a reagent having an amine group.

【0019】グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。 [0019] Measurement of the glucose concentration can be performed as follows. 恒温セルに緩衝液を入れ、PQQ The buffer was put in a constant-temperature cell, PQQ
およびCaCl 2 、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。 And CaCl 2, and a mediator in addition to maintaining a constant temperature. メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。 The mediator may be used potassium ferricyanide, and the like phenazine methosulfate. 作用電極として本発明の連結型GDH Linked GDH of the present invention as a working electrode
を固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。 Using immobilized electrode, using counter electrode (eg, platinum electrode) and a reference electrode (e.g., Ag / AgCl electrode). カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。 A constant voltage is applied to the carbon electrode, after the current becomes constant, measuring the increase in current by adding a sample containing glucose. 標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。 According calibration curve prepared from glucose solutions of standard concentration, it is possible to calculate the glucose concentration in the sample.

【0020】 [0020]

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, the present invention is not limited to these examples. 実施例1 連結型GDHの構築 連結型GDHの構築方法ならびにリンカー領域の一次構造を図1に示す。 The primary structure of construction method and the linker region construct linked GDH of Example 1 linked GDH shown in FIG. 連結型GDHを構築するためのそれぞれのフラグメントは、A. Each fragment for constructing linked GDH is, A. calcoaceticus calcoaceticus
LMD79.41(the Netherlands LMD79.41 (the Netherlands
Culture Collection)由来の天然のPQQGDH構造遺伝子をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、PCR反応により増幅した。 The Culture Collection) of natural origin PQQGDH structural gene as a template, to contain the desired restriction enzyme site, was amplified by PCR reaction. PCR反応には、次の2組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。 The PCR reaction used the following two sets of oligonucleotide primers. 第1フラグメント(Nco I/Sac I) フォワード 5'-GGCCATGGATAAACATTTATTGGCTAAAATTGCTTTAT-3' リバース 5'-GGGAGCTCCTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAG-3' 第2フラグメント(Pst I/Hind III) フォワード 5'-GGCTGCAGGTTCCTCTAACTCCATCTCAATTTGCTAAA-3' リバース 5'-GGAAGCTTTTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAG-3' これらのフラグメントを、発現ベクターpTrc99A The first fragment (Nco I / Sac I) forward 5'-GGCCATGGATAAACATTTATTGGCTAAAATTGCTTTAT-3 'Reverse 5'-GGGAGCTCCTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAG-3' second fragment (Pst I / Hind III) forward 5'-GGCTGCAGGTTCCTCTAACTCCATCTCAATTTGCTAAA-3 'Reverse 5'-GGAAGCTTTTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAG- 3 'these fragments expression vector pTrc99A
(Pharmacia社)の2つのクローニング部位にタンデムに挿入した。 It was inserted in tandem into two cloning sites (Pharmacia, Inc.). 終止コドンを有しない第1フラグメントをNcoI/SacI部位に挿入し、終止コドンを有する第2のフラグメントをPstI/HindII The first fragment no stop codon was inserted into the NcoI / SacI site, a second fragment having a stop codon PstI / HindII
I部位に挿入した。 It was inserted into the I site. 得られたプラスミドpLGB1は、 The resulting plasmid pLGB1 is,
GDHをコードする2つの領域がリンカー領域を介してインフレームでタンデムに連結されている融合蛋白質をコードする。 Two regions coding for GDH encodes a fusion protein which is connected in tandem in-frame via a linker region. リンカー領域は、発現ベクターのマルチクローニング部位の配列に由来するものであり、β−ガラクトシダーゼの部分配列の13アミノ酸残基をコードする。 Linker region is derived from the sequence of the multiple cloning site of the expression vector, encoding the 13 amino acid residues of the partial sequence of the β- galactosidase. 遺伝子配列決定により、所望の配列を有する遺伝子が得られたことを確認した。 Gene sequencing, it was confirmed that the genes with the desired sequence was obtained.

【0021】対照としては、野生型PQQGDHをコードする遺伝子が同じ発現ベクターpTrc99Aに挿入されているプラスミドpGB2を用いた。 [0021] As a control, with a plasmid pGB2 gene encoding a wild-type PQQGDH is inserted into the same expression vector pTrc99A. 実施例2 連結型GDHの製造および精製 宿主細胞としては、挿入変異によりPQQGDH構造遺伝子が壊されているE. The production and purification host cells of Example 2 linked GDH, are PQQGDH structural gene is destroyed by inserting mutations E. coli PP2418株(C coli PP2418 shares (C
leton−Jansen et al. leton-Jansen et al. ,1990) , 1990)
を用いた。 It was used. この株を実施例1で得られたプラスミドpL Plasmid pL obtained with this strain in Example 1
GB1および対照プラスミドpGB2でそれぞれトランスフォームし、各形質転換体をL−ブロス中で600n GB1 and the control plasmid pGB2 to transform respectively, 600n each transformants L- broth
M PQQおよび5mM CaCl 2の存在下で37℃ 37 ° C. in the presence of M PQQ and 5 mM CaCl 2
で好気的に培養した。 In was aerobically culture. 中期対数増殖期で0.3mM I 0.3mM I in the mid-log phase of growth
PTGを加え、さらに30℃で後期対数増殖期まで培養した。 PTG was added and incubated to late log phase at further 30 ° C.. 細胞を回収し、10mM リン酸緩衝液(pH Cells were harvested, 10 mM phosphate buffer (pH
7.0)中でフレンチプレスにより破壊し(110Mp 7.0) was destroyed by the French press in (110Mp
as)、超遠心分離(160,500g、1h、4℃) the as), ultracentrifugation (160,500g, 1h, 4 ℃)
を行った。 It was carried out. 酵素活性は水溶性画分中に認められた。 Enzyme activity was observed in the water-soluble fraction. この画分を回収し、10mM リン酸緩衝液(pH7.0) The fractions were collected, 10 mM phosphate buffer (pH7.0)
で透析した。 In the dialysis. 実施例3 連結型GDHの分子量の測定 実施例2で得られた粗精製酵素を、10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したカチオン交換クロマトグラフィー(CM−Toyopearl 650M)に供し、0.8M NaCl/10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で溶出した。 The crude enzyme obtained in the measurement example 2 of the molecular weight of Example 3 linked GDH, subjected to equilibrated cation exchange chromatography (CM-Toyopearl 650M) in 10mM phosphate buffer (pH 7.0), 0 and eluted with .8M NaCl / 10mM phosphate buffer (pH 7.0). 活性を示す画分を非変性条件下でゲル濾過クロマトグラフィー(G−3000、トーソー社)に供したところ、活性画分は、連結型GDH Gel filtration chromatography (G-3000, Tosoh Corporation) fractions under non-denaturing conditions showing the activity was subjected to, active fraction, linked GDH
について予測されるとおり、約100kDaの分子量を有していた。 As expected for, it had a molecular weight of approximately 100 kDa. しかし、さらにSDS−PAGEにより分析したところ、この画分は分子量50kDaの蛋白質を少量含有していた。 However, was further analyzed by SDS-PAGE, this fraction contained small amounts of protein having a molecular weight of 50 kDa. これは、インビボでの蛋白質分解により、または精製工程の間に融合蛋白質が分解されて、 This is because the protein degradation in vivo, or fusion protein during the purification process is decomposed,
50kDaのPQQGDHのサブユニットが生じたためと考えられる。 Subunit of PQQGDH of 50kDa is presumably because occurred. この分解生成物を分離除去するため、活性画分をさらに2.0mM グアニジン−HClの存在下でゲル濾過クロマトグラフィーに供して、分子量10 To separate off the decomposition product was subjected to gel filtration chromatography in the presence of a further 2.0mM guanidine -HCl active fractions, molecular weight 10
0kDaの蛋白質のみを含有するGDH活性画分を得た(図2)。 It was obtained GDH active fraction containing only protein kDa (Figure 2). このようにして得られた画分を連結型GHD The fractions thus obtained linked GHD
酵素標品として以下の実験に用いた。 It was used in the following experiments as enzyme preparation. 実施例4 酵素アッセイ 酵素活性は、酵素を10mM MOPS緩衝液(pH EXAMPLE 4 Enzyme Assay The enzyme activity, 10 mM MOPS buffer enzyme (pH
7.0)中で、1mMCaCl 2および1μM PQQ 7.0) In, 1 mM CaCl 2 and 1 [mu] M PQQ
の存在下で室温で10分間インキュベートした後、0. After incubation at room temperature for 10 minutes in the presence of 0.
6mM フェナジンメトサルフェート、0.06mM 6mM phenazine methosulfate, 0.06mM
2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCI 2,6-dichloro indophenol (DCI
P)の存在下で、25℃で600nmの吸光度の減少速度を測定することにより測定した。 In the presence of P), it was determined by measuring the rate of decrease of 600nm absorbance at 25 ° C..

【0022】グルコース濃度10−1000mMの範囲でアッセイを行い、連結型GDHの速度論的パラメータを算出した。 [0022] Assays were performed range of glucose concentrations 10-1000MM, was calculated kinetic parameters of linked GDH. 連結型GDHのグルコースに対するKm値およびラクトースに対するKm値はそれぞれ20mMおよび12mMであり、天然型ダイマーPQQGDHとほぼ同様であった(Mathushita et a Km value for Km value and lactose for glucose linked GDH are each 20mM and 12 mM, were almost the same as the native dimer PQQGDH (Mathushita et a
l. l. , 1995; Olsthoorn et a , 1995; Olsthoorn et a
l. l. , 1996, 1998)。 , 1996, 1998).

【0023】また、連結型GDHのグルコースに対するVmax値は897U/mgであり、ラクトースに対するVmax値は467U/mgであった。 Further, Vmax values ​​for glucose linked GDH is 897U / mg, Vmax values ​​for lactose was 467U / mg. 天然のダイマーPQQGDHの触媒活性はこれまでに複数の報告があり、酵素の調製方法およびアッセイ方法に依存して、3 Catalytic activity of the native dimer PQQGDH so far has multiple reports, depending on the method and assay method for the preparation of the enzyme, 3
000U/mgから7400U/mgの範囲である(M Is in the range of 7400U / mg from 000U / mg (M
athushita et al. athushita et al. ,1995;Ols , 1995; Ols
thoorn etal. thoorn etal. ,1996,1998)。 , 1996, 1998). すなわち、連結型GDHは天然のダイマーPQQGDHの10−30%程度の触媒活性を有する。 That is, linked GDH has a catalytic activity of about 10-30% of the native dimer PQQGDH. この値は、グルコースセンサーに一般に用いられているグルコースオキシダーゼの5−10倍高いものであり、バイオセンサーにおいて適用するのに十分な触媒活性である。 This value is intended 5-10 times higher glucose oxidase is generally used in a glucose sensor, a sufficient catalytic activity for application in biosensors. 実施例5 熱安定性の評価 連結型GDHおよび野生型GDHを、10mM MOP Evaluation linked GDH and wild-type GDH of Example 5 Thermal Stability, 10 mM MOP
S緩衝液(pH7.0)中で、30−70℃の指示された各温度で20分間処理し、次に4℃で2分間冷却した後、室温で残存酵素活性を測定した。 In S buffer (pH 7.0), and treated at each temperature, which is indicated in the 30-70 ° C. 20 min, after then cooled for 2 minutes at 4 ° C., it was measured residual enzyme activity at room temperature.

【0024】結果を図3に示す。 [0024] The results are shown in Figure 3. 試験した温度範囲においては、連結型GDHは野生型ダイマーGDHより高い残存活性を示した。 In tested temperature range, linked GDH showed higher residual activity than the wild-type dimer GDH. これらの結果は、連結型GDHが野生型ダイマーGDHよりはるかに高い熱安定性を有することを表す。 These results indicate that the linked GDH has a much higher thermal stability than the wild-type dimer GDH. 実施例6 合成リンカーにより連結された連結型GDH 実施例1で得られたプラスミドpLGB1の、連結型G Plasmid pLGB1 obtained in linked by Example 6 Synthesis linker linked GDH Example 1, linked G
DHのβ−ガラクトシダーゼ由来の13アミノ酸からなるリンカー部分:Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Ar Linker moiety consisting of 13 amino acids from DH of β- galactosidase: Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Ar
g-Val-Asp-Leu-Glnをコードする配列を、それぞれ Gly-Gly-Gly-Gly-Ser および Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser をコードする二本鎖合成オリゴヌクレオチドで置き換えて、合成リンカー連結型GDHをコードするプラスミドを作成した。 The sequence encoding g-Val-Asp-Leu-Gln, respectively two encoding Gly-Gly-Gly-Gly-Ser and Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser replaced by strand synthesis oligonucleotide to prepare a plasmid encoding a synthetic linker linked GDH. これらのプラスミドを用いて、実施例2と同様にして精製酵素を調製した。 Using these plasmids were prepared purified enzyme in the same manner as in Example 2. これらの合成リンカー連結型GDHはいずれも、実施例2で得られた連結型G Both of these synthetic linker linked GDH is linked G obtained in Example 2
DHと匹敵する酵素活性および熱安定性を示した。 It showed enzymatic activity and thermal stability comparable to DH. 実施例7 酵素センサーの作製および評価 5Uの連結型GDHにカーボンペースト20mgを加えて凍結乾燥させた。 It was added thereto to conduct lyophilization carbon paste 20mg to linked GDH Preparation and Evaluation 5U of Example 7 enzyme sensors. これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約40mg充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。 After mixing this well, already filled only to the surface of carbon paste electrode carbon paste is about 40mg filled, and polished on a filter paper. この電極を1%のグルタルアルデヒドを含む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で30分間処理した後、2 After treatment for 30 minutes at room temperature the electrode in 10 mM MOPS buffer (pH7.0) containing 1% glutaraldehyde, 2
0mMリジンを含む10mM MOPS緩衝液(pH 10 mM MOPS buffer containing 0mM lysine (pH
7.0)中で室温で20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。 7.0) were blocked glutaraldehyde for 20 minutes at room temperature in. この電極を10mM MOPS This electrode 10mM MOPS
緩衝液(pH7.0)中で室温で1時間以上平衡化させた。 Buffer (pH 7.0) was allowed to equilibrate for 1 hour at room temperature in. 電極は4℃で保存した。 Electrodes were stored at 4 ° C..

【0025】作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。 [0025] was measured glucose concentration by using the enzyme sensor prepared. 本発明の連結型GDHを固定化した酵素センサーを用いて、0.1mM−5mMの範囲でグルコースの定量を行うことができる。 Using an enzyme sensor with immobilized linked GDH of the present invention, it is possible to perform determination of glucose in the range of 0.1 mM-5 mM.

【0026】 [0026]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sode, Koji <120> Linked Glucose Dehydrogenase <130> 990388 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 1 ggccatggat aaacatttat tggctaaaat tgctttat 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 2 gggagctcct tagccttata ggtgaactta atgag 35 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 3 ggctgcaggt tcctctaact ccatctcaat ttgctaaa 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 4 ggaagctttt acttagcctt ataggtgaac ttaatgag 38 [Sequence Listing] SEQUENCE LISTING <110> Sode, Koji <120> Linked Glucose Dehydrogenase <130> 990388 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 1 ggccatggat aaacatttat tggctaaaat tgctttat 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 2 gggagctcct tagccttata ggtgaactta atgag 35 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 3 ggctgcaggt tcctctaact ccatctcaat ttgctaaa 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Acetobacter calcoaceticus <400> 4 ggaagctttt acttagcctt ataggtgaac ttaatgag 38

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 図1は、本発明の連結型GDHをコードするベクターの構築方法およびリンカー領域の一次構造を示す。 FIG. 1 shows the primary structure of the construction method and the linker region of the vector encoding the linked GDH of the present invention.

【図2】 図2は、本発明の連結型GDHのゲル電気泳動図である。 Figure 2 is a gel electropherogram of linked GDH of the present invention.

【図3】 図3は、本発明の連結型GDHと対照GDH Figure 3 is linked GDH and control GDH of the present invention
の熱安定性を示すグラフである。 Is a graph showing the thermal stability.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 4B024 AA11 AA20 BA08 CA03 DA05 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ03 QR04 QR65 QS02 QX01 4B065 AA04Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA28 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 CA11 DA89 EA50 FA72 FA74 ────────────────────────────────────────────────── ─── front page of continued F-term (reference) 4B024 AA11 AA20 BA08 CA03 DA05 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ03 QR04 QR65 QS02 QX01 4B065 AA04Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA28 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 CA11 DA89 EA50 FA72 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 リンカーペプチドを介して連結された2 1. A 2 which are linked via a linker peptide
    つの水溶性PQQGDHのサブユニットを含有する融合蛋白質。 Fusion proteins containing subunits One water-soluble PQQGDH.
  2. 【請求項2】 前記リンカーペプチドが5アミノ酸以上の長さである、請求項1記載の融合蛋白質。 Wherein the length of the linker peptide 5 amino acids or more, claim 1 fusion protein according.
  3. 【請求項3】 前記水溶性PQQGDHがAcinet Wherein the water-soluble PQQGDH is Acinet
    obacter calcoaceticus由来水溶性PQQGDHである、請求項1または2に記載の融合蛋白質。 Obacter calcoaceticus is derived from water-soluble PQQGDH, fusion protein according to claim 1 or 2.
  4. 【請求項4】 リンカーペプチドが次の配列 Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gl 4. A sequence linker peptide follows Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gl
    n を有する、請求項1−3のいずれかに記載の融合蛋白質。 Having n, fusion protein of any of claims 1-3.
  5. 【請求項5】 リンカーペプチドが次の配列 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser を有する、請求項1−3のいずれかに記載の融合蛋白質。 Wherein the linker peptide has the following sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, fusion protein of any of claims 1-3.
  6. 【請求項6】 リンカーペプチドが次の配列 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser を有する、請求項1−3のいずれかに記載の融合蛋白質。 6. A linker peptide has the following sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, fusion protein of any of claims 1-3.
  7. 【請求項7】 請求項1−6のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。 7. The gene encoding the fusion protein of any of claims 1-6.
  8. 【請求項8】 請求項7に記載の遺伝子を含むベクター。 8. A vector comprising the gene of claim 7.
  9. 【請求項9】 請求項7に記載の遺伝子を含む形質転換体。 9. Transformants containing the gene of claim 7.
  10. 【請求項10】 請求項7に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれた生物。 10. A gene according to claim 7 is incorporated into the main chromosome organism.
  11. 【請求項11】 請求項1−6のいずれかに記載の融合蛋白質を含むグルコースアッセイキット。 11. Glucose assay kit comprising the fusion protein of any of claims 1-6.
  12. 【請求項12】 請求項1−6のいずれかに記載の融合蛋白質を含むグルコースセンサー。 12. A glucose sensor comprising a fusion protein according to any of claims 1-6.
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