JP2001017174A - 胎盤型有機アニオントランスポーターとその遺伝子 - Google Patents
胎盤型有機アニオントランスポーターとその遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、胎盤における有機アニオン輸送に
関与する新規な有機アニオンントランスポーター遺伝子
およびその遺伝子がコードするポリペプチドである有機
アニオントランスポーターを提供するものである。 【解決手段】 本発明は、胎盤型有機アニオントランス
ポーターＯＡＴ４、より詳細には、配列番号２に示され
るアミノ酸配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失
し、他のアミノ酸で置換もしくは付加されてもよいアミ
ノ酸配列を有する胎盤型有機アニオントランスポーター
ＯＡＴ４に関する。また、本発明は、前記した胎盤型有
機アニオントランスポーターＯＡＴ４をコードする塩基
配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし得る塩基配列を有するをコードする核酸、好まし
くはＤＮＡに関する。
関与する新規な有機アニオンントランスポーター遺伝子
およびその遺伝子がコードするポリペプチドである有機
アニオントランスポーターを提供するものである。 【解決手段】 本発明は、胎盤型有機アニオントランス
ポーターＯＡＴ４、より詳細には、配列番号２に示され
るアミノ酸配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失
し、他のアミノ酸で置換もしくは付加されてもよいアミ
ノ酸配列を有する胎盤型有機アニオントランスポーター
ＯＡＴ４に関する。また、本発明は、前記した胎盤型有
機アニオントランスポーターＯＡＴ４をコードする塩基
配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし得る塩基配列を有するをコードする核酸、好まし
くはＤＮＡに関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は有機アニオン（有機
陰イオン）輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコー
ドするポリペプチドに関する。より詳細には、本発明
は、胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４、そ
れをコードする遺伝子、当該遺伝子を検出するためのプ
ローブ、及び当該蛋白質を認識し得る抗体に関する。
陰イオン）輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコー
ドするポリペプチドに関する。より詳細には、本発明
は、胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４、そ
れをコードする遺伝子、当該遺伝子を検出するためのプ
ローブ、及び当該蛋白質を認識し得る抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】腎臓や肝臓は、生体異物や薬物の代謝お
よび体外排出に関して重要な役割を果たしている。腎臓
の尿細管細胞は極性を有する上皮細胞であり、側底膜を
介して血液と接し、種々の物質の受け渡しを行ってい
る。有機アニオンの一部は、輸送担体（トランスポータ
ー）により側底膜を介して腎臓に取り込まれ、また細胞
内で代謝により産生された有機アニオンもトランスポー
ターにより排出されることがこれまでの生理学的な研究
から予測されてきた。
よび体外排出に関して重要な役割を果たしている。腎臓
の尿細管細胞は極性を有する上皮細胞であり、側底膜を
介して血液と接し、種々の物質の受け渡しを行ってい
る。有機アニオンの一部は、輸送担体（トランスポータ
ー）により側底膜を介して腎臓に取り込まれ、また細胞
内で代謝により産生された有機アニオンもトランスポー
ターにより排出されることがこれまでの生理学的な研究
から予測されてきた。
【０００３】有機アニオンは、薬物や環境毒素、またそ
れらの代謝物などの多くを含むことから、有機アニオン
輸送系は、生体異物排泄系あるいは薬物輸送系としても
広く知られてきた。尿細管細胞の有機アニオンの取り込
みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小
胞系などを用いた実験系により研究されてきた。しかし
従来の手法では、側底膜を介した有機アニオン輸送系に
ついて詳細に解析することは困難であり、トランスポー
ターそのものを単離して解析することが望まれてきた。
れらの代謝物などの多くを含むことから、有機アニオン
輸送系は、生体異物排泄系あるいは薬物輸送系としても
広く知られてきた。尿細管細胞の有機アニオンの取り込
みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小
胞系などを用いた実験系により研究されてきた。しかし
従来の手法では、側底膜を介した有機アニオン輸送系に
ついて詳細に解析することは困難であり、トランスポー
ターそのものを単離して解析することが望まれてきた。
【０００４】有機アニオン輸送は、腎臓や肝臓以外の組
織においても行われている。胎盤は、胎児と母体との間
で物質交換を活発におこなっている組織であり、糖やア
ミノ酸を含む生体必須物質はトランスポーターを介し
て、母体から効率良く胎児に輸送されている。一方、胎
盤は胎児の外部環境に対する組織バリアーとしての役目
も担っている。胎盤は、母体が摂取した生体異物の胎児
への自由な移行に対して、ある種の制限を与えており、
この機能の一部は、異物排泄トランスポーターによる胎
児循環からの異物除去によるものと想定される。
織においても行われている。胎盤は、胎児と母体との間
で物質交換を活発におこなっている組織であり、糖やア
ミノ酸を含む生体必須物質はトランスポーターを介し
て、母体から効率良く胎児に輸送されている。一方、胎
盤は胎児の外部環境に対する組織バリアーとしての役目
も担っている。胎盤は、母体が摂取した生体異物の胎児
への自由な移行に対して、ある種の制限を与えており、
この機能の一部は、異物排泄トランスポーターによる胎
児循環からの異物除去によるものと想定される。
【０００５】さらに、胎児の体内においても種々の代謝
反応がおこっており、その結果として有機アニオンが産
生されている。胎児の解剖学的な特殊性から、こうした
代謝物の排泄は主に胎盤を介している。有機アニオント
ランスポーターが胎盤に存在してこの役割を果たしてい
ると考えるのは、合目的的である。このように、胎盤に
おける生体異物輸送（特に有機アニオン輸送）は、胎児
の発育および遺伝毒性に関して重要な役割を担っている
と考えられるにも関わらず、腎臓や肝臓以上にその輸送
の詳細は不明である。
反応がおこっており、その結果として有機アニオンが産
生されている。胎児の解剖学的な特殊性から、こうした
代謝物の排泄は主に胎盤を介している。有機アニオント
ランスポーターが胎盤に存在してこの役割を果たしてい
ると考えるのは、合目的的である。このように、胎盤に
おける生体異物輸送（特に有機アニオン輸送）は、胎児
の発育および遺伝毒性に関して重要な役割を担っている
と考えられるにも関わらず、腎臓や肝臓以上にその輸送
の詳細は不明である。
【０００６】本発明者らは、既に腎臓、肝臓、脳などに
おいて中心的な役割を果たしている有機アニオントラン
スポーターＯＡＴ１（J. Biol Chem 272巻，18526-9
頁、1997）、ＯＡＴ２（FEBS letter 429、179-182頁、1
998）、およびＯＡＴ３（J. Biol Chem ,274巻, 13675-
13680頁、1999）を単離し報告してきた。また、これら
については、既に特許出願済みである。ＯＡＴ１、ＯＡ
Ｔ２およびＯＡＴ３は化学構造の異なる多くの有機アニ
オンを輸送することの出来るトランスポーターであり、
種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。ＯＡＴ１、
ＯＡＴ２さらにＯＡＴ３の単離、同定は有機アニオント
ランスポーターがファミリーを形成することを示してい
る。このファミリーのメンバーは、腎臓や肝臓など生体
異物の体外排泄に中心的な役割を果たしている臓器のみ
ならず、組織関門を形成する脳にもその発現が認められ
る。
おいて中心的な役割を果たしている有機アニオントラン
スポーターＯＡＴ１（J. Biol Chem 272巻，18526-9
頁、1997）、ＯＡＴ２（FEBS letter 429、179-182頁、1
998）、およびＯＡＴ３（J. Biol Chem ,274巻, 13675-
13680頁、1999）を単離し報告してきた。また、これら
については、既に特許出願済みである。ＯＡＴ１、ＯＡ
Ｔ２およびＯＡＴ３は化学構造の異なる多くの有機アニ
オンを輸送することの出来るトランスポーターであり、
種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。ＯＡＴ１、
ＯＡＴ２さらにＯＡＴ３の単離、同定は有機アニオント
ランスポーターがファミリーを形成することを示してい
る。このファミリーのメンバーは、腎臓や肝臓など生体
異物の体外排泄に中心的な役割を果たしている臓器のみ
ならず、組織関門を形成する脳にもその発現が認められ
る。
【０００７】これらの事実から、本発明者らは、組織関
門の機能的単位および胎児の代謝物排泄経路として、胎
盤における有機アニオントランスポーターの存在を予想
し、胎盤に存在する新規な有機アニオントランスポータ
ーを単離した。
門の機能的単位および胎児の代謝物排泄経路として、胎
盤における有機アニオントランスポーターの存在を予想
し、胎盤に存在する新規な有機アニオントランスポータ
ーを単離した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、胎盤
における有機アニオン輸送に関与する新規な有機アニオ
ンントランスポーター遺伝子およびその遺伝子がコード
するポリペプチドである有機アニオントランスポーター
を同定し、提供することにある。その他の目的について
は以下の記載より明白である。
における有機アニオン輸送に関与する新規な有機アニオ
ンントランスポーター遺伝子およびその遺伝子がコード
するポリペプチドである有機アニオントランスポーター
を同定し、提供することにある。その他の目的について
は以下の記載より明白である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、既に述べ
たように、３つの有機アニオントランスポーターＯＡＴ
１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３を単離した。これらは相互
に４０％前後のアミノ酸配列の相同性を有している。こ
れらの配列をもとに、ＥＳＴデータベース（expressed
sequence tag data base）を検索し、ＯＡＴ１，２およ
び３と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片を同定した。こ
のｃＤＮＡ断片を用いて、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリ
ーよりこれまでに報告のない新規クローン（ＯＡＴ４）
を同定した。そして、このものが胎盤型であることを確
認した。
たように、３つの有機アニオントランスポーターＯＡＴ
１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３を単離した。これらは相互
に４０％前後のアミノ酸配列の相同性を有している。こ
れらの配列をもとに、ＥＳＴデータベース（expressed
sequence tag data base）を検索し、ＯＡＴ１，２およ
び３と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片を同定した。こ
のｃＤＮＡ断片を用いて、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリ
ーよりこれまでに報告のない新規クローン（ＯＡＴ４）
を同定した。そして、このものが胎盤型であることを確
認した。
【００１０】したがって、本発明は、胎盤型有機アニオ
ントランスポーターＯＡＴ４に関し、より詳細には、本
発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、
又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のアミノ酸
で置換もしくは付加されてもよいアミノ酸配列を有する
胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４に関す
る。本発明の胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡ
Ｔ４は、有機アニオンとしてエストロン硫酸、デヒドロ
エピアンドロステロン硫酸、及び／又はオクラトキシン
Ａなどの有機アニオンを取り込む能力を有する胎盤型有
機アニオントランスポーターＯＡＴ４である。
ントランスポーターＯＡＴ４に関し、より詳細には、本
発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、
又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のアミノ酸
で置換もしくは付加されてもよいアミノ酸配列を有する
胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４に関す
る。本発明の胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡ
Ｔ４は、有機アニオンとしてエストロン硫酸、デヒドロ
エピアンドロステロン硫酸、及び／又はオクラトキシン
Ａなどの有機アニオンを取り込む能力を有する胎盤型有
機アニオントランスポーターＯＡＴ４である。
【００１１】また、本発明は、配列表の配列番号２に示
されるアミノ酸配列、又は、その一部のアミノ酸配列が
欠失し、他のアミノ酸で置換もしくは付加されていても
よいアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列
又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し得る塩基配列を有する核酸、好ましくはＤＮＡに関
し、前記した本発明の胎盤型有機アニオントランスポー
ターＯＡＴ４をコードする遺伝子に関する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を有す
るＤＮＡの連続する少なくとも１４塩基以上、好ましく
は２０塩基以上、またはそれらの相補鎖よりなる塩基配
列を有する核酸、好ましくはＤＮＡに関し、当該ＤＮＡ
などの核酸は前記下本発明の胎盤型有機アニオントラン
スポーターＯＡＴ４をコードする遺伝子を検出、同定又
は定量するためのプローブとして有用である。また、本
発明は、前記した本発明の胎盤型有機アニオントランス
ポーターＯＡＴ４を認識し得る抗体にも関する。
されるアミノ酸配列、又は、その一部のアミノ酸配列が
欠失し、他のアミノ酸で置換もしくは付加されていても
よいアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列
又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し得る塩基配列を有する核酸、好ましくはＤＮＡに関
し、前記した本発明の胎盤型有機アニオントランスポー
ターＯＡＴ４をコードする遺伝子に関する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を有す
るＤＮＡの連続する少なくとも１４塩基以上、好ましく
は２０塩基以上、またはそれらの相補鎖よりなる塩基配
列を有する核酸、好ましくはＤＮＡに関し、当該ＤＮＡ
などの核酸は前記下本発明の胎盤型有機アニオントラン
スポーターＯＡＴ４をコードする遺伝子を検出、同定又
は定量するためのプローブとして有用である。また、本
発明は、前記した本発明の胎盤型有機アニオントランス
ポーターＯＡＴ４を認識し得る抗体にも関する。
【００１２】本発明の有機アニオントランスポーターＯ
ＡＴ４は、異なる化学構造を持った有機アニオンに対し
てこれらを輸送する（取り込む）能力を有する、広い範
囲の基質選択性を有するトランスポーターである。本発
明の胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４は、
エストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、
及び／又はオクラトキシンＡなどの有機アニオンを取り
込む能力を有している。
ＡＴ４は、異なる化学構造を持った有機アニオンに対し
てこれらを輸送する（取り込む）能力を有する、広い範
囲の基質選択性を有するトランスポーターである。本発
明の胎盤型有機アニオントランスポーターＯＡＴ４は、
エストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、
及び／又はオクラトキシンＡなどの有機アニオンを取り
込む能力を有している。
【００１３】本発明者らは、既に本発明者らが単離した
ＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３の塩基配列情報をも
とに、公開されているＥＳＴ データベースを探索した
ところ、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３と相同性を
有する新規ｃＤＮＡ断片Ｈ１２８７６を得た。このＨ１
２８７６を３２Ｐでラベルしたプローブを用いて、既に
構築してあったヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングした。この結果、有機アニオン輸送活性を持つ
新規ｃＤＮＡ（ｈＯＡＴ４ ｃＤＮＡ）が得た。得られ
たｃＤＮＡ（ＯＡＴ４ ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定
は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）により行い、配列表
の配列番号１に示す塩基配列であることが分かった。
ＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３の塩基配列情報をも
とに、公開されているＥＳＴ データベースを探索した
ところ、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯＡＴ３と相同性を
有する新規ｃＤＮＡ断片Ｈ１２８７６を得た。このＨ１
２８７６を３２Ｐでラベルしたプローブを用いて、既に
構築してあったヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングした。この結果、有機アニオン輸送活性を持つ
新規ｃＤＮＡ（ｈＯＡＴ４ ｃＤＮＡ）が得た。得られ
たｃＤＮＡ（ＯＡＴ４ ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定
は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）により行い、配列表
の配列番号１に示す塩基配列であることが分かった。
【００１４】得られたＯＡＴ４が、有機アニオン輸送活
性を持っていることを確認するために、関根らの方法
（Sekine,T., et al.J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1
997年）に準じて、このｃＤＮＡを含むプラスミドから
ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製し、これ
をアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細
胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび
有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結果を
図１に示す。図１に示されるように、ＯＡＴ４を発現さ
せた卵母細胞は３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロ
エピアンドロステロン硫酸、及び３Ｈ−オクラトキシン
Ａの取り込みを示すことが判明した。これに対して代表
的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチル
アンモニウム）の取り込みは認められなかった。
性を持っていることを確認するために、関根らの方法
（Sekine,T., et al.J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1
997年）に準じて、このｃＤＮＡを含むプラスミドから
ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製し、これ
をアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細
胞について放射能標識された種々の有機アニオンおよび
有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結果を
図１に示す。図１に示されるように、ＯＡＴ４を発現さ
せた卵母細胞は３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロ
エピアンドロステロン硫酸、及び３Ｈ−オクラトキシン
Ａの取り込みを示すことが判明した。これに対して代表
的な有機カチオンである１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチル
アンモニウム）の取り込みは認められなかった。
【００１５】次に、前記したＯＡＴ４ ｃＲＮＡを注入
した卵母細胞を用いて、本発明のＯＡＴ４による種々の
濃度におけるエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロス
テロン硫酸の取り込み量の変化を調べ、有機アニオン輸
送のミカエリスーメンテン動力学試験を行った。この結
果を図２に示す。この結果、本発明のＯＡＴ４は、ある
濃度までは濃度依存的に有機アニオンの取り込み量を増
加させるものであることがわかった。そして、エストロ
ン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸の取り込み
のＫｍ値はそれぞれ １．０１±０．１５μＭ、０．６
３±０．０４μＭであった。
した卵母細胞を用いて、本発明のＯＡＴ４による種々の
濃度におけるエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロス
テロン硫酸の取り込み量の変化を調べ、有機アニオン輸
送のミカエリスーメンテン動力学試験を行った。この結
果を図２に示す。この結果、本発明のＯＡＴ４は、ある
濃度までは濃度依存的に有機アニオンの取り込み量を増
加させるものであることがわかった。そして、エストロ
ン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸の取り込み
のＫｍ値はそれぞれ １．０１±０．１５μＭ、０．６
３±０．０４μＭであった。
【００１６】本発明のＯＡＴ４の有機アニオン輸送にお
けるナトリウム依存性を検討した。ＯＡＴ４によるエス
トロン硫酸の取り込みを、種々の細胞外陽イオンの存在
下に実験した。結果を図３に示す。図３に示されるよう
に、細胞外陽イオンとしてナトリウムイオン、コリンイ
オン及びリチウムイオンが存在するとＯＡＴ４を介した
エストロン硫酸の取り込み活性が認められ、細胞外ナト
リウムをリチウムおよびコリンに置換しても、ＯＡＴ４
を介したエストロン硫酸の輸送に変化は無く、ＯＡＴ４
が細胞外ナトリウム非依存性の有機アニオントランスポ
ーターであることが明らかになった。
けるナトリウム依存性を検討した。ＯＡＴ４によるエス
トロン硫酸の取り込みを、種々の細胞外陽イオンの存在
下に実験した。結果を図３に示す。図３に示されるよう
に、細胞外陽イオンとしてナトリウムイオン、コリンイ
オン及びリチウムイオンが存在するとＯＡＴ４を介した
エストロン硫酸の取り込み活性が認められ、細胞外ナト
リウムをリチウムおよびコリンに置換しても、ＯＡＴ４
を介したエストロン硫酸の輸送に変化は無く、ＯＡＴ４
が細胞外ナトリウム非依存性の有機アニオントランスポ
ーターであることが明らかになった。
【００１７】さらに、本発明のＯＡＴ４の基質選択性を
検討するために、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験
系において、系へ各種イオン性物質を添加し、その影響
を調べた（阻害実験）。その結果を図４に示す。この結
果、種々のアニオン性物質（プロベネシド、ペニシリン
Ｇ、インドメタシン、イブプロフェン、ジクロフェナッ
ク、フロセミド、ブメタニド、ブロモサルフォフタレイ
ン、コール酸、タウロコール酸など）はＯＡＴ４による
３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害したが、テト
ラエチルアンモニウムのようなカチオン性物質および無
機硫酸は阻害作用を示さなかった。以上の結果から、Ｏ
ＡＴ４は多選択性有機アニオントランスポーターである
ことが判明した。
検討するために、３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験
系において、系へ各種イオン性物質を添加し、その影響
を調べた（阻害実験）。その結果を図４に示す。この結
果、種々のアニオン性物質（プロベネシド、ペニシリン
Ｇ、インドメタシン、イブプロフェン、ジクロフェナッ
ク、フロセミド、ブメタニド、ブロモサルフォフタレイ
ン、コール酸、タウロコール酸など）はＯＡＴ４による
３Ｈ−エストロン硫酸の輸送を有意に阻害したが、テト
ラエチルアンモニウムのようなカチオン性物質および無
機硫酸は阻害作用を示さなかった。以上の結果から、Ｏ
ＡＴ４は多選択性有機アニオントランスポーターである
ことが判明した。
【００１８】本発明のＯＡＴ４が、エストロン硫酸及び
デヒドロエピアンドロステロン硫酸の二つの硫酸抱合体
の取り込み活性を示したため、各種硫酸抱合体およびグ
ルクロン酸抱合体がＯＡＴ４と相互作用を示すか否か
を、阻害実験により調べた。結果を図５に示す。この結
果、ミノキシジル硫酸を除く硫酸抱合体は全てＯＡＴ４
と相互作用を示した。一方、グルクロン酸抱合体は、α
ナフチルβグルクロナイド以外は、ＯＡＴ４と弱い相互
作用を示すのみであった。
デヒドロエピアンドロステロン硫酸の二つの硫酸抱合体
の取り込み活性を示したため、各種硫酸抱合体およびグ
ルクロン酸抱合体がＯＡＴ４と相互作用を示すか否か
を、阻害実験により調べた。結果を図５に示す。この結
果、ミノキシジル硫酸を除く硫酸抱合体は全てＯＡＴ４
と相互作用を示した。一方、グルクロン酸抱合体は、α
ナフチルβグルクロナイド以外は、ＯＡＴ４と弱い相互
作用を示すのみであった。
【００１９】次に、本発明のＯＡＴ４が、ヒト組織のど
の部位に発現しているかをノーザンブロット解析により
調べた。このノーザンブロットの結果を図６に示す。こ
の結果、本発明のＯＡＴ４は腎臓および胎盤のみにおい
て、強いバンドが検出され、本発明のＯＡＴ４が胎盤型
のものであることが判明した。したがって、本発明のＯ
ＡＴ４は、ヒトの胎盤型有機アニオントランスポーター
であり、本発明においてはこれを胎盤型有機アニオント
ランスポーターＯＡＴ４という。
の部位に発現しているかをノーザンブロット解析により
調べた。このノーザンブロットの結果を図６に示す。こ
の結果、本発明のＯＡＴ４は腎臓および胎盤のみにおい
て、強いバンドが検出され、本発明のＯＡＴ４が胎盤型
のものであることが判明した。したがって、本発明のＯ
ＡＴ４は、ヒトの胎盤型有機アニオントランスポーター
であり、本発明においてはこれを胎盤型有機アニオント
ランスポーターＯＡＴ４という。
【００２０】本発明のタンパク質としては、配列番号２
で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、
配列番号２で示されたアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸が欠失、置
換もしくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない
程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１
〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号
２で示されたアミノ酸配列と通常、〜７５％、好ましく
は〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、
配列番号２で示されたアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸が欠失、置
換もしくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない
程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１
〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号
２で示されたアミノ酸配列と通常、〜７５％、好ましく
は〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００２１】本発明において、ストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイ
ゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハ
イブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件
下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩
濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又は
これと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施でき
る。また、より高いストリンジェンシーを得るために
は、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶
液中で洗浄を行うことにより実施できる。本発明におけ
るストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーショ
ンし得る核酸とは、前記した条件下でハイブリダイゼー
ションし得るものが包含される。
下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイ
ゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハ
イブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件
下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩
濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又は
これと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施でき
る。また、より高いストリンジェンシーを得るために
は、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶
液中で洗浄を行うことにより実施できる。本発明におけ
るストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーショ
ンし得る核酸とは、前記した条件下でハイブリダイゼー
ションし得るものが包含される。
【００２２】本発明の有機アニオントランスポーター及
びその遺伝子は、ヒト以外に適当な哺乳動物の組織や細
胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことに
より単離取得することもできる。哺乳動物としては、イ
ヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、
ラット、マウスなどの非ヒト動物を用いることもでき
る。遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホモロジー
スクリーニングおよびＰＣＲスクリーニングなどにより
好適に実施できる。得られたｃＤＮＡについては、常法
により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これに
コードされるタンパク質、即ちＯＡＴ４のアミノ酸配列
を決定することができる。
びその遺伝子は、ヒト以外に適当な哺乳動物の組織や細
胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことに
より単離取得することもできる。哺乳動物としては、イ
ヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、
ラット、マウスなどの非ヒト動物を用いることもでき
る。遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホモロジー
スクリーニングおよびＰＣＲスクリーニングなどにより
好適に実施できる。得られたｃＤＮＡについては、常法
により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これに
コードされるタンパク質、即ちＯＡＴ４のアミノ酸配列
を決定することができる。
【００２３】得られたｃＤＮＡが有機アニオントランス
ポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、即ち、ｃＤＮＡ
にコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポー
ターであることは、例えば次のようにして検証すること
ができる。得られたＯＡＴ４ｃＤＮＡから調製したｃＲ
ＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオンを細
胞内に輸送する（取り込む）能力を、適当な有機アニオ
ンを基質とする通常の取り込み実験（Sekine,T.ら、J. B
iol Chem 272巻，18526-9頁、1997）により、細胞内へ
の基質取り込みを測定することにより確認できる。
ポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、即ち、ｃＤＮＡ
にコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポー
ターであることは、例えば次のようにして検証すること
ができる。得られたＯＡＴ４ｃＤＮＡから調製したｃＲ
ＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオンを細
胞内に輸送する（取り込む）能力を、適当な有機アニオ
ンを基質とする通常の取り込み実験（Sekine,T.ら、J. B
iol Chem 272巻，18526-9頁、1997）により、細胞内へ
の基質取り込みを測定することにより確認できる。
【００２４】また、前記した発現細胞に同様の取り込み
実験を応用して、ＯＡＴ４の輸送特性や基質特異性など
を調べることができる。得られたＯＡＴ４遺伝子のｃＤ
ＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤ
ＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーを
スクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生
物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することが
できる。
実験を応用して、ＯＡＴ４の輸送特性や基質特異性など
を調べることができる。得られたＯＡＴ４遺伝子のｃＤ
ＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤ
ＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーを
スクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生
物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することが
できる。
【００２５】また、開示された本発明の遺伝子の塩基配
列（配列番号１）に示された塩基配列、もしくはその一
部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用
い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺
伝子を単離することが出来る。ｃＤＮＡライブラリー及
びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリ
ーは例えば、「Molecular Cloning;Sambrook, J.,Frits
h,E.F.およびManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Labo
ratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調
製することができる。あるいは、市販のライブラリーが
ある場合にはこれを用いてもよい。
列（配列番号１）に示された塩基配列、もしくはその一
部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用
い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺
伝子を単離することが出来る。ｃＤＮＡライブラリー及
びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリ
ーは例えば、「Molecular Cloning;Sambrook, J.,Frits
h,E.F.およびManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Labo
ratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調
製することができる。あるいは、市販のライブラリーが
ある場合にはこれを用いてもよい。
【００２６】本発明の有機アニオントランスポーター
（ＯＡＴ４）は、例えば、有機アニオントランスポータ
ーをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術に
より生産することができる。例えば、有機アニオントラ
ンスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当
な発現ベクターに組み込み、得られた組み換えＤＮＡを
適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド
を生産するための発現系（宿主ベクター系）としては、
例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発
現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るた
めには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが望
ましい。
（ＯＡＴ４）は、例えば、有機アニオントランスポータ
ーをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術に
より生産することができる。例えば、有機アニオントラ
ンスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当
な発現ベクターに組み込み、得られた組み換えＤＮＡを
適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド
を生産するための発現系（宿主ベクター系）としては、
例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発
現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るた
めには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが望
ましい。
【００２７】例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現さ
せる場合には、有機アニオントランスポーターをコード
するＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウ
イルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワク
シニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の
適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター
等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、
得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し
て、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳
動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズ
ハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓
組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細
胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株が挙げられ
る。
せる場合には、有機アニオントランスポーターをコード
するＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウ
イルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワク
シニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の
適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター
等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、
得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し
て、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳
動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズ
ハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓
組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細
胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株が挙げられ
る。
【００２８】有機アニオントランスポーターＯＡＴ４を
コードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示
される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来る
ほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸
配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコード
するＤＮＡを用いることもできる。この場合、一つのア
ミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られてお
り、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に
利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の
高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を
もつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化
と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人
為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変を
コードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマー
を利用して部位変異導入法（sitespecific mutagenesi
s）「Mark,D.F.ら、Proc Natl Acad Sci USA 第18巻、56
62-5666頁、1984年」等により実施できる。
コードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示
される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来る
ほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸
配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコード
するＤＮＡを用いることもできる。この場合、一つのア
ミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られてお
り、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に
利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の
高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を
もつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化
と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人
為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変を
コードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマー
を利用して部位変異導入法（sitespecific mutagenesi
s）「Mark,D.F.ら、Proc Natl Acad Sci USA 第18巻、56
62-5666頁、1984年」等により実施できる。
【００２９】本発明の有機アニオントランスポーター遺
伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレ
オチド）は、有機アニオントランスポーター遺伝子を検
出するためのプローブとして使用できるほか、有機アニ
オントランスポーターの発現を変調させるために、例え
ばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリボザイム、デ
コイとして使用することもできる。このようなヌクレオ
チドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列
の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくは
その相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることがで
き、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分
配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは
３０塩基以上の配列を用いても良い。
伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレ
オチド）は、有機アニオントランスポーター遺伝子を検
出するためのプローブとして使用できるほか、有機アニ
オントランスポーターの発現を変調させるために、例え
ばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリボザイム、デ
コイとして使用することもできる。このようなヌクレオ
チドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列
の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくは
その相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることがで
き、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分
配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは
３０塩基以上の配列を用いても良い。
【００３０】また、本発明の有機アニオントランスポー
ターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチ
ドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、
有機アニオントランスポーターの検出や精製などに利用
できる。抗体は、本発明の有機アニオントランスポータ
ー、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチ
ド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗
体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を
接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造する
ことができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリド
ーマ法などの技術により製造できる。
ターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチ
ドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、
有機アニオントランスポーターの検出や精製などに利用
できる。抗体は、本発明の有機アニオントランスポータ
ー、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチ
ド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗
体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を
接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造する
ことができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリド
ーマ法などの技術により製造できる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく
説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもので
はない。なお下記実施例において、各操作は特に断りが
ない限り、「Molecular Cloning:Sambrook,J.,Fritsh,E.
F.およびManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Laborator
y Pressより1989年に発刊」に記載の方法により行う
か、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指
示書に従って使用した。
説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもので
はない。なお下記実施例において、各操作は特に断りが
ない限り、「Molecular Cloning:Sambrook,J.,Fritsh,E.
F.およびManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Laborator
y Pressより1989年に発刊」に記載の方法により行う
か、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指
示書に従って使用した。
【００３２】実施例１（多選択性有機アニオントランス
ポーター４（ＯＡＴ４）ｃＤＮＡの単離とその解析） 既に本発明者らが単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯ
ＡＴ３の塩基配列情報をもとに、公開されているＥＳＴ
データベースを探索した。この結果、ＯＡＴ１、ＯＡ
Ｔ２およびＯＡＴ３と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片
Ｈ１２８７６を得た。得られたＨ１２８７６を３２Ｐで
ラベルしたプローブを用いて、既に構築してあったヒト
腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイ
ブリダイゼーションは、５０℃のハイブリダイゼーショ
ン用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、５０
℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイ
ブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミ
ド、５×ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａ
ｔｅ（ＳＳＣ）、３×デンハード液、０．２％ＳＤＳ、
１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモ
ン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５
ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ Ｂ（シグ
マ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。
ポーター４（ＯＡＴ４）ｃＤＮＡの単離とその解析） 既に本発明者らが単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２およびＯ
ＡＴ３の塩基配列情報をもとに、公開されているＥＳＴ
データベースを探索した。この結果、ＯＡＴ１、ＯＡ
Ｔ２およびＯＡＴ３と相同性を有する新規ｃＤＮＡ断片
Ｈ１２８７６を得た。得られたＨ１２８７６を３２Ｐで
ラベルしたプローブを用いて、既に構築してあったヒト
腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイ
ブリダイゼーションは、５０℃のハイブリダイゼーショ
ン用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、５０
℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイ
ブリダイゼーション溶液としては、５０％ホルムアミ
ド、５×ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａ
ｔｅ（ＳＳＣ）、３×デンハード液、０．２％ＳＤＳ、
１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サーモ
ン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５
ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ Ｂ（シグ
マ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。
【００３３】λＺｉｐＬｏｘ中に単離されたクローン
は、in vivo excision法によりプラスミドベクタ−ｐＺ
Ｌにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオ
ン輸送活性を持つ新規ｃＤＮＡ（ｈＯＡＴ４ ｃＤＮ
Ａ）が得られた。上記により得られたｃＤＮＡ（ＯＡＴ
４ ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定は、特異的プライマー
を用いて、自動シークエンサー（アプライドバイオシス
テム社製）により行った。この塩基配列を配列表の配列
番号１に示す。
は、in vivo excision法によりプラスミドベクタ−ｐＺ
Ｌにさらにサブクローン化した。この結果、有機アニオ
ン輸送活性を持つ新規ｃＤＮＡ（ｈＯＡＴ４ ｃＤＮ
Ａ）が得られた。上記により得られたｃＤＮＡ（ＯＡＴ
４ ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定は、特異的プライマー
を用いて、自動シークエンサー（アプライドバイオシス
テム社製）により行った。この塩基配列を配列表の配列
番号１に示す。
【００３４】実施例２（ＯＡＴ４の機能の特定） ＯＡＴ４ ｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤ
ＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Sekine,T.,et al.
J. Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年参照）。得ら
れたｃＲＮＡを、既に報告されている方法に従い（Seki
ne,T., et al.J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997
年）、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵
母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンお
よび有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結
果、図１に示すようにＯＡＴ４を発現させた卵母細胞は
３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロエピアンドロス
テロン硫酸、３Ｈ−オクラトキシンＡの取り込みを示す
ことが判明した。これに対して代表的な有機カチオンで
ある１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）の取
り込みは認められなかった。
Ａポリメラーゼを用いて、インビトロでｃＲＮＡ（ｃＤ
ＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Sekine,T.,et al.
J. Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997年参照）。得ら
れたｃＲＮＡを、既に報告されている方法に従い（Seki
ne,T., et al.J Biol Chem 272巻、18526-9頁、1997
年）、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵
母細胞について放射能標識された種々の有機アニオンお
よび有機カチオンによる取り込み実験を行った。この結
果、図１に示すようにＯＡＴ４を発現させた卵母細胞は
３Ｈ−エストロン硫酸、３Ｈ−デヒドロエピアンドロス
テロン硫酸、３Ｈ−オクラトキシンＡの取り込みを示す
ことが判明した。これに対して代表的な有機カチオンで
ある１４Ｃ−ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）の取
り込みは認められなかった。
【００３５】 実施例３（ＯＡＴ４の有機アニオン輸送の動力学試験） ＯＡＴ４の有機アニオン輸送のミカエリスーメンテン動
力学試験を行った。種々の濃度のエストロン硫酸、デヒ
ドロエピアンドロステロン硫酸のＯＡＴ４による取り込
み量の変化を調べることにより、これらの基質のＯＡＴ
４による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識され
たエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸
の取り込み実験は、ＯＡＴ４ ｃＲＮＡを注入した卵母
細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果
（図２）、エストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステ
ロン硫酸の取り込みのＫｍ値はそれぞれ １．０１±
０．１５μＭ、０．６３±０．０４μＭであった。
力学試験を行った。種々の濃度のエストロン硫酸、デヒ
ドロエピアンドロステロン硫酸のＯＡＴ４による取り込
み量の変化を調べることにより、これらの基質のＯＡＴ
４による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識され
たエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロン硫酸
の取り込み実験は、ＯＡＴ４ ｃＲＮＡを注入した卵母
細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果
（図２）、エストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステ
ロン硫酸の取り込みのＫｍ値はそれぞれ １．０１±
０．１５μＭ、０．６３±０．０４μＭであった。
【００３６】実施例４（ＯＡＴ４の有機アニオン輸送に
おける陽イオン依存性試験） ＯＡＴ４の有機アニオン輸送におけるナトリウム依存性
を検討した。細胞外ナトリウムをリチウムおよびコリン
に置換しても、ＯＡＴ４を介したエストロン硫酸の輸送
に変化は無く、ＯＡＴ４が細胞外ナトリウム非依存性の
有機アニオントランスポーターであることが明らかにな
った（図３）。
おける陽イオン依存性試験） ＯＡＴ４の有機アニオン輸送におけるナトリウム依存性
を検討した。細胞外ナトリウムをリチウムおよびコリン
に置換しても、ＯＡＴ４を介したエストロン硫酸の輸送
に変化は無く、ＯＡＴ４が細胞外ナトリウム非依存性の
有機アニオントランスポーターであることが明らかにな
った（図３）。
【００３７】ＯＡＴ４の基質選択性をさらに検討するた
めに、ＯＡＴ４ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３
Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各
種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実
験）。３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ＯＡＴ
４ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法
に準じて実施した。５００μＭの各種化合物（非標識）
の存在下および非存在下で、５０ｎＭ ３Ｈ−エストロ
ン硫酸の取り込みを測定した。その結果、種々のアニオ
ン性物質（プロベネシド、ペニシリンＧ、インドメタシ
ン、イブプロフェン、ジクロフェナック、フロセミド、
ブメタニド、ブロモサルフォフタレイン、コール酸、タ
ウロコール酸など）はＯＡＴ４によるの３Ｈ−エストロ
ン硫酸の輸送を有意に阻害した（図３）。一方、テトラ
エチルアンモニウムのようなカチオン性物質および無機
硫酸は阻害作用を示さなかった（図４）。以上の結果か
ら、ＯＡＴ４は多選択性有機アニオントランスポーター
であることが判明した。
めに、ＯＡＴ４ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による３
Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験系において、系へ各
種アニオン性物質を添加し、その影響を調べた（阻害実
験）。３Ｈ−エストロン硫酸の取り込み実験は、ＯＡＴ
４ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法
に準じて実施した。５００μＭの各種化合物（非標識）
の存在下および非存在下で、５０ｎＭ ３Ｈ−エストロ
ン硫酸の取り込みを測定した。その結果、種々のアニオ
ン性物質（プロベネシド、ペニシリンＧ、インドメタシ
ン、イブプロフェン、ジクロフェナック、フロセミド、
ブメタニド、ブロモサルフォフタレイン、コール酸、タ
ウロコール酸など）はＯＡＴ４によるの３Ｈ−エストロ
ン硫酸の輸送を有意に阻害した（図３）。一方、テトラ
エチルアンモニウムのようなカチオン性物質および無機
硫酸は阻害作用を示さなかった（図４）。以上の結果か
ら、ＯＡＴ４は多選択性有機アニオントランスポーター
であることが判明した。
【００３８】実施例５（ＯＡＴ４の各種硫酸抱合体およ
びグルクロン酸抱合体の取り込み試験） ＯＡＴ４がエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステ
ロン硫酸の二つの硫酸抱合体の取り込み活性を示したた
め、各種硫酸抱合体およびグルクロン酸抱合体がＯＡＴ
４と相互作用を示すか否かを、阻害実験を用いて行っ
た。図５に示す通り、ミノキシジル硫酸を除く硫酸抱合
体は全てＯＡＴ４と相互作用を示した。一方、グルクロ
ン酸抱合体は、αナフチルβグルクロナイド以外は、Ｏ
ＡＴ４と弱い相互作用を示すのみであった。
びグルクロン酸抱合体の取り込み試験） ＯＡＴ４がエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステ
ロン硫酸の二つの硫酸抱合体の取り込み活性を示したた
め、各種硫酸抱合体およびグルクロン酸抱合体がＯＡＴ
４と相互作用を示すか否かを、阻害実験を用いて行っ
た。図５に示す通り、ミノキシジル硫酸を除く硫酸抱合
体は全てＯＡＴ４と相互作用を示した。一方、グルクロ
ン酸抱合体は、αナフチルβグルクロナイド以外は、Ｏ
ＡＴ４と弱い相互作用を示すのみであった。
【００３９】実施例６（ＯＡＴ４遺伝子のノーザンブロ
ッティング解析） ヒトの各組織におけるＯＡＴ４遺伝子の発現（ノーザン
ブロッティング）の解析を行った。ＯＡＴ４ ｃＤＮＡ
の全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブ
として用いて、ヒトの種々の組織から抽出したＲＮＡを
ブロッティングしたフィルター（クロンテック社製）の
ハイブリダイゼーションをおこなった。ＯＡＴ４ ｃＤ
ＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイ
ブリダイセーションを行い、フィルターを６５℃にて、
０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。ノー
ザンブロットの結果（図６）、腎臓および胎盤のみにお
いて、強いバンドが検出された。なお、図６中のブロッ
トは、左側から脳（brain）、心臓（heart）、骨格筋
（skeletal muscle）、結腸（colon）、胸腺（thymu
s）、脾臓（spleen）、腎臓（kidney）、肝臓（live
r）、小腸（small intestine）、胎盤（placenta）、肺
（lung）、末梢血白血球（peripheral blood leukocyte
s）を示す。
ッティング解析） ヒトの各組織におけるＯＡＴ４遺伝子の発現（ノーザン
ブロッティング）の解析を行った。ＯＡＴ４ ｃＤＮＡ
の全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブ
として用いて、ヒトの種々の組織から抽出したＲＮＡを
ブロッティングしたフィルター（クロンテック社製）の
ハイブリダイゼーションをおこなった。ＯＡＴ４ ｃＤ
ＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイ
ブリダイセーションを行い、フィルターを６５℃にて、
０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。ノー
ザンブロットの結果（図６）、腎臓および胎盤のみにお
いて、強いバンドが検出された。なお、図６中のブロッ
トは、左側から脳（brain）、心臓（heart）、骨格筋
（skeletal muscle）、結腸（colon）、胸腺（thymu
s）、脾臓（spleen）、腎臓（kidney）、肝臓（live
r）、小腸（small intestine）、胎盤（placenta）、肺
（lung）、末梢血白血球（peripheral blood leukocyte
s）を示す。
【００４０】
【発明の効果】本発明は、新規な胎盤型有機アニオント
ランスポーターＯＡＴ４及びそれをコードする遺伝子を
提供するものである。トランスポーターはチャネルと同
様に細胞の生命維持に必要な物質を取り込むための蛋白
質であり、その異常は種々の疾患の原因となっている。
とりわけ本発明の胎盤型有機アニオントランスポーター
ＯＡＴ４は腎臓や胎盤に選択的に発現するものであり、
この解明は各種腎疾患や胎児の生長異常などの予防治療
に有用となるものである。
ランスポーターＯＡＴ４及びそれをコードする遺伝子を
提供するものである。トランスポーターはチャネルと同
様に細胞の生命維持に必要な物質を取り込むための蛋白
質であり、その異常は種々の疾患の原因となっている。
とりわけ本発明の胎盤型有機アニオントランスポーター
ＯＡＴ４は腎臓や胎盤に選択的に発現するものであり、
この解明は各種腎疾患や胎児の生長異常などの予防治療
に有用となるものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> Placenta type organic anion transporter and its gene <130> PA900382 <160> 2 <210> 1 <211> 2210 <212> DNA <213> Human <400> 1 gttccaaaca gcagttaggt cagcagtccg ctcagccgag gcagctctgt tcatggcgtt 60 ctcgaagctc ttggagcaag ccggaggcgt gggcctcttc cagaccctgc aggtgctcac 120 cttcatcctc ccctgcctca tgataccttc ccagatgctc ctggagaact tctcagccgc 180 catcccaggc caccgatgct ggacacacat gctggacaat ggctctgcgg tttccacaaa 240 catgaccccc aaggcccttc tgaccatctc catcccgcca ggccccaacc aggggcccca 300 ccagtgccgc cgcttccgcc agccacagtg gcagctcttg gaccccaatg ccacggccac 360 cagctggagc gaagctgaca cggagccgtg tgtggacggc tgggtctatg accgcagcgt 420 cttcacctcc accatcgtgg ccaagtggga cctggtgtgc agctcccagg gcttgaagcc 480 cctaagccag tccatcttca tgtccgggat cctggtgggc tcctttatct ggggcctcct 540 ctcctaccgg tttgggagga agccgatgct gagctggtgc tgcctgcagt tggccgtggc 600 gggcaccagc accatcttcg ccccaacatt cgtcatctac tgcggcctgc ggttcgtggc 660 cgcttttggg atggccggca tctttctgag ttcactgaca ctgatggtgg agtggaccac 720 gaccagcagg agggcggtca ccatgacggt ggtgggatgt gccttcagcg caggccaggc 780 ggcgctgggc ggcctggcct ttgccctgcg ggactggagg actctccagc tggcagcatc 840 agtgcccttc tttgccatct ccctgatatc ctggtggctg ccagaatccg cccggtggct 900 gattattaag ggcaaaccag accaagcact tcaggagctc agaaaggtgg ccaggataaa 960 tggccacaag gaggccaaga acctgaccat agaggtgctg atgtccagcg tgaaggagga 1020 ggtggcctct gcaaaggagc cgcggtcggt gctggacctg ttctgcgtgc ccgtgctccg 1080 ctggaggagc tgcgccatgc tggtggtgaa tttctctcta ttgatctcct actatgggct 1140 ggtcttcgac ctgcagagcc tgggccgtga catcttcctc ctccaggccc tcttcggggc 1200 cgtggacttc ctgggccggg ccaccactgc cctcttgctc agtttccttg gccgccgcac 1260 catccaggcg ggttcccagg ccatggccgg cctcgccatt ctagccaaca tgctggtgcc 1320 gcaagatttgc agaccctgc gtgtggtctt tgctgtgctg ggaaagggat gttttgggat 1380 aagcctaacct gcctcacca tctacaaggc tgaactcttt ccaacgccag tgcggatgac 1440 agcagatggca ttctgcata cagtgggccg gctgggggct atgatgggtc ccctgatcct 1500 gatgagccgcc aagccctgc ccctgctgcc tcctctcctc tatggcgtta tctccattgc 1560 ttccagcctgg ttgtgctgt tcttcctccc ggagacccag ggacttccgc tccctgacac 1620 tatccaggacc tggagagcc agaaatcaac agcagcccag ggcaaccggc aagaggccgt 1680 cactgtggaaa gtacctcgc tctagaaatt gtgcctgcat ggagcccctt tagtcaaaga 1740 ctcctggaaa ggagttgcct cttctccaat cagagcgtgg aggcgagttg ggcgacttca 1800 agggcctggc atggcagagg ccaggcagcc gtggccgagt ggacagcgtg gccgtctgct 1860 gtggctgaag gcagcttcca cagctcactc ctcttctccc tgccctgatc agattcccca 1920 ccttacccgg gccctacagg agcctgtgca gatggccatg cccaaccaat aacgagacgg 1980 ttcccctccc tttccctgcc aggctcatgt ctttacacct tcactcagcc acgccaacca 2040 gagactgggt tccaatctca ccccaccaca tacagagccc tcatctgtga aatgagaatg 2100 atcacgtgac ccacccccca gggcaggtat cagggtgaac tgatcttagc accggccaaa 2160 taaatggaac ctgctgagag agctgccaga taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2210 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Ala Phe Ser Lys Leu Leu Glu Gln Ala Gly Gly Val Gly Leu 15 Phe Gln Thr Leu Gln Val Leu Thr Phe Ile Leu Pro Cys Leu Met 30 Ile Pro Ser Gln Met Leu Leu Glu Asn Phe Ser Ala Ala Ile Pro 45 Gly His Arg Cys Trp Thr His Met Leu Asp Asn Gly Ser Ala Val 60 Ser Thr Asn Met Thr Pro Lys Ala Leu Leu Thr Ile Ser Ile Pro 75 Pro Gly Pro Asn Gln Gly Pro His Gln Cys Arg Arg Phe Arg Gln 90 Pro Gln Trp Gln Leu Leu Asp Pro Asn Ala Thr Ala Thr Ser Trp 105 Ser Glu Ala Asp Thr Glu Pro Cys Val Asp Gly Trp Val Tyr Asp 120 Arg Ser Val Phe Thr Ser Thr Ile Val Ala Lys Trp Asp Leu Val 135 Cys Ser Ser Gln Gly Leu Lys Pro Leu Ser Gln Ser Ile Phe Met 150 Ser Gly Ile Leu Val Gly Ser Phe Ile Trp Gly Leu Leu Ser Tyr 165 Arg Phe Gly Arg Lys Pro Met Leu Ser Trp Cys Cys Leu Gln Leu 180 Ala Val Ala Gly Thr Ser Thr Ile Phe Ala Pro Thr Phe Val Ile 195 Tyr Cys Gly Leu Arg Phe Val Ala Ala Phe Gly Met Ala Gly Ile 210 Phe Leu Ser Ser Leu Thr Leu Met Val Glu Trp Thr Thr Thr Ser 225 Arg Arg Ala Val Thr Met Thr Val Val Gly Cys Ala Phe Ser Ala 240 Gly Gln Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Phe Ala Leu Arg Asp Trp 255 Arg Thr Leu Gln Leu Ala Ala Ser Val Pro Phe Phe Ala Ile Ser 270 Leu Ile Ser Trp Trp Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Leu Ile Ile 285 Lys Gly Lys Pro Asp Gln Ala Leu Gln Glu Leu Arg Lys Val Ala 300 Arg Ile Asn Gly His Lys Glu Ala Lys Asn Leu Thr Ile Glu Val 315 Leu Met Ser Ser Val Lys Glu Glu Val Ala Ser Ala Lys Glu Pro 330 Arg Ser Val Leu Asp Leu Phe Cys Val Pro Val Leu Arg Trp Arg 345 Ser Cys Ala Met Leu Val Val Asn Phe Ser Leu Leu Ile Ser Tyr 360 Tyr Gly Leu Val Phe Asp Leu Gln Ser Leu Gly Arg Asp Ile Phe 375 Leu Leu Gln Ala Leu Phe Gly Ala Val Asp Phe Leu Gly Arg Ala 390 Thr Thr Ala Leu Leu Leu Ser Phe Leu Gly Arg Arg Thr Ile Gln 405 Ala Gly Ser Gln Ala Met Ala Gly Leu Ala Ile Leu Ala Asn Met 420 Leu Val Pro Gln Asp Leu Gln Thr Leu Arg Val Val Phe Ala Val 435 Leu Gly Lys Gly Cys Phe Gly Ile Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ile 450 Tyr Lys Ala Glu Leu Phe Pro Thr Pro Val Arg Met Thr Ala Asp 465 Gly Ile Leu His Thr Val Gly Arg Leu Gly Ala Met Met Gly Pro 480 Leu Ile Leu Met Ser Arg Gln Ala Leu Pro Leu Leu Pro Pro Leu 495 Leu Tyr Gly Val Ile Ser Ile Ala Ser Ser Leu Val Val Leu Phe 510 Phe Leu Pro Glu Thr Gln Gly Leu Pro Leu Pro Asp Thr Ile Gln 525 Asp Leu Glu Ser Gln Lys Ser Thr Ala Ala Gln Gly Asn Arg Gln 540 Glu Ala Val Thr Val Glu Ser Thr Ser Leu * 550
【図１】図１は、本発明ＯＡＴ４をアフリカツメガエル
卵母細胞に発現させた時の、有機アニオン取り込み活性
を示すものである。
卵母細胞に発現させた時の、有機アニオン取り込み活性
を示すものである。
【図２】図２は、本発明ＯＡＴ４を発現させた卵母細胞
を用いたエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロ
ン硫酸の輸送の動力学試験の結果を示すものである。
を用いたエストロン硫酸、デヒドロエピアンドロステロ
ン硫酸の輸送の動力学試験の結果を示すものである。
【図３】図３は、本発明ＯＡＴ４を発現させた卵母細胞
を用いたエストロン硫酸の輸送における各種陽イオンの
存在による影響を示したものである。
を用いたエストロン硫酸の輸送における各種陽イオンの
存在による影響を示したものである。
【図４】図４は、本発明のＯＡＴ４の有機アニオン輸送
における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示す
ものである。
における、各種有機物質の阻害作用の試験の結果を示す
ものである。
【図５】図５は、各種硫酸抱合体およびグルクロン酸抱
合体による、ＯＡＴ４の輸送阻害試験の結果を示すもの
である。
合体による、ＯＡＴ４の輸送阻害試験の結果を示すもの
である。
【図６】図６は、本発明のＯＡＴ４遺伝子のノーザンブ
ロッティング解析の結果を示す図面に代わる写真であ
る。
ロッティング解析の結果を示す図面に代わる写真であ
る。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA11 DA02 GA12 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ03 QQ53 QR55 QS34 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA75 EA50 FA72 FA74
Claims (9)
- 【請求項１】 胎盤型有機アニオントランスポーターＯ
ＡＴ４。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のア
ミノ酸で置換もしくは付加されてもよいアミノ酸配列を
有する請求項１に記載の胎盤型有機アニオントランスポ
ーターＯＡＴ４。 - 【請求項３】 エストロン硫酸、デヒドロエピアンドロ
ステロン硫酸、及び／又はオクラトキシンＡを輸送する
能力を有する請求項１又は２に記載の胎盤型有機アニオ
ントランスポーターＯＡＴ４。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のア
ミノ酸で置換もしくは付加されていてもよいアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードする塩基配列又はそれとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列
を有する核酸。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有するＤＮＡである請求項４に記載の核酸。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有するＤＮＡの連続する少なくとも１４塩基またはそ
の相補鎖よりなる核酸。 - 【請求項７】 塩基の数が２０以上である請求項６に記
載の核酸。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれかに記載の胎盤型
有機アニオントランスポーターＯＡＴ４をコードする遺
伝子の存在を検出、同定又は定量するためのプローブと
して使用されるための請求項６又は７に記載の核酸。 - 【請求項９】 請求項１〜３のいずれかに記載の胎盤型
有機アニオントランスポーターＯＡＴ４を認識し得る抗
体。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18724499A JP4435334B2 (ja) | 1999-07-01 | 1999-07-01 | 胎盤型有機アニオントランスポーターとその遺伝子 |
| CA002340795A CA2340795C (en) | 1999-07-01 | 2000-06-15 | Placental organic anion transporter and gene thereof |
| DE60038531T DE60038531T2 (de) | 1999-07-01 | 2000-06-15 | Transporter organischer anionen der plazenta und dessen gen |
| US09/786,261 US6673898B1 (en) | 1999-07-01 | 2000-06-15 | Placental organic anion transporter |
| EP00939064A EP1108784B1 (en) | 1999-07-01 | 2000-06-15 | Placental organic anion transporter and gene thereof |
| PCT/JP2000/003878 WO2001002562A1 (fr) | 1999-07-01 | 2000-06-15 | Transporteur d'anion organique placentaire et son gene |
| US10/339,513 US7393939B2 (en) | 1999-07-01 | 2003-01-09 | Placental organic anion transporter and gene thereof |
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|---|---|---|---|
| JP18724499A JP4435334B2 (ja) | 1999-07-01 | 1999-07-01 | 胎盤型有機アニオントランスポーターとその遺伝子 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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- 2000-06-15 WO PCT/JP2000/003878 patent/WO2001002562A1/ja active IP Right Grant
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- 2000-06-15 CA CA002340795A patent/CA2340795C/en not_active Expired - Fee Related
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2003
- 2003-01-09 US US10/339,513 patent/US7393939B2/en not_active Expired - Lifetime
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