JP2001008688A - ミスマッチプライマーおよびそれを用いたウシＰＰＡＲγ２変異体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウシの脂肪交雑のマスターキーと言われてい
るＰＰＡＲγ遺伝子の変異体を正確、かつ迅速に検出す
る方法を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
するミスマッチプライマー、並びに、該ミスマッチプラ
イマーを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を行い、得られた増
幅産物を電気泳動分析することを特徴とするウシＰＰＡ
Ｒγ２変異体の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ミスマッチプライ
マーおよびそれを用いたウシＰＰＡＲγ２変異体の検出
方法に関し、詳しくは、ミスマッチプライマーおよび該
プライマーを用いてウシＰＰＡＲγ２変異体を検出する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】脂肪交雑は牛肉の肉質を判定する場合の
重要な因子の一つであり、現在では牛肉の価格の最大の
決定要因である。そのため、脂肪交雑の多い優れた形質
を有するウシの選抜は、肉用種の肥育にとって重要なこ
とである。これまでに、脂肪交雑の形成や、他の因子と
の関連等について種々の検討がなされている。

【０００３】脂肪交雑の実体は、筋肉内の脂肪組織であ
り（岡田光男編、「肥育のすすめ」、ｐ43-47 、チクサ
ン出版、1991）、その形成には未分化な脂肪前駆細胞の
増殖と脂肪細胞への分化が関与していると推定されてい
る（河田照雄、最新医学、52: 20-28 、1997) 。脂肪交
雑の形成機構については、遺伝的な要因が関係している
と言われているが、その詳細はまだ明らかでなく、脂肪
交雑の形成機構の解明と優れた脂肪交雑を示す肉用種の
迅速な判定法の確立が望まれている。

【０００４】脂肪交雑と関連する遺伝子の探索も行われ
ているが、ウシ染色体上にマーカーを付け、遺伝子の住
所録を作るという最も確実な方法はまだ進展しておら
ず、成長ホルモン遺伝子の多型（個体変異）に基づく方
法が現在検討されている。しかしながら、成長ホルモン
の直接的作用は成長促進であって、脂肪の蓄積は間接的
効果にすぎない。また、この方法は、全牛を「成長型」
と「脂肪交雑型」のいずれかに分類するにとどまり、精
度が低かった。

【０００５】近年、分子遺伝学的手法の導入により脂肪
細胞の分化過程に関する研究が飛躍的に進展し、ＰＰＡ
Ｒγ遺伝子が脂肪細胞分化のマスターレギュレーターの
一つであることが明らかにされている（高田伊知男ほ
か、最新医学、52: 12-19 、1997) 。さらに、ウシＰＰ
ＡＲγ遺伝子の塩基配列が解明されている（Sundvold
H., Biochem. Biophys. Res. Com., 239: 857-861, 199
7) 。また、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現が、ビタミンＡ酸
により阻害されることが細胞レベルで報告され（Xue J.
C et al., Molecular and Cellular Biol., 16: 1567-1
575, 1996)、和牛の低ビタミン状態肥育にＰＰＡＲγ遺
伝子が関与している可能性も十分に考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ウシ
の遺伝的情報に基づいて、良好な脂肪交雑を示すことが
間接検定により確認されている種雄牛と同等の遺伝的変
異を持つ個体を正確に、かつ簡易に選抜するために有効
な手段を提供することである。

【０００７】上記の課題を解決するために検討を重ね、
本発明者らは、ウシの脂肪細胞分化のマスターキーとい
われているＰＰＡＲγ遺伝子に注目した。上述したよう
に、ウシのＰＰＡＲγ遺伝子の塩基配列は、すでに解明
されているが、黒毛和種は、肉用種の中でもとりわけ高
い脂肪交雑を有する品種であるために、該遺伝子の配列
の一部に、他の品種と区別し得る特異なものが存在する
可能性があると考えた。

【０００８】そこで、本発明者らは、黒毛和種のＰＰＡ
Ｒγ遺伝子の転写産物の一つであるＰＰＡＲγ２（Zhu
Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7921-79
25、1995)の部分配列についてシークエンスを行い、報
告されている塩基配列（Sundvold H., Biochem. Biophy
s. Res. Com., 239: 857-861、1997）との比較を行った
ところ、アミノ酸配列の一部が置換された変異体が存在
する場合があることを見出した。

【０００９】しかしながら、この変異は、同じ遺伝子座
の対立遺伝子の一方が正常で、一方が変異を示すヘテロ
変異であるために、単に各個体のＤＮＡの塩基配列を直
接決定しただけでは、両者が混合した状態で生ずるの
で、変異を特定できない。そのため、さらにプラスミド
へのサブクローニングを行い、改めて塩基配列を決定し
なおす必要があり、煩雑な操作と長時間を必要とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく、
本発明者らは鋭意検討の結果、ＰＰＡＲγ２変異体の塩
基配列の一部を改変することにより、変異が起きていな
いものとの区別が可能であることを見出した。本来な
ら、ＰＰＡＲγ２変異体および該変異を生じていないも
のの何れにも、制限酵素の特異的切断部位は存在しな
い。しかし、両者の塩基配列の一部を改変すると、変異
体にのみ制限酵素サイトが出現する。

【００１１】本発明者らは、ＰＰＡＲγ２変異体の配列
を基にして、このサイトを導入するためのミスマッチプ
ライマーを設計した。このミスマッチプライマーを用い
たＰＣＲ−ＲＦＬＰ（restriction fragment length po
lymorphism）法（Haliassos,A. et al., Nucleic Acids
Research, 17: 3606, 1989; Haliassos A. et al.,Nuc
leic Acids Research, 17: 8093-8099, 1989; 川上文清
ほか、細胞工学、15:1637-1643, 1996)により、目的と
する変異体の検出が可能である。

【００１２】ここで、ＲＦＬＰとは、ある制限酵素によ
りＤＮＡを切断した場合、ＤＮＡ塩基配列に変異がある
場合に制限酵素断片の長さが違ってくる性質を言う。ま
た、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とは、このＲＦＬＰをＰＣＲ法
と組み合わせることにより、目的とする領域を増幅した
のち、突然変異の有無を検出する手法を言う。

【００１３】本発明者らは、上記のようにしてミスマッ
チプライマーを作り出し、これを用いたＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法により、脂肪細胞分化との関連が示唆されるＰＰＡ
Ｒγ２変異体を正確、簡便かつ迅速に検出可能であるこ
とを見出した。

【００１４】すなわち、請求項１記載の本発明は、配列
表の配列番号１記載の塩基配列を有するミスマッチプラ
イマーである。請求項２記載の本発明は、請求項１記載
のミスマッチプライマーを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を
行い、得られた増幅産物を電気泳動分析することを特徴
とするウシＰＰＡＲγ２変異体の検出方法である。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明について、詳細に説明す
る。脂肪細胞分化のマスターキーとなるとされるウシＰ
ＰＡＲγ遺伝子の塩基配列は、既に発表されている（Su
ndvold H., Biochem. Biophys. Res. Com., 239: 857-8
61，1997）。ＰＰＡＲγ遺伝子の産物には、使用される
プロモーターの違いからγ１型とγ２型が存在する（Zh
u Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7921-792
5、1995) 。γ１型は、１、２、３、４、５および６の
６個のエキソンからなるのに対し、γ２型は、さらにＢ
１を加えた７個のエキソンからなり、Ｂ１エキソンがγ
２型に特異的である。γ２型は、マウスにおいては脂肪
細胞の分化に直接に関与し、脂肪組織での発現が顕著で
あるとされる（Tontonoz P. et al., Genes and Develo
pment, 8: 1224-1234 、994)など、γ１型とγ２型では
互いに異なる生理作用を有するものと考えられる。

【００１６】１、２、３、４、５および６の各エキソン
は、種間で保存性が高いのに対し、Ｂ１エキソンは種間
で変異が多いことが知られ、塩基配列の知られているマ
ウス、ヒト、ウシの間で６０％前後の保存性が報告され
ている（Tontonoz P. et al., Genes and Development,
8: 1224-1234 、1994; Yanase T. et al., Biochem.Bi
ophys. Res. Com., 233: 320-324 、1997; Sundvold H.
et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 239: 857-861
、1997）。

【００１７】前記したように、ウシのＰＰＡＲγ２型の
塩基配列は既に発表されているが、ウシの中でも黒毛和
種は脂肪交雑について顕著な形質を有することから、黒
毛和種の場合は、マスターキーに相当するＰＰＡＲγ２
に変異が存在する可能性があると本発明者らは予測し
た。

【００１８】そこで、本発明者らは、以下のようにして
黒毛和種のＰＰＡＲγ遺伝子の産物の一つを決定し、該
配列を報告されている塩基配列と比較することとした。 （１）ＲＮＡの調製とＲＴ−ＰＣＲ まず、黒毛和種から腎臓脂肪を取り出し、常法により全
ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡから、フォアードプライ
マーＰ１（配列表の配列番号２参照）およびリバースプ
ライマーＰ２（配列表の配列番号３参照）を用いて、Ｐ
ＰＡＲγ２の部分配列をＲＴ−ＰＣＲキット（宝酒造株
式会社製）により増幅した。なお、ＰＣＲ反応に用いた
フォアードプライマーＰ１（配列表の配列番号２参照）
とリバースプライマーＰ２（配列表の配列番号３参照）
は、ＰＰＡＲγ２特異的部位を含む２３９ｂｐを増幅す
ることができるように、本発明者らが設計したものであ
る。

【００１９】（２）シークエンスとクローニング 本発明者らが、ＲＴ−ＰＣＲの結果得られたＰＰＡＲγ
２の部分配列１８７塩基を、既に報告されているＰＰＡ
Ｒγ２のｃＤＮＡの塩基配列（Sundvold H. etal., Bio
chem. Biophys. Res. Com., 239: 857-861 、1997）と
比較した結果、１８番目のアミノ酸に変異を持つ個体の
存在が明らかとなった。この変異体はヘテロ体であるこ
とが確認され、ベクターにクローニング後、シークエン
ス反応によりその変異配列の確定を行ったところ、配列
表の配列番号４に記載の配列が得られた。すなわち、変
異体ではＰＰＡＲγのγ２特異的エキソン（Ｂ１）内の
１８番目のアミノ酸が、ＧＣＴにより表現されるアラニ
ンからＧＴＴにより表現されるバリンに変化しているこ
とが示された（配列表の配列番号４に記載の塩基配列の
１８番目）。

【００２０】今回、本発明者らが変異の存在を解明した
部位は、上記の通り、ＰＰＡＲγ２配列中でも種間変異
の多いＢ１エキソン内であった。具体的には、アラニン
からバリンへの変異であるが、このような変異の存在が
許容されたのは、アミノ酸側鎖としての性質が大きく変
わらないからと推定される。しかしながら、Ｂ１エキソ
ンがＰＰＡＲγ２特異的部位であること（Zhu Y. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7921-7925、1995)
、Ｂ１エキソン内にはアミノ酸がわずか３０個しかな
いこと（Sundvold H. et al., Biochem. Biophys. Res.
Com., 239: 857-861 、1997）を考慮すると、アミノ酸
が１個でも別の種類のものに代わることにより、タンパ
ク質の性質に与える影響は大きい。

【００２１】ＰＰＡＲγ２変異体では、この３０個のア
ミノ酸のうちの１８番目のアミノ酸がアラニンからバリ
ンに変換している。この部位に相当するアミノ酸は、マ
ウスでもアラニンであり、ウシとマウスの系統上の距離
を考慮すると、比較的保存されているアミノ酸であるも
のと思われる。したがって、このようなアミノ酸に生ず
る変異は、ウシの中でも珍しいと思われ、ＰＰＡＲγ２
の生理作用である脂肪細胞の分化制御に特異性がある可
能性が考えられる。

【００２２】本発明者らは、上記ＰＰＡＲγ２変異体を
有する変異個体と、該変異体を有しない正常個体との形
質の差を調べた。その結果、変異個体の中に、正常個体
と比較して、間接検定において良好な脂肪交雑、すなわ
ち良好なBeef Marbling Standard（牛脂肪交雑基準；Ｂ
ＭＳ）を示すことが明らかな種雄牛が存在すること、お
よびその変異体がその子孫に受け継がれていることを確
認した。本発明は、このようなＰＰＡＲγ２変異体の検
出を正確、迅速、かつ簡便に行うための手段を提供する
ものである。

【００２３】本発明の検出方法は、以下のような手順で
行うことができる。 （１）ＤＮＡの調製 調査対象であるウシ個体から常法に従いＤＮＡを調製す
る。本発明者らは、後述の実施例で示すように、黒毛和
種から採取した血液よりＤＮＡの精製を行った。

【００２４】（２）ミスマッチプライマーの設計 ＰＰＡＲγ２の各個体の通常の塩基配列（Sundvold H.
et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 239: 857-861
、1997）およびヘテロ変異体の塩基配列（配列表の配
列番号４参照）を検討したが、いずれも変異部位近傍に
制限酵素サイトは存在しない。しかしながら、本発明者
らの検討の結果、ヘテロ変異体の変異部位の３塩基下流
のチミン（配列表の配列番号４の塩基配列の６２番目）
をアデニンに変換すると、配列表の配列番号４の塩基配
列の６０番目と６１番目の塩基の間に Hinc II切断部位
が現れることが判明した。

【００２５】そこで、本発明者らは、このようなＰＰＡ
Ｒγ２の変異に基づく制限酵素切断部位の特性を生かし
て、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により変異の有無を検出すべ
く、そのような制限酵素断片を導入可能なミスマッチプ
ライマーについて検討した。その結果、ミスマッチプラ
イマーＰ３が得られた（配列表の配列番号１参照）。す
なわち、これが請求項１記載の本発明のミスマッチプラ
イマーである。

【００２６】ミスマッチプライマーＰ３は、ＰＰＡＲγ
２変異体のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号４参照）
の１塩基下流から２６塩基下流までの２５塩基に相補的
で、かつ変異部位の３塩基下流相当部位のみチミンに代
えた２６塩基のリバースプライマーである。請求項１記
載のミスマッチプライマーＰ３をリバースプライマーと
して用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を行うことにより、変異
体でのみ増幅産物に Hinc II切断部位の導入が可能であ
る。

【００２７】なお、本発明者らは、ミスマッチプライマ
ーＰ３を設計するにあたり、ＤＮＡからの直接検出を実
現すべく、以下の点にも配慮した。ＰＰＡＲγ２のアミ
ノ酸配列（配列表の配列番号４）において、エキソンＢ
１とエキソン１の境目となっているのは、３０番目のス
レオニンと３１番目のメチオニンの間である。ＤＮＡ上
では、この間に長大なイントロンが含まれていることに
なる。

【００２８】したがって、ミスマッチプライマーの設計
を、このエキソンとイントロンの境界を越えて３１番目
以降のアミノ酸にかかる部分から行うと、長大なイント
ロンを含むＰＣＲを行う必要が生じ、ＤＮＡからの直接
検出が事実上困難となる。

【００２９】さらに、ＤＮＡから直接検出可能とするこ
とにより、ＲＮＡからの検出と比較して逆転写酵素によ
る操作を省略することができる。それと同時に、ＲＮＡ
と比較してＤＮＡの方が安定性が高いことから、取扱の
点で難がない。したがって、この工夫により本発明の検
出方法による変異の検出を、一層迅速、簡便に行うこと
ができる。

【００３０】（３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法の適用 上記のように設計したミスマッチプライマーを用いて、
ＰＣＲ−ＲＦＬＰを行う。ここで、上記請求項１記載の
ミスマッチプライマーに対するフォーワードプライマー
は、ＰＰＡＲγ２変異体の変異部位である１８番目のア
ミノ酸より上流で、かつ、ミスマッチプライマーとの間
に２以上の Hinc II切断部位が生じないように設定すれ
ば特に制限はない。本発明者らは、先に用いたプライマ
ーＰ１を用いた。

【００３１】得られるＰＣＲ産物について、対応する制
限酵素 Hinc II処理後、得られる断片の大きさを確認す
ることにより、変異を検出することができる。なお、酵
素断片の大きさを確認するためには、切断前のものと比
較して、サイズにある程度差が生ずるように注意する必
要がある。そのためには、フォーワードプライマーを、
ＰＰＡＲγ２のどの部分をもとにするか検討する必要が
ある。

【００３２】仮に、プライマーＰ１（配列表の配列番号
１参照）より１００ｂｐ上流に（ただし、この１００ｂ
ｐの間には Hinc II切断部位がないものとする。）フォ
ーワードプライマーを設定し、プライマーＰ３とのＰＣ
Ｒで１８５ｂｐを増幅したとすると、制限酵素切断断片
の大きさは、１６０ｂｐと２５ｂｐとになる。この場
合、電気泳動では、２５ｂｐの検出は難しいので、１６
５ｂｐの大きさのバンドを酵素切断前の増幅産物１８５
ｂｐと比較することになるが、大きさがそれほど違わな
いので、両者を鮮明に分離できないことになる。先に挙
げたプライマーＰ１（配列表の配列番号２参照）は、こ
のような条件を満たすものである。

【００３３】このプライマーＰ１と、ミスマッチプライ
マーＰ３との間でＰＣＲを行った後、制限酵素 Hinc II
切断を行った場合、正常個体では切断が起こらず、変異
個体でのみ切断部位が出現するとともに、得られる切断
断片は、それぞれ８５ｂｐと６５ｂｐであり、後者は前
者の７１％の大きさとなり、電気泳動で分離可能であ
る。

【００３４】このように、得られるＰＣＲ産物につい
て、対応する制限酵素 Hinc II処理後、得られる断片の
大きさを確認することにより、変異を検出することがで
きる。すなわち、変異体の場合には、制限酵素断片が生
じる（図１のレーン４および５参照）のに対し、変異が
生じていない場合には、該断片は生じない（図１のレー
ン６〜８参照）。このようにして、請求項１記載の本発
明のミスマッチプライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
によりＰＰＡＲγ２変異体を検出する方法が、請求項２
記載の本発明の方法である。

【００３５】ウシＰＰＡＲγ２の変異については、今の
ところ報告がなく、本発明者らが初めて明らかにしたも
のである。この本発明者らが見いだしたウシＰＰＡＲγ
２の変異の検出に、従来の方法を採用すると、ウシのＰ
ＰＡＲ遺伝子をプラスミドにサブクローニングした後、
改めてＰＰＡＲγ２の部分塩基配列を決定し、ヘテロ変
異を確認すると言う、煩雑な手間と長時間が必要であっ
た。これに対して、本発明の方法によれば、ＰＰＡＲγ
２変異体を有するウシを、簡易な操作で、かつ迅速に検
出することができる。

【００３６】なお、本発明の検出方法を実際に行った結
果、ＰＰＡＲγ２変異体を有する個体として、良好な脂
肪交雑を示すことが間接検定の結果証明されている種雄
牛の存在が確認された。また、その子孫に当たる個体も
該変異体を有していることが分かった。このことから、
上記した本発明の方法により変異体を検出することによ
り、該変異を有するウシを、良好な脂肪交雑を有するこ
とが間接検定の結果明らかな種雄牛と同等の遺伝的変異
を持つ個体として選抜することが可能性である。

【００３７】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３８】実施例１ （１）ＲＮＡの調製とＲＴ−ＰＣＲの実施 農林水産省中国農業試験場で飼養している４０頭の黒毛
和種を放血により屠殺後、直ちに腎臓脂肪を取り出し、
細断した。その後、これを液体窒素で凍結し、保存し
た。組織は、凍結状態のまま粉砕し、トリゾル試薬（Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
次いで、ＰＰＡＲγ２の部分配列をＲＴ−ＰＣＲキット
（宝酒造（株）製）を用いて増幅した。逆転写反応は５
５℃で２０分間行い、ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラー
ゼを用い、９４℃で２分間の熱処理後、９４℃で１分
間、５５℃で１分間、７２℃で１分間のセットを３０サ
イクル行った。ＰＣＲ反応に用いたフォアードプライマ
ーＰ１（配列表の配列番号２参照）とリバースプライマ
ーＰ２（配列表の配列番号３参照）は、ＰＰＡＲγ２特
異的部位を含む２３９ｂｐを増幅することができるよう
に、本発明者らが設計したものである。

【００３９】（２）シークエンスとクローニング 上記（１）のＲＴ−ＰＣＲ法により得られたＰＰＡＲγ
２の部分配列１８７塩基を、ウシのＰＰＡＲγ２のｃＤ
ＮＡの塩基配列（Sundvold, H. et al., Biochem. Biop
hys. Res. Com., 239: 857-861, 1997）と比較した結
果、１８番目のアミノ酸に変異を持つ個体の存在が明ら
かとなった。このＰＰＡＲγ２変異体はヘテロ体であっ
た。そこで、クローニング後にシークエンスを行い、変
異配列の確定を行った。すなわち、まず、（１）のＲＴ
−ＰＣＲ法により特異的に増幅したＤＮＡ断片を、アガ
ロースゲルより切り出し、分離精製後、シークエンス用
テンプレートとして用いた。シークエンス反応は、PRIS
M Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit withAmpl
i Taq FS （Perkin-elmer Applied Biosystems 社製）
により行い、ＤＮＡシークエンサー（Perkin-elmer App
lied Biosystems 社製377XL)で配列を決定した。

【００４０】シークエンスによりヘテロ体であることが
確認されたＰＣＲ産物については、その塩基配列を決定
すべく、pT7 blue-Tベクターにクローニング後、さらに
シークエンス反応を行った。得られたヘテロ体の塩基配
列を配列表の配列番号４に示す。その結果、ＰＰＡＲγ
２変異体ではＰＰＡＲγのγ２特異的エキソン（Ｂ１）
内の１８番目のアミノ酸が、ＧＣＴにより表現されるア
ラニンからＧＴＴにより表現されるバリンに変化してい
ることが示された（配列表の配列番号４記載のアミノ酸
配列中、１８番目のアミノ酸残基部分参照）。

【００４１】（３）ミスマッチプライマーの設計および
簡易検出法の有効性の検討 上記ＤＮＡについて、本発明の変異体検出方法を実施
し、該方法の有効性を検討することにした。すなわち、
得られたＤＮＡを用いて、ミスマッチプライマーを用い
たＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用し、変異個体の簡易検出を
行った。まず、黒毛和種（農林水産省中国農業試験場で
飼養）４０頭の頚動脈から血液を採取した。全血１００
μＬから、ＤＮＡ精製キットGen とるくん（宝酒造
（株）製）を用いてＤＮＡの精製を行った。

【００４２】上記（２）において明らかにされた各個体
の通常の塩基配列およびヘテロ体の塩基配列をみると、
共に変異部位近傍に制限酵素サイトは存在しなかった。
しかしながら、後者では変異部位の３塩基下流のチミン
（配列表の配列番号４の塩基配列の６２番目）をアデニ
ンに変換すると、 Hinc II切断部位が現れる（配列表の
配列番号４の塩基配列の６０番目と６１番目の間参
照）。

【００４３】そこで、本発明者らは、配列表の配列番号
１に示す塩基配列を有するミスマッチプライマーＰ３を
作成した。すなわち、変異個体のＤＮＡ塩基配列（配列
表の配列番号４参照）の変異部位の１塩基下流から２６
塩基下流までの２５塩基に相補的で、かつ変異部位の３
塩基下流相当部位のみＴに代えた２６塩基のリバースプ
ライマーである。

【００４４】（４）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により得られる
変異体の検出 上記ミスマッチプライマーＰ３とあわせて、フォアード
プライマーとしてＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーＰ１
（配列表の配列番号２参照）を用い、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は９４℃で２分間の熱処理後、９４℃で１分
間、５５℃で１分間、７２℃で１分間のセットを３３サ
イクル行った。ＰＣＲ産物は、 Hinc IIで３７℃にて２
時間処理後、６％アクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。

【００４５】このミスマッチプライマーを用いたＰＣＲ
−ＲＦＬＰ法を行った結果、８５ｂｐ、６０ｂｐ、２５
ｂｐのバンドが出現したものがあり、ヘテロの変異の存
在が明らかとなった。ヘテロ変異体を有する変異個体の
うち２頭の結果を、図１の電気泳動写真のレーン４およ
びレーン５に示す。

【００４６】これらヘテロ変異体を有する２頭の電気泳
動の結果とあわせて、切断が見られなかった正常個体３
頭の結果を図１のレーン６、レーン７、レーン８に示
す。また、図１において、正常配列を含むプラスミドに
８５ｂｐのメインバンド以外の非特異的なバンドの増幅
が見られたが（図１のレーン３参照）、正常ウシ個体の
分析には支障がなかった（図１のレーン６、レーン７、
レーン８参照）ことから、非特異的なバンドの出現はプ
ラスミドの塩基配列に原因があるものと推定される。

【００４７】このように、ミスマッチプライマーＰ３を
リバースプライマーとして用いることにより、適当なフ
ォアードプライマーとの間の増幅産物に Hinc II切断部
位が導入されているはずである。そこで、実際に変異配
列が切断されるか否かの確認を行うことにした。クロー
ニングで変異を確認済みのプラスミドをＤＮＡテンプレ
ートとして用い、ミスマッチプライマーを用いたＰＣＲ
−ＲＦＬＰ法を適用した。ＰＣＲの条件等は、上記した
条件と基本的には同じである。その結果、ＰＣＲ産物の
切断が起こり、６０ｂｐと２５ｂｐの２本のバンドが出
現した。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にか
けた結果を図１のレーン２に示す。

【００４８】一方、クローニングで野生型を導入したプ
ラスミドをＤＮＡテンプレートとして用いた結果、ＰＣ
Ｒ産物は切断されず、８５ｂｐのメインバンドが観察さ
れた。結果は図１のレーン３に示す通りである。以上の
結果から、ミスマッチプライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦ
ＬＰ法が変異体の検出に有効であることが確認された。

【００４９】図１に示す変異個体と認定された２頭は、
繁殖牛である母牛とその子である肥育牛（肥育期間２８
ヵ月）である。肥育牛のＢＭＳは６であり、比較的良好
な脂肪交雑を示すものと認められた。一方、この繁殖牛
の父（肥育牛の祖父）について、ＰＰＡＲγ２変異の存
在を確認した結果、同様にヘテロ変異体であることが確
認された。この牛は、間接検定の結果良好なＢＭＳを示
すことが確認され、良好な脂肪交雑を有することが遺伝
的に証明された但馬系種雄牛であり、現在までに精液２
７００本以上が出荷されている。このことから、種雄牛
から受け継いだＰＰＡＲγ２のヘテロ変異体遺伝子が、
１／２の確率で子孫に受け継がれ、母子２頭で発現して
いることが明らかである。

【００５０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、特定のミスマッ
チプライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を利用するこ
とから、ＰＰＡＲγ２変異体を正確、迅速かつ簡便な操
作で検出することが可能である。ウシにおけるＰＰＡＲ
γ２変異については、今回、本発明者らが初めて見いだ
したものである。このような変異を検出するために、従
来であれば、プラスミドへサブクローニングした後、改
めて塩基配列を決定し、変異を確認する必要があった。
しかし、本発明によれば、血液１ｍＬで変異の判定がで
きるため、生後間もない個体であっても、変異体の検出
が可能である。

【００５１】ＰＰＡＲγ２変異体を有する個体の中に
は、良好な脂肪交雑を有していることが間接検定の結果
明らかな種雄牛（但馬牛）が存在し、この種雄牛の子孫
に当たる個体も、同等の変異体を有していることが明ら
かとなった。このことから、本発明の方法を用いること
により、この種雄牛と同等のＰＰＡＲγ２変異を持つウ
シを正確に選抜することが可能である。

【００５２】ＰＰＡＲγ２変異体は、ヘテロ変異体であ
ることから、変異体を有する変異個体を１頭選抜すれ
ば、その子孫に１／２の確率で良好な脂肪交雑の形質が
受け継がれる。このように子孫の遺伝子を調べるだけ
で、早期に選別し肥育できるので、本発明は産業的にも
実用性が高い方法である。このことから、本発明の方法
は、脂肪交雑の良好な種雄牛と同等な遺伝的変異を持つ
ウシを選抜するためのマーカーとしても有用である。以
上に説明したように、本発明は肉用牛の育種および改
良、ひいては畜産業の振興に寄与することが期待され
る。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director General of Chugoku National Agricultural Experiment Stati on, Ministry of agriculture, Forestry and Fisheries <120> ミスマッチプライマーおよびそれを用いたウシＰＰＡＲγ２変異体の検出 方法 <130> P111040K <160> 4 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Aritficial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on PPAR γ2 nucleotide sequence <400> 1 gtgaggtcct tgcagacact gtgtca 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 gctgtgatgg gtgaaactct gggaga 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 3 tagtgcggag tggaaatgct ggagaa 26 <210> 4 <211> 239 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 4 gctgtg atg ggt gaa act ctg gga gat gct ctt att gac cca gag agt 48 Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ala Leu Ile Asp Pro Glu Ser 1 5 10 gag ccc ttc gtt gtc aca gtg tct gca agg acc tca caa gaa att acc 96 Glu Pro Phe Val Val Thr Val Ser Ala Arg Thr Ser Gln Glu Ile Thr 15 20 25 30 atg gtt gac aca gag atg ccg ttt tgg ccc acc aac ttt ggg atc agc 144 Met Val Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser 35 40 45 tcc gtg gac ctt tct atg atg gat gac cac tcc cat gcc ttt gac atc 196 Ser Val Asp Leu Ser Met Met Asp Asp His Ser His Ala Phe Asp Ile 50 55 60 aag ccc ttc acc acc gtt gac ttc tcc agc att tcc act ccg cac ta 239 Lys Pro Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His 65 70 75

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例で得られたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により
得られた制限酵素断片の電気泳動写真である。

【符号の説明】

下部の数字はレーン１〜８を示し、レーン１はマーカ
ー、レーン２はＰＰＡＲγ２変異体プラスミド、レーン
３は野性型プラスミド、レーン４および５は黒毛和種の
ＰＰＡＲγ２変異体、レーン６〜８は黒毛和種の正常個
体の制限酵素断片の結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村元 隆行 島根県大田市大田町大田イ−263−１ ハ イツ山根201号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 CA04 HA08 HA14 4B063 QA01 QA08 QA20 QQ02 QQ43 QR14 QR32 QR62 QS12 QS25 QS28 QS36 QX05

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
   するミスマッチプライマー。
2. 【請求項２】 請求項１記載のミスマッチプライマーを
   用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を行い、得られた増幅産物を
   電気泳動分析することを特徴とするウシＰＰＡＲγ２変
   異体の検出方法。