JP2000516446A

JP2000516446A - ホジキン病関連分子とその利用法

Info

Publication number: JP2000516446A
Application number: JP10503465A
Authority: JP
Inventors: プフロイントシュー，ミヒャエル
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2000-12-12
Also published as: WO1997048721A1; EP0912595A4; AU3500497A; CN1225640A; NZ333545A; ZA975555B; CA2258573A1; US5840568A; EP0912595A1; AU708669B2; US5864015A; KR20000022086A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ホジキン病に特異的に関連する分子の同定と単離とを記載するものである。これらの分子の使用法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ホジキン病関連分子とその利用法関連出願本出願は、共に係属中であり、かつここに参考文献として合体させる、１９９５年６月７日出願の出願番号第０８／４７９，３２８号の一部継続出願である１９９６年１月３日出願の出願番号第０８／５８０，９８０号の一部継続出願である、１９９６年５月１０日出願の出願番号第０８／６４４，１１６号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、対象の分子を同定する方法に関する。特に好適な実施例に於いて、本発明は、ガン(メラノーマや腎ガン、等)、ホジキン病、自己免疫疾患、等の病状に関連する分子の同定に関する。提示されるペプチド等の本発明の方法の結果発見される単離分子も本発明の一部を構成する。これらの分子には、とりわけ、タンパク質含有分子、これらをコードする単離核酸分子、及び前記タンパク質含有分子に特異的に結合する抗体、が含まれる。便宜上、ここに記載される方法を、「血清学的フィッシング」と称する。背景及び従来技術感染、ガン、自己免疫疾患、等の多くの病状がある種の分子の不適切な発現によって特徴付けられるということがほぼ確定されている。従って、これらの分子は、特定の病的又は異常状態に対する「マーカー」として役立つ。それらの診断用「標的」、即ち、これらの異常状態を診断するために同定される物質、としての利用法に加えて、これらの分子は、診断および／又は治療剤を製造するのに利用可能な試薬として役立つ。これの非限定的な具体例の一つは、特定のマーカーに対して特異的な抗体の産生のためのガンマーカーの利用である。更に別の非限定的具体例は、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドの、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞の生成のための利用である。もちろん、このような物質の調製は、これらを生成するのに使用される試薬源を前提としている。細胞からの精製は、これを行うための一つの手間のかかる、しかも非常に確実性の低い方法である。別の好適な方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離し、その後、その単離されたコード分子を使用して所望の分子を発現させる方法である。これまで、たとえばヒトの腫瘍中に於けるそのような抗原を検出するために二つの方法が使用されてきた。これらを、遺伝学的アプローチ及び生化学的アプローチと称する。前記遺伝学的アプローチは、たとえば、ここに参考文献として合体させるデ・プレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７５（１９８８）によって例示されている。このアプローチに於いて、腫瘍から得られたｃＤＮＡライブラリーのプラスミドの数百のプールを、ＣＯＳ細胞等の受容細胞、又は、その特定の抗原の発現についてテストされる腫瘍細胞細胞ラインの抗原陰性バリアント、にトランスフェクトする。たとえば、その両方をここに参考文献として合体させるフォーク（Ｆａｌｋ）他，Ｎａｔｕｒｅ３５１：２９０（１９９１）とカワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｎａｔｕｒｅ３６９：６９（１９９４）とに例示されている前記生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ−Ｉ分子に結合するペプチドの酸による溶離と、その後の逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ−ＨＰＬＣ）に基づく。抗原ペプチドは、それらが抗原プロセッシングに於いて欠陥を有する変異体細胞ラインの空のＭＨＣ−Ｉ分子に結合し、細胞溶解性Ｔリンパ球の特異的反応を誘発した後に同定される。これらの反応には、ＣＴＬ増殖、ＴＮＦ放出、及びＭＴＴアッセイにおいて測定可能な標的細胞の溶解、または⁵¹Ｃｒ放出試験が含まれる。抗原の分子特定に対するこれらの二つのアプローチには以下の欠点がある。先ず、それらは非常に手間と時間がかかり、高コストである。第２に、それらは、予め規定された特異性を有する細胞溶解性Ｔ細胞ライン（ＣＴＬ）の確立に依存する。第３に、それらの対象とする症状又は疾病の原因についてのイン・ヴィヴォでの関連性は、そのＴ細胞レパートリーに依っては、それぞれのＣＴＬがそれぞれの疾病を有する患者からのみならず、健康な個体からも得ることが出来ることから、まだ証明されていない。抗原の同定と分子定義とに対する前記二つの公知のアプローチに存在する問題点は、これら両方の方法が、これまで、ヒトの腫瘍に於いて非常にわずかな数の新しい抗原しか特定し得ていないという事実によって最もよく示されている。たとえば、ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）；ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）；クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４）カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ：ＵＳＡ９１：３５１５−３５１９（１９９４）を参照。腫瘍関連抗原の検出に使用することが可能であるのみならず、なんらかの異常又は病理状態に関連する分子の判定にも使用可能な方法を利用可能とすることが望まれる。このような方法は、更に、そのような分子の同定を容易にし、これによって、それを、たとえば、抗体、細胞溶解性Ｔ細胞などの生成に使用することも可能にするものであろう。従って、本発明の目的は、疾病の分子診断において有用な、ヒトの組織、特に腫瘍細胞、中の抗原の簡便な検出及び分子キャラクタライゼーションおよび／又は感染性、自己免疫性、及び悪性疾患の免疫療法及び遺伝子療法のための方法及び試薬を開発することにある。本発明を以下の開示に於いて記載する。図面の簡単な説明図１は、本発明のアプローチの原理を示している。図２は、患者の血清の１：１００希釈液に反応する腎細胞クリア（ｃｌｅａｒ）ガンのｃＤＮＡ由来の陽性クローンを有するニトロセルロースメンブランを図示している。図３は、腎細胞ガン、正常腎臓、及びその他のヒトの組織中に於けるクローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３のノザンブロット分析を棒グラフで示している。図４は、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３をコードする遺伝子の翻訳領域を示している。それは、配列番号４でもある。好適実施例の詳細な説明以下の開示は、血清学的フィッシングと称される方法を記載するものである。この方法に於いて、病理状態を患う患者から細胞サンプルを採取する。前記細胞は、好ましくは、その病状を例示するものである。たとえば、もしも患者がメラノーマを有する場合、前記細胞はメラノーマ細胞である。もしも患者が神経障害を患っている場合、前記細胞は、好ましくは、その疾患細胞のサンプルである。このアプローチは、疾患細胞が問題のタンパク質含有分子、即ち、問題の病理状態に特異的に関連する分子の最良のソースである可能性が非常に高いことから、保証される。尚、病理状態を代表する細胞が、本発明の方法に於いて使用可能な唯一の細胞であるというわけではない。たとえば、細胞の分化と成熟に関連するような細胞「マーカー」を確認することが非常に重要である。ここで例として造血幹細胞が想起される。同様に、本発明は、たとえば、特異的リガンドに対する受容体分子の単離も考慮する。実際に、この方法を使用して、問題となるどのような分子の存在についてもアッセイすることができる。次に選択された細胞を使用して、相補的ＤＮＡ（即ち、ｃＤＮＡ）のライブラリーを作成する。この方法は、当業者にとって周知であり、ここで繰り返す必要はない。それは、もちろん、もしもタンパク質が細胞によって発現されるならば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が存在するはずであるという確立された事実に基づくものである。これらのｍＲＮＡ分子は、長命ではなく、不安定であるので、作業するには非実用的である。ｃＤＮＡが使用された場合に分子にもたらされる安定性がこの方法にとって非常に有用である。ｃＤＮＡが作られると、それを使用してベクターライブラリーを構築する。簡単に説明すると、ｃＤＮＡの分子を受容するように、キャリアベクターを、切断や接続等によって処理する。ベクターの選択は、当業者はそのような多数の具体例を周知であることから、様々なものであってよい。特に好適であるのは、ウィルスベースのベクターである。真核細胞の場合、レトロウィルス又はアデノウィルスをベースとしたベクターが好適である。このようなベクターは、長い末端反復配列(‘ＬＴＲ’)、プロモーター(たとえば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター)、エンハンサー、等の、ウィルスゲノムの全部又は一部を含む。宿主細胞が原核細胞である場合は、細菌ウィルス、即ち、ファージ、が好ましい。このようなベクターの具体例は、たとえばラムダファージに基づくベクターである。いずれの場合に於いても、ベクターは、一以上のウィルスのエルメントを含むものであってよい。その結果得られたベクターは、真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよい宿主細胞にトランスフェクト又はトランスフォームされる。トランスフェクション又はトランスフォーメーションに通常使用されるどのような細胞もこの方法に使用することができる。好適な材料は、大腸菌の菌株、ＣＨＯ−１等のＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７等のＣＯＳ細胞、等を含む。同様に、たとえば、サッカロミセス属などの酵母細胞や、シュードモナスアエルギノーザ等のシュードモナス属細菌、バチルスバクテリア、周知の昆虫宿主細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、等もすべて使用可能である。一旦、受容細胞がベクターを受容すると、外来性のタンパク質含有分子を発現させるべく、それらを培養する。ここで「タンパク質含有」という言葉を使用する理由は、原核生物はタンパク質のみを発現するのに対して、真核細胞は、たとえば、糖タンパク質や、リポタンパク質等を産生するべく、翻訳後にタンパク質を修飾する能力があることがよく知られているからである。又、ここで使用される「タンパク質含有」という言葉は、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド等のペプチドをも含むものであると銘記されなければならない。下記のプロセスは、上述したプロセスとは独立して行われるものであり、本発明の二つの態様間において何ら時間的関係は意図されていない。ガン等の病状や、たとえば自己免疫疾患に於いて、その病状に関連する分子に対するなんらかの免疫反応がある。この反応は、抗体応答、Ｂ細胞の増殖、特異的Ｔ細胞亜集団の増殖、サイトカイン産生の増加、等を含みうる。応答に関連する分子と細胞とは、血清等の患者の体液中に見つけることができる。免疫応答物は、それが組換えによって作られたものであれ、成いは自己によって作られたものであれ、問題の分子と反応する。問題はそれらを見つけることである。具体例が示すように、これはユニークな方法で行われる。先ず、体液、又は、対象となるその他のサンプルを、トランスフェクション又はトランスフォーメーションに使用されるものと同じ宿主細胞のサンプルと反応させる。この第１工程において、宿主細胞は、トランスフェクト又はトランスフォームされていない。この作用は、標的分子に対してではなく宿主細胞に対して特異的な免疫性の結合パートナーを除去（Ｓｔｒｉｐ）することにある。この工程が必要である理由は、前述したように、宿主細胞は、それに対して患者がなんらかの時点において免疫応答を発生するものである可能性があるからである。この第１除去工程（Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）によってこれらの免疫成分を除去する。次に第２除去工程を行う。この工程に於いて、前に除去されたサンプルを、今回は、上述したものと同じ宿主細胞であって、但し今度は患者からのｃＤＮＡを含まないキャリアベクターでトランスフェクト又はトランスフォームされた宿主細胞のサンプルと反応させる。この第２除去工程を行う理由は、本発明者等によってなされこれまで文献に報告されていない観察に基づくものである。ファージ、ウィルス、等のベクターとして使用される材料は、これらが自然に細胞に感染するが為に有用である。従って、ヒトの下部腸に生息する大腸菌にラムダファージを感染させる。従来に於いては、大腸菌に対する免疫応答が、これらの感染性物質に対する応答を含むということは考慮されていなかった。従って、本出願人等は、前述した二つの除去工程を行うことによって、前例のない程度にまで妨害免疫成分を除去する驚くべき可能性を達成したのである。前述したように、第１工程は、トランスフェクト又はトランスフォームされていない宿主細胞に対するものである。第２工程は、前述したように、ｃＤＮＡのキャリアとして使用されるベクターと免疫学的に同等なベクターであって、ｃＤＮＡを坦持していないベクターをトランスフェクト又はトランスフォームされた宿主細胞に対するものである。これらの除去工程のそれぞれを、複数の互いに類似した、但し異なる手順を使用して行うことが特に好ましい。たとえば、後述する実験は、固相カラム上での吸収と、その後のニトロセルロースペーパー上での吸収を示している。本出願人等は、なぜこのように二つの類似してはいるが異なるプロトコールを使用することによってここに記載されている結果がもたらされるのかということに関していかなる理論にも限定されることを望まない。以後、「サンプルに接触させる」という表現を使用する場合にはいつでも、これは、一つの接触工程のみに限定されるものではなく、一つ以上の、検査対象のサンプルから妨害結合パートナーを除去するように構成された複数の好ましくは互いに異なる接触プロトコールをも意味する、ことが銘記されるべきである。これらの除去工程を、ｃＤＮＡライブラリーを作成するのに使用する諸工程と、完全に独立して行うことが可能であると理解されるであろう。たとえば、もしもある抗原についてのテストが、第０日に行われる場合、サンプルの除去工程は、その前日、その前の週、等に行うことができる。更に、将来での使用のために、ドナー又は患者からの除去済み（Ｓｔｒｉｐｐｅｄ）サンプルを「バンク」することも可能である。使用されるサンプルは、好ましくは血清であるが、必ずしもそれに限られるものではない。免疫性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）結合パートナーを含むどのようなサンプルも使用することができる。本方法の次の工程に於いて、ｃＤＮＡを坦持し、異種タンパク質を発現する、溶解され、トランスフェクトされた細胞を、前述した二回除去されたサンプルに接触させる。このサンプルは、前記異種タンパク質に対して特異的な免疫成分のみを含み、それらに対して結合するはずである。この結合は、細胞可溶化液を、たとえば、活性化フィルターペーパー、固相カラム、等との接触によって予め固定化しておくことによって容易になるが、当該技術に於いて、問題の分子の同定のために多数の様々な形態のアッセイが利用可能であることが認識されているため、この固相結合は必ずしも必要なものではない。前記免疫成分が標的分子に結合すると、更にもう一つの工程を行うことが望ましいが、これは必ずしも行わなくてもよい。この追加工程は、たとえば、同定可能なラベルを坦持した抗−ＩｇＧなどの、第１の免疫成分に対するなんらかの結合パートナーの使用を含むものである。前記ラベルは、色素、酵素、金粒子、放射性標識、あるいはイムノアッセイに於いて使用される標準的ラベルのどのようなものであってもよい。同定が行われた後、標的分子を残して、前記免疫成分を除去する。次に、その標的分子を、当該技術におけるなんらかの標準的方法を使用して調べる。当業者は、前記方法に依れば、問題の分子と結合する免疫成分の単離も結果的に達成されることを理解するであろう。従って、本発明の別態様に於いて、たとえば、問題の分子に対する特異的結合パートナーである、抗体を単離することができる。本発明に依って同定および単離可能な更に別の免疫成分は、前記同定された分子に由来するペプチドと、これらのペプチドが結合して複合体を形成するＭＨＣ分子とからなる複合体に対して特異的な、細胞溶解性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」と称する）である。ＣＴＬ応答は、ＭＨＣ分子と、一般に約８−１２アミノ酸長であり、但し最も好ましくは９又は１０アミノ酸長であるペプチドとからなる複合体の、循環Ｔ細胞の表面上のＴ細胞レセプター（“ＴＣＲ”）による同定を含むものであることがほぼ受け入れられている。ＴＣＲは、これらの複合体に結合することによって反応し、これらの複合体に対して特異的なＣＴＬの増殖を含む一連の反応を、いわば「開始」させる。本発明の方法と、更に別の工程とを使用することによってこのようなＣＴＬを生成および／又は単離することができる。後述する具体例と、更に当該開示内容とに於いて指摘されているように、問題の抗原をコードするｃＤＮＡを容易に同定することができる。ｃＤＮＡが同定されると、これを、既にその表面上に所望のＭＨＣ分子を提示している宿主細胞か、もしくは、これらのＭＨＣ分子をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた宿主細胞をトランスフェクトするために使用する。問題の分子に対するｃＤＮＡが発現され、分子は、ＨＬＡ分子等の、ＭＨＣ分子によって提示される抗原ペプチドへとプロセッシングされる。前記複合体に対して向けられるＣＴＬは、自己リンパ球等の、リンパ球から得られる。反応細胞集団から、次に、限界希釈法の周知技術を使用して、長期（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ）ＣＴＬクローンが得られる。陽性ＣＴＬ応答が観察されると、そのＣＴＬに対して提示される特異的ペプチドを、たとえば、予め同定されたＣＴＬクローンの特異性のスクリーニング、等の確立された方法を使用して同定する。あるいは、潜在的ＭＨＣ−結合モチーフを同定するため、問題の分子の配列を研究し、そして、それらのペプチドについて、まず、関連ＭＨＣ分子に対する結合について分析し、もしＭＨＣ−結合に関して陽性であれば、次にそれらが、ペプチドＭＨＣ複合体を認識するＣＴＬを生成させる能力について分析する、という、より最近に記載された方法を使用することも可能である。もちろん、前記ペプチドは、周知技術を使用して、前記細胞から溶離させ、配列決定することも可能である。尚、当業者に於いては、問題の分子の発現から、逆にそれを発現した単数又は複数の特定の宿主細胞に関連付けることが可能であることも理解されるであろう。これを行うに当たって、問題の分子を発現したｃＤＮＡを取出し、それを配列決定する、等を行うことができる。当該方法のこの態様は、本発明の別の特徴を構成するものである。本発明の具体的実施例は、以下の例から理解されるであろう。図１はこの方法を模式的に示している。例１ヒト組織からのｃＤＮＡライブラリーを確立するために腎明細胞ガンの０．５ｕｇからトータルＲＮＡを得、そして参考文献として本出願にその内容を合体させる、チョムジンスキー(Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ)，Ｊ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）の方法に従って、確立した。ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴ−セルロースによってトータルＲＮＡから抽出した。ファーストストランドｃＤＮＡの合成は、ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン( Ｈｏｆｆｍａｎｎ)，Ｇｅｎｅ２５：２６３（１９８３）に記載されている方法によって、ＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラーゼＩを使用して達成した。ｃＤＮＡにクレノウ酵素を適用し、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｃＤＮＡの末端に結合させた（フェレッティエル（ＦｅｒｒｅｔｔｉＬ）および(スガメレッラヴィ(ＳｇａｍｅｒｅｌｌａＶ )，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：３６９５(１９８１）)。酵素ＸｈｏＩでの制限酵素消化の後、様々な長さのｃＤＮＡ分子をＳｅｐｈａｃｒｙｌ４００を使用して分離し、そしてλＺＡＰＩＩファージベクターにトランスフェクトした(ショート（Ｓｈｏｒｔ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７５８３(１９８８))。ライゲーションの後、組換えファージＤＮＡを、パッキング抽出液によりファージ中にパッケージングし、そして大腸菌細菌のトランスフェクションに使用した。ライブラリーの力価（タイター）測定の結果は、１．８ｘ１０⁶の組換え一次クローンであった。ｃＤＮＡライブラリーの全体を大腸菌にトランスフェクトし、そして増幅させた。増幅後のｃＤＮＡライブラリーの力価（タイター）は、ｍｌ当たり１０¹¹プラーク形成単位であった(ｐｆｕ／ｍｌ)。これらトランスフェクトされた細胞を以下の実験において使用した。例２前述の本発明によると、免疫性物質の同定は、ネイティブおよび溶菌されたλ ファージ−トランスフェクションされた大腸菌細菌に由来する抗原に対して向けられた抗体を完全に除去したヒト血清を使用することによって達成される。この目的で、血清を吸収によって“除去工程(ストリップ)”した。これについてここで記載する。大腸菌細菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを５０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した。吸光度ＯＤ₆₀₀＝１．０に達した後、細菌を遠心分離してペレットとし、５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして超音波によって処理し、溶菌液を得た。細菌溶菌液を活性化セファロースのマトリックスに結合させ、そしてそれをカラムに充填しヒト血清の吸収のために使用した。血清をこのカラムに１０回通した。指数増殖期にある大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細菌の培養物を遠心分離によってペレットとし、組換えインサートを有さない１０⁶のλＺＡＰＩＩファージによって０．０１Ｍの硫酸マグネシウム中にてトランスフェクトさせ、そして５ｍｌのＬＢ培地中で４時間インキュベートした。トランスフェクトされた細菌の溶菌液を、前記のトランスフェクトされていない細菌と同じ要領で使用した。前述のヒト血清をカラムに更に１０回通した。血清の除去工程（ディプリーション）を完全にするため、溶菌的（ｌｙｔｉｃａｌｌｙ）にトランスフェクトされた大腸菌細菌からの、妨害となる抗体を寒天プレート上で培養し(１０時間、３７℃)、そしてそれらのタンパク質をこの培養工程の後にニトロセルロースメンブランにブロットした。この後、前述の工程によって前吸収させておいた血清をブロットされたニトロセルロースメンブランに移し、吸収工程を５回繰り返した。本発明によって処理した血清は、完全に大腸菌およびファージ由来の抗原に対する抗体が取り除かれている。例３これらの実験において、腎ガン−特異的な抗原を以下の工程によって同定した。大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅの細菌を、前述のｃＤＮＡライブラリー由来の組換えファージでトランスフェクトし、プレート当たり４−５ｘ１０³のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の密度で、イソプロピルチオガラクトピラノシド（“ＩＰＴＧ”）を含有するＬＢ培地のプレートに播いた。３７℃で１２時間のインキュベーションの後、ニトロセルロースメンブランを、この培養物の上に載置し、そして培養プレートを更に４時間インキュベートした。この後、前記ニトロセルロースメンブランを、５％粉乳を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で１時間インキュベーションした。前記ニトロセルロースメンブランをＴＢＳ中で３回洗浄した後、例２にしたがって確保した除去工程後の（Ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ヒト血清を、ＴＢＳ／０．５％粉乳（ｗ／ｖ）中で１：１０００に希釈し、そして穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。ニトロセルロースメンブランとのインキュベーションの後、前記血清を取り出し、更なるテストを行うまで保存しておいた。血清とのインキュベーションの後、ニトロセルロースメンブランの方はＴＢＳ中で３回洗浄し、そしてポリクローナルアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧとともに１時間インキュベートした。この後、ニトロセルロースメンブランを、ＴＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）中で繰り返し洗浄した。この反応は、ニトロブルーテトラゾリウムクロライドおよびブロモクロロ−インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）−ホスファートを使用してＴＢＳ中で進行させた。ヒト抗体の、発現したタンパク質に対する結合は、ニトロセルロースメンブラン上での青色の環状呈色沈着物によって可視化された。血清に対する効果的な前吸収処理によって、大腸菌およびファージの抗原に対する抗体によってひきおこされるバックグラウンド反応性による原因でテストの質が損われることなく、メンブランを３７℃で数時間以上展開（ｄｅｖｅｌｏｐ）しておくことが可能となった。陽性のクローンを寒天プレート上で位置決定し、トランスフェクションバッファーに移し、そして第２ラウンドのトランスフェクションおよびサブクローニングのために使用した。全部で１．８ｘ１０⁶の組換えクローンをスクリーニングにかけたところ５種類の陽性の反応性クローンが同定された。例４例３にしたがって得られた陽性クローン、即ち、処理されたヒト血清由来の抗体に結合したクローン、をトランスフェクションおよび処理されたヒト血清との反応性についてのテストのラウンドを繰り返し行うことによって、単クローン性とし、サブクローニングした。対応するｃＤＮＡインサートを有するｐ−ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドをλＺＡＰＩＩファージベクターからｉｎｖｉｖｏエキシジョン（へイ（Ｈａｙ）およびショート(Ｓｈｏｒｔ)，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ５：１６−１９，１９９２）によってクローニングし、そして大腸菌ＳＯＬＲ細菌をトランスフェクションするのに使用した。バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドリー(Ｄｏｌｙ),Ｊ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３（１９７９）の方法を変更したＮａＯＨでのアルカリ法の後、細菌からプラスミドを単離した。組換えプラスミドＤＮＡを古典的なサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３(１９７７)）にしたがって、Ｍ１３−フォワードおよびＭ１３−リバースオリゴヌクレオチドを使用して配列決定した。得られたＤＮＡ配列およびその結果得られるアミノ酸配列を、核酸およびタンパク質データバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）においてチェックした。ｃＤＮＡインサートの配列決定を、内部オリゴヌクレオチドを使用して続けた。分析によると、前記データバンクにおいて登録されているいずれの配列ともホモロジーを示さなかった。ＳＫ３１３と称する全長のｃＤＮＡクローンは、ＲＡＣＥ法（ＦｒｏｈｍａｎＭＡ，ＤｕｓｈＭＫ，ＭａｒｔｉｎＧＲ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８(１９８８)）によつてクローニングしたものであり、５’末端に炭酸脱水酵素ドメインを有していた。この分子の核酸配列を配列番号１において示す。図２は、これらの実験からの陽性クローンを有するニトロセルロースメンブランを示す。例５これら諸実験を詳細に調べるため、ＲＮＡを、チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ）およびサッチ(Ｓａｃｃｈｉ)，ＡｎａｌｙｔＢｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７）の方法にしたがって、悪性および正常ヒト組織の範囲から単離した。変性の後、トータル単離ＲＮＡを１％ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルで電気泳動によって分離し（ゴールドバーグ ( Ｇｏｌｄｂｅｒｇ)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５７９４(１９８０）)、そして次に周知の方法（シード(Ｓｅｅｄ)，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：１７９９(１９８２)）によってナイロンメンブランにブロットした。前記同定されたクローンの放射能標識したｃＤＮＡインサートをハイブリダイゼーションのために用いた。ハイブリダイゼーションは、周知の方法（ジェフリー（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ）およびバーガー(Ｂｅｒｇｅｒ)，Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：４１９(１９８７)）にしたがって行った。対応するＲＮＡの存在は、オートラジオグラフィーおよびＸ線フィルムを使用して確認した。分析によると、クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３のｍＲＮＡは、正常の腎臓と比べて、腎細胞ガン（腎ガン）の１９のうち４つにおいて過剰発現していることが示された。非常に弱い発現が、結腸粘膜組織および正常の腎臓においてのみ見られた。その他の組織での発現は示されなかった。例６本発明に依って同定される抗原に対する抗体の発生率を測定するために、健康な個体と腫瘍患者とからの血清を分析した。この目的の為に、血清を、上述したように処理し、大腸菌及びファージ由来の抗原に対する抗体を除去した。抗原特異的抗体を検出するために、反応性クローンからのファージを、同じｃＤＮＡライブラリーに由来する非反応性ファージと１：１０の割合で混合し、上述した要領で、ヒトのテスト血清中の抗体との反応性についてテストした。前記抗原の同定に使用された血清を、陽性クローンとして使用した。非反応性ファージを、陰性コントロールとして使用した。血清サンプルは、もしも予想された割合のファージプラークが陽性の反応を示した場合、抗原反応性抗体について陽性とされた。クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３によって代表される腎細胞ガン抗原の場合、一定範囲のヒト血清の分析は、腎細胞ガン患者からの血清のみが、反応性抗体を含有していることを示した。健康なコントロールと他の腫瘍を有する患者からの血清は、そのような抗体を含んでいなかった。クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３のｃＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩでの消化によってプラスミドＤＮＡから切出し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、その後、前記ゲルからの抽出を行った。次に、これを使用して、細菌のタンパク質であるアントラニル酸合成酵素との融合タンパク質を発現するベクターを作った。正確なオープンリーディングフレーム内の関連フラグメントをｐＡＴＨプラスミドベクターにクローニングした(ケルナー（Ｋｏｅｒｎｅｒ）他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：４７７(１９９１))。記載されているように(スピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１３２(１９８４))、前記プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１にトランスフォーメーションした後、タンパク質発現を誘導させることができた。発現された融合タンパク質を、ＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切出し、溶出し、凍結乾燥した。ウサギを、フロイントアジュバント中に溶解させた１００μｇの前記凍結乾燥物での皮下注射によって免疫化した。免疫化は、フロイント不完全アジュバントを使用して２週間の間隔で３回繰り返された。ウサギから採血し、抗血清を得た。得られた抗血清から、上述した方法で、大腸菌とファージとに対して反応性の抗体を除去し、ヒト血清について記載したように、腎ガン抗原に対する反応性をテストした。反応性は、１：＞１００，０００の希釈で検出した。例７（ｉ）悪性メラノーマ，（ｉｉ）星状細胞腫、及び（ｉｉｉ）ホジキン病、を患う異なる患者から採取された生検組織を使用して、前述した諸例に記載されたプロトコールに従った。前述の例１−６に詳述した腎ガンの研究によって得られたものを含めて、その結果を次の表１に要約する。異なるインサートの分析によって、メラノーマ細胞は、公知の腫瘍拒絶抗原前駆体ＭＡＧＥ−１（ここに参考文献として合体させるファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−７（１９９１）を参照）と、更に一つの新規な抗原とを発現することが示された。この抗原のｃＤＮＡ配列の一部を配列番号２に示す。星状細胞腫の研究が完了した時、観察されたインサートは、以前に記載されたＴｅｇｔ遺伝子（ここに参考文献として合体させるオールド(Ｏｌｄ)，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４１：３６１−３７５(１９８１)）に対応しているもののようであった。ホジキン病の研究が完了した時、今まで知られていない抗原が単離され、それをコードするｃＤＮＡが、標準的方法を使用してライブラリー中に同定された。この抗原は、新規に観察されたものであり、レクチン様構造を有し、そのｃＤＮＡの一部が配列番号３に示されている。ビルベ（Ｂｉｌｂｅ）他，ＥＭＢＯ．Ｊ１１２１０３−１３（１９９２）によって記載されているレスチン（ｒｅｓｔｉｎ）に対する抗体も観察された。これは中間フィラメント関連タンパク質であって、その発現は、ホジキン細胞及びリードーステルンベルグ細胞と、培養された単球とに限られていることが示された。例８例１−７に記載された抗原に対する抗体の出現に関して更に研究を行った。表２にこれらのアッセイを要約する。これらの研究に於いて、陽性クローンからのファージを、非反応性ファージと混合（比率：１：１０）し、次に、これを使用して細菌（大腸菌）をトランスフェクトした。患者血清の希釈液（１：２００）を、上述したように、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）において使用した。「ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０」は、前記新規なメラノーマ抗原（配列番号２）を指し、「ＨＯＭ−ＭＥＬ−５５」はＭＡＧＥ−１（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）を指す。「ＨＯＭ−ＲＣＣ３．１．３ .」は、配列番号１の腎ガン抗原である。「ＨＯＭ−ＧＬＯ−３０．２．１」は以前に同定された星状細胞腫関連抗原を指し、「ＨＯＭ−ＨＤ−２１」は、配列番号３の新規なレクチン様抗原を指し、「ＨＯＭ−ＨＤ−３９７」は以前に同定されたレスチン抗原である。レスチンを除いて腫瘍抗原に対する抗体が、比率は異なるものの、同じタイプの腫瘍を患う患者の血清中にのみ検出されたという事実は、腫瘍の成長が、腫瘍抗原に対する体液性応答の発生に必須である、ということを示唆している。健康なコントロール中にレスチンが存在する理由は明らかではない。抗原が別の抗原に対して類似の配列を有するとか、ドナーが前ガン状態の細胞を有しているとか、或いは、抗原が、ウィルス感染、その他の炎症プロセス等の非悪性条件下に於いて正常細胞中で活性化される、などの理由に依り、それぞれの抗原に対する免疫寛容が回避されたのかもしれない、と推測される。例９ここに記載された新規に同定された抗原の発現パターンを調べるために、様々なヒト組織を使用してノザンブロット分析を行った。前述したチョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ）他の周知のグアニジウムイソチオシアネート／フェノール／クロロフォルム法を使用して、組織サンプル（腫瘍及び正常）からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの整合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、フォルマリン／ＭＯＰＳゲル中での電気泳動によってチェックした。次に、各レーン当たり４０ｕｇのＲＮＡを含むゲルを、ナイロンメンブラン上にブロットした。次に、これらのノザンブロットを、配列番号１、２又は３のｃＤＮＡでプローブした。ハイブリダイゼーションは、³²Ｐ標識化プローブを用いて４２ ℃でフォルムアミドと行った。フィルターを１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで６５ ℃で洗浄し、１６時間露出させた。これらが、後に定義する「ストリンジェントな条件」である。露出後、フィルターを取り出し、ＧＡＰＤＨで再びハイブリダイズさせた。表３にこれらの結果を要約する。理解されるように、前記新規なメラノーマ関連抗原は、メラノーマに於いて強く発現されるが、その他の組織中では発現されない。炭酸脱水酵素様抗原は、腎細胞ガンの約２０％に於いて強く発現されたが、正常腎臓組織に於いては弱く発現されただけであった。Ｔｅｇｔは、正常脳組織と比較して８／１２の星状細胞腫組織において過剰発現された。ホジキン病に関連するレクチン様分子のｍＲＮＡは、正常な扁桃腺と比較して疾患を有する扁桃腺に於いて約１０倍増加し、これは、過剰発現が自己Ｂ細胞応答を誘発するタンパク質によく見られる特徴であるかもしれないということを示唆している。例１０ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０配列について更に研究した。標準的遺伝子分析技術を使用したところ、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０のｍＲＮＡの５’領域がチロシンキナーゼ結合ドメインを有していることが示された。これは、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０がレセプターとして機能しているのかもしれないことを示唆している。前記ＲＮＡの３ ’部分は、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ）腫瘍のＳＹＴ−ＳＳＸトランスロケーションに関係していることが知られている分子である、「ＳＳＸ」のＲＮＡ分子と同一である。例１１更に、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０を研究するために追加の実験を行った。標準式ノザンブロッティング分析によって、精巣を例外として、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０は、正常組織に於いて発現されないことが示された。これに対して、それは、メラノーマの５０％、前立腺ガンの２０％、胃ガンの２０％、結直腸がんの２６％、肺ガンの１２％、胸部及び肝細胞ガンの２０％で発現された。それは、更に、胃ガンの１／１０、及び甲状腺ガンの１／５にも見つかった。追加のウェスタンブロッティング分析を行ったところ、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０に対する抗体が、テストされた８９名のメラノーマ患者の内１０名に存在していたのに対して、４９名の健全な男性被験者の内の３名に於いてのみ存在していることが示された。更に別の研究に於いて、ＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞が、ＨＯＭ−ＭＥＬ由来のノナマーを提示することが観察された。これは、ＣＴＬを誘発させるのに有用なＨＯＭ−ＭＥＬ４０特異的ワクチンが可能であることを示唆している。例１２前述の諸例に記載されたファージアッセイは、多数の血清サンプルをスクリーニングするには不適である。これを行うために、標準式ウェスタンブロット法の改変方法を開発した。この改変法は、ここに記載するように、Ｈｉｓ−ｔａｇした組換えＨＯＭ−ＭＥＬ４０に基づくものである。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０を、メラノーマ組織から調製したプラスミドｃＤＮＡに対してｐｆｕポリメラーゼを使用して、２０サイクル以上増幅した。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった。５’−ＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’(配列番号５)（センス）５’−ＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６）(アンチセンス)。９５℃／１分；６０℃／１分；７２℃／１分；で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、その後、最終伸長を７２℃で１０分間行った。その増幅産物を、周知の技術を使用してゲルで精製し、次に、ＳｍａＩで消化され、脱リン酸され、そしてゲルで精製されたｐＱＥ３２ベクターにイン・フレームにて結合させた。これによって、そのＮ末端に６個のヒスチジン分子から成る「尾部」を有する融合タンパク質が作り出された。このコンストラクトを、次に、大腸菌ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）株にトランスフォームし、その後、カナマイシンとアンピシリンとを含有するプレートでの選抜を行った。個々のコロニーをピックアップし、これらを、２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導をかけることによってスモールスケールで発現させた。これによって、タンパク質発現をチェックすることが可能になる。次に、各クローンにつき、Ｎｉ−ＮＴＡカラムでのスモールスケールでの精製を行った。一つのクローンが、予想された長さのタンパク質を発現するものとして同定された。このクローンを単離し、周知の方法を使用して配列決定した。それは、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０であることが確認された。この同定後、組換えタンパク質のラージスケールでの誘導を行った。具体的には、細胞を、２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、５時間後に集菌した。細胞を８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ８)、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸから成るバッファーと、一晩混合することによって溶解した。細胞細片を除去し、上清を、予め平衡化させておいたＮｉ・ＮＴＡ樹脂にロードした。前述したバッファーの２容量分、ｐＨ８で、次に、前記バッファーの少なくとも１０容量分、ｐＨ６．３で洗浄を行った。次に、ここに記載されたバッファーと、更に、２５０ｍＭのイミダゾールとを使用して、タンパク質を溶出させた。その収率は、１リットルの細菌培地に付き１５ないし４０ｍｇのＨｉｓ−ｔａｇしたタンパク質の範囲であった。次に、前記のＨｉｓ−標識タンパク質を使用して、ウェスタンブロッティングを行った。これらのアッセイにおいて、内部陰性コントロールとして作用した、５ｕｇの組換えＨｉｓ−ｔａｇしたタンパク質を、２ｘＳＤＳサンプルバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．２Ｍジチオトレイトール，４％ＳＤＳ，０．２％ブロモフェノール・ブルー、２０％グリセロール）と混合し、次に、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動にかけ、その後、半乾燥トランスファー（ｓｅｍｉ−ｄｒｙｔｒａｎｓｆｅｒ）を使用してナイロンメンブランにブロットした。非特異的な結合をＰＢＳ中にて５％の低脂肪ミルクでブロッキングした後(１時間)、メンブランを、腫瘍患者又は健康なコントロールからの１：１００希釈血清とインキュベートした。次に、ブロットを、一時間、アルカリフォスファターゼ結合マウス抗−ヒトＩｇＧとインキュベートした。次に、メンブランを、ウサギ抗−マウスＩｇＧと（３０分間）、抗−アルカリフォスファターゼと、その後、０．２５ｍｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼと、継続的にインキュベートした。各インキュベーション工程後、メンブランを、ＴＢＳと０．１％Ｔｗｅｅｎとで広範囲に洗浄した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート（ＢＣＩＰ）と、ニトロブルーテトラゾリウムとによる染色による可視化を行った。前記血清を、観察者に対してサンプルの状態を隠した状態で、ランダムな順番で（健康／メラノーマ陽性）分析した。すべての分析は、反復して実施した。前記ブロッティングは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２４ｋＤの分子量の生成物を示し、これは、予想アミノ酸配列に基づく、２１．６ｋＤの計算上の分子量と一致する。上述したイムノブロッティングを、８９個のメラノーマサンプルと、６個の卵巣ガンサンプルと、１０個の腎ガンサンプルとに対して行った。これらの内、１１個のメラノーマサンプルと、１個の卵巣ガンサンプルと、３個の腎細胞ガンサンプルとが陽性であった。結腸直腸、肺、胸部、胃、又は膵臓ガンの患者からの血清は陰性であった。全部で４１名の健康なコントロールも分析され、その内、３名が陽性であった。次に、前記ウェスタンブロッティングにおいて反応性であったすべての血清と、更に、２０個の陰性血清サンプルとを、前述したファージアッセイを使用して再評価した。その反応性は、１１名のメラノーマ患者の内の１０名と、前記陽性卵巣ガン患者とにおいて確認された。前記腎細胞ガン患者と健康なコントロールとは、陰性であり、前記ウェスタンブロッティングにおいて陰性であったすべてのサンプルが陰性であった。血清標本と腫瘍標本との両方を提供した１６名のメラノーマ患者がいた。腫瘍によるＨＯＭ−ＭＥＬ−４０の発現は、サンプル中に於ける抗体反応性と比較可能であることが判った。下記の表から理解されるように、１６名の患者の内の８名がＨＯＭ−ＭＥＬ−４０陽性腫瘍を有していたが、その血清中にその抗原に対する抗体を有していたのは３名のみであった。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０陰性腫瘍を有する患者の血清中には抗体は検出されなかった。例１３例７に於いて観察された結果が注目され、次に、追加の実験を行った。上述した血清学的分析を、様々なホジキン病細胞サンプルに対して行った。上述した方法を使用して同定された一つのｃＤＮＡクローンを、レスチンに対する公知のｃＤＮＡ配列と比較したところ、この公知のｃＤＮＡの切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態に対応するものであることが判った。具体的には、ここで配列番号７として示される前記切断（切形）ｃＤＮＡは、カルボキシ末端が切断されたタンパク質をコードし、α−ヘリックスロッドドメインの破壊をもたらすものである。このドメインは、フィラメントの形成に重要であることが知られている。上述したプロトコールを使用してノザンブロット分析を行ったところ、この分析は、転写産物がホジキン病関連組織中に於いて特異的に発現され、正常組織に於いては発現されないものであることを示した。次に、これらの結果を、転写産物特異的オリゴヌクレオチドを使用した単一細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。組換えによって生成された抗原を使用して作られたポリクローナル抗体血清を使用して、ウェスタンブロッティングによって、最後の一連の確認実験を行った。例１４ここに参考文献として合体させるラメンシー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１７８−２２８（１９９５）には、ＨＬＡ− Ａ２．１に結合する多数のペプチドと、同時にＣＴＬ増殖を引き起こすいくつかのペプチドとが開示されている。これらのいくつかは以下の式で表される。ＸａａＬｅｕ（Ｘａａ）₆（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）(配列番号８)。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０の推定アミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２．１バインダー／ＣＴＬスティミュレーターとして作用している可能性のある配列をスクリーニングしたところ、下記の配列が見つかった。ＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｙＩｌｅＳｅｒＰｒｏＬｙｓＩｌｅ（配列番号９）ＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｙｓＧｌｎＬｅｕＶａｌ（配列番号１０）ＬｙｓＩｌｅＧｌｎＬｙｓＡｌａＰｈｅＡｓｐＡｓｐＩｌｅ( 配列番号１１)。これらのペプチドは、周知の技術と、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸とを使用して合成された。次に、これらペプチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５と、その後、Ｃ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣとを使用して精製した。抗原提示に関連するトランスポーターが欠失しているＴ２細胞（デ・マース（ＤｅＭａｒｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８１８３−８１８７（１９８５）; スレイター（Ｓｌａｔｅｒ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２１：２３５ −２４１(１９９０)）を、下記のように、ペプチド結合アッセイに使用した。５ｘ１０⁵のＴ２細胞のサンプルを、１００ｕＭのＨＯＭ−ＭＥＬ４０ペプチドの存在下又は不在下で、３７℃で４時間インキュベートした。陽性のコントロールは、ＥＢＶＬＭＰ２由来ペプチド、即ち、ＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙＬｅｕＬｅｕＴｈｒＭｅｔＶａｌ（配列番号１２）と、ＨＩＶ逆転写酵素由来ペプチド、即ち、ＩｌｅＬｅｕＬｙｓＧｌｕＰｒｏＶａ１ＧｌｙＶａｌ（配列番号１３）とであった。Ｔ２細胞上に於けるＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションを、抗−ＨＬＡ −Ａ２．１特異的モノクローナル抗体（即ち、ＢＢ７．２）による標識化と、その後の、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウス抗体とのインキュベーションとによって測定した。これらのサンプルを、フローサイトメトリーによって分析した。ここでＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションは、下記の比率によって与えられる。ペプチドを有するサンプルの平均蛍光強度ペプチドを有さないサンプルの平均蛍光強度前記三つのペプチドのそれぞれが、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合することが観察され、配列番号８が、ＦＡＣＳ分析で測定したところ、飛びぬけて強いＨＬＡ−Ａ２．１アップレギュレーションを示した。上記記載に示されるように、本発明は、免疫反応性物質の判定又は単離の方法に関する。ここで「免疫反応性物質」とは、それを産出する対象に於いてなんらかの形の免疫応答を引き起こすすべての物質をいう。この応答は、Ｂ細胞応答又はＴ細胞応答のいずれに基づくものであってもよい。このような免疫反応性物質には、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド含有複合体(たとえば、ＭＨＣ／ペプチド複合体)、抗体、等が含まれる。これらの物質を測定するために、周知の標準式方法を使用して、対象の細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する。次に、ｃＤＮＡを、真核細胞特異的ウィルスやファージ（即ち、細菌ウィルス）等の適当なベクターに挿入し、トランスフェクト／トランスフォーム用ライブラリーを作成し、その後、これを、宿主細胞に組み込む。これらの宿主細胞を、それらが受取る前記ライブラリーの成分（クローニングされたｃＤＮＡ）を発現するように処理する。次に、これら宿主細胞を溶解し、これによって発現された物質を更なる処理のために使用することが可能となる。次に溶解された材料を、前記免疫反応性物質に対する免疫性結合パートナーを含むと考えられる「除去済み(ｓｔｒｉｐｐｅｄ)」サンプルに接触させる。ここで「免疫性結合パートナー」とは、標的、即ち、前記免疫反応性物質に結合するすべての免疫系関連物質をいう。このような結合パートナーには、非限定的に、抗体、Ｔ細胞、サイトカイン、リガンド、レセプター、等、更に、これらの分子の切形部分、相補的核酸分子、等が含まれる。尚、Ｔ細胞等のこれらの成分のいくつかについては、ここに記載されたものを含む追加の工程が必要とされる。前記除去済みサンプルは、前述したように、(i)トランスフェクトされていない、又はトランスフォームされていない宿主細胞と、(ｉｉ)関連ｃＤＮＡを含有しないベクターでトランスフェクト又はトランスフォームされた宿主細胞、との両方との接触によって既に処理されたものである。前記除去済みサンプルは、発現物質の結合パートナーを同定するのに有用である。というのは、もしも除去されなければ所望の特異的免疫反応を妨害するであろう免疫成分の多くがここに記載された吸収工程によって既に除去されているからである。発現物質の同定後に、それをコードするｃＤＮＡの単離を行ってもよい。宿主細胞のコロニーを含むペトリ皿の上に載置された、ニトロセルロースメンブラン等のメンブランを貫通して孔を開け、次に、その固相上での位置を決めるために免疫反応を使用することができる。各コロニーは、限定されたｃＤＮＡのトランスフェクションに基づくものであり、これによって、関連ｃＤＮＡの単離と同定とが容易になる。本発明は、更に、特定の状態（病状）に関連する分子をコードする配列番号１、２、３又は７の単離核酸分子にも関する。そのコード物質としての役割に加えて、これらの分子は、これらｃＤＮＡ分子（配列番号１、２、３及び７）が抗原へと翻訳されるｍＲＮＡに基づくものであることが判っていることから、関連抗原を発現する細胞を同定するためのプローブとしても使用可能である。その相補配列が、配列番号１、２，３又は７のいずれかにハイブリダイズし、そして配列番号１、２，３又は７によってコードされるタンパク質と同等のタンパク質をコードする、単離核酸分子も本発明の一部を成す。ここで「ストリンジェントな条件」とは、５０μｌ／ｃｍ²の３．５ｘＳＳＣと、１ｘデンハルト溶液と、２５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で、³²Ｐ−標識化プローブを使用して、１８時間６５℃でハイブリダイゼーションし、その後、４回洗浄（それぞれの洗浄は、１時間、６５℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）し、更に、１．０ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで３０分間最終洗浄する条件と少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。前記最終洗浄は、０．５ｘＳＳＣないし０．２ｘＳＳＣ、或いは更に、０．１ｘＳＳＣに変更することが可能であり、ＳＤＳは、望ましい場合には、ストリンジェンシーを増加させるべく０．１％まで低下させてもよい。本発明は、更に、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、これによって細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を引き起こす、配列番号９、１０および１１のもののような、腫瘍抗原に関連するペプチドを含む。下記の式のペプチドも本発明の一部を成す。即ち、ＸａａＬｅｕＸａａ₇(配列番号１４)、ここで、第６番目のアミノ酸酸残基は、Ｓｅｒ，Ｌｙｓ又はＰｈｅであり、第９番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ又はＩｌｅである。ペプチド／ＭＣＨ複合体形成は非常に特異的なものであることが周知であることから、これらの分子は、又、非常に簡便に、ＨＬＡ−Ａ２．１細胞に対するマーカーとしても役立つ。本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであり、従ってここで繰り返す必要はない。ここに使用された用語及び表現は、記載のための用語であり、限定のためのものではなく、このような用語及び表現を使用するに当たって、図示及び記載された構成又はその一部の均等物を除外する意図はなく、様々な改変が本発明の範囲内に於いて可能であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＰＧ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 ＹＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号７のヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。２．配列番号７によってコードされるタンパク質をコードし、かつ、ストリンジェントな条件下に於いて配列番号７のヌクレオチド配列にハイブリダイズする単離核酸分子。３．請求項１の単離核酸分子を有し、プロモーターに操作可能にリンクした発現ベクター。４．請求項２の単離核酸分子を有し、プロモーターに操作可能にリンクした発現ベクター。５．請求項１の単離核酸分子を有するトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞。６．請求項２の単離核酸分子を有するトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞。７．請求項３の発現ベクターを有するトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞。８．請求項４の発現ベクターを有するトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞。９．ホジキン病をスクリーニングするための方法であって、細胞サンプルを、請求項２の単離核酸分子と接触させる工程と、前記単離核酸分子の標的に対するハイブリダイゼーションを、ホジキン病の可能性の指標として判定する工程とを有する、ホジキン病をスクリーニングするための方法。１０．前記単離核酸分子が配列番号７から成る、請求項９の方法。１１．請求項２の単離核酸分子によってコードされる単離タンパク質。１２．請求項１１の単離タンパク質に特異的に結合する抗体。１３．前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１２の抗体。１４．ホジキン病をスクリーニングするための方法であって、細胞サンプルを、請求項１１の抗体に接触させる工程と、前記抗体の標的に対する結合をホジキン病の可能性の指標として判定する工程とを有する、ホジキン病をスクリーニングするための方法。