JP2000512494A - Cell growth regulatory gene - Google Patents

Cell growth regulatory gene

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JP2000512494A JP09543058A JP54305897A JP2000512494A JP 2000512494 A JP2000512494 A JP 2000512494A JP 09543058 A JP09543058 A JP 09543058A JP 54305897 A JP54305897 A JP 54305897A JP 2000512494 A JP2000512494 A JP 2000512494A
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バーテルセン，アーサー・エイチ
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Abstract

(57)【要約】 転写調節される増殖応答遺伝子は、細胞の運命の決定において中心的な役割を果たす。p53は細胞増殖能の調節に重要な遺伝子を転写調節するとわかっている。温度感受性p53対立遺伝子を含むラット胚繊維芽細胞の、ディファレンシャルRT-PCR解析を用い、我々は野生型p53タンパク質を保有する細胞で特異的に正に調節される、いくつかの転写産物を単離することができた。これらの遺伝子のうちの２つ、SM20およびミクロソームエポキシド加水分解酵素（mEH）は、以前に記載された遺伝子である。以前に特徴づけられていない２つのcDNA、細胞増殖調節（CGR）遺伝子CGR11およびCGR19を単離した。これらの新規タンパク質の予想アミノ酸配列には既知のモチーフ、すなわちEFハンドドメイン（CGR11)およびリングフィンガードメイン（CGR19）が含まれ、これは機能を示唆するものである。CGR11およびCGR19は、野生型p53細胞において全mRNAの0.05%および0.01%で発現する、初期応答遺伝子であるとみられる。CGR11およびCGR19ともに、SM20およびmEHと同様に、いくつかの細胞株の増殖を阻害することができる。 (57) Abstract Transcriptionally regulated growth response genes play a central role in determining cell fate. p53 has been shown to transcriptionally regulate genes important in regulating cell proliferation. Using differential RT-PCR analysis of rat embryonic fibroblasts containing a temperature-sensitive p53 allele, we isolated several transcripts that are specifically positively regulated in cells harboring wild-type p53 protein We were able to. Two of these genes, SM20 and microsomal epoxide hydrolase (mEH), are previously described genes. Two previously uncharacterized cDNAs, the cell growth regulation (CGR) genes CGR11 and CGR19, were isolated. The predicted amino acid sequences of these novel proteins include known motifs, namely, the EF hand domain (CGR11) and the ring finger domain (CGR19), which suggests function. CGR11 and CGR19 appear to be early response genes expressed at 0.05% and 0.01% of total mRNA in wild-type p53 cells. Both CGR11 and CGR19, like SM20 and mEH, can inhibit the growth of some cell lines.

Description

【発明の詳細な説明】 細胞増殖調節遺伝子発明の背景 細胞内の数々の潜在的増殖エフェクターの同定に対して重要な発展がなされた 。以前の分析は細胞環境、増殖因子及びストレスの表現型の効果を評価したが、 細胞増殖を混乱させる原因である根元的な分子イベントを明らかし始めたのはつ い最近のことである。多くの場合で、特定の細胞増殖反応の原因は、転写減少に 帰することができる。実際、細胞周期調節に直接的に関連する最近の遺伝子の発 見は、かなりの程度までディファレンシャル遺伝子発現解析に基礎をおいていた 。 p53遺伝子は、細胞増殖の制御において、間違いなくこの遺伝子に対する重要 な調節機能を反映するヒト癌において、もっとも頻度の高い変異された遺伝子で あり続けている。p53の機能は、ウイルスの、もしくは細胞のタンパク質と細胞 質隔離との相互作用によって弱めることができ、最終的には細胞増殖潜在力の変 化を導いている。p53はDNA損傷に反応して、そしてDNA複製を直接的に阻害し、 またはアポトーシスを誘導することにより増殖調節機能を発揮すると考えられて いるが、データの大部分が示すところによると、p53の主たる機能は、下流のエ フェクター遺伝子を転写的に調節することである。p53は強力な転写の活性ドメ インをもち、配列特異的様式によってDNAと結合することができ、これにより、 標的遺伝子の転写の活性及び抑制の両方を見込んでいる。 細胞増殖及び/または生存の制御に直接的に影響を及ぼすと示唆されている産 物であり、p53転写反応性遺伝子であるp21WAFl/CIPl、MDM2、GADD45、HIC、サイ クリンG、及びBAXの同定は、増殖反応遺伝子の発現レベルを調節する時にp53の 中心的な役割を強調する。最近までに、もっとも特徴づけられた、p53によって 転写的に調節される細胞増殖の直接のエフェクターのうちの二つはp21WAFl/CIPl 及びMDM2である。p21WAFl/CIPlは、細胞周期の進行中、サイクリン依存キナーゼ （CDK）タンパク質と直接的に相互作用することにより、CDK阻害剤として機能す る。形質導入によるp21WAFl/CIPlの過剰発現は、癌細胞株の広い範囲で、細胞増 殖を抑制する。一方、MDM2は、p53の活性をネガティブに調節することで機能し 、MDM2の過剰発 現により調節されない細胞増殖と腫瘍形成を導く。しかしながら、p53誘導転写 反応は、疾病保護（ill-conserved）である様であり、このことは、細胞型依存 性の、遺伝子依然性の、そして種依存性の因子がp53反応性に寄与する可能性が あることを示唆する。例えば、p21WAFl/CIPlとMDM2の両方は、温度感受性p53対 立遺伝子を含んでいる齧歯類細胞において、p53依存の様式によって転写的に活 性化されるが、p21WAFl/CIPlだけは類似したヒトの系において誘導される。加え て、p21WAFl/CIPlの活性化はp53依存的である場合、及び非依存である場合の両 方が示され、このことはp21WAFl/CIPlの制御に対する多くの経路を示唆する。さ らにBCL2もしくはE1Bのようなアポトーシス調節遺伝子産物のレベルも、細胞がp 53依存増殖停止を受けるか、アポトーシスを受けるかを決定することを促進する ことが明らかである。これらの結果は、多くのエフェクター遺伝子産物を使用す る複雑な調節カスケードが、細胞増殖潜在力に関して細胞の運命を決定している ことを示唆する。細胞増殖調節の複雑な性質は、細胞増殖調節に影響している分 子成分をさらに明らかにする必要性を強調している。発明の概要 哺乳類細胞増殖調節タンパク質をコードするDNA分子を提供することは本発明 の目的である。 哺乳類細胞増殖調節タンパク質を提供することは本発明の他の目的である。 哺乳類細胞増殖調節タンパク質に選択的に結合し、その分析に使用することが できる抗体を提供することは本発明のさらなる他の目的である。 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供することは本発明のさらなる他の目的で ある。 癌に対する診断及び診断方法を提供することは本発明の他の目的である。 細胞増殖を剌激するのに有用なアンチセンス構築物を提供することは本発明の 目的である。 細胞増殖調節遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド を提供することは本発明の目的である。 細胞の分裂増殖を誘導するための方法を提供することは本発明の他の目的であ る。 癌への感受性を評価するための方法を提供することは本発明のさらなる他の目 的である。 本発明のこれらの、そして他の目的は、以下に記載の、一つもしくはそれ以上 の態様によって提供される。本発明の一態様において、哺類のCGR11くはCGR19タ ンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子 が提供される。 本発明の他の態様によれば、単離され、そして精製された哺乳類CGR11もしく はCGR19タンパク質が提供される。 本発明の他の態様において、哺乳類CGR11もしくはCGR19タンパク質に特異的に 結合する抗体が提供される。 本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が提供される。こ の方法は、 腫瘍細胞に、哺乳類CGR11もしくはCGR19タンパク質を投与することの段 階を含む。 本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が提供される。こ の方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク質 を発現させる原因となるDNA分子を、腫瘍細胞に投与すること の段階を含む。 本発明のさらなる他の態様によれば、癌の診断のための方法が提供される。こ の方法は、 組織を試験して、その組織が正常組織に比べて、CGR11、CGR19、mEH及 びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク質、または、哺乳類タンパク質を コードしているmRNAを、より少なく発現しているかどうか決定すること の段階を含む。 本発明のさらなる他の観点によれば、癌の診断のための方法が提供される。こ の方法は、 組織を試験し、前記組織におけるDNAが、CGR11、CGR19、mEH及びSM20か らなる群から選択した哺乳類遺伝子コーディング配列の変異形であって、遺伝子 コーディング配列の野生型とは異なる変異型を含むかどうかを決定するために調 べること、 の段階を含む。 本発明の他の態様において、アンチセンスCGR11、CGR19、mEH及びSM20構築物 が提供される。この構築物は： a.転写プロモーター b.転写ターミネーター c.CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類タンパク 質の遺伝子コーディング配列の一つもしくはそれ以上の区分を含むDNA区分であ って、前記遺伝子コーディング配列の区分が前記プロモーターと前記ターミネー ターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーター及び前記ターミネーターに 関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作られるRNAが、哺 乳類細胞によって作られる対応するmRNAの区分と相補的である前記DNA区分、 を含む。 本発明の他の観点において、CGR11、mEH、SM20、もしくはCGR19のアンチセン スオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドは、哺乳類CGR11 もしくはCGR19のmRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む。 本発明の一つの態様によれば、細胞の分裂増殖を促進するための方法が提供さ れる。この方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子に対 するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、CGR11、CGR19、mEH及びSM20か らなる群から選択した哺乳類遺伝子mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチド を含むものを前記細胞に投与して、CGR11、CGR19、mEH及びSM20の発現を阻害す ること、 の段階を含む。 本発明の他の観点によれば、細胞の増殖を促進するための方法が提供される。 この方法は、 CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺乳類遺伝子に相 補 的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、三本鎖形成オリゴヌクレオチドを哺乳 類細胞に対して投与し、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択した哺 乳類遺伝子の発現を阻害すること、 の段階を含む。 他の観点によれば、細胞の増殖を促進するための他の方法が提供される。この 方法は、 哺乳類細胞に、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択したアン チセンス遺伝子構築物であって、 a.転写プロモーター b.転写ターミネーター c.哺乳類遺伝子コーディング配列の一つもしくはそれ以上の区分を含む DNA区分であって、前記遺伝子区分が前記プロモーターと前記ターミネーターの 間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーター及び前記ターミネーターに関して 逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作られるRNAが、哺乳類細 胞によって作られる対応するmRNAの区分と相補的であるとする前記DNA区分、 を含む遺伝子構築物を投与して、哺乳類遺伝子の発現を阻害すること、 の段階を含む。 本発明の他の態様によれば、癌への感受性を評価するための方法が提供される 。この方法は、 血液、絨毛膜絨毛、羊水、着床前の胚の卵割球からなる群から選択した組織を 検査して、前記組織内のDNAが、CGR11、CGR19、mEH及びSM20からなる群から選択 した変異型遺伝子コーディング配列を含むかどうか決定すること、 の段階を含む。 本発明は従って、付加的な診察及び治療手段に関した分野を提供し、それによ って癌リスク評価、初期癌、及び明らかな癌を扱う。 図面の簡単な説明 図１：REF-112 RNAの特性記述。図1a、WAF1誘導の速度論。示した時間(時)、3 2℃で維持したRFE12細胞からの全RNAを、ラットWAF1 cDNAにてプローブした。 図1b、サイクリンG RT-PCR。8時間、38℃、もしくは32℃で維持したREF-112細 胞から回収した全RNAを、固定オリゴ−dTプライマーにて逆転写した。PCRは、こ のプライマー及びラットサイクリンGの3'末端に特異的なプライマーで行った。 矢印は約300塩基対の、ディファレンシャルに（differentially）発現したラッ トサイクリンG RT-PCR産物を示す。図1c、REF-112細胞からの全RNAのノザン分 析。図1bに記載したサイクリンG RT-PCR cDNAを、38℃、もしくは32℃で維持 したREF-112細胞から単離したRNAに対するプローブとして用いた。 図2：野生型p53含有REF-112細胞からのディファレンシャルに発現した発現遺 伝子。38℃、及び32℃（8時間）維持した、CGR11(図2a)、CGR19(図2b)、SM20(図 2c)、及びmEH（図2d）を発現しているREF-112細胞からのRT-PCR及びノザン分析 。矢印は切り取り、再増幅し、付随したノザン分析のためのプローブとして使用 した、ディファレンシャルに発現したcDNAを示している。レーン1、レーン3；8 時間インキュベーション後回収した、32℃維持したREF-112 RNA。レーン2、レ ーン4；38℃維持したREF-112 RNA。デュプリケーションのサンプルは全RNA調整 物から独立に単離した。 図3：CGR11及びCGR19についての発現図。図3a；CGR11、CGR19、及びβ−アク チンに特異的な32P標識されたcDNA断片によりプローブした、ラットの複数の組 織のノザンブロット。図3b；CGR11及びCGR19の誘導速度論。REF-112細胞を示し た時間（時）32℃で維持した。全RNAを単離し、電気泳動し、ブロットし、そし てラットCGR11もしくはCGR19に対して特異的な32P標識されたcDNAにてプローブ した。 図4：ラット及びヒトのCGR11とCGR19のアミノ酸配列。図4a；ヒト（上段）及 びラット（下段）CGR11の推定したアミノ酸配列。ダッシュはヒト及びラット配 列間での一致を示す。アスタリスクはラットCGR11配列内に存在する欠落を示す 。上線は、二つの推定のEF−ハンドドメインを示す。図4b、コンセンサスのEF− ハンドメインと配列させたCGR11 EF−ハンドドメインI及びII。ヒトの配列と異 なっているラットアミノ酸を下線に示す。図4c、ヒト（上）及びラット（下）CG R19の推定したアミノ酸配列。上線の配列は潜在的なジンク−バインディング、 リング−フィンガードメインをコードしている。ダッシュはヒト及びラット配列 間で一致を示す。図4d、CGR−9リン−ーフィンガードメインは、コンセンサスの リング−フィンガー配列とともに配列させた。 好ましい態様の詳細な説明 本発明者は、以前にはp53によって調節されていると知られてはいない、４つ の遺伝子がp53によって調節され、本明細書で増殖調節をすることが示されるこ とを発見した。単離された遺伝子の二つ、ラットSM20とラット及びヒトmEHは、 すでに記述された遺伝子であるが、p53の状態とこれらの遺伝子の転写的誘導の 間の関係は以前には確立されてはいないものである。他の二つの遺伝子、CGR11 及びCGR19は以前には単離も記述もされていない。 ラットSM20は、血管平滑筋細胞のPDGF-A-誘導転写の解析により初めて単離さ れたが、しかしながら、ラットSM20の機能はいまだに解明されていない。一方、 mEHは、代謝反応性エポキシドを含む生体異物の触媒反応解毒化に関係すること が知られている。mEHと野生型p53の間には既知の関係は何も知られていないが、 エポキシドを介したp53活性の誘導は、毒素の存在下での遺伝子の安定性を保つ ことを助ける可能性がある。 我々は、よく特徴づけられているネズミの温度感受性p53変異VAL135を利用し て、野生型p53タンパク質の転写反応を同定した。活性化RAS及び、p53-VAL135を 形質導入したラット胚繊維芽細胞（REF-112）の増殖は温度感受性である。これ らの細胞の38℃での増殖は、細胞質中でHSP70と複合体形成する変異構造にp53タ ンパク質を維持する。REF-112細胞を32℃に移すと、p53タンパク質は、野生型構 造を採用し、核内に移動し、そして標的遺伝子の転写を調節する。これらの細胞 は、はじめに、特に細胞周期のG1期における増殖停止として記述された。我々は 、p53の機能に対して、温度感受性であるラット細胞からのディファレンシャル 転写解析を利用した。我々は、複製を許容する温度では存在し、しかしながら複 製を許容しない温度では存在しないこれらの転写を同定した。 本発明によるDNA分子は、他の遺伝子配列から単離され、そして精製される。 それらは、ゲノム配列またはcDNA配列のいずれかであり、すなわちそれらは介在 配列を含む可能性があるか、もしくはその可能性がない。ヒトCGR11、ヒトCGR19 、 ラットCGR11、及びラットCGR19のコーディング領域のヌクレオチド配列はそれぞ れSEQ ID Nos:1、3、5、及び7に示される。他の哺乳類相同物は、開示されてい る配列由来のヌクレオチドプローブ、またはプライマーを用いてcDNAライブラリ ーをスクリーニングすることで、容易に得ることができる。ゲノムクローンも、 遺伝子コーディング領域由来のプローブを用いて、YACもしくはP1クローンのよ うなゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることで入手できる。遺伝子の 対立遺伝子型も、本発明の範囲に含まれている。これらは、コード配列に影響し ない無影響変異、またはアミノ酸の相違を導く多型のいずれかをもちうる。アミ ノ酸の相違は、タンパク質の機能の変化を引き起こす可能性がある場合またはそ の可能性が内場合とがある。 SEQ ID Nos: 2、4、6、及び8に示したタンパク質配列を用いることで、変性し たオリゴヌクレオチドプローブを使用して、対応する遺伝子及び関連した哺乳類 CGR遺伝子を同定し、入手することもできる。一つもしくはそれ以上の変性した プローブを使用して、cDNA、もしくはゲノムDNAライブラリーにハイブリット形 成することができる。CGR遺伝子は、変性したプローブとハイブリット形成する ことによって同定できる。遺伝子の同定は、一つもしくはそれ以上の、以下の特 性に基づいて確かめることができる：すなわち、コードしているタンパク質のお およその大きさ、SEQ ID Nos:2、4、6、もしくは8のタンパク質との類似性もし くは同一性、そして野生型p53による遺伝子に対するmRNAの亢進調節である。変 性したプローブの使用のデザイン及び条件は、当該技術分野においてよく知られ ている。全長遺伝子、もしくはcDNAの一部分は、全長遺伝子を単離することによ り、もしくは全長遺伝子を単離することなく、同様に単離できる。あるいは、CG Rタンパク質（群）に特異的に結合する抗体は、SEQ ID Nos:2、4、6、及び8に示 した、タンパク質もしくはそのタンパク質のポリペプチド部分に対して作り上げ ることができる。これらの抗体を使用して、同様の、もしくは関連したエピトー プを発現している発現cDNAライブラリー中のクローンを選択することができる。 同定されたCGR遺伝子の部分は、制限エンドヌクレアーゼにより、または一部の 配列の増幅による遺伝子の断片化により作ることができる。ハイブリット形成に より、もしくは抗体結合により単離されたCGR遺伝子の部分は、全遺伝子を単離 することなしに、直接的に使用することもできる。 現在、4つの哺乳類細胞増殖調節遺伝子の配列が提供されているので、当業者 は、コードされているタンパク質を容易に入手できる。これらは、細菌、酵母、 もしくは他の便利な細胞に発現させることができる。発現ベクターは、当該技術 分野で既知のベクターに、コーディング領域をライゲーションすることによって 構築することができる。一般的には、ベクターはプロモーター、エンハンサー、 転写シグナルのターミネーションなどの発現調節配列を含みうる。従って、コー ディング配列を、発現調節配列に関して、正しい場所にそして正しい方向に配置 することによって、希望する宿主細胞内に選択された哺乳類タンパク質の発現を 指向することのできる、発現ベクターを入手する。適当なベクターは当該技術分 野で知られており、プラスミドもしくはウイルスゲノムに基くことができる。ベ クターに対する適当な宿主細胞も知られており、そしてそれら宿主細胞が示す希 望する性質について選択できる 選択されたタンパク質の部分を、合成し、実験動物の免疫のための担体タンパ ク質に結合して、これらの特異的に免疫反応性である抗体を産生することができ る。この抗体を使用して、天然の、もしくは組換え源からのタンパク質を精製す ることができる。このような抗体は、特定の用途に便利なように、ポリクローナ ルもしくはモノクローナルであってもよい。開示されたCGRタンパク質に特異的 に結合する抗体は、当該技術分野にてよく知られているように、日常的なスクリ ーニングを用いて容易に単離することができる。 本明細書で記載のように、細胞増殖調節タンパク質は、腫瘍細胞に対して増殖 抑制効果をもっている。従って、細胞増殖調節タンパク質の腫瘍細胞への投与、 もしくは結果としてタンパク質の発現を生ずるであろう構築物を用いたそれらに 対応する遺伝子の投与は、そのような増殖抑制をもたらすために好ましい可能性 がある。本発明のタンパク質は、ヒトに投与するために、薬剤組成物として製剤 化されうる。一般的には、これらは発熱性成分を含まない、希釈剤もしくは賦形 剤中での無菌剤形でありうる。この剤形は、鼻腔内及び非経口投与いずれにも適 合する。増殖性疾患に関連する他の細胞も、細胞増殖調節遺伝子媒介性増殖抑制 の標的でありうる。このような増殖性疾患は、乾鮮、ポリープ、再狭窄、いぼ、 炎症性疾患を含むが、これらにの限定されない。細胞増殖調節タンパク質は、腫 瘍細胞に、適切な剤形で投与されうる。それらは、腫瘍細胞への微量注入、もし くは単純に外部から供給することができる。それらは、例えばリポソーム内に被 包されるうる。哺乳類に投与する場合には、循環系内で腫瘍抑制量に達すること が望ましい。腫瘍抑制効果は、細胞増殖調節タンパク質が10-10から10-6Ｍの濃 度の時に目的を達することができる。細胞増殖調節タンパク質をコードしている DNAを、腫瘍細胞に投与すると、細胞は増殖抑制のための、それ自身の細胞増殖 調節タンパク質を発現することができる。そのようなDNAは、上述したように、 ゲノムDNA、もしくはcDNAであり得る。増殖性疾患に関連する他の細胞は、同様 にして処理されるうる。 本発明の細胞増殖調節遺伝子は、ここで、野生型p53によって調節されること が示される。従って、いずれかの細胞増殖調節遺伝子の発現を、野生型p53の発 現のマーカーとして使用できる。ちようど野生型p53の発現の減少、もしくは変 異したp53の発現の存在が癌を示すように、正常組織と比較して増殖調節遺伝子 の発現の減少は、癌を指し示すことができる。細胞増殖調節遺伝子の発現の分析 は、直接的な野生型p53の分析に加えて、もしくはそれに代えて使用することが できる。正常コントロールを提供するための比較目的に適合する組織は、一般的 には近接した、形態学的に正常な組織である。細胞増殖調節遺伝子の発現の存在 もしくはその量の試験は、細胞増殖調節タンパク質に特異的な抗体、核酸プロー ブ、もしくはSEQ ID Nos:1、3、5、もしくは7の配列の全部、または一部に相補 的な、少なくとも約10ヌクレオチドのプライマー、もしくは当該分野で知られて いる他の試験の、いずれかによって行うことができる。 同様に、腫瘍組織のDNAを試験して、それが変異を含んでいるかどうか決定す ることができる。細胞増殖調節遺伝子の変異は、p53変異がそうであるように、 細胞に腫瘍形成表現型を与える。変異は、試験をする組織内の遺伝子の配列を決 定し、その配列をSEQ ID Nos:1、3、5、もしくは7にて開示している配列と比較 することにより決定することができる。このような変異は、生殖系列もしくは体 組織で起こりうる。体組織で変異が起こった場合、同じ個体において他の組織で は変異は発見されないであろう。変異が生殖系列で起こった場合、体のすべての 組織で変異が発見され、生殖系列のp53変異のように癌への感受性を示すであろ う。生殖系列変異について試験をするのに適した組織は、血液、粘膜スメア、子 宮頸部スメア、皮膚、絨毛膜絨毛、羊水、及び着床前の卵割球を含む。 アンチセンス細胞増殖調節遺伝子構築物は転写プロモーターと転写ターミネー ター（ポリアデニル化シグナル）を含み、それらの間にDNA区分を持つ。DNA区分 は、一つもしくはそれ以上の細胞増殖調節遺伝子区分を含むが、その区分は構築 物中で、哺乳類ゲノムの方向に比べて逆になっている。この構築物の転写プロモ ーターからの転写は、正常哺乳類細胞における細胞増殖調節プロモーターから作 られる、細胞増殖調節遺伝子RNAに相補的な（アンチセンス）RNA分子を産生する 。アンチセンスRNA分予を作るのに使用したプロモーターは、ある処方された刺 激物質によって調節されうる誘導可能なプロモーターであり得る。例えば、メタ ロチオネインプロモーターもしくはホルモン応答性プロモーターは、都合よく使 用できる。他のプロモーター及びターミネーターは、特定の用途に都合よく使用 できる。加えて、当該技術分野で知られているエンハンサーを使用して、希望す るタンパク質の発現を高めることができる。 本発明のアンチセンス細胞増殖調節遺伝子構築物は、細胞の一つのタイプにお いて使用してアンチセンスRNAを産生し、当該技術分野で知られている技術によ って他の細胞に適用することができる。あるいは、細胞増殖調節遺伝子構築物を 、細胞増殖調節遺伝子の調節が望まれる、最終的な標的細胞に投与できる。細胞 へのDNA構築物の導入の適切な方法は、当該技術分野で知られている。アンチセ ンス構築物の投与は、当該技術分野で知られているような、トランスフェクショ ン、形質転換、エレクトロポレーション、融合、その他によって行われうる。細 胞増殖調節遺伝子発現の阻害は、細胞を増殖分裂させ、細胞死を防ぐ。これは、 移植のための表皮細胞を培養する場合のように、培養中で多数のある細胞が増殖 することが好ましいような状態で特に有用でありうる。あるいは、体のある細胞 への投与は、老化を防ぐために老齢化（aging）あるいは老化（senescent）しつ つある細胞に、もしくは免疫性の細胞または胃腸管の細胞などに関して望ましい ものでありうる。 細胞増殖調節遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以上で議論した ような、アンチセンス構築物と同様な目的のためにも提供される。オリゴヌクレ オチドは、長さとして、少なくとも10ヌクレオチドであり、20から30ヌクレオチ ドであり得る。それらは、通常のヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体、ま たは二つの混合物から成り立ちうる。類似体はメチルホスホン酸塩、アミノアル キルホスホン酸塩、ホスホロチオン酸塩、ホスホロジチオン酸塩、置換または非 置換ホスホルアミデイトを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、環状分子 も利用されうるが、一般的には、哺乳類細胞から作られた天然細胞増殖調節遺伝 子mRNAと相補的である、直鎖で一本鎖の分子である。これらは、受動、もしくは レセプター媒介性の輸送によって細胞により取り込まれるように、リポソーム中 、もしくはむきだしで細胞に投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレ オチドが、mRNAの5'末端、特に転写開始部位に特異的に相補的にデザインされて いることがたいてい好ましい。しかしながら、mRNA分子の他の部分が、アンチセ ンス阻害に影響を受けやすいことが明らかになっており、本発明の実施において 使用できうる。同一分子の他の部分との水素結合が関連する二次構造をもつ、ア ンチセンスヌクレオチドに対する標的としてのmRNAの部分をさけることも好まし い。例えば、ステム−ループ構造のステムの形態に関連していることが明らかな 部位をさけることは好ましい。 細胞増殖調節遺伝子の発現はまた、転写に対する干渉によって、オリゴヌクレ オチド、または細胞増殖調節遺伝子の区分と複合体化することで三重鎖構造（三 本鎖、triplexes）を形成できる修飾オリゴヌクレオチドを加えることによって 、抑制しうる。 以下の実施例は、例示の目的のためのみに提供され、そして、以上の広い用語 にて記載した本発明の範囲に限定するものではない。 実施例 実施例１ 予備研究により、温度感受性p53システムの有用性を明らかにする。 38℃および32℃の両方で培養した細胞から調製した全RNAを、まずp53に調節さ れる既知の遺伝子に関して特徴づけることにより、REF-112細胞を用いたデ ィファレンシャルディスプレイ解析の実行可能性を評価した。p21WAFl/CIPlのノ ーザン解析では急速な転写誘導が示され、p21WAFl/CIPlRNA量が32℃に移してか ら8-10時間後に頂点に達した(図1a)。さらに我々は、32℃に移してから8-10時間 以内のアポトーシス誘導の、同様の速度論を明らかにした。 本明細書中で述べるディファレンシャル転写解析に関して、我々は８時間の誘 導時間を選んだ。この時点では、ラットp21WAFl/CIPlおよびラットサイクリンＧ ノーザン解析により、32℃という増殖阻害温度においては各転写産物の量が多く 、38℃において対数的に増殖した細胞では転写産物はほとんどあるいは全くない 、ということが示された(図１)。サイクリンＧおよびp21WAFl/CIPlともに、同様 の量まで誘導されるようであった。 両方の増殖条件から単離した全RNAについて、ラットサイクリンＧの3'末端に 特異的なプライマーを用いてRT-PCR反応を行い、RNA調製物について特徴を調べ た後、p53に調節される新規遺伝子を同定した。予想した通り、ディファレンシ ャルに発現する300bpのバンドを、32℃で誘導したRNA中に検出したが、誘導して いない細胞由来のRNA中にはなかった(図1b)。サイクリンG RT-PCRバンドを切り 出し、続いてクローニングおよびノーザン解析（図1c）を行ったところ、このバ ンドがラットサイクリンＧと同一であることが確認された(データは示さず)。 細胞培養：ラット胚の繊維芽細胞REF-112（p53-VAL135）およびREF-132（p53- PHE132）(B．VogelsteinおよびM．Orenのご好意によりご供与いただいた)を、10 ％ウシ胎児血清を含むDMEM中、5％CO2、38℃あるいは32℃のいずれかにおいて培 養した。いずれかの温度移動の48時間前に、細胞を分配し、まいた。温度移動は 、あらかじめ平衡化したインキュベーターにサブコンフルエントなフラスコを、 培地を交換せずに単に移動させて行った。トランスフェクション用に、４ｘ105 個の細胞(T98GおよびSW480細胞)、または0.8ｘ105個の細胞（SKOV3-IP1）を６穴 培養皿にまいた。製造者が説明する通りに、リポフェクチン（Gibco/BRL）を用 いてトランスフェクションを行った。簡単にいうと、40μｌの血清低減培地（OP TIMEMTM、Giboco/BRL）を２μｇのDNAに加えた。10μｌのリポフェクチンを含む 50μｌの混合液および、40μｌのOPTIMEMTMを、DNA混 合液に加えた。15分間、室温でインキュベートしたあと、1mlのOPTIMEMTMを加え 、optimemで洗った細胞の上に混合液を重層した。細胞を５時間、37℃/5%CO2イ ンキュベーター中でインキュベートし、そのあと、トランスフェクション混合液 を通常の増殖培地と置き換えた。44時間後、ハイグロマイシン（0.25mg/ml）を 含む選択培地に細胞を分配した。12-14日後、50%エタノール中の2%メチレンブル ーにてコロニーを染め、計数した。50個以上の細胞を含むコロニーのみを取った 。 RNA単離：製造者が説明する通りに、RNAzol B（Tel-Test，Inc.）中で直接可 溶化することにより全RNAを単離した。製造者が説明する通りにMessageMakerkit （Gibco/BRL）を用い、全RNA調製物からpoly A+RNAを単離した。 RT-PCR反応：５mM MgCl2/10mM Tris、pH8.3/10mM KCl/20μＭ dNTP's/20units Rnase阻害剤（Perkin Elmer）/50μＭ T12NN中の200ngの全RNAおよび50units M MLV逆転写酵素（Perkin Elmer）を用い、試料（逆転写酵素なし）を65℃に５分 間温めて逆転写反応を行い、次いで反応液を37℃に５分間置いた。逆転写を37℃ で55分間かけて行った。５分間、95℃でインキュベートすることにより、RT反応 を不活性化させた。1.5mM MgCl2/10mM Tris pH8.3/10mM KCl/4μＭ dNTP's/2.5u nits Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）/10μCi35S-α-dATP（12.5μCi/μｌ、N EN）/50μＭ T12MN中の２μｌの逆転写反応液および0.2μMランダム10-merを用 い、PCR反応を行った。サーモサイクラー中で、94℃を３秒/40℃を２分/72℃を3 0秒というサイクルを40サイクル、PCR反応を行った。38％ホルムアミド/8mMEDTA /0.02%ブロモフェノールブルーおよびキシレンシラノールを加えることにより、 反応を終了させた。試料を２分間、70℃で温め、6%変性ポリアクリルアミドゲル 上で泳動した。ゲルをWhatmann 3MM紙上に乾燥させフィルムに露光した後、PCR 産物を精製した。切り出したバンドを120μｌ H2Oに10分間、室温で再懸濁させ 、続いて15分間煮沸した。遠心して残渣をペレットにし、10μｌの3M酢酸ナトリ ウム、５μｌの10mg/mlグリコーゲン、400μｌエタノールを、溶出した100μｌ のDNAに加えた。DNAを一晩、-20℃で沈殿させた。DNAをペレットにし、もとのRT -PCRに用いたプライマーと同じものを用いて増幅し、ゲルを精製し、pCRII (InV itrogen）にクローン化した。 オリゴヌクレオチド：サイクリンG RT-PCR反応に関して、dT12GCおよび5'-TCT TCACTGC-3'プライマー対を用いて約300bpの断片を増幅した。 ノーザン解析：1.2%ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した10-20μｇの全RNA を用い、ノーザン解析を行った。ブロッティングおよびプローブによる探索（pr obing）は、根本的には記載されている通りであった。プローブは、ランダムプ ライム（BMB）によりα-32Pラベルしたゲル精製cDNA断片とした。ラット組織ブ ロットをClontechから得て、製造者が勧めるように、プローブによる探索をし、 除去し(stripped)、再びプローブによる探索をした。ラットWAF1 cDNAは、B.Vog elsteinの好意によりご供与いただいた。実施例２ 本実施例では、p53が調節する遺伝子の同定に、温度感受性p53システムを使用 することを明らかにする。 増殖により調節される他の遺伝子を同定するために、我々は12の“固定された ”オリゴdTプライマーを25の“ランダムな”10-merと組み合わせて利用し、RT-P CR反応を行った。RT-PCR反応は、38℃または32℃に維持したREF-112細胞由来の 、独立に単離した全RNAについてデュプリケートで行った。ラットp21WAFl/CIPl またはMDM2のいずれかを増幅するであろうプライマー対を除外した。 異なって発現した総計35のRT-PCR産物を、32℃という誘導温度単独での産物の 誘導に基づいて、さらなる解析のために選んだ。RT-PCR反応を二重のRNAサンプ ルについて行ったが、可能性として目的の転写産物を含むすべての反応を省略せ ずに繰返して、ディファレンシャルディスプレイ解析における共通の問題である 、生じ得る人工物をさらに避けた。続くノーザン解析では、これらのRT-PCR産物 のうちすべてだが４つを、異なって発現した遺伝子として出した。これら４つの 遺伝子のいずれも、32℃で培養した非温度感受性p53変異を持つ対照細胞（REF-1 32細胞[PHE132]）由来のRNAではいかなる転写誘導も示さず、観察された転写誘 導は温度の移動のためのみでなく、変異のためでもあることを示唆する。誘導さ れた遺伝子のうちの２つは、以前にSM20およびミクロソームエポキシド水酸化酵 素（mEH）を含めて記載されたものである。相関的な遺伝子発現解析では、これ らの遺伝子を増殖条件に依存して異なって発現するとして説明した が、これらの遺伝子の転写は、以前にp53発現とは結び付けられていなかった。 11および19と名付けられた、２つの新規cDNAに由来するディファレンシャルRT -PCR産物を、SM20およびmEHと同様に図２に示す。これらの部分cDNAのそれぞれ に関するノーザン解析により、これらの転写産物が38℃または32℃で培養した細 胞において異なって発現していたということが確かめられた。 オリゴヌクレオチド：12の固定されたオリゴ-dTプライマー（dT12［A,C,G］［ A,C,G,T］の組み合わせ）および25のランダムな10merをRT-PCR反応に用いた。サ イクリンG RT-PCR反応に関しては、dT12GCおよび5'-TCTTCACTGC-3'プライマー対 を用いて□300bpの断片を増幅した。特異的なクローンのRT-PCR増幅を、以下の プライマー対を用いて達成した。すなわち、CGR11:dT12AT/TACAACGAGG；SM20：d T12GG/GATCATAGCG；CGR19：dT12CG/GATCATAGCC；mEH：dT12CA/GATCATGGTCである 。実施例３ 本実施例では、新規に同定した遺伝子、CGR11およびCGR19の組織特異的発現を 明らかにする。 部分cDNA断片11および19を、様々なラット組織由来の発現解析のプローブとし て用いた(図3a)。部分11cDNAプローブを用いて、1.3kbの転写産物が、脳全体お よび腎に広く存在し、心臓、肺、肝および骨格筋では限られた発現を示し、牌お よび精巣には検出できるような発現は示さない、といった限定された発現パター ンが観察された。部分cDNA19をプローブとして用いると、1.4kbの転写産物がラ ット精巣で最も高い発現量を示し、よりユビキタスな発現パターンを見せた。こ れらの遺伝子のいずれも以前に記載されていないため、我々はこれらを選び、細 胞増殖調節（Cell Growth Regulatory）遺伝子CGR11およびCGR19と名付けた。実施例４ 本実施例では、温度移動の際の細胞増殖調節遺伝子の発現の速度論も、遺伝子 の発現量の定量も明らかにする。 38℃から32℃への温度の移動後のREF-112細胞における、CGR11およびCGR19転 写産物誘導の速度論を、これらの遺伝子の転写誘導が増殖阻害に至るカスケー ドにおける初期の出来事であるのか決定することを目的として行った(図3b)。 誘導速度論は、CGR19に関してはp21WAFl/CIPlと密接に対応していた(図3b)。C GR11に関してはわずかに遅い誘導速度が観察された。これは、これらの遺伝子の 誘導が増殖阻害に至るカスケードにおける比較的初期の出来事であることを示唆 している。誘導された転写産物の発現量は有意に異なり、CGR11は32℃で誘導し たREF-112細胞においてより高く発現していた(図3b)。しかし、CGR11よりもCGR1 9について、基底状態の（誘導しない）転写産物量がより高く存在していた(図２ )。CGR11およびCGR19の発現量は、このREF-112システムにおいてp21WAFl/CIPlお よびサイクリンGと比較して間接的に評価することもできた。誘導されたREF-112 cDNAライブラリーに対するプローブハイブリッド形成では、p21WAFl/CIPlより も２倍高いサイクリンＧ量をもたらし、p21WAFl/CIPlは細胞内の全mRNAの□0.1% で発現し、サイクリンＧは0.2%で発現した。実施例５ 本実施例では、単離された細胞増殖調節遺伝子の配列解析を提供する。 CGR11およびCGR19に対応する全長であろうcDNAを、REF-112 RNAから5'RACE（5 '末端の急速な増幅）およびヒト、胎児脳cDNAライブラリーへのハイブリッド形 成により得た。得られたラットおよびヒトCGR11 cDNAは、長さが1,209および1,1 13bpである。5’RACE解析では、ヒトクローンに関してはより長い5'伸長を持っ たcDNAは得られなかった。CGR11に対するラットおよびヒトcDNAは、それぞれ272 および301アミノ酸のタンパク質産物をコードするオープンリーディングフレー ムを有する(図4a)。どちらのcDNAの予想される開始コドンの上流にも、読み枠に あう終止コドンは一つも見られなかった。ラットおよびヒトCGR11タンパク質の 間の最適な5'整列（allgnment）は、最初のラットCGR11 ATGから７アミノ酸（MS RWLMQ）を欠いており、従ってラットATG開始コドンを最終的に指定することがで ぎない。ラットおよびヒトCGR11タンパク質は65%同一である。加えて、非常に保 存された２つの予想Ca2+結合EFハンドモチーフ（ヒトタンパク質におけるアミノ 酸82-94およびアミノ酸127-139；図4bに上線を引いた）は、ほとんど100%同一で ある。クラスター状の17アミノ酸の繰返し４つが、ヒトCGR11タンパク質のみの カルボキシ末端部分内に存在しており(コンセ ンサス：PGPRGEAEGQAEA［K/R］GDA)、全く異なるターンによって中断される４つ のαヘリカルドメインに似た構造を示唆している。 CGR11およびCGR19タンパク質のIn vitro産生により、それぞれ□37Kdおよび34 Kdの産物を得た。CGR11タンパク質は非常に酸性で、計算された正味の負電荷が- 29でpIは4.21と予想される。 ラットおよびヒトCGR19タンパク質は、アミノ酸レベルで85%同一であり、332 アミノ酸タンパク質の完全長を通して一貫して相同である（図4c)。読み枠にあ う終止コドンは、予想される開始コドンより上流には一つも見つからないが、ラ ットおよびヒトのタンパク質相同体は開始コドンのすぐ上流で分かれており、指 定したATGが本当にCGR19の開始コドンであることをさらに示唆している。CGR１9 の予想タンパク質配列は、タンパク質のアミノ末端の予想される亜鉛結合C3HC4 リングフィンガードメインの領域においてのみ、既知のタンパク質と重要な相同 性を示す（図4d)。リングフィンガーを含むいくつかのタンパク質で見られてい た通り、付随するB-boxドメインはCGR19内には一つも見られなかった。 我々はREF-112細胞から、cDNAの中央部内に130bpのインサートを含む全長CGR1 9 cDNAも単離した。このインサートはエキソン−イントロン境界に一致する5'GT および3'AG末端を含む。これは、細胞内のいくつかのCGR19転写産物が不完全に 加工されているか、または保持されたイントロンを含む代替の転写産物が産生さ れていることを示唆する。この第二のCGR19は、CGR19の最初の140アミノ酸を保 持するタンパク質キメラを作り出す、読み枠にあう終止コドンを予想されるイン トロン内に作り出すだろう。さらに、32℃で誘導したREF-112細胞に由来するRT- PCR解析では、２つのCGR19転写産物の安定な生成と一致する、同等の強さの２つ のバンドが現れる。これらの２つの転写産物から作られる、あり得る異なるタン パク質産物のさらなる解析が、この異なって加工される転写産物が重要であるか どうかを決定するのに必要である。 5'RACE：cDNA末端の急速な増幅を、32℃処理した細胞から回収したREF-112 RN Aを使い、製造者が説明する通りにmarathon kit（Clonetech）を用いて行った。 ラットCGR11およびCGR19の3’末端に特異的なオリゴヌクレオチドを手順の中で 用いた。 DNA配列決定：すべてのcDNAクローンの配列決定を、完全長cDNAに沿って両方 の鎖の配列決定ができるプライマーを利用した、手動のSangerダイデオキシ配列 決定（USB）により行った。複数のクローンを、ラットおよびヒトCGR11およびCG R19 cDNAについて配列決定した。 データベース検索：すべての相同性検索(FASTA)、整列（BESTFIT）および構造 上の特徴（MOTIFS)を、The Genetics Computer Group（GCG）ソフトウエアプロ グラム（Madison、WI）を用いて行った。最終的な検索は、GenBank version 91 を利用して行った。実施例６ 本実施例では、細胞増殖調節遺伝子の増殖抑制特性を明らかにする。 本研究で単離した、異なって発現する遺伝子のあり得る増殖抑制特性を評価す るために、我々はコロニー阻害アッセイにおける、安定トランスフェクションに よる増殖阻害を分析した。調べたすべての遺伝子は、染色体外に維持されるプラ スミド（pCEP）上の唾液腺ウイルス（CMV）プロモーターから発現させ、コロニ ー形成はトランスフェクションの２から３週間後に計上した。対照として、p21W AFl/CIPl 、p53、およびp53アンチセンス構築物もトランスフェクとした。増殖抑 制機能の解析のために、我々は異なるp53対立遺伝子をすべてが持つ、３つの細 胞株を選んだ。すなわち、２つの点突然変異HIS273およびSER309を含むSW480大 腸カルシノーマ細胞株；卵巣カルシノーマ株、SKOV3 IP1、これはp53-nu11であ る；およびp53内に一つの点突然変異MET237を含むグリオブラストーマ細胞株、T 98Gである。 ラットmEH、SM20、CGR11、およびCGR19は、すべていくらかの増殖抑制効果を 示したが、解析した細胞に依存した様々な程度であった（表１に要約した）。こ の相違は、増殖抑制効果に対して臓器特異性という局面があることを示唆する。 p53は一貫して最も強力な増殖阻害効果を示した。以前の結果と一致して、p21WA Fl/CIPl は65-80%の間の阻害を示した。CGR11およびSM20のみがSW480細胞におい て有意な増殖阻害を示したが(それぞれ80%および85%)、調べたすべてのクローン がSKOVIPlおよびT98G細胞において増殖阻害を示し(70-90%阻害)、ヒトの細胞間 でCGR11およびCGR19の機能が保存されている可能性を明らかにしてい る。 上記の結果は、調べたcDNAの増殖阻害機能を示唆するものであるが、これらの タンパク質の過剰発現が非特異的な毒性のために、観察された阻害効果をもたら したという可能性が残っている。この可能性に焦点をあてるために、我々はヒト CGR11cDNA内のEFハンド欠失変異体を構築し、このタンパク質を増殖阻害能につ いて評価した。EFハンドを含むタンパク質を用いた以前の結果は、２つのEFハン ドモチーフのうちの一つを欠失させた結果、Ca2+結合能に関しては機能的なタン パク質が得られたということを示唆する。従って、我々はこの解析のために、ヒ トCGR11内の両方のEFハンドドメインを欠失させた(CGR11ΔEF、アミノ酸82-139) 。EFハンドを欠失したCGR11 cDNAトランスフェクタントは、SKOV3 IP1細胞にお いてコロニー形成を阻害できなかった(表1)。ヒト野生型CGR11 cDNAは細胞増殖 を、調べた変異体と比較して8%まで(SKOV3 IP1)および58%まで(T98G)抑制した。 従って、少なくともCGR11に関しては、観察された増殖抑制効果は構造-機能相関 を増殖阻害に反映しものであるかもしれない。同様の解析は、CGR19内のリング フィンガードメインに関して進行中である。 本発明の原理、好ましい態様および実施方法は、先行する明細書に記載されて いる。しかし、本明細書中で保護しようと意図する発明は、限定というよりはむ しろ説明として考えられるので、開示した特定の形態に限定されるとはみなされ ない。変化および変更は、本発明の精神から離れることなく、当業者によってな され得る。 Tab1e１ 細胞増殖調節遺伝子によるコロニー形成阻害 a実験はデュプリケートで行った。b pCEP4ベクターのみ N.D.，測定せずDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                             Cell growth regulatory geneBackground of the Invention   Significant progress has been made in identifying a number of potential growth effectors in cells . Previous analyzes evaluated the effects of cell environment, growth factors and stress phenotypes, One that has begun to unravel the underlying molecular events that disrupt cell proliferation It is recent. In many cases, the specific cause of the cell growth response is reduced transcription. Can be attributed. Indeed, the development of recent genes directly related to cell cycle regulation Look was to a large extent based on differential gene expression analysis .   The p53 gene is undoubtedly important for this gene in regulating cell growth Most frequently mutated gene in human cancers It continues to be. The function of p53 depends on viral or cellular proteins and cells. Can be attenuated by interactions with quality sequestration and ultimately alter cell growth potential. Is leading to p53 responds to DNA damage and directly inhibits DNA replication, Or it is thought that it exerts a growth regulation function by inducing apoptosis However, most of the data indicate that the primary function of p53 is It is to regulate the effector gene transcriptionally. p53 is a strong transcriptional activity domain And can bind to DNA in a sequence-specific manner, It anticipates both transcriptional activity and repression of the target gene.   Products that have been suggested to directly affect the control of cell growth and / or survival P21, a p53 transcription-responsive geneWAFl / CIPl, MDM2, GADD45, HIC, Rhino Identification of Clin G, and BAX, has been shown to regulate p53 expression when regulating expression levels of growth response genes. Emphasize the central role. Until recently, by p53, the most characterized Two of the direct effectors of transcriptionally regulated cell growth are p21WAFl / CIPl And MDM2. p21WAFl / CIPlIs a cyclin-dependent kinase during the cell cycle Interacts directly with (CDK) proteins to function as CDK inhibitors You. P21 by transductionWAFl / CIPlOverexpression is associated with cellular proliferation in a wide range of cancer cell lines. Inhibits breeding. On the other hand, MDM2 functions by negatively regulating p53 activity. , MDM2 overdose Currently leads to unregulated cell growth and tumorigenesis. However, p53-induced transcription The response appears to be ill-conserved, which is cell type dependent Sex, genetic and species-dependent factors may contribute to p53 responsiveness Suggest that there is. For example, p21WAFl / CIPlAnd MDM2 are both temperature-sensitive p53 In rodent cells containing the prostate gene, it is transcriptionally active in a p53-dependent manner. But p21WAFl / CIPlIs only induced in a similar human system. In addition And p21WAFl / CIPlActivation is both p53-dependent and -independent Which is indicated by p21WAFl / CIPlSuggests many pathways for the control of Sa In addition, the level of apoptosis-regulating gene products such as BCL2 or E1B Facilitates deciding whether to undergo 53-dependent growth arrest or apoptosis It is clear that. These results use many effector gene products. Complex regulatory cascade determines cell fate with respect to cell growth potential Suggest that. The complex nature of cell growth regulation is a factor that affects cell growth regulation. He emphasizes the need to further clarify the child components.Summary of the Invention   It is an object of the present invention to provide a DNA molecule encoding a mammalian cell growth regulatory protein. Is the purpose.   It is another object of the present invention to provide a mammalian cell growth regulatory protein.   Selectively binds to mammalian cell growth regulatory proteins and can be used for its analysis It is yet another object of the present invention to provide a possible antibody.   It is another object of the present invention to provide a method for inhibiting the growth of tumor cells. is there.   It is another object of the present invention to provide a diagnosis and a diagnostic method for cancer.   It is an object of the present invention to provide antisense constructs useful for stimulating cell proliferation. Is the purpose.   Antisense oligonucleotides for inhibiting the expression of cell growth regulatory genes It is an object of the present invention to provide   It is another object of the present invention to provide a method for inducing cell division and proliferation. You.   Providing a method for assessing susceptibility to cancer is a further object of the present invention. It is a target.   These and other objects of the present invention are directed to one or more of the following: Provided by the embodiments of the present invention. In one embodiment of the present invention, the mammalian CGR11 or CGR19 An isolated and purified subchromosomal DNA molecule that encodes a protein Is provided.   According to another aspect of the present invention, isolated and purified mammalian CGR11 or Provided a CGR19 protein.   In another embodiment of the present invention, specifically for mammalian CGR11 or CGR19 protein An antibody that binds is provided.   According to another aspect of the present invention, there is provided a method for inhibiting the growth of tumor cells. This The method is         Steps of administering mammalian CGR11 or CGR19 protein to tumor cells Including floors.   According to another aspect of the present invention, there is provided a method for inhibiting the growth of tumor cells. This The method is         Mammalian protein selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20 Administering to the tumor cells a DNA molecule that causes expression of Including the stage.   According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for the diagnosis of cancer. This The method is         Test the tissue and make sure that the tissue is CGR11, CGR19, mEH and And a mammalian protein selected from the group consisting of Determining whether the encoding mRNA is less expressed Including the stage.   According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for the diagnosis of cancer. This The method is         The tissue is tested to determine if the DNA in said tissue is CGR11, CGR19, mEH and SM20. A variant of a mammalian gene coding sequence selected from the group consisting of: To determine whether the coding sequence contains a variant that differs from the wild type, To be able to Including the stage.   In another embodiment of the present invention, the antisense CGR11, CGR19, mEH and SM20 constructs Is provided. This construct is:         a. Transcription promoter         b. Transcription terminator         c. a mammalian protein selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20 A DNA segment that contains one or more segments of a quality gene coding sequence. Thus, the gene coding sequence is divided into the promoter and the terminator. And the DNA segment is located between the promoter and the terminator. The RNA produced by the transcription of the DNA segment Said DNA section being complementary to a corresponding section of mRNA produced by a mammalian cell; including.   In another aspect of the invention, an antisense of CGR11, mEH, SM20, or CGR19 is provided. A oligonucleotide is provided. This oligonucleotide is a mammalian CGR11 Alternatively, it comprises at least 10 nucleotides that are complementary to CGR19 mRNA.   According to one aspect of the present invention, there is provided a method for promoting cell division and proliferation. It is. This method         For mammalian genes selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20, Antisense oligonucleotides that comprise CGR11, CGR19, mEH and SM20 At least 10 nucleotides complementary to a mammalian gene mRNA selected from the group consisting of: Is administered to the cells to inhibit the expression of CGR11, CGR19, mEH and SM20. That Including the stage.   According to another aspect of the present invention, there is provided a method for promoting cell proliferation. This method         Compatible with mammalian genes selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20 Supplement A triplex-forming oligonucleotide comprising at least 10 nucleotides Administered to mammalian cells and selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20. Inhibiting expression of the milk gene; Including the stage.   According to another aspect, another method is provided for promoting cell growth. this The method is       Mammalian cells are treated with an animal selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20. A chisense gene construct,         a. Transcription promoter         b. Transcription terminator         c. contains one or more segments of the mammalian gene coding sequence DNA section, wherein the gene section is the promoter and the terminator Wherein the DNA segment is located with respect to the promoter and the terminator. The reverse is so that the RNA produced by the transcription of the DNA segment converts the RNA into mammalian cells. Said DNA section to be complementary to the corresponding mRNA section produced by the vesicle; Administering a gene construct comprising: inhibiting expression of a mammalian gene; Including the stage.   According to another aspect of the present invention, there is provided a method for assessing susceptibility to cancer. . This method   Tissues selected from the group consisting of blood, chorionic villi, amniotic fluid, and pre-implantation embryo blastomeres Testing, the DNA in said tissue is selected from the group consisting of CGR11, CGR19, mEH and SM20 Determining whether it contains the altered variant gene coding sequence, Including the stage.   The present invention therefore provides the field relating to additional diagnostic and therapeutic measures, whereby Deals with cancer risk assessment, early stage cancer, and obvious cancer.   BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1: REF-112 RNA characterization. FIG. 1a, kinetics of WAF1 induction. Time shown (hours), 3 Total RNA from RFE12 cells maintained at 2 ° C. was probed with rat WAF1 cDNA. FIG. 1b, Cyclin G RT-PCR. REF-112 cells maintained at 38 ° C or 32 ° C for 8 hours Total RNA recovered from the cells was reverse transcribed with a fixed oligo-dT primer. PCR And a primer specific to the 3 'end of rat cyclin G. The arrow indicates a differentially expressed rat of about 300 base pairs. 3 shows a tocyclin G RT-PCR product. Figure 1c, Northern RNA of total RNA from REF-112 cells Analysis. The cyclin G RT-PCR cDNA described in Figure 1b is maintained at 38 ° C or 32 ° C Was used as a probe for RNA isolated from REF-112 cells.   Figure 2: Differentially expressed expression from REF-112 cells containing wild-type p53 Denko. CGR11 (FIG. 2a), CGR19 (FIG. 2b), SM20 (FIG. 2a) maintained at 38 ° C. and 32 ° C. (8 hours) RT-PCR and Northern analysis from REF-112 cells expressing 2c) and mEH (FIG. 2d) . Arrows are cut out, re-amplified, and used as probes for accompanying Northern analysis 3 shows the differentially expressed cDNA. Lane 1, Lane 3; 8 REF-112 RNA maintained at 32 ° C., collected after incubation for hours. Lane 2, Les Lane 4: REF-112 RNA maintained at 38 ° C. Duplication samples are prepared for total RNA Isolated independently from the product.   Figure 3: Expression diagram for CGR11 and CGR19. Figure 3a; CGR11, CGR19, and β-act Chin specific32Multiple sets of rats probed with P-labeled cDNA fragments Woven Northern blot. FIG. 3b; induction kinetics of CGR11 and CGR19. Shows REF-112 cells The temperature was maintained at 32 ° C for hours. Total RNA is isolated, electrophoresed, blotted, and Specific for rat CGR11 or CGR1932Probe with P-labeled cDNA did.   Figure 4: Amino acid sequences of rat and human CGR11 and CGR19. Figure 4a; human (top) and Deduced amino acid sequence of rat and rat (lower) CGR11. Dash is human and rat distribution Indicates a match between columns. Asterisk indicates deletion present in rat CGR11 sequence . The underline indicates the two putative EF-hand domains. Figure 4b, Consensus EF- CGR11 EF-hand domains I and II aligned with the Han domain. Different from human sequence Rat amino acids are underlined. Fig. 4c, human (top) and rat (bottom) CG Deduced amino acid sequence of R19. Overlined sequences are potential zinc-binding, Encodes a ring-finger domain. Dashes are human and rat sequences Indicates a match between Figure 4d, CGR-9 phosphorus-finger domain Aligned with the ring-finger sequence.   Detailed description of preferred embodiments   The present inventor has identified four previously unknown p53-regulated Genes are regulated by p53 and are shown to regulate growth herein. And discovered. Two of the isolated genes, rat SM20 and rat and human mEH, Genes already described, but not p53 status and transcriptional induction of these genes The relationship between them has not been established before. Two other genes, CGR11 And CGR19 have not been previously isolated or described.   Rat SM20 was first isolated by analysis of PDGF-A-induced transcription of vascular smooth muscle cells. However, the function of rat SM20 has not yet been elucidated. on the other hand, mEH may be involved in catalytic detoxification of xenobiotics, including metabolically reactive epoxides It has been known. No known relationship between mEH and wild-type p53 is known, Epoxide-mediated induction of p53 activity maintains gene stability in the presence of toxins Could help you.   We utilize the well-characterized murine temperature-sensitive p53 mutation VAL135. Thus, the transcription reaction of the wild-type p53 protein was identified. Activated RAS and p53-VAL135 The growth of transduced rat embryo fibroblasts (REF-112) is temperature sensitive. this Proliferation of these cells at 38 ° C caused p53 mutation in a mutant structure complexed with HSP70 in the cytoplasm. Maintain protein. When REF-112 cells were transferred to 32 ° C, p53 protein became wild-type It translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes. These cells Was initially described as growth arrest, especially in the G1 phase of the cell cycle. we , Differential from rat cells that are temperature sensitive to p53 function Transcription analysis was used. We exist at temperatures that allow replication, however, Those transcripts that were not present at temperatures that did not allow for production were identified.   DNA molecules according to the present invention are isolated from other gene sequences and purified. They are either genomic or cDNA sequences, i.e. they are intervening May or may not contain a sequence. Human CGR11, human CGR19 , The nucleotide sequences of the coding regions of rat CGR11 and rat CGR19 are respectively SEQ ID Nos: 1, 3, 5, and 7. Other mammalian homologs have been disclosed. Library using nucleotide probes or primers derived from the sequence Can be easily obtained by screening for Genomic clones, Using YAC or P1 clones with probes from the gene coding region It can be obtained by screening such a genomic DNA library. Genetic Allele types are also within the scope of the present invention. These affect the coding sequence It may have either no effect mutations or polymorphisms leading to amino acid differences. Ami Acid differences can cause or alter the function of proteins. There is the possibility of the inside.   Denatured using the protein sequences shown in SEQ ID Nos: 2, 4, 6, and 8. The corresponding gene and related mammal using the oligonucleotide probe The CGR gene can be identified and obtained. One or more modified Use probes to hybridize to cDNA or genomic DNA libraries Can be achieved. CGR gene hybridizes with denatured probe Can be identified. Gene identification can be based on one or more of the following features: Can be ascertained on the basis of gender: Approximate size, similarity to proteins of SEQ ID Nos: 2, 4, 6, or 8 Or the up-regulation of mRNA for genes by wild-type p53. Strange The design and conditions of use of a modified probe are well known in the art. ing. The full-length gene or a portion of the cDNA can be obtained by isolating the full-length gene. Alternatively, it can be similarly isolated without isolating the full-length gene. Or CG Antibodies that specifically bind to the R protein (s) are shown in SEQ ID Nos: 2, 4, 6, and 8. To the protein or polypeptide portion of the protein Can be Using these antibodies, similar or related epitopes Clones in an expression cDNA library expressing the strain can be selected. Portions of the identified CGR gene may be due to restriction endonucleases or to some It can be made by fragmentation of a gene by sequence amplification. For hybrid formation Or part of the CGR gene isolated by antibody binding It can also be used directly without having to do it.   Currently, sequences of four mammalian cell growth regulatory genes are provided. Can easily obtain the encoded protein. These are bacteria, yeast, Alternatively, it can be expressed in other convenient cells. Expression vectors are available in the art. By ligating the coding region to a vector known in the art Can be built. In general, vectors are promoters, enhancers, Expression control sequences such as termination of transcription signals may be included. Therefore, The coding sequence in the correct location and orientation with respect to the expression control sequence This allows expression of the selected mammalian protein in the desired host cell. Obtain an expression vector that can be directed. Suitable vectors are available in the art. Known in the field and can be based on plasmids or viral genomes. Be Suitable host cells for the vector are also known, and the rare Can choose for desired properties   A portion of the selected protein is synthesized and used as a carrier protein for immunization of experimental animals. Can bind to proteins and produce these specifically immunoreactive antibodies. You. This antibody can be used to purify proteins from natural or recombinant sources. Can be Such antibodies may be polyclonal for convenience in certain applications. Or monoclonal. Specific to the disclosed CGR protein Antibodies that bind to DNA are routinely screened, as is well known in the art. Can be easily isolated using   As described herein, cell growth regulatory proteins can be used to proliferate against tumor cells. Has an inhibitory effect. Thus, administration of a cell growth regulatory protein to tumor cells, Or to those using constructs that would result in expression of the protein Administration of the corresponding gene may be preferable to effect such growth suppression There is. The protein of the present invention is formulated as a pharmaceutical composition for administration to humans. Can be Generally, these are exothermic, diluents or excipients It may be in a sterile dosage form in the preparation. This dosage form is suitable for both intranasal and parenteral administration. Combine. Other cells associated with proliferative disorders also include cell growth-regulating gene-mediated growth suppression Target. Such proliferative disorders include dryness, polyps, restenosis, warts, Including, but not limited to, inflammatory diseases. Cell growth regulatory proteins The tumor cells can be administered in a suitable dosage form. They can be microinjected into tumor cells, Or simply supplied from outside. They are coated, for example, in liposomes. Can be wrapped. When administered to mammals, achieves tumor suppression in the circulation Is desirable. Tumor suppressive effect is 10%-TenFrom 10-6M thick You can reach your goals at the right time. Encodes a cell growth regulatory protein When DNA is administered to a tumor cell, the cell grows its own cells to suppress growth A regulatory protein can be expressed. Such DNA, as described above, It can be genomic DNA or cDNA. Other cells associated with proliferative disorders are similar And can be processed.   The cell growth regulatory gene of the present invention is now regulated by wild-type p53. Is shown. Therefore, expression of any of the cell growth regulatory genes is Can be used as a current marker. Reduced or altered wild-type p53 expression Growth-regulated genes compared to normal tissue, so that the presence of different p53 expression indicates cancer A decrease in expression of can be indicative of cancer. Analysis of cell growth regulatory gene expression Can be used in addition to or instead of direct wild-type p53 analysis. it can. Tissues that are suitable for comparative purposes to provide normal controls are generally Is a morphologically normal tissue close to. Presence of expression of cell growth regulatory genes Alternatively, test the amount using an antibody or nucleic acid probe specific for the cell growth regulatory protein. Or all or part of the sequence of SEQ ID Nos: 1, 3, 5, or 7 A primer of at least about 10 nucleotides, or as known in the art Can be done by any of the other tests.   Similarly, test the DNA of the tumor tissue to determine if it contains the mutation Can be Mutations in cell growth regulator genes, like p53 mutations, Giving cells a tumorigenic phenotype. Mutations determine the sequence of the gene in the tissue being tested. And compare that sequence to the sequence disclosed in SEQ ID Nos: 1, 3, 5, or 7. Can be determined. Such mutations can be germline or body It can happen in an organization. When a mutation occurs in a body tissue, Will not find a mutation. If the mutation occurs in the germline, all Mutations found in tissues that may be susceptible to cancer, like germline p53 mutations U. Tissues suitable for testing for germline mutations include blood, mucosal smear, and offspring. Includes cervical smear, skin, chorionic villi, amniotic fluid, and preimplantation blastomeres.   Antisense cell growth regulatory gene constructs are transcription promoters and transcription terminators. (A polyadenylation signal) with DNA segments between them. DNA classification Contains one or more gene segments that regulate cell growth, In an object, it is reversed compared to the direction of the mammalian genome. Transcription promoter for this construct Transcription from promoters is regulated by cell growth-regulated promoters in normal mammalian cells. Produces (antisense) RNA molecules complementary to cell growth regulatory gene RNA . The promoter used to make the antisense RNA appointment was based on a specific It can be an inducible promoter that can be regulated by a potent substance. For example, meta The rothionine promoter or hormone-responsive promoter is conveniently used. Can be used. Other promoters and terminators are conveniently used for specific applications it can. In addition, desired enhancers may be used using enhancers known in the art. Protein expression can be enhanced.   The antisense cell growth-regulating gene construct of the present invention is applied to one type of cell. To produce antisense RNA and use techniques known in the art. Can be applied to other cells. Alternatively, a cell growth regulatory gene construct Finally, it can be administered to the final target cells where regulation of cell growth regulatory genes is desired. cell Suitable methods for introducing a DNA construct into a DNA are known in the art. Antise The administration of the transfection construct is performed by transfection, as is known in the art. , Transformation, electroporation, fusion, and the like. Fine Inhibition of vesicle growth regulatory gene expression causes cells to proliferate and divide, preventing cell death. this is, A large number of cells grow in culture, such as when culturing epidermal cells for transplantation Can be particularly useful in situations where it is desirable to do so. Or a cell in the body Administration to aging or senescent to prevent aging Desirable for certain cells or for immune cells or cells of the gastrointestinal tract Can be something.   Cell growth regulatory gene antisense oligonucleotides are also discussed above Such is provided for the same purpose as the antisense construct. Oligonucleotide Otides are at least 10 nucleotides in length and have between 20 and 30 nucleotides. Can be They can be regular nucleotides, or nucleotide analogs, or Or a mixture of the two. Analogs are methylphosphonate, aminoal Kill phosphonate, phosphorothionate, phosphorodithionate, substituted or unsubstituted Includes substituted phosphoramidates. Antisense oligonucleotides are circular molecules In general, natural cell growth regulatory genes made from mammalian cells can be used. A linear, single-stranded molecule that is complementary to the offspring mRNA. These are passive or In liposomes, so that they are taken up by cells by receptor-mediated transport Alternatively, it can be administered to the cells bare. Antisense oligonuclease Otide is specifically designed to be complementary to the 5 'end of mRNA, especially the transcription initiation site. Is usually preferred. However, other parts of the mRNA molecule It has been found that the method is susceptible to inhibition of Can be used. A secondary structure in which hydrogen bonds with other parts of the same molecule are related It is also preferable to avoid parts of the mRNA as targets for antisense nucleotides No. For example, it is apparently related to the stem morphology of the stem-loop structure. It is preferable to avoid sites.   Cell growth regulatory gene expression can also be induced by interference with transcription, Complexing with a segment of otide or a cell growth regulatory gene creates a triple- By adding modified oligonucleotides that can form main strands, triplexes) , Can be suppressed.   The following examples are provided for illustrative purposes only, and The present invention is not limited to the scope of the present invention described above.                                  Example Example 1   Preliminary studies reveal the utility of a temperature-sensitive p53 system.   Total RNA prepared from cells cultured at both 38 ° C and 32 ° C was first regulated to p53. Characterization with respect to known genes The feasibility of differential display analysis was evaluated. p21WAFl / CIPlNo Southern analysis showed rapid transcription induction, indicating that p21WAFl / CIPlTransfer RNA to 32 ℃ The peak reached 8-10 hours later (Fig. 1a). 8-10 hours after we moved to 32 ℃ A similar kinetics of induction of apoptosis within was revealed.   For the differential transcription analysis described herein, we have an 8 hour invitation. I chose the lead time. At this point, rat p21WAFl / CIPlAnd rat cyclin G Northern analysis showed that the amount of each transcript was large at the growth inhibition temperature of 32 ° C. Little or no transcript in cells grown exponentially at 38 ° C (FIG. 1). Cyclin G and p21WAFl / CIPlBoth are the same Seemed to be induced.   For total RNA isolated from both growth conditions, at the 3 'end of rat cyclin G Perform RT-PCR reactions with specific primers to characterize RNA preparations After that, a novel gene regulated by p53 was identified. As expected, the differential A 300 bp band was detected in RNA induced at 32 ° C. Absent in RNA from cells (FIG. 1b). Cut the cyclin G RT-PCR band Cloning and Northern analysis (Figure 1c). Was confirmed to be identical to rat cyclin G (data not shown).   Cell culture: rat embryo fibroblasts REF-112 (p53-VAL135) and REF-132 (p53-VAL135) PHE132) (kindly courtesy of B. Vogelstein and M. Oren) 5% CO in DMEM containing 5% fetal bovine serumTwoCulture at either 38 ° C or 32 ° C Nourished. 48 hours prior to any temperature transfer, cells were split and seeded. Temperature transfer Place the subconfluent flask in a pre-equilibrated incubator, The transfer was performed simply without changing the medium. 4x10 for transfectionFive Cells (T98G and SW480 cells) or 0.8 x 10Five6 wells (SKOV3-IP1) Sprinkled in culture dishes. Use Lipofectin (Gibco / BRL) as described by the manufacturer And transfection was performed. Briefly, 40 μl of serum-reduced medium (OP TIMEMTMGiboco / BRL) was added to 2 μg of DNA. Contains 10 μl Lipofectin 50 μl of the mixture and 40 μl of OPTIMEMTMThe DNA mix Added to the combined solution. After incubating at room temperature for 15 minutes, 1 ml of OPTIMEMTMAdd The mixture was overlaid on cells washed with optimem. 5 hours at 37 ℃ / 5% COTwoI Incubate in incubator, then transfection mixture Was replaced with normal growth medium. 44 hours later, hygromycin (0.25mg / ml) The cells were distributed on a selection medium containing. 12-14 days later, 2% methylene bull in 50% ethanol The colonies were stained with a mouse and counted. Only colonies containing more than 50 cells were picked .   RNA isolation: directly in RNAzol B (Tel-Test, Inc.) as described by the manufacturer Total RNA was isolated by solubilization. MessageMakerkit as described by the manufacturer (Gibco / BRL) from total RNA preparation using poly A+RNA was isolated.   RT-PCR reaction: 5 mM MgClTwo/ 10mM Tris, pH8.3 / 10mM KCl / 20μM dNTP's / 20units  Rnase inhibitor (Perkin Elmer) / 50μM T12200 ng total RNA and 50 units M in NN Using MLV reverse transcriptase (Perkin Elmer), sample (without reverse transcriptase) at 65 ° C for 5 minutes The reverse transcription reaction was carried out while warming, and then the reaction solution was placed at 37 ° C. for 5 minutes. Reverse transcription at 37 ° C For 55 minutes. Incubate at 95 ° C for 5 minutes to allow RT reaction Was inactivated. 1.5mM MgClTwo/ 10mM Tris pH8.3 / 10mM KCl / 4μM dNTP's / 2.5u nits Taq polymerase (Perkin Elmer) / 10μCi35S-α-dATP (12.5μCi / μl, N EN) / 50μM T12Use 2 μl reverse transcription reaction in MN and 0.2 μM random 10-mer A PCR reaction was performed. In a thermocycler, 94 ° C for 3 seconds / 40 ° C for 2 minutes / 72 ° C for 3 seconds The PCR reaction was performed for 40 cycles of 0 seconds. 38% formamide / 8mMEDTA By adding /0.02% bromophenol blue and xylene silanol, The reaction was terminated. Warm the sample for 2 minutes at 70 ° C, 6% denaturing polyacrylamide gel Run on top. After drying the gel on Whatmann 3MM paper and exposing it to film, PCR The product was purified. 120 μl H of the excised bandTwoResuspend in O for 10 minutes at room temperature , Followed by boiling for 15 minutes. Centrifuge the residue to pellet and add 10 μl of 3M sodium acetate. 100 μl eluted with 5 μl of 10 mg / ml glycogen, 400 μl ethanol Was added to the DNA. DNA was precipitated overnight at -20 ° C. Pellet the DNA and mix with the original RT -Amplify using the same primers used for PCR, purify the gel, and use pCRII (InV Itrogen).   Oligonucleotides: dT for cyclin G RT-PCR reactions12GC and 5'-TCT An approximately 300 bp fragment was amplified using the TCACTGC-3 'primer pair.   Northern analysis: 10-20 μg total RNA electrophoresed on 1.2% formaldehyde gel Was used to perform Northern analysis. Search by blotting and probe (pr obing) was as originally described. The probe is a random probe Α- by Lime (BMB)32This was a P-labeled gel-purified cDNA fragment. Rat tissue Lots were obtained from Clontech and probed as recommended by the manufacturer, It was stripped and probed again. Rat WAF1 cDNA, B.Vog Courtesy of elstein.Example 2   In this example, a temperature-sensitive p53 system was used to identify genes regulated by p53. Make it clear.   To identify other genes that are regulated by growth, we used 12 "fixed Using an "oligo dT primer" in combination with 25 "random" 10-mers, RT-P A CR reaction was performed. RT-PCR reactions were derived from REF-112 cells maintained at 38 ° C or 32 ° C. Independently isolated total RNA was performed in duplicate. Rat p21WAFl / CIPl Alternatively, primer pairs that would amplify any of MDM2 were excluded.   A total of 35 differently expressed RT-PCR products were combined with the product at the induction temperature of 32 ° C alone. Based on induction, they were selected for further analysis. Duplicate RT-PCR reactions with RNA samples Performed, but potentially skip all reactions involving the transcript of interest. Is a common problem in differential display analysis , Further avoiding possible artifacts. In the subsequent Northern analysis, these RT-PCR products All but four were expressed as differentially expressed genes. These four Control cells (REF-1) with non-temperature sensitive p53 mutations cultured at 32 ° C RNA from 32 cells [PHE132]) did not show any induction of transcription, This suggests that induction is not only due to temperature shifts, but also due to mutations. Guided Two of the genes identified were previously SM20 and microsomal epoxide hydroxylase. It is described including element (mEH). For correlated gene expression analysis, this Described these genes as differentially expressed depending on growth conditions However, transcription of these genes was not previously linked to p53 expression.   Differential RTs derived from two new cDNAs, designated 11 and 19 -PCR products are shown in Figure 2 as well as SM20 and mEH. Each of these partial cDNAs Northern analysis of these transcripts showed that these transcripts were cultured at 38 ° C or 32 ° C. It was confirmed that the expression was different in the vesicle.   Oligonucleotides: 12 immobilized oligo-dT primers (dT12[A, C, G] [ A, C, G, T] and 25 random 10-mers were used in the RT-PCR reaction. Sa For the Eclin G RT-PCR reaction, dT12GC and 5'-TCTTCACTGC-3 'primer pair Was used to amplify a □ 300 bp fragment. RT-PCR amplification of specific clones Achieved using primer pairs. That is, CGR11: dT12AT / TACAACGAGG; SM20: d T12GG / GATCATAGCG; CGR19: dT12CG / GATCATAGCC; mEH: dT12CA / GATCATGGTC .Example 3   In this example, the tissue-specific expression of newly identified genes, CGR11 and CGR19, was determined. Reveal.   The partial cDNA fragments 11 and 19 were used as probes for expression analysis from various rat tissues. (FIG. 3a). Using a partial 11 cDNA probe, a 1.3 kb transcript is And are widely found in the kidney and kidney, with limited expression in the heart, lung, liver and skeletal muscle. And limited expression patterns with no detectable expression in testis Was observed. When partial cDNA 19 was used as a probe, a 1.4 kb transcript The testis showed the highest expression level and a more ubiquitous expression pattern. This Since none of these genes have been described previously, we chose these and The cells were named cell growth regulator genes CGR11 and CGR19.Example 4   In this example, the kinetics of expression of the cell growth regulatory The quantification of the expression level is also clarified.   CGR11 and CGR19 turnover in REF-112 cells after a temperature shift from 38 ° C. to 32 ° C. The kinetics of transcript induction are cascaded when transcriptional induction of these genes leads to growth inhibition. This was done to determine if this was an early event in the world (Figure 3b).   Induction kinetics is p21 for CGR19WAFl / CIPl(Figure 3b). C A slightly slower induction rate was observed for GR11. This means that these genes Induction suggests a relatively early event in the cascade leading to growth inhibition are doing. The expression levels of the induced transcripts were significantly different, and CGR11 was induced at 32 ° C. REF-112 cells expressed higher (FIG. 3b). However, CGR1 than CGR11 For 9 there was a higher amount of transcript in the ground state (not induced) (FIG. 2). ). The expression levels of CGR11 and CGR19 were determined in this REF-112 system by p21WAFl / CIPl And indirectly compared to cyclin G. Induced REF-112  For probe hybridization to cDNA libraries, p21WAFl / CIPlThan Also resulted in a 2-fold higher amount of cyclin G, and p21WAFl / CIPlIs □ 0.1% of total mRNA in cells And cyclin G was expressed at 0.2%.Example 5   This example provides sequence analysis of an isolated cell growth regulatory gene.   Full length cDNAs corresponding to CGR11 and CGR19 were excised from REF-112 RNA by 5'RACE (5 'Rapid amplification of the termini) and hybrid forms to human and fetal brain cDNA libraries Obtained by synthesis. The resulting rat and human CGR11 cDNAs were 1,209 and 1,1 13 bp. 5 'RACE analysis shows longer 5' extension for human clones CDNA was not obtained. Rat and human cDNAs for CGR11 were 272 each. And open reading frame encoding a protein product of 301 and 301 amino acids (FIG. 4a). An open reading frame upstream of the predicted start codon of either cDNA No matching stop codon was found. Rat and human CGR11 protein The optimal 5 'alignment between the first rat CGR11 ATG and the 7 amino acids (MS RWLMQ), thus making it possible to ultimately specify the rat ATG start codon. I can't do it. Rat and human CGR11 proteins are 65% identical. In addition, very secure Two expected Ca2+Binding EF hand motif (amino in human protein Acids 82-94 and amino acids 127-139; underlined in Figure 4b) are almost 100% identical is there. Four repetitions of 17 amino acids in a cluster form only human CGR11 protein Present in the carboxy terminal NSS: PGPRGEAEGQAEA [K / R] GDA), four interrupted by completely different turns Suggests a structure similar to the α-helical domain of   In vitro production of CGR11 and CGR19 proteins resulted in □ 37 Kd and 34 Kd, respectively. The product of Kd was obtained. CGR11 protein is very acidic and has a calculated net negative charge of- At 29 the pI is expected to be 4.21.   Rat and human CGR19 proteins are 85% identical at the amino acid level, with 332 Consistently homologous throughout the full length of the amino acid protein (FIG. 4c). In the reading frame Although no stop codon is found upstream of the expected start codon, And human protein homologs are separated immediately upstream of the start codon, It further suggests that the specified ATG is indeed the start codon of CGR19. CGR19 The predicted protein sequence of is the predicted zinc-binding C at the amino terminus of the protein.ThreeHCFour Significant homology to known proteins only in the region of the ring finger domain (Fig. 4d). Found on several proteins, including ring fingers As noted, no associated B-box domain was found in CGR19.   We derived from REF-112 cells a full-length CGR1 with a 130 bp insert in the middle of the cDNA. 9 cDNA was also isolated. This insert has a 5'GT matching the exon-intron boundary. And 3'AG end. This indicates that some CGR19 transcripts in cells are defective. Alternative transcripts containing processed or retained introns are produced. Suggest that This second CGR19 retains the first 140 amino acids of CGR19. Create a protein chimera that has an expected stop codon that matches the reading frame Will be created in Tron. In addition, RT-derived from REF-112 cells induced at 32 ° C. In PCR analysis, two of equal strength, consistent with stable production of two CGR19 transcripts Band appears. Possible different proteins made from these two transcripts Further analysis of protein products will be important for this differentially processed transcript Necessary to decide.   5'RACE: REF-112 RN recovered from cells treated at 32 ° C with rapid amplification of cDNA ends. A was performed using a marathon kit (Clonetech) as described by the manufacturer. Oligonucleotides specific for the 3 'end of rat CGR11 and CGR19 Using.   DNA sequencing: sequencing of all cDNA clones, both along full-length cDNA Manual Sanger dideoxy sequence using primers capable of sequencing the strand Decided (USB). Multiple clones were used for rat and human CGR11 and CG The R19 cDNA was sequenced.   Database search: All homology search (FASTA), alignment (BESTFIT) and structure The above features (MOTIFS) were added to The Genetics Computer Group (GCG) software Grams (Madison, WI) were used. The final search is GenBank version 91 I went using.Example 6   In this example, the growth-suppressing properties of cell growth-regulating genes will be clarified.   Evaluate the possible growth inhibitory properties of differentially expressed genes isolated in this study For stable transfection in colony inhibition assays Growth inhibition was analyzed. All the genes examined were plasmids maintained extrachromosomally. Expression from the salivary gland virus (CMV) promoter on Smid (pCEP) Formation was counted 2-3 weeks after transfection. As a control, p21W AFl / CIPl , P53, and p53 antisense constructs were also transfected. Growth suppression For the analysis of regulatory function, we used three subspecies, all with different p53 alleles. A cell strain was selected. That is, SW480 large containing two point mutations HIS273 and SER309 Intestinal carcinoma cell line; ovarian carcinoma line, SKOV3 IP1, which is p53-nu11 A glioblastoma cell line containing one point mutation MET237 in p53, T 98G.   Rat mEH, SM20, CGR11, and CGR19 all have some anti-proliferative effects. As shown, to varying degrees depending on the cells analyzed (summarized in Table 1). This This suggests that there is an aspect of organ specificity for the growth inhibitory effect. p53 consistently showed the strongest growth inhibitory effect. Consistent with previous results, p21WA Fl / CIPl Showed between 65-80% inhibition. Only CGR11 and SM20 in SW480 cells Showed significant growth inhibition (80% and 85%, respectively) but all clones examined Shows growth inhibition in SKOVIPl and T98G cells (70-90% inhibition), Reveals that the functions of CGR11 and CGR19 may be preserved. You.   Although the above results suggest a growth inhibitory function of the cDNAs examined, these Protein overexpression results in observed inhibitory effects due to non-specific toxicity The possibility remains. To focus on this possibility, we An EF-hand deletion mutant in CGR11 cDNA was constructed and this protein was tested for its ability to inhibit growth. And evaluated. Previous results using proteins containing EF hands have shown two EF hands. As a result of deleting one of the2+Functional binding It suggests that Parkin was obtained. Therefore, for this analysis, we Both EF hand domains in CGR11 were deleted (CGR11ΔEF, amino acids 82-139) . CGR11 cDNA transfectants lacking the EF hand are transferred to SKOV3 IP1 cells. And could not inhibit colony formation (Table 1). Human wild-type CGR11 cDNA grows cells Was suppressed by up to 8% (SKOV3 IP1) and by up to 58% (T98G) compared to the mutants examined. Therefore, at least for CGR11, the observed growth inhibitory effect is dependent on the structure-function relationship. May be reflected in growth inhibition. A similar analysis was performed for the ring in CGR19. Ongoing for finger domains.   The principles, preferred embodiments and methods of practicing the invention are described in the preceding specification. I have. However, the invention sought to be protected herein is not limited to It is considered to be a margin and is not considered to be limited to the particular form disclosed. Absent. Variations and changes may be made by those skilled in the art without departing from the spirit of the invention. Can be done.     Tab1e1 Inhibition of colony formation by cell growth regulatory gene aThe experiments were performed in duplicate.b pCEP4 vector only N.D., not measured

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ガレラ，エリザベス・エイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07645, ワシントン・タウンシップ，マウンテン・ アベニュー 572 (72)発明者 マッデン，スティーヴン・アイ アメリカ合衆国ニュージャージー州08512, クランベリー，ステイション・ロード 12 ―シー──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 14/47 C07K 16/18 16/18 C12P 21/08 C12N 5/06 C12Q 1/68 Z C12P 21 / 08 A C12Q 1/68 G01N 33/53 D C12N 5/00 E G01N 33/53 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR , IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP ( GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, A , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Galera, Elizabeth A. 76845, Washington Township, Mountain Avenue, New Jersey, United States of America 572 (72) Inventor Madden , Stephen Eye, New Jersey, USA 08512, Cranberry, Station Road 12-Sea

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1. 哺乳類CGR11タンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブ クロモゾームDNA分子。 2. ヒトCGR11タンパク質をコードする、請求項１の単離され、そして精製さ れたサブクロモゾームDNA分子。 3. 介在配列を含まない、請求項２のDNA分子。 4. SEQ ID NO:1に示す配列を含む、請求項２のDNA分子。 5. ラットCGR11タンパク質をコードする、請求項１の単離され、そして精製 されたサブクロモゾームDNA分子。 6. 介在配列を含まない、請求項５のDNA分子。 7. SEQ ID NO:5に示す配列を含む、請求項２のDNA分子。 8. 単離され、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 9. SEQ ID NO:2に示すようなヒトCGR11の配列からなる、請求項８の単離され 、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 10. SEQ ID NO:6に示すようなラットCGR11の配列からなる、請求項８の単離 され、そして精製された哺乳類CGR11タンパク質。 11. 哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 12. CGR11がヒトのものであってSEQ ID NO:2に示す配列からなる、請求項11 の哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 13. CGR11がラットのものであってSEQ ID NO:6に示す配列からなる、請求項1 1の哺乳類CGR11タンパク質に特異的に結合する抗体。 14. 腫瘍細胞に哺乳順CGR11タンパク質を投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 15. タンパク質がヒトのものであってSEQ ID NO:2に示す配列からなる、請求 項14の方法。 16. タンパク質がラットのものであってSEQ ID NO:6に示す配列からなる、請 求項14の方法。 17. 腫瘍細胞に哺乳類CGR11タンパク質を発現させるようなDNA分子を、前 記細胞に投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 18. DNA分子がSEQ ID NO:1に示す配列を含む、請求項17の方法。 19. DNA分子がSEQ ID NO:5に示す配列を含む、請求項17の方法。 20.組織サンプルを分析して組織における哺乳類CGR11タンパク質またはmRNAの 発現量を測定すること、 その量を正常組織に見出される発現量と比較することであって、組織サン プルにおいて正常組織サンプルよりも発現量が低いことが癌であることの指標と すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 21．哺乳類CGR11タンパク質と特異的に反応する抗体を分析段階で利用する、 請求項20の方法。 22．哺乳類CGR11タンパク質がSEQ ID NO:2に示すようなヒトCGR11である、請 求項21の方法。 23. 哺乳類CGR11タンパク質がSEQ ID NO:6に示すようなラットCGR11である、 請求項21の方法。 24. 哺乳類CGR11 mRNAに相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プロ ーブを分析段階で利用する、請求項20の方法。 25. プローブがSEQ ID NO:1から選択される配列を有する、請求項24の方法。 26. プローブがSEQ ID NO:5から選択される配列を有する、請求項24の方法。 27. 組織を分析して、哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の変異型あって 、その遺伝子のコーディング配列の野生型とは異なるものを前記組織のDNAが含 むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 28. 組織のDNAを正常組織のDNAと比較して、CGR11遺伝子のコーディング配列 が変異型であるかどうか決定する、請求項27の方法。 29. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示される、請求項27の 方法。 30. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示される、請求項27 の方法。 31. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分 を含むDNA区分であって、前記遺伝子のコーディング配列の区分が前記プロモー ターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前 記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によっ て作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR11 RNAの区 分と相補的である、前記DNA区分、 を含むアンチセンスCGR11構築物。 32. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項31のアンチセンスCGR11構 築物。 33. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示すラット遺伝 子配列である、請求項31のアンチセンスCGR11構築物。 34. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示すヒト遺伝子 コーディング配列である、請求項31のアンチセンスCGR11構築物。 35．哺乳類CGR11 mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR11 アンチセンスオリゴヌクレオチド。 36. CGR11 mRNAに相補的な少なくとも約20ヌクレオチドを含む、請求項35のC GR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 37. 修飾を加えたヌクレオチド類似体を一つまたはそれ以上含む、請求項35 のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 38. 環状分子である、請求項35のCGR11アンチセンスオリゴヌクレオチド。 39. SEQ ID NO:1の配列に相補的である、請求項35のCGR11アンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 40. SEQ ID NO:5の配列に相補的である、請求項35のCGR11アンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 41. 哺乳類CGR11 mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含むCGR11アン チセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してCGR11の発現を阻害するこ と、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 42. CGR11アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:5に示すようなラ ットCGR11に相補的である、請求項41の方法。 43. CGR11アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1に示すようなヒ トCGR11に相補的である、請求項41の方法。 44．哺乳類CGR11遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR11三 本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類CGR11遺伝子の発現を阻 害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 45. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:5に示すようなラットCGR11に相補的で ある、請求項44の方法。 46. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:1に示すようなヒトCGR11に相補的であ る、請求項44の方法。 47. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区 分を含むDNA区分であって、前記遺伝子配列の区分が前記プロモーターと前記タ ーミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネー ターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出され るRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR11 RNAの区分と相補的で ある、前記DNA区分、 を含むアンチセンスCGR11構築物を、細胞に投与して哺乳類CGR11の発現を阻害す ること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 48. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項47の方法。 49. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:5に示すラット遺伝 子配列である、請求項47の方法。 50. 哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:1に示すヒト遺伝 子コーディング配列である、請求項47の方法。 51. 血液、粘膜塗布標本（スメア）、皮膚、頚管塗布標本（スメア）、絨毛 膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選択される組織を分析 して、変異体である哺乳類CGR11遺伝子のコーディング配列を前記組織のDNAが含 むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌に対する感受性を分析する方法。 52. DNAをヒトCGR11遺伝子のコーディング配列の野生型配列と比較する、請 求項51の方法。 53．ヒト遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:1に示される、 請求項52の方法。 54. 哺乳類CGR19タンパク質をコードする、単離され、そして精製されたサブ クロモゾームDNA分子。 55. SEQ ID NO:4に示すようなヒトCGR19タンパク質をコードする、請求項54 の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 56. 介在配列を含まない、請求項55のDNA分子。 57. SEQ ID NO:3に示す配列を含む、請求項55のDNA分子。 58. SEQ ID NO:8に示すようなラットCGR19タンパク質をコードする、請求項5 4の単離され、そして精製されたサブクロモゾームDNA分子。 59. 介在配列を含まない、請求項58のDNA分子。 60. SEQ ID NO:7に示す配列を含む、請求項58のDNA分子。 61. 単離され、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 62. SEQ ID NO:4に示すようなヒトCGR19の配列からなる、請求項61の単離さ れ、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 63. SEQ ID NO:8に示すようなラットCGR19の配列からなる、請求項61の単離 され、そして精製された哺乳類CGR19タンパク質。 64. 哺乳類CGR19タンパク質に特異的に結合する抗体。 65．CGR19がヒトのものであってSEQ ID NO:4に示す配列からなる、哺乳類CGR1 9タンパク質に特異的に結合する請求項64の抗体。 66. CGR19がラットのものであってSEQ ID NO:8に示す配列からなる、哺乳 類CG19タンパク質に特異的に結合する請求項64の抗体。 67. 腫瘍細胞に哺乳煩CGR19タンパク質を投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 68. タンパク質がヒトのものであってSEQ ID NO:4に示す配列からなる、請求 項67の方法。 69. タンパク質がラットのものであってSEQ ID NO:8に示す配列からなる、請 求項67の方法。 70. 腫瘍細胞に咄乳類CGR19タンパク質を発現させるようなDNA分子を、前記 細胞に投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 71. DNA分子がSEQ ID NO:3に示す配列を含む、請求項70の方法。 72. DNA分子がSEQ ID NO:7に示す配列を含む、請求項70の方法。 73. 組織の試験サンプルを分析して哺乳類CGR19タンパク質またはmRNAの発現 量を測定すること、 試験サンプルにおいて正常組織よりも発現量が低いことが癌であることの 指標である、試験サンプルの発現量を正常組織の発現量と比較すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 74．哺乳類CGR19タンパク質と特異的に反応する抗体を分析段階で利用する、 請求項73の方法。 75. 哺乳類CGR11(19?)タンパク質がヒトCGR19である、請求項74の方法。 76. ヒトCGR11(19?)タンパク質がSEQ ID NO:4に示す通りである、請求項75の 方法。 77. 哺乳類CGR19 mRNAに相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プロ ーブを分析段階で利用する、請求項73の方法。 78. プローブがSEQ ID NO:3に隣接するヌクレオチドから選択される配列を有 する、請求項77の方法。 79. プローブがSEQ ID NO:7に隣接するヌクレオチドから選択される配列を有 する、請求項77の方法。 80. 試験組織を分析して、哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の変異型 を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 81. 組織のDNAを正常組織のDNAと比較して、CGR19遺伝子のコーディング配列 が変異型であるかどうか決定する、請求項80の方法。 82. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示される、請求項80の 方法。 83. 野生型遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示される、請求項80の 方法。 84. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区分 を含むDNA区分であって、前記遺伝子のコーディング配列の区分が前記プロモー ターと前記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前 記ターミネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によっ て作り出されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR19 RNAの区 分と相補的である、前記DNA区分、 を含むアンチセンスCGR19構築物。 85. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項84のアンチセンスCGR19構 築物。 86. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示すラット遺伝 子配列である、請求項84のアンチセンスCGR19構築物。 87. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示すヒト遺伝子 配列である、請求項84のアンチセンスCGR19構築物。 88．哺乳類CGR19 mRNAに相補的な、少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR19 アンチセンスオリゴヌクレオチド。 89. CGR19 mRNAに相補的な少なくとも約20ヌクレオチドを含む、請求項88のC GR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 90. 修飾を加えたヌクレオチド類似体を一つまたはそれ以上含む、請求項88 のCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 91. 環状分子である、請求項88のCGR19アンチセンスオリゴヌクレオチド。 92. SEQ ID NO:3の配列に相補的である、請求項88のCGR19アンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 93. SEQ ID NO:7の配列に相補的である、請求項88のCGR19アンテセンスオリ ゴヌクレオチド。 94. 哺乳類CGR19 mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含むCGR19アン チセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してCGR19の発現を阻害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 95. CGR19アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:7に示すようなラ ットCGR19に相補的である、請求項94の方法。 96. CGR19アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:3に示すようなヒ トCGR19に相補的である、請求項94の方法。 97．哺乳類CGR19遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、CGR19三 本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類CGR19遺伝子の発現を阻 害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 98. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:7に示すようなラットCGR19に相補的で ある、請求項97の方法。 99. オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:3に示すようなヒトCGR19に相補的であ る、請求項97の方法。 100. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ以上の区 分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前記ターミ ネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミネーター に関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出されるRNA が、哺乳類細胞によって作り出される対応するCGR19RNAの区分と相補的である、 前記DNA区分、 を含むアンチセンスCGR19構築物を、細胞に投与して哺乳類CGR19の発現を阻害す ること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 101. 前記転写プロモーターが誘導性である、請求項100の方法。 102. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:7に示すラット遺伝 子配列である、請求項100の方法。 103. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列がSEQ ID NO:3に示すヒト遺伝子 コーディング配列である、請求項100の方法。 104. 血液、絨毛膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選 択される組織を分析して、変異体である哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列 を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌に対する感受性を評価する方法。 105. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:3に示 される、請求項104の方法。 106. 哺乳類CGR19遺伝子のコーディング配列の野生型配列がSEQ ID NO:7に示 される、請求項104の方法。 107. 哺乳類SM20またはmEHタンパク質を腫瘍細胞に投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 108. 腫瘍細胞に哺乳類SM20またはmEHタンパク質を発現させるようなDNA分子 を、前記細胞に投与すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を抑制する方法。 109．組織を分析して、組織が哺乳類SM20またはmEHタンパク質あるいはmRNAを 正常組織よりも少なく発現しているかどうか決定すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 110. 組織を分析して、哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の変 異型であって、遺伝子のコーディング配列の野生型とは異なるものを前記組織の DNAが含むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌を診断する方法。 111. 哺乳類SM20またはmEH mRNAに相補的な少なくとも10オリゴヌクレオ チドを含むSM20またはmEHアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞に投与してS M20またはああEHの発現を阻害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 112. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含 む、SM20またはmEH三本鎖形成オリゴヌクレオチドを、細胞に投与して哺乳類SM2 0またはmEH遺伝子の発現を阻害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 113. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ 以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前 記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミ ネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出 されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するSM20またはmEH RNAの区 分と相補的である、前記DNA区分、 を含むアンチセンスSM20またはmEH構築物を、細胞に投与して哺乳類SM20またはm EHの発現を阻害すること、 の段階を含む、前記細胞の増殖を促進する方法。 114. 血液、絨毛膜絨毛、羊水、および着床前の胚の卵割球からなる群から選 択される組織を分析して、変異体である哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディ ング配列を前記組織のDNAが含むかどうか決定すること、 の段階を含む、癌に対する感受性を分析する方法。 115. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タン パク質を有効量含む薬剤組成物であって、鼻腔内または非経口投与するのに適し ている薬剤組成物。 116. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タン パク質を作り出すことができる発現ベクターを調製する方法であって、宿主細胞 内でそのタンパク質を発現するDNAを発現することができるように、そのタンパ ク質をコードするDNAを、機能可能な位置および方向でベクターにつなぐこと、 を含む方法。 117. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タン パク質を、宿主細胞内で作り出すことができる発現ベクターであって、 選択されたタンパク質をコードするDNA区分、および、 宿主細胞内でそのタンパク質をコードするDNAを発現することができるよ うに、作用可能な位置および方向でDNA区分がつながっている、ベクター、を含 むベクター。 118. SM20、mEH、CGR11、およびCGR19からなる群から選択される哺乳類タン パク質の発現を指向することができる発現ベクターを含む、宿主細胞。 119. 細胞が哺乳類の体内にあり、そして腫瘍を抑制する量のタンパク質を投 与する、請求項14、67、または107の方法。 120. 哺乳類SM20またはmEH mRNAに相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む 、SM20またはmEHアンチセンスオリゴヌクレオチド。 121. 細胞が哺乳類SM20またはmEH遺伝子の発現を阻害するのを助ける、哺乳 類SM20またはmEH遺伝子に相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、SM20また はmEH三本鎖形成オリゴヌクレオチド。 122. a. 転写プロモーター、 b. 転写ターミネーター、 c. 哺乳類SM20またはmEH遺伝子のコーディング配列の一つまたはそれ 以上の区分を含むDNA区分であって、前記遺伝子の区分が前記プロモーターと前 記ターミネーターの間に位置し、前記DNA区分が前記プロモーターと前記ターミ ネーターに関して逆になっており、それによってDNA区分の転写によって作り出 されるRNAが、哺乳類細胞によって作り出される対応するSM20またはmEH RNAの区 分と相補的である、前記DNA区分、 を含むアンチセンスSM20またはmEH構築物。 123. 少なくとも一組の混合オリゴヌクレオチドであって、混合オリゴヌクレ オチドの前記組の各要素が、SEQ ID NO:2、4、6、または８に示すアミノ酸配列 のうち少なくとも６つの隣接したアミノ酸の配列をコードするを哺乳類cDNAライ ブラリーとアニールさせること、 (1)混合オリゴヌクレオチドの組の少なくとも１つの要素にアニールし、 (2)約275から約335コドンの完全なオープンリーディングフレームを含み、そし て、(3)哺乳類CGRタンパク質をコードする、哺乳類cDNAを単離すること(その際 、CGR RNAが野生型p53の存在下で亢進調節される)、 の段階を含む方法によって得られる、哺乳類CGRタンパク質をコードするDNA配列 を単離する方法。 124. 少なくとも２組の混合オリゴヌクレオチドがアニールされる、請求項１ の哺乳類CGR DNA配列。[Claims]   1. An isolated and purified sub-encoding mammalian CGR11 protein Chromosomal DNA molecule.   2. The isolated and purified of claim 1, which encodes a human CGR11 protein. Subchromosomal DNA molecule.   3. The DNA molecule of claim 2, which does not contain intervening sequences.   4. The DNA molecule of claim 2, comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.   5. The isolated and purified of claim 1, which encodes the rat CGR11 protein. Subchromosomal DNA molecule.   6. The DNA molecule of claim 5, which contains no intervening sequences.   7. The DNA molecule of claim 2, comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 5.   8. Isolated and purified mammalian CGR11 protein.   9. The isolated of claim 8, consisting of the sequence of human CGR11 as set forth in SEQ ID NO: 2. , And purified mammalian CGR11 protein.   10. The isolation of claim 8, consisting of the sequence of rat CGR11 as set forth in SEQ ID NO: 6. Purified and purified mammalian CGR11 protein.   11. An antibody that specifically binds to mammalian CGR11 protein.   12. The method of claim 11, wherein CGR11 is human and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Antibodies that specifically bind to mammalian CGR11 proteins.   13. The method of claim 1, wherein the CGR11 is rat and comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 6. An antibody that specifically binds to one mammalian CGR11 protein.   14. administering a mammalian CGR11 protein to the tumor cells; A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   15. The claim, wherein the protein is human and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Item 14.   16. The protein is rat and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The method of claim 14.   17. DNA molecules that allow mammalian cells to express mammalian CGR11 protein Administering to the cells, A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   18. The method of claim 17, wherein the DNA molecule comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.   19. The method of claim 17, wherein the DNA molecule comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 5.   20.Analyze tissue samples to determine whether mammalian CGR11 protein or mRNA Measuring the expression level,       Comparing that amount to the expression level found in normal tissues, A lower expression level in pull than in normal tissue samples is an indicator of cancer. To do, A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   twenty one. Using antibodies that specifically react with mammalian CGR11 protein in the analysis stage, 21. The method of claim 20.   twenty two. The mammalian CGR11 protein is human CGR11 as set forth in SEQ ID NO: 2. The method of claim 21.   23. The mammalian CGR11 protein is rat CGR11 as shown in SEQ ID NO: 6, 22. The method of claim 21.   24. A nucleic acid sequence comprising at least 15 nucleotides complementary to mammalian CGR11 mRNA. 21. The method of claim 20, wherein the probe is utilized in an analysis step.   25. The method of claim 24, wherein the probe has a sequence selected from SEQ ID NO: 1.   26. The method of claim 24, wherein the probe has a sequence selected from SEQ ID NO: 5.   27. Tissue analysis reveals variants in the coding sequence of the mammalian CGR11 gene The DNA of the tissue contains a different coding sequence of the gene from the wild type. To decide whether or not A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   28. Compare coding DNA of CGR11 gene by comparing DNA of tissue with DNA of normal tissue. 28. The method of claim 27, wherein determining whether is a variant.   29. The coding sequence of claim 27, wherein the coding sequence of the wild-type gene is set forth in SEQ ID NO: 1. Method.   30. The coding sequence of a wild-type gene is set forth in SEQ ID NO: 5. the method of.   31. a. Transcription promoter,        b. transcription terminator,        c. One or more segments of the coding sequence of the mammalian CGR11 gene Wherein the coding sequence section of the gene is the promoter. And the DNA segment is located between the promoter and the terminator. The opposite is true for the terminator, so that the transcription of the DNA segment The RNA produced is the domain of the corresponding CGR11 RNA produced by mammalian cells. Said DNA segment being complementary to An antisense CGR11 construct comprising:   32. The antisense CGR11 structure of claim 31, wherein said transcription promoter is inducible. Kimono.   33. The coding sequence of the mammalian CGR11 gene is shown in SEQ ID NO: 5 in rat inheritance 32. The antisense CGR11 construct of claim 31, which is a child sequence.   34. Human gene whose coding sequence for mammalian CGR11 gene is shown in SEQ ID NO: 1 32. The antisense CGR11 construct of claim 31, which is a coding sequence.   35. A CGR11 comprising at least 10 nucleotides that is complementary to a mammalian CGR11 mRNA Antisense oligonucleotide.   36.The C of claim 35, comprising at least about 20 nucleotides complementary to the CGR11 mRNA. GR11 antisense oligonucleotide.   37. The method of claim 35, comprising one or more modified nucleotide analogs. CGR11 antisense oligonucleotide.   38. The CGR11 antisense oligonucleotide of claim 35, which is a circular molecule.   39. The CGR11 antisense oligonucleotide of claim 35, which is complementary to the sequence of SEQ ID NO: 1. Gonucleotide.   40. The CGR11 antisense oligonucleotide of claim 35, which is complementary to the sequence of SEQ ID NO: 5. Gonucleotide.   41. CGR11 amps containing at least 10 nucleotides complementary to mammalian CGR11 mRNA Administering a chisense oligonucleotide to cells to inhibit CGR11 expression. When, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   42. A CGR11 antisense oligonucleotide is identified as a rat as shown in SEQ ID NO: 5. 42. The method of claim 41, wherein said method is complementary to mit CGR11.   43. If the CGR11 antisense oligonucleotide is a human as shown in SEQ ID NO: 1 42. The method of claim 41, wherein said method is complementary to CGR11.   44. A CGR11 triad comprising at least 10 nucleotides complementary to the mammalian CGR11 gene The strand-forming oligonucleotide is administered to cells to inhibit expression of the mammalian CGR11 gene. Harm, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   45. The oligonucleotide is complementary to rat CGR11 as shown in SEQ ID NO: 5. 45. The method of claim 44, wherein the method comprises:   46. The oligonucleotide is complementary to human CGR11 as shown in SEQ ID NO: 1. 45. The method of claim 44, wherein   47. a. Transcription promoter,         b. transcription terminator,         c. one or more coding sequences of the mammalian CGR11 gene And the DNA sequence includes the promoter and the tag. Terminator, wherein the DNA segment comprises the promoter and the terminator. Is inverted with respect to the RNA is complementary to a corresponding section of CGR11 RNA produced by mammalian cells. The said DNA segment, Antisense CGR11 Constructs Containing Ingredients to Inhibit Mammalian CGR11 Expression by Administering to Cells That A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   48. The method of claim 47, wherein said transcription promoter is inducible.   49. The coding sequence of the mammalian CGR11 gene is shown in SEQ ID NO: 5 in rat inheritance 50. The method of claim 47, which is a child array.   50. The human inheritance of the coding sequence of the mammalian CGR11 gene is shown in SEQ ID NO: 1 50. The method of claim 47, which is a child coding sequence.   51. Blood, mucosal smear, skin, cervical smear, villi Analyzes tissues selected from the group consisting of membrane villi, amniotic fluid, and preimplantation embryo blastomeres The DNA of the tissue contains the coding sequence of the mutant mammalian CGR11 gene. To decide whether or not A method for analyzing susceptibility to cancer, comprising the steps of:   52. Comparing DNA with the wild-type sequence of the coding sequence of the human CGR11 gene, The method of claim 51.   53. The wild-type sequence of the coding sequence of the human gene is shown in SEQ ID NO: 1, 53. The method of claim 52.   54. An isolated and purified sub-encoding mammalian CGR19 protein Chromosomal DNA molecule.   55. Encoding a human CGR19 protein as set forth in SEQ ID NO: 4. An isolated and purified subchromosomal DNA molecule.   56. The DNA molecule of claim 55 without intervening sequences.   57. The DNA molecule of claim 55, comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.   58. The protein encodes a rat CGR19 protein as set forth in SEQ ID NO: 8. 4 isolated and purified subchromosomal DNA molecules.   59. The DNA molecule of claim 58 without intervening sequences.   60. The DNA molecule of claim 58, comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 7.   61. Isolated and purified mammalian CGR19 protein.   62. The isolated of claim 61, which consists of the sequence of human CGR19 as set forth in SEQ ID NO: 4. And purified mammalian CGR19 protein.   63. The isolation of claim 61, comprising the sequence of rat CGR19 as set forth in SEQ ID NO: 8. Purified and purified mammalian CGR19 protein.   64. An antibody that specifically binds to mammalian CGR19 protein.   65. A mammalian CGR1 wherein CGR19 is human and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 4 65. The antibody of claim 64, which specifically binds to 9 proteins.   66. The mammal, wherein CGR19 is of rat and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 8. 65. The antibody of claim 64, which specifically binds to a CG19 protein.   67. administering a mammalian CGR19 protein to the tumor cells, A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   68. The protein, wherein the protein is human and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 4. Clause 67. The method of clause 67.   69. The protein is rat and consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The method of claim 67.   70. A DNA molecule that causes a tumor cell to express the mammalian CGR19 protein is Administering to cells, A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   71. The method of claim 70, wherein the DNA molecule comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.   72. The method of claim 70, wherein the DNA molecule comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 7.   73. Analyze tissue test samples to express mammalian CGR19 protein or mRNA Measuring the quantity,       A lower expression level in the test sample than in normal tissue indicates that the cancer Comparing the expression level of a test sample with the expression level of a normal tissue, which is an index, A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   74. Using antibodies that specifically react with mammalian CGR19 protein in the analysis stage, 75. The method of claim 73.   75. The method of claim 74, wherein the mammalian CGR11 (19?) Protein is human CGR19.   76. The method of claim 75, wherein the human CGR11 (19?) Protein is as set forth in SEQ ID NO: 4. Method.   77. A nucleic acid sequence comprising at least 15 nucleotides complementary to mammalian CGR19 mRNA 75. The method of claim 73, wherein the probe is utilized in the analyzing step.   78. The probe has a sequence selected from the nucleotides flanking SEQ ID NO: 3. 78. The method of claim 77, wherein   79. The probe has a sequence selected from the nucleotides flanking SEQ ID NO: 7. 78. The method of claim 77, wherein   80. Analyze test tissue to determine variants in the coding sequence of the mammalian CGR19 gene. Determining whether the DNA of the tissue comprises A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   81. Compare the DNA of the tissue to the DNA of the normal tissue to determine the coding sequence of the CGR19 gene. 81. The method of claim 80, wherein determining if is a variant.   82. The coding sequence of claim 80, wherein the coding sequence of the wild-type gene is set forth in SEQ ID NO: 3. Method.   83. The coding sequence of claim 80, wherein the coding sequence of the wild-type gene is set forth in SEQ ID NO: 7. Method.   84. a. Transcription promoter,        b. transcription terminator,        c. One or more segments of the coding sequence of the mammalian CGR19 gene Wherein the coding sequence section of the gene is the promoter. And the DNA segment is located between the promoter and the terminator. The opposite is true for the terminator, so that the transcription of the DNA segment The RNA produced is the corresponding CGR19 RNA produced by mammalian cells. Said DNA segment being complementary to An antisense CGR19 construct comprising:   85. The antisense CGR19 structure of claim 84, wherein said transcription promoter is inducible. Kimono.   86. The coding sequence of the mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 7 in the rat 85. The antisense CGR19 construct of claim 84, which is a child sequence.   87. Human gene whose coding sequence for mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 3 85. The antisense CGR19 construct of claim 84, which is a sequence.   88. A CGR19 comprising at least 10 nucleotides that is complementary to a mammalian CGR19 mRNA Antisense oligonucleotide.   89.The C of claim 88, comprising at least about 20 nucleotides complementary to the CGR19 mRNA. GR19 antisense oligonucleotide.   90. The method of claim 88, comprising one or more modified nucleotide analogues. CGR19 antisense oligonucleotide.   91. The CGR19 antisense oligonucleotide of claim 88, which is a circular molecule.   92. The CGR19 antisense oligonucleotide of claim 88, which is complementary to the sequence of SEQ ID NO: 3. Gonucleotide.   93. The CGR19 antisense array of claim 88, which is complementary to the sequence of SEQ ID NO: 7. Gonucleotide.   94. A CGR19 amplifier comprising at least 10 nucleotides complementary to a mammalian CGR19 mRNA Administering a chisense oligonucleotide to the cells to inhibit expression of CGR19, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   95. A CGR19 antisense oligonucleotide is identified as a rat as shown in SEQ ID NO: 7. 95. The method of claim 94, wherein said method is complementary to CRT19.   96. The CGR19 antisense oligonucleotide is a human as shown in SEQ ID NO: 3. 95. The method of claim 94, wherein said method is complementary to CGR19.   97. A CGR19 triad comprising at least 10 nucleotides complementary to the mammalian CGR19 gene The strand-forming oligonucleotide is administered to cells to inhibit expression of the mammalian CGR19 gene. Harm, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   98. The oligonucleotide is complementary to rat CGR19 as shown in SEQ ID NO: 7 100. The method of claim 97, wherein the method comprises:   99. The oligonucleotide is complementary to human CGR19 as shown in SEQ ID NO: 3. 97. The method of claim 97, wherein   100. a. Transcription promoter,         b. transcription terminator,         c. One or more regions of the coding sequence of the mammalian CGR19 gene A DNA segment containing the promoter and the terminator. And the DNA segment is located between the promoter and the terminator. RNA that is produced by the transcription of a DNA segment Is complementary to the corresponding section of CGR19 RNA produced by mammalian cells. The DNA section, Antisense CGR19 Constructs Containing Toxin to Mammalian Cells to Inhibit Expression of Mammalian CGR19 That A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   101. The method of claim 100, wherein said transcription promoter is inducible.   102. The coding sequence of the mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 7 in rat inheritance 110. The method of claim 100, which is a child array.   103. Human gene whose coding sequence for mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 3 110. The method of claim 100, which is a coding sequence.   104. Selected from the group consisting of blood, chorionic villi, amniotic fluid, and preimplantation embryo blastomeres Analyzing the selected tissue, the coding sequence of the mutant mammalian CGR19 gene Determining whether the DNA of the tissue comprises A method for evaluating susceptibility to cancer, comprising the steps of:   105. The wild-type sequence of the coding sequence of the mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 3. 105. The method of claim 104, wherein   106. The wild-type sequence of the coding sequence of the mammalian CGR19 gene is shown in SEQ ID NO: 7. 105. The method of claim 104, wherein   107. administering a mammalian SM20 or mEH protein to the tumor cells; A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   108. DNA molecules that allow mammalian cells to express mammalian SM20 or mEH protein Administering to the cells, A method for suppressing the growth of the cells, comprising the step of:   109. Analyze the tissue to make sure that the tissue is producing mammalian SM20 or mEH protein or mRNA. Determining whether it is expressed less than in normal tissue; A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   110. Analyze the tissue to alter the coding sequence of the mammalian SM20 or mEH gene. A variant, which differs from the wild type of the coding sequence of the gene, Determining whether the DNA contains, A method for diagnosing cancer, comprising the steps of:   111. At least 10 oligonucleotides complementary to mammalian SM20 or mEH mRNA Administered cells with SM20 or mEH antisense oligonucleotides containing Inhibiting the expression of M20 or oh EH, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   112. Contains at least 10 nucleotides complementary to the mammalian SM20 or mEH gene. The SM20 or mEH triplex-forming oligonucleotide is administered to cells and the mammalian SM2 Inhibiting 0 or mEH gene expression, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   113. a. Transcription promoter,         b. transcription terminator,         c. One or more of the coding sequences of the mammalian SM20 or mEH genes A DNA section including the above sections, wherein the section of the gene is The DNA segment is located between the terminator and the promoter and the terminator. Is reversed with respect to the norator, thereby producing by transcription of the DNA segment The RNA that is generated is the fraction of the corresponding SM20 or mEH RNA produced by the mammalian cell. Said DNA segment being complementary to An antisense SM20 or mEH construct comprising Inhibiting the expression of EH, A method for promoting the growth of the cells, comprising the step of:   114. Selected from the group consisting of blood, chorionic villi, amniotic fluid, and preimplantation embryo blastomeres. The selected tissues are analyzed to determine the coding for the mutant mammalian SM20 or mEH gene. Determining whether the DNA of the tissue comprises a signaling sequence; A method for analyzing susceptibility to cancer, comprising the steps of:   115. A mammalian tan selected from the group consisting of SM20, mEH, CGR11, and CGR19 A pharmaceutical composition comprising an effective amount of a protein, suitable for intranasal or parenteral administration Pharmaceutical composition.   116. A mammalian tan selected from the group consisting of SM20, mEH, CGR11, and CGR19 A method for preparing an expression vector capable of producing protein, comprising the steps of: In order to be able to express DNA that expresses the protein within Linking the DNA encoding the protein to the vector at a operable position and orientation, A method that includes   117. A mammalian tan selected from the group consisting of SM20, mEH, CGR11, and CGR19 An expression vector capable of producing a protein in a host cell,       A DNA segment encoding the selected protein, and       DNA encoding the protein can be expressed in host cells. In this way, the DNA segments are linked in the operable position and direction. Vector.   118. A mammalian tan selected from the group consisting of SM20, mEH, CGR11, and CGR19 A host cell comprising an expression vector capable of directing the expression of a protein.   119. Cells are present in mammals and tumor-suppressing amounts of protein are injected 108. The method of claim 14, 67 or 107.   120. Contains at least 10 nucleotides complementary to mammalian SM20 or mEH mRNA , SM20 or mEH antisense oligonucleotides.   121. A mammal that helps inhibit the expression of a mammalian SM20 or mEH gene An SM20 or SM20 or mEH gene comprising at least 10 nucleotides complementary to the SM20 or mEH gene. Is an mEH triple-stranded oligonucleotide.   122. a. Transcription promoter,         b. transcription terminator,         c. One or more of the coding sequences of the mammalian SM20 or mEH genes A DNA section including the above sections, wherein the section of the gene is The DNA segment is located between the terminator and the promoter and the terminator. Is reversed with respect to the norator, thereby producing by transcription of the DNA segment The RNA that is generated is the fraction of the corresponding SM20 or mEH RNA produced by the mammalian cell. Said DNA segment being complementary to An antisense SM20 or mEH construct comprising:   123. At least one set of mixed oligonucleotides, The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 A mammalian cDNA library encoding a sequence of at least six adjacent amino acids of Annealing with the blurry,        (1) annealing to at least one element of the set of mixed oligonucleotides, (2) Contains a complete open reading frame of about 275 to about 335 codons, and (3) isolating a mammalian cDNA encoding a mammalian CGR protein (in this case, CGR RNA is upregulated in the presence of wild-type p53), DNA sequence encoding a mammalian CGR protein obtained by a method comprising the steps of A method for isolating   124. The at least two sets of mixed oligonucleotides are annealed. Mammalian CGR DNA sequence.
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