【発明の詳細な説明】
ＯＢレセプターイソ型及びそれらをコードする核酸 発明の分野
本発明は、ｏｂレセプタータンパク質イソ型、それらをコードするＤＮＡ配列
とＲＮＡ配列、及びレセプターイソ型タンパク質を用いるアッセイに関する。発明の背景
最近、齧歯類における肥満の発症に関与する幾つかの遺伝子の変異が同定され
た。特に興味深いのはペプチドホルモン、レプチンで発見された変異であるが、
レプチンは体重を調整する新規な信号伝達経路の一成分である（Zhangら,1994,N
ature372:425-432；Chenら，1996,Cell 84:491-495）。レプチンは始めはマウス
における肥満遺伝子ｏｂのポジショナルクローニングによって発見された。２種
の異なるｏｂ対立遺伝子が同定された。一つの変異はレプチンペプチドの未成熟
終結を引起し、短縮タンパク質が得られ、他の変異は肥満（ｏｂ）遺伝子の転写
活性を変化させ、循環するレプチンの量が減少する。
生物活性レプチンのレベルの減少とｏｂ／ｏｂマウスで観察
される歴然とした肥満表現型の間には関連がある。組換えレプチンはｏｂ／ｏｂ
マウスで体重減少を誘導するが、糖尿病表現型ｄｂ／ｄｂマウスではそうではな
いことが示された(Campfieldら,1995，Science 269:546-549；Halaasら,1995，S
cience 269:543-546;Pellymounterら,1995,Science 269:540-543；Rentschら,19
95,Biochem.Biophys.Res.Comm．214:131-136；Weigleら，1995,J.Clin.Invest．
96:2065-2070)。
レプチン合成は脂肪細胞で行われるが、摂食を減らし、代謝速度を増加させる
能力は中枢的に視床下部により媒介されるようである。組換えレプチンを第３脳
室に注入すると、レプチンの末梢投与と同様の反応が引起される。更に、レプチ
ンのヒトレセプター、ｏｂ−レセプター（ＯＢ−Ｒ）の最近のクローニングによ
ると、それは視床下部で転写される(Tartagliaら，1995,Cell 83:1263-1271；St
ephensら，1995,Nature 377:530-532)。更に、マウスＯＢ−Ｒの長型の未成熟終
結が起る変異(これは視床下部で優先的に発現される)は、ｄｂ／ｄｂマウスの肥
満表現型の原因であるらしい（Leeら，1996，Nature 379:632-635;Chuaら，1996
,Science 271:994-996;Chenら，1996，Cell 84:491-495）。
野生型（痩身）ラットと脂肪質（fatty）変異を有するラット（ｆａのヘテロ
接合体とホモ接合体の両方）からのＯＢ−Ｒが単離され、配列決定された（特許
出願第 号及び第 号，Attorney Docket No.19642PV及び
19642PV2，1996年２月22日及び1996年３月22日出願；両方とも引用により本明細
書に含まれるものとする）。
ＯＢ−Ｒの種々のイソ型も同定された。これらのイソ型はオールターナティブ
スプライシングのためである。例えば、マウスでは、ａ型は８８９のリシン後に
５個のアミノ酸を有し、ｂ型は８８９のリシン後に２７３個のアミノ酸を有し、
Ｃ型は８８９のリシン後に３個のアミノ酸を有し、ｄ型は８８９のリシン後に１
１個のアミノ酸を有する。
肥満のより良き理解のために種々のイソ型を用いて更に実験することができる
こと；及び新規ｏｂレセプターイソ型をクローニングし産生して、肥満を理解し
、その予防と治療に有用なリガンドを同定するアッセイで使用できること；は望
ましい。発明の詳細な説明
本発明は、実質的に付随する膜タンパク質を含まない、ｃ’、ｆ及びｇと命名
した新規ｏｂレセプターイソ型に関する。本発
明は、実質的に精製されたｏｂレセプターイソ型ｃ’、ｆ及びｇタンパク質にも
関する。これらのイソ型は、ラット、マウス及びヒトを含む種々の種で存在する
。
本発明のもう一つの面は、ＯＢレセプターイソ型ｃ’、ｆ又はｇをコードする
核酸である。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は種々の型のＲＮＡのいずれ
ものような、タンパク質をコードできる任意の核酸でありうる。好ましくは、核
酸はｃＤＮＡである。
本発明は、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含むベクター、該ベクター
を含む宿主細胞、及びＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含むベクターを宿
主細胞に導入し、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇが産生されるような適切な条件
下、該宿主細胞を培養する工程を特徴とする実質的に純粋なＯＢ−Ｒイソ型ｃ’
、ｆ又はｇタンパク質の製造法も包含する。そのように産生されたＯＢ−Ｒイソ
型ｃ’、ｆ又はｇは、通常の方法で宿主細胞から取得することができる。
本発明の更に別の面は、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇを用いるアッセイであ
る。これらのアッセイにおいて、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇリガンドである
可能性のある種々の分子を
ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇと接触させ、それらの結合を検出する。このよう
にして、アゴニスト、アンタゴニスト、及びリガンド擬似物質を同定することが
できる。本発明の更なる面はそのように同定されるリガンドである。図面の簡単な説明
図１は野生型ラットＯＢ−Ｒのアミノ酸配列である。
図２は野生型ラットＯＢ−ＲのｃＤＮＡ配列である。
図３はラットイソ型をコードするｃＤＮＡ配列である。
図４はラットイソ型ｃ’に特異的なｃＤＮＡである。
明細書と請求の範囲で用いる場合、以下の定義が適用される。
“結合した膜タンパク質を実質的に含まない”ということは、レセプタータン
パク質は如何なる膜タンパク質とも物理的接触をしていないことを示す。
“実質的に精製されたＯＢ−Ｒレセプターイソ型ｃ’、ｆ又はｇ”は、タンパ
ク質イソ型は最低９０％、好ましくは最低９５％純粋であることを意味する。
“野生型”は、遺伝子又はタンパク質が、その遺伝子又はタンパク質に関し変
異を有しないと考えられる動物で見出されるものと実質的に同一であることを意
味する。
“ｆａ”は、遺伝子又はタンパク質が、脂肪質変異に関しラット相同体で見出
されるものと実質的に同一であることを意味する。
核酸配列又はアミノ酸配列に言及する場合、“実質的に同一”とは、それが参
照配列と同一であるか、又は正確に同一でないならば、その生物活性又は機能に
影響しない変化を含むということを意味する。
驚くべきことに、本発明により、ＯＢ−Ｒには、３種の新規イソ型ｃ’、ｆ又
はｇを含む種々のイソ型があるということが知見された。これらのイソ型は全て
の種に当てはまるか、便宜上本明細書と請求の範囲では、アミノ酸と核酸の番号
付けには、ラット野生型配列（図１及び２）を参照として用いる。しかし、本発
明は、ラット野生型タンパク質及び核酸に限定されないで、特にラット（野生型
及び脂肪質）、マウス、及びヒトのＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇタンパク質及
び核酸を包含することを理解すべきである。
ＯＢ−Ｒイソ型ｆは、位置８８９のリシン後（図１のラット配列に関して）、
６個のアミノ酸があり、位置８９５のアスパラギン残基で終るという点で野生型
とは異なる。ｃＤＮＡにお
いては、コドンらの次に終止コドンがくる。ラットイソ型ｆの一つのｃＤＮＡを
図３に示す。本発明は特にイソ型ｆタンパク質をコードする全ての種々のｃＤＮ
Ａを包含する。上付き番号はタンパク質の位置番号を指す。
Lys889Iso890Met891Pro892Gly893Arg894Asn895
ヒトイソ型ｆでは、リシン８９１がラットのリシン８８９に対応し、同じ６個
のアミノ酸がリシン８８９に続く。
本発明の特に好適な実施の形態では、ＯＢ−Ｒイソ型ｆはラット起源である。
ＯＢ−Ｒイソ型ｇは、野生型配列よりかなり短いという点で野生型とは異なる
。以下の１８個のアミノ酸がタンパク質の始まりにみいだされている。上付き番
号はそれらの位置を示す。位置１８のアルギニンは位置１６６のプロリンで始ま
る野生型分子の大フラグメントにスプライスされている（マウスとヒトの両方）
。次いで、このイソ型は野生型分子の残りに及ぶ。
Met1Phe2Gln3Thr4Pro5Arg6Ile7Val8Pro9Gly10His11Lys12Asp13Leu14Ile15Se
r16Lys17Arg18Pro166…
Ｐｒｏ166後、タンパク質の残りは野生型と同じでありうるし、又はイソ型ａ
、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ又はｆのような別のイソ型
変異も含みうる。
特に好適な実施の形態はラットイソ型ｇである。
ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’はＯＢ−Ｒイソ型Ｃと類似しているが、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ
は以前に報告された（Leeら，Nature 379:632-635）。位置８８９のリシン後、
ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’は、３個のアミノ酸、Val890Thr891Phe892終止のみを含む。
見て分るように、イソ型ｃ’は、最終アミノ酸がイソ型ｃで見出されるバリンよ
りもむしろフェニルアラニンであるという点で異なる。更に、イソ型ｃ’をコー
ドするＤＮＡには非翻訳配列があり、それはイソ型ｃには存在しないようである
。ラットイソ型ｃ’をコードするｃＤＮＡを図４に示す。ヒトでは、Ｖａｌ、Ｔ
ｈｒ、Ｐｈｅがリシン８９１の後に続く。
本発明の一つの面は、ＯＢ−Ｒのこれらの種々のイソ型の分子クローニングで
ある。野生型とｆａレセプタータンパク質は、１個の細胞外ドメインと１個の膜
貫通ドメインを含む。ラットにおいて、細胞外ドメインはアミノ酸１〜８３０に
及ぶ。膜貫通ドメインは８３９〜８６０である。細胞質ドメインはアミノ酸８６
０〜１１６２である。同様のドメインがマウスとヒトタンパク質で同定された。
本発明は、１個以上のドメインを
欠くイソ型ｃ’、ｆ及びｇも包含する。このような欠失タンパク質は、リガンド
同定とそれらの結合活性のアッセイに有用である。
ラット野生型タンパク質では、アミノ酸１〜２８はシグナル配列を形成する。
即ち、成熟タンパク質はアミノ酸２８〜１１６２に及ぶ。成熟タンパク質イソ型
は本発明の更に別の面を形成する。これは、マウスとヒトＯＢ−Ｒで報告された
１〜２２のシグナル配列とはやや異なる。成熟マウス、ヒトイソ型は、本発明の
更に別の面を形成する。
ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子は、公知のベクターを用いて実際にいず
れの宿主細胞にも導入できる。好適な宿主細胞には、大腸菌（E.coli）並びに哺
乳動物細胞系及び酵母細胞系が含まれる。
当業者ならば、所定の宿主細胞に適切な公知のベクターを選択できる。一般的
にはプラスミド又はウイルスベクターが好ましい。ＯＢ−Ｒイソ型c’、ｆ又は
ｇ遺伝子はその天然形態で、ベクターに存在しうるし、又は異種プロモーター、
所望ならば１個以上のエンハンサー、もしくは転写か翻訳を制御することが知ら
れている他の配列の制御下にありうる。ＯＢ−Ｒイソ型
ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含む宿主細胞を培養し、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ
遺伝子を発現させる。適切な時間後、ＯＢ−Ｒｃ’、ｆ又はｇイソ型タンパク質
を、通常の分離技術を用いて細胞から取得できる。
本発明の更なる面は、アッセイでＯＢ−Ｒｃ’、ｆ又はｇを用いて、ＯＢ−Ｒ
ｃ’、ｆ又はｇイソ型リガンドを同定することである。リガンドはＯＢ−Ｒイソ
型レセプターへ結合し、インビボでレセプターの活性化を起こすかもしれないし
、起こさないかもしれない。リガンドは、レセプターのアゴニスト（即ち、その
活性を刺激する）、アンタゴニスト（その活性を阻害する）でありうるし、又は
リガンドは、結合するがレセプター活性に殆どもしくは全く効果を及ぼさないか
もしれない。
リガンドのアッセイでは、本発明のＯＢ−Ｒイソ型を、リガンドの可能性のあ
るものに曝し、結合量を測定する。結合量は多数の方法で測定できる。例えば、
研究するリガンド又はＯＢ−Ｒイソ型を通常の標識（例えば放射活性標識又は蛍
光標識）で標識し、次いで結合条件下、ＯＢ−Ｒイソ型と接触させうる。適切な
時間後、非結合リガンドをＯＢ−Ｒイソ型から分離し、結合したリガンド量を測
定できる。これは、本発明のＯＢ
−Ｒイソ型のいずれでも行うことができる。あるいは、種々のイソ型の結合量を
比較できる。競合アッセイでは、リガンドの可能性のあるものと公知のリガンド
の両方が存在し、リガンドの可能性のあるものの結合量を公知のリガンドとの結
合量と比較する。あるいは、前もって結合した公知のリガンドを置換するリガン
ドの可能性のあるものの能力（又は逆）を測定できる。更に別の実施の形態では
、アッセイは、ＯＢ−Ｒイソ型が表面に結合し、リガンドの可能性のあるものと
接触させうることを特徴とする不均一アッセイでありうる。結合の検出は、標識
、抗体及び発色団との反応を含む種々の方法でありうる。
別のアッセイで、本発明のＯＢ−Ｒイソ型は“トランス”活性化アッセイで使
用できる。このようなアッセイは、米国出願第 号（Attorney Docket
No.19686PV，1996年４月22日出願；引用により本明細書に含まれるものとする）
に記載されている。このアッセイでは、本発明のＯＢ−Ｒイソ型を発現する細胞
（天然又は組換え法による）を、最小プロモーター、レプチン活性化要素及びレ
ポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築体でトランスフェクトする。レポー
ター遺伝子の転写は、レプチン活性化要素の活性化に依存する。リガンドのレセ
プターイソ型への結合はレプチン活性化要素を活性化し、次いでそのことにより
、レポーター遺伝子の転写が起る。
本発明をより良く説明するために、以下の非限定実施例を記載する。
実施例１ ラット組織からのｍＲＮＡとｃＤＮＡの調製
痩身及びｆａ／ｆａ Zuckerラットから組織を集め、液体窒素中で急速凍結し
た。集めた組織は、視床下部、下垂体、肺、肝臓、腎臓、心臓、副腎腺、平滑筋
、骨格筋、及び脂肪組織を含んでいた。イソチオシアン酸グアニジニウムの存在
下、Brinkmann Polytronホモジナイザーで、組織をホモジナイズした。メッセン
ジャーＲＮＡ単離キット（Stratagene，La Jolla,CA）に備えられた指示に従い
、ｍＲＮＡを視床下部、肺及び腎臓から調製した。SuperScriptTMチョイスシス
テム（Gibco/BRL，Gaithersburg,MD）を用い、ｍＲＮＡ約２μｇからｃＤＮＡを
調製した。反応当りオリゴ（ｄＴ）12-18プライマー１μｇとランダムヘキサマ
ー２５ｎｇを用い、第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始させた。第２鎖ｃＤＮＡ合成を製
造業者の指示に従い行った。[α−32Ｐ]ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
約１μＣｉによる第２鎖反応のアリコート（１／１０）の標識によってｃＤＮＡ
量を評価した。標識産物をアガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーで
検出した。
実施例２ 視床下部ｃＤＮＡライブラリーの調製
実施例１に記載したように調製したｃＤＮＡ約３μｇに、リン酸化ＢｓｔｘＩ
アダプター（Invitrogen，San Diego，CA）約３．６μｇを連結した。次いで連
結混合液を希釈し、ｃＤＮＡサイジングカラム（Gibco/BRL Gaithersburg，MD）
でサイズ分画した。カラムからの液滴を集め、カラムからの溶出容積を測定した
。各分画からのアリコートをアガロースゲルで分析した。１ｋｂ以上のｃＤＮＡ
を含む分画をプールし、沈殿させた。ＢｓｔｘＩアダプターを有するサイズ分画
ｃＤＮＡを、原核細胞ベクターｐｃＤＮＡＩＩ（Invitrogen，San Diego，CA）
に連結した。最初に制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸＩで切断し、線状化ベクタ
ーをゲル精製し、次いで製造業者の指示に従いコウシ陽ホスファターゼ（Gibco/
BRL，Gaithersburg,MD）で末端を脱リン酸化することによってベクター（４μｇ
）を連結のために調製した。連結体はｃＤＮＡを約１０〜２０ｎｇとベ
クター約１００ｎｇを含んでいたが、それを１４℃で一晩インキュベートした。
連結体で、製造業者の指示に従いＸＬ−２ブルーウルトラコンピテント細胞（St
ratagene，La Jolla，CA）１ｍＬを形質転換した。形質転換細胞を１３３ｍｍコ
ロニー／プラークスクリーンフィルター（Dupont/NEN,Boston,MA）上に広げ、１
００μｇ／ｍＬアンピシリン（Sigma，St.Louis,MO）を含むルリアブロス寒天プ
レート上にプレート当り３０，０００〜６０，０００コロニーの密度で播いた。
実施例３ 視床下部ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
フィルター上のコロニーを第２のフィルターセットにレプリカプレートした。
陽性ハイブリダイゼーションシグナルを与えるコロニーを含む領域を次に単離す
るために、マスターフィルターを４℃で保存した。コロニーが肉眼で見えるまで
、レプリカフィルターを３７℃で数時間増殖させ、次いで確立された方法(Mania
tisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y Publications,Cold Spring Harbor,NY；引用により本明細書に含まれるものと
する)により、コロニーのインサイチューハイブリダイゼーションのために処理
し
た。ストラタリンカー（Stratagene，La Jolla，CA）を用い、ＤＮＡをフィルタ
ーに架橋した。フィルターを２×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳ中５５℃で２時間洗浄
し、細菌残渣を除去した。次いで、８〜１０枚のフィルターを、５０％ホルムア
ミド含有１×ハイブリダイゼーション溶液(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)１５〜
２０ｍＬを含む熱密閉性バッグ(Kapak,Minneapolis,MN)に入れ、４２℃で１時間
インキュベートした。５０％ホルムアミド含有１×ハイブリダイゼーション緩衝
液（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）中で、下記の放射標識プローブ１，０００
，０００ｃｐｍ／ｍＬ超を用い、４２℃でフィルターを１晩ハイブリダイズさせ
た。Ｏｂ−Ｒの細胞外部分をコードする２．２ｋｂフラグメントであるプローブ
を、レディープライム（Amersham，Arlington Heights，IL）を用い、［α32Ｐ
］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Amersham，Arlington Heights,IL）によ
るランダムプライミングで標識した。プロベクアントＧ−５０スピンカラム（Ph
armacia Biotech,Piscataway,NJ）を用いて、取込まれなかったヌクレオチドか
らプローブを精製した。フィルターを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い
２度、６０℃で３０分間洗浄し、オートラジオグ
ラフィーを行った。ハイブリダイゼーション陽性コロニーを含む個々の領域を、
ハイブリダイズさせたフィルターのオートラジオグラムで並べた。それらをマス
ターフィルターから切出し、０．５ｍＬのルリアブロス＋２０％グリセロール中
に入れた。陽性の各コロニーを、密度が１００×１５ｍｍのプレート当り約５０
〜２００コロニーで再プレートし、上記のようにハイブリダイズさせた。個々の
陽性コロニーを拾い、ウィザードキット（Promega，Madison,WI）を用い、一晩
培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。
実施例４ 痩身ラットＯＢ−レセプターｃＤＮＡのＰＣＲを用いる増幅
視床下部ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブを得るた
めに、マウス及びヒトＯＢ−レセプターアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを
用いるＰＣＲによって、ラットＯＢレセプターを最初に得た。一セットのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、低コドン縮重度の領域に対し設計した。マウスアミ
ノ酸配列ＨＷＥＦＬＹＶとＥＣＷＭＫＧに対応する正方向プライマーＲＯＢＲ２
（５’−ＣＡＹ ＴＧＧ ＧＡＲ ＴＴＹ ＣＴＩ ＴＡＹ ＧＴ−３’）とＲ
ＯＢＲ３（５’−
ＧＡＲ ＴＧＹ ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＡＹ ＧＧ−３’）、及びマウスアミノ酸
ＧＹＴＭＷＩ、ＶＹＷＳＮＷＳ、ＷＰＭＳＫＶ、ＤＤＧＭＫＷを表す逆方向プラ
イマーＲＯＢＲ６（５’−ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＴＩ ＧＴＲ ＴＡＩ ＣＣ−３
’）、ＲＯＢＲ７(５’−ＣＴＣ ＣＡＲ ＴＴＲ ＣＴＣ ＣＡＲ ＴＡＩ
ＣＣ−３’)、ＲＯＢＲ８（５’−ＡＣＹ ＴＴＲ ＣＴＣ ＡＴＩ ＧＧＣ
ＣＡ−３’）、ＲＯＢＲ９（５’−ＣＣＡ ＹＴＴ ＣＡＴ ＩＣＣ ＲＴＣ
ＲＴＣ−３’）のペア形成により、良好な収率で適切な大きさの産物を得た。問
題のフラグメントを、Barnesの方法（1994，Proc.Natl.Acad.Sci．91:2216-2220
；引用により本明細書に含まれるものとする）を改変して、ロングポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）産物として増幅させた。必要な長ＰＣＲフラグメントを得る
ために、Ｔａｑエクステンダー（Stratagene，La Jolla，CA）とエクスパンドロ
ングテンプレートＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim，Indianapolis,IN）を
組合せて用いた。最終容量２０μＬの標準ＰＣＲ反応混合液は、鋳型（痩身ラッ
トｃＤＮＡ）５ｎｇ、プライマー１００ｎｇ、ｄＮＴＰ５００μＭ、エクスパン
ドキットからの１×緩衝液３、ＴａｑポリメラーゼとＴａｑエクスパンダー各０
．１
μＬを含んでいた。反応物質を薄壁チューブに集めた。増幅プロトコルはパーキ
ン−エルマー（Norwalk,CT）９６００サーマルサイクラーを用いて、９２℃３０
秒が１サイクル、次いで、９２℃３０秒、４５℃１分、６８℃３分の３２サイク
ルであった。
この戦略により、一連のＰＣＲ産物を得たが、最大のものは、プライマーＲＯ
ＢＲ２とＲＯＢＲ９から増幅した約２．２Ｋ塩基対のものであった。これらの産
物を、下記のようにＤＮＡ配列解析のためにサブクローニングした。挿入体を制
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩでクローニングベクターから切出し、フラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離した。製造業者の指示
に従い、プレップ−Ａ−ジーンキット（BioRad，Richmond CA）を用いて、ゲル
からフラグメントを溶出し、上記のように放射標識した。
実施例５ ＰＣＲ産物のサブクローニング
アガロースゲル上での分離、バンドの切出し、プレップ−Ａ−ジーン（BioRad
，Richmond，CA）を用いるＤＮＡの抽出によって、適切なサイズのＰＣＲ産物を
、サブクローニングのため
に調製した。製造業者による指示に従い、ＰＣＲ産物をpCRTMII（Invitrogen，S
an Diego，CA）に連結させた。連結体でＩＮＶａＦ’細胞を形質転換し、１００
μｇ／ｍＬアンピシリンとＸ−Ｇａｌ（５０ｍｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌ（Promega
，Madison，WI）を３２μＬ）を含むルリア−ベルタニプレートに培養した。白
色コロニーを拾い、ルリア−ベルタニブロス＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中
で一晩増殖させた。ウィザードミニプレッブキット（Promega，Madison，WI）を
用い、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、
アガロースゲル上で制限エンドヌクレアーゼ消化産物を分離して、挿入体を解析
した。
ウィザードミニプレッププラスミドＤＮＡのエタノール沈殿、及び水に再懸濁
して最終ＤＮＡ濃度を１００μｇ／ｍＬにすることによって、プラスミドＤＮＡ
をＤＮＡ配列決定のために調製した。AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳによ
るＡＢＩ ＰＲＩＳＭTMダイターミネーターサイクルシークエンシングレディ反
応キットを用いて、ＤＮＡ配列解析を行った。Ｍ１３正方向と逆方向プライマー
によって、最初のＤＮＡ配列解析を行い、次いでラットＯＢ−Ｒ配列に基づくプ
ライマーを用いた。
パーキン−エルマー９６００中での増幅後、伸長産物を精製し、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭ ３７７自動配列決定器（Perkin Elmer,Norwalk,CT）で解析した。ＤＮＡ
配列データをSequencherプログラムで解析した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
OB receptor isoforms and nucleic acids encoding them Field of the invention
The present invention relates to isoforms of the ob receptor proteins, DNA sequences encoding them.
And assays using RNA sequences and receptor isoforms.Background of the Invention
Recently, mutations in several genes involved in the development of obesity in rodents have been identified.
Was. Of particular interest is the mutation found in the peptide hormone, leptin,
Leptin is a component of a novel signaling pathway that regulates body weight (Zhang et al., 1994, N
ature 372: 425-432; Chen et al., 1996, Cell 84: 491-495). Leptin is initially a mouse
Was found by positional cloning of the obesity gene ob. 2 types
Of different ob alleles were identified. One mutation is the immature leptin peptide
Causes termination, yields truncated proteins, and other mutations are transcriptions of the obesity (ob) gene.
Alters activity and reduces the amount of leptin circulating.
Decreased levels of bioactive leptin and observed in ob / ob mice
There is a link between the obese phenotypes that are observed. Recombinant leptin is ob / ob
Induces weight loss in mice, but not in diabetic phenotype db / db mice.
(Campfield et al., 1995, Science 269: 546-549; Halaas et al., 1995, S
cience 269: 543-546; Pellymounter et al., 1995, Science 269: 540-543; Rentsch et al., 19
95, Biochem. Biophys. Res. Comm. 214: 131-136; Weigle et al., 1995, J. Clin. Invest.
96: 2065-2070).
Leptin synthesis occurs in adipocytes, but reduces feeding and increases metabolic rate
Performance appears to be centrally mediated by the hypothalamus. Recombinant leptin for third brain
When injected into the chamber, a response similar to peripheral administration of leptin is elicited. Furthermore, Lepti
Recent Cloning of the Human Receptor Ob-Receptor (OB-R)
It is then transcribed in the hypothalamus (Tartaglia et al., 1995, Cell 83: 1263-1271; St.
ephens et al., 1995, Nature 377: 530-532). Furthermore, the long immature end of the mouse OB-R
The mutation that causes ligation, which is preferentially expressed in the hypothalamus, is in the fertilizer of db / db mice.
It appears to be responsible for the full phenotype (Lee et al., 1996, Nature 379: 632-635; Chua et al., 1996)
, Science 271: 994-996; Chen et al., 1996, Cell 84: 491-495).
Wild-type (slimming) rats and rats with fat mutation (fa heterozygous)
OB-R from both zygotes and homozygotes) have been isolated and sequenced (Patent
Application number No. and No. No., Attorney Docket No.19642PV and
19642PV2, filed February 22, 1996 and March 22, 1996; both incorporated herein by reference.
Document).
Various isoforms of OB-R have also been identified. These isoforms are alternative
For splicing. For example, in mice, type a is
Has 5 amino acids, Form b has 273 amino acids after 889 lysines,
Form C has three amino acids after 889 lysines and d form has 1 amino acid after 889 lysines.
It has one amino acid.
Further experiments with different isoforms can be done for a better understanding of obesity
And cloning and producing novel ob receptor isoforms to understand obesity
Can be used in assays to identify ligands useful for its prevention and treatment;
Good.Detailed description of the invention
The present invention has been designated c ', f and g, substantially free of associated membrane proteins.
To a novel ob receptor isoform. Departure
Ming also demonstrates that substantially purified ob receptor isoforms c ', f and g proteins
Related. These isoforms exist in various species, including rat, mouse and human
.
Another aspect of the invention encodes an OB receptor isoform c ', f or g.
It is a nucleic acid. Nucleic acids can be genomic DNA, cDNA, or various types of RNA.
It can be any nucleic acid capable of encoding a protein, such as Preferably, the nucleus
Acid is cDNA.
The present invention relates to a vector containing the OB-R isoform c ', f or g gene,
And a vector containing the OB-R isoform c ', f or g gene.
Appropriate conditions for introduction into the main cell and production of OB-R isoform c ', f or g
In the following, substantially pure OB-R isoform c 'is characterized by culturing the host cell.
, F or g proteins. OB-R isoforms so produced
Type c ', f or g can be obtained from a host cell in a conventional manner.
Yet another aspect of the invention is an assay using OB-R isoforms c ', f or g.
You. In these assays, the OB-R isoform c ', f or g ligand
A variety of potential molecules
Contact with OB-R isoforms c ', f or g and detect their binding. like this
To identify agonists, antagonists, and ligand mimetics
it can. A further aspect of the invention is a ligand so identified.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows the amino acid sequence of wild-type rat OB-R.
FIG. 2 shows the cDNA sequence of wild-type rat OB-R.
FIG. 3 shows the cDNA sequence encoding the rat isoform.
FIG. 4 is a cDNA specific to rat isoform c '.
As used in the specification and claims, the following definitions shall apply.
“Substantially free of bound membrane proteins” means that the receptor protein
The protein indicates no physical contact with any membrane proteins.
"Substantially purified OB-R receptor isoforms c ', f or g"
The crystalline isoform means at least 90%, preferably at least 95% pure.
“Wild type” is a gene or protein in which the gene or protein is
Meaning that they are substantially identical to those found in animals that are considered to have no differences.
To taste.
“Fa” indicates that the gene or protein is found in the rat homologue for fat mutation.
Means substantially the same as what is done.
When referring to a nucleic acid or amino acid sequence, "substantially identical" refers to the reference.
If they are, or are not exactly, identical to the reference sequence,
Includes unaffected changes.
Surprisingly, according to the invention, OB-R comprises three new isoforms c ', f or
Was found to have various isoforms including g. All of these isoforms
Or the number of amino acids and nucleic acids in the description and in the claims for convenience.
For reference, the rat wild-type sequence (FIGS. 1 and 2) is used as a reference. However,
Ming is not limited to rat wild-type proteins and nucleic acids, especially rat (wild-type)
And fat), mouse and human OB-R isoforms c ', f or g proteins and
And nucleic acids.
OB-R isoform f, after lysine at position 889 (for the rat sequence of FIG. 1),
Wild-type in that it has 6 amino acids and ends with an asparagine residue at position 895
And different. cDNA
In addition, the stop codon comes after the codons. One cDNA of rat isoform f
As shown in FIG. The present invention is particularly directed to all various cDNs encoding the isoform f protein.
A. Superscript numbers refer to the position number of the protein.
Lys889Iso890Met891Pro892Gly893Arg894Asn895
In human isoform f, ricin 891 corresponds to rat ricin 889 and the same 6
Followed by lysine 889.
In a particularly preferred embodiment of the invention, the OB-R isoform f is of rat origin.
OB-R isoform g differs from wild-type in that it is significantly shorter than the wild-type sequence
. The following 18 amino acids are found at the beginning of the protein. Superscript
The numbers indicate their location. Arginine at position 18 begins with proline at position 166
Spliced into large fragments of both wild-type molecules (both mouse and human)
. This isoform then extends to the rest of the wild-type molecule.
Met1PheTwoGlnThreeThrFourProFiveArg6Ile7Val8Pro9GlyTenHis11Lys12Asp13Leu14Ile15Se
r16Lys17Arg18Pro166…
Pro166Later, the rest of the protein may be the same as the wild type or
Another isoform such as, b, c, d, e or f
Mutations can also be included.
A particularly preferred embodiment is rat isoform g.
OB-R isoform c 'is similar to OB-R isoform C, but OB-R isoform c
Was previously reported (Lee et al., Nature 379: 632-635). After lysine at position 889,
The OB-R isoform c 'has three amino acids, Val890Thr891Phe892Including termination only.
As can be seen, isoform c 'is similar to valine, where the final amino acid is found in isoform c.
Rather, it is phenylalanine. Further, isoform c '
There is an untranslated sequence in the coding DNA, which does not appear to be present in isoform c
. The cDNA encoding rat isoform c 'is shown in FIG. In humans, Val, T
hr, Phe follows ricin 891.
One aspect of the invention is the molecular cloning of these various isoforms of OB-R.
is there. Wild-type and fa receptor proteins have one extracellular domain and one membrane
Contains a transmembrane domain. In the rat, the extracellular domain comprises amino acids 1-830
Reach. The transmembrane domains are 839-860. The cytoplasmic domain is amino acid 86
0 to 1162. Similar domains have been identified in mouse and human proteins.
The present invention provides for one or more domains
Includes the missing isoforms c ', f and g. Such a deleted protein may be a ligand
Useful for identification and assay of their binding activity.
In the rat wild-type protein, amino acids 1-28 form a signal sequence.
That is, the mature protein spans amino acids 28-1162. Mature protein isoform
Form yet another aspect of the present invention. It was reported in mouse and human OB-R
Slightly different from 1 to 22 signal sequences. Mature mouse, human isoforms
Another surface is formed.
The OB-R isoform c ', f, or g gene can actually be obtained using a known vector.
It can be introduced into any of these host cells. Suitable host cells include E. coli and
Milk cell lines and yeast cell lines are included.
One skilled in the art can select a known vector appropriate for a given host cell. general
Is preferably a plasmid or a viral vector. OB-R isoform c ', f or
The g gene can be in its natural form, present in the vector, or a heterologous promoter,
Knowing to control one or more enhancers, or transcription or translation, if desired
May be under the control of other sequences that are OB-R isoform
Culturing a host cell containing the c ', f or g gene and OB-R isoform c', f or g
The gene is expressed. After a suitable time, the OB-Rc ', f or g isoform protein
Can be obtained from cells using conventional separation techniques.
A further aspect of the invention relates to the use of OB-Rc ', f or g in an assay to generate OB-R
To identify the c ', f or g isoform ligand. The ligand is OB-R iso
May bind to type receptors and cause receptor activation in vivo
May not wake up. The ligand is an agonist of the receptor (ie, its
Activity), may be an antagonist (inhibits its activity), or
Does the ligand bind but has little or no effect on receptor activity?
Maybe.
In ligand assays, the OB-R isoforms of the invention may be used to identify potential ligands.
And measure the amount of binding. The amount of binding can be measured in a number of ways. For example,
The ligand or OB-R isoform to be studied is labeled with a conventional label (eg, a radioactive label or a fluorescent label).
Light label) and then contacted with the OB-R isoform under binding conditions. Appropriate
After time, the unbound ligand is separated from the OB-R isoform and the amount of bound ligand is determined.
Can be determined. This is the OB of the present invention.
Any of the -R isoforms can be performed. Alternatively, the binding amount of various isoforms
Can be compared. In competitive assays, potential ligands and known ligands
Are present, and the binding amount of the potential ligand is
Compare with the total amount. Alternatively, a ligand that displaces a previously bound known ligand
The potential (or vice versa) of the potential In yet another embodiment,
Assays show that the OB-R isoform binds to the surface and is a potential ligand.
It may be a heterogeneous assay characterized by being contactable. Detection of binding is labeled
, Antibodies and chromophores.
In another assay, the OB-R isoform of the invention is used in a "trans" activation assay.
Can be used. Such an assay is described in U.S. application Ser. Issue (Attorney Docket
No. 19686PV, filed on April 22, 1996; incorporated herein by reference)
It is described in. In this assay, cells expressing the OB-R isoform of the invention
(Natural or recombinant), a minimal promoter, a leptin activating element and a
Transfect with a reporter gene construct containing the porter gene. Report
Transcription of the intergene depends on activation of the leptin activating element. Receptor for ligand
Binding to the pter isoform activates the leptin activating element, which in turn
The transcription of the reporter gene occurs.
The following non-limiting examples are described to better illustrate the invention.
Example 1 Preparation of mRNA and cDNA from rat tissue
Tissue was collected from lean and fa / fa Zucker rats and snap frozen in liquid nitrogen.
Was. Collected tissues include hypothalamus, pituitary gland, lung, liver, kidney, heart, adrenal gland, and smooth muscle
, Skeletal muscle, and adipose tissue. Presence of guanidinium isothiocyanate
The tissue was homogenized using a Brinkmann Polytron homogenizer below. Messen
Jar RNA isolation kit (Stratagene, La Jolla, CA)
, MRNA was prepared from the hypothalamus, lung and kidney. SuperScriptTMChoice
Using cDNA (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD), cDNA was extracted from about 2 μg of mRNA.
Prepared. Oligo per reaction (dT)12-181 μg of primer and random hexamer
First strand cDNA synthesis was initiated using -25 ng. Made second strand cDNA synthesis
Performed according to the manufacturer's instructions. [α-32P] dCTP (3000 Ci / mmol)
Labeling of an aliquot (1/10) of the second strand reaction with about 1 μCi
The amount was evaluated. Labeled products are separated on an agarose gel and autoradiographed.
Detected.
Example 2 Preparation of hypothalamic cDNA library
About 3 μg of cDNA prepared as described in Example 1 was added to phosphorylated BstxI
About 3.6 μg of adapter (Invitrogen, San Diego, CA) was ligated. Next
Dilute the ligation mixture and use a cDNA sizing column (Gibco / BRL Gaithersburg, MD)
Size fractionated. Drops from the column were collected and the elution volume from the column was measured.
. Aliquots from each fraction were analyzed on an agarose gel. 1kb or more cDNA
The fractions containing were pooled and precipitated. Size fractionation with BstxI adapter
The cDNA is converted to the prokaryotic vector pcDNAII (Invitrogen, San Diego, CA).
Connected to. First cut with the restriction endonuclease BstXI and the linearized vector
Was gel purified and then calf positive phosphatase (Gibco /
Vector (4 μg) by dephosphorylating the ends with BRL, Gaithersburg, MD
) Was prepared for ligation. The ligated DNA contains about 10 to 20 ng of cDNA.
Containing about 100 ng of the reactor, which was incubated at 14 ° C. overnight.
In the conjugate, XL-2 blue ultracompetent cells (St.
ratagene, La Jolla, CA). The transformed cells are
Spread on Ronnie / plaque screen filter (Dupont / NEN, Boston, MA)
Luria broth agar plate containing 00 μg / mL ampicillin (Sigma, St. Louis, MO)
Plated at a density of 30,000-60,000 colonies per plate.
Example 3 Screening of hypothalamic cDNA library
The colonies on the filters were replica plated on a second set of filters.
The region containing the colony giving the positive hybridization signal is then isolated
For storage, the master filter was stored at 4 ° C. Until the colony is visible to the naked eye
The replica filters were grown for several hours at 37 ° C. and then established (Mania
tis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y Publications, Cold Spring Harbor, NY; hereby incorporated by reference.
Process for in situ hybridization of colonies
I
Was. Filter DNA with Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA)
Crosslinked. Wash filters in 2x SSC and 0.5% SDS at 55 ° C for 2 hours
To remove bacterial residues. Then, 8 to 10 filters were removed by 50% formaldehyde.
1x hybridization solution containing amide (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD) 15-
Place in a heat-tight bag (Kapak, Minneapolis, MN) containing 20 mL and place at 42 ° C for 1 hour
Incubated. 1x hybridization buffer containing 50% formamide
Solution (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD) in the following radiolabeled probe 1,000:
Hybridize filter overnight at 42 ° C. using> 2,000 cpm / mL
Was. Probe which is a 2.2 kb fragment encoding the extracellular portion of Ob-R
Using the ready prime (Amersham, Arlington Heights, IL) and [α32P
By dCTP (3000 Ci / mmol, Amersham, Arlington Heights, IL)
Labeled with random priming. Probecant G-50 spin column (Ph
armacia Biotech, Piscataway, NJ)
The probe was purified. Using a filter of 0.1 × SSC, 0.1% SDS
Wash twice at 60 ° C for 30 minutes.
Ruffy went. Individual regions containing hybridization-positive colonies
Autoradiograms of the hybridized filters were arranged. Trout them
Cut out from the filter and 0.5 mL of Luria Broth + 20% glycerol
Put in. Approximately 50 colonies per 100 × 15 mm plate were obtained for each positive colony.
Re-plated with ~ 200 colonies and hybridized as above. Individual
Pick positive colonies and use Wizard Kit (Promega, Madison, WI) overnight
Plasmid DNA was prepared from the culture solution.
Example 4 Amplification of lean rat OB-receptor cDNA using PCR
Obtaining probes for screening hypothalamic cDNA libraries
For example, degenerate primers based on mouse and human OB-receptor amino acid sequences were used.
The rat OB receptor was first obtained by the PCR used. A set of oligos
Nucleotide primers were designed for regions of low codon degeneracy. Mouse net
Forward primer ROBR2 corresponding to the amino acid sequences HWEFLYV and ECWMKG
(5'-CAY TGG GAR TTY CTI TAY GT-3 ') and R
OBR3 (5'-
GAR TGY TGG ATG AAY GG-3 ') and mouse amino acids
A backward plug representing GYTMWI, VYWSNWS, WPMSKV, DDGMKW
Immer ROBR6 (5'-ATC CAC ATI GTR TAI CC-3
'), ROBR7 (5'-CTC CAR TTR CTC CAR TAI
CC-3 '), ROBR8 (5'-ACY TTR CTC ATI GGC
CA-3 '), ROBR9 (5'-CCA YTT CAT ICC RTC
RTC-3 ') pairing yielded a suitably sized product in good yield. Question
The title fragment was prepared using the method of Barnes (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2216-2220).
Modified herein to include a long polymerase
Amplified as a chain reaction (PCR) product. Obtain the required long PCR fragment
And Taq Extender (Stratagene, La Jolla, CA)
Template PCR system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)
Used in combination. The standard PCR reaction mixture with a final volume of 20 μL
CDNA, 5 ng, primer 100 ng, dNTP 500 μM, Expan
1x Buffer 3, Taq polymerase and Taq expander from Dokit, 0 each
. 1
contained μL. The reactants were collected in a thin-walled tube. Amplification protocol is parked
92 ° C. 30 using a Norwalk, CT 9600 thermal cycler.
The second is one cycle, then 32 cycles of 92 ° C for 30 seconds, 45 ° C for 1 minute, and 68 ° C for 3 minutes.
It was.
This strategy yielded a series of PCR products, the largest being the primer RO
It was of about 2.2K base pairs amplified from BR2 and ROBR9. These products
The products were subcloned for DNA sequence analysis as described below. Control insert
Excised from the cloning vector with the restriction endonuclease EcoRI,
Were separated from the vector by agarose gel electrophoresis. Manufacturer's instructions
Using Prep-A-Gene kit (BioRad, Richmond CA)
The fragment was eluted from and radiolabeled as described above.
Example 5 Subcloning of PCR products
Separation on agarose gel, band excision, Prep-A-Gene (BioRad
, Richmond, CA) to extract PCR products of appropriate size.
For subcloning
Was prepared. Following the manufacturer's instructions, transfer the PCR product to pCRTMII (Invitrogen, S
an Diego, CA). The INVaF 'cells were transformed with the conjugate and 100
μg / mL ampicillin and X-Gal (50 mg / mL X-Gal (Promega
, Madison, WI) in a Luria-Bertani plate containing 32 μL). White
Pick a color colony and in Luria-Bertanibros + 100 μg / mL ampicillin
For overnight. Wizard Mini Preb Kit (Promega, Madison, WI)
Was used to prepare plasmid DNA. Digest the plasmid DNA with EcoRI,
Isolate restriction endonuclease digests on agarose gels and analyze inserts
did.
Ethanol precipitation of Wizard Miniprep plasmid DNA and resuspension in water
To a final DNA concentration of 100 μg / mL
Was prepared for DNA sequencing. By AmpliTaq DNA polymerase, FS
ABI PRISMTMDie terminator cycle sequencing ready
DNA sequence analysis was performed using the reaction kit. M13 forward and reverse primer
Performs an initial DNA sequence analysis, and then a protocol based on the rat OB-R sequence.
Limer was used.
After amplification in Perkin-Elmer 9600, the extension product was purified and the ABI PRI
Analysis was performed on an SM 377 automated sequencer (Perkin Elmer, Norwalk, CT). DNA
Sequence data was analyzed with the Sequencher program.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 ヘス，ジヨン・ダブリユ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 ヘイ，パトリシア
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 フイリツプス，マイケル・エス
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 G01N 33/566 G01N 33/566 C12N 5/00 A // A61K 38/00 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72 Inventor Hess, Jyon Dubrillo United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Hey, Patricia United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Phillips, Michael S.A. United States of America, New Jersey 07065; Lowway, East Lincoln Avenue 126