【発明の詳細な説明】
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
および細胞質性雄性不稔の核性回復発明の背景
(a)発明の分野
本発明は、細胞質雄性不稔の核性回復のためのマーカーに関し、特にこのよう
なマーカーの一つとしてのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素相補性DNAの
使用に関する。本発明は、また細胞質雄性不稔の核性回復のための遺伝子に関し
、特にこの目的のためのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする遺
伝子の一形態の使用に関連する。最後に、本発明はこのような遺伝子による植物
の遺伝的形質転換を直接的に用いた稔性回復因子の系の生産に関する。
(b)背景技術
異なる品種の穀物の雑種は、親の系よりもはるかに大きい生産高を示す。この
現象は雑種強勢として知られている。雑種強勢の使用に手段を与えるには、異種
交雑において親の系の一つまたは両方の自家受粉を妨げるために有効な方法を手
に入れる必要がある。機械的、化学的および遺伝学的方法が、これを達成するた
めに有効である。確立された遺伝学的方法の一つは、細胞質雄性不稔(CMS)の特
性を含む。CMSの遺伝学的決定因子、母系的に転移された、生存できる花粉を生
産する不能は、ミトコンドリアのゲノムに存在する。CMS植物は雄性不稔なので
、それらの植物上に形成する全ての種子は雑種形成を必然とする。しかしながら
、CMSの母系伝達のために、このようなF1雑種もまた正常に雄性不稔になり、こ
の故に自家受精できず種子を生産することができない。この問題に取り組むため
に、稔性回復因子(Rf：restorers of fertility)と名付けられた、雄性不稔の表
現型を抑圧する特異的核性遺伝子を異種交雑の受粉側の親に組込むことができる
。雄性不稔の細胞質が不稔性を授与する遺伝子型は維持因子（maintainers）と
名付けられ、一方、Rf遺伝子を持つ遺伝子型は回復因子（restorers）と名付け
られる。CMSの維持と回復のためのこれらの遺伝子は同じ遺伝子座の異なる対立
遺伝子(各々rfおよびRf)と見なされることができる。
現在の解決法の欠点
CMSを用いた種々の雑種を生産するためには、適切な数の、Rf遺伝子を含む回
復因予の系（restorers lines）およびCMS細胞質によって不稔化される維持因子
の系（”maintainers”lines）が入手可能でなければならない。雑種穀物生産に
おけるこのような系の使用は図１に概説されている。慣用的遺伝学によるこれら
の系の開発は、最低でも数年の努力を要するゆっくりとした過程であって、且つ
カナダの主要な商品作物（cash crop）であるcanolaを含む多くの穀類におけるC
MSに基づく雑種の生産に主要な障害を現在提示するゆっくりとした過程である。
例えば、新たな回復因子系を創造するためには、まず第一に、Rf遺伝子を与える
、すでに存在している回復株と受容株との間に一つの雑種を生産することが必要
であり；ついで受容株への一連の戻し交雑がその株の他の望まれる性質を変える
ことなくRf遺伝子を組込むために実施されるが、この過程は遺伝質浸透と名付け
られる。多くの世代を経た後でさえ、ドナーDNA上でRfに連鎖したいくつかのド
ナーDNAは残る。この現象は連鎖牽引（introgression）と名付けられる。このド
ナーDNAは有害な特性を持ち、受容株の特性を損なう可能性がある(Jean,M．ら、
.,1993,Current Topics in Molecular Genetics，１:195-201)。
この過程は間接的選択の一般的な作業によって促進されることができる。すな
わち、子孫の植物はまず初めに、回復遺伝子そのものよりはむしろ回復遺伝子に
連鎖した遺伝マーカーに関してスクリーニングされる。これらのマーカーは、そ
れらが植物発生の非常に初期の段階でスクリーニングされることができるように
選択される。これは、多くの子孫植物を成熟へと成長させるという費用のかかる
作業を迂回することになり、遺伝質浸透の過程をかなり加速することができる。
制限酵素断片長多型(RFLPs)はこの目的に理想的に適したDNAマーカーの一タイプ
を示す。RFLPは特異的DNAプローブによって検出される制限酵素断片パターンが
（二つの遺伝子型の間で）異なる。回復および維持因子系の間で異なる断片パタ
ーンを検出し、Rf遺伝子と共分離するプローブ群は、植物改良プログラムにおけ
る回復遺伝子の間接的な選択に用いられることができる。我々は、目下雑種種子
の生産に用いられているcanola(B．napus)におけるCMSの二つの形態の一つであ
るPolimaまたはpol CMSの回復因子であるRfplに連鎖したいくつかのプローブを
獲得している。これらのマーカーのいずれもが、この遺伝子に完全には連鎖して
いな
い。このことは，これらを間接的選択へ使用することに不確定要素を一つ導入し
一植物中のいかなるマーカーの存在もこの植物における回復遺伝子の存在を保証
しない。それゆえ、回復遺伝子を含む植物の間接的選択のためには沢山のマーカ
ーを用いることが必要である。
細胞質雄性不稔の核性回復に完全に連合したマーカーが提供されることが、非
常に望ましいはずである。
この過程は、単離された回復遺伝子の直接的導入によってさらに促進されうる
。我々は、我々が同定したプローブは、Rfplと完全な連鎖をしているので、回復
遺伝子そのものを検出することができると信じる。発明の概要
本発明の目的の一つは、細胞質雄性不稔に関する核性回復のためのマーカーの
一つを提供することである。
本発明のもう一つの目的は、このような回復因子マーカーとしてグリセルアル
デヒド３リン酸脱水素酵素相補DNAの使用を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、この遺伝子を遺伝学的形質転換によって直接的に
回復因子系を生産するのに使用することを可能にすることである。
本発明に従えば、植物の細胞質雄性不稔の核性回復のために特異的なプローブ
が提供されるが、該プローブはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素cDNAまた
はゲノムDNA配列、そのハイブリダイズする断片（hybrldizing fragment）また
はグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素の増幅のためのプライマーとして使用
されるためにそれらから得られるすべてのDNA配列を含み、前記のDNA配列または
そのハイブリダイズする断片はストリンジェントな条件下で核性回復遺伝子を所
有する植物に特有の特異的DNA断片とハイブリダイズする。
本発明に従えば、植物における細胞質雄性不稔の核性回復のための遺伝子も提
供される。その遺伝子は、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素およびその周
囲の配列をコードするDNA配列を含む。
この周囲の配列はグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素の配列に対して3’
末端および／または5’末端に位置しており、約50kbであってよい。
本発明に従えば、回復因子系の生産方法をも提供される。その方法は、本発明
の細胞質雄性不稔遺伝子の核性回復によって植物を遺伝学的に形質転換する方法
を含む。
本発明に従えば、植物種における回復遺伝子がGAPCの特異的形態に対応するな
らば、いかなる植物種も使用することができる。このような植物種は、制限なし
に、Brassica napus、他のBrassica種、トウモロコシ(Zea mays)、コメ（Oryza
sativum)、ヒマワリ（Helianthus annum）およびサトウモロコシ（Sorghum bico
lor)を含む。図面の簡単な説明
図1は、雑種種子生産における細胞質雄性不稔(CMS)の使用の略図である。
図2は、稔性回復遺伝子Rfp1に完全に連鎖したマーカーを同定するために用い
られた交雑を示す。
図3Aから3Eは、Brassica napusのcDNAクローンcRF1(配列番号１)の、Sinapisa
lba(配列番号２)およびArabidopsis thaliana(配列番号３)由来の細胞質グリセ
ルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(GACP)のcDNAsとの比較を示す。
図4は、Rfp1遺伝子について分離した遺伝学的集団におけるBrassica napusに
おけるcRF1プローブによって検出された多型を示すゲルを示す。発明の詳細な説明
我々は、回復遺伝子が分離してくる集団を生み出す遺伝学的交雑の分析を続け
た(図２に概説してある)。いかなる場合においても、交雑の性質は、連鎖したマ
ーカーに関しては、ほとんどの不稔の子孫の個体は交雑の雄性不稔の親に特異的
なRFLPを示すのに対して、ほとんどの雄性稔性子孫植物は稔性の親に特徴的なRF
LPを示すというものであった。cRF1と命名された新たなマーカーは、この遺伝子
に完全に連鎖することがわかった。特に、二つの交雑において試験された175個
体のうち稔性の子孫は全て稔性の親の対立遺伝子（または形態）を所有するのに
対して、不稔の植物は全て不稔の親の対立遺伝子を持つことがわかった(表1)。c
RF1は、ゆえに、回復遺伝子の間接的選択のためのとりわけ強力な道具であるこ
とを示す。
表１
以前の解決法との差異
cRF1とRfp1との完全な連鎖により回復遺伝子の間接的選択のための本プローブ
の使用における不確定性は実質的には除外された。
さらに、Pollmaまたはpol CMS系のためのいかなる回復遺伝子も単離されず、
それ故、直接的に遺伝学的形質転換による回復系の生産は可能ではない。このこ
とは、新たな回復因子系（図４）を発生させる際に間接的な選択法をとることに
よる費用の大幅な削減をもたらすべきである。
この多型を検出したDNAプローブはB．napus相補DNA(cDNA)、すなわち、メッセ
ンジャーRNA分子（mRNA）に相補的なDNAである。このcDNAのDNA配列を決定した
。ヌクレオチド配列のデータベースの分析は、cDNAの配列が99％Arabldopsis th
aliana由来の解糖酵素の細胞質の形態、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
の配列に類似していることを示した(図3Aから3B)。この配列はGAPC遺伝子により
コードされている(Shih，M.-C.et al.，1991，Gene，104:133-138)。回復遺伝子
とGAPC多型との間の完全な連鎖は、回復遺伝子はGAPCの特異的形態であるらしい
ことが考えられる。
我々は、異なるB.napusCMS（nap遺伝子）系に関する回復遺伝子が分離したBC1
集団についても同じ種類の分析を実施し、そしてnap回復因子が同じ遺伝子座の
異なる対立遺伝子であるにすぎなかったことがわかった。すなわち、GAPCの異な
る二つの形態はB.Napusの異なる二つの核性稔性回復遺伝子に対応している。こ
の結果はさらに、他の回復遺伝子がGAPCのイソ型に対応し、GAPCと回復遺伝子の
間の関係は他の植物種の他のCMS系に拡張することができることを示唆している
。いかなる植物種におけるGAPCと回復遺伝子の間のいかなる関係も、以前に提案
されて
はいない。
ゆえに、この遺伝子により、回復因子特異的GAPC遺伝子を維持因子遺伝子型（
回復因子を本来持たない遺伝子型）に導入する遺伝学的形質転換を用いて、単一
過程において回復系を構築することが可能になる可能性がある。それはこのよう
な系の発生に必要な植物育成過程における多くの過程を省くので、きわめて費用
において効果的なはずである。もしGAPCと回復遺伝子の間の連携が他の穀物種に
も拡張されれば、このことは多くの穀類における回復遺伝子の単離と回復因子系
の発生への普遍的方法を示す。
本発明は以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるだろう。
これらの実施例は本発明の範囲を制限するよりはむしろ本発明を例証するために
与えられる。
実施例Ｉ
新たな回復細胞系列の生産における
間接的選択マーカーとしてのGAPCプローブの使用
三つの植物遺伝子型が考察される。即ち、
A CMS細胞系
B 回復遺伝子を欠き雄性稔性細胞質を含む雄性稔性系
R 回復遺伝子および雄性不稔細胞質を含む雄性稔性系。
現有の遺伝学的交雑により生産された系Aと系Bの間の雑種は大きな雑種強勢を
示し、AとRの間の雑種は雑種強勢を示さないことが推定される。系Bは回復遺伝
子を欠いているため、CMSを用いてこれら二つの系から雄性稔性雑種を生産する
ことは不可能である。しかしながら、もし回復遺伝子が系Rから系Bへ系Bの特性
を変質させずに転移されることができれば、CMSを用いて系Aと系Bの間の雄性稔
性雑種を獲得することが可能なはずである。伝統的には、このことは遺伝質浸透
と呼ばれる方法により実施される。系Rは雌として系Bと交雑され、AとBの間の雄
性不稔のF1雑種を生じ、そのF1雑種は雄性不稔細胞質を含み(雑種の細胞質は独
占的に雌の親から由来する)、しかしまた雄性稔性でもある。なぜならこのF1雑
種は系Rの親から回復遺伝子の単コピーを受容しているからである。ついで第二
の交雑（戻し交雑と呼ぶ）が雑種（雌としての）と系Bの間で実施される。成長
した多数の子
孫が栽培地に存在し、そして同数の不稔と稔性の子孫が期待され、稔性のものは
回復遺伝子を有する。一つかそれ以上の稔性子孫が、ついで系Bとの第二の戻し
交雑に雌として使用される。稔性の植物が回収され雌として三度目の系Bとの戻
し交雑を行われた。この過程は何世代にもわたって繰り返された。新たな個々の
世代とともに子孫はより系Bに相似するようになることが期待される(それらが回
復遺伝子を所有する以外は)。個々の世代において、系Bに関連する様々な性質が
評価されることになる。結局、系Bの望ましい性質を全てまたはほとんどそなえ
た新たな回復系が生産されることになる。この系は、大規模な系AとBの間の雑種
生産に用いられることになる。
GAPCプローブはこの過程を容易にするが、なぜならこれは苗木の段階の子孫植
物における回復遺伝子の存在の評価を考慮に入れるからである。DNAが少量の葉
の材料から抽出され、HindIII（図４で使用される）などの制限エンドヌクレア
ーゼによって消化されGAPCプローブを用いて分析される。回復遺伝子に特異的な
制限酵素による断片の存在は、実生（seedling）が回復遺伝子を持つことを示唆
している。実生の段階にある非常に多数の植物が、栽培地で同じ植物を成熟まで
成長させるのに必要な費用より非常に低い費用でスクリーニングされる。さらに
、雄性稔性表現型は多くの異なる条件により影響を受け、完全に連鎖した多型に
関するスクリーニングによる遺伝子の存在に関するスクリーニングは、この遺伝
質浸透の作業により遺伝子の存在をより確実に検出する。
実施例II
GAPCの回復遺伝子形態の形質転換を介した導入による
新たな回復細胞系の生産
実施例Ｉの三つの植物遺伝子型が、この方法に従って考察される。
この実施例において、課題は正確に実施例Ｉのそれとまったく同じである。す
なわち、系Bの特性を改変することのない、系Rから系Bへの回復遺伝子の転移で
ある。この場合においては、しかしながら、我々は回復遺伝子を代表するGAPC遺
伝子の形態は単離されており、そして適当な植物であるAgrobacterium tumefaci
ensの形質転換ベクターpRD400の中に単離されたDNA断片として入手可能であると
推定する(Datla RSS，Hammerlindl JK，Panchuk B，Pelcher LE & Keller W．（
19
92）Gene 211:383-384)。実施例Ｉで記述された時間のかかる戻し交雑プログラ
ムの代わりに、GAPC遺伝子はAgrobacteriumを介した形質転換によって系Bに転移
される。
この実施例のために、我々は、系A、BおよびRがBrassica napus系であること
、および単離された回復遺伝子が系Rのものと同一であることも推定する。Molon
eyら(Moloney，M.，Walker，J．& Sharma，K．(1989)Plant Cell Rep.8:238-242
)によって記載された方法を用いることにより、prRD400ベクターに遺伝子を有す
るAgrobacterium株が株B実生由来の子葉を接種するのに用いられる。このAgroba
cteriumは抗生物質処理により除去され、得られた植物繊維は抗生物質カナマイ
シンを含む培地に植えられる。pRD400はカナマイシンへの耐性を与える遺伝子を
含んでおり、それ故にこの抗生物質培地に成長した細胞群は、おそらくpRD400の
中に単離された回復遺伝子と一緒にカナマイシン遺伝子を獲得した。ついで、こ
れらの植物における回復遺伝子の存在が、植物を直接検定し、GAPCプローブを用
いた回復因子に特異的な制限断片の存在によって検定された。三つの植物が、も
し雄性不稔細胞質を含めば稔性になること、および、系A（雌としての）と新た
な形質転換した系との交雑から生じたF1子孫もまた雄性稔性になることが期待さ
れる。
この方法は二つの異なる利点を持つ：この方法はこの系を開発するのに数年か
かるのに対して数ケ月だけしか必要としないため、慣用的な植物改良実験よりも
はるかに速く費用もかからない。さらに、回復遺伝子の存在は系Bのゲノムと新
たな回復系のゲノムの差異でしかない。すなわち、系Bの特性の完全性は、おそ
らく、より損なわれにくい。
上記の記載は特殊な植物種Brassica napusに関するものであるとはいえ、本発
明は、その穀物種の回復遺伝子がGAPCの特異的形態に一致するかぎり他の種にも
応用しうる。そのような場合には、形質転換の技術が上記のものと異なる可能性
もある。
本発明の特定の態様について記載したが、さらなる改変が可能であり、本出願
は、本発明のいかなる変形、用途、適用をも含むことを意図していることは理解
されようし、そして一般には本発明の原理に従い、また本発明が属する分野にお
ける既知のまたは慣用的な実施の範囲にあり、且つ前記の本質的な特性に応用さ
れてよいものとして、そして付属の請求の範囲に従うよう、本発明の開示からの
発展を包含する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Glyceraldehyde Triphosphate Dehydrogenase and Nuclear Recovery of Cytoplasmic Male Sterility Background of the Invention (a) Field of the Invention The present invention relates to a method for nuclear recovery of cytoplasmic male sterility. It relates to markers, and in particular to the use of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase complementary DNA as one of such markers. The present invention also relates to genes for nuclear restoration of cytoplasmic male sterility, and in particular to the use of one form of the gene encoding glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase for this purpose. Finally, the invention relates to the production of fertility-restoring factor systems directly using genetic transformation of plants with such genes. (b) Background Art Hybrids of different varieties of grain show much higher yields than the parental line. This phenomenon is known as heterosis. Providing a means for the use of heterosis requires the availability of effective methods to prevent self-pollination of one or both parental lines in a cross. Mechanical, chemical and genetic methods are effective to achieve this. One of the established genetic methods involves the characteristics of cytoplasmic male sterility (CMS). The genetic determinant of CMS, the inability to produce maternally transferred, viable pollen, resides in the mitochondrial genome. Since CMS plants are male sterile, all seeds that form on those plants will require hybridization. However, due to the maternal transmission of CMS, such F1 hybrids also become normally male sterile and therefore cannot self-fertilize and cannot produce seed. To address this problem, a specific nuclear gene, called the restorers of fertility (Rf), that suppresses the male sterility phenotype, can be incorporated into the pollinating parent of a cross. . Genotypes in which the cytoplasm of male sterility confers sterility are termed maintainers, while those with the Rf gene are termed restorers. These genes for maintenance and recovery of CMS can be considered as different alleles (rf and Rf, respectively) at the same locus. Disadvantages of current solutions In order to produce various hybrids using CMS, an appropriate number of restorers lines containing the Rf gene and maintenance factors that are sterilized by the CMS cytoplasm are required. Lines ("maintainers" lines) must be available. The use of such a system in hybrid cereal production is outlined in FIG. The development of these lines by conventional genetics is a slow process that requires at least several years of effort, and CMS in many cereals, including canola, Canada's major cash crop. It is a slow process that presents a major obstacle to the production of hybrids based on ATP. For example, in order to create a new recovery factor system, it is first necessary to produce one hybrid between an already existing recovery strain and a recipient strain that gives the Rf gene; A series of backcrosses to the recipient strain is then performed to integrate the Rf gene without altering the other desired properties of the strain, a process termed genetic infiltration. Even after many generations, some donor DNA remains linked to Rf on the donor DNA. This phenomenon is termed introgression. This donor DNA has deleterious properties and may impair the properties of the recipient strain (Jean, M. et al., 1993, Current Topics in Molecular Genetics, 1: 195-201). This process can be facilitated by the general task of indirect selection. That is, progeny plants are first screened for genetic markers linked to the rescuing gene rather than the rescuing gene itself. These markers are chosen so that they can be screened at a very early stage of plant development. This will bypass the costly task of growing many progeny plants to maturity and can significantly accelerate the process of genetic infiltration. Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) represent one type of DNA marker that is ideally suited for this purpose. RFLP differs (between the two genotypes) in the pattern of restriction fragments detected by specific DNA probes. Probes that detect fragment patterns that differ between the recovery and maintenance factor systems and that co-segregate with the Rf gene can be used for indirect selection of recovery genes in plant improvement programs. We have obtained several probes linked to Rfpl, one of the two forms of CMS, Polima or pol CMS, in canola (B. napus) currently used for hybrid seed production. ing. None of these markers are fully linked to this gene. This introduces one uncertainty in using them for indirect selection, and the presence of any marker in a plant does not guarantee the presence of a restored gene in this plant. Therefore, it is necessary to use a large number of markers for indirect selection of plants containing the recovery gene. It would be highly desirable to provide a marker that is fully associated with nuclear recovery of cytoplasmic male sterility. This process can be further facilitated by the direct introduction of the isolated recovery gene. We believe that the probe we identified is in perfect linkage with Rfpl and can detect the restored gene itself. SUMMARY OF THE INVENTION One of the objects of the present invention is to provide one of the markers for nuclear recovery for cytoplasmic male sterility. Another object of the present invention is to provide the use of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase complementary DNA as such a recovery factor marker. Another object of the present invention is to enable this gene to be used for producing a rescuer factor system directly by genetic transformation. According to the present invention, there is provided a specific probe for nuclear restoration of cytoplasmic male sterility of a plant, wherein the probe comprises a glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase cDNA or genomic DNA sequence, and a hybridized genomic DNA sequence. The DNA sequence or a hybridizing fragment thereof, including all the DNA sequences obtained therefrom to be used as primers for the amplification of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase, or a hybridizing fragment thereof. Hybridizes under stringent conditions with a specific DNA fragment specific to plants possessing a nuclear recovery gene. According to the present invention, there is also provided a gene for nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in a plant. The gene includes a DNA sequence encoding glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase and surrounding sequences. This surrounding sequence is located at the 3 'and / or 5' end relative to the sequence of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase and may be about 50 kb. According to the present invention, there is also provided a method for producing a recovery factor system. The method includes a method of genetically transforming a plant by nuclear recovery of the cytoplasmic male sterility gene of the present invention. According to the present invention, any plant species can be used, provided that the restoration gene in the plant species corresponds to a specific form of GAPC. Such plant species include, without limitation, Brassica napus, other Brassica species, corn (Zea mays), rice (Oryza sativum), sunflower (Helianthus annum) and sorghum (Sorghum bico lor). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic illustration of the use of cytoplasmic male sterility (CMS) in hybrid seed production. FIG. 2 shows the cross used to identify a marker that is completely linked to the fertility restoring gene Rfp1. FIGS. 3A to 3E show the results of the cytoplasmic glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (GACP) derived from Sinapisa lba (SEQ ID NO: 2) and Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3) of the Brassica napus cDNA clone cRF1 (SEQ ID NO: 1). 2 shows a comparison with cDNAs. FIG. 4 shows a gel showing polymorphisms detected by the cRF1 probe in Brassica napus in a genetic population segregated for the Rfp1 gene. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION We continued the analysis of genetic crosses that yielded a population in which rescuing genes segregated (reviewed in FIG. 2). In any case, the nature of the cross indicates that, for linked markers, most male offspring individuals show RFLPs specific to the male sterile parent of the cross while most male fertile offspring The plants exhibited RFLPs characteristic of fertile parents. A new marker, designated cRF1, was found to be completely linked to this gene. In particular, of the 175 individuals tested in the two crosses, all of the fertile offspring possess the allele (or morphology) of the fertile parent, while all of the sterile plants have the allele of the sterile parent. It was found to have the gene (Table 1). c RF1 thus indicates to be a particularly powerful tool for indirect selection of rescuing genes. Table 1 Differences from previous solutions The complete linkage between cRF1 and Rfp1 virtually eliminated the uncertainty in the use of this probe for indirect selection of rescuing genes. Furthermore, no recovery gene for the Pollma or pol CMS system has been isolated, and therefore the production of a recovery system by direct genetic transformation is not possible. This should result in a significant cost reduction by taking an indirect selection strategy in generating a new healing factor system (FIG. 4). The DNA probe that detected this polymorphism was B.A. Napus complementary DNA (cDNA), ie, DNA that is complementary to a messenger RNA molecule (mRNA). The DNA sequence of this cDNA was determined. Analysis of the nucleotide sequence database indicated that the sequence of the cDNA was similar to the cytoplasmic form of the glycolytic enzyme from 99% Arabldopsis th aliana, the sequence of glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (FIG. 3A). From 3B). This sequence is encoded by the GAPC gene (Shih, M.-C. et al., 1991, Gene, 104: 133-138). The complete linkage between the rescuing gene and the GAPC polymorphism suggests that the rescuing gene is likely to be a specific form of GAPC. We performed the same type of analysis on the BC1 population in which restoring genes for different B. napus CMS (nap genes) systems were segregated, and found that the nap restoring factor was only a different allele at the same locus. all right. That is, two different forms of GAPC correspond to two different nuclear fertility restoring genes of B. Napus. The results further suggest that other rescuing genes correspond to GAPC isoforms and that the relationship between GAPCs and rescuing genes can be extended to other CMS systems in other plant species. No relationship between GAPC and restoring genes in any plant species has been previously proposed. Therefore, this gene makes it possible to construct a recovery system in a single step using genetic transformation that introduces a recovery factor-specific GAPC gene into a maintenance factor genotype (a genotype that does not originally have a recovery factor). May be possible. It should be very cost effective as it eliminates many steps in the plant growing process required for the development of such a system. If the linkage between GAPC and the rescuing gene is extended to other cereal species, this indicates a universal approach to isolating the rescuing gene and generating a rescuer factor system in many cereals. The invention will be more readily understood by reference to the following examples. These examples are provided to illustrate, rather than limit, the scope of the invention. Example I Use of a GAPC Probe as an Indirect Selection Marker in the Production of a New Recovered Cell Line Three plant genotypes are considered. A male fertile line lacking the A CMS cell line B restoring gene and containing a male fertile cytoplasm R Male fertile line containing a restoring gene and a male sterile cytoplasm. It is presumed that hybrids between lines A and B produced by existing genetic crosses show large heterosis, and hybrids between A and R do not show heterosis. It is not possible to produce male fertile hybrids from these two lines using CMS because line B lacks the recovery gene. However, if the recovered gene can be transferred from line R to line B without altering the characteristics of line B, it is possible to obtain a male fertile hybrid between line A and line B using CMS It should be. Traditionally, this is performed by a method called genetic penetration. Line R is crossed with line B as a female, resulting in a male-sterile F1 hybrid between A and B, the F1 hybrid containing male-sterile cytoplasm (the cytoplasm of the hybrid is exclusively derived from the female parent. ), But also male fertile. This is because this F1 hybrid has received a single copy of the restored gene from the parent of line R. A second cross (called backcrossing) is then performed between the hybrid (as a female) and line B. A large number of grown offspring are present in the cultivation area, and the same number of sterile and fertile offspring is expected, fertile ones having the rescuing gene. One or more fertile offspring are then used as females in a second backcross with line B. Fertile plants were recovered and backcrossed with strain B for the third time as females. This process was repeated for generations. It is expected that offspring will become more similar to lineage B with the new individual generation (except that they possess the restored gene). In each generation, various properties related to system B will be evaluated. Eventually, a new recovery system will be produced that has all or almost all of the desirable properties of system B. This line will be used for large-scale hybrid production between lines A and B. GAPC probes facilitate this process because they allow for the assessment of the presence of a rescuing gene in progeny plants at the seedling stage. DNA is extracted from a small amount of leaf material, digested with a restriction endonuclease such as HindIII (used in FIG. 4) and analyzed using a GAPC probe. The presence of a fragment by a restriction enzyme specific for the recovery gene suggests that the seedling has the recovery gene. A very large number of plants at the seedling stage are screened at a much lower cost than that required to grow the same plant to maturity in the growing area. In addition, the male fertility phenotype is affected by many different conditions, and screening for the presence of a gene by screening for fully linked polymorphisms will more reliably detect the presence of the gene through this work of penetrating the genetic material. Example II Production of a New Restorative Cell Line by Transformation of the Restorable Gene Form of GAPC The three plant genotypes of Example I are considered according to this method. In this embodiment, the problem is exactly the same as that of embodiment I. That is, transfer of the restored gene from system R to system B without altering the characteristics of system B. In this case, however, we have isolated the form of the GAPC gene representing the restored gene and obtained it as a DNA fragment isolated in the transformation vector pRD400 of the appropriate plant, Agrobacterium tumefaciens. Presumably possible (Datla RSS, Hammerlindl JK, Panchuk B, Pelcher LE & Keller W. (1992) Gene 211: 383-384). Instead of the lengthy backcrossing program described in Example I, the GAPC gene is transferred to system B by Agrobacterium-mediated transformation. For this example, we also estimate that lines A, B and R are Brassica napus lines, and that the isolated rescued gene is identical to that of line R. By using the method described by Moloney et al. (Moloney, M., Walker, J. & Sharma, K. (1989) Plant Cell Rep. 8: 238-242), an Agrobacterium strain having the gene in the prRD400 vector was established. Used to inoculate cotyledons from strain B seedlings. The Agrobacterium is removed by antibiotic treatment, and the resulting plant fiber is planted in a medium containing the antibiotic kanamycin. pRD400 contains a gene that confers resistance to kanamycin, and therefore the population of cells grown on this antibiotic medium acquired the kanamycin gene, probably together with the rescuing gene isolated in pRD400. The presence of the restoration gene in these plants was then assayed directly by assaying the plants and the presence of a restriction fragment specific for the restoration factor using a GAPC probe. Three plants become fertile if they contain male-sterile cytoplasm, and F1 progeny resulting from the crossing of line A (as a female) with the newly transformed line also become male fertile It is expected. This method has two distinct advantages: it takes years to develop this system, but only a few months, so it is much faster and less expensive than conventional plant improvement experiments . Furthermore, the presence of the restoration gene is only a difference between the genome of system B and the genome of the new restoration system. That is, the integrity of the properties of system B is probably less impaired. Although the above description is with respect to the specific plant species Brassica napus, the invention is applicable to other species as long as the restoring gene of the cereal species matches the specific form of GAPC. In such cases, the transformation techniques may differ from those described above. While particular embodiments of the present invention have been described, it is to be understood that further modifications are possible and that this application is intended to cover any variations, uses, or adaptations of the invention and, in general, In accordance with the principles of the present invention, and as set forth in the well-known or conventional practice of the art to which it pertains and which may be applied to the essential characteristics set forth above, and in accordance with the appended claims, Includes developments from the disclosure of the invention.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１０年７月２４日（１９９８．７．２４）
【補正内容】
日本語明細書第12頁を次のとおり補正する（請求の範囲を差し替える）
『 請求の範囲
１．グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする核酸配列またはその
ハイブリダイズする断片からなる、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的
なプローブであって、上記のDNA配列またはそのハイブリダイズする断片は、ス
トリンジェントな条件下での核性回復遺伝子を有する植物に特徴的な特異的DNA
断片にハイブリダイズする、前記プローブ。
２．配列番号１の核酸を含む、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的な
プローブ。
３．請求項１または２記載のプローブに由来するプライマーDNA配列。
４．核ゲノムDNA中の回復遺伝子を検出する方法であって、該方法は、以下の
工程：
ｉ）グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする核酸配列からなる、
植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的なプローブであって、上記のDNA配
列またはそのハイブリダイズする断片は、ストリンジェントな条件下での核性回
復遺伝子を有する植物に特徴的な特異的DNA断片にハイブリダイズする、前記プ
ローブを、ストリンジェントな条件下で核ゲノムDNA配列とハイブリダイズさせ
；そして
ii）プローブと核ゲノムDNAのハイブリダイゼーションを検出するが、但し、
プローブと核ゲノムDNAのハイブリダイゼーションが回復遺伝子含有核ゲノムDNA
の指標であること
からなる。
５．核ゲノムDNA中の回復遺伝子の存在を検出する方法であって、該方法は、
以下の工程：
ｉ）請求項３記載のプライマーDNA配列を用いて適切な条件下で核ゲノムDNAを
増幅し；そして
ii）上記プライマーDNA配列を用いて核ゲノムDNAを検出するが、但し、核ゲノ
ムDNAの増幅が回復遺伝子を含有する核ゲノムDNAの指標であること
ことからなる。
６．プローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の核酸からな
る、請求項４記載の方法。
７．プローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の核酸からな
る、請求項５記載の方法。
８．グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードするDNA配列および周辺
配列からなり、そして請求項４、５、６または７記載の方法により検出される、
植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための遺伝子。
９．周辺配列がグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素配列に対して３'およ
び／または５'に位置する、請求項８記載の遺伝子。
10．請求項８記載の細胞質性雄性不稔の核性回復により遺伝学的に植物を形質
転換することからなる、回復因子系列の生成方法。
11．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項１記載のプローブの
使用。
12．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項２記載のプローブの
使用。
13．プローブが配列番号２または配列番号３に記載の核酸配列からなる、請求
項11記載の使用。
14．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項３記載のプライマー
DNA配列の使用。』[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act
[Submission date] July 24, 1998 (July 24, 1998)
[Correction contents]
Amend page 12 of the Japanese description as follows (replace claims)
" The scope of the claims
1. Nucleic acid sequence encoding glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase or a nucleic acid sequence thereof
Specific for nuclear restoration of plant cytoplasmic male sterility, consisting of hybridizing fragments
The above DNA sequence or a hybridizing fragment thereof
Specific DNA characteristic of plants with nuclear recovery genes under stringent conditions
The probe, which hybridizes to a fragment.
2. Specific for nuclear recovery of cytoplasmic male sterility in plants, comprising the nucleic acid of SEQ ID NO: 1
probe.
3. A primer DNA sequence derived from the probe according to claim 1 or 2.
4. A method for detecting a recovery gene in nuclear genomic DNA, the method comprising:
Process:
i) consisting of a nucleic acid sequence encoding glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase,
A probe specific for nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in a plant,
The array or its hybridizing fragments are subjected to nuclear recovery under stringent conditions.
The step of hybridizing to a specific DNA fragment characteristic of a plant having a revertant gene.
The lobes are hybridized under stringent conditions to the nuclear genomic DNA sequence.
; And
ii) detecting hybridization between the probe and nuclear genomic DNA, provided that
Hybridization of probe and nuclear genomic DNA restores nuclear genomic DNA containing gene
Be an indicator of
Consists of
5. A method for detecting the presence of a recovery gene in nuclear genomic DNA, the method comprising:
The following steps:
i) converting nuclear genomic DNA under appropriate conditions using the primer DNA sequence of claim 3;
Amplify; and
ii) Nucleic genomic DNA is detected using the above primer DNA sequence, except that nuclear genomic DNA is detected.
DNA amplification is an indicator of nuclear genomic DNA containing a recovery gene
Consisting of
6. The probe consists of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
The method of claim 4, wherein
7. The probe consists of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
The method of claim 5, wherein
8. DNA sequence encoding glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase and surroundings
Consisting of a sequence and detected by the method of claim 4, 5, 6 or 7.
Gene for nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in plants.
9. The surrounding sequence is 3 'to the glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase sequence.
9. The gene according to claim 8, wherein the gene is located at 5 'and / or 5'.
Ten. Genetically transforming a plant by nuclear recovery of the cytoplasmic male sterility according to claim 8.
A method for generating a recovery factor series, comprising converting.
11． The probe according to claim 1, which is used for nuclear recovery of cytoplasmic male sterility of a plant.
use.
12． The probe according to claim 2 for nuclear recovery of cytoplasmic male sterility in a plant.
use.
13. The probe, comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
Use according to item 11.
14. The primer according to claim 3, which is used for nuclear recovery of cytoplasmic male sterility of a plant.
Use of DNA sequences. 』
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ
，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 ジャン，マルティンヌ
カナダ国ケベック ジー１ブイ・３エック
ス３，サント―フイ，デラージュ 877
ニュメロ３────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S
D, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG)
, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT
, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA,
CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F
I, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG
, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT,
LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, N
O, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG
, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG,
US, UZ, VN, YU, ZW
(72) Inventor Jean Martin
Quebec G 1 buoy 3 ek Canada
SU 3, Santo Huy, Delage 877
Numero 3