【発明の詳細な説明】
インビボで発現されるB．burgdorferiポリペプチド
本発明は、米国衛生研究所によって授与された助成番号第AI30548、AI26815、
AI49387、およびAR40452の元に政府の援助で行われた。米国政府は本発明におい
て一定の権利を有する。
発明の技術分野
本発明は、ライム病の予防、診断、および処置に有用な組成物および方法に関
する。より詳細には、本発明は、処置された動物において免疫応答を惹起し得る
新規のB．burgdorferiポリペプチドに関する。本発明はまた、宿主の感染の間に
発現されるがインビトロ培養においてB．burgdorferiによっては発現されない新
規のB．burgdorferiポリペプチドに関する。
本発明はまた、一つ以上の新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む多成分ワ
クチンに関する。本発明の範囲にはまた、新規のB．burgdorferiポリペプチドを
コードするDNA配列、新規のポリペプチドに対する抗体、およびこの抗体または
このポリペプチドを含む診断キットが存在する。最後に、本発明は、インビボで
選択的に発現される細菌遺伝子の同定のための新規の方法に関する。
発明の背景
ライムボレリア症は、米国では最も一般のベクター媒介感染である（S.W.Bart
holdら、"An Animal Model For Lyme Arthritis"，Ann．N.Y．Acad．Sci.，539,
pp.264-73(1988)）。これは、南極以外のすべての大陸において報告されている
。ライム病の臨床特徴は、遊走性紅斑として知られる早期拡張性の皮膚傷害であ
り、これは、数週間から数カ月間後に神経性、心臓、および関節の異常を伴い得
る。
ライム病の原因病原体は、Borrelia burgdorferiとして知られるスピロヘータ
であり、まずIxodes ricinus複合体のIxodesマダニにより伝染する。B．burgdor
feriはまた、他の種のマダニならびに蚊およびメクラアブに保有されていること
が示されている。しかし、I.ricinus複合体のマダニのみがヒトに対して疾患を
伝染させ得るようである。
ライム病は一般に、三段階で起こる。第一段階は、スピロヘータが感染の他の
任意の時間よりもより容易に培養される局所的な皮膚の傷害（遊走性紅斑）を含
む（B.W.Bergerら、"Isolation And Characterization Of The Lyme Disease Sp
irochete From The Skin Of Patients With Erythema Chronicum Migrans"，J.A
m．Acad．Dermatol．3，pp.440-49(1985)）。インフルエンザ様症状または髄膜
炎様症状が、この時点で一般的である。第二段階は、数日から数週間以内に起こ
り、そしてスピロヘータの患者の血液またはリンパを介した体内の多くの異なる
部位（脳および関節を含む）への拡散を含む。この汎発性感染の異なる症状が、
皮膚、神経系、および骨格筋系において起こるが、これらは、代表的には断続的
である。第三段階、または感染後期は、持続性の感染と定義され、そして重篤に
無力にされ得る。慢性関節炎、および中枢神経系および末梢神経系の症候群は、
この段階において継続的な感染そしておそらくは生じた自己免疫疾患の結果とし
て、発現する（R.Martinら、"Borrelia burgdorferi-Specific And Autoreactiv
e T-Cell Lines From Cerebrospinal Fluid In Lyme Radiculomyelitis"、Ann.N
eurol.，24，pp.509-516(1988)）。
ヒト由来のB．burgdorferiは、マダニ由来よりも培養することがはるかにより
困難である。それゆえ、現在では、ライム病は、血清学によりまず診断される。
酵素連結免疫吸収アッセイ（ELISA）は、しばしば使用される検出方法である。
代表的には超音波処理した全培養スピロヘータを、このようなアッセイにおいて
抗原として使用して、感染した個体の血清において形成される抗B．burgdorferi
抗体を検出する（J.E．Craftら、"The Antibody Response In Lyme Disease:Eva
luation Of Diagnostic Tests"，J．Infect．Dis.，149 pp.789-95(1984)）。し
かし、偽陰性および、より一般には、偽陽性の結果が現在利用可能な試験では付
随する。
現在、ライム病の全段階は、抗生物質で処置されている。疾患初期の処置が通
常効果的である。しかし、より後の段階で付随する心臓、関節、および神経系の
障害は、しばしば、治療には応答しない（A,C，Steere，"Lyme Disease"，New E
ng．J．Med．321,pp.586-96(1989)）。従って、初期の介入が、効果的な治療に
は重要である。従って、感染の初期に発現される免疫原性B．burgdorferiタンパ
ク質を同定するという緊急の需要が存在する。
梅毒を引き起こすTreponemapallidumおよび感染性黄疸を引き起こすleptospir
aeのように、Borreliaは、スピロヘータの真正細菌門に属する（A.G．Barbourお
よびS.F.Hayes、"Biology Of Borrelia Species"，Microbiol．Rev.，50,pp.381
-400(1986)）。Borrelia burgdorferiは、細胞膜により、次いで鞭毛により、そ
して次いで外膜により取り囲まれる原形質円筒（cylinder）を有する。
現在までに同定されているB．burgdorferi外部表面タンパク質は、[3H]パルミ
チン酸での標識により実証されるようにリポタンパク質であると考えられている
（M.E.Brandtら、"Immunogenic Integral membrane Proteins of Borrelia burg
dorferi Are Lipoproteins"，Infect Immun.，58,pp983-991(1990)）。２つの主
要な外部表面タンパク質は、31kDa外部表面タンパク質Ａ（OspA）および34kDa外
部表面タンパク質Ｂ（OspB）である。両方のタンパク質は、異なる単離物からま
たは同じ単離物の異なる継代から、それらの分子量およびモノクローナル抗体と
の反応性により決定されるように異なっていることが示されている。OspCは、以
前にpCとして同定された（R．Fuchsら、"Molecular Analysis and Expression o
f a Borrelia burgdorferi Gene Encoding a 22 kDa Protein(pC)in Escherichi
a coli"，Mol．Microbiol.，6，pp．503-09(1992)）。OspDは、低継代の病原性
株のB．burgdorferi B31により優先的に発現されるといわれる（S.J．Norrisら
、"Low-Passage-Associated Proteins of Borrelia burgdorferi B31:Character
ization and Molecular Cloning of OspD，A Surfaced-Exposed，Plasmid-Encod
ed Lipoprotein"，Infect．Immun．60，pp．4662-4672(1992)）。19kDタンパク
質であるOspEは、感染初期に発現される一方、26kDタンパク質であるOspFは、後
期に発現される（T.T．Lamら、"Outer SurfaceProteins E and F Of Borreli a
burgdorferi，the Agent of Lyme Disease,"Infect．Immun.，62，pp.290-298(1
994)）。
今日までに同定された非OspB．burgdorferiタンパク質は、他の細菌フラゲリ
ンとの相同性の領域を含むことで知られる41kDaのフラゲリンタンパク質（G.S.
Gassmanら、"Analysis of the Borrelia burgdorferi GeHo fla Gene and Antig
enic Characterization of Its Gene Product"，J.Bacteriol．173,pp.1452-59(
1991)）、および周辺質空間に局在化するといわれる93kDaタンパク質（D.J.Volk
manら、"Characterizatioin of an Immunoreactive 93 kDa Core Protein of Bo
rrelia burgdorferi With a Human IgG Monoclonal Antibody"J．Immun.146,pp
．3177-82(1991)）である。
B．burgdorferiはその生活環の異なる段階の間に外側の表面での抗原を変化さ
せることが知られている。例えば、OspCは、餌を与えられないマダニ内のスピロ
ヘータによっては発現されない。しかし、OspCは、吸血および血液飼料のマダニ
の中腸の内腔への導入の後に合成される。対照的に、OspAは、静止期マダニの中
腸内のスピロヘータの顕著な表面抗原である。スピロヘータは、マダニの食餌の
間に中腸から唾液腺に移動するため、OspAの発現は減少する。マダニ内のOspAの
ダウンレギュレーションは、OspA抗体応答の存在下でのスピロヘータの生存を可
能にし、選択的抗原発現が、免疫破壊を避けるB．burgdorferiによる機構であり
得ることを示唆する。
他の細菌病原性遺伝子産物の発現は、環境シグナルによって誘導されることが
知られている（J.J.Mekalanos,"Environmental Signal Controlling Expression
of Virulence Determinants In Bacteria"，J．Bacteriol.，174，pp.1-7(1992
)）。遺伝子発現の同様の誘導は、特定の外的シグナルが存在する感染した宿主
において生じ得る。従って、病原性機構を理解するためには、宿主では発現され
るが、インビトロ培養物では発現されない遺伝子を同定し、次いで遺伝子産物の
機能を研究することが重要である。
Salmonella typhimuriumを用いる遺伝子系は、インビボで誘導される細菌遺伝
子を同定するために開発されている（M.J．Mahanら、"Selection of Bacterial
Virulence Genes That Are Specifically Induced in Host Tissues"，Science
259，pp686-688(1993)）。しかし、この系は、遺伝子伝達系および充分定義され
た栄養要求性が利用可能でない病原性生物には適用され得ない。このような系は
、B．burgdorferiでは利用不可能である。ライム病の効果的な処置および予防に
は、B．burgdorferiが宿主の防御を回避し、疾患を起こし、そして宿主内で生存
する
ことを可能にする機構の理解が要求されるため、インビボで選択的に発現される
B．burgdorferi遺伝子を同定する方法に対する緊急の需要が存在する。
脊椎動物宿主内でのみ発現されるB．burgdorferi抗原への体液性応答は、ライ
ム病の血清学的な診断において助けとなり得る。このようなタンパク質は、Barb
our-Stoenner-Kelly（BSK）II培地中で培養されたスピロヘータには存在しない
。いくつかのB．burgdorferiタンパク質の選択的インビボ発現は、培養B．burgd
orferiの全細胞溶解物に基づいたライム病に対する現在の診断検査が信頼できな
い一つの理由であり得る。このような検査は、インビボで発現される抗原に対す
る抗体を検出し得ない。従って、より信頼できるライム病の診断検査を提供する
B.burgdorferiタンパク質を同定するための需要もまた存在する。
最近、マウスの組換えOspAでの免疫化は、その後のB．burgdorferiでの感染に
対する長期の保護を与えるのに効果的であることが示されている（E．Fikrigら
、”Long-Term Protection of Mice from Lyme Disease by Vaccination with O
spA"，Infec．Immun．60，pp.773-77(1992)）。しかし、今日までに使用されたO
spA免疫原による保護は、いくらか株特異的であるようであり、これはおそらく
、異なるB．burgdorferi単離物の間でのOspA遺伝子の異質性のためである。例え
ば、B．burgdorferi株N40由来のOspAでの免疫化は株N40、B31、およびCD16によ
る後の感染に対して保護を与えるが、株25015に対しては与えない（E.Fikrlgら
、"Borrelia burgdorferi Strain 25015:Characterization of Outer Surface P
rotein A and Vaccination Against Infection"，J.Immun 148，pp.2256-60(199
2)）。
OspBでの免疫化はまた、ライム病に対する保護を与えることが示されているが
、OspAにより与えられるのと同程度には与えない（E．Fikrigら、"Roles of Osp
A,OspB and Flagellin in Protecitve Immunity to Lyme Borreliosis in Labor
atory Mice"，Infec.Immun，60，pp.657-61(1992)）。さらに、いくつかのB．bu
rgdorferiは、OspBで免疫化したマウスにおける破壊を、切断型OspBタンパク質
の発現を生じるOspB遺伝子の変異を介して回避し得るようである（E．Fikrigら
、"Evasion of Protective Immunity by Borrelia burgdorferi by Truncation
of Outer Surface Protein B"，Proc．Natl．Acad．Sci.,90，pp.4092-96(1993)
）。OspCもまた、B．burgdorferi感染のスナネズミモデルにおいて保護的効果が
示さ
れている。しかし、このタンパク質での免疫化により生じる保護は、部分的でし
かないようである（V.Preac-Mursicら、"Active Immunization with pC Protein
of Borrelia burgdorferi Protects Gerbilsagainst B．burgdorferi Infectio
n"Infection，20，pp.342-48(1992)）。
OspFによる免疫化もまた、感染に対して部分的な保護を与えることが示されて
いる（T.K．Nguyenら、"Partial Destruction of Borrelia burgdorferi Within
Ticks That Engorged On OspE-Or OspF-Immunized Mice."Infect．Immun．62,p
p．2079-2084(1994)）。抗OspE抗体および抗OspF抗体の両方は、マダニにおける
スピロヘータの数を低減させることが示されている（T.K．Nguyenら、前出）。
マダニの侵入の防御が完全ではなく、そしてライム病が出現した場合にライム
病は看過または誤診断され得るので、保護的免疫応答を惹起させ得、そして広ス
ペクトルワクチンにおいて有用であり得るB．burgdorferiのさらなる抗原および
関連するタンパク質の決定に対する、継続的に緊急な需要が存在する。さらに、
さらなるB．burgdorferi抗原の同定は、ライムボレリア症の種々の段階において
有用である、より信頼できる診断試薬の開発を可能にし得る。
発明の開示
本発明は、新規のB．burgdorferiポリペプチドを提供する。このタンパク質は
、B．burgdorferiスピロヘータまたはそのフラグメントを実質的に含有せず、従
って、B．burgdorferi感染およびライム病の診断、処置、および予防のための組
成物および方法において有用である。１つの実施態様において、本発明は、p21
ポリペプチドならびにこれらのポリペプチドを含む組成物および方法を提供する
。
別の実施態様において、本発明は、K2ポリペプチドならびにこれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、P35ポリペプチドならびにこれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、P37ポリペプチドならびにこれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、M30ポリペプチドならびにこれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、V3ポリペプチドならびにこれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、J1ポリペプチドならびにこれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、J2ポリペプチドならびにこれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法を提供する。
前記の各実施態様の好ましいポリペプチドは、インビボで選択的に発現される
。
前記の各実施態様の好ましい組成物および方法はまた、処置した動物において
免疫応答の形成を惹起する新規のB．burgdorferiポリペプチドにより特徴付けら
れる。
別の実施態様において、本発明は、１つ以上の他の免疫原性B．burgdorferiポ
リペプチドに加えて本発明の１つ以上の新規のB．burgdorferiポリペプチドを含
む多成分ワクチンを提供する。このようなワクチンは、B．burgdorferi感染に対
して広範な保護を与えるのに効果的である。
さらに別の実施態様において、本発明は、本発明の新規のB．burgdorferiポリ
ペプチドに対する抗体、ならびにこれらの抗体を含む組成物および方法を提供す
る。
別の実施態様において、本発明は、１つ以上の新規のB．burgdorferiポリペプ
チド、またはこれらのポリペプチドに対する抗体により特徴付けられる診断手段
および方法を提供する。これらの手段および方法は、ライム病およびB．burgdor
feri感染の検出に有用である。これらはまた、このような感染に対する処置の経
過を追跡するのに有用である。本発明のワクチンを事前に接種した患者において
、本明細書中で開示される検出手段および方法はまた、ブースト接種が適切であ
るかどうかを決定するのに有用である。
さらに別の実施態様において、本発明は、さらなるB．burgdorferiポリペプチ
ドの同定および単離の方法ならびにこのようなポリペプチドを含む組成物および
方法を提供する。
さらに別の実施態様において、本発明は、宿主の感染の間に発現するが細菌の
インビトロ培養の間には発現しない抗原タンパク質をコードする細菌遺伝子を同
定する方法を提供する。
最後に、本発明は、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドをコードする
DNA配列、これらのDNA配列により特徴付けられる組換えDNA分子、これらのDNA配
列および分子で形質転換される単細胞宿主、ならびに本発明の新規のB．burgdor
feriポリペプチドおよび多成分ワクチンを産生するためにこれらの配列、分子お
よび宿主を使用する方法を提供する。本発明のDNA配列はまた、ライム病およびB
.burgdorferi感染の診断のための方法および手段に有利に使用される。
図面の簡単な説明
図１は、B．burgdorferi株N40のP21ポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配列を
示す。
図２は、B．burgdorferi株N40のP35ポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配列を
示す。
図３は、B．burgdorferi株N40のP37ポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配列を
示す。
図４は、B．burgdorferi株N40のM30ポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配列を
示す。
図５は、B．burgdorferi株N40のV3ポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配列を示
す。
図６は、P35および37の親水性プロフィールを示す。
図７は、P21とB．burgdorferi株N40 OspEのアミノ酸配列の比較を示す。
図８は、P21およびK2をコードするDNA配列、ならびに他の公知のB．burgdorfe
ri外表面タンパク質のDNA配列の間での、転写および翻訳制御領域の比較を示す
。
発明の詳細な説明
本発明は、新規のB．burgdorferiポリペプチド、それらをコードするDNA配列
、それらのポリペプチドに対する抗体、ポリペプチドまたは抗体を含む組成物、
ならびにライム病の検出、処置、および予防のための方法に関する。
より詳細には、１つの実施態様において、本発明は、P21ポリペプチドならび
にそれらのポリペプチドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、K2ポリペプチドならびにそれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、P35ポリペプチドならびにそれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、P37ポリペプチドならびにそれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、M30ポリペプチドならびにそれらのポリペ
プチドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、V3ポリペプチドならびにそれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、J1ポリペプチドならびにそれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法に関する。
別の実施態様において、本発明は、J2ポリペプチドならびにそれらのポリペプ
チドを含む組成物および方法に関する。
前述の各実施態様の好ましいポリペプチド、組成物、および方法は、免疫原性
B．burgdorferiポリペプチドである新規のB．burgdorferiポリペプチドによって
特徴付けられる。
別の実施態様において、本発明は、他の免疫原性B．burgdorferiポリペプチド
に加えて１つ以上の新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む、ライム病に対す
る多成分ワクチンに関する。このようなワクチンは、広範なスペクトルのB．bur
gdorferi生物による感染に対して保護するのに有用であり得る。
本発明によって提供される新規のB．burgdorferiポリペプチド、およびそれら
をコードするDNA配列の全ては、B．burgdorferiスピロヘータまたはそのフラグ
メントを実質的に含まないように産生され得、従って、望ましくないB．burgdor
feri成分による不慮の感染または汚染の危険なしに、種々の適用において使用さ
れ得る。従って、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドは、B．burgdorfe
ri感染の診断および予防のための組成物および方法において特に有利である。
別の実施態様において、本発明は、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチ
ドに対する抗体を含む組成物および方法に関する。このような抗体は、種々の適
用において使用され得、その適用にはB．burgdorferiの存在の検出、新規のB．b
urgdorferiポリペプチドの発現のスクリーニング、新規のB．burgdorferiポリペ
プチドの精製、新規のB．burgdorferiポリペプチドへのブロッキングまたは結合
、B．burgdorferiの表面への分子の指向、B．burgdorferi感染のいくらかの期間
にわたる重篤度の防止または軽減、およびマダニ中のB．burgdorferiスピロヘー
タのレベルの減少が含まれる。
なお別の実施態様において、本発明は、本明細書中に開示される新規のB．bur
gdorferiポリペプチドまたはそれらのポリペプチドに対する抗体によって特徴付
けられる、診断手段および診断方法に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は、インビボで選択的に発現される細菌
遺伝子を同定するための方法に関する。
本発明をさらに規定するために、以下の用語および定義を本明細書中で提供す
る。
本明細書中で使用される用語「免疫原性B．burgdorferiポリペプチド」は、動
物に投与された場合に免疫応答を惹起し得る、任意のB．burgdorferiポリペプチ
ドである。
免疫原性B．burgdorferiポリペプチドは、本発明の新規のB．burgdorferiポリ
ペプチドのみならず、PCT特許出願WO92/00055号に開示されるOspAおよびOspBポ
リペプチド；R．Fuchsら、前出に記載のOspCタンパク質；PCT特許出願WO95/0414
5号に開示されるOspEおよびOspFポリペプチド；他のB．burgdorferiタンパク質
；ならびに上記の任意のフラグメント、血清型改変体および誘導体もまた含むこ
とが意図される。特に、免疫原性B．burgdorferiポリペプチドは、本明細書中に
開示される方法に従って同定されるさらなるB．burgdorferiポリペプチドを含む
ことが意図される。
本明細書中で使用される「B．burgdorferiスピロヘータまたはそのフラグメン
トを実質的に含まない」ポリペプチドは、改変Barbour-Stoener-Kelly（BSK-II
）培地に導入し、そして37℃で７日間培養した場合に、暗視野顕微鏡によって
検出可能なB．burgdorferiスピロヘータを全く産生しないポリペプチドであるか
、またはポリクローナル抗B．burgdorferi抗血清でプローブした免疫ブロット上
で単一のバンドとして検出可能なポリペプチドである。
本明細書中で使用される「インビボで選択的に発現される」ポリペプチドは、
宿主の感染の際に発現されるがB．burgdorferiのインビトロ培養の際には発現さ
れない、そのB．burgdorferi遺伝子に対応するDNA配列によってコードされるポ
リペプチドである。「B．burgdorferi遺伝子に対応する」DNA配列は、天然に存
在するB．burgdorferiポリペプチドのフラグメントまたは誘導体と同一のポリペ
プチドをコードするDNA配列である。
本明細書中で使用される「P21ポリペプチド」は、以下からなる群より選択さ
れるポリペプチドを意味する：
（a）配列番号２のアミノ酸１〜182からなるP21ポリペプチド；
（b）（a）のP21ポリペプチドからブロック(block)として取られた少なくとも
15個のアミノ酸を含むフラグメント；および
（c）インビボで選択的に発現されるポリペプチドであって：
（1）（a）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少なくとも80％
同一である、（a）のP21ポリペプチドの誘導体；
（2）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（こ
の抗体は（a）のP21ポリペプチドと免疫学的に反応性である）と免疫学的に反応
性であるポリペプチド；
（3）B．burgdorferiおよび（a）のP21ポリペプチドと免疫学的に反応性で
ある抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（4）（a）のP21ポリペプチドでの免疫化によって惹起された抗体と免疫学
的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される用語「K2ポリペプチド」は、以下からなる群より選択
されるポリペプチドを意味する：
（a）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号３とアミノ酸配列において少なくとも80％同一であるアミノ酸
のブロックを有するポリペプチドを含む、（a）のポリペプチドの誘導体；およ
び
（c）インビボで選択的に発現されるポリペプチドであって：
（1）（a）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少なくとも80％
同一である、（a）のポリペプチドの誘導体；
（2）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（こ
の抗体は（a）のポリペプチドと免疫学的に反応性である）と免疫学的に反応性
であるポリペプチド；
（3）B．burgdorferiおよび（a）のポリペプチドと免疫学的に反応性である
抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（4）（a）のポリペプチドでの免疫化によって惹起された抗体と免疫学的に
反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「P35ポリペプチド」は、以下からなる群より選択さ
れるポリペプチドを意味する：
（a）配列番号５に示すアミノ酸配列を含むP35タンパク質、およびその血清型
改変体；
（b）（a）のP35ポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個の
アミノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のP35ポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のP35ポリペプチドと免疫学的に反応性であ
る）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のP35ポリペプチド
と免疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のP35ポリペプチドでの免疫化によって惹
起された抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「P37ポリペプチド」は、以下からなる群より選択さ
れるポリペプチドを意味する：
（a）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するP37タンパク質、およびその血清
型改変体；
（b）（a）のP37ポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個の
アミノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のP37ポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のP37ポリペプチドと免疫学的に反応性であ
る）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のP37ポリペプチド
と免疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のP37ポリペプチドでの免疫化によって惹
起された抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「M30ポリペプチド」は、以下からなる群より選択さ
れるポリペプチドを意味する：
（a）配列番号９に示すアミノ酸配列を有するM30ポリペプチド、およびその血
清型改変体；
（b）（a）のM30ポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個の
アミノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のM30ポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のM30ポリペプチドと免疫学的に反応性であ
る）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のM30ポリペプチド
と免疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のM30ポリペプチドでの免疫化によって惹
起された抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「V3ポリペプチド」は、以下からなる群より選択され
るポリペプチドを意味する：
（a）配列番号10によってコードされるアミノ酸配列を有するV3タンパク質、
およびその血清型改変体；
（b）（a）のポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個のアミ
ノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免疫学的に反応性である
）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免
疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のポリペプチドでの免疫化によって惹起さ
れた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「V3ポリペプチド」は、ATCC受託番号第 号に含ま
れるB．burgdorferi DNA配列（配列番号10のDNA配列にクロスハイブリダイズす
る）によって全部または一部がコードされるB．burgdorferiポリペプチドを含む
ことが意図される。
本明細書中で使用される「J1ポリペプチド」は、以下からなる群より選択され
るポリペプチドを意味する：
（a）ATCC受託番号第（2）号に含まれるB．burgdorferi DNA配列によって全部
または一部がコードされるポリペプチド、およびその血清型改変体；
（b）（a）のポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個のアミ
ノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免疫学的に反応性である
）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免
疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のポリペプチドでの免疫化によって惹起さ
れた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「J1ポリペプチド」は、ATCC受託番号第（2A）号に含
まれるB．burgdorferi DNA配列（ATCC受託番号第 号に含まれるB．burgdorfe
ri DNA配列にクロスハイブリダイズする）によって全部または一部がコードされ
るB．burgdorferiポリペプチドを含むことが意図される。
本明細書中で使用される「J2ポリペプチド」は、以下からなる群より選択され
るポリペプチドを意味する：
（a）ATCC受託番号第（3）号に含まれるB．burgdorferl DNA配列によって全部
または一部がコードされるポリペプチド、およびその血清型改変体；
（b）（a）のポリペプチドからブロックとして取られた少なくとも８個のアミ
ノ酸を含むフラグメント；
（c）（a）または（b）の対応するポリペプチドとアミノ酸配列において少な
くとも80％同一である、（a）または（b）のポリペプチドの誘導体；
（d）B．burgdorferiでの哺乳動物宿主の感染によって生成された抗体（この
抗体は（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免疫学的に反応性である
）と免疫学的に反応性であるポリペプチド；
（e）B．burgdorferiおよび（a）または（b）または（c）のポリペプチドと免
疫学的に反応性である抗体を惹起することが可能なポリペプチド；および
（f）（a）または（b）または（c）のポリペプチドでの免疫化によって惹起さ
れた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチド。
本明細書中で使用される「J2ポリペプチド」は、ATCC受託番号（3）に含まれ
るB．burgdorferi DNA配列にクロスハイブリダイズする、ATCC受託番号（3Aおよ び3B）
に含まれるB．burgdorferi DNA配列により全体または一部がコードされる
B．burgdorferiポリペプチドを含むことが意図される。
本明細書中で使用される「新規のB．burgdorferiポリペプチド」は、P21ポリ
ペプチド、K2ポリペプチド、P35ポリペプチド、P37ポリペプチド、M30ポリペプ
チド、V3ポリペプチド、J1ポリペプチド、またはJ2ポリペプチドである。
本明細書中で使用される、本発明による新規のB．burgdorferiポリペプチドの
「血清型改変体」は、Tmよりも20〜27℃低い温度で、新規のB．burgdorferiポリ
ペプチドをコードするDNA配列にハイブリダイズするDNA配列により全体または部
分がコードされ得る、任意の天然に存在するポリペプチドである。当業者は、本
発明による新規のB．burgdorferiポリペプチドの血清型改変体が、ポリメラーゼ
連鎖反応および新規のB．burgdorferiポリペプチドをコードするDNA配列の任意
の部分に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて任意の部分が増幅され
得るDNA配列によりコードされるポリペプチドを含むことを理解する。
本明細書中で使用される、本発明による新規のB．burgdorferiポリペプチドの
「誘導体」は、１つ以上の物理的、化学的、または生物学的な特性が変更されて
いる、新規のB．burgdorferiポリペプチドである。このような改変は、以下を含
むがこれらに限定されない：アミノ酸の置換、修飾、付加、または欠失；脂質化
、グリコシル化、またはリン酸化のパターンの変化；ポリペプチド中に存在する
アミノ酸残基の遊離のアミノ側鎖基、カルボキシル側鎖基、またはヒドロキシル
側鎖基と、他の有機分子および非有機分子との反応；ならびに一次構造、二次構
造、または三次構造における変化をもたらし得る、他の任意の改変。
本明細書中で使用される「防御抗体」は、B．burgdorferi感染に関連する生理
学的障害の任意の１つに対していくらかの期間防御を与える抗体である。
本明細書中で使用される「防御B．burgdorferiポリペプチド」は、防御エピト
ープを含むポリペプチドである。
本明細書中で使用される「防御エピトープ」は、(1)防御抗体により認識され
るエピトープ、および／または(2)動物を免疫化するために使用する場合、いく
らかの期間、B．burgdorferi感染の重篤度を防止または低下させるに十分な免疫
応答を惹起するエピトープである。
感染の重篤度を防止または低下させることは、遊走性紅斑、関節炎、心臓炎、
神経性障害、および他のライム病関連障害の生理学的発現の変化により証明され
得る。これは、処置された動物におけるスピロヘータのレベルの減少により証明
され得る。そして、これはまた、処置された動物から吸血する感染マダニにおけ
るスピロヘータのレベルの減少により証明され得る。防御エピトープは、Ｔ細胞
エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはそれらの組合せを含み得る。
本明細書中で使用される「Ｔ細胞エピトープ」は、抗原提示細胞によりＴ細胞
へ提示される場合、Ｔ細胞応答（例えば、クローン拡大またはリンホカインもし
くは他の免疫刺激分子の発現）をもたらすエピトープである。Ｔ細胞エピトープ
はまた、細胞内B．burgdorferi感染に影響を与え得る細胞傷害性Ｔ細胞により認
識されるエピトープであり得る。強力なＴ細胞エピトープは、強力なＴ細胞応答
を惹起するＴ細胞エピトープである。
本明細書中で使用される「Ｂ細胞エピトープ」は、特異的抗体と反応する、最
も単純な空間的コンホメーションの抗原である。
本明細書中で使用される、ポリペプチドまたは抗体の「治療有効量」は、動物
に投与された場合に、いくらかの期間、B．burgdorferi感染の重篤度を防止また
は低下させるのに有効である免疫応答を惹起する量である。
本明細書中で使用される「新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する抗体」
（「本発明の抗体」ともいう）は、P21ポリペプチド、K2ポリペプチド、P35ポリ
ペプチド、P37ポリペプチド、M30ポリペプチド、V3ポリペプチド、J1ポリペプチ
ド、またはJ2ポリペプチドに対する抗体である。新規のB．burgdorferiポリペプ
チドに対する抗体もまた、防御抗体であり得ることが理解されるはずである。
新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する抗体は、インタクトな免疫グロブ
リン分子またはインタクトな抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の部分（当
該分野でF(v)、Fab、Fab'、およびF(ab')2として知られる部分を含む）であり得
る。これはまた、遺伝子操作または合成により産生された分子であり得る。
本明細書中に開示される新規のB．burgdorferiポリペプチドは、B．burgdorfe
riでの哺乳動物宿主の感染により生じた抗血清と免疫学的に反応性である。従っ
て、これらは、ライム病に対する診断および防御のための方法および組成物にお
いて、ならびに進行中の感染の間のB．burgdorferiの免疫学的クリアランスを刺
激するための治療的組成物において有用である。さらに、本明細書中に開示され
る新規のB．burgdorferiポリペプチドの全てではなくとも少なくともいくらかは
B．burgdorferiの免疫原性表面タンパク質であるので、これらは、ライム病に対
する多成分ワクチンにおいて特に有用である。なぜなら、このようなワクチンは
、
複製能力のあるB．burgdorferiにより提示される免疫原をより密接に類似させる
ために処方され得るから、およびこのようなワクチンは単一のB．burgdorferiポ
リペプチドのみを含むワクチンよりも広域な防御を与える可能性が高いからであ
る。本発明による多成分ワクチンはまた、ライム病以外の病気（例えば、ジフテ
リア、ポリオ、肝炎、および麻疹）に対する免疫化に有用な他のワクチンを特徴
付けるポリペプチドを含み得る。このような多成分ワクチンは、代表的には、単
一の組成物中に取り込まれる。
本発明の好ましい組成物および方法は、増強された免疫原性を有する新規のB.
burgdorferiポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、天然形態のポリ
ペプチドまたはそのフラグメントが、意図されるレシピエントにおけるそれらの
免疫原性の特徴を増強するために、処置の改変またはそのような処置に供される
場合に生じ得る。
過度の実験を行わずに、本明細書中に開示される新規のB．burgdorferiポリペ
プチドの免疫原性を実質的に増加させるために使用され得る多数の技術が入手可
能であり、そして当業者に周知である。例えば、ポリペプチドは、ジニトロフェ
ノール基またはアルサニル酸にカップリングすることにより、または加熱および
／またはSDSでの変性により、改変され得る。特に、ポリペプチドが化学的に合
成された小さなポリペプチドである場合、これらを免疫原性キャリアにカップリ
ングすることが所望され得る。カップリングはもちろん、ポリペプチドまたはキ
ャリアのいずれかの適切に作用する能力を妨害してはならない。カップリングス
トラテジーにおけるいくつかの一般的な考慮すべき事柄の総説については、Anti
bodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，E．Harlowお
よびD．Lane編(1988)を参照のこと。有用な免疫原性キャリアは、当該分野で周
知である。このようなキャリアの例は、キーホールリンペットヘモシアニン（KL
H）；アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）およびオボアルブミン）
、PPD（ツベルクリンの精製タンパク質誘導体）；赤血球；破傷風トキソイド；
コレラトキソイド；アガロースビーズ；活性炭；またはベントナイトである。
脂質化状態を変更するための本明細書中に開示される新規のB．burgdorferiポ
リペプチドのアミノ酸配列の改変はまた、それらの免疫原性および生化学的特性
を増加させるために使用され得る方法である。例えば、ポリペプチドまたはその
フラグメントは、脂質部分の付加を指向するシグナル配列を有してまたは有さな
いで発現され得る。
以下の開示から明らかなように、ポリペプチドはまた、この分子の安定性を増
すこと、ならびにこの分子に精製および調製を受けやすくすることを目的として
調製され得る。このような技術の１つは、ポリペプチドを、他のB．burgdorferi
配列または非B．burgdorferi配列を含む融合タンパク質として発現することであ
る。
本発明によれば、新規のB．burgdorferiポリペプチドの誘導体は、種々の方法
（天然のポリペプチドをコードするDNAのインビトロ操作およびその後の改変DNA
の発現、誘導体化DNA配列の化学合成、または発現されたアミノ酸配列の化学的
もしくは生物学的操作を含む）により調製され得る。
例えば、誘導体は、異なる天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然ア
ミノ酸との１つ以上のアミノ酸の置換により産生され得、保存的置換が好ましく
、例えば、3-メチルヒスチジンはヒスチジンに置換し得、4-ヒドロキシプロリン
はプロリンに置換し得、5-ヒドロキシリジンはリジンに置換し得るなどである。
あまり保存的でないアミノ酸置換を生じることはまた、例えば、電荷、コンホ
メーション、および他の生物学的特性の変化を生じることにより、所望の誘導体
をもたらし得る。このような置換は、例えば、疎水性残基の親水性残基への置換
、システインもしくはプロリンの別の残基への置換、小さな側鎖を有する残基の
大きな側鎖を有する残基への置換、または正味の正電荷を有する残基の正味の負
電荷を有する残基への置換を含む。与えられた置換の結果が確実に予測され得な
い場合、誘導体は、本明細書中に開示される方法に従って容易にアッセイされて
、所望の特徴の存在または非存在を決定され得る。
本発明の好ましい実施態様では、本明細書中に開示される新規のB．burgdorfe
riポリペプチドは、より大きな融合タンパク質の一部として調製される。例えば
、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で、異な
る免疫原性B．burgdorferiポリペプチドに、非B．burgdorferiポリペプチドに、
またはそれらの組合せに融合されて、新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む
融
合タンパク質が産生され得る。
本発明の好ましい実施態様では、B．burgdorferiの複数の血清型改変体由来の
Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含む、新規のB．burgdorferiポリペプ
チドを含む融合タンパク質が構築され、各改変体は、ポリペプチド内のエピトー
プの位置または配列に関して別の改変体と異なっている。より好ましい実施態様
では、他の免疫原性B．burgdorferiポリペプチドに融合された１つ以上の新規の
B．burgdorferiポリペプチドを含む融合タンパク質が構築される。このような融
合タンパク質は、広範なB．burgdorferi単離株により引き起こされるようなライ
ム病の防止、処置、および診断に特に有効である。
本発明の別の好ましい実施態様では、新規のB．burgdorferiポリペプチドは、
ポリペプチドの安定性を増大させ得、そしてポリペプチドのインビボ血漿半減期
を延長させ得る部分（例えば、免疫グロブリンドメイン）に融合される。このよ
うな融合体は、当業者に周知の方法に従って（例えば、米国特許第4,946,778号
または米国特許第5,116,964号の教示に従って）、過度の実験を行うことなく調
製され得る。融合の正確な部位は、ポリペプチドが所望の生物学的活性を保持す
る限りは重要ではない。このような決定は、本明細書中の教示に従って、または
当業者に公知の他の方法により行われ得る。
新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む融合タンパク質は、DNAレベルで、
例えば、融合体をコードする核酸分子を構築し、この分子で宿主細胞を形質転換
し、細胞を誘導して融合タンパク質を発現させ、そして細胞培養物から融合タン
パク質を回収することにより、産生されることが好ましい。あるいは、融合タン
パク質は、公知の方法による遺伝子発現の後に産生され得る。
新規のB．burgdorferiポリペプチドはまた、組換えにより産生され得るかまた
は化学的に合成され得る、より大きな多量体分子の一部であり得る。このような
多量体はまた、アミノ酸以外の部分（脂質および炭水化物を含む）に融合または
カップリングされるポリペプチドを含み得る。
好ましくは、多量体タンパク質は、同じ分子内で、ランダムにまたはそれらの
間にスペーサー（アミノ酸または他のもの）を有して繰り返される複数のＴまた
はＢ細胞エピトープまたはそれらの組合せからなる。
本発明の最も好ましい実施態様では、免疫原性B．burgdorferiポリペプチドで
もある、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドは、他の免疫原性B．burgd
orferiポリペプチドも含む多成分ワクチン中に組み込まれる。このような多成分
ワクチンは、種々の免疫原性B．burgdorferiポリペプチドに対する抗体を惹起す
るその能力のおかげで、広範な異なるB．burgdorferi単離株（たとえ１つ以上の
Ospタンパク質を発現しないかもしれない単離株であっても）により引き起こさ
れるようなライム病に対して防御するに有効である。
多成分ワクチンは、新規のB．burgdorferiポリペプチドを、種々の成分が共有
結合している多量体分子の一部として含み得る。あるいは、これは、複数の個々
の成分を含み得る。例えば、２つ以上の新規のB．burgdorferiポリペプチドを含
むか、または１つの新規のB．burgdorferiポリペプチドおよび１つの以前に同定
されたB．burgdorferiポリペプチドを含む多成分ワクチンが調製され得、ここで
、各ポリペプチドは、独立した細胞培養物から発現および精製され、そしてポリ
ペプチドは、処方の前または間に組み合わされる。
あるいは、多成分ワクチンは、ヘテロ二量体または四量体から調製され得る。
ここで、ポリペプチドは、免疫グロブリン鎖またはその部分に融合されている。
このようなワクチンは、例えば、免疫グロブリン重鎖に融合したP35ポリペプチ
ド、および免疫グロブリン軽鎖に融合したOspAポリペプチドを含み得、そして重
鎖融合体をコードするDNAおよび軽鎖融合体をコードするDNAで宿主細胞を形質転
換することにより産生され得る。当業者は、選択される宿主細胞が、２つの鎖を
適切にアセンブリし得るべきであることを理解する。あるいは、重鎖および軽鎖
融合体は、別々の細胞株から産生され、そして精製後に会合され得る。
特定の成分および各成分の相対的割合を含むことの望ましさは、本明細書中に
開示されるアッセイシステムを使用することにより、または当業者に公知の他の
システムを使用することにより決定され得る。最も好ましくは、多成分ワクチン
は、免疫原性B．burgdorferiポリペプチド（本発明の新規のB．burgdorferiポリ
ペプチドを含む）の多数のＴ細胞およびＢ細胞エピトープを含む。
本発明はまた、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドが、単独または他
の免疫原性B．burgdorferiポリペプチドとともにのいずれかで、動物に、それら
の安定性および／または免疫原性を増強するために、リポソーム送達システムを
介して投与され得ることも意図する。リポソームを介する新規のB．burgdorferi
ポリペプチドの送達は、特に有利であり得る。なぜなら、リポソームは処置され
る動物において貧食細胞によりインターナライズされ得るからである。そのよう
な細胞は、リポソームの取り込みに際して、リポソーム膜を消化し、そして次い
で強い免疫応答を惹起するために必要とされる他の分子とともに、ポリペプチド
を免疫系に提示する。
リポソームシステムは、任意の種々の、単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞、また
は安定な複ラメラ（plurilamellar）小胞であり得、そして当業者に周知の方法
に従って（例えば、米国特許第5,169,637号、同第4,762,915号、同第5,000,958
号、または同第5,185,154号の教示に従って）調製および投与され得る。さらに
、それらのリポソームへの結合を増強するために、本発明の新規のB．burgdorfe
riポリペプチドおよび他の選択されるB．burgdorferiポリペプチドを、リポタン
パク質として発現することが所望され得る。
任意の本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドは、薬学的に受容可能な塩
の形態で使用され得る。本発明のポリペプチドと塩を形成し得る適切な酸および
塩基は当業者に周知であり、そして無機および有機の酸および塩基を含む。
本発明に従って、発明者らは、治療有効量の新規のB．burgdorferiポリペプチ
ド、または新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む融合タンパク質もしくは多
量体タンパク質で、B．burgdorferi感染の重篤度を、いくらかの期間、防止また
は低減するに十分な方法で、動物を処置する工程を包含する方法を記載する。そ
のような方法における使用のために好ましいポリペプチドは、防御エピトープを
含むポリペプチドである。そのような防御エピトープは、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ
細胞エピトープ、またはそれらの組み合わせであり得る。
本発明の別の実施態様に従って、発明者らは、治療有効量の新規のB．burgdor
feriポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを含む融合タンパク質もしく
は多量体タンパク質を含む多成分ワクチンで、B．burgdorferi感染の重篤度を、
いくらかの期間、防止または低減するのに十分な方法で、動物を処置する工程を
包含する方法を記載する。再び、そのような方法における使用のために好ましい
ポリペプチド、融合タンパク質、および多量体タンパク質は、防御エピトープを
含むものであり、防御エピトープは、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、ま
たはそれらの組み合わせであり得る。
これらの組成物および方法における使用のために最も好ましいポリペプチド、
融合タンパク質、および多量体タンパク質は、強力なＴ細胞およびＢ細胞両方の
エピトープを含むものである。理論に結びつけられることなしに、発明者らは、
これが、B．burgdorferi感染を中和するのに有効な高力価抗体を刺激するための
最良の方法であると考える。そのような好ましいポリペプチドは、Ｂ細胞エピト
ープ（単数または複数）を認識する表面免疫グロブリンを発現するＢ細胞により
インターナライズされる。次いで、Ｂ細胞は抗原をプロセシングし、そしてそれ
をＴ細胞に提示する。Ｔ細胞はＴ細胞エピトープ（単数または複数）を認識し、
そして増殖することおよびリンホカインを産生することにより応答する。このリ
ンホカインは、次いでＢ細胞を抗体産生形質細胞に分化させる。従って、このシ
ステムにおいて、閉鎖自己触媒性回路が存在し、これはＢ細胞およびＴ細胞の両
方の応答の増幅を生じ、これは最終的に、新規のB．burgdorferiポリペプチドに
対する高力価抗体を含む強い免疫応答の産生を導く。
当業者はまた、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドを、２型ヘルパー
Ｔ細胞（TH2）（これは、Ｂ細胞が抗体応答を生成することを補助する）の産生
を援助する形態で投与することが有利であり得ることを理解する。強力なＢ細胞
エピトープであるエピトープを投与することに加えて、TH2細胞の誘導はまた、
例えば、特定の用量で、または特定のアジュバントおよび免疫調節薬（例えば、
インターロイキン４）とともに投与することによる、ポリペプチドの投与の様式
により援助され得る。
本発明の好ましいポリペプチドを調製するために、１つの実施態様において、
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドの重複するフラグメントが構築され
る。Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドは、種々の方法で、例えば、（1）ポ
リペプチドに対するポリクローナル抗血清から防御抗体を除去するそれらの能力
、または（２）B．burgdorferi感染の重篤度を防御または低減するに有効な免疫
応答を惹起するそれらの能力により、同定され得る。
あるいは、ポリペプチドは、モノクローナル抗体を産生するために使用され得
、これらは、未処置の動物を免疫化するために使用された場合にB．burgdorferi
感染に対する防御を与えるそれらの能力についてスクリーニングされる。一旦所
定のモノクローナル抗体が防御を与えることが見出されると、次いで、その抗体
により認識される特定のエピトープが同定され得る。
Ｔ細胞エピトープの認識はMHC拘束性であるので、Ｔ細胞エピトープを含むポ
リペプチドは、種々のHLA型のヒトから、C3H/Heマウスのリンパ節、脾臓、もし
くは末梢血リンパ球から、または家畜から生成されるＴ細胞クローンによる増殖
および／またはサイトカイン産生を刺激するそれらの能力についてそれらを試験
することにより、インビトロにおいて同定され得る。異なるクラスII抗原を有す
る個体により認識される複数のＴ細胞エピトープを含む組成物は、広範な患者に
おけるライム病の予防および処置のために有用である。
本発明の好ましい実施態様において、Ｂ細胞エピトープを含む新規のB．burgd
orferiポリペプチドは、強力なＴ細胞エピトープを含む１つ以上の他の免疫原性
B．burgdorferiポリペプチドに融合される。強力なＴ細胞およびＢ細胞の両方の
エピトープを有する融合タンパク質は、B．burgdorferiでの感染を中和するのに
有効な高力価抗体応答の惹起に関与し得る。
強力なＴ細胞エピトープはまた、非B．burgdorferi分子により提供され得る。
例えば、強力なＴ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（HBcAg）にお
いて観察されている。さらに、これらのセグメントの１つの、Ｂ型肝炎ウイルス
の表面抗原（これは、Ｔ細胞によって弱く認識される）のセグメントへの連結は
、抗HBV表面抗原応答の顕著な増幅を生じることが示された（D.R．Milichら、「
Antibody Production To The Nucleocapsid And Envelope Of The Hepatitis B
Virus Primed By A Single Synthetic T Cell Site」,Nature，329，547-49頁（
1987)）。
それゆえ、なお別の好ましい実施態様において、B．burgdorferiに対する高力
価抗体応答を惹起し得る融合タンパク質を産生するために、新規のB．burgdorfe
riポリペプチドのＢ細胞エピトープはHBcAGのセグメント、または強力なＴ細胞
エピトープを含む他の抗原に融合される。さらに、本発明の新規のB．burgdorfe
riポリペプチドを、これもまた広く認識されている強力な免疫原（例えば、破傷
風類毒素）に連結することは、特に有利であり得る。
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチド、ならびにそれらを含む融合タン
パク質および多量体タンパク質は、組換え手段、化学的手段、またはそれらの組
み合わせにより調製され得ることが、当業者によって容易に理解される。
例えば、ポリペプチドは、本明細書中に含まれる配列表に記載のB．burgdofer
i N40株のDNA配列を使用して、組換え手段により生成され得る。ポリペプチドの
血清型改変体をコードするDNAは、例えば、PCRおよび本明細書中に開示される配
列に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、同様にクローン化され
得る。
これに関して、本発明の方法および組成物において有用である広範な異なるエ
ピトープを得るために、25015株、およびN40株とは抗原性的に異なることが知ら
れているB．burgdorferiの他の株由来の新規のB．burgdorferiポリペプチドをコ
ードする遺伝子を単離することが、特に所望され得る。例えば、B．burgdorferi
25015株のOspA遺伝子は、抗OspA抗体（これは、N40株でのその後の感染に対し
て防御する）が25015株での感染に対して防御することに無効であるようである
程度に、B．burgdorferi N40株のOspA遺伝子とは異なることが知られている。
新規のB．burgdorferiポリペプチドをコードする遺伝子に由来するオリゴヌク
レオチドプライマーおよびその他の核酸プローブはまた、B．burgdorferiおよび
本発明のDNA配列に相同なDNA配列の領域を含み得る関連するスピロヘータから、
他の関連する表面タンパク質を単離およびクローン化するために使用され得る。
さらに、本発明のDNA配列はまた、感染が疑われるサンプルにおけるB．burgdorf
eriの存在を検出するためのPCR反応において使用され得る。
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドが組換えで産生される場合、それ
らは単細胞宿主において発現され得る。当業者に周知であるように、宿主におい
て外来DNA配列の高い発現レベルを得るために、配列は、一般に、選択される宿
主において機能的である転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結される。
好ましくは、発現制御配列、および目的の遺伝子は、さらに選択マーカーをさら
に含む発現ベクター中に含まれる。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、シグナル配列をコードしても
よく、またはコードしなくてもよい。発現宿主が真核生物である場合、成熟タン
パク質が真核生物宿主から分泌されるようにシグナル配列がコードされることが
一般に好ましい。
アミノ末端メチオニンは、本発明の発現されるポリペプチドに存在してもよく
、または存在しなくてもよい。末端メチオニンが発現宿主により切断されない場
合、所望であれば、それは標準的な技術により化学的に除去され得る。
広範な種々の発現宿主／ベクターの組み合わせが、本発明のDNA配列の発現に
おいて用いられ得る。真核生物宿主のために有用な発現ベクターとしては、例え
ば、SV40、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイト
メガロウイルス、およびレトロウイルス（レンチウイルスを含む）由来の発現制
御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主のために有用な発現ベクターとし
ては、例えば、E．coliに由来するような細菌プラスミド（pBluescript，pGEX-2
T．pUCベクター、col EL、pCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体、pET-15を
含む）、より広い宿主域のプラスミド（例えば、RP4）、ファージDNA（例えば、
ファージλの多数の誘導体（例えば、λGT10およびλGT11）および他のファージ
）が挙げられる。酵母細胞のために有用なベクターとしては、２μプラスミドお
よびその誘導体が挙げられる。昆虫細胞のために有用なベクターとしては、pVL9
41が挙げられる。
さらに、任意の広範な種々の発現制御配列−−それに作動可能に連結された場
合にDNA配列の発現を制御する配列−−は、本発明のDNA配列を発現させるために
これらのベクターにおいて使用され得る。そのような有用な発現制御配列として
は、上記の発現ベクターの構造遺伝子に伴われる発現制御配列が挙げられる。有
用な発現制御配列の例としては、例えば、SV40またはアデノウイルスの初期およ
び後期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、T3およびT7プロモーター
、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質
の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモータ
ー、酸性ホスファターゼ（例えば、Pho5）のプロモーター、酵母α接合系のプロ
モーター、ならびに原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルス
の遺
伝子の発現を制御することが知られている他の構成性および誘導性プロモーター
配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが挙げられる。
好ましい実施態様において、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドをコ
ードするDNA配列は、発現ベクターλZAP II（Stratagene，La Jolla，CA）中に
クローン化され、ここでlacプロモーターからの発現は、IPTGにより誘導され得
る。
別の好ましい実施態様において、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチド
をコードするDNAは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質として
のポリペプチドの高レベル発現を可能にする発現ベクター中にインフレームで挿
入される。従って、そのような融合タンパク質は、ベクター配列によりコードさ
れるアミノ酸および新規のB．burgdorferiポリペプチドのアミノ酸を含む。
広範な種々の単細胞宿主細胞は、本発明のDNA配列を発現することにおいて有
用である。これらの宿主としては、E．coli株、Pseudomonas、Bacillus、Strept
omyces、真菌、酵母、昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda(SF9)）、動物
細胞（例えば、CHOおよびマウス細胞、アフリカミドリザル細胞（例えば、COS 1
、COS 7、BSC 1、BSC 40、およびBMT 10）、ならびにヒト細胞）、ならびに植物
細胞のような、周知の真核生物および原核生物の宿主が挙げられ得る。
全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明のDNA配列を発現するように等
しく良好に機能するわけではないことが、当然理解されるべきである。また、全
ての宿主が同じ発現系について等しく良好に機能するわけではない。しかし、当
業者は、過度な実験なしに、そして本発明の範囲から逸脱することなしに、これ
らのベクター、発現制御配列、および宿主の間の選択をなし得る。例えば、ベク
ターの選択において、宿主は考慮されなければならない。なぜなら、ベクターは
その中で複製されなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピ
ー数を制御する能力、組み込みを制御する能力（あれば）、およびベクターによ
りコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質または他の選択マーカ
ー）の発現もまた考慮されるべきである。
発現制御配列の選択において、種々の因子もまた考慮されるべきである。これ
らとしては、例えば、プロモーター配列の相対的強度、その制御可能性、および
本発明のDNA配列とのその適合性（特に、潜在的な二次構造に関して）が挙げら
れる。単細胞宿主は、選択されるベクターとのそれらの適合性、本発明のDNA配
列によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特性、ポリペプチドを適正に折
り畳むそれらの能力、それらの発酵または培養要求性、および本発明のDNA配列
によりコードされる産物のそれらからの精製の容易さの考慮により選択されるべ
きである。
これらのパラメーター内で、当業者は、発酵でまたは他の大規模培養で本発明
のDNA配列を発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを選択
し得る。
本発明のDNA配列によりコードされる新規のB．burgdorferiポリペプチドを含
む分子は、発酵または細胞培養物から単離され得、そして以下を含む任意の種々
の従来の方法を使用して精製され得る：HPLC、FPLCなどを使用する液体クロマト
グラフィー（例えば、順相または逆相）；アフィニティークロマトグラフィー（
例えば、無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いる）；サイズ排除クロマ
トグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；など。
当業者は、本発明の範囲から逸脱することなしに、最も適切な単離および精製の
技術を選択し得る。
さらに、新規のB．burgdorferiポリペプチドは、任意のいくつかの化学的技術
により生成され得る。例えば、それらは、R.B．Merrifield，"Solid Phase Pept
ide Synthesis．I．The Synthesis Of A Tetrapeptide"，J．Am．Chem．Soc.，8
3，2149-54頁(1963)によりもともと記載された固相合成技術を使用して調製され
得るか、またはそれらは、溶液中での合成により調製され得る。ペプチド合成技
術の要約は、E．GrossおよびH.J．Meinhofer，4 The Peptides:Analysis，Synth
esis，Biology; Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis，Joh
n Wiley & Sons，(1981)、およびM．Bodanszky,Principles Of Peptide Synthes
is，Springer-Verlag(1984)において見出され得る。
代表的には、これらの合成方法は、成長するペプチド鎖への１つ以上のアミノ
酸残基の連続的な付加を包含する。しばしばペプチドカップリング剤は、この反
応を容易にするために用いられる。本明細書中に記載される使用に適したペプチ
ドのカップリング剤の詳述については、M．Bodansky（前出）を参照のこと。通
常、第一のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な
、選択的に除去可能な保護基によって保護される。異なる保護基が、反応性の側
鎖基（例えば、リジン）を含むアミノ酸について利用される。ペプチド合成の分
野で公知であり、そしてそこで従来の略語により認識される種々の保護基は、T
．Greene,Protective Groups In Organic Synthesis．Academic Press (1981)に
見出され得る。
本発明の別の実施態様によれば、新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する
抗体が生成される。このような抗体は、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプ
チドと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子またはその部分である。本発
明の抗体は、新規のB．burgdorferiポリペプチドを含む融合タンパク質および多
量体タンパク質と免疫学的に反応性である抗体を含むことが理解されるべきであ
る。
新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する抗体は、B．burgdorferiでの哺乳
動物宿主の感染を含む種々の手段により、または本発明の新規のB．burgdorferi
ポリペプチドでの哺乳動物宿主の免疫化により生成され得る。このような抗体は
、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、それらはモノクローナルであ
ることが好ましい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生する方法は
、当業者に周知である。このような方法の総説については、Antibodies，A Labo
ratory Manual，前出、およびD．E．Yeltonら、Ann．Rev．of Biochem.，50、65
7-80頁(1981)を参照のこと。本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドとの免
疫学的反応性の決定は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法（免疫ブロット
アッセイおよびELISAを含む）によってなされ得る。
本発明の抗体はまた、異なる種（例えば、マウスおよびヒト）由来の免疫グロ
ブリン配列から、または同一の種由来の免疫グロブリン軽鎖および重鎖の配列の
部分から形成されるハイブリッド分子であり得る。本発明の抗体は、以下を含む
複数の結合特異性を有する分子（例えば、当該分野で公知の多くの技術のいずれ
かによって調製される二機能抗体）であり得る：ハイブリドハイブリドーマの産
生；ジスルフィド交換；化学架橋；２つのモノクローナル抗体間へのペプチドリ
ンカーの付加；２セットの免疫グロブリン重鎖および軽鎖の特定の細胞株への導
入など。
本発明の抗体はまた、当該分野で公知の任意のいくつかの方法によって産生さ
れるヒトモノクローナル抗体であり得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、
不死化ヒト細胞によって、SCID-huマウスまたは「ヒト」抗体を産生し得る他の
非ヒト動物によって、クローン化ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現によって、フ
ァージディスプレイによって、または当該分野で公知の他の任意の方法によって
産生され得る。
さらに、本発明の抗体を毒素（例えば、ジフテリア、シュードモナス外毒素、
リシンＡ鎖、ゲロニンなど）、または抗生物質（例えば、ペニシリン、テトラサ
イクリン、およびクロラムフェニコール）に結合させることは有利であり得る。
まとめて、本発明の教示を提供された当業者は、本発明の抗体の生物学的特性
を変更するために用いられ得る種々の利用可能な方法（所定の抗体分子の安定性
または半減期、免疫原性、毒性、親和性または収量を増大または減少させる方法
を含む）を有するか、またはその方法を特定の適用のためにより適切にし得る任
意の他の様式でそれを変更するために用いられ得る種々の利用可能な方法を有す
る。
当業者は、新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する抗体が、ライム病およ
びB．burgdorferi感染に対する治療的および予防的組成物ならびに方法における
有用性を有し得ることを理解する。例えば、感染させたマダニにおけるB．burgd
orferiのレベルは、それらに本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドで免疫
化した動物の血を吸血させることによって減少し得る。
本発明の抗体はまた、種々の他の使用を有する。例えば、それらは、B．burgd
orferiDNAから構築されたライブラリーにおいてか、またはタンパク質が存在し
得る他のサンプルから、B．burgdorferiポリペプチドの発現をスクリーニングす
るための試薬として有用である。さらに、それらの特異的結合親和性のために、
本発明の抗体がまた、所定のサンプルからポリペプチドを精製または除去するた
めに、ポリペプチド上の特定のエピトープをブロックまたは結合するために、お
よび種々の分子（例えば、毒素）をB．burgdorferiの表面に指向させるために有
用である。
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドおよび抗体を、ライム病に対する
防御を与えるそれらの能力、またはB．burgdorferi感染の重篤度を減少させるそ
れらの能力についてスクリーニングするために、C3H/Heマウスが動物モデルとし
て好ましい。もちろん、B．burgdorferiでの感染に感受性である任意の動物が有
用であり得るが、C3H/Heマウスは、B．burgdorferi感染に対して感受性であるば
かりでなく、ヒトにおけるライム病に驚くほど類似する疾患の臨床症状にもまた
罹患する。従って、特定のポリペプチドまたは抗体をC3H/Heマウスに投与するこ
とによって、当業者は、過度の実験をせずにポリペプチドまたは抗体が本明細書
中で請求される方法および組成物において有用であるか否かを決定し得る。
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドまたは抗体の動物への投与は、本
明細書中で開示される方法のいずれか、または種々の他の標準的な手順により達
成され得る。このような技術の詳細な議論については、Antibodies，A Laborato
ry Manual,前出を参照のこと。好ましくは、ポリペプチドが用いられる場合、薬
学的に受容可能なアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバ
ント、RIBI（ムラミルジペプチド）、またはISCOM（免疫刺激複合体））ととも
に投与される。このようなアジュバントは、局所的な沈着物中にポリペプチドを
隔離することによって迅速な分散からポリペプチドを保護し得るか、またはそれ
らはマクロファージおよび免疫系の他の成分について走化性の因子を分泌する宿
主を刺激する基質を含み得る。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免
疫化スケジュールは、数週間にわたるポリペプチドの２回以上の投与を含む。
一旦、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドまたは抗体が、スクリーニ
ングプロセスにおいて有効であることが決定されると、次いでそれらは薬学的組
成物および方法において治療有効量で、種々の動物において天然に存在し得るラ
イム病を処置または防止するために用いられ得る。
本発明の薬学的組成物は、種々の通常の貯蔵形態にあり得る。これらには、例
えば、固体、半固体、および液体投与量形態（例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体
溶液、または懸濁液、リポソーム、カプセル、坐剤、注射可能溶液および注入可
能溶液）が含まれる。好ましい形態は、投与および予防適用の意図される態様に
依存する。
このような投薬形態は、当業者に公知の薬学的に受容可能なキャリアおよびア
ジュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントには、例えば、RI
BI、ISCOM、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、
血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝液物質（例えば、リン酸
塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセ
リド混合物、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナ
トリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、、三ケイ酸マグネシウ
ム(magnesium trisilicate)、ポリビニルピロリドン、セルロースベース物質、
およびポリエチレングリコールが含まれる。局所用の、またはゲルベース形態の
アジュバントは、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリ
コール、および木蝋の(wood wax)アルコールからなる群より選択され得る。
本発明のワクチンおよび組成物はまた、他の成分を含み得るか、またはそれら
の免疫学的特徴を増強するため、または患者におけるそれらの耐性を改善するた
めの調製の間、他の処置に供され得る。
本発明の抗体を含む組成物は、他の受動的免疫治療に用いられ、当業者に周知
のものに類似する種々の投薬形態および養生法により投与され得る。一般に、新
規のB．burgdorferiポリペプチドは、他の薬学的に重要なポリペプチド（例えば
、肝炎に対するワクチン）のために用いられるものに類似の方法および組成物を
用いて処方され、そして患者に投与され得る。
任意の薬学的に受容可能な投薬経路（非経口的、静脈内、筋肉内、病巣内、ま
たは皮下注射を含む）がポリペプチドまたは抗体組成物を投与するために用いら
れ得る。例えば、組成物が、それらを含む薬学的に受容可能な投薬形態において
患者に投与され得る。それらには、大量瞬時投与として静脈内に、または数時間
、数日間、数週間、もしくは数カ月の期間にわたる連続的注入により、筋肉内（
脊椎傍および間接周囲を含む）に、皮下に、皮内に、関節内に、滑液内に、くも
膜下腔内に、病巣内に、骨膜に、あるいは経口もしくは局所経路によって患者に
投与され得る。好ましくは、本発明の組成物は単位用量の形態であり、そして通
常
患者に筋肉内に投与される。
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドまたは抗体は、一度に、または一
連の処置にわたって患者に投与され得る。最も有効な投与および投与養生法の態
様は、免疫原性のレベル、処置に用いられた特定の組成物および/またはアジュ
バント、予想される感染の重篤度および経過、以前の治療、患者の健康状態およ
び免疫化に対する応答、ならびに処置をしている医者の判断に依存する。例えば
、免疫コンピテントな患者において、ポリペプチドがより高度に免疫原性である
ほど、投薬量および必要な免疫化の回数が低くなる。同様に、ポリペプチドがア
ジュバントとともに投与される場合には、投薬量および必要な処置時間は低減さ
れる。一般に、投薬量は、精製ポリペプチドの10μｇ〜100mgからなり、そして
好ましくは、投薬量は10〜1000μｇからなる。一般に、抗体についての投薬量は
、0.5mg〜3.0gである。
本発明の好ましい実施態様において、新規のB．burgdorferiポリペプチドが、
その免疫原性を増大するためにアジュバントともに投与される。有用なアジュバ
ントには、RIBI、およびISCOM、単純な金属塩（例えば、水酸化アルミニウム）
、およびオイルベースアジュバント（例えば、完全および不完全フロイントアジ
ュバント）が含まれる。オイルベースのアジュバントが用いられる場合、ポリペ
プチドは、通常、アジュバントとの乳濁液において投与される。
さらに別の好ましい実施態様において、新規のB．burgdorferiポリペプチドを
含むタンパク質を発現するE.coliが、ヒト以外の動物にB．burgdorferi感染の重
篤度を減少または低減するために経口投与される。例えば、新規のB．burgdorfe
riポリペプチドを、単独でまたは融合タンパク質またはキメラタンパク質の形態
で発現する細菌の口当たりの良い養生法が、野生のマウスまたはシカ、あるいは
家畜動物により消費されるための動物食物とともに投与され得る。このような細
菌の摂取は、体液性および細胞媒介性成分の両方を含む免疫応答を誘導し得る。
J.C．Sadoffら、「Oral Salmonella Typhimurium Vaccine Expressing Circumsp
orozoite Protein Protects Against Malaria」Science，240，336〜38頁(1988)
およびK.S．Kimら、「Immunization Of Chickens With Live Escherichia coli
Expressing Eimeria acervulina Merozoite Recombinant Antigen Induces Pa
rtial Protection Against Coccidiosis」Inf．Immun.，57，2434〜40頁(1989)
を参照のこと。実際、OspAを発現する細菌での経口ワクチン接種は、有効である
ことが示されている。M．Dunneら、「Oral Vaccination Against Lyme Disease
Using Salmonella Expressing OspA」、Inf．and Immun.，63:1611(1995); E.Fi
krigら、「Protection of Mice From Lyme Borreliosis By Oral Vaccination W
ith Escherichia coli Expressing OspA」J．Infec．Dis.，164:1224(1991)。さ
らに、このような動物のマダニの吸血におけるB．burgdorferi感染のレベルは、
低減されるかまたは排除され、従って次の動物への伝染を阻害する。
なお別の実施態様によれば、本発明の抗体および本発明の新規のB．burgdorfe
riポリペプチド、ならびにこれらをコードするDNA配列は、B．burgdorferiでの
感染を検出するための診断因子として有用である。なぜなら、ポリペプチドは、
B．burgdorferiで感染されたヒトを含む動物において産生される抗体分子に結合
し得、そしてこの抗体は、B．burgdorferiまたはその抗原に結合し得るからであ
る。
このような診断薬は、使用のための説明書および他の適切な試薬、好ましくは
ポリペプチドまたは抗体がいつ結合されるかを検出するための手段をもまた含み
得るキット中に含められ得る。例えば、ポリペプチドまたは抗体は、抗体に結合
された場合にポリペプチドの検出を可能にするか、またはB．burgdorferiまたは
その抗原に結合される場合に抗体の検出を可能にする検出手段で標識され得る。
検出手段は、蛍光標識因子（例えば、フルオレセインイソシアネート(FIC)、
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）および酵素(例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ(HRP)、グルコースオキシダーゼなど)、放射性エレメント(
例えば、ガンマ線放射を産生する125Iまたは51Cr)、または試験溶液中に存在す
る電子と衝突した場合にガンマ線を産生するポジトロンを放射する放射性エレメ
ント（例えば、11C、15O、または13N）であり得る。結合はまた、他の方法によ
って（例えば、アビジン-ビオチン複合体を介して）検出され得る。
検出手段の連結は、当該分野で周知である。例えば、ハイブリドーマから産生
されるモノクローナル抗体分子は、培養培地への放射性同位体含有アミノ酸の組
み込みにより代謝的に標識され得、またはポリペプチドが活性化官能基により検
出手段に結合体化またはカップリングされ得る。
本発明の診断キットはまた、体液サンプル（例えば、血清、結晶、または尿）
中のB．burgdorferiまたは抗B．burgdorferi抗体の量の存在を検出するために使
用され得る。従って、好ましい実施態様において、新規のB．burgdorferiポリペ
プチドまたは本発明の抗体が、固体支持体に、代表的には水性培地からの吸着に
より結合される。有用な固体マトリックスは、当該分野で周知であり、そして架
橋デキストラン；アガロース；ポリスチレン；ポリビニルクロリド；架橋ポリア
クリルアミド；ニトロセルロースまたはナイロンベースの物質；チューブ；マイ
クロタイタープレートのプレートまたはウェルを含む。本発明のポリペプチドま
たは抗体は、診断因子として溶液形態でまたは実質的に乾燥粉末として（例えば
、凍結乾燥形態で）用いられ得る。
これらのポリペプチドに対する新規のB．burgdorferiポリペプチドおよび抗体
は、B．burgdorferi全体よりもずっと特異的な診断試薬を提供し、従って偽陽性
および偽陰性の結果のような落とし穴を軽減し得る。
特に、当業者は、感染させた宿主中に（そして培養B．burgdorferiではなく）
選択的に発現される本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチド、およびポリペ
プチドに対する抗体が、抗原としての培養されたスピロヘータの溶解物を用いる
診断方法によっては検出不可能なサンプル中の抗原および抗体の検出を可能にす
る。
当業者は、鞭毛関連タンパク質を含む他のB．burgdorferiタンパク質に由来す
るエピトープおよびそのようなエピトープに対する抗体を利用することはまた、
検出試薬の調製において有利であり得ることを理解する。P35およびP37に対する
抗体は、B．burgdorferiの感染過程の初期に生じる傾向があるが、P21およびOsp
Fに対する抗体は、より後期に現れる傾向がある。従って、ライム病のより後期
において生じる抗体を惹起する他のB．burgdorferiタンパク質由来のエピトープ
と組み合わせてP35またはP37エピトープを使用することは特に有利であり得る。
異なった時間で現れる抗体と反応性の複数のエピトープを含む診断用試薬は、感
染過程の全体にわたって抗B．burgdorferi抗体の存在を検出するため、およびす
べての段階でライム病を診断するために有用である。
本発明のポリペプチドおよび抗体、ならびにそれらを含む組成物および方法は
また、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドとアミノ酸配列または立体配
置的な類似性を共有する表面タンパク質を含み得るスピロヘータにより引き起こ
される他の感染の検出、予防、および処置のために有用であり得る。これらの他
のスピロヘータは、Borrelia HermsiiおよびBorrelia Recurientis、Leptospira
、ならびにTreponemaを含む。
本発明の別の実施態様によれば、発明者らは、宿主の感染の間は発現されるが
細菌のインビトロでの培養の間には発現されない抗原性タンパク質をコードする
細菌遺伝子を同定するための方法を記載する。この方法は、以下の工程：
(a)細菌についての発現ライブラリーを構築する工程；
(b)細菌に感染した動物由来の抗血清でライブラリーをスクリーニングする工
程；
(c)生存不能細菌またはその成分で免疫化された動物由来の抗血清でライブラ
リーをスクリーニングする工程；および
(d)第１の抗血清には反応するが第２の抗血清には反応しないクローンを同定
する工程、
を含む。
本発明の方法における使用のための発現ライブラリーが、当該分野で公知の任
意の技術を用いて構築され得ることは、当業者に容易に明らかである。
本発明の方法における使用のための抗血清を生成するために、免疫応答を生じ
得る任意の動物が有用である。抗血清は、当業者に周知の広範な種々の技術のい
ずれかにより生成され得る。
本明細書中に使用されるように、細菌は、宿主内で増殖し得る、任意の病原性
または非病原性の細菌を含む。好ましい実施態様において、細菌は病原性細菌で
ある。
本明細書中で使用されるように、宿主は、細菌によって感染され得る任意の生
物（植物宿主および動物宿主を含む）である。好ましい実施態様において、宿主
は哺乳動物である。
本明細書中で使用されるように、生存不能細菌は、タンパク質を合成し得ない
細菌である。好ましい実施態様において、細菌は加熱殺菌された細菌である。し
かし、本発明の方法によれば、細菌は、当該分野で公知の任意の方法により生存
不能にされ得る。
本明細書中に使用されるように、生存不能な細菌の成分は、溶解産物、ホモジ
ネート、またはその細胞画分（例えば、細胞膜含有画分）を含む。
抗血清に反応するクローンについて発現ライブラリーをスクリーニングするた
めに、当業者に公知の任意の技術が有用である。好ましい実施態様において、抗
血清の結合は、検出手段に結合した二次抗体で検出される。当該分野で公知の広
範な種々の任意の検出手段が有用であることを、当業者は容易に理解する。有用
な検出手段の例は、上記に示される。
本発明がより良く理解され得るように、以下の実施例を示す。これらの実施例
は、例示の目的のためのみであり、そしていかなる方法でも本発明の範囲を限定
するとは解釈されない。
実施例Ｉ−B ．burgdorferi発現ライブラリーの構築およびスクリーニング
Ａ．発現ライブラリーの構築
発明者らは、Stratagene(La Jolla，CA)によるλZAP II中に構築されたB．bur
gdorferiゲノムDNA発現ライブラリーから開始した（T.T．Lamら、Inf．Immun.，
62，290-298頁(1994)）。手短に言えば、発明者らは、B．burgdorferi株N40を改
変Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)II培地において32℃で７日間増殖させ、16,00Or
pmで30分間の遠心分離により収集し、そしてSDSで溶菌した（A.G．Barbour,「Is
olation and Cultivation of Lyme Disease Spirochetes」,Yale J．Biol.Med.
，57，521-25頁(1984)）。次に、発明者らはこのスピロヘータからゲノムDNAを
単離し、そしてフェノール／クロロホルム抽出によりそれを精製した。
ライブラリーを構築するために、200μｇのDNAをランダムに剪断し、S1ヌクレ
アーゼで平滑末端化し、そしてEcoR1部位をEcoR1メチラーゼによりメチル化した
。次に、EcoR1リンカーをDNA分子の末端へ連結し、DNAをEcoR1で消化し、そして
フラグメントをショ糖勾配により精製した。１〜９kbのフラグメントを単離し、
そしてEcoR1消化したλZAP IIアームへ連結した。
発明者らは、ファージ感染のためのE．coli SURE細菌(Stratagene)を、以下の
ように調製した。発明者らは、0.2％マルトースおよび10mM硫酸マグネシウムを
補充したLB培地中へ単一コロニーを拾い、そして激しく振盪しながら30℃で一晩
培養した。次に、発明者らは、細胞を2000rpmで10分間遠心分離し、そして10mM
硫酸マグネシウム中へ再懸濁した。細胞を、バクテリオファージの感染のために
O.D.600=0.5へさらに希釈した。
Ｂ．抗B．burgdorferi抗血清の調製
発明者らは、発現ライブラリーを示差的にスクリーニングするための抗B．bur
gdorferi N40抗血清を、以下のように調製した。
１．免疫抗血清
発明者らは、「免疫化」マウス抗B．burgdorferi N40抗血清を、以下のように
調製した。発明者らは、５個体の３週齢雌性C3h/HeNCrマウスまたはJ(C3H)マウ
スの３〜５群に、完全フロイントアジュバント(CFA)中の107個の加熱殺菌（60℃
にて１時間）したB．burgdorferi N40の接種材料を皮下注射した。発明者らは、
加熱不活化した調製物でマウスを感染させることも、またはBSKII培地内に置い
た調製物からスピロヘータを培養することもできなかった。従って、このことは
全ての加熱不活化スピロヘータが死滅したことを確認する。発明者らは、不完全
フロイントアジュバント(IFA)中のB．burgdorferiの同じ投与量で２週目および
４週目にマウスに追加免疫した。最終免疫の２週間後で、発明者らは、マウスを
屠殺および採血し、そして血液を2000rpmで15分間遠心分離することにより抗B．
burgdorferi抗血清を分離した。
E.coliおよびファージのタンパク質を認識する血清中の抗体を除くために、発
明者らは、以下のようにE.coli／ファージ溶解産物(Stratagene)を用いて抗血清
を吸収した。発明者らは、溶解産物を0.05％のTween-20を有するTris緩衝化生理
食塩水(TBST)中に1:10で希釈した。次に、発明者らは、0.45μＭの孔径のニトロ
セルロースフィルター(Millipore，Bedford; MA)を、溶解産物中で、室温で30分
間インキュベートし、取り出し、そしてフィルターをWhatman濾紙(Whatman Inte
rnational Ltd.，Maidstone，England)上で風乾し、そしてTBSで３回（各５分間
）洗った。発明者らは、室温でフィルターをTBS中の１％ウシ血清アルブミン
(BSA)に１時間浸し、そしてTBSTで３回すすぐことによりこブロックした。次に
、発明者らは、マウス抗血清をTBSTで１：５に希釈し、これをフィルターととも
に、37℃で10分間振盪しながらインキュベートし、そしてフィルターを取り出し
、そして廃棄した。
２．感染抗血清
発明者らは、３匹のC3H/HeJマウスに104個のB．burgdorferi N40スピロヘータ
を皮内接種により注射した。発明者らは、抗原投与されたマウスの脾臓、膀胱、
および皮膚（耳パンチ）からスピロヘータを培養することにより、および炎症の
証拠についての関節および心臓の組織病理学的検査により、感染を証明した。発
明者らは、感染後の種々の時間において感染マウスから血清を採集した。
免疫抗血清および感染抗血清の両方は、全細胞溶解産物に対する高力価の抗B
．burgdorferi抗体を含んでいた。発明者らは、免疫化および感染したマウスの
血清中の抗体を、それぞれ、免疫ブロットにより1:15,000および1:10,000の希釈
で、ならびにELISAにより1:6400および1:3200の希釈で検出した。さらに、両抗
血清は、免疫ブロットにより多くのB．burgdorferi抗原を異なる強度で認識した
。
吸収後、発明者らは、抗血清を1:100の最終希釈に希釈し、そしてそれを製造
者の使用説明書に従って、λZAPライブラリー由来の発現タンパク質を含むニト
ロセルロースフィルターをスクリーニングするために使用した。
Ｃ．B ．burgdorferi N40ゲノム発現ライブラリーの示差的スクリーニング
ライブラリーをスクリーニングするために、発明者らは、picoBlue免疫スクリ
ーニングキット(Stratagene)を用いた。発明者らは、当該分野で周知の方法に従
って、細菌のローン(lawn)上に４×104プラーク形成単位の組換えファージをプ
レートし、10mM IPTGでタンパク質発現を誘導し、そしてタンパク質をニトロセ
ルロースフィルター上の二連のプラークリフトに転写した。
発明者らは、プラークリフトの１組を、加熱殺菌したスピロヘータで免疫化し
たマウス由来のプールされた血清（免疫血清）とともにインキュベートし、そし
て他の組を、９ケ月間感染させたマウス由来の血清（感染血清）とともにインキ
ュベートした。洗浄後、発明者らは、フィルターを1:5000希釈のアルカリホスフ
アターゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体(Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)
とともにインキュベートし、そして発色のためにニトロブルーテトラゾリウム(N
BT)(Stratagene)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)(Stratage
ne)を使用した。発明者らは、更なる研究のために、感染血清には反応するが免
疫血清には反応しないクローンを選択した。
実施例II−p21/k2 オペロンのクローン化
B．burgdorferi N40ゲノム発現ライブラリーの示差的スクリーニングは、実施
例Ｉに記載のように、感染マウス由来の血清と反応する172個のクローンおよび
免疫化マウス由来の血清と反応する169個のクローンを明らかにした。発明者ら
は、２つの血清と示差的に反応する３個のファージクローンを、別の回のスクリ
ーニングに供して同一の結果を得た。
発明者らは、製造者の使用説明書に従ったXL1-Blue E.coli細胞の感染およびR
408ヘルパーファージでのレスキュー(rescue)により、これらのクローンの一つ
（クローン１）からpBluescriptプラスミドを切り出した。回収されたプラスミ
ドを用いて、発明者らは、プラスミドの最初の配列を得るためにT3およびT7ユニ
バーサルプライマーを用いた。100〜300bpの最初の配列から、発明者らは、発明
者らが配列全体を得るまで、一度に100〜300bpの配列を延長するために使用する
新しいプライマーを作製した。
あるいは、発明者らは、Erase-A-Base System(Promega，Madison，WI)で（5'
平滑末端を生成するためにSmaIを用い、そして3'突出末端を生成するためにBstX
Iを用いて）クローン１のDNA挿入物内での欠失のネステッドセットを生成した。
次に、発明者らは、サブクローンをSequenase Kit(United States Biochemical
Corp.，Cleveland，OH)を用いて配列決定し、そしてMacVector(International B
iotechnology，Inc.，New Haven，CT)を用いて配列全体を再構築した。
発明者らは、Circumvent Thermal cycle Dideoxy DNA配列決定キット(New Eng
land Biolabs)を用いてプラスミド挿入物のヌクレオチド配列を決定した。変性
、アニーリング、および伸長のための条件は、それぞれ、94℃30秒間、55℃20秒
間、および72℃20秒間であった。
挿入物のDNA配列の分析は、発明者らが、配列番号１に示す配列を有する完全
なオープンリーディングフレームおよび部分的なオープンリーディングフレーム
を含むクローンを単離したことを明らかにした。発明者らは、Genetics Compute
r Group Program(University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，W
I)でのGenBank(1994年12月)の検索を行った。発明者らの検索は、発明者らが新
規の２シストロン性(bicistronic)のB．burgdorferiオペロンを単離したことを
明らかにした。発明者らは、完全なオープンリーディングフレームをp21と命名
し、そして部分的なオープンリーディングフレームをk2と命名した。発明者らは
、オペロン中の２つの遺伝子によりコードされる抗原を、それぞれ、P21およびK
2と命名した。
実施例III−p21/k2 オペロンの配列分析
配列番号１に示されるように、p21遺伝子は、オペロンの5'末端で、182アミノ
酸タンパク質（配列番号２）をコードし得る546ヌクレオチドのオープンリーデ
ィングフレームを含む。P21の推定アミノ酸配列は、切断および脂質化(lipidati
on)による翻訳後プロセシングのための代表的な原核生物シグナル配列を含み、
このことはこの遺伝子産物が約20.7kDaのリポタンパク質であることを示唆する
。P21は、B．burgdorferi OspEに対して71％のアミノ酸配列の同一性を有する（
図７）。
k2遺伝子についてのATG開始コドンは、p21遺伝子のTAG停止コドンの27ヌクレ
オチド下流に位置する。クローン１内のk2遺伝子は、最初の10アミノ末端アミノ
酸（配列番号３）をコードし得る、32ヌクレオチドの部分的なオープンリーディ
ングフレームを含む。しかし、配列番号３のK2配列の最後の２ヌクレオチドに基
づけば、11番目のアミノ酸はバリンでなければならない。従って、本明細書中に
使用されるように、K2ポリペプチドは、配列番号３の11アミノ酸配列を含むポリ
ペプチドである。K2のアミノ末端アミノ酸は、OspFのアミノ末端配列と64％相同
である。それ故、発明者らは、K2遺伝子によりコードされる全長タンパク質は、
全長OspFタンパク質に対して同様の相同性を有すると予想する。
配列-GGAG-(Shie-Dalgarno配列)を有する共通リボゾーム結合部位はp21 ATG開
始コドンの10bp上流に位置する。この翻訳開始配列のさらに上流は、「-10」
領域および「-35」領域として知られるプロモーターセグメントであり、それら
はE.coliおよび他のB．burgdorferi遺伝子において見出される配列と同様である
。（種々のB．burgdorferi遺伝子間のこれらの領域の比較については、図８を参
照のこと。）配列-GGAG-を有するさらなるリボゾーム結合部位は、k2遺伝子のAT
G開始コドンの11bp上流に位置する。これらの配列エレメントの配置は、p21およ
びk2の両遺伝子が単一のプロモーターにより制御されることを示唆する。OspEお
よびOspFに対するP21およびK2の相同性、ならびに２シストロン性のオペロンに
おけるこれらの配置は、組換え事象が、最近の進化の時点でこれらの遺伝子間で
生じた可能性が最も高いことを示唆する。
OspA、OspB、OspD、OspE、およびOspFのように、p21遺伝子によってコードさ
れるタンパク質は、表面リポタンパク質であるようである。配列番号２に示され
るように、このタンパク質は、５アミノ酸の塩基性Ｎ末端ペプチドから始まり、
代表的な原核生物リポタンパク質前駆体において見出されるリーダーペプチド（
M.E．Brandtら、前出、およびC.H．WuおよびM．Tokunaga，「Biogenesis of Lip
oproteins in Bacteria」，Current Topics in Microbiology and Immunology，
125，127-157頁(1986)）に対応する約20アミノ酸のアミノ末端疎水性ドメインが
続く。
疎水性ドメインのカルボキシル末端は、おそらくB．burgdorferiのシグナルペ
プチダーゼにより認識される切断部位を含む。OspFにおけるように、P21におい
て、潜在的な切断部位は、Ser17とCys18との間に位置する。
シグナルペプチダーゼIIにより認識および切断される代表的な細菌リポタンパ
ク質前駆体の共通配列は、通常２つの小さな中性アミノ酸により隔てられるLeu
およびCysである（C.H．Wuら，前出）。実際に、B．burgdorferi B31のOspAおよ
びOspBの遺伝子は、それぞれ、-L-I-A-C-および-L-I-G-C-のシグナル配列を含む
(S．Bergstromら、「Molecular Analysis of Linear Plasmid-Encoded Major Su
rface Proteins，OspA and OspB，of the Lyme Disease Spirochaete Borrelia
burgdorfer」，Mol．Microbiol.，3，479-86(1989)）。
対照的に、B．burgdorferi N40 p21遺伝子（-L-I-S-S-C-）のシグナル配列は
、OspE（-L-I-G-A-C-）、OspF（-L-I-V-S-C-）、OspC-PKo（-L-F-I-S-C-）、お
よ
びOspD-B31（-L-S-I-S-C-）遺伝子と同様に、ロイシンとシステインとの間の２
つのアミノ酸の代わりに３つのアミノ酸を含む。（R.S．Fuchsら、およびS.J．N
orrisら、（前出）を参照のこと）。しかし、シグナル配列におけるこの変異に
もかかわらず、OspA、OspB、およびOspDは、確立された[3H]パルミテート標識手
順によってリポタンパク質であることが示されている（M.E．Brandtら、およびS
.J．Norrisら、（前出）を参照のこと）。P21のリーダーシグナル配列は、この
表面タンパク質が同様にリポタンパク質としてプロセスされ得ることを示唆する
。システイン残基における脂質部分の付加は、スピロヘータの外表面にタンパク
質をアンカーさせることに役立ち得る（H.C．WuおよびM．Tokunaga、（前出）を
参照のこと）。
最後に、P21は、短いストレッチの疎水性のセグメントによって分離された長
い親水性ドメインを含む。
DNA配列の比較は、p21およびospEが、密接に関連するが、B．burgdorferiゲノ
ム内において、同一の-35および-10プロモーター配列およびリボソーム結合部位
を有する異なる遺伝子であることを示す。p21およびospEの5'上流領域は、配列
決定されている-10配列から5'隣接DNAの境界（ATGの189nt5'側）への上流にかけ
て同一である（図７）。p21とospEとの間の８ヌクレオチドのみの差異が、-10領
域とATG開始コドンとの間の領域において明白である。p21と比較した場合、ATG
の上流で、以下の差異がospEにおいて認められる：-54,Ｇ；-45,Ｃ：-32,Ｔ；-3
0,Ｇ；-24,Ａ；-15,Ｃ；-6,Ｔ；-3,Ｃ（ここで-1は、ATGコドンにおけるＡであ
る）。差異の全ては、おそらくp21 mRNAの5'非翻訳領域を含む領域に位置する。
P21とOspEとの間のこの相同性を考慮して、当業者は、治療的組成物および診
断的組成物を処方するにおいて、OspEと交差反応しないP21のエピトープを選択
することが望まれ得ることを理解する。
実施例IV−培養したB．burgdorferiにおけるp21発現のノーザンブロッティン グによる分析
p21がスピロヘータのインビトロ培養の間転写されるか否かを決定するために
、発明者らは、その発現をノーザンブロット分析により評価した。発明者らは、
酸
性グアニジウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出によって培養し
たB．burgdorferiから全RNAを単離した（引例）。発明者らは、１％ホルムアル
ライマービオチン標識キット（New EnglandBiolabs）を用いてビオチン化p21プ
ローブおよびospAプローブ（コントロール）を生成した。p21およびospAプロー
ブは、それぞれ、完全なp21およびospA配列を含んだ。発明者らは、ランダムオ
クタマープライム化標識反応のための鋳型としてp21またはospAの増幅したPCR産
物を使用した。
ブリダイゼーションおよびシグナル検出を行った。簡潔には、発明者らは、ブロ
ットしたメンブレンをSSC中で68℃にて１時間プレハイブリダイズさせ、そしてp
21またはospA（コントロール）についてのビオチン化プローブを用いて68℃にて
一晩ハイブリダイズさせた。発明者らは、そのメンブレンを0.1×標準生理食塩
水クエン酸塩（SSC）/0.1％SDSの最終ストリンジェンシーで68℃にて洗浄した。
発明者らは、ビオチン標識化プローブをストレプトアビジン、ビオチン化アルカ
リホスファターゼ、そしてlumigen-PPDを用いる一連のインキュベーションによ
って検出した。
発明者らは、培養したB．burgdorferlからp21 RNAではなくospA RNAを検出し
た。
実施例Ｖ−培養したB．burgdorferiゲノムのサザンドットブロット分析および PCR
B．burgdorferiのインビトロ培養は、しばしば、遺伝子またはプラスミドの喪
失と関連付けられているので（引例）、発明者らは、ドットブロット分析および
PCRを使用して、培養したB．burgdorferiのゲノムを調べ、p21遺伝子の存在つい
てのノーザンブロット分析（実施例IVに記載）のために、RNAを培養したB．burg
dorferiから得た。
Ａ．サザンドットブロット分析 変性したλファージ（コントロール）DNAまたは培養したB．burgdorferi DNAを
スポットした。発明者らは、まず乾燥させたメンブレンをエチジウムブロマイド
で染色し、等量のDNAが存在することを確認した。次いで、発明者らは、ノーザ
ンブロット分析について実施例IVに記載したp21プローブおよびospAプローブで
ハイブリダイズした。両方のプローブがB．burgdorferiのゲノムDNAに強くハイ
ブリダイズしたが、バクテリオファージDNAにはハイブリダイズしなかった。こ
れは培養したB．burgdorferiにおけるp21遺伝子の存在を確実にした。
Ｂ．PCR 分析
発明者らは、培養したB．burgdorferi由来の10ngのゲノムDNAを、p21遺伝子由
来のプライマーを使用するPCRに供した。発明者らは、それぞれ、配列番号11お
よび配列番号12に示される5'プライマーおよび3'プライマーを使用した。これら
のプライマーはp21に対して特異的であり、そしてospEを増幅しない。発明者ら
は、培養したB．burgdorferi DNAのPCRについて以下の条件を使用した：94℃１
分間、65℃１分間、72℃２分間（それぞれ、変性温度、アニーリング温度、およ
び伸長温度）を用いる30サイクル。
これらのプライマーを使用して、発明者らは、p21のコード領域の513bpのPCR
産物を得た。これは、p21遺伝子がノーザンブロット研究について使用した培養B
．burgdorferiのゲノム中に存在することをさらに確実にした。
実施例VI−B ．burgdorferiによるマダニにおけるp21発現の検討
P21が、IxodesマダニにおけるB．burgdorferiによって発現されるか否かを決
定するために、発明者らは、スピロヘータを含む扁平なマダニおよび充溢したマ
ダニの溶解物を間接的な免疫蛍光検定によって調べた。同じ方法を使用して、当
業者は、本発明の他の新規のB．burgdorferiポリペプチドがマダニにおいて発現
されるか否かを、過度の実験を要することなく容易に決定し得る。
簡潔には、発明者らは、B．burgdorferi N40感染マダニを、充満するまでC3H/
Heマウスから吸血させた。発明者らは、吸血していないマダニおよび充溢したマ
ダニを100μI PBS中で軽くホモジナイズし、そして10μｌのアリコートをシリル
化したガラススライド上にスポットした。発明者らは、スライドを風乾させ、そ
して４％パラホルムアルデヒドおよびサポニンでそれらを固定した。発明者らは
、実施例VIIにおいて調整した（配列番号 で示される）P21特異的ペプチドで免
疫化したマウス由来の抗血清（1:10希釈）中で検体を１時間インキュベートした
。発明者らは、スライドを洗浄し、そしてFITCを結合させた抗マウスIgG（1:500
希
下でスライドを観察した。発明者らは、陽性コントロールとして、吸血していな
いマダニ内のB．burgdorferiを認識するが充溢したマダニ内のスピロヘータを容
易には検出しない抗OspAモノクローナル抗体CIII.78を使用した（De Silvaら、(
1996)）。発明者らは、第２の陽性コントロールとして、扁平なマダニおよび充
溢したマダニの両方においてB．burgdorferiを認識する（引例）抗フラジェリン
モノクローナル抗体H9724を使用した。発明者らは、陰性コントロールとして抗B
SA血清を使用した。
以前の研究と一致して、スピロヘータは、扁平なマダニおよび充溢したマダニ
の両方においてフラジェリン特異的モノクローナル抗体によって容易に検出され
たが、OspA特異的モノクローナル抗体は扁平なマダニにおいてスピロヘータを検
出したが、充溢したマダニにおいては検出しなかった。しかし、扁平なマダニま
たは充溢したマダニのいずれにおいてもp21特異的免疫蛍光を検出しなかった。
p21特異的抗血清がp21と反応し得ることを確認するために、発明者らは、抗血
清を使用して、実施例12において調整した組換えP21または組換えOspEをプロブ
した。予想されたように、p21抗血清は、組換えp21を容易に認識したが、OspEを
認識しなかった。これらの結果は、p21もまた感染したマダニにおいて発現され
ないことを示す。
実施例VII−感染したマウスにおけるp21発現のドット免疫ブロット分析およ びRNA-PCRによる確認
Ａ．ドット免疫ブロット分析
次いで、発明者らは、B．burgdorferiで感染されたマウスにおいてp21が発現
されることを、２匹の感染マウス由来の血清おけるp21に対する抗体の存在を示
すことによって確認した。
発明者らはp21とOspEのアミノ酸配列を比較して、そしてp21に独特であるアミ
ノ酸31〜40を含むp21の領域を選択した。発明者らは、Quality Control Biochem
icals（Hopkinton，MA）にウシ血清アルブミン（BSA）と結合したペプチドを合
成させた。（システインを、BSA結合反応のためにペプチドのアミノ末端に付加
した）。ペプチドのアミノ酸配列を配列番号13に記載する。
発明者らは、BSAまたはBSAと結合した合成p21由来ペプチドの３μｇをニトロ
セルロースメンブレン上にスポットした。発明者らは、乾燥させたメンブレンを
、熱で殺滅したB．burgdorferiで免疫化したマウス由来の血清または感染マウス
由来の血清のいずれかとインキュベートした。発明者らは、西洋ワサビペルオキ
シダーゼと結合した２次抗体とインキュベートすることによって結合した抗体を
検出した（ECL Western blot detectionsystem，Amersham）。最後に、発明者ら
は、メンブレンをアミドブラックで染色し、等量のタンパク質が全ての試験サン
プル中に存在したことを示した。
感染したマウスからの血清はP21ペプチドと反応したが、熱で殺滅したB．burg
dorferiで免疫化したマウスからの血清は反応しなかった。従って、p21はインビ
ボで選択的に発現される。
Ｂ．RNA PCR
発明者らは、感染マウスにおけるp21の発現をp21 RNAを検出するRNA PCRを使
用して、さらに実証した。発明者らは、酸性グアニジウムチオシアネート／フェ
ノール／クロロホルム抽出（Micro RNA Isolation Kit，Stratagene）を使用し
て、マダニ伝播を介してB．burgdorferiに感染したマウスの脾臓から全RNAを、
そしてインビトロ培養したB．burgdorferiからRNAを単離した。発明者らは、５
匹のB．burgdorferi N40感染マダニを充血するまでマウスから吸血させた。任意
の残留DNAを除去するために、発明者らは、10μｇのプールしたRNAを、RNaseを
含まないDNase（Promega）でHPRIおよびRnaseインヒビターと共に37℃にて３時
間処理した。発明者らは、逆転写酵素と伴っておよびこれを伴わずにRNA PCRを
行って、残留DNAもまた増幅され得るという可能性を排除した。発明者らは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Stratagene）およびp21（マウス組織
お
よび培養したB．burgdorferi）、γ-アクチン（マウス組織コントロール）、ま
たはospA（培養したB．burgdorferiコントロール）のいずれかに対する3'プライ
マーを用いる逆転写によってcDNAを合成した。続いて、発明者らは95℃にて５分
間加熱することによって逆転写酵素を不活化した。次いで、発明者らは、p21、
γ-アクチン、またはospAに対する5'プライマーを添加し、そして94℃１分間、5
5℃１分間、および72℃２分間の45サイクルのPCRを行った。
発明者らは、逆転写酵素の存在下においてのみP21のRNA PCRから513bpの産物
を得た。増幅された産物のp21としての同定を確実にするために、発明者らは、R
そしてノーザンブロット分析について実施例IVに記載されるp21プローブでハイ
ブリダイズさせた。逆転写酵素がなければ産物が存在しないということによって
、DNAが増幅されていないことを確認した。発明者らは、非感染マウスから調整
したRNAからまたはインビトロで培養したB．burgdorferiのRNA PCRからp21特異
的プライマーでの増幅は得られなかった。
実施例VIII−p35 およびp37遺伝子の配列分析
発明者らは、熱で殺滅したB．burgdorferiで免疫化したマウスおよび生存B．b
urgdorferiで90日間感染させたマウス由来の血清を使用したことを除いて、実施
例Ｉの記載に厳密に、λZap II B．burgdorferi発現ライブラリーをディファレ
ンシャルにスクリーニングした。発明者らは、感染したマウスからの血清中の抗
体と反応したが、熱で殺滅したスピロヘータで免疫化したマウスからの血清中の
抗体とは反応しない14のファージクローンを同定した。
発明者らは、感染抗血清に強く反応したクローンの２つを選択し、プラスミド
を切り出し、そして実施例Ｉに記載のように挿入物を配列決定した。一方の挿入
物は、309アミノ酸タンパク質をコードする927ヌクレオチドのオープンリーディ
ングフレームを含んだ。（配列番号５）。発明者らは、Genetics Computer Grou
p Program（University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison,WI）を
用いてGenBank（1995年７月）の検索を行った。発明者らの検索は、発明者らが
新規のB．burgdorferi遺伝子（発明者らはp35と命名した）を単離したことを明
らかにした。発明者らは、その遺伝子によってコードされる抗原をP35と命名し
た。
他方の挿入物は、322アミノ酸タンパク質をコードする996ヌクレオチドのオー
プンリーディングフレームを含んだ。（配列番号７）。GenBank（1995年７月）
の検索は、発明者らが第２の新規のB．burgdorferi遺伝子（発明者らはp37と命
名した）を単離したことを明らかにした。発明者らはその遺伝子によってコード
される抗原をP37と命名した。
配列番号７から明らかであるように、P37の推定アミノ酸配列は、典型的な原
核生物リポタンパク質前駆体において見出されるリーダーペプチドに類似するリ
ーダーペプチドを示す。疎水的コアのカルボキシ末端にSer19とCys20との間に潜
在的なシグナルペプチダーゼII切断部位が存在する。しかし、P35は、LeuとCys
との間に介在する５つのアミノ酸を有する潜在的な切断部位を有する。これはリ
ポタンパク質に適切ではない。P35がリポタンパク質であることを確認するため
のさらなる証拠を探す必要がある。最後に、P37は短い疎水性セグメントによっ
て分離される長い親水性ドメインを含む。図６に示される、P35およびP37の親水
性プロフィールは、両方が親水性タンパク質であることを示唆する。発明者らは
、-35領域および-10領域ならびにそれぞれのオープンリーディングフレームの上
流のリボソーム結合部位を同定した。
実施例IX−p21 ．p35、およびp37遺伝子のマッピング
発明者らは、M.S．FerdowsおよびA.G．Barbour,''Megabase-Sized Linear DNA
in the Bacterium Borrelia burgdorferi，the Lyme DieaseAgent"，Proc．Nat
l．Acad．Sci.，86，5969-5973頁（1989）に記載される技術の改変を使用して、
全B．burgdorferi N40 DNAを用いるパルスフィールド電気泳動（PFGE）によって
p2L p35、およひp37遺伝子をマッピングした。簡潔には、発明者らは、約105のB
．burgdorferi N40を含むDNAプラグをサルコシルで処理し、プロテイナーゼＫで
一晩溶解させ、次いで染色体DNAおよびプラスミドDNAを0.8％アガロースゲル
ad Laboratories，Richmond，Calif）を使用してTris-borate-EDTA（TBE）緩衝
液（0.025M Tris、0.5mM EDTA、0.025Mホウ酸）中で14℃にて18時間198Vで、１
秒〜30秒のランプ化（ramped）パルス時間を用いて、DNAを電気泳動した。B．bu
rgdorferiDNAの２次元電気泳動のために、発明者らは、90℃方向を変え、そして
80Vの定電圧で６時間再び電気泳動した。
発明者らは、パルスフィールドB．burgdorferiDNAをニトロセルロースメンブ
レンに移し、そしてPCR増幅放射標識p21、 p35、p37プローブでプローブした。
発明者らは、サザンブロットにおけるコントロールとして、p30、ospA、およびo
sp
dom primer kit（Stratagene）を使用して、［a-32P]dCTPで標識したp35プロー
ブおよび37プローブを生成した。
予想されたように、ospAプローブおよびospDプローブは、それぞれ、49kbおよ
び38kbに移動したプラスミドにハイブリダイズした（A.G．BarbourおよびC.F．G
aron，“Linear Plasmids of the Bacterium Borreliaburgdoferi Have Covale
ntly Closed Ends”，Science，237，409-411頁（1987）およびS.J．Norrisら、
（前出））。p30プローブは染色体を同定した。全長p21プローブは３つの位置に
結合したが、p21特異的プローブ（配列番号14）は、環状プラスミドを認識した
。P35プローブは約42kbの線状プラスミドと同じ移動度で移動するように見える
プラスミドに結合した。P37プローブは約16kbの線状プラスミドと同一の移動度
で移動するように見えるプラスミドに結合した。
実施例Ｘ−p35 またはp37発現についての培養したB．burgdorferiの分析
p35またはp37がインビトロで転写されるかどうかを決定するために、発明者ら
は、実施例IVおよびＶに示すのと同様の分析を行った。PCR分析に使用する5'お
よび3'プライマーを、配列番号15および16（p35について）ならびに配列番号17
および18（p37について）に示す。
これらの分析の結果は、p35およびp37がインビトロで転写されることを確証す
る。
実施例XI−免疫ブロット分析およびRNA-PCRによる、感染したマウスにおけるp 35 発現およびp37発現の確認
発明者らは、実施例６で使用したドットブロットおよびRNA PCR方法ならびに
実施例９で使用したプライマーと同じものを使用した。発明者らは、p35およびp
37が感染したマウスにおいて発現することを確認した。それゆえ、p35およびp37
はインビボで選択的に発現される。
実施例XII−p21 、P35、およびP37ポリペプチドの発現
本発明の新規のB．burgdorferi遺伝子を発現するために、発明者らはpMXベク
ターを利用した。これは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ融合タンパク質
としてのクローン化した挿入物の発現を指向し得る（J．Searsら、「Molecular
Mapping of OspA-Mediated Immunity to Lyme Borreliosis」 J．Immunol.，147,
1995-2000頁(1991)）。PMXベクターはまた、GTタンパク質のすぐ後にトロンビン
切断部位を含む。従って、GT融合パートナーを含まずに組換えタンパク質を回収
し得る。
発明者らは、疎水性リーダーペプチドをコードする配列を欠失するP37遺伝子
を増幅するために、まずPCRを使用した。発明者らは、ポリペプチドがリポタン
パク質としてよりも可溶性融合タンパク質として発現されることを確実にするた
めに、その配列を削除することを選んだ。これは、細胞膜に固定されるか、また
は生合成の間もしくは生合成の後に細胞内のいずれかの場所で凝集し得る。
サブクローン化を容易にするために、発明者らは、さらなる制限酵素消化部位
を有するプライマーを使用して遺伝子を増幅した。発明者らは、さらなるBamHI
部位を有する5'プライマーおよびHind III部位を有する3'プライマー（配列番号
21および22）を使用してp21遺伝子を増幅した。発明者らは、さらなるXhoI制限
酵素消化部位を有する5'プライマーおよび補充したHindIII部位を有する3'プラ
イマー（配列番号23および24）を使用してp35遺伝子を増幅した。
発明者らは、さらなるBamHI制限酵素消化部位を有する5'プライマーおよび補
充したXhoI部位を有する3'プライマー（配列番号25および26）を使用してp37遺
伝子を増幅した。発明者らは、遺伝子の鋳型としてR408ヘルパーファージを使用
して最初のファージコロニーから切除した50ngのプラスミドDNAを使用した。
発明者らは以下のPCRを30サイクル行った：最初の鋳型変性を94℃で１分間、
アニーリングを40℃で２分間、そして伸長を72℃で３分間。
発明者らは増幅遺伝子産物をBamHI（p21）、XhoIおよびBamHI（p35）またはHi
ndIIIおよびXhoI（p37）で消化し、そしてPMXプラスミドの対応する部位にクロ
ーン化した。次いで、発明者らはEscherichia coli DH5αを形質転換するために
、当業者に周知の方法に従って、連結反応物を使用した。発明者らは、アンピシ
リンを補充したLuriaブロス上の組換えプラスミドを含むコロニーを単離し、そ
して細胞を培養した。
発明者らは、形質転換した細菌を対数期まで増殖させ、そして１mMのイソプロ
ピル-1-チオ−β-ガラクトシド（IPTG）を３時間添加することにより、グルタチ
オンＳ-トランスフェラーゼ融合タンパク質としての遺伝子の発現を誘導した。
当業者は、上記の技術に続いて、過度の実験を行わずに本発明の他のB．burgdor
feriポリペプチドを容易に発現し得る。
実施例XIII−組換え融合タンパク質の精製
実施例XIに記載したようにタンパク質発現を誘導した後、発明者らはE．coli
を１％Tritonを含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中に配置し、そしてそれら
を超音波処理に供した。発明者らは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ-B．b
urgdorferiポリペプチド融合タンパク質（GT-p21、GT-P35、GT-P37、およびGT-M
30）を、以下のように細胞溶解物から精製した。
発明者らは、1000×で８分間遠心分離することにより細胞上清とペレットとを
分離し、そしてそして製造者の説明書に従って、組換え融合タンパク質を含む上
清をグルタチオン-セファロース4Bカラム（Pharmacia）に通過させた。発明者ら
は、過剰のグルタチオンを含む溶液を使用して融合タンパク質をカラムから溶出
し、そしてBradfordアッセイを用いて定量化した。
さらに、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼを含まずにB．burgdorferiタン
パク質を精製するために、発明者らは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ融
合タンパク質をグルタチオン-セファロース4Bカラムにロードし、組換えB．burg
dorferiタンパク質をGTから切断するために25ユニットのトロンビンを添加し、
そして室温で一晩インキュベートした。次いで発明者らは、50mM Tris-CaCl2-Na
Clでタンパク質を溶出し、溶出物を抗トロンビンビーズで1.5〜２時間処理し、
そして13,000rpmで遠心分離した。
当業者は、これらの手順を使用して、過度の実験を行わずに本発明の他の新規
のB．burgdorferiポリペプチドが容易に精製され得ることを理解する。
実施例XIV−本発明のB．burgdorferiポリペプチドに対する抗体の調製
発明者らは、以下のように本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドに対す
る抗体を生成した。発明者らは、出版されたプロトコルに従って14日および28日
目に、C3H/Heマウス（Frederick Cancer Research Center，Frederick，MD）に
、完全Freundアジュバント（CFA）において10マイクログラムのGT-p21、BSAに結
合した配列番号13のP21特異的ペプチド、GT-P35、またはGT-P37のいずれかで皮
下に免疫化し、そして不完全Freundアジュバント（IFA）中の同量の抗原で追加
免疫した。発明者らは、コントロールマウスを同様の様式で組換えグルタチオン
Ｓ-トランスフェラーゼまたはBSAのいずれかで免疫化した。
最終追加免疫の14日後、発明者らは免疫化された動物から血清を採取し、そし
てそれを使用して、組換えGT-p21、BSA結合p21特異的ペプチド、P35ポリペプチ
ド、またはP37ポリペプチドのSDS-PAGEゲルのウェスタンブロットへハイブリダ
イズした。
組換えP35およびP37はマウスにおいて抗体を惹起し、これは1：5000までの希
釈で免疫ブロットにより検出し得た。発明者らはまた、ELISAにより結合を検出
した。
実施例XV−全長K2ポリペプチドの単離
全長K2ポリペプチドおよびそれをコードするDNAを、当業者に入手可能な種々
の方法により単離し得る。例えば、配列番号３に示されるペプチドに対して惹起
された抗血清を使用して、そのタンパク質を発現し得るクローンについてB．bur
gdorferi発現ライブラリーをスクリーニングし得る。あるいは、発現ライブラリ
ーは、B．burgdorferi DNAのより小さいフラグメントが発現ベクター中にインフ
レームでクローン化され、そこからそれらがグルタチオンＳ-トランスフェラー
ゼ融合タンパク質（例えば、pGEX-2T、pMX、またはpGEMEX）として発現されるよ
うに構成され得る。このようなライブラリーは、E．coliにおいては転写活性で
ないプロモーターに正常に連結される場合でさえ、融合タンパク質として配列を
発現する可能性が高い。
あるいは、配列番号３に示されるペプチドをコードするDNAは、小さいcDNAラ
イブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブの基礎とし
て使用され得る。
実施例XVI−新規のB．burgdorferiポリペプチドに対する免疫応答の特徴付け
Ａ．マウス体液性応答
本発明のB．burgdorferiポリペプチドに対する免疫応答を特徴付けるために、
発明者らは、104のB．burgdorferi N40での皮内接種により、またはB．burgdorf
eriN40感染I．scapularisマダニを使用するマダニ伝達（Harvard School of Tro
pical Public Health）により、C3H/Heマウスを感染させた。マダニ伝達研究に
おいて、発明者らは、B．burgdorferi N40に感染した５匹のマダニにマウスを曝
した。発明者らは、マダニに満腹まで吸血させ、そして試験のために水浴上でそ
れらを回収した。
発明者らは、感染マウスから、感染して７日後、14日後、30日後、90日後、お
よび180日後で血清を回収した。発明者らはそのサンプルを凝血塊形成のために
試験管に一晩保存し、そして血清を900g×で30分間の遠心分離により単離した。
次いで、発明者らは血清を、精製したGT-p21，BSA結合p21特異的ペプチド、GT-P
35ポリペプチドまたはGT-P37ポリペプチドとともに以下のようにELISAで使用し
た。
発明者らは２連のセットの96ウェルマイクロタイタープレートを、種々の組換
えポリペプチド（200マイクログラム｛１μｇ/ml、200ml/ウェル｝でコートし、
そして一晩４℃でインキュベートした。非特異的結合を防ぐために、発明者らは
100μｌ/mlのPBS中10％ウシ胎児血清で１時間ブロックした。発明者らは、プレ
ートを0.05％PBS Tween（PBST）で３回洗浄した。発明者らは、３連の血清サン
プ
ル（200マイクロリットル／ウェル、１：100に希釈）をコートしたプレートに添
加し、そして室温で１時間／４℃で８時間インキュベートした。次いで発明者ら
はプレートをPBSTで３回洗浄し、そして各ウェルに、ヤギ抗-マウスIgMまたはヤ
ギ抗-マウスIgG（各々１：2000で希釈し、そしてアルカリホスファターゼに結合
させた）を添加した。発明者らはプレートを室温で１時間インキュベートし、そ
してPBSTで３回洗浄した。最終的に、発明者らは、各ウェルに200マイクロリッ
トルの新たに調製したp-ニトロフェノールリン酸（グリシン緩衝液｛pH10.5｝中
1mg/ml）を添加し、そして色の変化を405ナノメータでモニターした。発明者ら
は反応を３M NaOHで停止した。
発明者らは、感染して14日後には早くも、P35およびP37の両方に対する抗体を
高い力価で検出した。応答は感染して30日後でピークに達し、感染して60〜90日
後までに減少し、そして180日目までにほとんど消失した。P21特異的抗体が28日
目にマウスの血清中に出現し、そして感染過程を通じて持続した。
当業者は、過度の実験を行わずに、本明細書中で教示した手順を使用して、本
発明の他の新規のb.burgdorferiポリペプチドに対するマウス体液性応答を容易
に測定し得る。
Ｂ．ヒト体液性応答
発明者らはまた、P21、P35、およびP37タンパク質に対するヒト免疫応答を特
徴付けた。p21の研究のために、発明者らは、Yaleライム病クリニックから82検
体の患者の血清群および疾患管理センター（Centers forDisease Control: CDC
）から40検体の患者の血清群を得た。患者を、医師により実証される、臨床症状
に基づく初期または後期のライム病、およびCDC定義疾患判定基準に従うB.burgd
orferiに対する血清抗体を有するとして分類した。CDCにサンプルを寄付した患
者のうち、60％を超える患者が、B．burgdorferiについて培養ポジティブであっ
た。Yaleクリニックからの患者は、培養による感染について日常的に試験しなか
った。
発明者らは、血清を、組換えGT-P21、 BSA結合p21特異的ペプチドを用いてELI
SAにおいて使用した。発明者らは、Yaleクリニックからの82個の血清のうち20個
（24％）が組換えp21に対するIgG抗体を有し、そしてこれらの20個のうち8個が
抗p21 IgM抗体も有すことを見出した。抗p21抗体を有する20個の血清のうち、４
個はIgM抗体を有し、そして16個はIgG抗体を有した。これらの抗体はp21特異的
ペプチドに結合する。発明者らは、CDCからの40個の血清のうち13個（33％）がP
21に対するIgG抗体および/またはIgM抗体を有することを見出した。これらの13
個の血清のうち、11個がIgG抗体を有し、そして４個がIgM抗体を有した。これら
の抗体はp21特異的ペプチドに結合する。一般的に、発明者らは３ヶ月以下の期
間ライム病を有する患者についてIgM応答を検出した。発明者らは、３ヶ月より
長い期間疾病を有する患者、およびライム病を有する患者の56％においてIgG抗
体を検出した。
P35およびP37の研究のために、発明者らは、疾患管理センターからの40個の血
清、ならびにYaleクリニックおよびConnecticut農学研究局（Agricultural Rese
arch Station）で見られた詳細に記録されたライム病を有するさらなる25検体の
患者からの血清を使用した。
発明者らは、二次抗体としてヤギ抗ヒトIgGおよびヤギ抗ヒトIgMを使用して、
血清を、上記のように組換えGT-P35および-P37を用いてELISAにおいて使用した
。
発明者らは、CDCからの全ての血清はP35および干37に対するIgG応答を有する
ことを見出した。組換えP35およびア37に対する高い反応性のために、発明者ら
は、発明者らのクリニックならびにYale University Medical SchoolおよびConn
ecticut農学研究局のライム病研究室で見られた詳細に記録されたライム病を有
するさらなる25検体の患者からの血清を試験した。これらのうち、22個の血清は
P35に対する抗体応答を有し、そして20個の血清はP37に対する抗体応答を有した
。
実施例XVII−B.burgdorferi 感染に対して防御するための新規のB．burgdorfer i ポリペプチドの能力
本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドが、B．burgdorferi感染に対して
防御するために有効である免疫応答を惹起し得るかどうかを測定するために、発
明者らは、C3H/Heマウスを、CFA中の10マイクログラムの組換えGT-P35または組
換えGT-P37ポリペプチドで皮下に能動免疫化し、そして公開されたプロトコルに
従ってIFAにおいて同量の抗原で14日目および28日目に能動追加免疫した。発明
者らは、同様の様式でコントロールマウスを組換えGTで免疫化した。次いで発明
者らは、免疫化したマウスをB．burgdorferi N40で感染させることを試みた。
発明者らは、B．burgdorferi N40の低継代単離物を、C3H/Heマウスにおいて示
された感染性または病原性で、BSK II培地において33℃で対数期まで増殖させ、
そして暗視野顕微鏡下で血球計数器により計数した。発明者らは、能動免疫化し
たマウスを、104スピロヘータの皮内接種で最終追加免疫し、およそ14日後に抗
原投与し、そして感染の14日後に屠殺した。
屠殺において、発明者らは、無菌的に血液、脾臓、膀胱、および耳パンチを回
収し、組織をBSK ll培地中で２週間培養し、そしてスピロヘータについて暗視野
顕微鏡下で観察した。同時に、発明者らは切開し、ホルマリン固定し、およびパ
ラフィン包埋し、そして次いで接合部および心臓を炎症について検査した。発明
者らは、心臓および頸足根を盲目的に試験した。発明者らは、好中球およびリン
パ球での浮腫および滑液浸潤により、関節炎を特徴付けた。発明者らは、大動脈
炎、心筋炎、または心膜炎の存在により心臓炎を特徴付けた。
これらの方法を使用して得た予備的な結果は、P35またはP37は防御を与え得る
ことを示した。
実施例XVIII−マダニ媒介伝達に対する防御
発明者らはまた、本発明の新規のB．burgdorferiポリペプチドが、スピロヘー
タのマダニ媒介伝達に対して防御するために有効な免疫応答を惹起し得るかどう
か測定した。発明者らは、Ipswich，MA集団由来の研究室コロニーを維持してい
るHarvard School of PublicHealth からスピロヘータが存在しないIxodes damm
iniマダニを得た。発明者らは、103B．burgdorferi N40スピロヘータの皮内接種
により以前に感染（宿主として使用する３週間前）している非近交系のCD-１マ
ウスをマダニが満腹まで吸血し得るようにすることにより、マダニ（幼生時期で
）を感染させた。満腹時に、発明者らは血を体腔いっぱいに吸った幼生を回収し
、それらを100〜200の群にプールし、そしてそれらを21℃および相対湿度95％で
若虫時期へ脱皮させた。発明者らは、各プールにおける感染の罹患率を、代表
的なサンプル（10匹のマダニ）の免疫蛍光により、脱皮して３週間後に測定した
。発明者らは、抗原投与実験について70％より多い感染罹患率を有するプールの
みを使用した。
発明者らは、実施例XVIIに記載のように、GT-P35、GT-P37、またはその両方、
GT-P21、またはGT（コントロール）でマウスを能動免疫化した。最終追加免疫の
２週間後、発明者らは各マウスに5/15感染若虫マダニを配置し、マダニに満腹ま
で吸血させ、次いで水上で自然にマダニが離れるようにした。２週間後、発明者
らは上記のように、マウスを屠殺しそしてスピロヘータについて組織を培養し、
そして器官を試験した。
GT-p21による免疫化は、感染または疾患からマウスを防御しなかった。コント
ロールの各マウスおよび処置群は少なくとも１：5000の力価で特異的抗体を発現
した。これは、例えばOspAのような防御抗体の場合（Fikrigら、1992)において
、マウスを感染および疾患から防御するのに十分であることが見出されている。
マウスを、抗体力価のピーク時にスピロヘータで抗原投与した（最終追加免疫の
１週間後）。p21が、感染の初期段階で大量に発現しないことは可能である。発
明者らは、p21特異的抗体が非常に少量で発現し得る場合、感染して28日後にP21
特異的抗体の発現を示した。p21による免疫化がマウスにおいて十分に防御可能
な抗体を産生しないこと、またはp21がスピロヘータの表面で十分量で発現され
ず、それらを抗体媒介殺滅に対して脆弱性にすることもまた可能である。
実施例XIX−免疫化動物を吸血するマダニにおけるスピロヘータ負荷の減少
以前の研究は、マウスの組換えOspAでの免疫化が、免疫化動物を吸血するマダ
ニからスピロヘータを排除し得ることを示している（E.Fikrigら、「Eliminatio
n of Borreliaburgdorferi frovector ticks feeding on OspA-immunizedmice」
、Proc.Natl.Acad.Sci.,89,5418-5421頁(1992)）。従って、感染したマダ二が本
発明の新規のB.burgdorferiポリペプチドで免疫化した動物で吸血した場合に、
スピロヘータもまた殺傷されるかどうか決定するために、発明者らは、以下の実
験を行う。
発明者らは、実施例XVIIIに記載のように感染させた５匹のIxodes damminiマ
ダニを、GTで免疫化した12匹のコントロールマウスまたはGT-P21で免疫化した12
匹のマウスの各々に配置する。満腹まで吸血した後、マダニは、水の上に自然に
落ちる(detached)。一部のマダニのみが、各群より回収され、残りはマウスによ
り摂食されたようである。満腹の10日後、発明者らは、ｌ.5mlの微量遠心管にお
いて100μlのPBS中に個々のマダニをホモジナイズし、そして３つのスライドの
各々に10μｌのアリコートをスポットした。発明者らは、スライドを風乾させ、
冷アセトン中で10分間固定し、そして直接的または間接的免疫蛍光によりアッセ
イした。
直接的免疫蛍光アッセイについて、発明者らは、1:100の希釈度のFITC結合ウ
サギ抗B.burgdorferi N40抗血清を有するスライドをインキュベートし、カバー
発明者らは、１スライドあたり約20視野において、蛍光を発している細胞の数を
計数することにより、スピロヘータを数量化した。B.burgdorferi感染率は、免
疫化したマウスを吸血したマダニおよびコントロールマウスを吸血したマダニに
おいて同様であった。このことは、GT-p21での免疫化が感染を防御しないことを
示す。
当業者は、本発明の他の新規のB.burgdorferiポリペプチドでの免疫化の効果
が、本明細書中で教示される方法を使用して過度の実験法を伴わずに容易に決定
され得ることを理解する。
実施例XX−抗P35または抗P37抗血清でのマウスの受動免疫化
組換えB.burgdorferiポリペプチドで免疫化した動物由来の抗血清が防御を与
えるかどうか決定するために、発明者らは、0.2mlのGT-P35、GT-P37、または抗P
35/P37抗血清でマウスを受動免疫化した。次いで、発明者らは、免疫化の１日後
に104のB.burgdorferi N40で受動免疫化マウスをチャレンジした。
予備結果は、受動免疫化マウスにおけるB.burgdorferi感染の頻度および疾患
の経過が、コントロールマウスにおけるものと同じようであったことを示す。
別の研究において、発明者らは、５匹のscidマウスの３つの群を103のB.burgd
orferi、40で接種し、次いでGT-P21免疫化マウス、GT免疫化マウス、または90日
目の感染マウスのいずれかに由来する0.5mlの抗血清（1：10で希釈）を、接種後
１、４、８、および12日目に注射した。発明者らは、マウスを15日目に屠殺し、
そしてBSK II培地中で血液、膀胱、脾臓、および接種部位からの皮膚を培養した
。発明者らはまた、炎症について各マウスの脛足根および心臓を試験した。p21
抗血清で受動免疫化したマウスにおける感染および疾患の比率は、コントロール
マウスにおける比率と同様であった。B.burgdorferi感染マウス由来の90日目の
抗血清で受動免疫化したマウスは、実質的に感染から防御された。また、当業者
は、防御効果を検出するために、種々の実験条件がなされ得ることを理解する。
例えば、抗血清をGTを有さない組換えポリペプチドでの免疫化により得たり、力
価がより高い場合には異なる時点で抗血清を回収したり、より多くの抗血清で受
動免疫化したり、スピロヘータ用量を減少させたり、または当該分野で公知の他
の手段がなされ得る。
実施例XXI−インビボで発現されるB.burgdorferiポリペプチドのさらなるクロ ーン
発明者らは、実施例１に記載のスクリーニングにより生成される２つのさらな
るクローンの予備分析を実施した。発明者らは、それらのクローンをV１およびV
3と称した。発明者らは、V1およびV3をそれぞれ含むpV1およびpV3を、1996年５
月７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Ro
ckville，MDに寄託した。クローンV3を配列決定した（配列番号10）。当業者は
、これらのクローンにコードされたポリペプチドが、インビボで選択的に発現さ
れることを確認するために、上記と同様な実験を実施し得た。
発明者らはまた、実施例VIIに記載のスクリーニングにおいて同定された残り
のクローンの予備分析を実施した。各クローンの、他のものにクロスハイブリダ
イズする能力に基づいて、発明者らは、それらのクローンを５つのグループに分
離した。P35およびP37をコードするものに加え、少なくとも３つの遺伝子が同定
された。それらの遺伝子の１つ（M30と称される）のDNAおよびアミノ酸配列を、
配列番号８および９に記載する。発明者らは、他の遺伝子をJ1およびJ2と称した
。Jlに対応するクローン由来のプラスミドを、ATCC受託番号 の下でP15およ
びp
5として寄託した。p2、p7、およびp9に対応するクローン由来のプラスミドを、A
TCC受託番号 の下で寄託した。
実施例XXII−防御エピトープの決定
発明者らは、防御エピトープを含むフラグメントを決定するために、新規のB.
burgdorferiポリペプチドのフラグメントを発現する組換え遺伝子を構築する。
まず、発明者らは、上記のように、制限酵素消化、またはPCRおよび制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いての特異的配
列の増幅のいずれかにより、各々の遺伝子のヌクレオチド配列全体を含む、重複
する200-300bpのフラグメントを生成した。次いで、発明者らは、精製を容易に
するためおよび安定性を増加させるために、これらのフラグメントを適切な発現
ベクター（好ましくは、フラグメントが融合タンパク質として発現されるベクタ
ー）にクローン化する。例えば、遺伝子フラグメントが、pGEMEX(Promega，Madi
son，WS)にクローン化され、そしてT7遺伝子の10個の融合タンパク質として発現
され得た。このようなタンパク質は不溶性であり、それ故、不溶性ペレット画分
の回収、それに続く尿素のような変性剤での可溶化により容易に精製される。あ
るいは、フラグメントは、上記のように、グルタチオンS-トランスフェラーゼ融
合タンパク質として発現され得た。次いで、発明者らは、適切な宿主細胞を形質
転換し、そしてフラグメントの発現を誘導する。
防御Ｂ細胞エピトープを含むフラグメントを同定する１つの方法は、上記のよ
うに、個々の精製されたフラグメントを使用してC3H/HeJマウスを免疫化するこ
とである。B.burgdorferiでのマウスのチャレンジの後、発明者らは、血液およ
び脾臓の培養により、ならびに関節および心臓の組織病理学的試験により感染の
存在を決定する。
防御エピトープを同定するための別の技術は、種々のフラグメントを使用して
マウスを免疫化し、B.burgdorferiで感染させたマダニにマウスを吸血させ、次
いで実施例VIIIに記載のように、フラグメントにより惹起された免疫応答がマダ
ニ中のB.burgdorferiのレベルにおける減少を引き起こすに十分であるかどうか
を決定する。このような応答を惹起する任意のエピトープが、たとえこれらがそ
れら自身B.burgdorferiでの次の感染に対して防御を与えるに十分でないとして
も、多成分ワクチンにおいて有用であり得る。
一旦、発明者らは、種々のエピトープを融合タンパク質の特定の領域に局在化
させると、発明者らは、５〜35アミノ酸の短い合成ペプチドを使用してさらなる
分析を実施する。合成ペプチドの使用は、発明者らが、各エピトープをさらに規
定し、同時に融合タンパク質の非B.burgdorferi部分により寄与されるいかなる
変動も排除することを可能にする。
実施例XXIII−多成分ワクチンの調製
発明者らは、どの防御エピトープが、Osp遺伝子がクローン化された株以外のB
．burgdorferi株での次の感染に対して防御する抗体を惹起し得るかを決定する
。次いで、発明者らは、これらのエピトープ周辺のワクチンを設計する。いずれ
の防御エピトープもB.burgdorferiの他の株での感染に対して保護を与え得ない
場合、相当する新規のB.burgdorferiポリペプチドをそれらの株から単離するこ
とが特に有利であり得る。次いで、いくつかの異なるB.burgdorferi単離物由来
の複数のエピトープを含む多成分ワクチンを構築し得る。従って、このようなワ
クチンは、種々の異なる株に対して防御を与える抗体を惹起する。
実施例XXIV−Ｔ細胞エピトープの同定
動物における高力価の中和抗体を含む体液性免疫応答の剌激は、Ｔ細胞および
Ｂ細胞のエピトープを含む抗原により容易にされる。Ｔ細胞エピトープを含むそ
れらのポリペプチドを同定するために、発明者らは、上記のように、C3H/HeJマ
ウスを完全フロイントアジュバント中のB.burgdorferi株N40で感染させた。プラ
イミングの10日後、発明者らは、リンパ節を収集し、そしてインビトロでのＴ細
胞株を生成する。次いで、これらのＴ細胞株を、限界希釈および軟寒天の技術を
使用してクローン化する。発明者らは、これらのＴ細胞クローンを使用してどの
ポリペプチドがＴ細胞エピトープを含むかを決定する。Ｔ細胞クローンを種々の
ポリペプチドおよび同系の抗原提示細胞で刺激する。抗原提示細胞の存在下でＴ
細胞エピトープを含むポリペプチドにＴ細胞クローンを曝露することにより、Ｔ
細胞が増殖し、発明者らはこれを3H-チミジン取り込みにより測定する。発明者
らはまた、刺激されたＴ細胞クローンによるリンホカイン産生を、標準的な方法
を使用して測定する。
ヒトＴ細胞に認識されるポリペプチドのＴ細胞エピトープを決定するために、
発明者らは、複数のHLA型のB.burgdorferi感染患者からＴ細胞クローンを単離す
る。Ｔ細胞エピトープを、種々のポリペプチドでクローンを刺激しそして3H-チ
ミジン取り込みを測定することによって同定する。次いで、種々のＴ細胞エピト
ープを、DR、DP、およびDQのようなクラスII HLA抗原と相関させる。相関を、種
々のHLA遺伝子を発現するＢリンパ芽球腫細胞株の利用により実施する。所定の
Ｔ細胞クローンを適切なＢリンパ芽球腫細胞株および新規のB.burgdorferiポリ
ペプチドと混合する場合、Ｂ細胞はＴ細胞に対してポリペプチドを提示し得る。
次いで、増殖を、3H-チミジン取り込みにより測定する。
あるいは、当業者に周知の方法（例えば、M.S.DeSouzaら、「Long-TermStudyo
f Cell-Mediated Responses to Borrelia burgdorferi in the Laboratory Mous
e」、Infect Immun．61、 1814-22頁(1993)）に従って、Ｔ細胞エピトープは、
本発明の種々の新規のB.burgdorferiポリペプチドで免疫化したマウスに由来す
るＴ細胞を、ナイーブなマウスに養子移入することにより同定され得る。
次いで、発明者らは、異なるＴ細胞エピトープに基づく多成分ワクチンを合成
する。このようなワクチンは、異なるHLA型を有する広範囲の患者においてＴ細
胞応答を誘導するのに有用である。
発明者らはまた、他の免疫原性B.burgdorferiポリペプチドにおいて、または
非B.burgdorferiポリペプチドにおいて、刺激性(stimulating)Ｔ細胞エピトープ
を同定し、本発明の新規のB.burgdorferiポリペプチドに由来するＢ細胞および
Ｔ細胞エピトープと組み合わせて、これらのエピトープに基づく多成分ワクチン
を設計する。
実施例XXV−ＴおよびＢ細胞エピトープを含む融合タンパク質の構築
新規のB.burgdorferiポリペプチドのＴ細胞エピトープを同定した後に、発明
者らは、これらのエピトープならびに中和抗体により認識されるＢ細胞エピトー
プを含む組換えタンパク質を構築する。これらの融合タンパク質は、Ｔ細胞およ
びＢ細胞の両エピトープを含むことによって、表面免疫グロブリンを発現するＢ
細胞によるＴ細胞への抗原提示を可能にする。これらのＴ細胞は順に、表面免疫
グロブリンを発現するＢ細胞を刺激し、高力価の中和抗体の産生を導く。
発明者らはまた、Ｂ細胞エピトープを含むと決定されたポリペプチドの領域を
、他の抗原の強力なＴ細胞エピトープと連結することにより、新規のB.burgdorf
eriポリペプチドから融合タンパク質を構築する。発明者らは、Ｂ型肝炎ウイル
スコア抗原のアミノ酸120〜140と相同であるオリゴヌクレオチドを合成する。コ
ア抗原のこの領域は、強力なＴ細胞エピトープを含むことが示されている（D.R.
Millichら、前出）。次いで、オリゴヌクレオチドを、実施例XIのように、中和
抗体により認識されるＢ細胞エピトープをコードするDNAのセグメントの5'およ
び3'末端に連結する。次いで、組換えDNA分子を使用して、新規のB.burgdorferi
ポリペプチド由来のＢ細胞エピトープおよびコア抗原由来のＴ細胞エピトープを
含み、従ってポリペプチドの免疫原性を増強した融合タンパク質を発現させる。
発明者らはまた、新規のB.burgdorferiポリペプチドのエピトープならびに破
傷風トキソイドタンパク質のエピトープを含む融合タンパク質を構築する。
発明者らはまた、Salmonellaのフラゲリンタンパク質に組み込まれた、種々の
新規のB.burgdorferiポリペプチドのＢ細胞エピトープを含むプラスミドを構築
する。細菌のフラゲリンは、細胞性応答および体液性応答の強力な刺激因子であ
り、そして防御抗原のためのベクターとして使用され得る（S.M.C.Newton，C.Ja
cob、B.Stocker、「Immune Response To Cholera Toxin Epitope Inserted In S
almonella Flagellin」、Science、244、70-72頁(1989)）。発明者らは、超可変
領域における唯一のEco RV部位で、クローン化されたSalmonella muenchensのH1
-dフラゲリン遺伝子を切断する。次いで、発明者らは、T4 DNAリガーゼを使用し
て、ポリペプチドの防御Ｂ細胞エピトープをコードする、平滑末端化されたDNA
を挿入する。次いで、組換えプラスミドを使用して、ワクチンとしての使用のた
めにSalmonellaの無べん毛株(non-flagellate strain)を形質転換する。マウス
を、生存細菌およびホルマリン死滅細菌で免疫化し、そして抗体産生についてア
ッセイする。さらに、脾臓細胞を、目的のペプチドに対する増殖性細胞応答に
ついて試験する。最後に、この因子で免疫化したマウスを、上記のように、B.bu
rgdorferiでチャレンジする。
発明者らはまた、新規のB.burgdorferiポリペプチドの１つに由来のＢ細胞エ
ピトープと異なる新規のB.burgdorferiポリペプチドまたは他の免疫原性B.burgd
orferiポリペプチド由来のＴ細胞エピトープとを含む融合タンパク質を構築する
。さらに、発明者らは、新規のB.burgdorferiポリペプチド由来のＴ細胞エピト
ープと新規のB.burgdorferiポリペプチドおよび／または他の免疫原性B.burgdor
fｅriポリペプチド由来のＢ細胞エピトープとを含む融合タンパク質を構築する
。これらの融合タンパク質の構築は、当業者に周知の組換えDNA技術により達成
される。融合タンパク質およびそれらを指向する抗体は、B.burgdorferiでの感
染により引き起こされるライム病を検出、処置、および予防するための方法およ
び組成物において使用される。
発明者らは、本発明の多数の実施態様を記載しているが、発明者らの基本的な
構成が改変されて、本発明のプロセスおよび産物を利用する他の実施態様を提供
し得ることは明白である。それ故、本発明の範囲は、例として提示されている特
定の実施態様よりもむしろ添付の請求の範囲により定義されることが理解される
。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
B. expressed in vivo burgdorferi polypeptide
This invention is awarded grant number AI30548, AI26815, awarded by the National Institutes of Health.
Made with government assistance under AI49387 and AR40452. The U.S. Government
And have certain rights.
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to compositions and methods useful for preventing, diagnosing, and treating Lyme disease.
I do. More specifically, the invention can elicit an immune response in a treated animal
New B. burgdorferi polypeptide. The present invention also relates to infection during host infection.
B. expressed but in vitro culture. New not expressed by burgdorferi
Rule B. burgdorferi polypeptide.
The invention also relates to one or more novel B.I. Multi-component protein containing burgdorferi polypeptide
About Kuching. The scope of the present invention also includes new B.V. burgdorferi polypeptide
A coding DNA sequence, an antibody to the novel polypeptide, and the antibody or
There are diagnostic kits containing this polypeptide. Finally, the present invention
Novel methods for the identification of selectively expressed bacterial genes.
Background of the Invention
Lyme borreliosis is the most common vector-borne infection in the United States (S.W.Bart
hold et al., "An Animal Model For Lyme Arthritis", Ann. N.Y. Acad. Sci., 539,
pp.264-73 (1988)). It has been reported on all continents except Antarctica
. A clinical feature of Lyme disease is an early dilating skin injury known as erythema migrans.
This can be accompanied by neurological, cardiac, and joint abnormalities after weeks to months.
You.
The causative agent of Lyme disease is a spirochete known as Borrelia burgdorferi
And transmitted first by the Ixodes tick of the Ixodes ricinus complex. B. burgdor
feri is also found in other species of ticks and mosquitoes and black-eye
It is shown. However, only ticks in the I.ricinus complex cause disease in humans.
Seems to be able to spread.
Lyme disease generally occurs in three stages. The first stage is when spirochetes are the other
Including local skin injuries (erythema migrans) that are more easily cultured than at any given time
(B.W.Berger et al., "Isolation And Characterization Of The Lyme Disease Sp.
irochete From The Skin Of Patients With Erythema Chronicum Migrans ", J.A.
m. Acad. Dermatol. 3, pp. 440-49 (1985)). Flu-like symptoms or meninges
Flame-like symptoms are common at this point. The second stage occurs within days to weeks.
And many different things in the body via the blood or lymph of patients with spirochetes
Includes diffusion to sites (including brain and joints). The different symptoms of this pandemic are
Occurs in the skin, nervous system, and skeletal muscle system, which are typically intermittent
It is. The third stage, or late infection, is defined as persistent infection and
You can be helpless. Chronic arthritis, and syndromes of the central and peripheral nervous system,
At this stage, as a result of continued infection and possibly the resulting autoimmune disease
(R. Martin et al., "Borrelia burgdorferi-Specific And Autoreactiv
e T-Cell Lines From Cerebrospinal Fluid In Lyme Radiculomyelitis ", Ann.N
eurol., 24, pp. 509-516 (1988)).
B. of human origin burgdorferi is much more cultivable than ticks
Have difficulty. Therefore, at present, Lyme disease is first diagnosed by serology.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a frequently used detection method.
Typically, sonicated whole culture spirochetes are used in such assays.
Used as an antigen, anti-B. burgdorferi
Detect antibodies (JE Craft, et al., "The Antibody Response In Lyme Disease: Eva
luation Of Diagnostic Tests ", J. Infect. Dis., 149 pp.789-95 (1984)).
However, false negative and, more generally, false positive results are
Accompany.
Currently, all stages of Lyme disease are treated with antibiotics. Early treatment of the disease
Always effective. However, the heart, joints, and nervous system
Disorders often do not respond to treatment (A, C, Steere, "Lyme Disease", New E
ng. J. Med. 321, pp. 586-96 (1989)). Therefore, early interventions can be effective treatments
Is important. Thus, the immunogenic B. aureus expressed early in infection. burgdorferi tampa
There is an urgent need to identify quality.
Treponemapallidum causing syphilis and leptospir causing infectious jaundice
Like ae, Borrelia belongs to the eubacteria of spirochetes (A.G. Barbour et al.
And S.F. Hayes, "Biology Of Borrelia Species", Microbiol. Rev., 50, pp. 381
-400 (1986)). Borrelia burgdorferi is released by cell membranes and then by flagella.
And then has a plasma cylinder surrounded by an outer membrane.
B. identified to date burgdorferi external surface protein [ThreeH] Palmi
Is thought to be a lipoprotein as demonstrated by labeling with citrate
(M.E. Brandt et al., "Immunogenic Integral membrane Proteins of Borrelia burg
dorferi Are Lipoproteins ", Infect Immun., 58, pp983-991 (1990).
Key external surface proteins are 31 kDa external surface protein A (OspA) and 34 kDa
Partial surface protein B (OspB). Both proteins are from different isolates.
Or from different passages of the same isolate, their molecular weights and monoclonal antibodies
Are shown to be different as determined by the reactivity of OspC:
Previously identified as pC (R. Fuchs et al., "Molecular Analysis and Expression o
f a Borrelia burgdorferi Gene Encoding a 22 kDa Protein (pC) in Escherichi
abi ", Mol. Microbiol., 6, pp. 503-09 (1992). OspD is a low-passage virulence
B. of the strain burgdorferi B31 (S.J. Norris et al.)
"Low-Passage-Associated Proteins of Borrelia burgdorferi B31: Character
ization and Molecular Cloning of OspD, A Surfaced-Exposed, Plasmid-Encod
ed Lipoprotein ", Infect. Immun. 60, pp. 4662-4672 (1992)). 19kD protein
OspE is expressed early in infection, while OspF, a 26 kD protein, is expressed later.
(T.T. Lam et al., "Outer Surface Proteins E and F Of Borreli a
burgdorferi, the Agent of Lyme Disease, "Infect. Immun., 62, pp. 290-298 (1
994)).
Non-OspB identified to date. burgdorferi protein is another bacterial flagelli
A 41-kDa flagellin protein (G.S.
Gassman et al., "Analysis of the Borrelia burgdorferi GeHo fla Gene and Antig
enic Characterization of Its Gene Product ", J. Bacteriol. 173, pp. 1452-59 (
1991)), and a 93 kDa protein that is said to be localized in the periplasmic space (D.J.
man et al., "Characterizatioin of an Immunoreactive 93 kDa Core Protein of Bo
rrelia burgdorferi With a Human IgG Monoclonal Antibody "J. Immunol. 146, pp
. 3177-82 (1991)).
B. burgdorferi alters antigens on the outer surface during different stages of its life cycle
It is known to cause. For example, OspC can be used in spider ticks in unfed ticks.
Not expressed by heta. However, OspC is a tick in blood feeding and blood feed
It is synthesized after introduction into the lumen of the midgut. OspA, in contrast, is present in stationary ticks.
It is a prominent surface antigen of spirochetes in the intestine. Spirochetes are a tick diet
OspA expression is reduced as it travels from the midgut to the salivary glands in time. OspA in ticks
Downregulation allows spirochetes to survive in the presence of the OspA antibody response.
B. Enable and selective antigen expression avoids immune destruction burgdorferi mechanism
Suggest to get.
Expression of other bacterial virulence gene products can be induced by environmental signals
Known (J.J.Mekalanos, "Environmental Signal Controlling Expression
of Virulence Determinants In Bacteria ", J. Bacteriol., 174, pp. 1-7 (1992
)). Similar induction of gene expression can be detected in infected host cells where certain external signals are present.
Can occur. Therefore, to understand the pathogenic mechanism,
Genes that are not expressed in in vitro cultures,
It is important to study function.
The genetic system using Salmonella typhimurium is based on bacterial inheritance induced in vivo.
Have been developed to identify offspring (M.J. Mahan et al., "Selection of Bacterial
Virulence Genes That Are Specifically Induced in Host Tissues ", Science
259, pp686-688 (1993)). However, this system is a gene transfer system and well defined
It cannot be applied to pathogenic organisms for which no auxotrophy is available. Such a system
, B. Not available in burgdorferi. Effective treatment and prevention of Lyme disease
Is B. burgdorferi evades host defenses, causes disease, and survives in host
Do
Requires an understanding of the mechanisms that enable it to be expressed selectively in vivo
B. There is an urgent need for a method to identify the burgdorferi gene.
B. expressed only in vertebrate hosts The humoral response to the burgdorferi antigen
May help in the serological diagnosis of disease. One such protein is Barb
Not present in spirochetes cultured in our-Stoenner-Kelly (BSK) II medium
. Some B. Selective in vivo expression of the burgdorferi protein was performed using culture B. burgdorferi. burgd
Current diagnostic tests for Lyme disease based on whole cell lysates of orferi are unreliable
That could be one reason. Such tests are directed against antigens expressed in vivo.
Antibody cannot be detected. Thus, providing a more reliable Lyme disease diagnostic test
There is also a need to identify B. burgdorferi proteins.
Recently, immunization of mice with recombinant OspA has Infections in burgdorferi
Has been shown to be effective in providing long-term protection against the disease (E. Fikrig et al.
, “Long-Term Protection of Mice from Lyme Disease by Vaccination with O
spA ", Infec. Immun. 60, pp. 773-77 (1992). However, O
Protection by the spA immunogen appears to be somewhat strain-specific, probably due to
, Different B. Due to heterogeneity of the OspA gene among burgdorferi isolates. example
If B. Immunization with OspA from burgdorferi strain N40 was performed with strains N40, B31, and CD16.
Protection against subsequent infection but not against strain 25015 (E. Fikrlg et al.
"Borrelia burgdorferi Strain 25015: Characterization of Outer Surface P
rotein A and Vaccination Against Infection ", J. Immun 148, pp. 2256-60 (199
2)).
Immunization with OspB has also been shown to provide protection against Lyme disease,
, Not as much as that provided by OspA (E. Fikrig et al., "Roles of Osp
A, OspB and Flagellin in Protecitve Immunity to Lyme Borreliosis in Labor
atory Mice ", Infec. Immun, 60, pp. 657-61 (1992)).
rgdorferi has demonstrated the disruption in mice immunized with OspB by truncated OspB protein
Appear to be circumvented through mutations in the OspB gene that result in expression of E. coli (E. Fikrig et al.).
, "Evasion of Protective Immunity by Borrelia burgdorferi by Truncation
of Outer Surface Protein B ", Proc. Natl. Acad. Sci., 90, pp. 4092-96 (1993).
). OspC has also Protective effect in gerbil model of burgdorferi infection
Show
Have been. However, the protection resulting from immunization with this protein is only partial.
(V. Preac-Mursic et al., "Active Immunization with pC Protein
of Borrelia burgdorferi Protects Gerbilsagainst B. burgdorferi Infectio
n "Infection, 20, pp. 342-48 (1992)).
Immunization with OspF has also been shown to provide partial protection against infection
(T.K. Nguyen et al., "Partial Destruction of Borrelia burgdorferi Within
Ticks That Engorged On OspE-Or OspF-Immunized Mice. "Infect.Immun.62, p
p. 2079-2084 (1994)). Both anti-OspE and anti-OspF antibodies are found in ticks
It has been shown to reduce the number of spirochetes (TK Nguyen et al., Supra).
Inadequate defense against tick infestation and lime when Lyme disease appears
Since the disease can be overlooked or misdiagnosed, it can elicit a protective immune response and
B. Potential for Use in Vector Vaccines more antigens of burgdorferi and
There is a continuing and urgent need for the determination of related proteins. further,
Further B. The identification of burgdorferi antigens at different stages of Lyme borreliosis
It may enable the development of useful and more reliable diagnostic reagents.
Disclosure of the invention
The present invention provides a novel B.I. Provide a burgdorferi polypeptide. This protein is
, B. burgdorferi spirochetes or fragments thereof.
What is B. Team for diagnosis, treatment, and prevention of burgdorferi infection and Lyme disease
Useful in compositions and methods. In one embodiment, the present invention relates to p21
Polypeptides and compositions and methods comprising these polypeptides are provided
.
In another embodiment, the present invention relates to K2 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a tide.
In another embodiment, the present invention relates to P35 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a peptide.
In another embodiment, the present invention relates to P37 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a peptide.
In another embodiment, the present invention relates to M30 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a peptide.
In another embodiment, the present invention relates to V3 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a tide.
In another embodiment, the present invention relates to J1 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a tide.
In another embodiment, the invention relates to J2 polypeptides and polypeptides thereof.
Provided are compositions and methods that include a tide.
Preferred polypeptides of each of the above embodiments are selectively expressed in vivo.
.
The preferred compositions and methods of each of the above embodiments are also useful in treated animals.
Novel B. elicits the formation of an immune response characterized by a burgdorferi polypeptide
It is.
In another embodiment, the present invention relates to one or more other immunogenic B. burgdorferi po
One or more novel B.I. burgdorferi polypeptide
To provide a multi-component vaccine. Such vaccines are described in against burgdorferi infection
It is effective in providing widespread protection.
In yet another embodiment, the present invention relates to the novel B.V. burgdorferi poly
Antibodies to peptides, and compositions and methods comprising these antibodies are provided.
You.
In another embodiment, the present invention relates to one or more novel B.I. burgdorferi polypep
Diagnostic means characterized by tides, or antibodies against these polypeptides
And provide a method. These means and methods are described in Lyme disease and B. et al. burgdor
Useful for detecting feri infection. They also provide a course of treatment for such infections.
Useful for tracking down. In patients previously vaccinated with the vaccine of the invention
The detection means and methods disclosed herein may also be suitable for boost inoculation.
Useful to determine whether or not.
In yet another embodiment, the present invention provides an additional B.R. burgdorferi polypepti
Methods of identifying and isolating the compounds and compositions comprising such polypeptides and
Provide a way.
In yet another embodiment, the present invention relates to a method of expressing bacterial cells during infection of a host but comprising
Bacterial genes encoding antigenic proteins that are not expressed during in vitro culture
Provide a way to determine
Finally, the present invention relates to the novel B.V. encodes a burgdorferi polypeptide
DNA sequences, recombinant DNA molecules characterized by these DNA sequences, these DNA sequences
Single cell hosts transformed with rows and molecules, and the novel B. burgdor
These sequences, molecules, and the like to produce feri polypeptides and multicomponent vaccines.
And methods of using the host. The DNA sequences of the present invention also include Lyme disease and B
It is advantageously used in methods and means for the diagnosis of .burgdorferi infection.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. DNA and amino acid sequence of P21 polypeptide of burgdorferi strain N40
Show.
FIG. The DNA and amino acid sequence of the P35 polypeptide of burgdorferi strain N40
Show.
FIG. DNA and amino acid sequence of P37 polypeptide of burgdorferi strain N40
Show.
FIG. DNA and amino acid sequence of M30 polypeptide of burgdorferi strain N40
Show.
FIG. FIG. 3 shows the DNA and amino acid sequence of the V3 polypeptide of burgdorferi strain N40.
You.
FIG. 6 shows the hydrophilicity profiles of P35 and 37.
FIG. 3 shows a comparison of amino acid sequences of burgdorferi strain N40 OspE.
FIG. 8 shows DNA sequences encoding P21 and K2, as well as other known B.A. burgdorfe
Shows a comparison of transcriptional and translational control regions between the DNA sequences of ri outer surface proteins
.
Detailed description of the invention
The present invention provides a novel B.I. burgdorferi polypeptides, DNA sequences encoding them
Antibodies to those polypeptides, compositions comprising the polypeptides or antibodies,
And methods for the detection, treatment, and prevention of Lyme disease.
More specifically, in one embodiment, the present invention relates to P21 polypeptides and
And compositions comprising these polypeptides.
In another embodiment, the present invention relates to K2 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the tides.
In another embodiment, the present invention relates to P35 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the peptides.
In another embodiment, the present invention relates to P37 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the peptides.
In another embodiment, the present invention relates to M30 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the peptides.
In another embodiment, the present invention relates to V3 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the tides.
In another embodiment, the present invention relates to J1 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the tides.
In another embodiment, the present invention relates to J2 polypeptides and polypeptides thereof.
Compositions and methods comprising the tides.
Preferred polypeptides, compositions and methods of each of the foregoing embodiments are immunogenic.
B. A novel B. burgdorferi polypeptide. by burgdorferi polypeptide
Characterized.
In another embodiment, the present invention relates to other immunogenic B. burgdorferi polypeptide
Plus one or more new B.I. against lyme disease, including burgdorferi polypeptide
A multi-component vaccine. Such vaccines have a broad spectrum of B. bur
It may be useful to protect against infection by gdorferi organisms.
Novel B. provided by the present invention. burgdorferi polypeptides, and them
All of the DNA sequences encoding burgdorferi spirochetes or their flags
And can be produced to be substantially free of B. burgdor
Used in a variety of applications without risk of accidental infection or contamination by feri components
Can be Therefore, the novel B.I. The burgdorferi polypeptide is a B. burgdorferi polypeptide. burgdorfe
Particularly advantageous are compositions and methods for the diagnosis and prevention of ri infection.
In another embodiment, the present invention provides a novel B.V. burgdorferi polypepti
Compositions and methods comprising antibodies to the antibodies. Such antibodies are available in a variety of suitable
Applications, including B.I. detection of the presence of burgdorferi; b
screening for expression of urgdorferi polypeptide, a novel B. burgdorferi polype
Purification of peptide, new B. blocking or binding to burgdorferi polypeptides
, B. Direction of molecules to the surface of burgdorferi, B. Some period of burgdorferi infection
Prevention or reduction of the severity of B. in ticks. burgdorferi spiroge
Data reduction.
In yet another embodiment, the present invention relates to a novel B.I. bur
Characterized by gdorferi polypeptides or antibodies to those polypeptides
The present invention relates to a diagnostic means and a diagnostic method.
In yet another embodiment, the invention relates to a bacterium that is selectively expressed in vivo.
The present invention relates to a method for identifying a gene.
The following terms and definitions are provided herein to further define the invention.
You.
As used herein, the term "immunogenic B. burgdorferi polypeptide"
Any B. capable of eliciting an immune response when administered to a substance. burgdorferi polypepti
Is.
Immunogenicity B. The burgdorferi polypeptide is a novel B. burgdorferi polypeptide of the present invention. burgdorferi poly
Not only peptides but also OspA and OspB polypeptides disclosed in PCT patent application WO 92/00055.
Repeptide; OspC protein described in Fuchs et al., Supra; PCT patent application WO 95/0414.
OspE and OspF polypeptides disclosed in No. 5; burgdorferi protein
And any fragments, serotype variants and derivatives described above.
Is intended. In particular, immunogenic B. The burgdorferi polypeptide is referred to herein as
Additional B. identified according to the disclosed methods. Contains burgdorferi polypeptide
Is intended.
As used herein, "B. burgdorferi spirochetes or fragments thereof
Polypeptides that are substantially free of modified "Babour-Stoener-Kelly" (BSK-II
) By dark field microscopy when introduced into the medium and cultured at 37 ° C. for 7 days
B. Detectable Does the polypeptide produce no burgdorferi spirochetes at all?
Or polyclonal anti-B. On immunoblot probed with burgdorferi antiserum
Is a polypeptide that can be detected as a single band.
As used herein, a "selectively expressed in vivo" polypeptide is
It is expressed during infection of the host. burgdorferi is expressed during in vitro culture.
No, that B. burgdorferi gene
It is a repeptide. The DNA sequence "corresponding to the B. burgdorferi gene" is naturally occurring.
Existing B. burgdorferi polypeptide fragment or derivative
DNA sequence encoding the peptide.
"P21 polypeptide" as used herein is selected from the group consisting of:
Means a polypeptide that is:
(A) a P21 polypeptide consisting of amino acids 1-182 of SEQ ID NO: 2;
(B) at least taken as a block from the P21 polypeptide of (a)
A fragment comprising 15 amino acids; and
(C) a polypeptide that is selectively expressed in vivo,
(1) at least 80% in the amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a)
A derivative of the P21 polypeptide of (a), which is identical;
(2) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
Antibodies are immunologically reactive with (a) the P21 polypeptide)
A polypeptide that is sexual;
(3) B. immunologically reactive with P21 polypeptide of burgdorferi and (a)
A polypeptide capable of raising an antibody; and
(4) Antibodies and immunology raised by immunization with (a) P21 polypeptide
Polypeptides that are reactive.
The term “K2 polypeptide” as used herein is selected from the group consisting of:
Means the polypeptide to be used:
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(B) amino acids that are at least 80% identical in amino acid sequence to SEQ ID NO: 3
A derivative of the polypeptide of (a), comprising a polypeptide having a block of
And
(C) a polypeptide that is selectively expressed in vivo,
(1) at least 80% in the amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a)
A derivative of the polypeptide of (a), which is the same;
(2) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
Antibodies are immunologically reactive with (a) polypeptides)
A polypeptide which is
(3) B. immunologically reactive with burgdorferi and (a) polypeptides
A polypeptide capable of raising an antibody; and
(4) Immunologically with antibodies raised by immunization with the polypeptide of (a)
A polypeptide that is reactive.
"P35 polypeptide" as used herein is selected from the group consisting of:
Means a polypeptide that is:
(A) P35 protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and its serotype
Variant;
(B) at least eight of the P35 polypeptides of (a) taken as blocks
Fragments containing amino acids;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the P35 polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
The antibody is immunologically reactive with the (a) or (b) or (c) P35 polypeptide.
A) a polypeptide that is immunologically reactive with
(E) B. burgdorferi and P35 polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide capable of raising an antibody that is immunologically reactive with; and
(F) Induced by immunization with the (a) or (b) or (c) P35 polypeptide
A polypeptide that is immunologically reactive with the raised antibody.
"P37 polypeptide" as used herein is selected from the group consisting of:
Means a polypeptide that is:
(A) P37 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and its serum
Type variants;
(B) at least eight of the P37 polypeptides of (a) taken as blocks
Fragments containing amino acids;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the P37 polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
The antibody is immunologically reactive with the (a) or (b) or (c) P37 polypeptide.
A) a polypeptide that is immunologically reactive with
(E) B. burgdorferi and P37 polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide capable of raising an antibody that is immunologically reactive with; and
(F) induced by immunization with (a) or (b) or (c) a P37 polypeptide;
A polypeptide that is immunologically reactive with the raised antibody.
"M30 polypeptide" as used herein is selected from the group consisting of:
Means a polypeptide that is:
(A) M30 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and its blood
Clear variant;
(B) at least eight of the M30 polypeptides of (a) taken as blocks
Fragments containing amino acids;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the M30 polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
The antibody is immunologically reactive with the M30 polypeptide of (a) or (b) or (c).
A) a polypeptide that is immunologically reactive with
(E) B. burgdorferi and (a) or (b) or (c) M30 polypeptides
A polypeptide capable of raising an antibody that is immunologically reactive with; and
(F) Induced by immunization with M30 polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide that is immunologically reactive with the raised antibody.
A `` V3 polypeptide '' as used herein is selected from the group consisting of:
Refers to a polypeptide that:
(A) a V3 protein having the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 10,
And serotype variants thereof;
(B) at least eight amino acids taken as blocks from the polypeptide of (a);
A fragment containing nonoic acid;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
Antibody is immunologically reactive with (a) or (b) or (c) polypeptide
A) immunologically reactive with a polypeptide;
(E) B. burgdorferi and free of polypeptide (a) or (b) or (c)
A polypeptide capable of raising an antibody that is epidemiologically reactive; and
(F) caused by immunization with the polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide that is immunologically reactive with a selected antibody.
As used herein, "V3 polypeptide" refers to ATCC Accession No. Included in the issue
B. burgdorferi DNA sequence (cross-hybridizing to the DNA sequence of SEQ ID NO: 10)
B) is encoded in whole or in part by B. Contains burgdorferi polypeptide
Is intended.
`` J1 polypeptide '' as used herein is selected from the group consisting of:
Refers to a polypeptide that:
(A) ATCC accession number(2)B included in the issue all by burgdorferi DNA sequence
Or a partially encoded polypeptide, and a serotype variant thereof;
(B) at least eight amino acids taken as blocks from the polypeptide of (a);
A fragment containing nonoic acid;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
Antibody is immunologically reactive with (a) or (b) or (c) polypeptide
A) immunologically reactive with a polypeptide;
(E) B. burgdorferi and free of polypeptide (a) or (b) or (c)
A polypeptide capable of raising an antibody that is epidemiologically reactive; and
(F) caused by immunization with the polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide that is immunologically reactive with a selected antibody.
As used herein, “J1 polypeptide” refers to ATCC Accession No.(2A)Included in the issue
B. burgdorferi DNA sequence (ATCC accession no. B included in the issue burgdorfe
cross-hybridize with the ri DNA sequence)
B. It is intended to include burgdorferi polypeptides.
As used herein, a `` J2 polypeptide '' is selected from the group consisting of:
Refers to a polypeptide that:
(A) ATCC accession number(3)B included in the issue all by burgdorferl DNA sequence
Or a partially encoded polypeptide, and a serotype variant thereof;
(B) at least eight amino acids taken as blocks from the polypeptide of (a);
A fragment containing nonoic acid;
(C) less amino acid sequence with the corresponding polypeptide of (a) or (b);
A derivative of the polypeptide of (a) or (b), which is at least 80% identical;
(D) B. antibodies produced by infection of a mammalian host with burgdorferi (this
Antibody is immunologically reactive with (a) or (b) or (c) polypeptide
A) immunologically reactive with a polypeptide;
(E) B. burgdorferi and free of polypeptide (a) or (b) or (c)
A polypeptide capable of raising an antibody that is epidemiologically reactive; and
(F) caused by immunization with the polypeptide of (a) or (b) or (c)
A polypeptide that is immunologically reactive with a selected antibody.
As used herein, "J2 polypeptide" has the ATCC accession number(3)Included in
B. ATCC accession number, cross-hybridizes with the burgdorferi DNA sequence(3A and 3B)
B. included in burgdorferi DNA sequence is encoded in whole or in part
B. It is intended to include burgdorferi polypeptides.
As used herein, "new B. burgdorferi polypeptide" refers to P21 poly.
Peptide, K2 polypeptide, P35 polypeptide, P37 polypeptide, M30 polypeptide
Or a V3 polypeptide, a J1 polypeptide, or a J2 polypeptide.
As used herein, the novel B.I. burgdorferi polypeptide
A "serotype variant" is a novel B.A. burgdorferi poly
Depending on the DNA sequence that hybridizes to the DNA sequence encoding the peptide
Any naturally occurring polypeptide that can be encoded. The person skilled in the art
Novel B. according to the invention. A serotype variant of the burgdorferi polypeptide is a polymerase
Chain Reactions and New B. any of the DNA sequences encoding the burgdorferi polypeptide
Any part is amplified using oligonucleotide primers derived from the part
It is understood to include the polypeptide encoded by the resulting DNA sequence.
As used herein, the novel B.I. burgdorferi polypeptide
A “derivative” is one in which one or more physical, chemical, or biological properties have been altered.
New B. burgdorferi polypeptide. Such modifications include:
But not limited to: amino acid substitutions, modifications, additions or deletions;
Altered pattern of glycosylation, or phosphorylation; present in polypeptides
Free amino side groups, carboxyl side groups, or hydroxyl of amino acid residues
Reaction of side groups with other organic and non-organic molecules; and primary and secondary structures
Structure, or any other modification that can result in a change in tertiary structure.
As used herein, “protective antibody” refers to B.A. Physiology associated with burgdorferi infection
Antibodies that provide some period of protection against any one of the biological disorders.
As used herein, "protective B. burgdorferi polypeptide" refers to a protective epitope.
Polypeptide.
As used herein, a "protective epitope" is (1) a protein that is recognized by a protective antibody.
Epitopes, and / or (2) when used to immunize an animal,
For a period of time, B. Sufficient immunity to prevent or reduce the severity of burgdorferi infection
An epitope that elicits a response.
Preventing or reducing the severity of the infection can be caused by erythema migrans, arthritis, carditis,
Demonstrated by altered physiological manifestations of neurological disorders, and other Lyme disease-related disorders
obtain. This is evidenced by a decrease in spirochetes levels in treated animals
Can be done. And this is also the case in infected ticks that feed on blood from treated animals.
Can be evidenced by a reduced level of spirochetes. The protective epitope is a T cell
May comprise an epitope, a B cell epitope, or a combination thereof.
As used herein, “T cell epitope” refers to a T cell
T cell response (eg, clonal expansion or lymphokine if presented to
Or the expression of other immunostimulatory molecules). T cell epitope
Is also intracellular B. recognized by cytotoxic T cells that can affect burgdorferi infection
Can be a recognized epitope. Strong T-cell epitopes have a strong T-cell response
Is a T cell epitope that causes
As used herein, a "B cell epitope" is one that reacts with a specific antibody.
Are also simple spatial conformational antigens.
As used herein, a "therapeutically effective amount" of a polypeptide or antibody refers to an animal or animal.
When administered to B. for some period. prevent the severity of burgdorferi infection
Is an amount that elicits an immune response that is effective to reduce it.
As used herein, "antibodies to novel B. burgdorferi polypeptides"
(Also referred to as "the antibody of the present invention") comprises a P21 polypeptide, a K2 polypeptide, a P35 polypeptide.
Peptide, P37 polypeptide, M30 polypeptide, V3 polypeptide, J1 polypeptide
Or an antibody against the J2 polypeptide. New B. burgdorferi polypep
It should be understood that antibodies to the tides can also be protective antibodies.
New B. Antibodies to burgdorferi polypeptides are intact immunoglobulins
Phosphorus molecules or portions of immunoglobulin molecules that contain an intact antigen binding site (such as
Including those known in the art as F (v), Fab, Fab ', and F (ab') 2).
You. It can also be a molecule produced by genetic manipulation or synthesis.
The novel B.I. The burgdorferi polypeptide is a B. burgdorferi polypeptide. burgdorfe
Reactive immunologically with antisera raised by infection of a mammalian host with ri. Follow
Thus, these are methods and compositions for diagnosis and protection against Lyme disease.
And during ongoing infection. Stinging the immunological clearance of burgdorferi
Useful in intensifying therapeutic compositions. Further, as disclosed herein,
New B. At least some, if not all, of the burgdorferi polypeptides
B. Since they are immunogenic surface proteins of burgdorferi, they are effective against Lyme disease.
It is especially useful in multi-component vaccines. Because such vaccines
,
B. capable of duplication. Making the immunogen presented by burgdorferi more similar
And such vaccines may have a single B. burgdorferi po
It is more likely to provide broader protection than vaccines containing only the polypeptide.
You. The multi-component vaccine according to the present invention may also be used for diseases other than Lyme disease (eg,
Features other vaccines that are useful for immunization against rear, polio, hepatitis, and measles)
Polypeptides. Such multi-component vaccines are typically
Incorporated into one composition.
Preferred compositions and methods of the present invention provide novel B.
burgdorferi polypeptide. Such polypeptides are naturally occurring forms of the polypeptide.
The peptide or fragment thereof may be
Modification of treatment or subject to such treatment to enhance immunogenic characteristics
It can happen in some cases.
Without undue experimentation, the novel B.C. burgdorferi polype
Numerous techniques are available that can be used to substantially increase the immunogenicity of the peptide
And is well known to those skilled in the art. For example, the polypeptide may be dinitrophen
By coupling to a hydroxyl group or arsanilic acid, or by heating and
And / or by denaturation with SDS. In particular, when polypeptides are chemically
If small polypeptides are formed, they can be coupled to an immunogenic carrier.
May be desired. Not only coupling but also polypeptide or key
Carriers must not interfere with any of its ability to work properly. Couplings
For a review of some common considerations in strategies, see Anti.
bodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, E. Harlow
And D. See Lane (1988). Useful immunogenic carriers are well known in the art.
Is knowledge. An example of such a carrier is keyhole limpet hemocyanin (KL
H); albumin (eg, bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin)
, PPD (purified protein derivative of tuberculin); erythrocytes; tetanus toxoid;
Cholera toxoid; agarose beads; activated carbon; or bentonite.
Novel B.1 disclosed herein to alter lipidation status. burgdorferi po
Modifications of the amino acid sequence of the polypeptides may also affect their immunogenic and biochemical properties.
Is a method that can be used to increase For example, a polypeptide or its polypeptide
Fragments may or may not have a signal sequence that directs the addition of a lipid moiety.
Can be expressed.
As will be apparent from the disclosure below, polypeptides will also increase the stability of this molecule.
And to make this molecule more amenable to purification and preparation.
Can be prepared. One such technique is to transfer the polypeptide to another B.V. burgdorferi
Array or non-B. expression as a fusion protein containing the burgdorferi sequence
You.
According to the present invention, a new B.I. Derivatives of burgdorferi polypeptides can be obtained by various methods.
(In vitro manipulation of DNA encoding natural polypeptide and subsequent modified DNA
Expression, chemical synthesis of derivatized DNA sequences, or chemical synthesis of expressed amino acid sequences
Or including biological manipulations).
For example, a derivative can be a different naturally occurring amino acid, an amino acid derivative, or a non-naturally occurring amino acid.
It can be produced by substitution of one or more amino acids with a amino acid, with conservative substitutions being preferred
For example, 3-methylhistidine can be substituted for histidine and 4-hydroxyproline
Can be substituted for proline, 5-hydroxylysine can be substituted for lysine, and so on.
Producing less conservative amino acid substitutions can also include, for example, charge, conformational
Formation of the desired derivative by causing a change in
Can be brought. Such substitutions include, for example, the substitution of a hydrophobic residue for a hydrophilic residue.
, Substitution of cysteine or proline for another residue, substitution of a residue with a small side chain
Substitution for residues with large side chains, or net negative for residues with a net positive charge
Includes substitutions for charged residues. The results of a given replacement cannot be reliably predicted
In some cases, the derivative is easily assayed according to the methods disclosed herein.
, The presence or absence of the desired feature can be determined.
In a preferred embodiment of the present invention, the novel B.C. burgdorfe
The ri polypeptide is prepared as part of a larger fusion protein. For example
The novel B. of the present invention. The burgdorferi polypeptide has a different N-terminal or C-terminal
B. Immunogenicity burgdorferi polypeptides and non-B. burgdorferi polypeptide
Or a combination thereof to form a new B.I. Contains burgdorferi polypeptide
Fusion
Synthetic proteins can be produced.
In a preferred embodiment of the present invention, burgdorferi derived from multiple serotype variants
Novel B.1 containing B cell and / or T cell epitopes burgdorferi polypep
A fusion protein containing the peptide is constructed, and each variant is an epitope within the polypeptide.
Different from the other variants with respect to the position or sequence of the loop. More preferred embodiments
Now, the other immunogenic B. one or more novel fusions to a burgdorferi polypeptide
B. A fusion protein comprising the burgdorferi polypeptide is constructed. Such fusion
Synthetic proteins have a broad range of B. Rye as caused by burgdorferi isolates
Particularly effective in the prevention, treatment, and diagnosis of mildew.
In another preferred embodiment of the invention, the novel B.I. burgdorferi polypeptide
Can increase the stability of a polypeptide and in vivo plasma half-life of the polypeptide
(Eg, an immunoglobulin domain). This
Such fusions can be prepared according to methods well known to those skilled in the art (eg, US Pat. No. 4,946,778).
Or in accordance with the teachings of US Pat. No. 5,116,964) without undue experimentation.
Can be made. The exact site of the fusion is important as the polypeptide retains the desired biological activity.
It doesn't matter as long as Such a determination may be made according to the teachings herein, or
This can be done by other methods known to those skilled in the art.
New B. The fusion protein containing the burgdorferi polypeptide, at the DNA level,
For example, constructing a nucleic acid molecule encoding the fusion and transforming the host cell with this molecule
Cells are induced to express the fusion protein, and the fusion protein is expressed from the cell culture.
It is preferably produced by recovering the protein. Alternatively, fusion tongue
Protein can be produced after gene expression by known methods.
New B. A burgdorferi polypeptide can also be produced recombinantly or
Can be part of a larger multimeric molecule that can be chemically synthesized. like this
Multimers can also be fused or fused to moieties other than amino acids, including lipids and carbohydrates.
It may include the polypeptide to be coupled.
Preferably, the multimeric proteins are randomly or in the same molecule.
Multiple Ts or repeats with spacers (amino acids or others) in between
Consists of a B cell epitope or a combination thereof.
In a most preferred embodiment of the present invention, burgdorferi polypeptide
There is also a new B.I. burgdorferi polypeptides are other immunogenic B. burgdorferi polypeptides. burgd
Orferi polypeptides are also incorporated into multi-component vaccines. Such a multi-component
The vaccines have various immunogenic B. Raise antibodies to burgdorferi polypeptide
Thanks to its ability, a wide range of different B.A. burgdorferi isolates (even if more than one
Caused by Osp protein (even in isolates that may not express it)
It is effective in protecting against Lyme disease.
Multi-component vaccines are new B. Various components share burgdorferi polypeptide
It may be included as part of a bound multimeric molecule. Alternatively, this can be multiple individual
May be included. For example, two or more new B.I. burgdorferi polypeptide
Or one new B.I. burgdorferi polypeptide and one previously identified
B. A multi-component vaccine comprising a burgdorferi polypeptide can be prepared, where
Each polypeptide is expressed and purified from independent cell cultures, and
The peptides are combined before or during the formulation.
Alternatively, multi-component vaccines can be prepared from heterodimers or tetramers.
Here, the polypeptide is fused to an immunoglobulin chain or a portion thereof.
Such vaccines include, for example, P35 polypeptides fused to immunoglobulin heavy chains.
And OspA polypeptide fused to an immunoglobulin light chain, and
Transform host cells with DNA encoding the chain fusion and DNA encoding the light chain fusion
It can be produced by transposition. One skilled in the art will recognize that the host cell chosen
Understand that you should be able to assemble properly. Alternatively, heavy and light chains
Fusions can be produced from separate cell lines and associated after purification.
The desirability of including the specific components and the relative proportions of each component is described herein.
By using the disclosed assay system or by other methods known to those of skill in the art.
It can be determined by using the system. Most preferably, a multi-component vaccine
Is immunogenic B. burgdorferi polypeptide (the novel B. burgdorferi polypeptide of the present invention)
(Including peptides).
The present invention also relates to the novel B.V. burgdorferi polypeptide alone or other
B. Immunogenicity of B. to animals, either together with burgdorferi polypeptides
Liposome delivery systems to enhance the stability and / or immunogenicity of
It is also contemplated that it can be administered via Novel B. via liposome burgdorferi
Delivery of polypeptides can be particularly advantageous. Because liposomes are treated
This is because they can be internalized by poor phagocytes in animals. Like that
Cells digest the liposome membrane upon liposome uptake, and then
Together with other molecules required to elicit a strong immune response in the polypeptide
To the immune system.
The liposome system can comprise any of a variety of unilamellar vesicles, multilamellar vesicles, and
Can be stable plurilamellar vesicles and methods well known to those skilled in the art
(E.g., U.S. Patent Nos. 5,169,637, 4,762,915, and 5,000,958
Or according to the teachings of US Pat. No. 5,185,154). further
In order to enhance their binding to liposomes, the novel B.A. burgdorfe
ri polypeptides and other selected B. ri polypeptides. burgdorferi polypeptide, lipotan
It may be desirable to express it as protein.
Any novel B.I. burgdorferi polypeptide is a pharmaceutically acceptable salt
Can be used in the form of A suitable acid capable of forming a salt with the polypeptide of the present invention and
Bases are well known to those skilled in the art and include inorganic and organic acids and bases.
In accordance with the present invention, the inventors have determined that a therapeutically effective amount of a novel B.R. burgdorferi polypepti
Or a new B. fusion proteins containing burgdorferi polypeptides or multiple
A multimeric protein; reduce the severity of burgdorferi infection for some time
Describes a method comprising treating an animal in a manner sufficient to reduce it. So
Preferred polypeptides for use in methods such as
Polypeptide. Such protective epitopes include B cell epitopes, T
It can be a cellular epitope, or a combination thereof.
According to another embodiment of the present invention, the inventors provide a therapeutically effective amount of a novel B.R. burgdor
feri polypeptides, or fusion proteins containing such polypeptides
Is a multi-component vaccine containing multimeric proteins; the severity of burgdorferi infection,
Treating the animal in a manner sufficient to prevent or reduce it for some period of time.
The method of inclusion is described. Again, preferred for use in such methods
Polypeptides, fusion proteins, and multimeric proteins have protective epitopes.
And protective epitopes include B-cell epitopes, T-cell epitopes,
Or a combination thereof.
Most preferred polypeptides for use in these compositions and methods,
Fusion proteins, and multimeric proteins, are both potent T cells and B cells.
It contains an epitope. Without being bound by theory, the inventors
This is B. to stimulate high titer antibodies effective in neutralizing burgdorferi infection
Think of it as the best way. Such a preferred polypeptide is a B-cell epitope.
B cells expressing surface immunoglobulin that recognizes one or more
Be internalized. The B cells then process the antigen and
Is presented to T cells. T cells recognize the T cell epitope (s),
It responds by proliferating and producing lymphokines. This resource
The lymphokines then differentiate B cells into antibody-producing plasma cells. Therefore, this system
In the stem, there is a closed autocatalytic circuit, which is associated with both B and T cells.
Amplification of the response, which ultimately results in a novel B. burgdorferi polypeptide
Leads to the production of a strong immune response, including high titer antibodies to it.
Those skilled in the art will also appreciate the novel B.I. burgdorferi polypeptide, type 2 helper
T cells (TH2) Production of which helps B cells generate an antibody response
It will be appreciated that it may be advantageous to administer in a form that assists. Powerful B cells
In addition to administering an epitope that is an epitope, THInduction of 2 cells also
For example, at certain doses or at certain adjuvants and immunomodulators (eg,
Mode of administration of polypeptide by administration with interleukin 4)
Can be assisted by
To prepare preferred polypeptides of the invention, in one embodiment,
The novel B. of the present invention. Overlapping fragments of the burgdorferi polypeptide are constructed
You. Polypeptides containing B cell epitopes can be prepared in a variety of ways, including, for example, (1)
Their ability to remove protective antibodies from polyclonal antisera to repeptides
Or (2) B. Effective immunity to prevent or reduce the severity of burgdorferi infection
They can be identified by their ability to elicit a response.
Alternatively, the polypeptide can be used to raise monoclonal antibodies.
, When used to immunize untreated animals. burgdorferi
Screened for their ability to confer protection against infection. Once
If a given monoclonal antibody is found to provide protection, then the antibody
Can be identified.
Since recognition of T-cell epitopes is MHC-restricted,
Repeptides were obtained from humans of various HLA types, from lymph nodes, spleen, and C3H / He mice.
Or T cell clones produced from peripheral blood lymphocytes or from livestock
And / or test them for their ability to stimulate cytokine production
Can be identified in vitro. Has different class II antigens
Compositions comprising multiple T-cell epitopes recognized by an individual
It is useful for the prevention and treatment of Lyme disease in children.
In a preferred embodiment of the present invention, a novel B. coli comprising a B cell epitope burgd
orferi polypeptides may have one or more other immunogenic properties that include potent T cell epitopes
B. fused to a burgdorferi polypeptide. Of both strong T cells and B cells
Fusion proteins with epitopes are described in to neutralize burgdorferi infection
It may be involved in eliciting an effective high titer antibody response.
Strong T cell epitopes are also non-B. burgdorferi molecule.
For example, a potent T-cell epitope is found on hepatitis B virus core antigen (HBcAg).
Has been observed. In addition, one of these segments, the hepatitis B virus
Of the surface antigen, which is weakly recognized by T cells, to the segment
Have been shown to produce significant amplification of the anti-HBV surface antigen response (D.R. Milich et al., "
Antibody Production To The Nucleocapsid And Envelope Of The Hepatitis B
Virus Primed By A Single Synthetic T Cell Site ”, Nature, 329, pp. 547-49 (
1987)).
Therefore, in yet another preferred embodiment, B.I. High strength against burgdorferi
To produce a fusion protein capable of eliciting a multivalent antibody response, a novel B. burgdorfe
The B cell epitope of the ri polypeptide is a segment of HBcAG, or a potent T cell
Fused to other antigens, including epitopes. Furthermore, the novel B.I. burgdorfe
ri polypeptides can be converted to powerful immunogens, which are also widely recognized (eg, perforated
It can be particularly advantageous to link to (wind toxins).
The novel B. of the present invention. burgdorferi polypeptides and fusion proteins containing them
Proteins and multimeric proteins may be obtained by recombinant means, chemical means, or a combination thereof.
It will be readily appreciated by those skilled in the art that they can be prepared by combination.
For example, the polypeptides may be those described in the Sequence Listing contained herein. burgdofer
Using the DNA sequence of the iN40 strain, it can be produced by recombinant means. Polypeptide
DNAs encoding serotype variants can be obtained, for example, by PCR and the sequences disclosed herein.
Similarly cloned using oligonucleotide primers from the column
obtain.
In this regard, a wide variety of different agents that are useful in the methods and compositions of the present invention.
In order to obtain pitopes, it is known that they are antigenically different from the 25015 strain and the N40 strain.
B. New B. burgdorferi strains from other strains. burgdorferi polypeptide
It may be particularly desirable to isolate the gene to be loaded. For example, B. burgdorferi
The 25015 strain of OspA gene is an anti-OspA antibody (which is
Appears to be ineffective at protecting against infection with 25015 strains
To the extent, B. It is known to be different from the OspA gene of burgdorferi N40 strain.
New B. Oligonucleotides derived from the gene encoding the burgdorferi polypeptide
Reotide primers and other nucleic acid probes are also described in burgdorferi and
From related spirochetes, which may include regions of the DNA sequence homologous to the DNA sequences of the present invention,
It can be used to isolate and clone other related surface proteins.
In addition, the DNA sequences of the present invention can also be used to detect B. aureus in suspected infection samples. burgdorf
It can be used in PCR reactions to detect the presence of eri.
The novel B. of the present invention. If the burgdorferi polypeptide is produced recombinantly, it
Can be expressed in a single cell host. As is well known to those skilled in the art,
In order to obtain high expression levels of the foreign DNA sequence, the sequence is generally
It is operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that are primarily functional.
Preferably, the expression control sequence and the gene of interest further carry a selection marker.
Is contained in the expression vector contained in.
The DNA sequence encoding the polypeptide of the present invention may encode a signal sequence.
Good or uncoded. If the expression host is eukaryotic, the mature
The signal sequence may be encoded so that the protein is secreted from the eukaryotic host
Generally preferred.
The amino terminal methionine may be present on the expressed polypeptide of the invention.
Or may not be present. If the terminal methionine is not cleaved by the expression host
If desired, it can be removed chemically, if desired, by standard techniques.
A wide variety of expression host / vector combinations can be used to express the DNA sequences of the present invention.
Can be used in Useful expression vectors for eukaryotic hosts include, for example,
For example, SV40, bovine papilloma virus, adenovirus, adeno-associated virus, site
Expression control derived from megalovirus and retrovirus (including lentivirus)
And a vector containing the sequence. Useful expression vector for bacterial hosts
For example, bacterial plasmids such as those derived from E. coli (pBluescript, pGEX-2
T. pUC vector, col EL, pCR1, pBR322, pMB9 and their derivatives, pET-15
, A broader host range plasmid (eg, RP4), phage DNA (eg,
Numerous derivatives of phage λ (eg λGT10 and λGT11) and other phages
). Useful vectors for yeast cells include the 2μ plasmid and
And its derivatives. A useful vector for insect cells is pVL9
41 are listed.
In addition, any of a wide variety of expression control sequences-fields operably linked thereto.
The sequence that controls the expression of the DNA sequence in order to express the DNA sequence of the present invention
It can be used in these vectors. As such a useful expression control sequence
Examples include expression control sequences associated with the structural genes of the above expression vectors. Yes
Examples of expression control sequences for use include, for example, the early and
And late promoters, lac, trp, TAC or TRC, T3 and T7 promoters
, Major operator and promoter regions of phage λ, fd coat protein
Regulatory region, promoter of 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes
-, Acid phosphatase (eg, Pho5) promoter, yeast α mating system
Motors and prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses
Remains of
Other constitutive and inducible promoters known to control gene expression
Sequences, as well as various combinations thereof.
In a preferred embodiment, the novel B.A. burgdorferi polypeptide
The DNA sequence to be loaded is stored in the expression vector λZAP II (Stratagene, La Jolla, CA).
Cloned, where expression from the lac promoter can be induced by IPTG.
You.
In another preferred embodiment, the novel B. burgdorferi polypeptide
Is a glutathione S-transferase fusion protein
Inserts in frame into an expression vector that allows high-level expression of a given polypeptide
Is entered. Thus, such a fusion protein is encoded by the vector sequence.
Amino acids and new B. Contains the amino acids of the burgdorferi polypeptide.
A wide variety of unicellular host cells are useful in expressing the DNA sequences of the present invention.
It is for. These hosts include E. coli. coli strain, Pseudomonas, Bacillus, Strept
omyces, fungi, yeast, insect cells (eg, Spodoptera frugiperda (SF9)), animals
Cells (eg, CHO and mouse cells, African green monkey cells (eg, COS 1
, COS 7, BSC 1, BSC 40, and BMT 10), and human cells), and plants
Well-known eukaryotic and prokaryotic hosts, such as cells, may be mentioned.
All vectors and expression control sequences should be identical to express the DNA sequence of the present invention.
It should be understood that it does not work well. Also, all
Not all hosts function equally well for the same expression system. However,
Those skilled in the art will recognize this without undue experimentation and without departing from the scope of the invention.
A choice between these vectors, expression control sequences, and hosts can be made. For example, Baek
In selecting a target, the host must be considered. Because the vector
It must be duplicated in it. Vector copy number, copy
Ability to control the number of cells, the ability to control integration (if any), and
Any other proteins encoded (eg, antibiotics or other selectable markers)
The expression of-) should also be considered.
Various factors should also be considered in selecting an expression control sequence. this
These include, for example, the relative strength of the promoter sequence, its controllability, and
Its compatibility with the DNA sequences of the present invention, particularly with regard to potential secondary structure, is mentioned.
It is. Unicellular hosts determine their compatibility with the vector of choice, the DNA
The toxicity of the products encoded by the sequences, their secretory properties, and the proper folding of the polypeptide
Their ability to fold, their fermentation or culture requirements, and the DNA sequences of the invention
Should be selected for ease of purification of the products encoded by
It is.
Within these parameters, those skilled in the art will recognize that
Select various vector / expression control sequence / host combinations that express the DNA sequence of
I can do it.
The novel B.1 encoded by the DNA sequence of the present invention. burgdorferi polypeptide
The molecule can be isolated from a fermentation or cell culture, and can comprise any of a variety of
Can be purified using conventional methods: liquid chromatography using HPLC, FPLC, etc.
Chromatography (eg, normal or reverse phase); affinity chromatography (
Eg using inorganic ligands or monoclonal antibodies);
Chromatography; immobilized metal chelate chromatography; gel electrophoresis;
Those skilled in the art will recognize the most appropriate isolation and purification procedures without departing from the scope of the present invention.
Technology can be selected.
In addition, a new B.I. burgdorferi polypeptide can be produced by any of several chemical techniques
Can be generated by For example, they are described in R.B. Merrifield, "Solid Phase Pept
ide Synthesis. I. The Synthesis Of A Tetrapeptide ", J. Am. Chem. Soc., 8
3,2149-54 (1963), prepared using the solid phase synthesis technique originally described.
Or they can be prepared by synthesis in solution. Peptide synthesis technology
A summary of the procedure can be found in E. Gross and H.J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synth
esis, Biology; Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, Joh
n Wiley & Sons, (1981); Bodanszky, Principles Of Peptide Synthes
is, Springer-Verlag (1984).
Typically, these synthetic methods involve adding one or more amino acids to a growing peptide chain.
Includes the sequential addition of acid residues. Often, peptide coupling agents are
Used to facilitate response. Peptides suitable for use as described herein
For details of the coupling agent of M.D. See Bodansky, supra. Through
Usually, either the amino or carboxyl group of the first amino acid residue is
, Protected by a selectively removable protecting group. Different protecting groups are on the reactive side
Used for amino acids containing a chain group (eg, lysine). Minutes of peptide synthesis
Various protecting groups that are well known in the art and are recognized there by conventional abbreviations include
. Greene, Protective Groups In Organic Synthesis. Academic Press (1981)
Can be found.
According to another embodiment of the present invention, a novel B.I. against burgdorferi polypeptide
Antibodies are generated. Such antibodies are the subject of the novel B.A. burgdorferi polypep
An immunoglobulin molecule or portion thereof that is immunologically reactive with a tide. Departure
Ming's antibody is a novel B. fusion proteins and burgdorferi polypeptides
Should be understood to include antibodies that are immunologically reactive with the
You.
New B. Antibodies to burgdorferi polypeptides are described in Feeding in burgdorferi
By various means, including infection of animal hosts, or by the novel B.V. burgdorferi
It can be produced by immunization of a mammalian host with the polypeptide. Such antibodies are
, Polyclonal or monoclonal, which are monoclonal.
Preferably. Methods for producing polyclonal and monoclonal antibodies
Are well known to those skilled in the art. For a review of such methods, see Antibodies, A Labo
ratory Manual, supra, and D. E. Yelton et al., Ann. Rev. of Biochem., 50, 65
See pages 7-80 (1981). The novel B. of the present invention. Free from burgdorferi polypeptide
Determination of epidemiological reactivity can be determined by any of several methods known in the art (immunoblot
Assay and ELISA).
The antibodies of the present invention can also be immunoglobulins from different species (eg, mouse and human).
The sequence of immunoglobulin light and heavy chains from the blink sequence or from the same species.
It can be a hybrid molecule formed from moieties. The antibodies of the present invention include:
Molecules with multiple binding specificities (e.g., any of many techniques known in the art)
Or a bifunctional antibody prepared by:
Raw; disulfide exchange; chemical crosslinking; peptidylation between two monoclonal antibodies
The addition of two sets of immunoglobulin heavy and light chains to a particular cell line.
And so on.
The antibodies of the present invention can also be produced by any of several methods known in the art.
Human monoclonal antibodies. For example, human monoclonal antibodies
SCID-hu mice or other humans capable of producing "human" antibodies by immortalized human cells
By non-human animals, expression of cloned human immunoglobulin genes
Image display, or by any other method known in the art.
Can be produced.
Further, the antibody of the present invention can be used for toxin (eg, diphtheria, pseudomonas exotoxin,
Ricin A chain, gelonin, etc.) or antibiotics (eg, penicillin, tetrasa)
Iculin, and chloramphenicol) may be advantageous.
In summary, those skilled in the art provided with the teachings of the present invention will appreciate the biological properties of the antibodies of the present invention.
There are various available methods (stability of a given antibody molecule) that can be used to alter
Or a method of increasing or decreasing half-life, immunogenicity, toxicity, affinity or yield
Or that may make the method more appropriate for a particular application.
Has various available methods that can be used to modify it in any other way you want
You.
Those skilled in the art will recognize the novel B.I. antibodies against burgdorferi polypeptide
And B. burgdorferi infection therapeutic and prophylactic compositions and methods
Understand that it can have utility. For example, B. in infected ticks. burgd
orferi levels, they provide the novel B. Immunize with burgdorferi polypeptide
It can be reduced by sucking the blood of a simulated animal.
The antibodies of the present invention also have various other uses. For example, they are burgd
in a library constructed from orferi DNA or
From other samples obtained, Screen for expression of burgdorferi polypeptide
It is useful as a reagent for Furthermore, due to their specific binding affinity,
The antibodies of the present invention can also be used to purify or remove polypeptides from a given sample.
To block or bind to a specific epitope on a polypeptide,
And various molecules (eg, toxins). Yes for pointing to the surface of burgdorferi
It is for.
The novel B. of the present invention. burgdorferi polypeptides and antibodies against Lyme disease
B. their ability to provide defense, or burgdorferi infection
To screen for these capabilities, C3H / He mice were used as animal models.
Preferred. Of course, B. If any animal is susceptible to infection with burgdorferi
C3H / He mice can be If you are susceptible to burgdorferi infection
Not only the clinical manifestations of a disease that is surprisingly similar to Lyme disease in humans.
Affected. Therefore, specific polypeptides or antibodies can be administered to C3H / He mice.
The skilled artisan will appreciate that the polypeptide or antibody can be used herein without undue experimentation.
May be useful in the methods and compositions claimed therein.
The novel B. of the present invention. Administration of burgdorferi polypeptides or antibodies to animals
Achieved by any of the methods disclosed herein or various other standard procedures.
Can be achieved. For a detailed discussion of such technologies, see Antibodies, A Laborato
See ry Manual, supra. Preferably, if a polypeptide is used, the drug
Biologically acceptable adjuvants (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant)
With RIBI (muramyl dipeptide) or ISCOM (immunostimulating complex)
Is administered. Such adjuvants allow the polypeptide to be deposited in local deposits.
Can sequester or protect the polypeptide from rapid dispersion by sequestration
And others secrete chemotactic factors for macrophages and other components of the immune system.
It may include a substrate that stimulates the Lord. Preferably, when the polypeptide is administered,
Epidemiological schedules involve two or more administrations of the polypeptide over several weeks.
Once the new B.I. burgdorferi polypeptide or antibody
Once determined to be effective in the pharmaceutical process, they are then
La can exist naturally in a variety of animals in therapeutically effective amounts in the compositions and methods.
It can be used to treat or prevent IM disease.
The pharmaceutical compositions of the invention may be in various conventional storage forms. These include examples
For example, solid, semi-solid, and liquid dosage forms (eg, tablets, pills, powders, liquids)
Solutions or suspensions, liposomes, capsules, suppositories, injectable solutions and injectables
Solution). The preferred form depends on the intended mode of administration and prophylactic application.
Dependent.
Such dosage forms contain pharmaceutically acceptable carriers and agents known to those skilled in the art.
It may include a adjuvant. These carriers and adjuvants include, for example, RI
BI, ISCOM, ion exchanger, alumina, aluminum stearate, lecithin,
Serum proteins (eg, human serum albumin), buffer substances (eg, phosphate
Salts, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyces of saturated vegetable fatty acids
Lido mixture, water, salt, or electrolyte (eg, protamine sulfate, dihydrogen phosphate)
Thorium, sodium chloride, zinc salt, colloidal silica, magnesium trisilicate
(Magnesium trisilicate), polyvinylpyrrolidone, cellulose-based material,
And polyethylene glycol. Topical or gel-based form
The adjuvant is sodium carboxymethylcellulose, polyacrylate,
Polyoxyethylene polyoxypropylene block polymer, polyethylene glycol
Coal and wood wax alcohols.
The vaccines and compositions of the present invention may also include or contain other components.
To enhance the immunological characteristics of or to improve their tolerance in patients
During the preparation, other treatments may be provided.
Compositions comprising the antibodies of the invention may be used for other passive immunotherapy and are well known to those skilled in the art.
Can be administered in a variety of dosage forms and regimes similar to those of Generally, new
Rule B. Burgdorferi polypeptides are other pharmaceutically important polypeptides (eg,
, Vaccines against hepatitis) and methods similar to those used for
And can be administered to a patient.
Any pharmaceutically acceptable route of administration (parenteral, intravenous, intramuscular, intralesional, or
Or subcutaneous injection) is used to administer the polypeptide or antibody composition.
Can be For example, when the compositions are in a pharmaceutically acceptable dosage form containing them.
It can be administered to a patient. They may be given as a bolus intravenously or for several hours.
Intramuscular (by continuous infusion over a period of days, weeks, or months)
(Including paravertebral and peri-articular), subcutaneously, intradermally, intra-articularly, in synovial fluid, spider
Intrathecal, intralesional, periosteal, or oral or topical routes to patients
Can be administered. Preferably, the compositions of the present invention are in unit dosage form and
Always
Administered intramuscularly to patients.
The novel B. of the present invention. The burgdorferi polypeptide or antibody can be
It can be administered to a patient over a series of treatments. The most effective dosing and dosing regimen
Depending on the level of immunogenicity, the particular composition and / or adjuvant used in the treatment.
Bunt, expected severity and course of infection, previous treatment, patient health and
And the response to immunization, as well as the judgment of the treating physician. For example
Polypeptides are more immunogenic in immunocompetent patients
The lower the dosage and the number of immunizations required. Similarly, polypeptides
When administered with adjuvant, dosage and required treatment time are reduced.
It is. Generally, the dosage will consist of 10 μg to 100 mg of the purified polypeptide, and
Preferably, the dosage comprises 10-1000 [mu] g. Generally, the dosage for an antibody is
, 0.5 mg to 3.0 g.
In a preferred embodiment of the present invention, the novel B.I. burgdorferi polypeptide
Co-administered with an adjuvant to increase its immunogenicity. Useful Ajuba
Include RIBI, and ISCOM, simple metal salts (eg, aluminum hydroxide)
, And oil-based adjuvants (eg, complete and incomplete Freund's horse mackerel)
Uvant). If an oil-based adjuvant is used,
The peptide is usually administered in an emulsion with an adjuvant.
In yet another preferred embodiment, the novel B. burgdorferi polypeptide
E. coli expressing the protein containing burgdorferi infection
Administered orally to reduce or reduce severity. For example, the new B. burgdorfe
Ri polypeptides, alone or in the form of fusion or chimeric proteins
The mouth-watering regimen of bacteria expressed in wild mice or deer, or
It can be administered with animal food for consumption by livestock animals. Such a fine
Bacterial uptake can induce an immune response that includes both humoral and cell-mediated components.
J.C. Sadoff et al., `` Oral Salmonella Typhimurium Vaccine Expressing Circumsp
orozoite Protein Protects Against Malaria "Science, 240, pp. 336-38 (1988)
And K.S. Kim et al., `` Immunization Of Chickens With Live Escherichia coli
Expressing Eimeria acervulina Merozoite Recombinant Antigen Induces Pa
rtial Protection Against Coccidiosis ”Inf. Immun., 57, 2434-40 (1989)
checking ... In fact, oral vaccination with bacteria expressing OspA is effective
It has been shown. M. Dunne et al., `` Oral Vaccination Against Lyme Disease
Using Salmonella Expressing OspA ", Inf. and Immun., 63: 1611 (1995); E.Fi
krig et al., `` Protection of Mice From Lyme Borreliosis By Oral Vaccination W
ith Escherichia coli Expressing OspA " Infec. Dis., 164: 1224 (1991). Sa
In addition, B. et al. In the blood feeding of ticks in such animals. The level of burgdorferi infection
It is reduced or eliminated, thus inhibiting transmission to the next animal.
According to yet another embodiment, the antibodies of the present invention and the novel B. burgdorfe
ri polypeptides, as well as the DNA sequences encoding them, are described in in burgdorferi
Useful as a diagnostic factor for detecting infection. Because polypeptides
B. Binds to antibody molecules produced in animals, including humans, infected with burgdorferi
And this antibody can be burgdorferi or its antigen.
You.
Such diagnostics may include instructions for use and other appropriate reagents, preferably
Also includes means for detecting when the polypeptide or antibody is bound
May be included in the resulting kit. For example, a polypeptide or antibody binds to the antibody
B. allow the detection of the polypeptide when performed; burgdorferi or
It can be labeled with a detection means that allows detection of the antibody when bound to the antigen.
The detection means is a fluorescent labeling agent (for example, fluorescein isocyanate (FIC),
Fluorescein isothiocyanate (FITC) and enzymes (eg, horseradish
Biperoxidase (HRP), glucose oxidase, etc.), radioactive elements (
For example, produce gamma radiation125I or51(Cr) or present in the test solution
Element that emits a positron that produces gamma rays when colliding with an electron
(For example,11C,15O, or13N). Coupling can also be done in other ways.
(Eg, via an avidin-biotin complex).
The coupling of detection means is well known in the art. For example, produced from hybridoma
The monoclonal antibody molecule used is a set of radioisotope-containing amino acids in the culture medium.
Can be labeled metabolically by incorporation, or the polypeptide can be detected by activating functional groups.
It can be conjugated or coupled to an exit means.
The diagnostic kit of the present invention can also include a body fluid sample (eg, serum, crystals, or urine).
B inside. burgdorferi or anti-B. used to detect the presence of burgdorferi antibody levels.
Can be used. Thus, in a preferred embodiment, the novel B. burgdorferi polype
The peptide or the antibody of the present invention is adsorbed to a solid support, typically from an aqueous medium.
More combined. Useful solid matrices are well known in the art, and
Bridge dextran; agarose; polystyrene; polyvinyl chloride; cross-linked polya
Acrylamide; nitrocellulose or nylon-based material; tube;
Includes plates or wells of a crotiter plate. The polypeptide of the present invention
Alternatively, the antibody may be in solution form as a diagnostic agent or substantially as a dry powder (eg,
, In lyophilized form).
Novel B.E.R. burgdorferi polypeptides and antibodies
Is B. Provides a diagnostic reagent that is much more specific than the whole burgdorferi, and thus false positives
And pitfalls such as false negative results.
In particular, one skilled in the art will recognize that in infected hosts (and not in cultured B. burgdorferi)
The novel B.1 of the present invention, which is selectively expressed. burgdorferi polypeptides and polypeptides
Antibodies to peptides use lysate of cultured spirochetes as antigen
Enables the detection of antigens and antibodies in samples that are not detectable by some diagnostic methods.
You.
One skilled in the art will recognize other B. elegans, including flagella-related proteins. from the burgdorferi protein
Utilizing epitopes and antibodies against such epitopes also
It is understood that it may be advantageous in preparing the detection reagent. Against P35 and P37
Antibodies are available from B.A. burgdorferi tends to occur early in the course of infection, but P21 and Osp
Antibodies to F tend to appear later. Thus, later in Lyme disease
Other B. eliciting antibodies raised in epitope from burgdorferi protein
The use of a P35 or P37 epitope in combination with may be particularly advantageous.
Diagnostic reagents containing multiple epitopes reactive with antibodies that appear at different times are sensitive.
Anti-B. Throughout the dyeing process to detect the presence of burgdorferi antibodies and
It is useful for diagnosing Lyme disease at all stages.
The polypeptides and antibodies of the present invention, and compositions and methods containing them,
Further, the novel B.I. burgdorferi polypeptide and amino acid sequence or configuration
Caused by spirochetes that may contain surface proteins that share positional similarities
May be useful for the detection, prevention, and treatment of other infections that occur. Other than these
Spirochetes are Borrelia Hermsii and Borrelia Recurientis, Leptospira
, As well as Treponema.
According to another embodiment of the present invention, we express but not express during host infection.
Encodes an antigenic protein that is not expressed during in vitro culture of bacteria
A method for identifying a bacterial gene is described. The method comprises the following steps:
(a) constructing an expression library for the bacteria;
(b) Screening libraries with antisera from animals infected with bacteria
About;
(c) library with antisera from animals immunized with nonviable bacteria or components thereof.
Screening the cells; and
(d) Identify clones that react with the first antiserum but do not react with the second antiserum
Process,
including.
Expression libraries for use in the methods of the present invention may be any library known in the art.
It will be readily apparent to one skilled in the art that it can be constructed using any technique.
Generate an immune response to generate antisera for use in the methods of the invention.
Any animal that obtains is useful. Antisera is derived from a wide variety of techniques well known to those of skill in the art.
It can be generated by a shift.
As used herein, a bacterium can be any pathogenic, capable of growing in a host.
Or contains non-pathogenic bacteria. In a preferred embodiment, the bacterium is a pathogenic bacterium
is there.
As used herein, a host is any source that can be infected by bacteria.
(Including plant hosts and animal hosts). In a preferred embodiment, the host
Is a mammal.
As used herein, a non-viable bacterium cannot synthesize protein
Bacteria. In a preferred embodiment, the bacteria are heat-killed bacteria. I
However, according to the method of the present invention, the bacteria can survive by any method known in the art.
Can be disabled.
As used herein, the components of non-viable bacteria are lysates, homogenous
Or a cell fraction thereof (eg, a cell membrane-containing fraction).
Screen expression libraries for clones that respond to antisera
For this purpose, any technique known to those skilled in the art is useful. In a preferred embodiment, the anti-
Serum binding is detected with a secondary antibody bound to the detection means. Widely known in the art
Those of skill in the art will readily appreciate that a wide variety of optional detection means are useful. useful
Examples of such detecting means are shown above.
The following examples are provided so that the invention might be better understood. Examples of these
Is for illustrative purposes only and in any way limits the scope of the invention
It is not interpreted.
Example I-B . Construction and screening of burgdorferi expression library
A.Construction of expression library
We have constructed a B. elegans constructed in λZAP II by Stratagene (La Jolla, CA). bur
gdorferi genomic DNA expression library (T.T. Lam et al., Inf.
62, 290-298 (1994)). In short, the inventors have described B.S. burgdorferi strain N40 modified
Grow at 32 ° C. for 7 days in modified Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) II medium,
collected by centrifugation at pm for 30 minutes and lysed with SDS (A.G. Barbour, "Is
olation and Cultivation of Lyme Disease Spirochetes, "Yale J. Biol.Med.
, 57, 521-25 (1984)). Next, the inventors obtained genomic DNA from the spirochetes.
Isolated and purified it by phenol / chloroform extraction.
To construct the library, 200 μg of DNA was randomly sheared and S1
EcoR1 site was blunt-ended and methylated by EcoR1 methylase
. Next, an EcoR1 linker is ligated to the end of the DNA molecule, the DNA is digested with EcoR1, and
The fragment was purified by a sucrose gradient. Isolating a 1-9 kb fragment;
It was ligated to the EcoR1-digested λZAP II arm.
We have identified E. coli for phage infection. coli SURE bacteria (Stratagene)
Was prepared as follows. We have added 0.2% maltose and 10 mM magnesium sulfate.
Pick a single colony into LB medium supplemented and overnight at 30 ° C with vigorous shaking
Cultured. Next, we centrifuged the cells at 2000 rpm for 10 minutes and 10 mM
Resuspended in magnesium sulfate. Cells for bacteriophage infection
O.D.600= Further dilution to 0.5.
B.Anti-B. Preparation of burgdorferi antiserum
We have developed anti-B.D. To differentially screen expression libraries. bur
gdorferi N40 antiserum was prepared as follows.
1.Immune antiserum
We have found that "immunized" mouse anti-B. burgdorferi N40 antiserum as follows
Prepared. The inventors have determined that five 3-week-old female C3h / HeNCrMouse or J (C3H) mouse
Group 3-5, 10 in complete Freund's adjuvant (CFA)7Heat sterilization (60 ℃
B. for 1 hour) An inoculum of burgdorferi N40 was injected subcutaneously. The inventors have
Infect mice with the heat-inactivated preparation, or place in BSKII medium.
Spirochetes could not be cultured from the prepared preparations. So this is
Confirm that all heat inactivated spirochetes have been killed. The inventors are incomplete
B. in Freund's adjuvant (IFA). Week 2 with the same dose of burgdorferi and
Mice were boosted on the fourth week. Two weeks after the final immunization, the inventors
Sacrifice and blood collection and anti-B. By centrifuging the blood at 2000 rpm for 15 minutes.
Burgdorferi antiserum was isolated.
To eliminate antibodies in serum that recognize E. coli and phage proteins,
The inventors reported that antiserum was obtained using E. coli / phage lysate (Stratagene) as follows.
Was absorbed. We clarified the lysate with Tris-buffered physiologic with 0.05% Tween-20.
Diluted 1:10 in saline (TBST). Next, the inventors have developed a 0.45 μM pore size nitro
Cellulose filters (Millipore, Bedford; MA) in lysate for 30 minutes at room temperature
Incubate for 1 hour, remove, and filter out Whatman filter paper.
rnational Ltd., Maidstone, England) and 3 times with TBS (5 min each)
)washed. We filter the filters at room temperature with 1% bovine serum albumin in TBS.
(BSA) for 1 hour and blocked by rinsing 3 times with TBST. next
The inventors have diluted the mouse antiserum 1: 5 with TBST and combined it with the filter.
Incubate at 37 ° C with shaking for 10 minutes and remove the filter
, And discarded.
2.Infection antiserum
We added 10 C3H / HeJ mice to 10 mice.FourB. burgdorferi N40 spirochetes
Was injected by intradermal inoculation. We have found that the spleen, bladder,
And culture of spirochetes from the skin (ear punch) and
Histopathological examination of joints and heart for evidence demonstrated the infection. Departure
We collected serum from infected mice at various times after infection.
Both immune and infectious antisera have high titers of anti-B against whole cell lysates.
. burgdorferi antibody. The inventors found that immunized and infected mice
Antibodies in serum were diluted 1: 15,000 and 1: 10,000 by immunoblot, respectively.
And by ELISA at 1: 6400 and 1: 3200 dilutions. In addition,
Serum showed more B.I. Recognized burgdorferi antigen with different intensities
.
After absorption, we diluted the antiserum to a final dilution of 1: 100 and made it
Containing the expressed protein from the λZAP library according to the manufacturer's instructions.
Used to screen rocellulose filters.
C.B . Differential screening of burgdorferi N40 genomic expression library
To screen the library, we used the picoBlue immunoscreen.
A cleaning kit (Stratagene) was used. The inventors have followed methods well known in the art.
4x10 on the lawn of bacteriaFourPlaque recombinant phage in plaque forming units
Rate, induce protein expression with 10 mM IPTG, and
Transferred to duplicate plaque lifts on Lurose filters.
We immunized one set of plaque lifts with heat-sterilized spirochetes.
Incubated with a pooled serum (immune serum) from a murine mouse
The other group was inked together with serum (infected serum) from mice infected for 9 months.
Was added. After washing, the inventors filter the filter with a 1: 5000 dilution of alkaline phosphine.
Atase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Organon Teknika Corp., West Chester, PA)
With nitro blue tetrazolium (N
BT) (Stratagene) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) (Stratage
ne) was used. The inventors reacted with the infected serum but did not
Clones that did not react with the sera were selected.
Example II-p21 / k2 Operon cloning
B. Differential screening of burgdorferi N40 genomic expression library performed
As described in Example I, 172 clones reacting with serum from infected mice and
169 clones were identified that reacted with sera from immunized mice. Inventors
Used three phage clones differentially reactive with the two sera in another round of screening.
And the same results were obtained.
We infected and infected XL1-Blue E. coli cells according to the manufacturer's instructions.
One of these clones was rescued with 408 helper phage.
The pBluescript plasmid was cut out from (clone 1). Recovered plastic
Using the code, we have obtained T3 and T7 units to obtain the initial sequence of the plasmid.
Versal primers were used. From the initial sequence of 100-300 bp, we
Used to extend 100-300 bp sequence at a time until they get the whole sequence
New primers were made.
Alternatively, we have used the Erase-A-Base System (Promega, Madison, WI) (5 '
Use SmaI to generate blunt ends and BstX to generate 3 ′ overhangs
A nested set of deletions within the DNA insert of clone 1 was generated (using I).
Next, the inventors cloned the subclone into the Sequenase Kit (United States Biochemical
Corp., Cleveland, OH) and sequenced using MacVector (International B
The entire sequence was reconstructed using iotechnology, Inc., New Haven, CT).
The inventors have developed a Circumvent Thermal cycle Dideoxy DNA sequencing kit (New Eng
land Biolabs) was used to determine the nucleotide sequence of the plasmid insert. Degeneration
, Annealing, and extension conditions were 94 ° C for 30 seconds and 55 ° C for 20 seconds, respectively.
For 20 seconds at 72 ° C.
Analysis of the DNA sequence of the insert confirms that we have the complete sequence with the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Open reading frames and partial open reading frames
It was revealed that a clone containing was isolated. The inventors have used Genetics Compute
r Group Program (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, W
I) GenBank (December 1994) search was performed. Inventors search for new
Normal bicistronic B. that the burgdorferi operon was isolated
Revealed. We name the complete open reading frame p21
And the partial open reading frame was named k2. The inventors
, The antigens encoded by the two genes in the operon are designated P21 and K, respectively.
Named 2.
Example III-p21 / k2 Operon sequence analysis
As shown in SEQ ID NO: 1, the p21 gene has 182 amino acids at the 5 'end of the operon.
546 nucleotide open reads that can encode the acid protein (SEQ ID NO: 2)
Including frame. The deduced amino acid sequence of P21 shows cleavage and lipidation (lipidati
on) contains a representative prokaryotic signal sequence for post-translational processing,
This suggests that this gene product is a lipoprotein of about 20.7 kDa
. P21 is B. burgdorferi OspE with 71% amino acid sequence identity (
(FIG. 7).
The ATG start codon for the k2 gene is 27 nucleotides of the TAG stop codon of the p21 gene.
It is located downstream of Otide. The k2 gene in clone 1 contains the first 10 amino terminal amino acids
Partial open nucleotide of 32 nucleotides capable of encoding acid (SEQ ID NO: 3)
Including frame. However, based on the last two nucleotides of the K2 sequence of SEQ ID NO: 3,
In other words, the 11th amino acid must be valine. Therefore, in this specification
As used, the K2 polypeptide comprises a polypeptide comprising the 11 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
Is a peptide. The amino terminal amino acid of K2 is 64% homologous to the amino terminal sequence of OspF
It is. Therefore, we have found that the full-length protein encoded by the K2 gene
We expect to have similar homology to the full length OspF protein.
The common ribosome binding site having the sequence -GGAG- (Shie-Dalgarno sequence) is
Located 10 bp upstream of the start codon. Further upstream of this translation initiation sequence is "-10".
Region and the promoter segment known as the "-35" region.
Is E. coli and other B. Similar to the sequence found in the burgdorferi gene
. (See FIG. 8 for a comparison of these regions between the various B. burgdorferi genes.
Teru. ) A further ribosome binding site having the sequence -GGAG-
Located 11 bp upstream of the G start codon. The arrangement of these sequence elements depends on p21 and
And that both genes k2 and k2 are controlled by a single promoter. OspE
P21 and K2 homology to OspF and OspF, and to the bicistronic operon
These arrangements in the sequence indicate that recombination events have occurred between these genes at the time of recent evolution.
Suggests the most likely occurrence.
Encoded by the p21 gene, like OspA, OspB, OspD, OspE, and OspF.
The resulting protein appears to be a surface lipoprotein. As shown in SEQ ID NO: 2
As such, this protein begins with a basic N-terminal peptide of 5 amino acids,
Leader peptides found in typical prokaryotic lipoprotein precursors (
M.E. Brandt et al., Supra, and C.H. Wu and M.S. Tokunaga, "Biogenesis of Lip
oproteins in Bacteria ”, Current Topics in Microbiology and Immunology,
125, 127-157 (1986)) corresponding to the amino-terminal hydrophobic domain of about 20 amino acids.
Continue.
The carboxyl terminus of the hydrophobic domain is probably burgdorferi signal
Includes a cleavage site recognized by the peptidase. P21 as in OspF
And the potential cleavage site is Ser17And Cys18Located between.
Representative bacterial lipoproteins recognized and cleaved by signal peptidase II
The consensus sequence of cytoplasmic precursors is Leu, usually separated by two small neutral amino acids.
And Cys (CH Wu et al., Supra). In fact, B. OspA and burgdorferi B31
And OspB genes contain signal sequences -L-I-A-C- and -L-I-G-C-, respectively.
(S. Bergstrom et al., "Molecular Analysis of Linear Plasmid-Encoded Major Su
rface Proteins, OspA and OspB, of the Lyme Disease Spirochaete Borrelia
burgdorfer ", Mol. Microbiol., 3, 479-86 (1989)).
In contrast, B.I. The signal sequence of the burgdorferi N40 p21 gene (-L-I-S-S-C-)
, OspE (-L-I-G-A-C-), OspF (-L-I-V-S-C-), OspC-PKo (-L-F-I-S-C-),
Yo
And OspD-B31 (-L-S-I-S-C-) gene, as well as the two between leucine and cysteine.
Contains three amino acids instead of one. (R.S. Fuchs et al. And S.J.N.
orris et al. (supra)). However, this mutation in the signal sequence
Nevertheless, OspA, OspB, and OspD have been established [ThreeH] palmitate sign hand
Are shown to be lipoproteins (M.E. Brandt et al., And
.J. Norris et al. (Supra)). The leader signal sequence of P21
Suggests that surface proteins can be processed as lipoproteins as well
. The addition of a lipid moiety at the cysteine residue results in protein
Can help anchor quality (H.C. Wu and M. Tokunaga, supra)
See).
Finally, P21 is a long stretch separated by short stretch hydrophobic segments.
Contain hydrophilic domains.
Comparison of DNA sequences shows that p21 and ospE are closely related, whereas burgdorferi geno
Within the system, identical -35 and -10 promoter sequences and ribosome binding sites
Are different genes having The 5 'upstream region of p21 and ospE contains the sequence
Upstream from the determined -10 sequence to the 5'-flanking DNA boundary (189 nt 5 'of ATG)
(FIG. 7). A difference of only 8 nucleotides between p21 and ospE indicates a -10 region
Region and the region between the ATG start codon. ATG when compared to p21
Upstream, the following differences are observed in ospE: -54, G; -45, C: -32, T; -3
0, G; -24, A; -15, C; -6, T; -3, C (where -1 is A in the ATG codon)
). All of the differences are probably located in the region containing the 5 'untranslated region of p21 mRNA.
Given this homology between P21 and OspE, those skilled in the art will recognize therapeutic compositions and diagnostics
Select P21 epitopes that do not cross-react with OspE in formulating disruptive compositions
Understand that it may be desirable to do so.
Example IV-Cultured B. Northern blotting of p21 expression in burgdorferi Analysis
To determine whether p21 is transcribed during in vitro culture of spirochetes
We evaluated its expression by Northern blot analysis. The inventors have
acid
Cultured by extraction with neutral guanidium thiocyanate / phenol / chloroform
B. Total RNA was isolated from burgdorferi (reference). We have 1% formal
Biotinylated p21 plates using the Limer Biotin Labeling Kit (New England Biolabs)
Lobe and ospA probes (control) were generated. p21 and ospA probes
Contained the complete p21 and ospA sequences, respectively. The inventors have found that random
Amplified PCR production of p21 or ospA as template for kutamer primed labeling reaction
The thing was used.
Hybridization and signal detection were performed. Briefly, the inventors disclose
Pre-hybridized membrane in SSC at 68 ° C. for 1 hour and p
At 68 ° C using a biotinylated probe for 21 or ospA (control)
Hybridized overnight. The inventors used 0.1 × standard saline as the membrane.
Washed at 68 ° C. with a final stringency of water citrate (SSC) /0.1% SDS.
The inventors have proposed a biotin-labeled probe using streptavidin,
A series of incubations with rephosphatase and lumigen-PPD
Was detected.
The inventors have determined that cultured B. burgdorferl detects ospA RNA but not p21 RNA
Was.
Example V-Cultured B. Southern dot blot analysis of the burgdorferi genome and PCR
B. In vitro culture of burgdorferi often results in gene or plasmid loss.
Associated with loss (cited by reference), we used dot blot analysis and
B. cultured using PCR. The burgdorferi genome was examined to determine if the p21 gene was present.
RNA was cultured for B. northern blot analysis (described in Example IV). burg
Obtained from dorferi.
A.Southern dot blot analysis Denatured λ phage (control) DNA or cultured B. burgdorferi DNA
Spotted. The inventors first used ethidium bromide to dry the dried membrane.
And it was confirmed that an equal amount of DNA was present. Then, the inventors
With the p21 and ospA probes described in Example IV for blot analysis.
Hybridized. Both probes are B. Strongly high on burgdorferi genomic DNA
Hybridized but did not hybridize to bacteriophage DNA. This
This was cultured B. Ensured the presence of the p21 gene in burgdorferi.
B.PCR analysis
The inventors have determined that cultured B. 10 ng of genomic DNA from burgdorferi
PCR was performed using the following primers. The inventors have set out SEQ ID NO: 11 and
And the 5 'and 3' primers shown in SEQ ID NO: 12 were used. these
Primers are specific for p21 and do not amplify ospE. Inventors
Indicates that the cultured B. The following conditions were used for PCR of burgdorferi DNA: 94 ° C. 1
Min, 65 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes (denaturation temperature, annealing temperature, and
And elongation temperature) for 30 cycles.
Using these primers, we performed a 513 bp PCR of the coding region of p21.
The product was obtained. This is because the p21 gene was used in culture B used for Northern blot studies.
. It further ensured that it was present in the burgdorferi genome.
Example VI-B . Examination of p21 expression in ticks by burgdorferi
P21 is a B.I. whether it is expressed by burgdorferi
In order to determine, we found that flat ticks containing spirochetes and full
Tick lysates were examined by indirect immunofluorescence assays. Using the same method,
Those skilled in the art will recognize other novel B.I. burgdorferi polypeptide is expressed in ticks
Can be easily determined without undue experimentation.
Briefly, the inventors have described B.S. burgdorferi N40 infected ticks until full
Blood was sucked from He mice. The inventors have found that ticks that have not sucked blood and full
Mites are gently homogenized in 100 μl PBS and 10 μl aliquots are silyl
And spotted on a glass slide. The inventors allowed the slides to air dry and
And fixed them with 4% paraformaldehyde and saponin. The inventors
Immunized with the P21 specific peptide prepared in Example VII (shown in SEQ ID NO :)
Specimens were incubated for 1 hour in antiserum (1:10 dilution) from infected mice
. We washed the slides and used FITC-conjugated anti-mouse IgG (1: 500
Rare
The slide was observed below. The inventors considered that no blood was sucked as a positive control.
B. in a tick Spirochetes in ticks that recognize burgdorferi but are full of ticks
An anti-OspA monoclonal antibody CIII.78, which is not easily detected, was used (De Silva et al., (
1996)). We used flat ticks and bulls as a second positive control.
B. in both flooded ticks. anti-flagellin that recognizes burgdorferi (reference)
The monoclonal antibody H9724 was used. We used anti-B as a negative control.
SA serum was used.
Consistent with previous studies, spirochetes were found to be flat and full of ticks.
Easily detected by both flagellin-specific monoclonal antibodies
However, an OspA-specific monoclonal antibody detected spirochetes in flat ticks.
However, it was not detected in the overfilled tick. But flat ticks
No p21-specific immunofluorescence was detected in any of the overfilled ticks.
To confirm that a p21-specific antiserum can react with p21, we
The recombinant P21 or recombinant OspE prepared in Example 12 was probed using
did. As expected, the p21 antiserum readily recognized recombinant p21 but did not recognize OspE.
Did not recognize. These results indicate that p21 is also expressed in infected ticks
Indicates no.
Example VII-Dot immunoblot analysis of p21 expression in infected mice and And RNA-PCR confirmation
A.Dot immunoblot analysis
The inventors then proceed to B.I. p21 expression in mice infected with burgdorferi
Indicates the presence of antibodies to p21 in sera from two infected mice.
Confirmed by doing.
We compared the amino acid sequences of p21 and OspE and found that amino acids unique to p21
A region of p21 containing noic acids 31-40 was selected. The inventors have found that Quality Control Biochem
peptide bound to bovine serum albumin (BSA) to icals (Hopkinton, MA)
Was completed. (Cysteine is added to the amino terminus of the peptide for the BSA binding reaction
did). The amino acid sequence of the peptide is set forth in SEQ ID NO: 13.
The inventors have determined that 3 μg of BSA or a synthetic p21-derived peptide conjugated with BSA
Spotted on cellulose membrane. The inventors have prepared a dried membrane
B. killed by heat Serum or infected mice from mice immunized with burgdorferi
Incubated with any of the sera from the origin. The inventors have found horseradish peroki
The antibody bound by incubation with the secondary antibody bound to the
Detected (ECL Western blot detection system, Amersham). Finally, the inventors
Stain the membrane with amide black and ensure that equal amounts of protein
Indicated that it was present in the pull.
Serum from infected mice reacted with the P21 peptide but was killed by heat. burg
Sera from mice immunized with dorferi did not react. Therefore, p21 is
It is selectively expressed in cells.
B.RNA PCR
The inventors used RNA PCR to detect p21 expression in infected mice using p21 RNA.
To demonstrate further. The inventors have found that acidic guanidium thiocyanate /
Nol / chloroform extraction (Micro RNA Isolation Kit, Stratagene)
And, through tick transmission, total RNA from the spleen of mice infected with burgdorferi,
Then, B. cultivated in vitro. RNA was isolated from burgdorferi. We have 5
B. Mice were allowed to suck blood until burgdorferi N40 infected ticks were reddened. Any
To remove residual DNA, we used 10 μg of pooled RNA with RNase.
3 hours at 37 ° C with HPRI and Rnase inhibitors in DNase (Promega) without
For a while. We used RNA PCR with and without reverse transcriptase.
Performed to eliminate the possibility that residual DNA could also be amplified. The inventors have
Ronnie mouse leukemia virus reverse transcriptase (Stratagene) and p21 (mouse tissue
You
And cultured B. burgdorferi), γ-actin (mouse tissue control),
Or ospA (cultured B. burgdorferi control)
CDNA was synthesized by reverse transcription using a mer. Subsequently, the inventors proceeded at 95 ° C for 5 minutes.
The reverse transcriptase was inactivated by heating for a while. We then proceed to p21,
Add 5 'primer for γ-actin, or ospA and add 5 min at 94 ° C for 5 min.
Forty-five cycles of PCR were performed at 5 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 2 minutes.
We found that the 513 bp product from P21 RNA PCR only in the presence of reverse transcriptase
I got To ensure the identity of the amplified product as p21, we used R
Then, the Northern blot analysis was performed with the p21 probe described in Example IV.
It was bridged. Without reverse transcriptase, the absence of products
As a result, it was confirmed that the DNA was not amplified. We adjusted from uninfected mice
B. cultured from RNA isolated or in vitro. p21 specific from burgdorferi RNA PCR
No amplification with the target primer was obtained.
Example VIII-p35 Analysis of p37 and p37 genes
The inventors found that B. killed by heat. Mice immunized with burgdorferi and surviving B. burgdorferi b
performed except that serum from mice infected with urgdorferi for 90 days was used.
Exactly as described in Example I, λZap II B.I. burgdorferi expression library
Screening. The inventors have found that antiserum in infected mice
Serum from mice immunized with spirochetes that reacted with the body but were killed by heat
Fourteen phage clones that did not react with the antibody were identified.
We selected two of the clones that reacted strongly with the infectious antisera and selected plasmids
Was excised and the insert was sequenced as described in Example I. One Insert
The product is an open-ready 927 nucleotides encoding a 309 amino acid protein.
Includes framing frames. (SEQ ID NO: 5). The present inventors, Genetics Computer Grou
p Program (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI)
A search of GenBank (July 1995) was performed using the search. The search for inventors was done by the inventors
New B. burgdorferi gene (named p35)
I made it clear. We named the antigen encoded by the gene P35
Was.
The other insert is a 996 nucleotide aurora encoding a 322 amino acid protein.
Includes pun reading frame. (SEQ ID NO: 7). GenBank (July 1995)
Are searched by the inventors for a second new B.I. The burgdorferi gene (the inventors believe that p37
Was isolated. We code by that gene
The antigen used was named P37.
As is evident from SEQ ID NO: 7, the predicted amino acid sequence of P37
Lipoproteins similar to leader peptides found in eukaryotic lipoprotein precursors
2 shows a leader peptide. Ser at the carboxy terminus of the hydrophobic core19And Cys20Submerged between
There is a potential signal peptidase II cleavage site. But P35, Leu and Cys
Has a potential cleavage site with five amino acids intervening between. This is
Not suitable for poprotein. To confirm that P35 is a lipoprotein
We need to look for further evidence. Finally, P37 has a short hydrophobic segment.
Long hydrophilic domains that are separated. Hydrophilicity of P35 and P37 shown in FIG.
The sex profile suggests that both are hydrophilic proteins. The inventors
, -35 and -10 regions and above each open reading frame
The ribosome binding site of the stream was identified.
Example IX-p21 . Mapping of p35 and p37 genes
The inventors have proposed M.S. Ferdows and A.G. Barbour, '' Megabase-Sized Linear DNA
in the Bacterium Borrelia burgdorferi, the Lyme DieaseAgent ", Proc. Nat
l. Acad. Sci., 86, pp. 5969-5973 (1989).
All B. By pulse field electrophoresis (PFGE) using burgdorferi N40 DNA
The p2L p35 and p37 genes were mapped. Briefly, we have about 10FiveB
. DNA plug containing burgdorferi N40 is treated with sarkosyl and treated with proteinase K
Lyse overnight, then chromosomal DNA and plasmid DNA in 0.8% agarose gel
ad Laboratories, Richmond, Calif) using Tris-borate-EDTA (TBE) buffer
In a liquid (0.025M Tris, 0.5mM EDTA, 0.025M boric acid) at 14 ° C for 18 hours at 198V.
The DNA was electrophoresed using a ramped pulse time of seconds to 30 seconds. B. bu
For two-dimensional electrophoresis of rgdorferi DNA, we turned 90 ° and
Electrophoresis was performed again at a constant voltage of 80 V for 6 hours.
The inventors have proposed a pulse field B.R. burgdorferi DNA with nitrocellulose membrane
Transferred to Len and probed with PCR amplified radiolabeled p21, p35, p37 probes.
We used p30, ospA, and o as controls in Southern blots.
sp
Using dom primer kit (Stratagene), [a-32P35 probe labeled with [P] dCTP
And 37 probes were generated.
As expected, the ospA and ospD probes were 49 kb and 49 kb, respectively.
(A.G. Barbour and C.F.G.)
aron, “Linear Plasmids of the Bacterium Borreliaburgdoferi Have Covale
ntly Closed Ends ", Science, 237, pp. 409-411 (1987) and S.J. Norris et al.
(See above)). The p30 probe identified the chromosome. Full length p21 probe in 3 positions
Bound, but the p21-specific probe (SEQ ID NO: 14) recognized the circular plasmid
. The P35 probe appears to migrate with the same mobility as the approximately 42kb linear plasmid
Bound to plasmid. P37 probe has the same mobility as the linear plasmid of about 16kb
Bound to the plasmid which appears to move.
Example X-p35 Or cultured B. for p37 expression. Analysis of burgdorferi
To determine whether p35 or p37 is transcribed in vitro, we
Performed the same analysis as shown in Examples IV and V. 5 'standard used for PCR analysis
And 3 ′ primers were compared to SEQ ID NOs: 15 and 16 (for p35) and SEQ ID NO: 17
And 18 (for p37).
The results of these analyzes confirm that p35 and p37 are transcribed in vitro
You.
Example XI-P in infected mice by immunoblot analysis and RNA-PCR 35 Confirmation of expression and p37 expression
We used the dot blot and RNA PCR methods used in Example 6 and
The same primers as those used in Example 9 were used. We believe that p35 and p
37 was confirmed to be expressed in infected mice. Therefore, p35 and p37
Is selectively expressed in vivo.
Example XII-p21 , P35, and P37 polypeptide expression
The novel B. of the present invention. To express the burgdorferi gene, we used pMX vector
Was used. This is a glutathione S-transferase fusion protein
Can be directed to the expression of the cloned insert as described in (J. Sears et al., "Molecular
Mapping of OspA-Mediated Immunity to Lyme Borreliosis. " Immunol., 147,
1995-2000 (1991)). The PMX vector also contains thrombin immediately after the GT protein.
Includes cleavage site. Therefore, recover recombinant protein without GT fusion partner
I can do it.
We have found that the P37 gene lacking the sequence encoding the hydrophobic leader peptide
PCR was first used to amplify. We have found that the polypeptide is lipotan
To ensure that it is expressed as a soluble fusion protein rather than as a protein
I chose to delete that sequence. It is either fixed to the cell membrane or
Can aggregate anywhere within the cell during or after biosynthesis.
To facilitate subcloning, we have added additional restriction enzyme digestion sites.
The gene was amplified using primers having The inventors have further developed BamHI
5 'primer having a Hind III site and a 5' primer having a Hind III site (SEQ ID NO:
21 and 22) were used to amplify the p21 gene. We have further XhoI restriction
5 'primer with enzyme digestion site and 3' primer with supplemented HindIII site
The p35 gene was amplified using the immers (SEQ ID NOs: 23 and 24).
We have developed a 5 'primer with additional BamHI restriction enzyme digestion site and a complement.
Using a 3 'primer with a filled XhoI site (SEQ ID NOS: 25 and 26)
The gene was amplified. We use R408 helper phage as gene template
Then, 50 ng of plasmid DNA excised from the first phage colony was used.
We performed the following PCR for 30 cycles: initial template denaturation at 94 ° C. for 1 minute,
Annealing at 40 ° C for 2 minutes and elongation at 72 ° C for 3 minutes.
We used amplified gene products as BamHI (p21), XhoI and BamHI (p35) or Hi.
digest with ndIII and XhoI (p37) and clone into the corresponding site of the PMX plasmid.
It has become The inventors then proceeded to transform Escherichia coli DH5α.
The ligation reaction was used according to methods well known to those skilled in the art. The inventors have found that
A colony containing the recombinant plasmid on Luria broth supplemented with phosphorus was isolated and
And cultured the cells.
We allowed the transformed bacteria to grow to log phase and produce 1 mM isopro
By adding pill-1-thio-β-galactoside (IPTG) for 3 hours, glutathione was added.
Expression of the gene as an on-S-transferase fusion protein was induced.
Those skilled in the art will be able to follow the techniques described above without undue experimentation. burgdor
Feri polypeptides can be readily expressed.
Example XIII-Purification of recombinant fusion proteins
After inducing protein expression as described in Example XI, the inventors set out E. coli. coli
Are placed in phosphate buffered saline (PBS) containing 1% Triton and
Was subjected to sonication. The inventors have determined that glutathione S-transferase-B. b
urgdorferi polypeptide fusion proteins (GT-p21, GT-P35, GT-P37, and GT-M
30) was purified from cell lysates as follows.
The inventors centrifuged at 1000 × for 8 minutes to separate the cell supernatant and the pellet.
Isolate and contain the recombinant fusion protein according to the manufacturer's instructions.
The clarified was passed through a glutathione-Sepharose 4B column (Pharmacia). Inventors
Elute the fusion protein from the column using a solution containing excess glutathione
And quantified using the Bradford assay.
In addition, B.A. burgdorferi tan
To purify the protein, we used glutathione S-transferase fusion.
The combined protein was loaded onto a glutathione-Sepharose 4B column and the recombinant B.A. burg
Add 25 units of thrombin to cleave the dorferi protein from GT,
And incubated overnight at room temperature. The inventors then proceeded with 50 mM Tris-CaClTwo-Na
Elute the protein with Cl, treat the eluate with anti-thrombin beads for 1.5-2 hours,
Then, it was centrifuged at 13,000 rpm.
Those skilled in the art will use these procedures to perform other novel methods of the present invention without undue experimentation.
B. It is understood that burgdorferi polypeptides can be easily purified.
Example XIV-B. of the present invention. Preparation of antibodies to burgdorferi polypeptide
The present inventors have proposed a novel B.I. for burgdorferi polypeptides
Antibodies were produced. We have 14 and 28 days according to published protocols
Eyes on C3H / He mice (Frederick Cancer Research Center, Frederick, MD)
Results in 10 micrograms of GT-p21, BSA in complete Freund's adjuvant (CFA).
Skin with either the combined P21-specific peptide of SEQ ID NO: 13, GT-P35, or GT-P37
Immunize down and add with equal amount of antigen in incomplete Freund's adjuvant (IFA)
Immunized. We used control mice in a similar fashion to recombinant glutathione.
Immunization with either S-transferase or BSA.
Fourteen days after the final boost, we collected serum from the immunized animal and
Using it, recombinant GT-p21, BSA binding p21 specific peptide, P35 polypeptide
Or P37 polypeptide to a Western blot of an SDS-PAGE gel
I did it.
Recombinant P35 and P37 elicit antibodies in mice, which are rare up to 1: 5000.
Could be detected by immunoblotting. We also detect binding by ELISA
did.
Example XV−Isolation of full-length K2 polypeptide
The full-length K2 polypeptide and the DNA encoding it can be obtained by various methods available to those skilled in the art.
Can be isolated. For example, raising the peptide shown in SEQ ID NO: 3
Using the isolated antiserum for B.A. bur
gdorferi expression libraries can be screened. Alternatively, an expression library
-B. A smaller fragment of burgdorferi DNA is inserted into the expression vector.
Cloned in the frame from which they are glutathione S-transferr
It is expressed as a fusion protein (eg, pGEX-2T, pMX, or pGEMEX).
It can be configured as follows. Such libraries are described in E.I. In E. coli,
Sequence as a fusion protein, even when successfully linked to a non-promoter
Highly likely to be expressed.
Alternatively, the DNA encoding the peptide shown in SEQ ID NO: 3 is a small cDNA library.
The basis for oligonucleotide probes to screen libraries
Can be used.
Example XVI-New B. Characterization of the immune response to burgdorferi polypeptide
A.Mouse humoral response
B. of the present invention. To characterize an immune response to a burgdorferi polypeptide,
We have 10FourB. burgdorferi N40 by intradermal inoculation or burgdorf
eriN40 infection I. Tick transmission using scapularis ticks (Harvard School of Tro
pical Public Health) infected C3H / He mice. For tick transmission research
In addition, the inventors have described B.S. Exposing mice to five ticks infected with burgdorferi N40
did. The inventors let the ticks feed on blood until satiety, and then put them on a water bath for testing.
They were recovered.
The inventors found that from infected mice, 7 days, 14 days, 30 days, 90 days, and
And 180 days later serum was collected. The inventors used the sample for clot formation.
Tubes were stored overnight and serum was isolated by centrifugation at 900 g × for 30 minutes.
The inventors then used serum to purify the purified GT-p21, a BSA-binding p21-specific peptide, GT-P
Used in ELISA with 35 or GT-P37 polypeptides as follows:
Was.
The inventors have used duplicate sets of 96-well microtiter plates in various recombinant formats.
And coated with 200 micrograms {1 μg / ml, 200 ml / well}
And incubated overnight at 4 ° C. To prevent non-specific binding, the inventors
Blocked for 1 hour with 100 μl / ml 10% fetal bovine serum in PBS. The inventors have
The plate was washed three times with 0.05% PBS Tween (PBST). The inventors have identified three serum samples.
Step
(200 microliter / well, diluted 1: 100)
And incubated at room temperature for 1 hour / 4 ° C. for 8 hours. Then the inventors
Wash the plate three times with PBST and add to each well goat anti-mouse IgM or yeast.
Giant anti-mouse IgG (diluted 1: 2000 each and conjugated to alkaline phosphatase
Was added. We incubated the plate for 1 hour at room temperature,
And washed three times with PBST. Eventually, we will add 200 microliters to each well.
Tol's freshly prepared p-nitrophenol phosphate in glycine buffer (pH 10.5)
1 mg / ml) was added and the color change was monitored at 405 nanometers. Inventors
Stopped the reaction with 3M NaOH.
As early as 14 days after infection, the inventors have developed antibodies to both P35 and P37.
Detected at high titer. Response peaks 30 days after infection, 60-90 days after infection
Decreased later and almost disappeared by 180 days. P21 specific antibody 28 days
Appeared in the mouse serum in the eyes and persisted throughout the infection process.
One of ordinary skill in the art would be able to utilize the procedures taught herein without undue experimentation and
Facilitates mouse humoral response to other novel b.burgdorferi polypeptides of the invention
Can be measured.
B.Human humoral response
We have also characterized human immune responses to P21, P35, and P37 proteins.
I charged. For the study of p21, we found 82 tests from the Yale Lyme disease clinic.
Centers for Disease Control: CDC
) Obtained serogroups of 40 patients. Clinical symptoms demonstrated by the physician
B. burgd according to early or late Lyme disease based on CDC and CDC defined disease criteria
orferi were classified as having serum antibodies. Patients who donated samples to CDC
More than 60% of patients have B.I. Culture positive for burgdorferi
Was. Patients from Yale clinic do not routinely test for infection by culture
Was.
The inventors used serum-based recombinant GT-P21, BSA-binding p21-specific
Used in SA. We found that 20 of the 82 sera from the Yale clinic
(24%) have IgG antibodies to recombinant p21, and 8 of these 20
They also found that they also have anti-p21 IgM antibodies. Of the 20 sera with anti-p21 antibodies, 4
One had an IgM antibody and 16 had an IgG antibody. These antibodies are p21 specific
Binds to peptides. We found that 13 out of 40 sera from CDC (33%) had P
It was found to have an IgG and / or IgM antibody to 21. These 13
Of the sera, 11 had IgG antibodies and 4 had IgM antibodies. these
Antibodies bind to p21-specific peptides. In general, the inventors have identified
IgM responses were detected for patients with interstitial Lyme disease. The inventors have been from three months
IgG anti-virus in 56% of patients with long-term illness and Lyme disease
Body detected.
For the studies of P35 and P37, we found that 40 blood
Qing and Yale Clinic and Connecticut Agricultural Research Agency (Agricultural Rese
arch Station) of 25 additional specimens with Lyme disease recorded in detail
Serum from the patient was used.
We used goat anti-human IgG and goat anti-human IgM as secondary antibodies,
Serum was used in ELISA with recombinant GT-P35 and -P37 as described above
.
We have found that all sera from CDC have an IgG response to P35 and dried 37
I found that. Due to the high reactivity to recombinant P35 and A37, we
Is the clinic of the inventors and Yale University Medical School and Conn.
A well-documented Lyme disease found in the Lyme disease lab at
Serum from an additional 25 patients was tested. Of these, 22 sera
Had an antibody response to P35, and 20 sera had an antibody response to P37
.
Example XVII-B.burgdorferi Novel B. to protect against infection burgdorfer i Polypeptide capabilities
The novel B. of the present invention. burgdorferi polypeptide is a B. burgdorferi polypeptide. against burgdorferi infection
To determine whether an immune response that is effective to protect can be elicited,
The authors reported that C3H / He mice were replaced with 10 micrograms of recombinant GT-P35 or
Active immunization subcutaneously with a recombinant GT-P37 polypeptide and following published protocols
Therefore, active boosters were given on days 14 and 28 with the same amount of antigen in IFA. invention
They immunized control mice with recombinant GT in a similar manner. Then invention
They used immunized mice as B.I. burgdorferi N40.
The inventors have described B.S. burgdorferi N40 low passage isolate in C3H / He mice
Grown in BSK II medium to log phase at 33 ° C.
The cells were counted by a hemocytometer under a dark-field microscope. The inventors have been actively immunizing
MouseFourA final booster was given by intradermal inoculation of spirochetes.
The original dose was administered and sacrificed 14 days after infection.
In slaughter, we aseptically used blood, spleen, bladder, and ear punches.
Harvest, tissues were cultured in BSK II medium for 2 weeks, and dark field for spirochetes
Observed under a microscope. At the same time, we dissected, fixed in formalin, and
Raffin embedded and then the joints and heart were examined for inflammation. invention
They blindly tested the heart and cervical tarsus. We have found that neutrophils and phosphorus
Arthritis was characterized by edema and synovial infiltration at the papule. We have found that the aorta
Carditis was characterized by the presence of inflammation, myocarditis, or pericarditis.
Preliminary results obtained using these methods indicate that P35 or P37 may provide protection
That was shown.
Example XVIII-Defense against tick-borne transmission
The inventors have also noted that the novel B.I. burgdorferi polypeptide, spiroche
Eliciting an effective immune response to defend against tick-borne transmission of foxes
Was measured. We maintain a laboratory colony from the Ipswich, MA population.
Harvard School of PublicHealth from Ixodes damm without spirochetes
ini got a tick. We have 10ThreeB. Intradermal inoculation of burgdorferi N40 spirochetes
Outbred CD-1 virus previously infected (3 weeks before use as host)
By allowing the ticks to feed the ticks up to satiety,
) Infected. When full, we collect the larvae that have sucked blood to fill the body cavity.
, Pool them in groups of 100-200 and put them at 21 ° C and 95% relative humidity
Moulted to nymph stage. The inventors estimated the incidence of infection in each pool as a representative
3 weeks after moulting by immunofluorescence of a typical sample (10 ticks)
. We have identified pools with infection rates greater than 70% for challenge experiments.
Only used.
The inventors have determined that GT-P35, GT-P37, or both, as described in Example XVII,
Mice were actively immunized with GT-P21 or GT (control). Final booster
Two weeks later, we placed 5/15 infected nymph ticks on each mouse and let the ticks become full.
, And then the ticks were allowed to separate naturally on the water. Two weeks later, the inventor
Killed mice and cultured tissue for spirochetes, as described above,
And the organs were tested.
Immunization with GT-p21 did not protect mice from infection or disease. Conte
Each mouse and treatment group in the roll express specific antibodies at a titer of at least 1: 5000
did. This is the case, for example, in the case of protective antibodies such as OspA (Fikrig et al., 1992).
Has been found to be sufficient to protect mice from infection and disease.
Mice were challenged with spirochetes at the time of peak antibody titers (the last boost
One week later). It is possible that p21 is not expressed abundantly in the early stages of infection. Departure
The authors suggested that if p21-specific antibodies could be expressed in very small amounts, P21 28 days after infection
Specific antibody expression was indicated. Immunization with p21 is well protected in mice
Not produce sufficient antibodies or p21 is expressed in sufficient amounts on the surface of the spirochetes
It is also possible to make them vulnerable to antibody-mediated killing.
Example XIX-Reduced spirochetal load in ticks feeding on immunized animals
Previous studies have shown that immunization of mice with recombinant OspA could
(See E. Fikrig et al., "Eliminatio").
n of Borreliaburgdorferi frovector ticks feeding on OspA-immunizedmice ''
Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 5418-5421 (1992)). Therefore, infected Madani
When blood is sucked in an animal immunized with the novel B. burgdorferi polypeptide of the invention,
To determine if spirochetes are also killed, we will:
Test.
The inventors found that five Ixodes dammini mice infected as described in Example XVIII
Mites were immunized with 12 control mice immunized with GT or 12 mice immunized with GT-P21.
Are placed in each of the two mice. After sucking blood to fullness, ticks spontaneously sit on the water.
Falling (detached). Only some ticks were recovered from each group and the rest were
Seems to have been fed. Ten days after satiety, we placed in a 1.5 ml microcentrifuge tube.
Homogenize individual ticks in 100 μl of PBS and transfer 3 slides
A 10 μl aliquot was spotted on each. The inventors allowed the slides to air dry,
Fix for 10 minutes in cold acetone and assay by direct or indirect immunofluorescence.
I did.
For direct immunofluorescence assays, we used a 1: 100 dilution of FITC binding
Incubate and cover slides with heron anti-B.burgdorferi N40 antiserum
The inventors have determined the number of fluorescent cells in approximately 20 fields per slide.
Spirochetes were quantified by counting. B.burgdorferi infection rate is exempt
Tick that sucked blood from infected mice and tick that sucked blood from control mice
Was similar. This indicates that immunization with GT-p21 does not protect against infection.
Show.
One of skill in the art will appreciate the effects of immunization with other novel B. burgdorferi polypeptides of the present invention.
Can be easily determined without undue experimentation using the methods taught herein.
Understand what can be done.
Example XX-Passive immunization of mice with anti-P35 or anti-P37 antiserum
Antiserum from animals immunized with recombinant B. burgdorferi polypeptide provides protection
In order to determine whether or not it is possible, we use 0.2 ml of GT-P35,
Mice were passively immunized with 35 / P37 antiserum. Then, one day after immunization
To 10FourImmunized mice were challenged with B.burgdorferi N40.
Preliminary results indicate the frequency and disease of B. burgdorferi infection in passively immunized mice
Indicates that the course of the test was similar to that in control mice.
In another study, the inventors added three groups of five scid mice to 10 groups.ThreeB.burgd
orferi, inoculated with 40, then GT-P21 immunized mice, GT immunized mice, or 90 days
0.5 ml of antiserum (diluted 1:10) from any of the eye-infected mice after inoculation
Injections were made on days 1, 4, 8, and 12. We sacrificed the mice on day 15 and
The blood, bladder, spleen, and skin from the inoculation site were cultured in BSK II medium
. We also tested the tibialis tarsus and heart of each mouse for inflammation. p21
Infection and disease rates in mice passively immunized with antisera were controlled
Similar to the ratio in mice. Day 90 from B.burgdorferi infected mice
Mice passively immunized with antisera were substantially protected from infection. Also, those skilled in the art
Understands that various experimental conditions can be used to detect a protective effect.
For example, antisera can be obtained by immunization with a recombinant polypeptide without GT,
If the titer is higher, the antiserum may be collected at different times or may be received with more antiserum.
Immunize, reduce spirochetes doses, or use other known in the art.
The following measures can be taken.
Example XXI-Additional Clones of B.burgdorferi Polypeptide Expressed In Vivo Or
We found that two additional screens generated by the screening described in Example 1.
A preliminary analysis of the clones was performed. We identified those clones as V1 and V
Called 3. The inventors have developed pV1 and pV3, including V1 and V3, respectively, in May 1996.
American Type Culture Collection on March 7, 12301 Parklawn Drive, Ro
Deposited with ckville, MD. Clone V3 was sequenced (SEQ ID NO: 10). Those skilled in the art
The polypeptides encoded by these clones are selectively expressed in vivo.
An experiment similar to the above could be performed to confirm that this was the case.
We also have the remaining identified in the screen described in Example VII.
A preliminary analysis of the clones was performed. Cross-hybridize each other in each clone
Based on the ability to clone, the inventors divided the clones into five groups.
Released. At least three genes identified in addition to those encoding P35 and P37
Was done. The DNA and amino acid sequence of one of those genes (designated M30)
It is described in SEQ ID NOs: 8 and 9. We called other genes J1 and J2
. The plasmid derived from the clone corresponding to Jl was assigned the ATCC accession number Under P15 and
P
Deposited as 5. Plasmids from clones corresponding to p2, p7, and p9 were
TCC accession number Deposited under
Example XXII-Determination of protective epitope
The present inventors have determined that a novel B.
A recombinant gene expressing a fragment of a burgdorferi polypeptide is constructed.
First, we used restriction enzyme digestion, or PCR and restriction endonucleases, as described above.
Specific arrangement using an oligonucleotide primer containing a nuclease recognition sequence
Duplicate, including the entire nucleotide sequence of each gene, due to any of the row amplifications
A 200-300 bp fragment was generated. The inventors then made the purification easier.
Appropriate expression of these fragments to increase stability and increase stability.
Vector (preferably a vector in which the fragment is expressed as a fusion protein)
-). For example, when a gene fragment is pGEMEX (Promega, Madi
son, WS) and expressed as 10 fusion proteins of the T7 gene
Could be done. Such proteins are insoluble and therefore insoluble pellet fractions
And is readily purified by subsequent solubilization with a denaturing agent such as urea. Ah
Alternatively, the fragment may be fused to glutathione S-transferase as described above.
Could be expressed as a synthetic protein. We then transduce a suitable host cell.
Invert and induce expression of the fragment.
One method for identifying fragments containing a protective B cell epitope is described above.
Immunization of C3H / HeJ mice with individual purified fragments
And After challenge of mice with B.burgdorferi, we
Of the infection by culture of the spleen and spleen, and by histopathological examination of the joints and heart.
Determine existence.
Another technique for identifying protective epitopes uses various fragments
The mice were immunized and B. burgdorferi-infected ticks were used to feed the mice.
As described in Example VIII, the immune response elicited by the fragment
Whether it is sufficient to cause a decrease in the level of B. burgdorferi in d
To determine. Any epitope that elicits such a response, even if they are
As they are not enough to provide protection against the next infection with B.burgdorferi
May also be useful in multi-component vaccines.
Once we localized various epitopes to specific regions of the fusion protein
Then, we use a short synthetic peptide of 5 to 35 amino acids to further
Perform analysis. The use of synthetic peptides allows the inventors to further define each epitope.
And simultaneously contributed by the non-B.burgdorferi portion of the fusion protein
Variations can also be eliminated.
Example XXIII-Preparation of multi-component vaccine
We have identified which protective epitopes are B B other than the strain in which the Osp gene was cloned.
. Determine if antibodies can be raised that protect against the next infection with the burgdorferi strain
. We then design vaccines around these epitopes. Either
Protective Epitope Can Not Protect Against Infection with Other Strains of B.burgdorferi
In some cases, the corresponding novel B. burgdorferi polypeptides may be isolated from those strains.
May be particularly advantageous. Then from several different B. burgdorferi isolates
Multi-component vaccines can be constructed that include multiple epitopes. Therefore,
Kuching elicits antibodies that provide protection against a variety of different strains.
Example XXIV-Identification of T cell epitopes
Stimulation of a humoral immune response involving high titers of neutralizing antibodies in animals is dependent on T cells and
Facilitated by antigens containing B cell epitopes. Including T cell epitopes
To identify these polypeptides, we used the C3H / HeJ mask as described above.
The mice were infected with B. burgdorferi strain N40 in complete Freund's adjuvant. Plastic
Ten days after the immunization, we collect the lymph nodes and in vitro T cells.
Generate a cell line. These T cell lines were then subjected to limiting dilution and soft agar techniques.
Use to clone. We use these T cell clones to identify
Determine if the polypeptide contains a T cell epitope. T cell clones
Stimulate with polypeptides and syngeneic antigen presenting cells. T in the presence of antigen presenting cells
By exposing a T cell clone to a polypeptide comprising a cellular epitope,
The cells proliferate, and the inventorsThreeMeasured by H-thymidine incorporation. Inventor
Also described the production of lymphokines by stimulated T cell clones using standard methods.
Measure using
To determine the T cell epitope of a polypeptide recognized by human T cells,
The inventors have isolated T cell clones from multiple HLA-type B. burgdorferi-infected patients.
You. T cell epitopes stimulate clones with various polypeptides andThreeH-H
Identified by measuring midin incorporation. Then, various T cell epithelia
Groups are correlated with class II HLA antigens such as DR, DP, and DQ. Correlation, species
It is performed by utilizing a B lymphoblastoma cell line expressing various HLA genes. Predetermined
T cell clones are cloned into a suitable B lymphoblastoma cell line and a new B. burgdorferi poly
When mixed with a peptide, B cells can present the polypeptide to T cells.
The growth is thenThreeMeasured by H-thymidine incorporation.
Alternatively, methods known to those skilled in the art (for example, M.S.DeSouza et al., "Long-Term Studyo
f Cell-Mediated Responses to Borrelia burgdorferi in the Laboratory Mous
e ", Infect Immun. 61, 1814-22 (1993)).
Derived from mice immunized with various novel B. burgdorferi polypeptides of the invention
T cells can be identified by adoptive transfer into naive mice.
We then synthesize a multi-component vaccine based on different T cell epitopes.
I do. Such vaccines are T-cell specific in a wide range of patients with different HLA types.
Useful for inducing a vesicular response.
The inventors have also found that in other immunogenic B. burgdorferi polypeptides, or
Stimulating T cell epitopes on non-B. Burgdorferi polypeptides
B cells derived from the novel B. burgdorferi polypeptides of the present invention and
Multi-component vaccines based on these epitopes in combination with T-cell epitopes
To design.
Example XXV-Construction of fusion proteins containing T and B cell epitopes
After identifying a novel B. burgdorferi polypeptide T cell epitope, the invention
We believe that these epitopes, as well as the B-cell epitopes recognized by neutralizing antibodies
Construct a recombinant protein containing the loop. These fusion proteins are
B that express surface immunoglobulins by containing both epitopes of
Allows cells to present antigen to T cells. These T cells, in turn,
Stimulates globulin-expressing B cells, leading to the production of high titers of neutralizing antibodies.
The inventors have also identified regions of the polypeptide determined to contain a B cell epitope.
, A novel B. burgdorf by linking to potent T cell epitopes of other antigens
A fusion protein is constructed from the eri polypeptide. The inventors have determined that hepatitis B virus
Oligonucleotides that are homologous to amino acids 120-140 of the score antigen are synthesized. Ko
This region of the antigen has been shown to contain a potent T cell epitope (D.R.
Millich et al., Supra). The oligonucleotide was then neutralized as in Example XI.
5 ′ and 5 ′ of the segment of DNA encoding the B cell epitope recognized by the antibody.
And 3 'end. Then, using the recombinant DNA molecule, a new B. burgdorferi
B-cell epitope derived from polypeptide and T-cell epitope derived from core antigen
Expression of a fusion protein comprising the polypeptide and thus enhancing the immunogenicity of the polypeptide.
The inventors have also disclosed epitopes and disruptions of the novel B. burgdorferi polypeptide.
A fusion protein containing an epitope of the tetanus toxoid protein is constructed.
The inventors have also found that various monsters incorporated into the flagellin protein of Salmonella
Construction of a plasmid containing a B cell epitope of a novel B.burgdorferi polypeptide
I do. Bacterial flagellin is a potent stimulator of cellular and humoral responses
And can be used as a vector for protective antigens (S.M.C.Newton, C.Ja.
cob, B. Stocker, `` Immune Response To Cholera Toxin Epitope Inserted In S
almonella Flagellin ", Science, 244, pp. 70-72 (1989)). The inventors are hyper-variable
The only Eco RV site in the region, the cloned Salmonella muenchens H1
-d Cut the flagellin gene. We then used T4 DNA ligase.
And blunt-ended DNA encoding a protective B cell epitope of the polypeptide
Insert The recombinant plasmids were then used for vaccine use.
For this purpose, Salmonella is transformed into a non-flagellate strain. mouse
Immunized with live and formalin-killed bacteria and tested for antibody production.
I'll do it. In addition, spleen cells can be used for proliferative cell responses to the peptide of interest.
Test for Finally, mice immunized with this factor were transferred to B.bu as described above.
Challenge with rgdorferi.
The inventors have also determined that B cell erosions derived from one of the novel B. burgdorferi polypeptides.
Novel B.burgdorferi polypeptides or other immunogenic B.burgd different from pitope
Construction of fusion protein containing T cell epitope derived from orferi polypeptide
. In addition, the inventors have determined that the novel B. burgdorferi polypeptide-derived T cell
And novel B.burgdorferi polypeptides and / or other immunogenic B.burgdor
Construction of a fusion protein containing a B cell epitope derived from a feri polypeptide
. Construction of these fusion proteins is achieved by recombinant DNA techniques well known to those skilled in the art.
Is done. The fusion proteins and antibodies directed against them are sensitive to B.burgdorferi.
Methods for detecting, treating, and preventing Lyme disease caused by staining
And compositions.
Although the inventors have described a number of embodiments of the present invention, their basic
Modified configuration to provide other embodiments utilizing the processes and products of the present invention
It's clear what you can do. Therefore, the scope of the present invention should not be construed as being limited by the examples given.
It is understood that the invention is defined by the appended claims rather than by the specific embodiments.
.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｆ
33/569 Ａ６１Ｋ 37/02
//(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(72)発明者 バーソルド，スティーブン ダブリュー.
アメリカ合衆国 コネチカット 06443,
マディソン，リトル ホロウ ロード 18
(72)発明者 フラベル，リチャード エイ.
アメリカ合衆国 コネチカット 06437,
ギルフォード，ムース ヒル ロード
283──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int. Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 19/00 C12P 21/02 C C12P 21/02 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/569 F 33 / 569 A61K 37/02 // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:01) (72) Inventor Bersold, Steven W. United States Connecticut 06443, Madison, Little Hollow Road 18 (72) Inventor Flavel, Richard A. United States Connecticut 06437, Guildford, Moose Hill Road 283