JP2000509394A

JP2000509394A - Polypeptide conjugates for transporting substances across cell membranes

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Publication number: JP2000509394A
Application number: JP9539221A
Authority: JP
Inventors: イー．サマートン，ジェームス; ディー．ウェラー，ドワイト
Original assignee: アンティバイラルズインコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 2000-07-25
Also published as: WO1997040854A3; WO1997040854A2; EP0966303A2; CA2252706A1; AU2929897A; AU729643B2

Abstract

(57)【要約】生きている生物において化合物を送達するのに効果的なポリマー組成物が記載される。この組成物は、低pHの親油性形態から高pHの親水性形態への可逆的pH依存的遷移を受けることによって、親水性および親油性の両方の環境での溶解性を示すポリペプチドを含む。 (57) Summary Polymer compositions effective to deliver compounds in living organisms are described. The composition comprises a polypeptide that exhibits solubility in both hydrophilic and lipophilic environments by undergoing a reversible pH-dependent transition from a low pH lipophilic form to a high pH hydrophilic form .

Description

【発明の詳細な説明】細胞膜を横切って物質を輸送するためのポリペプチド結合体発明の分野本発明は、生きている生物において化合物を送達するのに効果的なポリマー組成物の使用に関する。この組成物は、低pHの親油性形態から高pHの親水性形態への可逆的pH依存性遷移を受けることによって、親水性および親油性の両方の環境下で溶解性を示す。参考文献発明の背景細胞膜および角質層の細胞外マトリクスを構成するような脂質層は、薬物送達に対する強力な障壁を構築し得る。最適な送達については、薬物は、体の水性コンパートメントおよびこれらのコンパートメントを包む脂質層の両方に自由に溶解すべきである。低から中程度の極性の多くの低分子量化合物は脂質層を通って直接通過し得るが、より大きな極性および／またはより高い分子量を有する化合物は、一般的に、エンドサイトーシスまたは関連するプロセスによってのみ、真核生物細胞に入る。このプロセスでは、化合物は、膜の領域の進行性陥入によって細胞に取り込まれ、最終的に、細胞内で閉鎖した小胞、すなわちエンドソームを形成する。ほとんどの場合、次に、エンドソームは、リソソームに合併され、中に取り込まれた化合物を分解性酵素に曝露させる。脂質層を横切る薬物および他の化合物のより効果的な送達を促進するために、選択された条件下での脂質溶解性および他の条件下での水溶性に影響を及ぼす薬物輸送組成物を提供することが望まれる。リソソーム酵素への曝露を避ける経路によって細胞サイトゾルに化合物を送達することもまた望まれる。発明の要旨１つの局面では、本発明は、化合物を、低pH環境から脂質層を横切ってより高いpHの水性コンパートメントに輸送するための組成物を提供する。この組成物は、１つ以上の対のカルボキシル基を有するポリペプチドを含み、ここで一対のカルボキシル基は、０、２または３アミノ酸、および約８〜約100アミノ酸残基の間の長さ、および好ましくは10〜50残基の間の長さによって分けられる。ポリペプチドは、さらに、脂質層への末端領域の侵入およびポリペプチドを分割することを促進するために、ポリペプチドの一方の末端領域にイニシエーター部分を含む。このようなポリペプチドは、親油性形態（これは、低pH環境から脂質層へ分割するのに効果的である）と親水性形態（これは、脂質層からより高いpHの水性コンパートメントへ優先的に分割するのに効果的である）との間の可逆性遷移を受けるのに効果的である。これによって、ポリペプチドは、低pH環境からより高いpHのコンパートメントへ脂質層を横切ることが可能である。組成物はまた、ポリペプチドに共有結合され、輸送されるべき化合物を含む。１つの好ましい実施態様では、イニシエーター部分を除いて、ポリペプチドを形成するアミノ酸残基の30〜100パーセントは、グルタミン酸である。ポリペプチド中のグルタミン酸残基の対は、他のアミノ酸残基によって分けられ得、これは好ましくは、ロイシン、メチオニン、アラニン、および2-アミノ酪酸からなる群より選択される。あるいは、ポリペプチドは、一方の末端領域にイニシエーター部分を有するポリグルタミン酸であり得る。イニシエーター部分は、３〜12アミノ酸残基を有するイニシエーターアミノ酸配列であり得る。この配列は、同じ長さのポリグルタミン酸がαヘリックスを形成するpHよりも高いpHでαヘリックスを形成するのに効果的である。このような配列において好ましいアミノ酸残基は、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、アラニン、2-アミノ酪酸、ノルバリン、およびβ-アラニンであり、ここで非グルタミン酸対グルタミン酸残基の比は、１より大きい。ポリペプチド成分が約50 ％以下のグルタミン酸残基を有する配列を含む場合、イニシエーター配列は、それ自体のポリペプチドの末端領域であり得る。あるいは、ＮまたはＣ末端に共有結合した基であり得、これは、この末端で正または負の電荷を排除するのに効果的であり、そして末端付近の極性部位を保護するのに効果的な少なくとも１つの遠隔極性基を有する。末端での親油性物質（送達されるべき化合物を含む）は、イニシエーター部分として作用し得る。単一のポリペプチドはまた、このようなイニシエーター部分の組み合わせを含み得る。送達されるべき化合物は、ポリペプチド成分の末端、代表的にはイニシエーター配列の反対側の末端に付着され得る。組成物は、１つのポリペプチド成分当たり１つのみ、または複数の化合物を有し得る。送達されるべき化合物は、注入可能な水性送達培地（例えば、タキソール、シクロスポリン、アンホテリシンＢ）中に遊離形態でそれ自体ほんのわずかに溶解性である化合物を含み得る。他の実施態様では、化合物は、配列特異的核酸結合ポリマー、例えば、アンチセンス化合物である。他の局面では、本発明は、低pH環境から脂質層を横切ってより高いpHの水性コンパートメントへの化合物の輸送を促進するための方法を提供する。この方法によれば、化合物は、上記のようにポリペプチドに共有結合される。この方法は、例えば、所定のpHを有する細胞外培地からより高いpHを有する細胞のサイトゾルに治療化合物を送達することに有用である。１つの特定の適用では、この方法は、抗腫瘍治療に使用され、ここでは、細胞は酸性の細胞外培地中に存在する腫瘍細胞であり、そして結合した化合物は抗新生物剤である。他の適用では、この方法は、H．pylori感染の処置に使用され、ここでは、細胞外培地は胃液であり、細胞はH．pylori細菌細胞であり、そして化合物は抗細菌剤であり、あるいは、歯の崩壊の処置および予防に使用され、ここでは、細胞は酸生成カリエス誘発性細菌細胞であり、そして結合した化合物はカリエス誘発性細菌に対して効果的な薬剤である。さらなる適用は、角質層を通る化合物の経皮送達、および脳血液関門を横切って化合物を輸送することを包含し、ここで、横切られるべき脂質層は、角質層の細胞外マトリクスを含む。後者の場合、組成物は、毛細血管壁の内皮細胞を通ってトランスサイトーシス小胞内に輸送され、そしてエンドサイトーシス小胞内に脳細胞によって取り込まれる。以下の本発明の詳細な説明が、付随する図面とともに読まれる場合、本発明のこれらおよび他の特徴は、より十分に明らかになる。図面の簡単な説明図1A〜1Bは、ポリマーの側鎖カルボキシルの親水性および親油性コンホメーション間のpH依存性遷移を示す；図2Aは、本発明の１つの局面によれば、結合した化合物を有するポリペプチドの、エンドサイトーシスによるサイトゾル侵入のプロセスを示す；図2Bは、初期エンドソームに存在する、高いpH形態でのポリペプチド−化合物複合体を示す；図2Cは、後期エンドソームに存在し、脂質膜に侵入し、そしてより高いpHのサイトゾルを変換する際に高pH形態に変換して戻る、低pH形態での複合体を示す；図３は、結合した化合物を含むポリペプチドの経皮輸送プロセスを示し、ここで、複合体は、細胞外脂質マトリクスから角質層下の水性コンパートメントに通過する；図４は、αヘリックス中のポリペプチドの対になった一定の間隔をあけたグルタミン酸カルボキシルを示す；図5A〜5Cは、ポリペプチドの代表的なＣ末端の末端構造を示し、ここで5B〜5C における構造は、部分的に保護されたまたは欠失した末端極性部位を有する；図6A〜6Dは、ポリペプチドの代表的なＮ末端の末端構造を示し、ここで6B〜6D における構造は、保護された末端極性部位を有する；図6Eは、図6Dに示されるように、ポリペプチドにおけるＮ末端の末端構造の極性部位を保護するために使用され得る「Ｎクラウン」構造を示す；図７は、本発明の実施態様によれば、分子エンジンとして機能するポリペプチドを示す；図8A〜8Cは、オクタノール溶解性および細胞侵入について評価されたポリペプチドを示し、ここで、図8Aは、非改変末端を有するポリグルタミン酸を示し、図 8Bは、極性部位を欠失または保護する基の組込みを示し、そして図8Cは、末端での親油性アミノ酸残基のさらなる付加を示す；図９は、ポリペプチド上の側鎖結合の代表的部位を示し、左から右へ、アミドおよびカーバメートがリジンに連結し、エステルがグルタミン酸に連結し、そしてジスルフィド、チオエーテル、およびアミドがシステインに連結することを示す；図10は、本発明に従って使用され得るポリペプチドの調製方法を示す；図11A〜11Bは、ポリペプチドの側鎖または末端に化合物を結合することに使用され得るような、代表的なポリマー−化合物結合を示す；図12は、ポリカチオン頭部基に結合される脂質アンカーによる、図2Aに示されるような、エンドサイトーシスの増強を示す；図13A〜Cは、モルホリノアンチセンスオリゴマーへ本発明のポリペプチドを連結するための手順を示す；および図14A〜14Fは、pHの関数として、いくつかの代表的ポリペプチドのオクタノール／水分配特性を示す。発明の詳細な説明Ｉ．定義以下の用語は、他に指示がなければ以下の意味を有する。本発明のポリペプチド、またはこのポリペプチドのセグメントの「低pH形態」（また、低pHコンホメーション、親油性形態、または親油性コンホメーション）は、対になった側鎖または末端カルボキシル基間の水素結合により親油性にされた、実質的に非イオン性のαヘリカルコンホメーションである。本発明のポリペプチド、またはこのポリペプチドのセグメントの「高pH形態」（また、高pHコンホメーション、親水性形態、または親水性コンホメーション）は、側鎖または末端カルボキシル基が、全体的にまたは主として非水素結合したイオン性状態にあるコンホメーションである。ポリペプチドの親油性形態および親水性形態間の「可逆性遷移」は、非イオン性のαヘリカルコンホメーション（ここで、側鎖カルボキシルが分子内水素結合に関係し、低pHで好都合である）と、形態（ここで、側鎖カルボキシルがイオン性の非水素結合状態であり、高pHで好都合である）との間の遷移である。このような遷移は、ポリペプチド全体を含み得、またはポリペプチドの局在化した領域で生じ得、または特にこの領域が水性／脂質界面付近にある場合、特に親油性でありおよび／または特にαヘリックスの形成に好都合である組成物を有する。このようなポリペプチドの局在化した領域は、脂質相からさらに離れたポリペプチドの領域が親水性コンホメーションにあり得るとしても、膜のような脂質相へのポリペプチドの侵入を開始することに、しばしば効果的である。「酸アミノ酸」または「酸側鎖酸」は、ポリペプチドに組込まれた場合に遊離のカルボキシル基を有するものである。例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。「非酸アミノ酸」または「非酸側鎖酸」は、ポリペプチドに組込まれた場合に遊離のカルボキシル基を有さないものである。「高グルタミン酸」ポリペプチドは、約50％以上のグルタミン酸残基を含むポリペプチドである。「イニシエーター配列」は、哺乳動物細胞のエンドソームに到達可能なpHで、一般的にはグルタミン酸残基の同じ長さの配列がαヘリックスを形成するpHよりも著しく高いpHで、αヘリックスを容易に形成するポリペプチドの末端での短い（代表的には３〜12アミノ酸残基）配列である。ポリペプチドの末端でのこのような配列は、脂質層へのポリペプチドの侵入を開始し、そしてポリペプチドのすぐ隣接するセグメントでのαヘリックス形成を促進する。ポリペプチドの末端でまたはその付近で極性基を「欠失」または「保護」する基は、末端でカルボキシレートアニオンまたはプロトン化したアミンをキャップまたは置換する、共有結合した部分である。好ましい基は、非共有結合、代表的には水素結合によって、末端付近の他の極性部位をさらにマスクする。「エンドサイトーシス」は、細胞外物質が細胞膜の陥入によって細胞中に取り込まれるプロセスであり、これは閉じて、エンドソームとして公知の細胞内の小胞を形成する。細胞外化合物が細胞表面の特異的レセプターに結合するか、または細胞外化合物が細胞膜付近に存在することによって非特異的に輸入され得る場合、エンドサイトーシスは、レセプターに媒介され得る。後者のプロセスは、液相エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスとしても公知である。関連のプロセスであるポトサイトーシスは、カベオラとして公知の細胞表面付近の小胞によって細胞に化合物を取り込む。上記のプロセスのすべてにおいて、細胞外化合物を包む小胞は、形成後にますます酸性になる。したがって、本発明の組成物および方法は、輸送のこれらの方法のすべてに適用可能である。 II．ポリマー組成物本発明のポリマー組成物は、疎水性のαヘリカル形態と親水性形態との間の遷移を受け得るポリペプチド成分を含む；末端領域を介する脂質層へのポリペプチドの分配を促進するためのポリペプチドの一方の末端領域でのイニシエーター部分、およびポリペプチドに共有結合した送達されるべき化合物。以下に記載のように、１つの対の２つのカルボキシルが０、２または３アミノ酸に分かれる場合、ポリペプチド成分は、カルボキシル基の１つ以上の対、および好ましくはカルボキシル基の２つ以上の対を含む。ポリペプチドのアミノ酸の組成物および位置づけは、水性および脂質様相の両方の存在下で、ポリペプチドが、代表的には約4.0と約7.0との間のpHで、複数のイオン化した親水性構造を含む高pH形態と、対になったカルボキシル間の水素結合によって親油性にされる実質的に非イオン性のαヘリカル構造を含む低pH形態との間の可逆的遷移を受けるようなものである。親油性の低pH形態は脂質環境に分配するが、親水性の高pH形態は優先的に水性溶液に分配する。図1Aは、ポリペプチドの親水性と親油性形態との間のpH依存性遷移を示し、そして図1Bは、適切な間隔を開けたカルボキシル含有アミノ酸対の特異的配列についてのこの溶解性遷移を示す。Ａ．脂質層を横切る組成物輸送ポリマー組成物は、細胞外コンパートメントから細胞内のサイトゾルコンパートメントへ結合した化合物を輸送するために使用され得る。このプロセスは図2A に示される。組成物10は、ポリペプチドの高pH形態によって与えられる水溶性によって、水性ベヒクル中で、細胞外コンパートメントに容易に送達される。細胞 12によるエンドサイトーシスの後、組成物は、エンドソーム14内に包まれる。エンドソーム内のpHは、エンドソーム膜内のATP駆動プロトンポンプの作用によって減少する（例えば、Clague，Fuchsを参照のこと）。組成物は、16で示される、後期エンドソームの漸増酸性環境において、エンドソーム膜に侵入する低pH脂質溶解性形態に変換する。エンドソーム膜のサイトゾル面に接触させる際に、組成物は、18で示されるように、水性サイトゾルのほぼ中性のpHでポリペプチド鎖の進行性イオン化および溶媒和によってサイトゾル中に能動的に引き込まれ、所望の細胞下コンパートメントへの結合した化合物20の送達を生じる。以下でさらに論議するように、L-アミノ酸から構築されたポリペプチドは、代表的には、薬物が放出された後、示されるように、サイトゾルで分解される。この一方向能動輸送プロセスは、図2Bおよび2Cにさらに例示され、ここではエンドソーム膜の一部のみが表される。上記の図は、エンドソーム膜に侵入する前の完全に水素結合したコンホメーションを仮定するポリペプチドを表す。このようなものは、ポリペプチドが比較的高pHでαヘリックスを容易に形成する組成物にある場合に生じるようである。しかし、高極性ペプチド、すなわち、高いパーセントの酸側鎖残基を含むペプチドについては、ポリペプチドの他の領域が非水素結合した親水性コンホメーションにある場合でさえ、膜への侵入は、ポリペプチドの局在化した親油性領域によって開始され得る。このような侵入は、この親油性領域がポリペプチドの末端にある場合、特に好都合である。したがって、ポリペプチドの末端、特に高濃度の極性基を含むより長いポリペプチドは、比較的高pHで親油性コンホメーションを容易に仮定するアミノ酸配列を含み得、または他には末端をより親油性にするために改変され得る。このような改変は、以下にさらに論議される。本発明の組成物の有利点は、上記の説明からわかり得るように、エンドソームからサイトゾルへの輸送が、エンドソーム膜の破壊なしに達成され、そのため細胞のサイトゾルコンパートメントへのリソソーム酵素の漏出を避け得ることである。ポリマー組成物はまた、以下に記載のように、細胞外培地が細胞のサイトゾルのpHよりも低いpHを有する場合、結合した化合物を細胞のサイトゾルに直接輸送するために使用され得る。これは、例えば、酸性環境において、真核生物細胞、細菌、または他の標的細胞に化合物を選択的送達させる。ポリマー組成物は、さらに、以下に記載のように、および図３に示されるように、選択された化合物の経皮送達のために使用され得る。この場合、組成物10は、低pH脂質可溶性形態で、22で示される表皮の表面と接触し、角質層の細胞外脂質マトリクス24（上皮細胞26を含む）を通って拡散する。28で示される角質層の下にある水性コンパートメントとの接触の際、組成物は、このコンパートメントのほぼ中性のpHでポリペプチド鎖の進行性イオン化および溶媒和によって、このコンパートメントに能動的に引き入れられ、それによって下にある組織に結合した化合物を送達し、そして続いて体全体にわたって分布させる。組成物は、水性送達培地において遊離形態でほんのわずかに可溶性である化合物の送達に、特に有用である。これらの化合物には、Taxol^TM．Taxol^TMアナログ、シクロスポリンアナログ、およびアンホテリシンＢが含まれる。配列特異的核酸結合ポリマーの送達も考慮される。Ｂ．ポリペプチド成分ポリペプチド成分の２つの重要な構造的特徴は、a）少なくとも１つの適切な間隔を開けた酸対を含むこと、およびb）低pHで親油性αヘリックスを採用するために十分な多くのアミノ酸を含むことである。所定の適用について好ましいポリマーを選択することにおいて、送達されるべき化合物の特性、そこからおよびそこへ化合物が送達されるべきコンパートメント、ならびに曝露された極性部位を保護しヘリックスの末端で親油性を増加させるための末端改変を含む所望性のような、種々の因子が考慮される。Ｂ１．酸性アミノ酸．ポリペプチドがαヘリカルコンホメーションである場合に水素間結合し得る遊離のカルボキシル基を提供するために、カルボキシル側鎖アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。これらの酸の好ましい数および頻度は、以下に記載する。いずれかのポリペプチド末端での遊離カルボキシル基もまた適切に位置したカルボキシル側鎖アミノ酸と水素結合し得ることが理解される。例えば、カルボキシル末端は、実施例１に記載のように、このような酸を使用するポリペプチドの合成を開始することによって、その末端基として、β-アラニン、γ-アミノ酪酸、または他のω-アミノカルボン酸で調製され得る。これは、Ｃ末端でω-カルボキシアルキルアミドを生じ（例えば、図10および5Cに示すように）、ここでアルキル鎖の末端のカルボキシル基は、水素結合に利用可能である。Ｎ末端は、さらなる水素結合カルボキシル基を提供するために、グルタル酸のようなジ酸でキャップされ得る（図6Bに示されるように）。Ｂ２．非酸性アミノ酸．ポリマーの非酸アミノ酸は、存在する場合、主として、各水素結合対の２つのカルボキシル基間に適切な間隔を提供するために、および以下に記載のように、選択された値に分配遷移のpHを調節するために用いられる。これらのアミノ酸は、ポリマーが低pHのαヘリカルコンホメーション（すなわち、アルギニン、リジン、およびヒスチジン）にある場合、カチオン性である部分を含むべきではない。（例外は、以下に記載のように、輸送された化合物の結合のための部位としてのリジンのようなアミノ酸の低レベルの使用である。）ポリマーの非酸アミノ酸のほとんどは、比較的非極性でありそしてαヘリックス形成に適合可能である。したがって、ほとんどの適用に好ましい非酸アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、およびアラニンから選択される。ノルバリン、α-アミノ酪酸、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖エステルもまた、「非酸」アミノ酸として適切である。費用、使用の容易さ、および他の実際的考慮に基づくと、ロイシン、メチオニン、アラニン、およびα-アミノ酪酸が特に好ましい。核酸の例外として、高密度の酸性部分を有するポリマーは、細胞の内部の天然成分ではなく、そのためそこでの毒性を証明し得る。しかし、薬物輸送機能を行った後、そのポリマーが細胞のサイトゾルに特有の天然のサブユニットに分解されるならば、このような毒性は、非常に減少または抑制される。これに関して、天然のL-アミノ酸から構成される組み立てられていないポリペプチドが、細胞のサイトゾルにおいて、主としてプロテアソームと呼ばれる複合多環構造において、迅速に脱重合し得ることが公知である。ポリマーが細胞のサイトゾル内の無害のサブユニットに分解されることが望まれる適用については、ポリマーの好ましいアミノ酸は、天然のL-アミノ酸から選択される。逆に、以下に記載のように、ポリマーがサイトゾルにおいて未処置のままであることが望まれる適用については、好ましいアミノ酸はD-アミノ酸から選択される。後者の適用では、α-アミノ酪酸、ノルバリン、およびノルロイシンのような、他の非天然アミノ酸も適切である。Ｂ３．酸のスペーシング．αヘリックスコンホメーションにおいて、ポリペプチド骨格のアミド部分は、広範囲の分子内水素結合によって溶媒から効果的に保護されることが公知である。αヘリカルコンホメーションのポリペプチドにおいて、酸性側鎖の適切なスペーシングが、遊離酸状態で対になった酸部分間の二つの水素結合の形成によって溶媒から酸部分の極性部位を実質的に保護すると予測された。環境からのポリマーの極性部位のこのような保護は、改善された脂質溶解性を生じるべきである。３つのアミノ酸に分かれる対になったグルタミン酸を含む、このような１つの代表的構造を、図４に示す。 CPK分子モデルでの研究を、所望の水素結合した構造を提供するために酸側鎖の好ましいスペーシングを予測するために使用した。適切なポリペプチド配列でのその後のオクタノール／水およびペンタノール／水分配研究は、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される酸対がそのように間隔をあける場合、良好な脂質溶解性が、低pHで実際に達成され得ることを確認した。表１は、低pHで酸対の極性部位の所望の保護を提供するこれらのスペーシングを挙げる。表１ E-E D-E E-X-X-E E-X-X-D E-X-X-X-E E-X-X-X-D D-X-X-X-E ここで:E＝グルタミン酸 D=アスパラギン酸 X=アミノ酸表からわかり得るように、カルボキシル側鎖アミノ酸間の０、２、または３アミノ酸のスペーシングが効果的である。これらのうち、カルボキシル側鎖アミノ酸間の２または３アミノ酸のスペーシングが好ましい。極性側鎖が非極性側鎖と交互になる場合の配列を含むポリペプチドは、β-シートおよび関連のコンホメーションを採用することが公知である。約６アミノ酸長よりも大きなこのような交互配列を有するポリペプチドは、おそらく極性部位が溶媒から適切に保護されていない複数鎖複合体の形成のため、一般的には低pH でオクタノールに不溶性であることが見いだされた。したがって、本発明のポリマーは、交互になった極性および非極性側鎖の重要な流れ(run)から大きく自由であるべきである。Ｂ４．ポリペプチドの長さ．カルボキシル側鎖の適切に間隔をあけた対を有するαヘリックスを形成するために、本発明のポリペプチドは、少なくとも８アミノ酸長、好ましくは少なくとも10アミノ酸長であるべきである。実用的な速度で脂質膜を横切って拡散しない特に大きなおよび／または極性化合物の送達については、αヘリカルコンホメーションにおいて、ポリマーが膜の厚さよりも長い場合、このような送達は促進される。この場合、ポリペプチドの少なくとも一部分は、サイトゾルに侵入しそして高pH形態に変換され得、大きなおよび／または極性の化合物が、図７に示されるように、脂質膜に侵入することが必要とされる前に、プロセスは溶媒和およびイオン化によってエネルギー的に好都合になる。ポリペプチドαヘリックスでは、各アミノ酸残基は、軸の長さに対して約1.5 Å寄与する。真核生物細胞における細胞膜の脂質二重層が、代表的には約33〜36 Å厚であるので、ポリマー組成物について好ましい長さは、約22アミノ酸以上である。好ましくは、少なくとも１つの酸側鎖が高pHコンパートメントに侵入してイオン性高pH形態への変換を開始することを確実にするために、いくつかの追加のアミノ酸が含まれる。したがって、約24〜100アミノ酸、好ましくは24〜48アミノ酸の長さの範囲のポリペプチドは、大きなおよび／または極性の化合物のエンドソームからサイトゾルへの輸送に好ましい。より小さいまたはより極性の低い結合した化合物の送達については、より短いペプチドが使用され得る。ポリペプチドがその遷移pH以下、その付近、または幾分上である場合、低pH親油性形態は、脂質膜中およびこれを横切ってポリペプチドを拡散させるために十分な平衡濃度で存在する。上記のように、この拡散を顕著に妨害する結合した化合物についてのみ、所定の任意の時間に膜を完全に横切るためのポリペプチドが必要である。さらに以下に記載のように、細胞膜への侵入は、おそらく、ポリペプチドの末端で、特により極性のポリペプチドについて、開始されるようである。約200アミノ酸よりも大きな長さを有するもののようなより長いポリペプチドでは、末端は、低濃度であり、そして統計的には細胞膜にあまり接触しないようである。さらに、サイズのみによって、より長いポリペプチドは、代表的には約80nm（800 Å）の直径であるエンドソーム内に効果的に吸い込まれ得ない。したがって、上記のような好ましいポリペプチドは、200より少ないアミノ酸、および最も好ましくは約100より小さいアミノ酸の平均長を有する。Ｂ５．ポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸ホモポリマー成分．例えば、Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WIから市販される、またはN-カルボキシ無水物（Blout）から容易に重合されるような、高分子量のランダム長のポリグルタミン酸は、水から沈殿されるが、約pH４でn-ペンタノールに分配されない。このようなポリマーもまた、哺乳動物細胞のエンドソームで到達可能な pHで、以下および実施例10Aに記載のような、直接侵入実験で細胞膜を横切らない。さらに、高分子量ポリ-L-グルタミン酸が、水溶性を増加させることによって薬物のエンドサイトーシス取り込みを増強させようと努力して、アドリアマイシン（Hoes，Nukui）のような種々の抗ガン剤に連結された場合、ポリペプチド −薬物結合体のポリグルタミン酸成分は、エンドソーム膜に侵入もせず、膜を横切って薬物を輸送もしなかった。むしろ、キャリアを、融合したエンドソーム− リソソーム内で分解し、そして次いで放出された薬物を、リソソーム膜を横切ってサイトゾル中に能動的に拡散した。これらの結果は、さらに以下に記載のように、比較的極性のポリペプチド（例えば、約50％以上のグルタミン酸残基を含む）が、ポリペプチドの一方または他方の末端を介して細胞膜中に侵入し始めるという前提で説明され得る。改変されていない末端を有する高グルタミン酸ポリペプチドは、Ｃ末端およびＮ末端の両方で多数の保護されていない極性部位を有するので、これらは、明らかに、細胞膜の非極性内部に効果的に侵入し始めることができない。これらの結果とは逆に、60〜100％グルタミン酸残基を有する比較的低分子量のポリペプチドは、以下に記載のように、一方または両方の末端で局所的親油性を提供するように改変される場合、実施例10Aに記載のように、直接侵入実験において細胞膜を横切る。このように改変された高グルタミン酸ポリペプチドもまた、4.3〜4.9の範囲のpHで水性緩衝液からn-ペンタノールに分配され得る。ポリアスパラギン酸は、酸性のpHの水溶液に可溶性であり、水相のpHが４のように低い場合でさえ、n-オクタノールまたはn-ペンタノールに分配されない。ポリアスパラギン酸はまた、以下に記載のように、直接侵入実験において細胞膜を横切らない。このような親油性の欠如は、分配計算（Leo）を根拠にして予測され、そしてポリアスパラギン酸αヘリックスの分子モデリングが、カルボキシル基が環境から極性酸部位を保護するために必要とされる二重水素結合した対を形成することができないことを示すためである。Ｃ．イニシエーター部分イニシエーター部分の２つの一般的な実施態様が期待される。第１は、イニシエーターポリペプチド配列であり、これは約50％以下の酸性残基を含むポリペプチド成分の末端領域伸長であり得、あるいは酸性アミノ酸のホモポリマーの場合には、約50％以下の酸性、例えば、グルタミン酸残基を含む、より疎水性のαヘリックス形成領域であり得る。第２は、例えば、投与されるべき化合物、あるいは末端電荷および極性基を排除および／またはマスクするのに効果的な化合物であり得る疎水性部分である。Ｃ１．イニシエーター配列上記のポリグルタミン酸のＣ末端付近の親油性アミノ酸のさらなる追加（すなわち、残基位置C2、C3、およびC5でのロイシン；図 8Cを参照のこと）は、細胞膜を横切る非常に良好な輸送を提供した。ポリペプチドは、n-ペンタノールへの良好な溶解性を示したが、酸性pHではn-オクタノールへの良好な溶解性を示さなかった。ポリペプチド末端でのこのようなアミノ酸配列は、本発明の実施例では、このコンホメーションを仮定するためにグルタミン酸残基の同様の長さの配列に必要とされるよりも、高いpHでαヘリックスを形成するのに効果的なイニシエーター配列を提供することに特に有用である。細胞侵入および分配研究は、このような αヘリックス形成イニシエーター配列の包含が、脂質溶解性および細胞侵入を、 αヘリックス形成をそれ自体で開始しない親油性改変基よりも非常に大きな程度に増大させることを示した。比較的高いpHでαヘリックスを形成するにおいて、イニシエーター配列はまた、ポリペプチドの隣接セグメントにおけるその後のα ヘリックス伝播を促進する。好ましいイニシエーター配列は、３〜12、および好ましくは５〜10アミノ酸残基長であり、そして好ましくは、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、アラニン、2-アミノ酪酸、3-アミノ酪酸、ノルバリン、およびβ-アラニンを含み、ここで非酸側鎖残基対酸側鎖残基の比は、１より大きく、好ましくは２より大きい。このようなイニシエーター配列の例は、XEXXβおよびXEXXXβ（Ｃ末端）ならびにグルタル酸-XXEXおよびグルタル酸-XXXEX（Ｎ末端）であり、ここでEはグルタミン酸であり、βはβ-アラニンであり、そしてXは上記のリストから選択される。１つのこのようなＣ末端配列であるleu-glu-leu-leu-βを、図8Cに示す。このような末端配列は、非常に極性の（例えば、高グルタミン酸）ポリペプチドにおいて最も明確な有益性を提供する。これらはまた、酸側鎖残基のより低いレベル（すなわち、約50％以下）を含む所定の配列のポリペプチドで有用である。しかし、このようなポリペプチドは、一般的に、αヘリックス形成に対するより高い傾向を有し、したがって、他のイニシエーター部分（例えば、末端の親油性薬物、または上記のような保護基）は、このようなポリペプチドの膜への侵入を開始するのに効果的であり得る。Ｃ２．極性部位の保護または除去．αヘリカルコンホメーションでのポリペプチドは、代表的には、分子内水素結合によって保護されないＣ末端およびＮ末端の両方に複数の極性部位を含む。これらの保護されていない極性およびイオン性部位は、溶媒和したカウンターイオンおよび溶媒和の水の存在のため、および非 αヘリカルコンホメーションを仮定するような極性末端の傾向のため、脂質層へのポリペプチドの開始に対する実質的な障害を構築する。末端電荷を欠失することおよび１つ以上のこれらの極性部位を保護または除去することは、特に短いまたは非常に極性のポリペプチド（例えば、上記の高グルタミン酸ポリペプチド）の場合、脂質溶解性を改善し得る。ポリマー末端に結合された親油性物質（例えば、送達されるべき薬物）は、この末端での電荷を排除しそして局所的親油性を与える。末端電荷を欠失することおよび極性部位を保護または除去することはまた、Ｃ末端またはＮ末端で、末端カルボキシルまたはアミノ基に共有結合するかまたは含み、そしてヒドロキシルまたはカルボキシル基のような少なくとも１つの遠隔の極性基をさらに含み、ポリペプチド末端でまたはその付近で１つ以上の追加の極性基を水素結合によって保護するのに効果的である基を、組み入れることによって達成され得る。特定の例は以下のとおりである。Ｃ末端保護．ポリペプチドのＣ末端は、代表的には、図5Aに示すように、分子内水素結合によって保護されない３つのカルボニル基および１つの負に荷電したカルボキシレートイオンを含む。これらの保護されていない末端極性部位の数を減少させる１つの方法は、図5Bに示されるように、Ｃ末端で、α-エステル、好ましくは2-ヒドロキシエチルエステルを組み入れることである。極性部位はまた、図5Cに示されるようにおよび実施例１に記載のように、β-アラニンを有する支持体樹脂上でポリペプチドの合成を開始することによって、Ｃ末端から都合よく排除され得る。Ｎ末端保護．ポリペプチドのＮ末端は、代表的には、図6Aに示すように、分子内水素結合によって保護されない３つのアミドプロトンおよび１つの正に荷電したプロトン化アミンを含む。極性部位は、図6Bに示されるように、ジ酸を有するポリペプチドを終結させることによってＮ末端から都合よく除去され得る。あるいは、極性部位は、図6Cに示されるように、末端アミンをアセチル化することによって、簡単に保護され得る。水素結合は、ポリペプチドがαヘリックスである場合に示されるように生じる。Ｎ末端のより広範な保護は、αヘリックスのＮ末端で正常に曝露された極性部位のすべてを保護するように設計された、N-クラウンといわれる新規の構造によって達成され得る。図6Dは、このような１つのN-クラウンを示し、その構造は、図6Eに与えられ、H-結合したコンホメーションでは、αヘリカルコンホメーションに存在するポリペプチドのＮ末端に連結された場合に採用されると考えられる。このような改変を有するポリグルタミン酸を図8Bに示す。図8Aに示される改変されていないポリペプチドは、n-オクタノールまたはn-ペンタノールに分配されず、直接侵入研究において細胞膜を横切るどのような輸送も示さなかった。図8Bに示されるようなＮ末端カルボキシ-フルオレセインの付加は、Ｎ末端から正電荷を除去し、Ｎ末端極性部位を部分的に保護し、そして大きな親油性部分（すなわち、低pH形態でのフルオレセイン）をＮ末端に付加する。さらに、２つの極性部位を有する負に荷電したカルボキシレートは、図10に示されるように、 β-アラニンでポリペプチド合成を開始することによってＣ末端から排除された。これらの改変は、細胞膜を横切った適度な輸送を与え（図8B）、そしてポリペプチドはn-ペンタノールに分配したが、n-オクタノールには分配しなかった。実施において、一旦ポリペプチドの末端のイニシエーター部分が膜に侵入すると、ポリペプチドの次のセグメントは、親油性の水素結合したコンホメーションに変換し得る。このような変換は、エンドソーム内の漸増酸性環境によって、ならびにポリペプチドの隣接αヘリカルセグメントおよび細胞膜の近位によって提供される増加した局所的親油性によって誘導される。イニシエーター部分の侵入の後、多数の酸側鎖を有するポリペプチドは、「段階的」様式で膜に分配し得、ここでは、膜にすぐ隣接して位置する酸側鎖は、近くの酸側鎖と水素結合した対を形成し、そしてこの対を含み、親油性αヘリカルコンホメーションを仮定したポリペプチドのセグメントは、膜に侵入する。この意味で、カルボン酸側鎖間のスペーシングは、特に重要である。ポリペプチドが上記の段階的方法で膜に侵入する場合、もう１つのカルボキシレート側鎖と対になることができない膜に隣接したカルボキシレート側鎖は、さらなる侵入をブロックするようである。上記のように、０、２または３アミノ酸のスペーシングは、このような対形成に効果的である。さらに、薬物が、末端でのみよりもポリペプチド鎖に沿った部位で結合されるべきならば、これらは側鎖カルボキシレート間のスペーシングおよび対形成を妨害しないように位置しなければならない。したがって、薬物のランダム結合、ならびに非酸側鎖残基（グルタミン酸エステルを含む）のランダムスペーシングは、避けられるべきである。さらに以下に記載のように、一方向輸送についての追加の駆動力は、ポリペプチドが膜にわたりそしてより高いpHの細胞サイトゾルに遭遇すると、側鎖カルボキシルのイオン化および水和によって提供される。したがって、高い割合の側鎖カルボキシルを有するポリペプチドは、結合した化合物を膜を横切って輸送するための高い駆動力を提供することが予想される。したがって、本発明での使用のためのポリペプチドの１つの好ましいクラスには、30％〜100％、および好ましくは50％〜100％のグルタミン酸含量を有し、そして一方の末端で本明細書に記載のようなイニシエーター配列を有するものが含まれる。（この意味では、100％グルタミン酸含量とは、イニシエーター部分を除いて、ポリペプチドの中心鎖をいう。）好ましくは、輸送されるべき化合物は、ポリペプチドの他方の末端にまたはその付近に結合される。Ｄ．遷移pH ポリペプチド成分またはそのセグメントが、親水性形態と親油性形態との間で変換し、そして水相から脂質相へ、あるいはその逆に分配するのに効果的である pHを、「遷移pH」という。一般的に、化合物を低pH環境から脂質層を横切ってより高いpHの水性コンパートメントに輸送することについて、この変換は、低pH環境のpHよりも大きいまたはほぼ等しく、そしてより高いpHの水性コンパートメントのpHよりも低いpHで生じるべきである。しかし、上記の論議から、ポリペプチドの局所的改変が、全体としてポリペプチドがこのような改変の不在下でまたは脂質層の不在下でαヘリカルコンホメーションに変換するpHよりも大きなpHで、脂質層への侵入および分配を促進し得ることが理解される。膜のような薄い脂質層を通る水性コンパートメントへの輸送もまた、組成物がこの水性コンパートメントに接触させる際に親水性コンパートメントに変換して戻るので、イオン化および溶媒和によって促進される。したがって、組成物がインビボでまたは細胞侵入研究で効果的に輸送するpHは、２相分配研究において、ポリペプチド分子の遷移pHとは異なり得る。したがって、後者の値は、ポリペプチドの最初の選択についての有用なガイドラインとして用いるが、特に高極性のポリペプチドについては、以下に記載の直接侵入研究によって補われるべきである。効果的な遷移pHは、種々の適用について変化する。例えば、潰瘍の主要な原因である、細菌H．pyloriは、胃中の非常に酸性の環境に存在する。この環境は、以下に記載のように、約4.5以下のpHで脂質層への分配に効果的であるポリマー組成物の使用によって、特異的に標的され得る。逆に、経皮送達については、a）ポリマー組成物が、角質層の細胞外脂質マトリクスに安全に到達可能なpHで親油性形態で存在すること、およびb）ポリマー組成物が、角質層の下にある水性環境に接触させる際に親水性形態に変換することが好ましい。約５〜6.5の範囲の遷移pHは、一般的にこれらの２つの基準を満たす。エンドソームから真核生物細胞のサイトゾルへの比較的極性の化合物の輸送において、本明細書に記載のポリマー組成物は、エンドソーム膜中および膜を介して比較的極性の化合物を引っ張る分子エンジンとして機能し得る。図７に示されるように、非イオン性親油性αヘリカルポリペプチドがエンドソーム膜のサイトゾル面でイオン化および溶媒和を受けるので、エンジンによって作用する駆動力が生じる。この駆動力は、一部は、遷移pHとサイトゾルのpHとの間の差の関数である。したがって、遷移pHが低いほど、このようなエンジンが作用すべき力がより強く、そのためエンドソーム膜を通って輸送し得る負荷がより大きい。かなり小さくおよび／またはほんの適度に極性である化合物について、エンドソームからサイトゾルへの輸送に使用されるポリマー組成物は、6.4〜6.8の範囲にあるようなかなり高い遷移pHを有し得る。より大きくおよび／またはより極性の化合物（すなわち、より大きな負荷）については、遷移pHは、一般的により低いべきである。しかし、遷移pHが低すぎる場合、エンドソーム／リソソーム融合は、ポリペプチドエンジンが親油性形態へ変換しそして包んでいる膜に侵入する前に生じ得、輸送機能を行い得る前にポリペプチド（L-アミノ酸を含むと仮定する）の酵素的分解を導く。エンドソーム／リソソーム融合の時点で、エンドソームのpHは、代表的には、約５〜６の範囲である。したがって、この範囲における最小遷移pHは、L-アミノ酸から組み立てられる組成物が好ましく、そしてエンドサイトーシス侵入が意図される。上記から、最適遷移pHが、実質的に、送達されるべき化合物ならびにそこからおよびそこに送達されるべきコンパートメントに依存して変化し得ることがわかる。以下に記載のいくつかのパラメーターは、広いpH範囲にわたって遷移pHを調節するために変化され得、それによって、ポリマー組成物の最適化は、選択されたコンパートメント間の選択された化合物の送達を可能にする。 1.）長さ．表2Aに示すように、ポリペプチドの長さが増加するにつれて、オクタノール／水分配系で決定した場合、遷移pHの適度の増加がある。 2.）酸アミノ酸．表2Bの結果は、一般的に、グルタミン酸残基が、アスパラギン酸残基よりも高い遷移pHを提供することを示す。この表の結果はまた、順序およびスペーシング（すなわち、ELLDL対ELLLD）もまた遷移pHに重要な影響を有することを示す。 3.）非酸アミノ酸．表2Cの結果は、非酸アミノ酸部分の選択がまた、遷移pHに実質的に影響を与え得ることを示す。例えば、ロイシンをフェニルアラニンで置換することは、遷移pHを減少させる。表2Cに示されるように、遷移pHはまた、ロイシン−＞バリン−＞アラニン−＞グリシン（グリシンについてのデータは示していない）の順で各置換によってさらに減少する。したがって、広い範囲にわたって遷移pHを調節する１つの簡単な方法は、ロイシン残基（高い遷移pH値を与える）をアラニンで漸次置換することによる。ロイシンがノルロイシンとほぼ同じ遷移pH値を与えることもわかる。 4.）酸対非酸の比．遷移pHは、一般的に、酸アミノ酸の割合（ロイシンのような親油性アミノ酸を置換すること）が増加するにつれて減少することが見出された。 5.）末端構造．水素結合に関係ない極性の末端基をマスクするまたは欠失することは、遷移pHを増加させるのに役立つ。表２Ａ．長さ：繰り返し配列長さ遷移pH^* -ELALE- 25 5.83 -ELALE- 45 6.05 -ELALE- 65 6.14 Ｂ．酸アミノ酸：繰り返し配列長さ遷移pH^* -ELLLE- 50 6.92 -ELLLD- 50 6.51 -DLLLE- 60 6.45 -ELLEL- 49 6.85 -ELLDL- 49 6.29 Ｃ．非酸アミノ酸：繰り返し配列長さ遷移pH^* -ELEDLDLL- 54 5.50 -EFEDLDLL- 54 5.39 -ELLLE- 50 6.92 -ELVLE- 50 6.44 -ELALE- 50 6.14 -ELLLE- 30 6.83 -ELALE- 30 5.90 -EALAE- 30 5.10 -ELLLE- 30 6.93 -EnLnLnLE- 30 6.90 A＝アラニン D＝アスパラギン酸 E＝グルタミン酸 F＝フェニルアラニン L＝ロイシン nL＝ノルロイシン V＝バリン ^*n-オクタノール／水で決定した場合表２は、上記の構造的特徴を変化させることによるn-オクタノール／水分配系で到達される遷移pHの選択を示す。これらのパラメータ一をさらに調節することによって、さらに高いまたは低い遷移pHを有するポリペプチドを調製することができる。例えば、４以下の遷移pHを有する組成物は、比較的短いポリペプチドにおいて高い割合のアスパラギン酸およびアラニンサブユニットを含むことによって調製され得る。上記のように、オクタノール／水またはペンタノール／水分配研究から決定された遷移pHは、選択された環境への化合物の送達に適切なポリペプチドを選択するために有用なガイドラインを提供する。しかし、追加の因子が、細胞環境においてポリペプチドの挙動に影響を及ぼし得ることが理解される。研究は、例えば、高レベルのロイシンを含むポリペプチドが血清タンパク質に結合し得ることを示唆している。末端に親油性の局所的領域を有するポリペプチドが、バルク分配研究で示されるよりも高いpHでインビトロまたはインビボで細胞侵入に効果的な遷移を受け得ることも、本明細書で示されている。したがって、分配研究は、理想的には、組成物の膜輸送特性をさらに評価するために、以下に記載のような、インビトロ細胞侵入実験の後である。候補ポリペプチドはまた、血清アルブミンを添加したおよび添加しないアガロースゲルでの電気泳動を行うことによって、血清タンパク質への結合についてテストされ得る。Ｅ．ポリペプチド成分への化合物のカップリング１つ以上の薬物または他の化合物は、末端での部位を介しておよび／または鎖内の限られた数の選択された部位でポリペプチドに結合され得る。上記のように、鎖に沿った化合物のランダム結合または高い負荷は、特に高い酸側鎖ポリペプチドについて、膜への分配を妨げ得る。選択的結合のための方法は、当該技術分野で周知であり、そしていくつかのこのような方法は、以下の実施例２〜７に記載される。図９は、実質的に多様な化合物およびポリマー組成物に便利および効果的の両方である、代表的な結合位置およびタイプを示す。左から右へ、リジンへのアミドおよびカーバメート結合、グルタミン酸へのエステル結合、およびシステインへのジスルフィド、チオエーテル、およびアミド結合が示される。特に、アミド、カーバメート、エステル、チオエーテル、ジスルフィド、およびヒドラゾンから選択された結合は、代表的には、形成することが容易であり、そしてほとんどの適用に適切である。結合が、化合物の送達後にサイトゾルで容易に切断されるべきである場合、エステルおよびジスルフィド結合が特に好ましい。図11は、このような結合の代表的な出発物質および生成物を例示する。実施例２〜７は、これらの結合タイプを介する代表的ポリマーへの代表的化合物の結合を記載し、これには、シクロスポリン、Taxol^TM（paclitaxel）、およびモルホリノアンチセンスオリゴマー（SummertonおよびWeller）を含む。シクロスポリンは、ジスルフィド結合（実施例3A）、チオエーテル結合（実施例4A）、カーバメート結合（実施例５）、およびアミドまたはチオエーテル結合（実施例６）を介してポリペプチドに結合される。同様の方法を使用するTaxol^TMのポリペプチドの対応する結合（実施例3B、4B、５、および6B、および7A）、ならびにモルホリノアンチセンスオリゴマーへのアミド結合（実施例6C、図13A〜Cに示される）もまた、記載される。上記の実施例において、Taxol^TMは、そのC-7ヒドロキシル基を介してポリペプチドに好都合に結合される。シクロスポリンＡを結合するために、一級ヒドロキシル基を有するメタボライト17（EberleおよびNuninger，1992）が使用される。これらの両方の場合、結合は、分子の公知の活性部位を含まない。メトロニダゾールまたはドキソルビシンのような、以下に記載の適用で使用され得る他の薬物もまた、好都合な結合のための一級ヒドロキシル基を有する。一般的に、多くの官能基（ヒドロキシル、アミノ、ハロゲンなど）が結合に使用され得る。特にポリペプチドまたはその任意の部分が送達後に化合物へ結合したままである場合、化合物の活性部位の一部であることが知られていない基が好ましい。実施例８は、ポリマー−化合物生成物の精製のための代表的な方法、ならびにその生成物の構造分析の方法を記載する。化合物／ポリペプチド比は、好ましくは5：1またはそれ以下、および大きいおよび／または極性化合物についてはより好ましくは1:1である。好ましくは、化合物は、ポリペプチドの末端でまたは付近で結合され；最も好ましくは、一方の末端はイニシエーター部分を含み、そして他方は結合した化合物を含む。核酸結合ポリマーのような特に大きいおよび／または極性化合物については、輸送は、本発明の複数（例えば、２〜５）のポリペプチドキャリアを単一の化合物分子に結合することによって増強され得る。キャリアは、好ましくは、輸送されるべき分子の同じ領域に（例えば、核酸結合ポリマーにまたは付近に）結合される。 III．組成物特性の評価Ａ．分配特性水とn-オクタノールとの間の化合物の分配は、通常、水性コンパートメントと細胞膜の脂質二重層との間の化合物の分配を評価するための薬学的調査に使用されている。n-オクタノールと種々のpHの一連の緩衝液との間の分配を使用して、アミノ酸の約50％までの酸側鎖酸含量を有する本発明のポリマー組成物のpH依存的溶解性特性の定量的測定を提供した。50％を越える酸側鎖含量を有するポリマー組成物については、n-ペンタノールと水性緩衝液との間の分配を使用した。n- オクタノール／水で得られた遷移pH値が、n-ペンタノール／水で得られたものより約0.3pHユニット低いことに留意すべきである。その遷移pHで、ポリマーは、水相および有機相において等しい濃度で分配する。これらの研究から決定した遷移pH値は、ポリマー溶解性特性に対する種々の因子の効果の簡単な定量的評価を与える。実施例９は、このような分配研究を行うためおよび代表的なポリマー組成物についての遷移pHを得るための便利な手順を記載する。この手順では、フルオレセインでタグ付けしたポリペプチドは、ｎ− オクタノールまたはn-ペンタノールと種々のpHの水性緩衝液との間で分配され、そして各相の吸光度が測定される。図14A〜Fは、本発明の６つの代表的なフルオレセインでタグ付けしたポリペプチド組成物についてのpHの関数として、これらの吸光度値のプロットを示し、ここで６つの異なるポリペプチドは、5.1〜6.9の範囲のオクタノール／水遷移pH値を示す。次の項に記載の培養した細胞での実験の結果は、約50％までの酸アミノ酸組成物を有するポリマーについては、ポリマーが低pHコンホメーションである場合、これらの分配特性が、一般的に、ポリマーが脂質層に侵入する能力を予測することを示唆する。上記のように末端基の親油性を生じるように改変する場合、50％より大きい酸アミノ酸組成物を有するポリマーは、分配研究で示される遷移pHから予測されるよりも高いpHで、より効果的な直接細胞侵入を示す傾向がある。Ｂ．サイトゾル侵入 B1．直接侵入．選択された化合物の送達についてポリマー組成物をスクリーニングすることにおいて、直接的膜貫通通過は、細胞外培地のpHの簡単な段階的減少によって評価され得、これは、膜に埋められたプロトンポンプの作用によってエンドソームで生じる進行性pH減少に匹敵する。このプロセスはまた、細胞外培地のpHが細胞のサイトゾルのpHよりも低い場合、インビボでの直接的侵入の代表である。真核生物細胞では、蛍光化合物がエンドソーム／リソソームコンパートメントに限定される場合、蛍光顕微鏡検査は、細胞での核周囲の点状パターンを示す。逆に、蛍光化合物がサイトゾルに侵入する場合、細胞全体に拡散する蛍光が見られる。したがって、サイトゾルに輸送されるべき化合物に蛍光タグを結合することは、培養した細胞への添加後、ポリマー−化合物生成物の細胞下局在化を容易に評価することを可能にする。理想的には、結合した蛍光タグは、輸送プロセスに最小の影響を有するべきである。詳細には、これは、比較的小さいべきであり、そして低pHでオクタノールおよび脂質層にかなり可溶でありそして中性pHおよびそれ以上で水溶液にかなり可溶であるべきである。ほとんどのこのような適用に適切な２つの蛍光タグは、5-カルボキシ-フルオレセインおよび7-ジメチルアミノクマリン-4-酢酸（Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregonから得た）である。実施例10Aは、培養した真核生物細胞での直接的細胞侵入実験を記載する。この実験では、細胞を、5-カルボキシフルオレセインでタグ付けした本発明の代表的なポリマー組成物で、２、３分間処理した。細胞外培地が中性であった場合、サイトゾル侵入は観察されなかった。しかし、細胞外培地のpHが、エンドソームで生じる進行性pH減少に匹敵するように段階的に減少した場合、ポリマーが、サイトゾルコンパートメントに迅速に侵入することが見られ、これは細胞全体にわたって拡散した蛍光によって証明された。 B2．エンドサイトーシスによる侵入直接的細胞侵入研究が、選択された化合物の膜貫通送達に１つ以上のポリマーが効果的であることを示した後、エンドサイトーシスによる細胞侵入は、実施例 10に記載のような方法によって評価され得る。図２は、エンドサイトーシス取り込みによる真核生物細胞のサイトゾルへの、本発明のポリマー化合物組成物の侵入を示す。この図から、真核生物細胞のサイトゾルへの侵入が、複数工程を包含することがみられ、その主なものは、最初のエンドサイトーシス取り込みおよびそれに続く酸性化したエンドソームから中性サイトゾルへの膜貫通通過である。蛍光でタグ付けしたポリペプチドが細胞にエンドサイトーシスされる場合、核周囲の点状パターンの観察は、タグ付けされた材料がエンドソームまたはエンドソーム／リソソームコンパートメントに局在することを示す。したがって、細胞全体にわたって拡散した蛍光は、ポリペプチドが、所望のエンドソームからサイトゾルへの輸送を達成したことを示し得た。しかし、L-アミノ酸から組み立てられたポリペプチドの場合、このようなパターンはまた、ポリペプチドがリソソーム酵素によって分解されそして蛍光タグのみがサイトゾルに拡散したことを示し得た。したがって、エンドサイトーシス経路によるこのようなぺプチドのサイトゾル侵入が、実施例10に記載のように、ポリペプチド−薬物生成物の薬物成分についての機能的アッセイによって評価されることが好ましい。あるいは、選択されたポリペプチドのエンドサイトーシス送達を示しそして最適化することに関する、最初のエンドサイトーシス侵入研究は、リソソーム酵素によって分解されないD-アミノ酸から組み立てられたポリマーで行われ得る。本発明を支持する研究では、同じ配列を有するD-およびL-ポリペプチドが、同じ分配および膜輸送特性を示すことが示されている。この実施例では、ポリペプチドに結合した化合物は、配列特異的核酸結合ポリマーであり、詳細には、処理した細胞に含まれるプラスミドによってコードされる、ホタルルシフェラーゼについての特異的メッセンジャーRNAを標的とした非イオン性アンチセンスオリゴマー（SummertonおよびWeller）である。アンチセンスオリゴマーが、トランスフェクトした細胞のサイトゾルコンパートメントに接近する場合、未処理細胞に対して、デキサメタゾン誘導したルシフェラーゼ活性の顕著な減少が観察されるべきである。ポリマー−化合物組成物を、エンドサイトーシス取り込みに適切な時間、約５時間、細胞に接触させた。ポリペプチド単独、アンチセンスオリゴ単独、および培地単独（コントロール）もテストした。実施例に記載のように、アンチセンスオリゴ単独は、おそらく細胞のサイトゾルに侵入できないため、標的したメッセンジャーRNAを阻害できなかった。逆に、本発明のポリマーに結合した同じアンチセンスオリゴは、コントロールに対して約31％ルシフェラーゼ活性を阻害し、これはサイトゾルコンパートメントへの化合物の良好な送達を示唆した。結合した親和性部分によるエンドサイトーシスの増強．本発明のポリマー組成物は、本質的に中性の細胞外培地中で比較的高密度の負電荷を有する。さらに、相当な部分で糖衣上のシアル酸残基のため、代表的には、真核生物細胞の外表面はまた、相当な密度の負電荷を有する。おそらく、同様に荷電したポリマーと細胞表面との間の静電反発のため、流体相エンドサイトーシスによるいくつかのポリマー−化合物生成物の細胞侵入の速度は、比較的遅いようである。以下に記載のさらなる実験結果は、エンドサイトーシスの速度が、ポリマー− 化合物組成物に結合したまたは複合体化した脂質アンカー（すなわち、脂肪酸、長鎖アルキルアミン、長鎖アルコールなどのような親油性分子）のような、細胞表面に対する親和性を有する部分を使用することによって、しばしば増強され得ることを示唆する。このような脂質アンカーは、エンドソームを形成するための細胞膜の陥入の際に、より大量のポリマー−化合物が他の場合よりも包まれるように、細胞表面でポリマー−化合物の濃度を増加させる役割を有し易い。脂質アンカーが静電引力によってポリマーに結合される場合、このような引力は、低pHで、すなわち、後期エンドソーム内で排除される。脂質アンカーがポリマー−化合物に共有結合される場合、ポリマー−化合物が、エンドソーム膜に埋められた脂質アンカーに結合したままであるよりもサイトゾルで自由に放出されるように、結合が細胞のサイトゾル中で切断可能であることが、一般的に望ましい。実施例10にも記載された、上記のポリペプチド−アンチセンスオリゴ組成物を使用するさらなる実験では、四カチオン性脂質アンカー（Transfectam^TM．Prome ga Corp.，Madison，WI，USAから）を添加して、ポリアニオン性ポリマー組成物と複合体化することによってエンドサイトーシスエ程を増強した。これは図12に示し、ここでは、脂質アンカーは30で示される。この場合、ルシフェラーゼ活性は、コントロールに対して約68％阻害された。これは、上記の脂質アンカーなしの31％と比較される。図12は、ポリマーが後期エンドソームで、その低pH非イオン性形態に変換する場合、Transfectam^TMのような脂質アンカーが、最初のエンドサイトーシス工程、次いで、ポリマーからの解離を増強することにおいて果たす、起こりそうな役割を示す。親油性薬物（例えば、Taxol^TMおよびシクロスポリンＡ）のような多くの化合物が、その本来の親油性のため、エンドサイトーシスを増強するように作用することが理解されるべきである。このような場合、一般的に、別々の脂質アンカーは必要とされない。エンドサイトーシスはまた、レセプターシグナル、またはリガンドのポリペプチド−化合物組成物への結合によって促進され得る。レセプターが媒介するエンドサイトーシスでは、取り込みのために標的された組成物に結合または複合体化したリガンドは、細胞表面のレセプターに結合し得る。このようなリガンドは、さらに以下に記載のように、一般的なエンドサイトーシス取り込みを増強するために、または特定の細胞タイプを標的するために、使用され得る。 IV．適用本発明のポリマーは、体内の特定の細胞または位置への結合した化合物の送達を標的するために使用され得る。標的の特異性は、サイトゾルと細胞外培地との間のpH差（differential）を利用することによって、または標的した細胞表面レセプターの使用によって、制御され得る。Ａ．H．pylori感染の処置標的細胞が酸性環境に存在する場合、細胞への直接侵入は、エンドソームによる侵入を必要とせずに、細胞外環境と細胞のサイトゾルとの間のpH差によって促進される。このような直接侵入は、一般的には、エンドサイトーシス侵入よりも非常に速い。低pH環境でのこのような標的の例を以下に示す。胃の非常に酸性の環境は、約4.5よりも低いpHで膜への分配に効果的なポリマー組成物を使用することによって、H．pylori感染の処置でのように特異的に利用され得る。真核生物細胞のエンドソームコンパートメントを含む、体における他のコンパートメントは、4.5〜6.5の範囲のpHを有しており、これは、この低い pHに到達せず、そしてそのためポリマー組成物を、その脂質層を横切る通過のために必要とされる親油性状態に変換しない。例えば、6.5または7.0までの、より高い遷移pHを有するポリペプチドが、H．p ylori細胞にさらに侵入するが、エンドサイトーシスによって他の細胞にも侵入し得、その結果、選択性が減少する。細菌細胞に浸透するために、組成物は、外膜（グラム陰性菌で）、細胞壁、および内形質膜を通過できなければならない。細菌細胞壁は、一般的に、2000Da以上の球状化合物の侵入を排除する。本発明の支持での研究は、本明細書に記載のポリペプチド組成物が、一般的に2000Daよりも高分子量であるが、H．pylori細胞に良好に浸透することを示す。低pHでの組成物は、球状よりも主として直線桿体であるので、これらがレプテーション（reptation）メカニズムによって細胞壁を浸透すると仮定される。 H．pyloriを標的するために使用されている薬物には、アモキシシリン、ビスマス塩、メトロニダゾリン、オメプラゾール、クラリスロマイシン、およびテトラサイクリンが挙げられる。単一の薬物での治療は、感染部位での薬物のpH効果および／または不適切な濃度のため、必ずしも効果的とは限らない。したがって、ビスマス塩（例えば、次サリチル酸ビスマス(bisumuth subsalicylate)）、抗感染剤（例えば、メトロニダゾール）、およびテトラサイクリンまたはアモキシシリンのいずれかの組み合わせを使用する、３薬物治療がしばしば推奨される（例えば、Dixon，O’Conner，Glupczynskiを参照のこと）。本発明の方法は、病原体に対してより選択的な標的を提供するので、より高用量の薬物および／またはより細胞傷害性の薬物が送達され得、そのためより大きな効率の単一および複数の両方の薬物療法、ならびに一般的に根絶に必要とされる３〜４週よりも短い処置期間を提供する。この適用は、有益性が、化合物の送達後に、ポリペプチドを未処理で維持することによって得られ得るものである。詳細には、未処理のポリペプチド−化合物組成物は、胃または小腸壁に吸収されないようであり、そのため標的されていない体の部位への結合した化合物の送達を防止する。上記のように、D-アミノ酸から構成されるポリペプチドは、タンパク質分解酵素によって分解されず、そしてそのためこの目的に好ましい。アミドのような、比較的安定な化合物−ポリペプチド結合はまた、この場合に好ましい。Ｂ．標的腫瘍細胞ほとんどの固体腫瘍塊は、不十分な血液供給のため、低酸素（酸素不足）である細胞を含む。この低酸素症は、このような細胞を放射線および薬物治療の両方により抵抗性にする（例えば、Kennedyを参照のこと）。抗ガン剤の送達はまた、限定された血管系によって損なわれ得る。このような固体腫瘍内の細胞外環境は、嫌気的条件下の乳酸の産生のような因子のため、正常組織（例えば、Kennedy，Tannock，Vaupel）よりも酸性であることが示されている。測定したpHは、代表的には、6.0〜7.0の範囲にあり、あるいは、一般的には、対応する正常組織よりも低い約0.3〜1.0ユニットである（Vaup el）。腫瘍塊の細胞外培地もまた、腫瘍細胞自体の細胞内コンパートメントよりも低いpHであるようである（Newell）。例えば、主として細胞内pHを測定する³¹P NM RによるpHの測定は、脳腫瘍および肉腫が、対応する正常組織よりも高い細胞内p Hを有することを示した（Vaupel）。本発明の方法によれば、低酸素腫瘍細胞は、その低pH環境によって、この細胞外環境に存在するpHでの膜への分配に効果的であるポリペプチドに結合した抗新生物薬物によって標的され得る。このような薬物には、例えば、シスプラチン、メトトレキセートおよびフルオロウラシルのような抗代謝剤、ドキソルビシンのようなトポイソメラーゼインヒビター、シクロホスファミドおよびクロラムブシルのようなアルキル化剤、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ドセタキセル、およびパクリタキセル（Taxol^TM）のようなチューブリン結合植物アルカロイドが含まれる。上記のような、低酸素細胞の標的に効果的なポリペプチドはまた、後期エンドソームでのその親油性形態へのpH依存的遷移を受け得、ここで代表的には、pH範囲は約4.5〜6.5である。しかし、直接細胞侵入は、一般的に、エンドサイトーシスよりも非常に速い。適切なpH差を使用する直接的細胞侵入実験において、輸送は数分内に生じる；例えば、実施例10を参照のこと。他方、感知可能なエンドサイトーシス侵入は、一般的に、多くの時間がかかる。したがって、標的されていない細胞によるエンドサイトーシス取り込みは、細胞外培地と細胞内コンパートメントとの間に存在するpH差によって誘導される、標的されたガン細胞への直接侵入に対して最少である。Ｃ．歯崩壊の処置／予防歯の崩壊（歯カリエス）は、炭水化物を破壊することにおいて細菌による酸の産生（酸生成）によって促進される。スクロース誘導されたプラーク（Igarashi )のpHの研究は、２日齢のプラークで4.6±0.2の最小pHを示した；21日後にはpH は5.7に上昇した。優勢な細菌は、Streptococci（全体の＞50％）およびActinom yces（全体の＞10％）であった。もう１つの研究では、カリエス活性部位から取った細菌は、糖ブロス中で4.2以下の最終pHを生じた（van Houte）。抗細菌剤は、約4.5〜6.5の範囲のpHで、好ましくは約4.5〜5.5の範囲のpHで、膜への分配に効果的なポリペプチドを使用して、上記の方法に従って、崩壊または潜在的崩壊部位に標的され得る。歯カリエスの処置に使用されている適切な抗細菌剤には、クロルヘキシジン、トリクロサン（Friedman，Bouwsma）、キシリトール、抗細菌酵素、ならびに9-オクタデセン-1-アミンヒドロフルオリドおよび1-ヘキサデシルアミンヒドロフルオリドのようなアミンフルオリドが含まれる。Ｄ．細胞表面レセプターの標的エンドサイトーシスによる薬物送達は、適切なリガンド、またはレセプターシグナルにポリマー薬物組成物を結合または複合体化することによって促進され得る。マンノース-6-ホスフェート、ビオチン、葉酸、および他の水溶性ビタミンのようなあるレセプターシグナルが、多くの細胞タイプへの送達を与え（Ludwig ）、そのため多くの適用において細胞侵入を促進するために使用され得るので、このようなリガンドの使用は、細胞標的の多能性を提供し得る。以下にさらに記載のように、他には、１つまたは２、３の特異的細胞タイプへの送達に焦点を絞るために使用され得る。一般的に、ポリマー薬物組成物とリガンドとの間の結合が切断可能であり、そのため輸送後にポリマー薬物がサイトゾルで自由に放出され得ることが望ましい。リボフラビン、チアミン、ニコチン酸、および葉酸のような水溶性ビタミンは、細胞表面レセプターを標的するために使用され得る。これらの化合物は、小分子の取り込みについて特定化されるエンドサイトーシスの変法であるポトサイトーシスによって、細胞に取り込まれると考えられる。ポトサイトーシスでは、レセプターは、カベオラとして公知の細胞表面の小さい（約50nm直径）穴または小胞に存在する。これらのカベオラは、細胞表面でまたはその付近で、開閉のサイクルを行っているままである。閉じている場合、膜内のプロトンポンプは、カベオラ内約6.0のpHを生じる。カベオラのpHが十分に低くなる場合、ビタミンは、結合したポリマーとともに、レセプターから放出される（Anderson）。次いで、親油性コンホメーションへのpH依存的遷移を受けた後、ポリマー化合物組成物は、脂質膜に挿入し、その後本明細書に記載のメカニズムにしたがって、サイトゾルへ輸送する。この経路は、代表的には、エンドサイトーシス経路のように大きなpHの差異を含まないが、ある有利点を提供する。カベオラは、プレリソソームに溶け込まず、したがって、分解性酵素への化合物の潜在的曝露が避けられる。さらに、水溶性ビタミンは、カベオラ内の低pHに曝露される場合、一般的に、ポリマーから放出され、遊離のポリマー薬物のサイトゾルへの侵入を可能にする。レセプターシグナルによって特異的に標的され得る細胞には、肝臓細胞（肝細胞）が含まれ、その表面は、ガラクトース末端糖タンパク質を特異的に認識するレセプターを含む。多くの悪性細胞は、特定のレセプターを過剰発現し、そのため、葉酸（Mathias）および上皮増殖因子（Deshpande）を使用して報告されているように、このような細胞を選択的に標的することができ得る。D-シクロセリンは、細菌の細胞形質膜を通る輸送を促進することが報告されている（Chopra，Ra paport）。Ｅ．血液-脳関門を横切る輸送血液-脳関門（BBB）は、血流と中枢神経系との間の物質の交換を調節し、薬物輸送に対する強力な障壁を提供する。脳毛細血管の内皮細胞は、隣接細胞と密接する細胞のまわりの周囲のバンドである「堅い連結」を含む。これらの連結は、細胞間の輸送を防止し、そのため、効果的な輸送については、化合物は、内皮細胞自体を通過しなければならない。このようなペプチドの輸送に関する研究は、親油性が、おそらく、BBBを横切るペプチドの輸送を促進することにおいて最も重要な因子であることを示す（Banga）。一般的に、化合物は、トランスサイトーシスによって細胞を横切って輸送され得る。毛細血管内の極性を与えられた内皮細胞（すなわち、明確な頂膜および基底膜を有する細胞）の場合、化合物は、最初に、トランスサイトーシス小胞へ、毛細血管内壁における頂膜を通って取り込まれる。このような小胞は、代表的には、約6.0のpHを到達する。小胞は、毛細血管外壁で、内皮細胞の基底膜に化合物を移動する。次いで、化合物は、トランスサイトーシス小胞から追い出され、それによって化合物を細胞および毛細血管の外に放出する。本発明の方法によれば、血液-脳関門を横切る化合物の輸送は、化合物を本発明のポリペプチドに連結することによって行われ得、これは以下に記載のように、選択された範囲内のpHで膜への分配に効果的である。組成物は、好ましくは、脳内皮細胞の表面のレセプターに結合するのに効果的な、レセプターシグナル（例えば、ヒポキサンチンまたはイノシン）にさらに連結される。脳血流への送達後、組成物は、上記のように、トランスサイトーシスによって毛細血管壁を横切って輸送される。次いで、組成物は、本明細書に記載のメカニズムに従って、エンドサイトーシスによって脳細胞に取り込まれ、そして細胞サイトゾルに放出されるために利用可能である。後者のプロセスでは、エンドソームは、約5.0のpHを有することが期待される。上記から、ポリマーが細胞膜を横切るのに効果的であるpHが、5.0と6.0との間、より一般的には、内皮細胞においてトランスサイトーシス小胞のpH以下および最終標的細胞においてエンドサイトーシス小胞のpH以上であるべきであることがわかり得る。pHが6.0以上であるならば、この場合、ポリマーは、トランスサイトーシス小胞内でその親油性コンホメーションをとりそしてその膜を浸透し、そのため標的した脳細胞の代わりに内皮細胞に侵入する。Ｆ．経皮送達皮膚の主な浸透性障壁である角質層は、細胞外脂質マトリクスに取り囲まれる角質化した上皮細胞からなる。皮膚を通る化合物の通過についての主な経路を構築する細胞外脂質マトリクスは、積み重ねた二重層の極性面間に分散した水および他の極性化合物とともに、脂質二重層の複数シートに整列した脂質（セラミド、コレステロール、遊離脂肪酸、およびコレステリルスルフェート）からなる。複数の交互になった極性および非極性層のこの構造は、親水性および親油性の両方の化合物の浸透のための強力な障壁を提供する。複数の脂質二重層のそれぞれは、親水性化合物の通過のための実質的な障壁として作用し、一方、積み重ねた脂質二重層の極性面間の水および他の極性化合物の層のそれぞれは、親油性化合物の通過に対する実質的な障壁として作用する。細胞外脂質マトリクスの積み重ねた二重層が、種々の浸透エンハンサー（例えば、Azone（1-ドデシル-アザシクロヘプタン-2-オン））、不飽和長鎖アルコール、および不飽和長鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸およびリノレン酸）によって乱雑にされ得ることが公知である（Aungstら，1986;RehfeldおよびElias，1982; Goldenら，1986;GoodmanおよびBarry，1985，1986）。浸透エンハンサーでの皮膚の処置は、種々の比較的両親媒性の薬物の改良された送達を与えるが、多くの親油性および親水性化合物の簡単かつ効果的な経皮送達は、当該技術分野で公知の方法によっては、依然として容易に達成されない。本発明によれば、適切なポリペプチドは、その低pH脂質溶解性形態で表皮の表面と接触する。皮膚表面のpHは、代表的には、5.0〜5.5の範囲にあるので（例えば、Yosipovitch，Kortingを参照のこと）、この範囲またはより高い遷移pHを有するポリペプチドは、主として皮膚表面にその低pH形態で存在する。ペプチドは、その親油性形態で、角質層の細胞外マトリクスの脂質層を通って拡散し得る。角質層の下にある水性コンパートメントとの接触の際、組成物は、このコンパートメントのほぼ中性pHでのポリペプチド鎖の漸進的イオン化および溶媒和によって、このコンパートメントに能動的に引き込まれる。親水性および親油性の両方の化合物が輸送され得る。この適用に好ましいポリペプチドは、約５と6.5との間のpHで可逆的pH依存的遷移を受ける。本発明のポリマー組成物は、好ましくは、上記のように、１つ以上の適切な浸透エンハンサーと協力して使用される。オレイン酸およびリノレン酸のような親油性酸は、脂質層を横切る通過の間、その低pH親油性形態でポリマーを維持するために添加され得る。これらの脂肪酸はまた、上記のように、浸透エンハンサーとして機能する。実施例11は、抗拒絶剤、シクロスポリンＡの経皮送達を増強するための、本発明の代表的ポリマー組成物の使用を示す。Ｇ．化合物送達後のポリペプチドの分布上記のように、本発明のポリペプチドは、細胞のサイトゾルに侵入した後、プロテアソームによって分解されやすく、そのため輸送された薬物または他の化合物を遊離する。この薬物の放出を、例えば、図２に示す。いくつかの場合では、ポリペプチドがもとのままであることが所望され得、この場合、ポリペプチドはD-アミノ酸から合成されるべきである。１つの例は、上でH．pyloriの根絶について記載されるように、胃への送達である。もう１つは、例えば、腫瘍細胞への、非常に毒性の高い薬物の選択的送達である。ポリペプチドの輸送作用が、より低いpHからより高いpHへ向かう一方向であるので、薬物に結合したポリペプチドは、最初に送達される標的細胞から薬物が拡散して戻ることを防止する。したがって、標的されていない細胞への接近から生じる、望ましくない副作用は最小になる。もとのままのポリペプチドはまた、細胞プロセスによる、送達された薬物の流出を防止または最小にし得る。多くの細胞は、細胞から薬物化合物を外へ輸送する薬物排出ポンプとして働く糖タンパク質を発現する。結合したポリペプチドは、このプロセスを妨害し易く、そして結合した薬物の流出（exportation）を減少させまたは防止し易い。薬物に結合したポリペプチド全体を維持することの代替として、ポリペプチドは、薬物に隣接した１つ以上のD-アミノ酸および残りのL-アミノ酸で調製され得る。L-アミノ酸は、プロテアソームによって除去され、薬物に結合したD-アミノ酸の短くなったポリペプチド「テイル（tail）」を残す。しかし、D-およびL-アミノ酸セグメントが連結される場合、αヘリックスの局所的な崩壊がこのようなセグメントの連結部で生じ易いことに留意すべきである。この場合、近傍における遊離カルボキシルの遮蔽および水素結合は効率が低く、そしてすべて１つの立体配置が使用される場合よりも、ポリペプチドのαヘリカル形態は親油性が少ない場合がある。Ｈ．処方物および投与本発明の組成物を含む処方物は、好ましくは正確な投与量の単純投与に適切な単位投与形態で、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、持続放出処方物、溶液、懸濁液、乳化液、坐剤、軟膏、ローション剤、またはエアロゾルのような、固体、半固体、または液体投与形態であり得る。このような処方物には、代表的には、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤が含まれ、そして、他の医療薬剤、キャリア、またはアジュバントをさらに含み得る。好ましくは、処方物は、本発明の１つまたは複数の化合物の約0.5重量％〜75 重量％を含み、残りは適切な薬学的賦形剤からなる。経口投与については、このような賦形剤には、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。所望であれば、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、または緩衝剤のような、少量の非毒性補助化合物を含み得る。液体組成物は、溶液または懸濁液を形成するために、例えば、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、またはエタノールのようなキャリア中に、ポリペプチド−化合物組成物（約0.5％〜約20％）および必要に応じた薬学的アジュバントを溶解または分散することによって調製され得る。組成物は、種々の公知の経路、例えば、経口、上記のような経皮、あるいは非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射による）によって被験体に投与され得る。経口液体調製物での使用については、組成物は、液体形態、あるいは水または正常生理食塩液中での水和に適切な乾燥形態のいずれかで供給される、溶液、懸濁液、乳化液、またはシロップとして調製され得る。経皮送達は、代表的には、選択された皮膚領域への化合物のゆっくりした送達を可能にする経皮「パッチ」の使用を含む。経皮パッチ送達システムの例は、米国特許第4,655,766号（液体を吸収する浸透圧駆動システム）、および米国特許第5,004,610号（速度制御した経皮送達システム）によって提供される。経皮送達については、上記のように、浸透を増強する化合物を含むことが所望であり得る。このような処方物は、目的の領域への閉塞詰め物(occluded dressi ng)として提供され得るか、あるいは１つ以上の上記の経皮パッチ形状で提供され得る。非経口投与については、非経口投与用の注入可能組成物は、代表的には、滅菌生理学的塩溶液のような、適切なIV溶液中に、本発明の組成物を含む。組成物はまた、脂質またはリン脂質中、リポソーム懸濁液中、または水性乳化液中の、懸濁液として処方され得る。このような投与形態を調製する方法は公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)を参照のこと。以下の実施例は、本発明を例示する。実施例１ポリマー組成物の代表的調製方法Ａ．組み立て図10に示すように、β-アラニンがポリペプチドのＣ末端残基を構成するように、合成樹脂を調製する。0.7mMolのp-アルコキシベンジルアルコール，１（Cat .# A3039，Sigma Chem．Co.，St．Louis，MO）を含む１グラムの１％架橋ポリスチレン樹脂を、８mlのN-メチルピロリジノン（NMP）に溶解し、そして0.62gのフルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）β-アラニン，2を添加し、次いで316μ ｌのN,N'-ジイソプロピルカルボジイミドおよび41μｌのN-メチルイミダゾールを添加する。このスラリーを、37℃で100分間激しく撹拌しながらインキュベートし、次いでNMP続いてCH₂Cl₂で徹底的に洗浄し、排出し、そして乾燥する。これは、物質１グラム当たり約250μｍｏｌのβ-アラニン-FMOCの含有量（loading ）で樹脂3を与える。ポリペプチドを伸長するための保護した／活性化したアミノ酸のその後の添加は、Athertonら(1988)により行われ得る。この方法は、4で示すような、N-フルオレニルメトキシ-カルボニルペンタフルオロフェニルアミノ酸エステルを使用する。所望ならば、図8B〜Cに示されるような、末端を改変する構造が付加され得、ここで、活性化したエステル5は、ポリペプチドのＮ末端と反応する。次いで、標準的方法に従ってポリペプチドを切断しそして脱保護する。ポリペプチドの末端以外の１つ以上の位置で輸送されるべき化合物（代表的には薬物）を結合することが望まれる場合、適切に保護されたリジンまたはシステインは、代表的には、１つまたは複数の選択された結合位置に組み込まれる。合成樹脂からの完成したポリペプチドの切断および側鎖脱保護の後、薬物は、図９に示される連結を与えるために、実施例２に記載のように、得られるアミンまたはスルフヒドリル部分に結合され得る。あるいは、ある薬物は、エステル結合によって、グルタミン酸のγカルボキシルまたはアスパラギン酸のβ-カルボキシルに、必要であれば適切に保護して、結合され得る。次いで、得られたアミノ酸を、１つ以上の選択された位置でポリペプチド鎖に組み込む。このような薬物は、ポリペプチドを組み立てるために、合成樹脂からポリペプチドを切断するために、および側鎖を脱保護するために使用される条件で残存する構造を有さなければならない。Ｂ．末端改変輸送されるべき化合物がＮ末端を介して結合されない場合、一般的に、Ｎ末端極性部位の少なくともいくつかを遮蔽または欠失することが望ましい。これは、完成した樹脂結合ポリペプチドのＮ末端からFOMC部分を切断し、次いで無水グルタル酸、無水酢酸、または図6Eに示されるスクシンイミド誘導体のニトロフェニルエステルで処理して、それぞれ図6B、6C、および6Dに示されるような末端構造を得ることによって、容易に達成される。Ｃ．合成樹脂からの切断、脱保護、および単離完成したポリペプチドは、樹脂をCH₂Cl₂で洗浄し、排出し、そして樹脂１グラム当たり、10mlのトリフルオロ酢酸（TFA）、10mlのCH₂Cl₂、および400mgのジチオエリトリトールを含む溶液を添加することによって、樹脂から切断され得る。 20分後、切断溶液をフラスコに排出し、そしてCH₂Cl₂をエバポレーションによって除去する。その後、５〜10ml TFAを添加し、そして溶液を４時間43℃に保持して、保護基の除去を行う。一般的に、脱保護したポリペプチドの後処理は、エーテル沈殿、エーテルでの完全な洗浄および乾燥を伴う。本発明の組成物を調製するためにも適切である当該技術分野で公知の種々の他のペプチド組み立て方法があることが、理解されるべきである。実施例２カラム上でのポリペプチドへの化合物の結合合成樹脂からポリペプチドを切断しそして側鎖を脱保護するために使用される条件で残存し得る薬物または他の化合物（例えば、分配および細胞侵入研究についての蛍光タグ）については、完成した樹脂結合ポリペプチドのＮ末端からFMOC を切断し、次いで末端アミンにこのような化合物を連結することが、しばしば望ましい。このような場合、結合されるべき化合物は、代表的には、図９に示されるようなポリペプチドに、それぞれアミドまたはカルバメート結合を形成するのに効果的な活性エステルまたは活性カーボネート部分を生成するために、当該技術分野で公知の方法によって、活性化される。以下の実施例３〜７は、カラムからの除去後にポリペプチドに化合物を結合する代表的方法を記載する。実施例３ポリペプチドのシステイン残基へのジスルフィド結合ポリペプチド組成物のシステインに薬物を連結するための便利な十分に確立された方法では、脱保護されたポリペプチドは、2,2'-ジピリジルジスルフィドと反応し、そしてスルフヒドリル部分を含む薬物を添加して、図７および11に示されるように、所望のジスルフィド結合を形成する。このようなジスルフィド結合の特に有利な点は、細胞外コンパートメントでおよびエンドソーム内で比較的安定であるが、エンドソーム膜を横切る輸送後、サイトゾルコンパートメントで容易に切断されることである。以下の具体的な実施例は、この方法の適用を例示する。 3A．ジスルフィド結合したポリペプチド−シクロスポリン結合体の調製．配列（FMOC-ELLD-[LELLD]₇LELLβ；β＝β-アラニン）を有するポリペプチドは、実施例1Aで与えられる方法によって固相支持体上で組み立てられる。末端FMOC基を、NMP中20％のピペリジンでの処理によって切断し、そして末端S-トリチル化FMO C-システインを、実施例1Aの方法によって組み込む。FMOC基の切断およびアセチル化の後、ポリペプチドをカラムから切断し、脱保護し、沈殿させ、そして実施例1Cのように洗浄する。ポリペプチドを、0.1Mジチオトレイトールを含むpH＝7. 5のtris緩衝液に溶解する。溶液を、等容量のアセトニトリルで希釈し、そして十分なジピリジルジスルフィドで処理して0.4モル溶液を生成する。室温にて２時間撹拌した後、混合物を、等容量の水で希釈し、十分な水飽和した酢酸エチルで洗浄して、過剰のジピリジルジスルフィドを除去する。溶液を部分的にエバポレートして残りの酢酸エチルを除去し、そして生成物を、Amberchrome（TosoHaa s）を通す溶液の通過、次に0.01％トリエチルアミン緩衝液を含む０〜80％アセトニトリルでの溶出、次に凍結乾燥によって単離する。別々のフラスコに、一級ヒドロキシル基を有するシクロスポリンＡメタボライト17（EberleおよびNuninger，1992）を、ChenおよびTai(1995)の方法を使用して無水コハク酸で処理し、そして酸を、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-(3 -ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジド（Aldrich）で活性化エステルに変換する。生成物を、DMFに溶解し、そして2-アミノエタンチオール塩酸塩およびトリエチルアミンで処理する。反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、そして0.1Mクエン酸で洗浄して、過剰の試薬を除去する。生成物を、エバポレーションによって得る。残渣をDMFに溶解し、そしてこれまでの段落からのピリジルポリペプチドジスルフィドで処理する。生成物を、DMFのエバポレート除去、次いで0.01％トリエチルアミン緩衝液中０〜80％アセトニトリルで溶出するAmberchromeでの逆相精製、次に凍結乾燥によって単離する。あるいは、DMFのエバポレーションに続いて、生成物を、0.1MN a₂HPO₄に溶解し、そして水で飽和した酢酸エチルで十分に洗浄する。溶解した酢酸エチルを除去するための部分エバポレーションの後、ギ酸を添加して、生成物を沈殿させ、これを0.1％ギ酸を含む水で十分に洗浄し、次いで高真空下で完全に乾燥させる。 3B．ジスルフィド結合したポリペプチド−Taxol^TM結合体の調製．システインの末端ピリジルジスルフィド部分とともに配列（AcNH-CELLD-[LELLD]₇LELLβ； β＝β-アラニン）を有するポリペプチドを、上記の項のように調製する。別々の容器中で、Taxol^TMを、Gueritte-Vogeleinら(1991)の方法によって、7- グルタリルTaxol^TMに変換する。この種のカルボキシル基を、ジクロロメタン中1 -(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジド（Aldrich）および4-ジメチルアミノピリジンを使用して、N-ヒドロキシスクシンイミドとの N-ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化する。生成物を、DMFに溶解し、そして2-アミノエタンチオール塩酸塩およびトリエチルアミンで処理する。反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、そして0.1Mクエン酸で洗浄して、過剰の試薬を除去する。生成物をエバポレーションによって得る。残渣をDMFに溶解し、そして上記からのピリジルポリペプチドジスルフィドで処理する。生成物を、シクロスポリンの実施例のように単離する。実施例４ポリペプチドのシステイン残基へのチオエーテル結合 4A．チオエーテル結合ポリペプチド−シクロスポリン結合体の調製．シクロスポリンＡメタボライト17（実施例3Aを参照）を、1:1ジクロロメタン／ピリジン中の無水クロロ酢酸で処理し、酸クロリドを形成する（図11を参照のこと）。過剰の試薬を、水の添加によってクエンチし、そして溶媒をエバポレートする。残渣を酢酸エチルに溶解し、そして0.1Mクエン酸、0.1M重炭酸ナトリウム、および塩水で洗浄し、次いでエバポレートする。残渣をDMFに再溶解する。実施例3Aで調製されたポリペプチドピリジルジスルフィドを、pH9.0ホウ酸緩衝液に溶解する。これを、等容量の上記のDMF溶液（CS:ポリペプチドの比＝4:1 ）と混合し、そしてTCEP（トリス(カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩）を添加する。室温で撹拌した後、生成物を、実施例3Aでのように単離する。 4B．チオエーテル結合したポリペプチド−Taxol^TM結合体の調製．配列（FMOC- ELLD-[LELLD]₇LELLβ；β＝β-アラニン）を有するポリペプチドを、実施例1Aでのように固相支持体上で調製する。末端FMOC基を除去し、そしてカラムをジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメタン中のアクリロイルクロリドで処理して、末端アクリリル基を形成する（図11）。ポリマーをカラムから取り出し、標準的方法に従ってトリフルオロ酢酸を使用して脱保護し、沈殿させ、そして洗浄する。生成物を、pH9.0ホウ酸緩衝液に溶解する。別々のフラスコ中で、Taxol^TMを、実施例3Aでの方法によってチオール化した種に変換する。生成物をDMFに溶解し、上の段落からのアクリルアミド種と混合し、そしてTCEPを添加する。室温にて撹拌後、生成物を実施例3Aにおけるように単離する。実施例５ポリペプチドのアミン部分へのカルバメート結合実施例1Cでのように調製した１つ以上のアミン部分を含む脱保護したポリペプチドのエーテル沈殿物を、0.1M Na₂HPO₄水溶液に溶解する。ポリペプチドを沈殿させるために十分なギ酸を添加し、そして沈殿物を遠心分離によって集め、そして水中0.1％ギ酸で２回洗浄する。次いで、ポリペプチド沈殿物を、高真空下で一晩乾燥させる。少なくとも１つのヒドロキシル部分を含む、ポリペプチドに結合されるべき化合物を、NMP中３当量のビス-ニトロフェニルカーボネートおよび0.1当量のトリエチルアミンと反応させることによって活性化する。活性化後、過剰のビス-ニトロフェニルカーボネートを除去し、次いで活性カーボネート生成物（図11を参照のこと）を、NMP中の、上記のように調製した、0.5〜２当量のポリペプチド組成物と反応させる。一般的に、良好なカップリングを、43℃にて12〜72時間のインキュベーションによって達成する。実施例６アミン部分へのアミド結合 6A．アミド結合したポリペプチド−シクロスポリン結合体の調製．１．所定の長さのペプチドの使用．配列（FMOC-ELLD-[LELLD]₇LELLβ；β＝β -アラニン）を有するポリペプチドを、実施例1Aで与えられる方法によって、固相支持体上に組み立てる。末端FMOC基を、実施例1Aでの方法のように切断し、そして樹脂を、NMP中の過剰のグルタル酸のビス−(4-ニトロフェニル)エステルで処理する。（エステルを、ジクロロメタン中のトリエチルアミンを使用して、グルタリルクロリドおよびニトロフェノールから調製する。過剰のニトロフェノールおよび未反応のグルタル酸種を除去するために、水酸化ナトリウム溶液で洗浄した後、エバポレートした生成物を、トルエンから再結晶する。）活性化したポリペプチドを、カラムから切断し、沈殿させ、そして実施例1Cでの方法を使用して洗浄する。別々のフラスコ中で、シクロスポリンＡメタボライト17（実施例3Aを参照のこと）を、4-ジメチルアミノピリジン触媒の存在下、ジクロロメタン中のグリシンのFMOC誘導体および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジド（Aldrich）で処理する。反応混合物を、酸および塩基で洗浄して、過剰の試薬を除去し、そして生成物を、クロロホルム中の０〜２％メタノールを使用して、シリカゲル上でクロマトグラフィーを行う。FMOC基の除去を、DMF中20 ％トリエチルアミンを含むFMOC-グリシルシクロスポリンの、50℃での１時間の処理によって達成する。トリエチルアミンを、真空下エバポレーションによって除去し、そして遊離のアミノ誘導体を、上記の活性化したポリペプチドと混合する。溶液を、最小容量まで真空下でエバポレートし、そして42℃にて24時間放置する。生成物を、実施例3Aにおけるように単離する。２．ランダム長の高グルタミン酸含量ペプチドの使用．高グルタミン酸含量の、Ｃ末端イニシエーター領域を有するランダム長ペプチドを、以下のように調製する。 N-Fmoc-β-アラニンをプレロードしたクロロトリチル樹脂（Novabiochem，LaJ olla CA）を、HBTU（Novabiochem）およびジイソプロピルエチルアミンを使用して、N-α-Fmoc-L-グルタミン酸γ-t-ブチルエステルおよびN-α-Fmoc-L-ロイシンと反応させて、FMOC-LeuGlu(OtBu)LeuLeu-NHCH₂CH₂COO-樹脂を生成する。次いで、Fmoc基を、通常の方法で除去する。樹脂結合したイニシエーターペプチドを、約10対１の無水物対イニシエーター比を使用して、DMF中L-グルタミン酸γ-(4-メトキシベンジル)エステルのカルボキシ無水物（Hanabusaら，1984）で６回処理した。これは、ペプチドに約40〜50 の保護したグルタミン酸残基を付加するために十分である。次いで、N-末端を、過剰のグルタル酸のビス-(p-ニトロフェニル)エステルと反応させる。ペプチドを、実施例1Cに記載のように、樹脂から切断しそして脱保護する。エバポレーション後の残渣を、ジクロロメタンに溶解し、そして水で洗浄して、少量のトリフルオロ酢酸を除去する。単離したポリ酸をDMFに溶解し、そしてTaxol^TM -7-アラニン（Mathewら，1992）で処理する。反応混合物を、pH7.0リン酸緩衝液で希釈し、そして生成物を、０〜1.0M NaClグラジエントを使用するQ-Sepharo se（Pharmacia，Piscataway，NJ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。次いで、物質を、Amberchrome SD(TosoHaas)への吸着、０〜80％アセトニトリルグラジエントでの溶出、および凍結乾燥によって、ナトリウム塩として単離する。 6B．アミド結合したポリペプチド-Taxol^TM結合体の調製．配列（H₂N-ELLD-[LE LLD]₇LELLβ；β＝β-アラニン）を有するポリペプチドを、末端アミノ基とともに、実施例１および５におけるように調製する。別々の容器中で、Taxol^TMを、Gueritte-Vogeleinら(1991)の方法によって、7- グルタリルTaxol^TMに変換する。この種のカルボキシル基を、ジクロロメタン中の1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジド（Aldrich ）および4-ジメチルアミノピリジンを使用して、N-ヒドロキシスクシンイミドとのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化する。過剰の試薬および副生成物の除去のための洗浄後、エステルを、エバポレーションによって単離し、そしてDMF中でポリペプチドと混合する。溶液を、最小容量まで真空下でエバポレートし、そして42℃にて24時間放置する。生成物を実施例３におけるように単離する。 6C．ポリペプチドと20マーのモルホリノアンチセンスオリゴの5'末端との間のアミド結合の調製．モルホリノオリゴおよびポリペプチドの構造およびサブユニット配列は、図13を参照して、以下のとおりである： R₁＝-ELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLβ ここでD＝アスパラギン酸、E＝グルタミン酸、L＝ロイシン、β＝β-アラニン R₂=5'-G^*G^*UG^*G^*UUC^*C^*UUC^*UC^*A^*G^*UC^*G^*G^*-アセチルここで A^*＝モルホリノ6-ベンゾイルアデニン C^*＝モルホリノ6-ベンゾイルシトシン G^*＝モルホリノ6-フェニルアセチルグアニン U＝モルホリノウラシル手順１（図13A）：図13Aに１で示される、SummertonおよびWeller(1993)のように調製した、17mg（２μＭｏｌｅ）の塩基保護したモルホリノアンチセンスオリゴ（MW 8361）を、200μｌ NMPに懸濁する。ビス(p-ニトロフェニル)スクシネート2（7.2mg;20μＭｏｌ）を添加し、そして調製物を43℃にて４時間インキュベートする。未反応のスクシネートを、30mlのアセトニトリルからモルホリノ− スクシネート生成物を沈殿させることによって除去し、遠心分離し、上清を捨て、0.4mlのNMP中でペレットを再懸濁し、30mlのアセトニトリルに添加し、遠心分離し、上清を捨て、そして高真空下でペレットになったモルホリノ−スクシネート生成物3を乾燥させる。上で調製した、スクシネートリンカー3（２μＭｏｌｅ）を有するモルホリノアンチセンスオリゴを、4で示される、上で定義されるような、31mg（６μＭｏｌｅ）の脱保護した44-アミノ酸ポリペプチドR₁-NH₂とともに３mmのマグネチック撹拌バーを含む0.75mlバイアルに入れ、実施例2B(iii)に記載のように水溶液から沈殿させ、これはＮ末端に遊離アミン部分を有する。DMF（150μＬ）を添加し、そして混合物を、溶解が完了するまで温水浴中で撹拌する。次いで、反応混合物を43℃にて72時間インキュベートし、200μＬのNMPで希釈し、そして2mlのスクリューキャップバイアルに移す。600μＬの濃NH₄OHを添加し、そして溶液を 43℃にて18時間インキュベートして、モルホリノアンチセンスオリゴのプリンおよびピリミジン塩基を脱保護する。生成物5を、実施例8Cに記載のように精製する。手順２（図13B）：この手順では、活性化したスクシネートリンカーをポリペプチドに付加し、そして付加物をモルホリノアンチセンスオリゴと反応させる。したがって、実施例１におけるように調製した、180mgの合成樹脂／ポリペプチドのNMP懸濁液を、NMP中の20％ピペリジンで処理し、次いでNMPで繰り返して洗浄する。ビス(p-ニトロフェニル)スクシネート（150mg）を0.9mlのNMPに溶解し、樹脂／ポリペプチド調製物を含む短いフリットカラムに添加し、そして43℃にて２時間インキュベートする。過剰のスクシネートリンカーを洗い流し、そして実施例1Cに記載のように、生成物を合成樹脂から切断して、ポリペプチド−スクシネート生成物（MW 5329）を得る。マグネチック撹拌バーを含む0.75mlバイアル中に、上記のように調製した32mg （６μＭｏｌｅ）のポリペプチド−スクシネート生成物を入れ、そして5'二級アミン部分を含む17mg（２μＭｏｌｅ）のモルホリノアンチセンスオリゴ（1）、および150μＬのDMFを添加する。この混合物を、溶解が完了するまで温水浴中で撹拌する。次いで、反応混合物を、43℃にて48時間インキュベートする。その後、反応混合物を、200μＬのNMPで希釈し、そして２mlのスクリューキャップバイアルに移す。600μＬの濃NH₄OHを添加し、そして溶液を43℃にて18時間インキュベートして、モルホリノアンチセンスオリゴのプリンおよびピリミジン塩基を脱保護する。生成物（5）を、実施例8Cに記載のように精製する。手順３（図13C）：モルホリノアンチセンスオリゴを調製し、ここでは、当該技術分野で公知の方法に従って、5'-SHを含む第１のサブユニットを、ジスルフィド結合を介して合成樹脂に連結する。依然として保護された塩基を有する2vut hMorpholinoオリゴを、１％wt/volジチオトレイトールおよび５％v/vトリエチルアミンを含むN-メチルピロリジノンを使用して、合成樹脂から切断する。溶出されたオリゴを、t-ブチルメチルエーテルで沈殿させ、そしてペレットを、t-ブチルメチルエーテルで２回洗浄し、次いで高真空下で乾燥させて、5'-SHおよび3' アセチルを有する塩基保護されたモルホリノオリゴを得る。図10に示されるように調製した、配列E₃₂MELMLβ（Ｎ末端からＣ末端）を有する、なお合成樹脂上にあるポリペプチドを、ジクロロメタン中の無水クロロ酢酸を使用してＮ末端でキャップし、そして樹脂を完全に洗浄する。次いで、ポリペプチドを切断し、そして49:49:2のTFA:CH₂Cl₂:H₂Oで樹脂から溶出し、CH₂Cl₂をアスピレーター真空下で除去し、98:2のTFA:H₂Oを添加し、そして溶液を43℃にて４時間からインキュベートする。次いで、ポリペプチドを、t-ブチルメチルエーテルで沈殿させ、そしてペレットをt-ブチルメチルエーテルで２回洗浄し、そして高真空下で乾燥させて、図13Cに示されるクロロアセチル化したポリペプチドを得る。モルホリノオリゴおよびポリペプチドを、５μｍｏｌｅの5'-SHモルホリノオリゴ、10μｍｏｌクロロアセチルポリペプチド、および400μｍｏｌ N,N-ジメチルエタノールアミンを１mlのホルムアミドに添加することによってカップリングし、溶解が完了するまで撹拌し、次いで室温にて２時間インキュベートして、手順3vuth、図13Cに示されるように、チオエーテル結合によって連結されたポリペプチド−モルホリノオリゴを得る。モルホリノオリゴの塩基を、２容量の濃NH₄O Hを反応混合物に添加することによって脱保護し、そして43℃にて16時間インキュベートする。過剰のNH₃を放出した後、生成物を、実施例8Cに記載のように、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。実施例7A カルボキシル部分へのアミド結合この実施例は、ランダム長の高グルタミン酸含量ペプチドとの、アミド結合したポリペプチド−Taxol^TM結合体の調製を記載する。高グルタミン酸含量の、Ｃ末端イニシエーター領域を含むランダム長ペプチドを、まず以下のように調製する。 N-Fmoc-β-アラニン（Novabiochem）で予備充填（preload）されたクロロトリチル樹脂を、HBTU（Novabiochem）およびジイソプロピルエチルアミドを使用して、N-α-Fmoc-L-グルタミン酸γ-t-ブチルエステルおよびN-α-Fmoc-L-ロイシンと反応させて、Fmoc-Leu-Glu(OtBu)LeuLeu-NHCH₂CH₂COO-樹脂を生成する。保護されたペプチドを、ジクロロメタン中0.5％トリフルオロ酢酸との処理によって樹脂から除去する。残渣を、ジクロロメタンで再溶解し、そしてジフェニルジアゾメタン（Kametaniら）で処理してＣ末端ジフェニルメチルエステルを生成し、そして生成物をヘキサンで沈殿させる。残渣をジクロロメタンで溶解し、そして生成物をエーテル／ヘキサンで沈殿させる。沈殿物を、20％(v/v)ピペリジンを含むDMFに溶解する。溶液をエバポレートし、そしてアミノ末端のイニシエーターペプチドを伸長のために用意する。イニシエーターペプチドをDMFに溶解し、そしてL-グルタミン酸γ-(4-メトキシベンジル)エステルのカルボン酸無水物（Hanabusaら）と反応させる。無水物対イニシエーター比は、約60:1であった。これは、約40〜50の保護されたグルタミン酸残基をペプチドに付加するために十分である。反応を、無水酢酸の添加によってクエンチし、溶媒をエバポレーションによって除去し、そして生成物をエーテル／ヘキサンを使用してジクロロメタンからの繰り返し沈殿によって精製した。ペプチドを、実施例1Cに記載のように脱保護し、そして0.1M Na₂HPO₄への溶解によって結合のために調製し、次いで実施例５に記載のようにギ酸で沈殿する。ポリ酸をDMFに溶解し、そして酸側鎖の５〜30％を置換するために十分な、Taxol^TM -7-アラニン（Mathewら）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドメチオジドで処理する。反応混合物を、pH7.0リン酸緩衝液で希釈し、そして生成物を、０〜1.0M NaClグラジエントを使用するQ-Sepharose（Pharma cia）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。次いで、物質を、A nberchrome SD(TosoHaas)への吸着、０〜80％アセトニトリルグラジエントでの溶出、および凍結乾燥によって、ナトリウム塩として単離する。実施例7B Ｎ末端システインへのアミド結合非常に効果的なカップリングは、Dawsonら（1994）の方法に従って、活性チオエステルを含む薬物または他の化合物とＮ末端システイン残基との間で行われ得る。図11に示されるように、このカップリングは２工程で進行する。最初のチオエステルにおけるシステインスルフヒドリルの攻撃の後に、アミド結合を形成するための生成物のチオエステルにおけるＮ末端アミンによる迅速な分子内攻撃が続く。実施例８ポリマー化合物生成物の精製および構造分析のための代表的方法Ａ．シリカゲルクロマトグラフィーポリペプチド成分が組成物のクロマトグラフィー特性を左右する、多くのポリペプチド−薬物生成物については、精製は、シリカゲルクロマトグラフィーによって容易に達成される。約1:1〜3:1，v/vの範囲の割合でのイソプロパノールと2 5％トリエチルアミン水溶液との混合物は、代表的には、良好なクロマトグラフィー分解能を提供する。Ｂ．分配による精製減少したpHでオクタノールに良好に分配するポリペプチド組成物（一般的に、 50％未満のアミノ酸組成物を有するもの）は、n-オクタノールとポリペプチドの遷移pHより約0.2pH単位低いpHを有する水性緩衝液との間で分配することによって、ポリペプチド組み立て中に生じる望ましくない失敗した配列から、しばしば効果的に分離され得る。精製したポリペプチドは、水性Na₂HPO₄への分配によっってオクタノール相から回収され得、次いでギ酸で沈殿させる。代表的には、この精製手順は、薬物の結合前に行う。この「機能による精製（purification-by- function）」方法は、失敗配列の重要な画分を含むかなり長いポリペプチドの調製に有用であることが見いだされている。Ｃ．イオン交換／逆相クロマトグラフィーポリペプチド−薬物生成物を精製するための特に多才な方法は、イオン交換クロマトグラフィー次いで逆相クロマトグラフィーを用い、ここで後の段階は塩を除去しそしてさらなる精製を提供する。この精製方法の使用は、ポリペプチド− モルホリノアンチセンスオリゴ生成物について記載され、その合成は実施例6Cに記載されそしてその構造は図13に示される。ポリペプチド−モルホリノオリゴ調製物を、回転蒸発（rotovap）フラスコに移し、そして過剰のアンモニアをアスピレーター真空下で除去する。約10mlのTr is酢酸緩衝液（0.1M Trizma塩基、酢酸でpH8）を添加し、そして溶液を、MacroP rep Q陰イオン交換樹脂（BioRad Corp.）の2.5cm×15cmカラムにロードする。ロードした後、カラムを、Tris酢酸緩衝液で10分間洗浄し（流速５ml/分）、次いでNaClを０から1.0Mまで直線的に増加させるTris酢酸緩衝液で、40分間かけて溶出する。このシステムでは、モルホリノアンチセンスオリゴ（254nmでモニターする）は最初の15分で溶出し、そしてポリペプチド−モルホリノ生成物は、約 30分で溶出する。ポリペプチド−モルホリノピークを集め、次いで50μｍポリプロピレンの2.5c m×15cmカラム（Polysciences Corp.）で脱塩する。この逆相カラムを、１％濃N H₄OHで15分間洗浄し、次いで１％濃NH₄OH中０〜80％アセトニトリルグラジエントで、5ml/分の流速で40分かけて溶出する。ポリペプチド−モルホリノオリゴ生成物を含む画分を合わせ、アセトニトリルおよびアンモニアを除去するために簡単に回転蒸発（rotovaped）し、次いで凍結乾燥する。Ｄ．マススペクトル分析マススペクトル分析について、ポリペプチド−モルホリノ生成物の一部を、１％濃NH₄OH中20μＭの濃度で懸濁する。3,4,5-トリヒドロキシアセトフェノン／クエン酸ジアンモニウム（1:2）で共結晶（co-crystallize）したこの物質を、レーザー脱着飛行時間型マススペクトロメトリーによって分析する。代表的分析では、11,881のマスが見られ、これは図13で示されるポリペプチド−モルホリノ生成物について予測された11,861の計算マスとほぼ正確に一致する。実施例９分配特性の評価特定の送達適用のためのポリペプチド組成物の最適化において、ポリペプチド成分単独における分配研究を最初に行うことが、しばしば望まれる。このような研究では、一般的に、オクタノールと水相との間のポリペプチドの分布の定量を簡単にするための発色団または蛍光団タグを付加することが有用である。これに関して、5-カルボキシフルオレセインは、容易に定量されそして合理的な長さのポリペプチドの分配特性に過度の影響を有さないタグを構築する。このタグは、細胞侵入研究に適切な容易に可視化されるシグナルを提供することのさらなる有利点を有する。代表的分配研究を、以下に記載する。ストック緩衝液１｛0.1Mクエン酸（pK_a1 ＝3.14；pK_a2＝4.77；pK_a3＝6.39）、0.1M N-モルホリンエタンスルホン酸（MES ；pK_a＝6.1）、および0.1Mリン酸（pK_a1＝2.2；PK_a2＝7.2)｝およびストック緩衝液２（0.1M MESナトリウム塩、0.1Mクエン酸三ナトリウム、および0. 1Mリン酸二ナトリウム）を調製する。ストック緩衝液１をストック緩衝液２で滴定して、約0.2pH単位づつ増加する、pH4〜pH8の範囲の一連の緩衝液を形成する。各バイアルが0.28mlの１つの緩衝液のセットおよび0.3mlの溶媒を含む、１セットの0.75mlガラスバイアルを調製する。溶媒は、約50％未満の酸アミノ酸を含むポリペプチドのためのn-オクタノールおよび約50％を越える酸アミノ酸を含むポリペプチドのためのn-ペンタノールである。このセットの各バイアルに、結合したカルボキシフルオレセインを有するポリペプチドの0.1mM水溶液の20μｌを添加する。これらのバイアルのそれぞれをキャップし、完全に振盪し、次いで遠心分離して相を分離する。その後、150μｌの上のオクタノール相を、150μｌの 85％イソプロパノール／15％1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン（DBU ）に添加し、そしてこの溶液の吸光度を、500nmで測定する。次に、150μｌの下の水相を、150μｌの85％イソプロパノール／15％DBUに添加し、そして吸光度を測定する。図14A〜Fは、本発明の６つの代表的フルオレセインでタグ付けしたポリペプチド組成物についてのpHの関数としてのこれらの吸光度値のプロットを示し、ここで、６つの異なるポリペプチドは、5.1〜6.9の範囲のオクタノール／水遷移pH値を示す。実施例10 サイトゾル侵入の評価Ａ．直接侵入この実施例は、細胞外培地から直接、付着した動物細胞のサイトゾルへの、結合した薬物を含むまたは含まない、フルオレセインでタグ付けしたポリペプチド組成物の輸送についてのテストのための有用な方法を記載する。エンドサイトーシスによる感知できる細胞侵入が、この手順の短い期間（約20分）で生じないことに留意すべきである。蛍光顕微鏡検査で一般的に使用される封入培地は、細胞の環境の浸透圧およびpHの両方を改変するので、これらの細胞侵入研究に封入培地を使用しないことが推奨される。その代わりに、細胞を、水浸用対物鏡を使用して検査する。さらに、細胞を検査する培養培地が、フェノールレッド（これは、代表的には、培養培地中でpH指示薬として使用される）を含まないことが望ましい。なぜなら、この化合物が蛍光シグナルを妨害するからである。直接細胞侵入研究についての手順を以下に記載する。培地１は、NaOHでpH6.5 に調節された、20mM MES（モルホリンエタンスルホン酸）で緩衝化した無血清培地を含む。培地２は、pH5.0に調節された、50mM MESで緩衝化された無血清培地を含む。フルオレセインでタグ付けしたポリペプチド組成物の1mM溶液の150μｌアリコートを、1.9mlの培地１に希釈し、そして0.5ml部分を、Hela細胞が24時間前にプレーティングされた、４つのガラスチャンバースライドの２cm×２cmウェルに添加する。10分後、375μｌの培地２を、ウェル２、３、および４（pH6.0を与える）に添加する。さらに10分後、さらなる375μｌの培地２を、ウェル３および４（pH5.8を与える）に添加する。10分後、さらなる500μｌの培地２を、ウェル４（pH5.6を与える）に添加する。各添加の後、スライドを、穏やかに渦巻かせて、溶液を完全に混合する。最後の添加の10分後、すべてのウェルをアスピレートし、そして各ウェルを、1ml容量のDME-F12培養培地＋10％FBS，pH7.4で３回洗浄し、そして細胞を、蛍光顕微鏡検査によって観察する。サイトゾル侵入は、一般的に、細胞の内部全体にわたる拡散した蛍光によって示される。しかし、いくつかの化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）が、続いて、サイトゾルから核（ここにこれらが優先的に蓄積する）へ通過することに、留意すべきである。したがって、直接侵入実験における核蓄積もまた、良好なサイトゾル侵入についての証拠である。蛍光顕微鏡検査によるサイトゾル侵入の上記の定量的評価の他に、輸送される薬物に特異的な定性的および／または定量的機能アッセイもまた、減少-pH培地での細胞の処理後に行われ得ることが、理解されるべきである。上記の手順は、所望の場合、輸送されるべき結合した化合物を含む、本発明の所定のポリペプチド組成物の膜貫通輸送を行うために、pHがどれくらい低くなければならないかについての情報を提供する。ポリマーが、アルカリ金属塩基またはアンモニアでよりも、トリエチルアミンで、精製中に中和される場合、一般的に、優れた侵入が得られたことに、留意すべきである。この効果は、比較的親油性の対イオンによるものであり得る。したがって、テストされるべきポリペプチドは、この結果における対イオンの任意のこのような効果を最小にするために一貫した方法で精製されるべきである。Ｂ．エンドサイトーシスによる侵入蛍光タグ付けしたポリペプチドを細胞にエンドサイトーシスする場合、核周囲の点状パターンの観察は、タグ付けした物質がエンドソーム／リソソームコンパートメントに局在することを示す。しかし、細胞全体に拡散した蛍光は、ポリぺプチドが所望のエンドソームからサイトゾルへの輸送を達成したこと、またはポリペプチド（L-アミノ酸から組み立てられる場合）がリソソーム酵素によって分解し、そして蛍光タグがサイトゾル中に拡散したことを示し得た。したがって、エンドサイトーシス経路によるサイトゾル侵入が、ポリペプチド−薬物生成物の薬物成分についての機能的アッセイによって確認されることが望まれる。以下の２つの実施例は、このような機能的アッセイを利用する。１．エンドサイトーシスエンハンサーなし．この機能的アッセイで使用される Hela細胞を、ウサギα-グロビンmRNAの5'非翻訳領域をコードする遺伝予を制御するマウス乳ガンウイルスプロモーター（デキサメタゾンで誘導性）、次にホタルルシフェラーゼについてのコード配列（Partridge，1996）を含むプラスミドで安定にトランスフェクトした。無細胞および細胞内掻き取り−装填（in-cells crape-load）翻訳研究は、図13に示されるモルホリノアンチセンスオリゴマーが、この遺伝子構築物からのルシフェラーゼの翻訳をブロックすることに非常に効果的であることを示している。したがって、図13のアンチセンスオリゴマーがこれらのトランスフェクトされた細胞のサイトゾルコンパートメントへの接近を得る場合、未処理の細胞に対して、デキサメタゾン誘導の際、ルシフェラーゼ活性の顕著な減少をもたらすべきである。照度計での相対光ユニットとして測定される、ルシフェラーゼ活性のこのような減少は、モルホリノオリゴマーの良好なサイトゾル送達を示す。サイトゾル送達をテストするために、実施例6Cにおけるように調製したポリペプチド−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド生成物を、５μＭの濃度で培養培地に懸濁した。上記のトランスフェクトしたHela細胞を、懸濁液で５時間処理し、次いでデキサメタゾンで16時間処理してルシフェラーゼ合成を誘導した。並行して、別々のウェル中の細胞を、a）培地単独、b）モルホリノアンチセンスオリゴ、およびc）ポリペプチドで処理した。これらの４つのウェル中の細胞からのルシフェラーゼを定量し、そして相対光ユニットを表３に示す。表３処理相対光ユニット培地単独 100 ポリペプチド 105 ポリペプチド−モルホリノ生成物 69 モルホリノアンチセンスオリゴ 114 ポリペプチド−モルホリノ生成物で処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性の阻害は、ポリペプチドが、Hela細胞のエンドソームからサイトゾルにこのアンチセンスオリゴマーを輸送したことを示唆する。２．エンドサイトーシスエンハンサーあり．上記の実施例における実験を、以下の変更を行って繰り返した：a）培地中のポリペプチド−モルホリノ生成物の濃度は300nMのみであった、およびb）Transfectam（Promega Corp.，Madison，W I）を20μｇ/mlの濃度で添加した。四カチオン性Transfectamが、ポリアニオン性ポリペプチドに（その高pH形態で）静電的に結合し、そしてTransfectamの２つの長鎖アルカン部分が、図12に示されるように、細胞表面で複合体化したポリペプチド−モルホリノ生成物の効果的な濃度まで実質的に増加させるための脂質アンカーとして作用し、それによって細胞への侵入の速度を実質的に増加させることが予測された。この実験からの結果を表４に示す。表４処理相対光ユニット培地のみ．．．．．．．．．．．．．．．．．．78 Transfectam ．．．．．．．．．．．．．．．．97 Transfectam＋ポリペプチドーモルホリノ生成物 35 Transfectamとポリペプチド−モルホリノ生成物との組み合わせで処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加した阻害はまた、ポリペプチドが、Hela細胞のエンドソームからサイトゾルへこのアンチセンスオリゴを輸送したこと、およびサイトゾル侵入が最初のエンドサイトーシス工程を加速することによって増加し得ることを示唆する。実施例11 経皮送達の増強この実施例は、表皮を横切る非常に最小の通過を通常示す薬物の経皮送達を増強するための、本発明の代表的なポリペプチド組成物の使用を例示する。トリチウム化したシクロスポリンＡメタボライト17を、実施例３および４に記載のように、適切なポリペプチドに連結し、そしてその低pH形態でのポリペプチド部分を有する結合体組成物を、親油性脂肪酸（例えば、10％リノレン酸／90％プロピレングリコール）を含む適切な浸透エンハンサー溶液に懸濁する。結合したポリペプチドを含まないトリチル化したシクロスポリンＡメタボライト17を、非改変薬物の経皮通過の速度の比較評価のために、同じ浸透エンハンサー溶液に懸濁する。各シクロスポリン含有溶液を、ヌードヘアレスマウスの皮膚の所定の領域に接触し、そして小アリコートの血液を、皮膚を通っておよび循環系へ通過したトリチル化薬物の量の評価のために定期的に採取する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Polypeptide conjugates for transporting substances across cell membranesField of the invention The present invention relates to a class of polymers effective for delivering compounds in living organisms. Concerning the use of the product. This composition converts from a low pH lipophilic form to a high pH hydrophilic form Undergoes a reversible pH-dependent transition of both the hydrophilic and lipophilic environments Shows solubility below.References Background of the Invention The lipid layer, which comprises the extracellular matrix of the cell membrane and stratum corneum, Can build strong barriers to For optimal delivery, the drug should be Freely soluble in both the compartments and the lipid layer surrounding these compartments I should understand. Many low to moderately polar low molecular weight compounds can pass directly through the lipid layer However, compounds with greater polarity and / or higher molecular weight are generally Enter eukaryotic cells only by endocytosis or related processes. You. In this process, compounds are taken up into cells by progressive invagination of areas of the membrane. Rarely, they eventually form closed vesicles, or endosomes, within the cell. Ho Tond In the case of endosomes, then the endosomes are merged into lysosomes and The material is exposed to a degrading enzyme. To facilitate more effective delivery of drugs and other compounds across the lipid layer, Drugs that affect lipid solubility under selected conditions and water solubility under other conditions It is desirable to provide a mass transport composition. Routes to avoid exposure to lysosomal enzymes It is also desirable to deliver the compound to the cell cytosol by.Summary of the Invention In one aspect, the present invention provides that compounds can be transferred from a low pH environment to a higher pH across a lipid layer. Compositions for transport to aqueous compartments of low pH. This composition is A polypeptide having one or more pairs of carboxyl groups, wherein A ruboxyl group has 0, 2 or 3 amino acids, and about 8 to about 100 amino acid residues. Separated by the length between them, and preferably between 10 and 50 residues. Polype Peptides can further penetrate terminal regions into the lipid layer and cleave polypeptides. Initiator moieties are included in one terminal region of the polypeptide to facilitate No. Such polypeptides are separated from the lipophilic form, which separates from a low pH environment into a lipid layer. Effective to split) and hydrophilic forms (which are higher pH aqueous Which is effective for preferentially dividing into compartments) It is effective to receive. This allows the polypeptide to be higher from low pH environments It is possible to traverse the lipid layer into compartments of lower pH. The composition also contains Includes compounds to be covalently linked to and transported to the polypeptide. In one preferred embodiment, the polypeptide, except for the initiator moiety, is 30-100 percent of the amino acid residues that form are glutamic acid. Polypep The pairs of glutamic acid residues in the tide can be separated by other amino acid residues, Preferably consists of leucine, methionine, alanine, and 2-aminobutyric acid Selected from group. Alternatively, the polypeptide has an initiator at one terminal region. -Polyglutamic acid having a-moiety. The initiator moiety is an initiator amino acid having 3 to 12 amino acid residues It can be an array. In this sequence, polyglutamic acids of the same length form an alpha helix. It is effective to form an α-helix at a pH higher than the pH to be formed. like this Preferred amino acid residues in the sequence are glutamic acid, leucine, methionine, Alanine, 2-aminobutyric acid, norvaline, and β-alanine, where non- The ratio of glutamic acid to glutamic acid residues is greater than 1. About 50 polypeptide components If it contains a sequence with less than or equal to glutamic acid residues, the initiator sequence will It may be the terminal region of its own polypeptide. Alternatively, it may be a group covalently linked to the N or C terminus, which is positive at this terminus. Or effective in eliminating negative charges, and protects polar sites near the ends Has at least one remote polar group that is effective to Lipophilic substances at the end ( (Including the compound to be delivered) can act as an initiator moiety. single May also include such a combination of initiator moieties. . The compound to be delivered is at the end of the polypeptide component, typically an initiator. -Can be attached to the opposite end of the sequence. The composition may comprise one polypeptide component. It may have only one or more compounds. The compound to be delivered is injectable Competent aqueous delivery media (eg, taxol, cyclosporine, amphotericin B) It may contain compounds which are only slightly soluble in themselves in free form. Other fruit In embodiments, the compound is a sequence-specific nucleic acid binding polymer, for example, an antisense It is a compound. In another aspect, the present invention provides a method for preparing a higher pH aqueous solution from a low pH environment across a lipid layer. Methods for facilitating transport of a compound to a compartment are provided. This way Thus, the compound is covalently attached to the polypeptide as described above. This method For example, cytosol of cells with higher pH from extracellular medium with predetermined pH Useful for delivering therapeutic compounds to In one particular application, this method Used in anti-tumor therapy, where cells are located in acidic extracellular medium The cell and the compound bound is an anti-neoplastic agent. In other applications, this The law is H. pylori infection, where the extracellular medium is gastric juice, The cells are H. pylori bacterial cells, and the compound is an antibacterial agent, or Used in the treatment and prevention of tooth decay, where the cells are acid-producing caries-inducing Fine Bacterial cells and bound compounds are effective drugs against cariogenic bacteria Agent. Further applications are transdermal delivery of compounds through the stratum corneum, and across the blood-brain barrier Transporting the compound, wherein the lipid layer to be traversed is of the stratum corneum Contains extracellular matrix. In the latter case, the composition passes through the endothelial cells of the capillary wall. Transported into transcytotic vesicles and into endocytic vesicles It is taken up by brain cells. The following detailed description of the invention, when read in conjunction with the accompanying drawings, illustrates These and other features will become more fully apparent.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES 1A-1B show the hydrophilic and lipophilic conformations of the side chain carboxyls of the polymer. Exhibit pH-dependent transitions between FIG. 2A shows a polypeptide having an attached compound according to one aspect of the present invention. Shows the process of cytosol invasion by endocytosis of FIG.2B shows polypeptide-compounds in high pH form present in early endosomes Showing the complex; FIG.2C shows the presence of late endosomes, penetration of lipid membranes, and higher pH Shows the complex in a low pH form, which converts to a high pH form upon conversion of the itsol; FIG. 3 shows the transdermal delivery process of a polypeptide containing a bound compound, The complex passes from the extracellular lipid matrix to the aqueous compartment below the stratum corneum. Have; FIG. 4 shows regularly spaced pairs of polypeptides in an α-helix. Shows carboxyl tamate; FIGS.5A-5C show representative C-terminal end structures of polypeptides, where 5B-5C Has a partially protected or deleted terminal polar site; 6A-6D show typical N-terminal end structures of the polypeptides, where 6B-6D Has a protected terminal polarity site; FIG. 6E shows the extremes of the N-terminal structure of the polypeptide as shown in FIG. 6D. Shows an "N crown" structure that can be used to protect the sexual site; FIG. 7 shows a polypeptide acting as a molecular engine, according to an embodiment of the present invention. To indicate Figures 8A-8C show polypep evaluated for octanol solubility and cell invasion. 8A shows polyglutamic acid with unmodified ends, FIG. 8B shows the incorporation of a group that deletes or protects the polar site, and FIG. Shows further addition of lipophilic amino acid residues of FIG. 9 shows representative sites of side chain attachment on the polypeptide, from left to right, amide And carbamates link to lysine, esters link to glutamic acid, and Shows that disulfides, thioethers, and amides link to cysteine You; FIG. 10 illustrates a method for preparing a polypeptide that can be used in accordance with the present invention; FIGS.11A-11B are used to attach compounds to the side chains or termini of a polypeptide. Showing a typical polymer-compound bond, as can be done; FIG. 12 is shown in FIG.2A with a lipid anchor attached to a polycation head group. Exhibit enhanced endocytosis, such as FIGS. 13A-C show a polypeptide of the invention linked to a morpholino antisense oligomer. Showing the procedure for tying; and 14A-14F show the octanones of some representative polypeptides as a function of pH. And water / water distribution characteristics.Detailed description of the invention I.Definition The following terms have the following meanings unless otherwise indicated. A "low pH form" of a polypeptide of the invention, or a segment of this polypeptide (Also low pH conformation, lipophilic form, or lipophilic conformation) Is made lipophilic by hydrogen bonding between paired side chains or terminal carboxyl groups. Also, it is a substantially nonionic α-helical conformation. "High pH form" of a polypeptide of the invention, or a segment of this polypeptide (Also high pH conformation, hydrophilic form, or hydrophilic conformation) Means that the side chain or terminal carboxyl group is totally or mainly non-hydrogen bonded The conformation is in an ionic state. A “reversible transition” between a lipophilic and a hydrophilic form of a polypeptide is a nonionic Alpha helical conformation (where the side chain carboxyl is an intramolecular hydrogen bond And the morphology (where the side chain carboxyl is an ion) A non-hydrogen bonded state, which is advantageous at high pH). This Such transitions can involve the entire polypeptide, or localized regions of the polypeptide. Or especially if this region is near the aqueous / lipid interface, And / or especially having a composition that favors the formation of an alpha helix. This Localized regions of the polypeptide, such as Even if the domain of the lipid can be in a hydrophilic conformation, It is often effective at initiating polypeptide entry. “Acid amino acid” or “acid side chain acid” is released when incorporated into a polypeptide Having a carboxyl group of Examples include aspartic acid and glue Tamamic acid. "Non-acid amino acid" or "non-acid side chain acid" when incorporated into a polypeptide It does not have a free carboxyl group. A “high glutamic acid” polypeptide is a polypeptide that contains about 50% or more glutamic acid residues. It is a repeptide. "Initiator sequence" is a pH that can reach the endosomes of mammalian cells, In general, the same length sequence of glutamic acid residues is better than pH at which α-helix is formed. Even at significantly higher pH, a short terminus at the end of the polypeptide that readily forms an alpha helix (Typically 3 to 12 amino acid residues). At the end of the polypeptide Such a sequence initiates entry of the polypeptide into the lipid layer, and Promotes α-helix formation in adjacent segments. "Delete" or "protect" polar groups at or near the end of the polypeptide Group caps carboxylate anion or protonated amine at the end Or a covalently bonded moiety to be substituted. Preferred groups are non-covalent, typically The other polar sites near the ends are further masked by hydrogen bonding. "Endocytosis" is a process in which extracellular material is trapped in cells by invading the cell membrane. Process, which closes and contains small cells within the cell, known as endosomes. Form vesicles. Whether the extracellular compound binds to a specific receptor on the cell surface, Is a place where extracellular compounds can be imported non-specifically due to their presence near the cell membrane. If so, endocytosis can be mediated by the receptor. The latter process involves Also known as phase endocytosis or pinocytosis. Related professionals The process, potatocytosis, is caused by vesicles near the cell surface, known as caveolae. To incorporate the compound into the cells. In all of the above processes, extracellular compounds The vesicles that envelop are increasingly acidic after formation. Therefore, the composition of the present invention and The methods and methods are applicable to all of these methods of transport. II.Polymer composition The polymer composition of the present invention has a transition between a hydrophobic α-helical form and a hydrophilic form. Polypeptide component capable of undergoing translocation; polypeptide to lipid layer via terminal region Initiator at one end region of the polypeptide to facilitate partitioning of the polypeptide Min and the compound to be delivered covalently linked to the polypeptide. As described below, one pair of two carboxyls is 0, 2 or 3 amino acids. When split into acids, the polypeptide component may contain one or more pairs of carboxyl groups, and And preferably contains two or more pairs of carboxyl groups. Polypeptide amino acid The composition and positioning of the polypeptide in both the aqueous and lipid-like But typically contains multiple ionized hydrophilic structures at a pH between about 4.0 and about 7.0. Fruit that is made lipophilic by high pH forms and hydrogen bonds between paired carboxyls Undergoes a reversible transition between low-pH forms containing a qualitatively non-ionic .ALPHA.-helical structure It is like. Lipophilic low pH forms partition into the lipid environment, while hydrophilic high pH forms preferentially aqueous Dispense into solution. FIG. 1A shows the pH dependence between hydrophilic and lipophilic forms of a polypeptide. Transitions are shown, and FIG. 1B shows the appropriately spaced carboxyl-containing amino acid pairs. This solubility transition for a specific sequence is shown.A. Composition transport across lipid layers The polymer composition is used to convert intracellular cytosolic Can be used to transport the compound bound to the target. This process is shown in Figure 2A Is shown in Composition 10 is made water soluble by the high pH form of the polypeptide. Thus, it is easily delivered to the extracellular compartment in an aqueous vehicle. cell After endocytosis by 12, the composition is encapsulated within endosomes 14. D PH in the endosome is regulated by the action of the ATP-driven proton pump in the endosomal membrane. (See, eg, Clague, Fuchs). The composition is shown at 16 , A low pH lipid that penetrates the endosomal membrane in late-endosomal increasingly acidic environments To a soluble form. Upon contact with the cytosolic surface of the endosomal membrane, the composition will be indicated at 18. Thus, at near neutral pH of the aqueous cytosol, the progressive ionization and It is actively drawn into the cytosol by solvation and produces the desired subcellular compartment. Resulting in the delivery of bound Compound 20 to the patient. As discussed further below, L-A Polypeptides constructed from amino acids are typically shown after the drug has been released. Decomposed in the cytosol, as This one-way active transport process is illustrated in Figure 2B and And 2C, wherein only a portion of the endosomal membrane is represented. The figure above shows a fully hydrogen-bonded conformation before it enters the endosomal membrane. Represents a polypeptide assuming an alternative. Such is where the polypeptide is relatively It is likely to occur when in compositions that readily form an alpha helix at high pH. I However, highly polar peptides, i.e. peptides containing a high percentage of acid side chain residues For the hydrophilic conformation in which other regions of the polypeptide are non-hydrogen bonded Even when they are located in the membrane, entry into the membrane may be due to localized lipophilic regions of the polypeptide. Can be started. Such an invasion will result in this lipophilic region at the end of the polypeptide. It is particularly advantageous when Therefore, the ends of the polypeptide, especially at high concentrations Longer polypeptides containing lipophilic groups can have a lipophilic conformation at relatively high pH. Can contain easily hypothesized amino acid sequences or otherwise make the termini more lipophilic Can be modified. Such modifications are discussed further below. The advantages of the composition of the invention are, as can be seen from the above description, Transport to the cytosol is achieved without disruption of the endosomal membrane, To avoid leakage of lysosomal enzymes into the cytosol compartment of the vesicle. You. The polymer composition may also contain extracellular medium, as described below, Transports bound compounds directly to the cell cytosol if they have a pH lower than Can be used to This is, for example, in an acidic environment, eukaryotic cells, Selective delivery of the compound to bacteria or other target cells. The polymer composition may further be as described below and as shown in FIG. In addition, it can be used for transdermal delivery of selected compounds. In this case, composition 10 is In contact with the surface of the epidermis, indicated by 22, in a low pH lipid soluble form, extracellular fat in the stratum corneum It diffuses through the quality matrix 24 (including the epithelial cells 26). Of the stratum corneum indicated by 28 Upon contact with the underlying aqueous compartment, the composition Due to the progressive ionization and solvation of the polypeptide chain at nearly neutral pH of Actively drawn into the compartment, thereby connecting to the underlying tissue The compound is delivered and subsequently distributed throughout the body. The composition is a compound that is only slightly soluble in free form in the aqueous delivery medium. It is particularly useful for delivery of goods. These compounds include Taxol^TM. Taxol^TManalog , Cyclosporin analogs, and amphotericin B. Sequence-specific nucleus Delivery of acid-bound polymers is also contemplated.B. Polypeptide component Two important structural features of the polypeptide component are: a) at least one suitable Including spaced acid pairs and b) adopting a lipophilic α-helix at low pH Is to contain as many amino acids as necessary. Preferred policy for a given application In selecting a rimer, the properties of the compound to be delivered, from there and The compartment into which the compound is to be delivered, as well as the exposed polar sites Including terminal modifications to protect DNA and increase lipophilicity at the ends of the helix Various factors are considered. B1.Acidic amino acids. When the polypeptide is in an α-helical conformation Carboxyl side chain to provide a free carboxyl group that can be hydrogen bonded to Amino acids, preferably aspartic and glutamic acids, are included. these Preferred numbers and frequencies of acids are described below. Free carboxyl groups at either end of the polypeptide may also be It is understood that it can hydrogen bond with ruboxyl side chain amino acids. For example, carboki The syl terminus is the position of the polypeptide using such an acid, as described in Example 1. By starting the synthesis, β-alanine, γ-aminobutyric acid Or other ω-aminocarboxylic acids. This is the ω-carbo A xyalkylamide is formed (eg, as shown in FIGS. 10 and 5C) where The carboxyl group at the end of the kill chain is available for hydrogen bonding. N-terminal With a diacid such as glutaric acid to provide a hydrogen bonded carboxyl group. (See FIG. 6B). B2.Non-acidic amino acids. The non-acidic amino acids of the polymer, when present, are primarily To provide an adequate spacing between the two carboxyl groups of each hydrogen bond pair, and And used to adjust the pH of the partitioning transition to a selected value, as described below. You. These amino acids have a low pH α-helical conformation (such as (Eg, arginine, lysine, and histidine) when cationic Should not include parts. (The exception is as described below for the transported compound. Low level use of amino acids such as lysine as a site for conjugation. ) Most of the non-acid amino acids of the polymer are relatively non-polar and α-helical Compatible with the formation. Therefore, the preferred non-acid amino acids for most applications are , Tryptophan, phenylalanine, leucine, isoleucine, methionine, It is selected from valine and alanine. Norvaline, α-aminobutyric acid, and In addition, the side chain esters of aspartic acid and glutamic acid are also non-acidic amino acids. As appropriate. Based on cost, ease of use, and other practical considerations, Isine, methionine, alanine and α-aminobutyric acid are particularly preferred. With the exception of nucleic acids, polymers with a high density of acidic moieties are naturally occurring inside cells. It is not an ingredient, so it can prove toxic there. However, the drug transport function After that, the polymer is broken down into natural subunits that are unique to the cytosol of the cell. If so, such toxicity is greatly reduced or suppressed. In this regard, An unassembled polypeptide composed of natural L-amino acids is In the cytosol, mainly in a complex polycyclic structure called proteasome It is known that it can be rapidly depolymerized. Desirable for polymer to be broken down into harmless subunits in cell cytosol For some applications, the preferred amino acids of the polymer are selected from natural L-amino acids. Selected. Conversely, as described below, the polymer is untreated in the cytosol. For applications where it is desired to remain, the preferred amino acids are from D-amino acids Selected. In the latter application, α-aminobutyric acid, norvaline, and norleucine Other unnatural amino acids, such as amino acids, are also suitable. B3.Acid spacing. In the α-helix conformation, polypep The amide portion of the tide skeleton is effectively protected from solvents by a wide range of intramolecular hydrogen bonds. Is known to be protected. α-Helical conformation polypeptide odor Proper spacing of the acidic side chains is necessary to ensure that the two Predicted to substantially protect the polar portion of the acid moiety from solvent by hydrogen bond formation Was done. Such protection of the polar sites of the polymer from the environment will result in improved lipid solubility. It should give rise to solvability. Glutamic acid paired into three amino acids One such representative structure, including, is shown in FIG. Studies on CPK molecular models have been performed with acid side chains to provide the desired hydrogen bonded structure. Was used to predict preferred spacing. With the appropriate polypeptide sequence Subsequent octanol / water and pentanol / water partition studies of Asparagine Good if the acid pairs selected from acid and glutamic acid are so spaced It was determined that good lipid solubility could indeed be achieved at low pH. Table 1 shows the acidity at low pH. These spacings are provided to provide the desired protection of the polar sites of the pair. Table 1 E-E D-E E-X-X-E E-X-X-D E-X-X-X-E E-X-X-X-D D-X-X-X-E Where: E = glutamic acid D = aspartic acid X = amino acid As can be seen from the table, 0, 2, or 3 amino acids between the carboxyl side chain amino acids. The spacing of the amino acids is effective. Of these, carboxyl side chain amino A spacing of two or three amino acids between the acids is preferred. A polypeptide containing a sequence in which polar side chains alternate with non-polar side chains is a β-cysteine. It is known to employ a sheet and related conformations. About 6 amino acids Polypeptides having such alternating sequences larger than the length are likely to have polar sites Is generally low pH due to the formation of multi-chain complexes that are not properly protected from solvents. Was found to be insoluble in octanol. Therefore, the polystyrene of the present invention Mers are largely free from the critical run of alternating polar and non-polar side chains Should be. B4.Polypeptide length. Has appropriately spaced pairs of carboxyl side chains To form an α-helix, the polypeptide of the present invention should have at least 8 amino acids. Acid length, preferably at least 10 amino acids in length. Particularly large and / or polarized that does not diffuse across lipid membranes at practical rates For the delivery of the compound, in alpha helical conformation, the polymer If longer than the thickness, such delivery is facilitated. In this case, the polypeptide At least a portion can enter the cytosol and be converted to a high pH form, And / or polar compounds penetrate the lipid membrane, as shown in FIG. Before energy is required, the process is energetically controlled by solvation and ionization. It will be convenient. In a polypeptide alpha helix, each amino acid residue is approximately 1.5 relative to the axis length. Å Contribute. The lipid bilayer of the cell membrane in eukaryotic cells is typically about 33-36 Due to thickness, the preferred length for the polymer composition is about 22 amino acids or more. is there. Preferably, at least one acid side chain penetrates into the high pH compartment Some additional to ensure that conversion to ionic high pH form begins Amino acids. Therefore, about 24-100 amino acids, preferably 24-48 amino acids Polypeptides in the amino acid length range can be used for large and / or polar compounds. Preferred for transport from endosomes to cytosol. For delivery of smaller or less polar bound compounds, shorter Peptides can be used. The polypeptide is below, near, or at its transition pH. When the pH is low, the low pH lipophilic form is Present at an equilibrium concentration sufficient to diffuse the ions. As noted above, this diffusion Completely traverses the membrane at any given time only for those compounds that significantly interfere Is required. As described further below, entry into the cell membrane is most likely at the end of the polypeptide. At the end, it appears to be initiated, especially for more polar polypeptides. About 200 For longer polypeptides, such as those having a greater length than the amino acid, Is low in concentration and statistically does not appear to make much contact with cell membranes. Sa Furthermore, depending on the size alone, longer polypeptides are typically about 80 nm (800 Ii) cannot be effectively sucked into the endosome, which is the diameter of Therefore, on Preferred polypeptides as described above have less than 200 amino acids, and most preferred Or less than about 100 amino acids. B5.Polyglutamic and polyaspartic acid homopolymer components. For example, commercially available from Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, or High molecular weight random length, easily polymerized from ruboxic anhydride (Blout) Of polyglutamic acid precipitate from water, but partition at about pH 4 into n-pentanol. Not. Such polymers are also accessible in the endosomes of mammalian cells At pH, do not cross cell membranes in direct invasion experiments, as described below and in Example 10A. No. In addition, high molecular weight poly-L-glutamic acid increases water solubility, Efforts to increase the endocytic uptake of drugs by Adriamy When linked to various anticancer drugs such as Shin (Hoes, Nukui), the polypeptide -The polyglutamic acid component of the drug conjugate does not penetrate the endosomal membrane and crosses the membrane. Did not cut and transport the drug. Rather, the carrier is fused to the endosome- The drug is degraded in the lysosome and then released across the lysosomal membrane Actively diffused into the cytosol. These results indicate that relatively polar polypeptides (eg, For example, containing about 50% or more glutamic acid residues) It can be explained on the assumption that it begins to penetrate into the cell membrane via the other end. Modified High glutamate polypeptides with unterminated ends have both C-terminal and N-terminal These apparently have a large number of unprotected polar sites It cannot start to penetrate effectively into the non-polar interior of the membrane. Contrary to these results, relatively low molecular weight with 60-100% glutamic acid residues Are locally lipophilic at one or both termini, as described below. If modified to provide a direct invasion experiment, as described in Example 10A. And cross the cell membrane. Such modified high glutamate polypeptides are also Alternatively, it can be partitioned from aqueous buffer to n-pentanol at a pH ranging from 4.3 to 4.9. Polyaspartic acid is soluble in aqueous solutions of acidic pH and the pH of aqueous phase is 4 Even at such low levels, it does not partition into n-octanol or n-pentanol. Po Rias-partic acid can also enhance cell membranes in direct invasion experiments, as described below. Does not cross. This lack of lipophilicity is predicted on the basis of distribution calculations (Leo). And the molecular modeling of the polyaspartic α-helix The group forms a double hydrogen-bonded pair required to protect the polar acid site from the environment. This is to show that it cannot be achieved.C. Initiator part Two general embodiments of the initiator portion are expected. The first is Initi Eater polypeptide sequence, which is a polypeptide containing less than about 50% acidic residues. In the case of homopolymers of acidic amino acids May be less than about 50% acidic, for example, a more hydrophobic α-form containing glutamic acid residues. It can be a ric-forming region. The second is, for example, the compound to be administered or Are compounds that are effective at eliminating and / or masking terminal charges and polar groups A possible hydrophobic moiety. C1.Initiator array The lipophilic amino acid near the C-terminus of the above polyglutamic acid Further addition of amino acids (ie leucine at residue positions C2, C3 and C5; FIG. 8C) provided very good transport across the cell membrane. Polypepti Showed good solubility in n-pentanol, but at acidic pH n-octanol Did not show good solubility in Such an amino acid sequence at the end of the polypeptide may be Required for similar length sequences of glutamate residues to assume a conformation Initiator effective at forming α-helix at higher pH than It is particularly useful for providing sequences. Cell invasion and distribution studies have Inclusion of the α-helix forming initiator sequence can increase lipid solubility and cell entry, Significantly greater than lipophilic modifying groups that do not initiate alpha helix formation by themselves It was shown to increase. In forming an alpha helix at relatively high pH, The initiator sequence may also include a subsequent α in adjacent segments of the polypeptide. Promotes helix propagation. Preferred initiator sequences are 3-12, and preferably 5-10 amino acid residues. And preferably glutamic acid, leucine, methionine, alanine. Contains 2-aminobutyric acid, 3-aminobutyric acid, norvaline, and β-alanine. Here, the ratio of non-acid side chain residues to acid side chain residues is greater than 1, preferably greater than 2. . Examples of such initiator sequences are XEXXβ and XEXXXβ (C-terminal) And glutaric acid-XXEX and glutaric acid-XXXEX (N-terminal), where E is Tamate, β is β-alanine, and X is selected from the list above. You. One such C-terminal sequence, leu-glu-leu-leu-β, is shown in FIG. 8C. Such terminal sequences can be very polar (eg, high glutamic acid) polypeptides. Provide the clearest benefits in the world. These are also lower in acid side chain residues Useful for polypeptides of a given sequence that include levels (ie, less than about 50%) . However, such polypeptides are generally more effective at α-helix formation. Tend to be higher, so that other initiator moieties (eg, terminal lipophilic sex Drugs, or protecting groups as described above) prevent the entry of such polypeptides into the membrane. It can be effective to get started. C2.Protection or removal of polar sites. Polypep in α-helical conformation Tides are typically C-terminal and N-terminal not protected by intramolecular hydrogen bonds. Both contain multiple polar sites. These unprotected polar and ionic properties The sites are due to the presence of solvated counterion and solvated water, and Due to the tendency of polar ends to assume an α-helical conformation, Construct a substantial obstacle to the initiation of the polypeptide. Lack of terminal charge And protecting or removing one or more of these polar sites is particularly short. Or a highly polar polypeptide (eg, a high glutamate polypeptide as described above) In this case, lipid solubility can be improved. Lipophilic substances (eg, the drug to be delivered) attached to the polymer end Eliminates charge at the ends and provides local lipophilicity. Lack of terminal charge And protecting or removing polar sites can also be performed at the C-terminus or N-terminus, Covalently linked to or contain a carboxyl or amino group and Or at least one remote polar group such as a carboxyl group, One or more additional polar groups at or near the end of the peptide by hydrogen bonding It can be achieved by incorporating groups that are effective to protect. specific An example is as follows. C-terminal protection. The C-terminus of the polypeptide is typically a molecule as shown in FIG. 5A. Three carbonyl groups not protected by internal hydrogen bonds and one negatively charged Contains carboxylate ions. The number of these unprotected terminal polar sites One way to reduce this is to use an α-ester at the C-terminus, as shown in FIG. 5B. Preferably, it incorporates 2-hydroxyethyl ester. Polar sites also With β-alanine, as shown in FIG. 5C and as described in Example 1. By starting the synthesis of the polypeptide on the support resin, one can conveniently access the C-terminus. Can be eliminated.N-terminal protection. The N-terminus of the polypeptide is typically a molecule as shown in FIG. 6A. Three amide protons and one positively charged unprotected by internal hydrogen bond Containing protonated amines. The polar moiety has a diacid, as shown in FIG.6B It can be conveniently removed from the N-terminus by terminating the polypeptide. is there Alternatively, the polar moiety can acetylate the terminal amine, as shown in Figure 6C. Therefore, it can be easily protected. Hydrogen bonds indicate that the polypeptide is an alpha helix Occurs as shown in the case. More extensive protection of the N-terminus is due to the N-terminus of the alpha helix. N-crown designed to protect all polar sites normally exposed at the edges Can be achieved by a novel structure called a FIG. 6D shows one such N-k The structure is given in Figure 6E, and in the H-linked conformation A site linked to the N-terminus of a polypeptide present in the α-helical conformation It is thought that it is adopted when. A polyglutamic acid having such a modification is shown in FIG. 8B. Modification shown in FIG. 8A Polypeptides are partitioned into n-octanol or n-pentanol. And did not show any transport across the cell membrane in direct invasion studies. The addition of the N-terminal carboxy-fluorescein as shown in FIG. To remove the positive charge, partially protect the N-terminal polar site, and remove large lipophilic moieties. (Ie, fluorescein in low pH form) is added to the N-terminus. Two more Negatively charged carboxylate with a polar site of, as shown in FIG. Eliminated from the C-terminus by initiating polypeptide synthesis with β-alanine . These modifications provide modest transport across the cell membrane (FIG. 8B) and The peptide partitioned into n-pentanol but not n-octanol. In practice, once the terminal initiator moiety of the polypeptide enters the membrane And the next segment of the polypeptide is the lipophilic hydrogen-bonded conformation Can be converted to Such conversion is due to the increasing acidic environment within the endosome. In addition, it is provided by adjacent α-helical segments of the polypeptide and proximal to the plasma membrane. Induced by the increased local lipophilicity provided. After invasion of the initiator moiety, the polypeptide with multiple acid side chains is Can be distributed to the membrane in a "gradual" manner, wherein the acid side chains located immediately adjacent to the membrane Form a hydrogen-bonded pair with many acid side chains, and contain this pair, the lipophilic α-helical Segments of the polypeptide that assume a conformation penetrate the membrane. this In a sense, spacing between carboxylic acid side chains is of particular importance. Polypeptide When entering the membrane in the stepwise manner described above, it is paired with another carboxylate side chain. A carboxylate side chain adjacent to the membrane that cannot become It seems to be locked. As mentioned above, the spacing of 0, 2 or 3 amino acids is Is effective for such pair formation. In addition, the drug is more If they are to be linked at sites along the peptide chain, these are the side chain carboxylate It must be positioned so as not to interfere with spacing and pairing between them. I Thus, random binding of the drug, as well as non-acid side chain residues (glutamate Random spacing) should be avoided. As described further below, the additional driving force for one-way transport is When the tide encounters the cell cytosol across the membrane and at a higher pH, the side chain carbohydrate Provided by ionization and hydration of xyl. Therefore, a high percentage of side chains Polypeptides with carboxyls transport bound compounds across membranes It is expected to provide a high driving force for. Accordingly, one preferred class of polypeptides for use in the present invention is Has a glutamic acid content of 30% to 100%, and preferably 50% to 100%, and Include those having an initiator sequence at one end as described herein. I will. (In this sense, 100% glutamic acid content refers to the initiator portion. Except for the central chain of the polypeptide. Preferably, the compound to be transported is , At or near the other end of the polypeptide.D. Transition pH When the polypeptide component or a segment thereof is between the hydrophilic and lipophilic forms Effective for converting and partitioning from aqueous phase to lipid phase or vice versa The pH is called "transition pH". In general, compounds should be transported across a lipid layer from a low pH environment. For transport to a higher pH aqueous compartment, this conversion Aqueous compartments at or near the pH of the environment and at a higher pH Should occur at a pH lower than the pH of the sample. However, from the above discussion, local modifications of the polypeptide may In the absence of such modifications or in the absence of a lipid layer, the α-helical conformation At a pH greater than the pH at which it converts to lipids can facilitate entry and distribution into the lipid layer It is understood that. Transport to the aqueous compartment through a thin lipid layer such as a membrane Also, when the composition is brought into contact with this aqueous compartment, the hydrophilic compartment It is converted back to a mentment and is facilitated by ionization and solvation. But Thus, the pH at which the composition effectively transports in vivo or in cell invasion studies is In configuration studies, the transition pH of the polypeptide molecule may be different. Therefore, the latter Values are used as useful guidelines for initial selection of polypeptides However, particularly for highly polar polypeptides, direct invasion studies described below Should be supplemented. The effective transition pH will vary for different applications. For example, the main cause of ulcers The bacteria H. pylori exists in a very acidic environment in the stomach. This environment is As described below, polymers that are effective at partitioning to the lipid layer at a pH of about 4.5 or less It can be specifically targeted by the use of the composition. Conversely, for transdermal delivery, a) the polymer composition comprises Exists in a lipophilic form at a pH at which the lix can be safely reached, and b) the polymer The composition converts to a hydrophilic form upon contact with the aqueous environment underlying the stratum corneum. Is preferred. A transition pH in the range of about 5 to 6.5 generally meets these two criteria. Add For transport of relatively polar compounds from endosomes to the cytosol of eukaryotic cells In certain embodiments, the polymer compositions described herein can be used in and through endosomal membranes. Can act as a molecular engine to pull relatively polar compounds. Shown in FIG. As shown, the nonionic lipophilic α-helical polypeptide is located at the endosomal membrane site Driving force exerted by the engine as it undergoes ionization and solvation at the sol surface Occurs. This driving force is, in part, a function of the difference between the transition pH and the pH of the cytosol. is there. Therefore, the lower the transition pH, the greater the force that such an engine should act on. And the greater the load that can be transported through the endosomal membrane. Pretty For compounds that are small and / or only moderately polar, The polymer composition used for transport from the sol to the cytosol is in the range of 6.4 to 6.8. Can have a rather high transition pH. Larger and / or more polar compounds For (ie, greater loading), the transition pH should generally be lower is there. However, if the transition pH is too low, endosomal / lysosomal fusion will Can occur before the tide engine converts to a lipophilic form and penetrates the enclosing membrane, Enzymatic of the polypeptide (assuming it contains L-amino acids) before it can perform its transport function Leads to decomposition. At the time of endosome / lysosomal fusion, the pH of the endosome is altered. Typically, it is in the range of about 5-6. Therefore, the minimum transition pH in this range is , A composition assembled from L-amino acids is preferred, and endocytosis Intrusion is intended. From the above, it can be seen that the optimal transition pH is substantially the And that it can vary depending on the compartment to be delivered to it You. Several parameters described below adjust the transition pH over a wide pH range. The optimization of the polymer composition can be selected Allow delivery of the selected compound between compartments. 1.)length. As shown in Table 2A, as the length of the polypeptide increased, There is a modest increase in the transition pH as determined by the tanol / water partition system. 2.)Acid amino acid. The results in Table 2B generally indicate that glutamic acid residues 4 shows that it provides a higher transition pH than acid residues. The results in this table are also And spacing (ie, ELLDL vs. ELLLD) also have important effects on transition pH To indicate that 3.)Non-acid amino acids. The results in Table 2C show that the selection of the non-acid amino acid moiety also Indicates that it can be substantially affected. For example, replacing leucine with phenylalanine Inverting reduces the transition pH. As shown in Table 2C, the transition pH also Isine-> valine-> alanine-> glycine (data for glycine are shown In each case). Therefore, over a wide range One simple way to adjust the transition pH is to use leucine residues (to give high transition pH values). By alanine. Leucine is almost the same as norleucine It can also be seen that it gives a transition pH value. Four.)Acid to non-acid ratio. The transition pH generally depends on the percentage of acid amino acids (like leucine). Lipophilic amino acids) are found to decrease with increasing Was. Five.)Terminal structure. Mask or delete polar end groups not involved in hydrogen bonding This helps to increase the transition pH. Table 2 A.length: Repeating array length Transition pH ^* -ELALE- 25 5.83 -ELALE- 45 6.05 -ELALE- 65 6.14 B.Acid amino acid: Repeating array length Transition pH ^* -ELLLE- 50 6.92 -ELLLD- 50 6.51 -DLLLE- 60 6.45 -ELLEL- 49 6.85 -ELLDL- 49 6.29 C.Non-acid amino acids: Repeating array length Transition pH ^* -ELEDLDLL- 54 5.50 -EFEDLDLL- 54 5.39 -ELLLE- 50 6.92 -ELVLE- 50 6.44 -ELALE- 50 6.14 -ELLLE- 30 6.83 -ELALE- 30 5.90 -EALAE- 30 5.10 -ELLLE- 30 6.93 -EnLnLnLE- 30 6.90 A = Alanine D = aspartic acid E = glutamic acid F = phenylalanine L = Leucine nL = norleucine V = Valine^*When determined with n-octanol / water Table 2 shows the n-octanol / water partition system by varying the above structural features. Shows the choice of the transition pH reached in. Further adjusting one of these parameters Can be used to prepare polypeptides with higher or lower transition pH. it can. For example, a composition having a transition pH of 4 or less will result in a relatively short polypeptide. High percentages of aspartic and alanine subunits Can be prepared. As determined above, determined from octanol / water or pentanol / water partition studies. The selected transition pH selects the appropriate polypeptide for delivery of the compound to the chosen environment. Provide useful guidelines for However, additional factors affect the cellular environment. And affect the behavior of the polypeptide. Research, for example That polypeptides containing high levels of leucine can bind to serum proteins Suggests. Polypeptides with lipophilic local regions at the ends can be bulk distributed Laboratory Efficient transition for cell in vitro or in vivo at higher pH than indicated in studies Transferring is also indicated herein. Therefore, distribution studies are ideal Specifically, in order to further evaluate the membrane transport properties of the composition, a. After the in vitro cell invasion experiment. Candidate polypeptides also include serum albumin By performing electrophoresis on an agarose gel with and without addition, blood It can be tested for binding to a clear protein.E. FIG. Coupling of compounds to polypeptide components One or more drugs or other compounds may be linked via sites at the termini and / or Within a limited number of selected sites. As described above , Random binding or high loading of compounds along the chain can result in particularly high acid side-chain polypeptides. Pide may interfere with partitioning into the membrane. Methods for selective binding are well known in the art, and are Such methods are described in Examples 2-7 below. FIG. 9 shows a substantially diversified version. Representative attachment sites that are both convenient and effective for compounds and polymer compositions And type. Amide and carbamate linkage to lysine, from left to right, Ester linkage to glutamic acid and disulfide to cysteine Ter and amide bonds are indicated. In particular, amides, carbamates, esters, Bonds selected from thioethers, disulfides, and hydrazones are representative Is easy to form and is suitable for most applications. Join If the compound should be easily cleaved in the cytosol after delivery, And disulfide bonds are particularly preferred. FIG. 11 illustrates representative starting materials and products of such conjugation. Example 2-7 are representative compound linkages to representative polymers via these bond types Which includes cyclosporine, Taxol^TM(Paclitaxel), and morpho Includes lino antisense oligomers (Summerton and Weller). Cyclospoli Are disulfide bonds (Example 3A), thioether bonds (Example 4A), A mate bond (Example 5) and an amide or thioether bond (Example 6) To the polypeptide. Taxol using a similar method^TMPolypepti The corresponding linkages of the amide (Examples 3B, 4B, 5, and 6B, and 7A) Amide bond to lino antisense oligomer (Example 6C, shown in FIGS. 13A-C) Are also described. In the above example, Taxol^TMIs a polypeptide via its C-7 hydroxyl group. Conveniently linked to the tide. To bind cyclosporin A, a primary hydroxy Metabolite 17 with a sil group (Eberle and Nuninger, 1992) is used. In both of these cases, the linkage does not include the known active site of the molecule. Metronidazo Or other drugs such as doxorubicin that can be used in the applications described below Also have primary hydroxyl groups for convenient attachment. In general, many Functional groups (hydroxyl, amino, halogen, etc.) can be used for conjugation. Especially po If the polypeptide or any part thereof remains attached to the compound after delivery, Groups which are not known to be part of the active site of the compound are preferred. Example 8 describes a representative method for purification of a polymer-compound product, and A method for the structural analysis of the product is described. The compound / polypeptide ratio is preferably 5: 1 or less and higher. And / or more preferably 1: 1 for polar compounds. Preferably, The compound is attached at or near the end of the polypeptide; most preferably, one The terminus contains the initiator moiety and the other contains the bound compound. For particularly large and / or polar compounds, such as nucleic acid binding polymers, Transporting comprises combining multiple (eg, 2-5) polypeptide carriers of the invention into a single compound. Can be enhanced by binding to the molecule. The carrier is preferably transported. Attached to the same region of the molecule (eg, at or near the nucleic acid binding polymer) It is. III.Evaluation of composition characteristics A. Distribution characteristics The distribution of the compound between water and n-octanol is usually Used in pharmaceutical research to evaluate the distribution of compounds between lipid bilayers of cell membranes Have been. Using partitioning between n-octanol and a series of buffers at various pHs, PH dependence of polymer compositions of the invention having an acid side chain acid content of up to about 50% of amino acids A quantitative measurement of the specific solubility properties was provided. Polymers with acid side chain content above 50% For compositions, a partition between n-pentanol and aqueous buffer was used. n- The transition pH value obtained with octanol / water is lower than that obtained with n-pentanol / water. It should be noted that this is about 0.3 pH units lower. At its transition pH, the polymer partitions at equal concentrations in the aqueous and organic phases . The transition pH values determined from these studies are dependent on various factors affecting polymer solubility properties. Gives a simple quantitative assessment of the child's effect. Example 9 performs such a distribution study And a convenient procedure to obtain the transition pH for representative polymer compositions Describe. In this procedure, the polypeptide tagged with fluorescein is n- Partitioned between octanol or n-pentanol and aqueous buffers of various pHs, Then, the absorbance of each phase is measured. 14A-F show six representative fluoros of the present invention. These as a function of pH for the polypeptide composition tagged with 5 shows a plot of the absorbance values of the six different polypeptides, from 5.1 to 6.9. Shows a range of octanol / water transition pH values. The results of experiments with cultured cells described in the next section show that the acid-amino acid composition up to about 50% For a polymer with a material, if the polymer is in a low pH conformation, These partitioning properties generally predict the ability of the polymer to penetrate the lipid layer. And suggest. If modified to produce terminal group lipophilicity as described above, 50% Polymers with a larger acid amino acid composition may have a transition pH as shown in partition studies At higher pH than expected, they tend to show more effective direct cell invasion. B.Cytosol intrusion B1.Direct intrusion. Screening the polymer composition for delivery of the selected compound In transit, direct transmembrane passage is a simple step-down of the pH of the extracellular medium. Which can be evaluated by the action of a proton pump embedded in the membrane. Comparable to the progressive pH decrease that occurs in endosomes. This process also involves extracellular culture When the earth's pH is lower than the cell's cytosol pH, it is representative of direct in vivo invasion It is. In eukaryotic cells, fluorescent compounds are located in the endosome / lysosomal compartment. When limited, fluorescence microscopy shows a punctate pattern around the nucleus in cells. Conversely, when a fluorescent compound enters the cytosol, fluorescence that diffuses throughout the cell is seen. It is. Therefore, attaching a fluorescent tag to the compound to be transported to the cytosol Facilitates subcellular localization of the polymer-compound product after addition to cultured cells To be evaluated. Ideally, the attached fluorescent tag will Should have minimal impact on In detail, this should be relatively small And is quite soluble in octanol and lipid layers at low pH and at neutral pH and Above and above should be fairly soluble in aqueous solutions. Most such applications Two suitable fluorescent tags are 5-carboxy-fluorescein and 7-dimethyla Minocmarin-4-acetic acid (obtained from Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) You. Example 10A describes a direct cell invasion experiment in cultured eukaryotic cells. This In the experiments described, cells were labeled with 5-carboxyfluorescein, a representative of the present invention. With a typical polymer composition for a few minutes. If the extracellular medium was neutral, No cytosol intrusion was observed. However, the pH of the extracellular medium When the polymer decreases stepwise to match the progressive pH decrease that occurs in It is seen to rapidly enter the itosol compartment, which spreads throughout the cell. This was evidenced by the diffused fluorescence. B2.Invasion by endocytosis Direct cell invasion studies may require one or more polymers for transmembrane delivery of selected compounds After showing that is effective, cell invasion by endocytosis was It can be evaluated by a method as described in 10. FIG. 2 shows that eukaryotic cells into the cytosol by endocytosis uptake. 3 illustrates penetration of the polymer compound composition of the present invention. From this figure, the size of eukaryotic cells Intrusion into the tosol has been seen to involve multiple steps, the main ones being the first Neutralization from endocytosis uptake and subsequent acidified endosomes Transmembrane passage to the cytosol. When a fluorescently tagged polypeptide is endocytosed into cells, nuclear Observation of the surrounding dot pattern indicates that the tagged material It shows that it is located in the sosome / lysosomal compartment. Therefore, cells The diffused fluorescence indicates that the polypeptide is It could be shown that the transport to the tosol was achieved. However, assembled from L-amino acids In the case of a modified polypeptide, such a pattern may also be Indicating that only the fluorescent tag was diffused into the cytosol Obtained. Therefore, the site of such peptides via the endocytosis pathway Sol invasion is associated with the drug component of the polypeptide-drug product, as described in Example 10. Preferably, it is assessed by a functional assay. Or selected Involved in demonstrating and optimizing the endocytic delivery of a selected polypeptide The first endocytic invasion study shows that no lysosomal enzymes It can be performed on polymers assembled from different D-amino acids. Research supporting the present invention In D- and L-polypeptides having the same sequence, the same partitioning and membrane transport properties Is shown. In this example, the compound bound to the polypeptide is a sequence-specific nucleic acid binding polypeptide. And specifically encoded by a plasmid contained in the treated cells. To target specific messenger RNA for firefly luciferase Ionic antisense oligomers (Summerton and Weller). Antise Oligomers in the cytosol compartment of transfected cells When approached, dexamethasone-induced luciferase activity was induced against untreated cells. A significant decrease in gender should be observed. The polymer-compound composition is allowed to undergo the appropriate time for endocytic uptake for about 5 minutes. The cells were contacted for hours. Polypeptide alone, antisense oligo alone, and Medium alone (control) was also tested. Antisense as described in the Examples Oligos alone may not be able to enter the cell cytosol, Could not inhibit RNA. Conversely, the same polymer attached to the polymer of the invention Thisense oligo inhibits luciferase activity by about 31% relative to control, This suggested good delivery of the compound to the cytosol compartment. Enhanced endocytosis by bound affinity moieties. Polymer composition of the present invention An object has a relatively high density of negative charges in an essentially neutral extracellular medium. further, Due to the sialic acid residues on sugar coatings to a large extent, typically on the outer surface of eukaryotic cells Also have a significant density of negative charges. Possibly, similarly charged polymers and fines Due to electrostatic repulsion between the cell surface and some The rate of cell entry of the limer-compound product appears to be relatively slow. Further experimental results described below indicate that the rate of endocytosis was A lipid anchor attached to or complexed with the compound composition (ie, a fatty acid, Cells (lipophilic molecules such as long-chain alkylamines, long-chain alcohols, etc.) Can often be enhanced by using moieties with affinity for the surface Suggest that Such lipid anchors are used to form endosomes. Larger amounts of polymer-compounds are encased during cell membrane invagination than in other cases. Thus, it tends to have a role in increasing the concentration of the polymer-compound on the cell surface. If the lipid anchor is attached to the polymer by electrostatic attraction, such attraction Is eliminated at low pH, ie, in late endosomes. Lipid anchor is poly When covalently linked to a mer-compound, the polymer-compound is embedded in the endosomal membrane. Is released more freely in the cytosol than remains attached to the As such, it is generally desirable that the bond be cleavable in the cytosol of the cell. No. The polypeptide-antisense oligo composition described above, also described in Example 10, In a further experiment used, a tetracationic lipid anchor (Transfectam^TM. Prome ga Corp., Madison, WI, USA). And enhanced the endocytosis process. This is shown in Figure 12. Shown here, the lipid anchor is shown at 30. In this case, luciferase activity Was inhibited by about 68% relative to the control. This is without the above lipid anchor Compared to 31% of Figure 12 shows that the polymer transforms in late endosomes into its low pH non-ionic form If Transfectam^TMIs the first endocytosis step , Then a possible role to play in enhancing dissociation from the polymer Indicates a percentage. Lipophilic drugs (eg, Taxol^TMAnd many compounds such as cyclosporin A) The substance acts to enhance endocytosis because of its inherent lipophilicity It should be understood that. In such cases, generally separate lipid anchors Is not required. Endocytosis can also be a receptor signal or ligand It may be facilitated by binding to the tide-compound composition. Receptor-mediated ene In Dcytosis, it binds or complexes to a targeted composition for uptake Such ligands can bind to cell surface receptors. Such a ligand is As described further below, to enhance general endocytosis uptake Or to target a specific cell type. IV.Application The polymers of the present invention can be used to deliver bound compounds to specific cells or locations in the body. Can be used to target The specificity of the target depends on the cytosol and extracellular medium. By taking advantage of the pH difference between It can be controlled by the use of scepters.A. H. Treatment of pylori infection If the target cell is in an acidic environment, direct entry into the cell is due to endosomes. Facilitated by the pH difference between the extracellular environment and the cytosol of the cell without the need for invasion Is advanced. Such direct intrusions are generally more common than endocytosis intrusions. Very fast. Examples of such targets in a low pH environment are given below. The highly acidic environment of the stomach is a polymer that is effective at partitioning to membranes at pH below about 4.5. -By using the composition. specifically useful in treating pylori infection Can be used. In the body, including the endosomal compartment of eukaryotic cells The other compartment has a pH in the range of 4.5-6.5, which is pH has not been reached, and therefore the polymer composition has not passed over its lipid layer. Does not convert to the lipophilic state required for For example, a polypeptide having a higher transition pH, such as up to 6.5 or 7.0, can be obtained from H. et al. p further invades ylori cells, but also invades other cells by endocytosis And consequently the selectivity is reduced. In order to penetrate bacterial cells, the composition is applied to the outer membrane (in gram negative bacteria), cell walls, And be able to cross the endoplasmic membrane. Bacterial cell walls are generally less than 2000 Da Eliminates ingress of the upper globular compound. Research in support of the present invention has been described herein. Although the polypeptide composition is generally of higher molecular weight than 2000 Da, pylori fine It shows good penetration into cells. Compositions at low pH are mainly straight rods rather than spherical Because they are the body, these are cells by the reptation mechanism. It is assumed to penetrate the wall. H. Drugs used to target pylori include amoxicillin, bis Trout salt, metronidazoline, omeprazole, clarithromycin, and tet Lacycline. Treatment with a single drug may result in a pH effect of the drug at the site of infection And / or not always effective due to inappropriate concentrations. Therefore , Bismuth salts (eg, bisumuth subsalicylate), antimicrobial Infectious agents (eg, metronidazole) and tetracycline or amoxy Three drug treatments using any combination of sylin are often recommended ( See, for example, Dixon, O'Conner, Glupczynski). The method of the present invention Because it provides a more selective target for the drug substance, higher doses of drug and / or Can deliver more cytotoxic drugs, thus providing greater efficiency for single and multiple Number of both medications, and generally less than 3-4 weeks required for eradication Provide a treatment period. This application would benefit the polypeptide remaining untreated after delivery of the compound Can be obtained by doing so. In particular, an untreated polypeptide-compound The composition does not appear to be absorbed into the stomach or small intestinal wall and is therefore not targeted To prevent delivery of the bound compound to the body site. As mentioned above, D-amino acids The polypeptide consisting of is not degraded by proteolytic enzymes, and Therefore, it is preferable for this purpose. Relatively stable compounds such as amides-polypep Tide linkages are also preferred in this case.B. Target tumor cells Most solid tumor masses are hypoxic (lack of oxygen) due to insufficient blood supply. Cells. This hypoxia can cause such cells to undergo both radiation and drug treatment. To make it more resistant (see, for example, Kennedy). Delivery of anticancer drugs also Can be impaired by limited vasculature. The extracellular environment in such solid tumors can cause factors such as lactic acid production under anaerobic conditions. Be more acidic than normal tissues (eg, Kennedy, Tannock, Vaupel) Are shown. The measured pH is typically in the range 6.0-7.0, or Is typically about 0.3-1.0 units lower than the corresponding normal tissue (Vaup el). The extracellular medium of the tumor mass is also lower than the intracellular compartment of the tumor cells themselves. PH appears to be low (Newell). For example, mainly measure intracellular pH³¹P NM Measurement of pH by R indicates that brain tumors and sarcomas have higher intracellular p H (Vaupel). According to the method of the present invention, the hypoxic tumor cells, due to their low pH environment, Antibodies bound to polypeptides are effective at partitioning to membranes at pH present in the external environment Can be targeted by biological drugs. Such drugs include, for example, cisplatin, Antimetabolites such as methotrexate and fluorouracil, doxorubicin Such as topoisomerase inhibitors, cyclophosphamide and chlorambuci Alkylating agents such as vinblastine, vincristine, docetaxi Cells and paclitaxel (Taxol^TMTubulin-binding plant alka such as) Lloyd included. Polypeptides that are effective at targeting hypoxic cells, as described above, also Can undergo a pH-dependent transition in the liposome to its lipophilic form, where the pH range is typically The box is about 4.5-6.5. However, direct cell entry generally involves endocytosis. Very fast than su. Transport in direct cell invasion experiments using appropriate pH differences Occurs within minutes; see, eg, Example 10. On the other hand, Itosis invasion generally takes a lot of time. Therefore, it is targeted Endocytic uptake by non-cells is due to extracellular media and intracellular compartment Direct to the targeted cancer cells, induced by the pH difference existing between Minimal against intrusion.C. Treatment / prevention of tooth decay Tooth decay (tooth caries) is caused by bacterial acid in the breakdown of carbohydrates. Promoted by production (acid production). Sucrose-induced plaque (Igarashi ) PH studies showed a minimum pH of 4.6 ± 0.2 in 2-day-old plaques; Rose to 5.7. The predominant bacteria are Streptococci (> 50% of total) and Actinom yces (> 10% of the total). In another study, taking from the caries active site Bacteria produced a final pH of less than 4.2 in sugar broth (van Houte). The antibacterial agent is at a pH in the range of about 4.5-6.5, preferably at a pH in the range of about 4.5-5.5, Using polypeptides that are effective at partitioning to the membrane, disruption or Can be targeted to potential disruption sites. Suitable anti-cancer used in the treatment of dental caries Bacterial agents include chlorhexidine, triclosan (Friedman, Bouwsma), Toll, antibacterial enzymes, and 9-octadecene-1-amine hydrofluoride and And amine fluorides such as 1-hexadecylamine hydrofluoride .D. Cell surface receptor targets Drug delivery by endocytosis can be accomplished by appropriate ligand or receptor Can be facilitated by attaching or complexing the polymer drug composition to the signal. You. Mannose-6-phosphate, biotin, folic acid, and other water-soluble vitamins Certain receptor signals, such as, provide delivery to many cell types (Ludwig ), And thus can be used to promote cell entry in many applications, Use of such ligands may provide for pluripotency of cellular targets. Further notes below Others, as noted, focus on delivery to one or a few specific cell types. Can be used to Generally, the bond between the polymer drug composition and the ligand is cleavable, and It is desirable that the polymer drug can be released freely in the cytosol after transport . Water-soluble vitamins such as riboflavin, thiamine, nicotinic acid, and folic acid , Can be used to target cell surface receptors. These compounds are Potocyte, a variant of endocytosis specified for incorporation of offspring It is thought that they are taken up into cells by lysis. At potcytosis, C Putters are small (about 50 nm diameter) holes or vesicles on the cell surface known as caveolae. Exists. These caveolae form a cycle of opening and closing at or near the cell surface. Still go. When closed, the proton pump in the membrane This results in a pH of about 6.0 in the LA. If the caveolae pH is low enough, the vitamins will be , Released from receptors (Anderson). Next, to the lipophilic conformation After undergoing a pH-dependent transition, the polymer compound composition is inserted into the lipid membrane and then Transport to the cytosol according to the mechanism described herein. This pathway typically has large pH differences, such as the endocytic pathway. Not included, but offers certain advantages. Caveola does not dissolve into the prelysosome Thus, potential exposure of the compound to degrading enzymes is avoided. In addition, water soluble Sex vitamins are generally released from polymers when exposed to the low pH in caveolae. And allows free polymer drug to enter the cytosol. Cells that can be specifically targeted by receptor signals include liver cells (liver cells). Vesicles) whose surface specifically recognizes galactose-terminated glycoproteins Including receptors. Many malignant cells overexpress certain receptors, Has been reported using folic acid (Mathias) and epidermal growth factor (Deshpande). As such, it may be possible to selectively target such cells. D-cycloserine Have been reported to promote bacterial transport across the plasma membrane (Chopra, Ra). paport).E. FIG. Transport across the blood-brain barrier The blood-brain barrier (BBB) regulates the exchange of substances between the bloodstream and the central nervous system, Provides a strong barrier to transport. Endothelial cells of brain capillaries are closely associated with adjacent cells Includes "tight connections", which are bands around cells that make up. These concatenations The compound prevents endothelial cells from transporting between cells, thus for effective transport. Must pass through the cell itself. Studies on the transport of such peptides are: Lipophilicity is probably the most important in promoting peptide transport across the BBB. Indicates an important factor (Banga). Generally, compounds are transported across cells by transcytosis obtain. Polarized endothelial cells within capillaries (ie, clear apical membrane and substrate) In the case of a cell with a bottom membrane), the compound is first converted to transcytotic vesicles. It is taken up through the apical membrane on the capillary inner wall. Such vesicles are typically Reaches a pH of about 6.0. Vesicles combine with the basement membrane of endothelial cells on the outer capillary wall. Move things. The compound is then expelled from the transcytosis vesicle, This releases the compound out of cells and capillaries. According to the method of the present invention, the transport of a compound across the blood-brain barrier involves the compound Can be performed by linking the polypeptide to a known polypeptide, as described below. Effective at partitioning to the membrane at a pH within the selected range. The composition preferably comprises A receptor signal (effective for binding to receptors on the surface of brain endothelial cells) (Eg, hypoxanthine or inosine). Delivery to the cerebral bloodstream Later, the composition traverses the capillary wall by transcytosis, as described above. Is transported. The composition is then subjected to endocytosis according to the mechanisms described herein. Used to be taken up by brain cells into brain cells and released into the cell cytosol It is possible. In the latter process, the endosome may have a pH of about 5.0 Be expected. From the above, the pH at which the polymer is effective to cross cell membranes is between 5.0 and 6.0 More generally, below the pH of transcytotic vesicles in endothelial cells and Should be above the pH of endocytic vesicles in the final target cell I can understand. If the pH is above 6.0, then the polymer is It adopts its lipophilic conformation in tosis vesicles and penetrates its membrane, Invades endothelial cells instead of targeted brain cells.F. Transdermal delivery The stratum corneum, the main permeable barrier of the skin, is surrounded by an extracellular lipid matrix Consists of keratinized epithelial cells. Configure the main pathway for the passage of the compound through the skin The extracellular lipid matrix built is composed of water and water dispersed between the polar faces of the stacked bilayers. Together with other polar compounds, lipids (ceramides) arranged in multiple sheets of lipid bilayers Cholesterol, free fatty acids, and cholesteryl sulfate). This structure of multiple alternating polar and non-polar layers is both hydrophilic and lipophilic. It provides a strong barrier for the penetration of one compound. Each of multiple lipid bilayers Act as a substantial barrier for the passage of hydrophilic compounds, while stacked Each of the layers of water and other polar compounds between the polar faces of the lipid bilayer is a lipophilic compound. Acts as a substantial barrier to the passage of objects. Stacked bilayers of extracellular lipid matrices can be used to enhance various penetration enhancers (eg, For example, Azone (1-dodecyl-azacycloheptan-2-one)), unsaturated long-chain alcohol And unsaturated long-chain fatty acids (eg, oleic and linolenic) It is known that they can be disrupted (Aungst et al., 1986; Rehfeld and Elias, 1982; Golden et al., 1986; Goodman and Barry, 1985, 1986). Treatment of skin with permeation enhancers improves various relatively amphiphilic drugs. Simple and effective transdermal delivery of many lipophilic and hydrophilic compounds Are still not easily achieved by methods known in the art. According to the present invention, a suitable polypeptide is the epidermal surface in its low pH lipid soluble form. Contact with surface. Since the pH of the skin surface is typically in the range of 5.0 to 5.5 (eg, See Yosipovitch, Korting), with this range or higher transition pH. Polypeptides are present primarily in the low pH form on the skin surface. Peptide , In its lipophilic form, can diffuse through the lipid layer of the extracellular matrix of the stratum corneum. Upon contact with the aqueous compartment below the stratum corneum, the composition By progressive ionization and solvation of the polypeptide chain at near neutral pH Thus, it is actively drawn into this compartment. Both hydrophilic and lipophilic The other compound can be transported. Preferred polypeptides for this application are about 5 and 6.5. Undergoes a reversible pH-dependent transition at a pH between. The polymer composition of the present invention is preferably one or more suitable immersion, as described above. Used in cooperation with the penetration enhancer. Parents such as oleic and linolenic Oily acids maintain the polymer in its low pH lipophilic form during passage across the lipid layer May be added for These fatty acids can also be used as permeation enhancers, as described above. Function as Example 11 demonstrates the use of the present invention to enhance the transdermal delivery of the anti-rejection agent cyclosporin A. 3 illustrates the use of a representative exemplary polymer composition.G. FIG. Distribution of polypeptide after compound delivery As described above, the polypeptide of the present invention, after invading the cytosol of cells, Drugs or other compounds that are susceptible to degradation by the roteasome and therefore transported Release the material. The release of this drug is shown, for example, in FIG. In some cases, it may be desirable for the polypeptide to be intact, In this case, the polypeptide should be synthesized from D-amino acids. One example is above In H. Delivery to the stomach as described for eradication of pylori. The other is For example, the selective delivery of highly toxic drugs to tumor cells. Polypep Because the transport action of the tide is in one direction from lower pH to higher pH, Polypeptide diffuses back from the initially delivered target cells To prevent that. Therefore, the desired, resulting from access to untargeted cells Unwanted side effects are minimized. Intact polypeptides also cause the flow of the delivered drug through cellular processes. Egress can be prevented or minimized. Many cells transport drug compounds out of cells Express a glycoprotein that acts as a drug efflux pump. The bound polypeptide is Easily interfere with this process and reduce the exportation of bound drugs. Easy to reduce or prevent. As an alternative to maintaining the entire polypeptide attached to the drug, the polypeptide Can be prepared with one or more D-amino acids and the remaining L-amino acids adjacent to the drug You. L-amino acids are removed by the proteasome and D-amino acids The polypeptide "tail" with shortened acid remains. However, when the D- and L-amino acid segments are joined, It should be noted that local collapse is likely to occur at the junction of such segments . In this case, shielding and hydrogen bonding of free carboxyl in the vicinity is less efficient , And the alpha helicity of the polypeptide than when all one configuration is used. Mosquito The lipophilic form may be less lipophilic.H. Formulation and administration Formulations containing the compositions of the present invention are preferably suitable for simple administration of precise dosages. In unit dosage form, for example, tablets, capsules, powders, sustained release formulations, solutions, Solids, such as suspensions, emulsions, suppositories, ointments, lotions, or aerosols; It can be a semi-solid or liquid dosage form. Such formulations typically include a conventional pharmaceutical carrier or excipient. Rare and may further include other medical agents, carriers, or adjuvants . Preferably, the formulation will contain from about 0.5% to 75% by weight of one or more compounds of the present invention. % By weight, with the balance consisting of suitable pharmaceutical excipients. For oral administration, Such excipients include pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, starch Magnesium thearate, saccharin sodium, talc, cellulose, gluco Sucrose, gelatin, sucrose, magnesium carbonate and the like. If desired The compositions may also contain small amounts of non-toxic auxiliary substances, such as wetting, emulsifying, or buffering agents. Compounds may be included. The liquid composition may be added to form a solution or suspension, for example, saline, In a carrier such as aqueous dextrose, glycerol, or ethanol, The polypeptide-compound composition (about 0.5% to about 20%) and optional pharmaceutical It can be prepared by dissolving or dispersing the adjuvant. The compositions may be prepared by various known routes, for example, orally, transdermally, as described above, or non-transdermally. Tested orally (eg, by intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular injection) It can be administered to the body. For use in oral liquid preparations, the composition may be in liquid form or in water or Solutions, suspensions, supplied in any of the dry forms suitable for hydration in normal saline It can be prepared as a suspension, emulsion, or syrup. Transdermal delivery typically involves the slow delivery of a compound to a selected skin area Including the use of transdermal "patches" that allow for An example of a transdermal patch delivery system is rice National Patent No. 4,655,766 (Osmotic Drive System for Absorbing Liquid) and US Patent No. 5,004,610 (rate controlled transdermal delivery system). For transdermal delivery, it is desirable to include a compound that enhances penetration, as described above. Can be Such formulations may be used to fill occluded dressings in the area of interest. ng) or provided in one or more of the above-mentioned transdermal patch forms Can be For parenteral administration, injectable compositions for parenteral administration are typically sterile. The composition of the present invention is contained in a suitable IV solution, such as a physiological salt solution. The composition is Also, suspensions in lipids or phospholipids, liposome suspensions, or aqueous emulsions It can be formulated as a suspension. Methods for preparing such dosage forms are known, or will be apparent, to those skilled in the art. Yes; for exampleRemington's Pharmaceutical Sciences(1980). The following examples illustrate the invention. Example 1 Representative method for preparing polymer composition A. assembly As shown in FIG. 10, β-alanine constitutes the C-terminal residue of the polypeptide. Next, a synthetic resin is prepared. 0.7 mMol p-alkoxybenzyl alcohol,1(Cat . # A3039, Sigma Chem. Co., St. Gram containing 1% cross-linked police The Tylene resin is dissolved in 8 ml N-methylpyrrolidinone (NMP) and 0.62 g Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) β-alanine,TwoAnd then 316μ l N, N'-diisopropylcarbodiimide and 41 μl N-methylimidazole Is added. Incubate the slurry at 37 ° C with vigorous stirring for 100 minutes. And then NMP followed by CH_TwoCl_TwoWash thoroughly, drain and dry. This This is due to the content of about 250 μmol β-alanine-FMOC per gram of the substance (loading ) With resinThreegive. Protected / activated amino acids for elongating polypeptides Subsequent addition of the acid can be made by Atherton et al. (1988). This methodFourso As shown, N-fluorenylmethoxy-carbonylpentafluorophenylamido Use the acid esters. If desired, modify ends as shown in FIGS. With structure Wherein the activated ester 5 reacts with the N-terminus of the polypeptide . The polypeptide is then cleaved and deprotected according to standard methods. Compounds to be transported at one or more positions other than the termini of the polypeptide (typically If it is desired to bind the drug), a properly protected lysine or system The inn is typically incorporated at one or more selected attachment positions. Combination After cleavage and side-chain deprotection of the completed polypeptide from the resin, the drug To give the linkage shown in Example 2, the resulting amine or Can be linked to a sulfhydryl moiety. Alternatively, some drugs provide the γ-carboxy of glutamic acid via an ester linkage. To the β-carboxyl of aspartic acid or aspartic acid, as appropriate, Can be combined. The resulting amino acids are then poly-modified at one or more selected positions. Incorporate into the peptide chain. Such drugs are used to assemble polypeptides. Used to cleave polypeptides from synthetic resins and to deprotect side chains. It must have a structure that survives the conditions used. B.End modification If the compound to be transported is not linked via the N-terminus, then generally the N-terminus It is desirable to mask or delete at least some of the polar sites. this is, The FOMC moiety is cleaved from the N-terminus of the completed resin-bound polypeptide and then The nitrophenyl of tallic acid, acetic anhydride, or the succinimide derivative shown in FIG. End-structures as shown in Figures 6B, 6C and 6D, respectively. Is easily achieved by obtaining C.Cleavage, deprotection, and isolation from synthetic resins The completed polypeptide has a resin CH_TwoCl_Two, Drain, and remove 1 g 10 ml of trifluoroacetic acid (TFA), 10 ml of CH_TwoCl_Two, And 400mg of dice It can be cleaved from the resin by adding a solution containing erythritol. After 20 minutes, the cutting solution was drained into the flask, and CH_TwoCl_TwoBy evaporation To remove. Thereafter, 5-10 ml TFA is added and the solution is brought to 43 ° C. for 4 hours. Hold and remove the protecting group. Generally, post-processing of the deprotected polypeptide With ether precipitation, thorough washing with ether and drying. Various other known in the art that are also suitable for preparing the compositions of the present invention. It should be understood that there is a peptide assembly method. Example 2 Binding of compound to polypeptide on column Used to cleave polypeptides from synthetic resins and deprotect side chains Drugs or other compounds that may survive conditions (eg, for partition and cell invasion studies) The fluorescent tag) from the N-terminus of the completed resin-bound polypeptide It is often desired to cleave the compound and then link such a compound to the terminal amine. Good. In such a case, the compound to be bound is typically shown in FIG. Form amide or carbamate bonds, respectively, to such polypeptides. Technology to produce an active ester or carbonate moiety that is effective for Activated by methods known in the art. Examples 3-7 below bind compounds to polypeptides after removal from the column. A typical method is described below. Example 3 Disulfide bonds to cysteine residues in polypeptides Convenient and well-established for linking drugs to cysteines in polypeptide compositions In a preferred method, the deprotected polypeptide is combined with 2,2'-dipyridyl disulfide. React and add a drug containing a sulfhydryl moiety, as shown in FIGS. To form the desired disulfide bond. Such disulfide bonds A particular advantage of this is that it is relatively safe in the extracellular compartment and in the endosome. After transport across the endosomal membrane, the volume in the cytosol compartment is constant. It is easy to cut. The following specific examples illustrate the application of this method You. 3A.Preparation of disulfide-linked polypeptide-cyclosporin conjugate. Array (FMOC-ELLD- [LELLD]₇LELLβ; β = β-alanine) Assembled on a solid support by the method given in Example 1A. Terminal FMOC group Cleaved by treatment with 20% piperidine in NMP and terminal S-tritylated FMO C-cysteine is incorporated by the method of Example 1A. Cleavage of FMOC group and acetyl After purification, the polypeptide is cleaved from the column, deprotected, precipitated, and run. Wash as in Example 1C. The polypeptide was prepared at pH = 7 containing 0.1 M dithiothreitol. Dissolve in 5 tris buffer. Dilute the solution with an equal volume of acetonitrile, and Treatment with sufficient dipyridyl disulfide to produce a 0.4 molar solution. 2 at room temperature After stirring for an hour, the mixture was diluted with an equal volume of water, and To remove excess dipyridyl disulfide. Evaporate the solution partially Rate to remove residual ethyl acetate and the product is purified by Amberchrome (TosoHaa s) through the solution, followed by a 0-80% solution containing 0.01% triethylamine buffer. Isolate by elution with tonitrile and then lyophilization. In a separate flask, cyclosporin A metabolite having a primary hydroxyl group G (Eberle and Nuninger, 1992) using the method of Chen and Tai (1995). Treated with succinic anhydride and the acid is treated with N-hydroxysuccinimide and 1- (3 Active in (-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide methiodide (Aldrich) Converted to sexual ester. The product is dissolved in DMF and 2-aminoethanethio And triethylamine. The reaction mixture was diluted with dichloromethane And wash with 0.1 M citric acid to remove excess reagent. The product Obtained by evaporation. Dissolve the residue in DMF and use the previous paragraph Treated with these pyridyl polypeptide disulfides. The product is evaporated off of DMF and then in 0.01% triethylamine buffer Reverse phase purification on Amberchrome eluting with 0-80% acetonitrile followed by lyophilization Therefore, it is isolated. Alternatively, following evaporation of DMF, the product is a_TwoHPO_FourAnd thoroughly washed with ethyl acetate saturated with water. Dissolved vinegar After partial evaporation to remove the ethyl acid, formic acid was added and the product Which is thoroughly washed with water containing 0.1% formic acid and then completely removed under high vacuum. To dry. 3B.Preparation of Disulfide Bonded Polypeptide-Taxol ^™ Conjugate. Cysteine With the terminal pyridyl disulfide moiety of (AcNH-CELLD- [LELLD]₇LELLβ; A polypeptide having (β = β-alanine) is prepared as described above. Taxol in a separate container^TMBy the method of Guerite-Vogelein et al. (1991). Glutaryl Taxol^TMConvert to This type of carboxyl group is -(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide methiodide (Aldrich) And 4-dimethylaminopyridine using N-hydroxysuccinimide Activates as N-hydroxysuccinimide ester. Product is dissolved in DMF And treated with 2-aminoethanethiol hydrochloride and triethylamine. The reaction mixture was diluted with dichloromethane and washed with 0.1 M citric acid to remove excess Remove the reagents. The product is obtained by evaporation. Dissolve residue in DMF And treated with a pyridyl polypeptide disulfide from above. The product , Isolated as in the example of cyclosporine. Example 4 Thioether bonds to cysteine residues in polypeptides 4A.Preparation of thioether-linked polypeptide-cyclosporin conjugate. Sicross Porin A metabolite 17 (see Example 3A) was treated with 1: 1 dichloromethane / pyridine. Treat with chloroacetic anhydride in to form the acid chloride (see FIG. 11). Excessive Excess reagent is quenched by the addition of water and the solvent is evaporated. Remaining The residue is dissolved in ethyl acetate and 0.1 M citric acid, 0.1 M sodium bicarbonate, and Wash with brine and then evaporate. Redissolve the residue in DMF. The polypeptide pyridyl disulfide prepared in Example 3A was diluted with pH 9.0 borate buffer. Dissolve in the buffer. This was combined with an equal volume of the DMF solution (CS: polypeptide ratio = 4: 1). ) And add TCEP (tris (carboxyethyl) phosphine hydrochloride) I do. After stirring at room temperature, the product is isolated as in Example 3A. 4B.Preparation of thioether-linked polypeptide-Taxol ^™ conjugate. Array (FMOC- ELLD- [LELLD]₇LELLβ; β = β-alanine) in Example 1A Prepare on a solid support as described above. Remove the terminal FMOC group and distill the column Treatment with acryloyl chloride in dichloromethane containing isopropylethylamine Thus, a terminal acrylyl group is formed (FIG. 11). Remove the polymer from the column, Deprotect, precipitate and wash using trifluoroacetic acid according to standard methods. Cleanse. The product is dissolved in a pH 9.0 borate buffer. Taxol in separate flasks^TMWas thiolated by the method in Example 3A. Convert to seed. Dissolve product in DMF and mix with acrylamide species from above paragraph And add TCEP. After stirring at room temperature, the product was treated as in Example 3A. Isolate. Example 5 Carbamate binding to the amine moiety of the polypeptide Deprotected polypep containing one or more amine moieties prepared as in Example 1C The ether precipitate of tide was washed with 0.1 M Na_TwoHPO_FourDissolve in aqueous solution. Precipitating polypeptide Sufficient formic acid is added to allow for precipitation and the precipitate is collected by centrifugation and And wash twice with 0.1% formic acid in water. The polypeptide precipitate is then removed under high vacuum. Dry overnight. A compound to be attached to a polypeptide, comprising at least one hydroxyl moiety The compound is combined with 3 equivalents of bis-nitrophenyl carbonate and 0.1 equivalent of Activated by reacting with ethylamine. After activation, excess bis-ni The trophenyl carbonate is removed and then the activated carbonate product (see FIG. 11). See), 0.5 to 2 equivalents of the polypeptide set, prepared as described above, in NMP React with the product. Generally, good coupling is achieved at 43 ° C for 12-72 hours. Achieved by incubation. Example 6 Amide bond to amine moiety 6A.Preparation of amide-linked polypeptide-cyclosporin conjugate. 1.Use of peptides of defined length. Array (FMOC-ELLD- [LELLD]₇LELLβ; β = β -Alanine) by the method given in Example 1A, Assemble on a solid support. The terminal FMOC group is cleaved as in the method in Example 1A, The resin is then replaced with excess bis- (4-nitrophenyl) ester of glutaric acid in NMP. To process. (The ester is synthesized using triethylamine in dichloromethane, Prepared from glutaryl chloride and nitrophenol. Excess nitropheno Wash with sodium hydroxide solution to remove the alcohol and unreacted glutaric acid species. After purification, the evaporated product is recrystallized from toluene. ) Activated The polypeptide is cleaved from the column, precipitated, and using the method in Example 1C And wash. In a separate flask, add cyclosporin A metabolite 17 (see Example 3A). And glycine in dichloromethane in the presence of a 4-dimethylaminopyridine catalyst Of FMOC derivative and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide Treat with thiozide (Aldrich). The reaction mixture is washed with acid and base, Excess reagents are removed and the product is purified using 0-2% methanol in chloroform. Perform chromatography on silica gel. Removal of FMOC group in DMF 20 Of FMOC-glycylcyclosporin containing 50% triethylamine at 50 ° C. for 1 hour Achieved by processing. Triethylamine is removed by evaporation under vacuum Remove and mix the free amino derivative with the activated polypeptide described above. You. The solution was evaporated under vacuum to a minimum volume and left at 42 ° C. for 24 hours I do. The product is isolated as in Example 3A. 2.Use of random length high glutamate content peptides. High glutamate content A random length peptide having a C-terminal initiator region was prepared as follows. I do. Chlorotrityl resin preloaded with N-Fmoc-β-alanine (Novabiochem, LaJ olla CA) using HBTU (Novabiochem) and diisopropylethylamine N-α-Fmoc-L-glutamic acid γ-t-butyl ester and N-α-Fmoc-L-leucine Reaction with FMOC-LeuGlu (OtBu) LeuLeu-NHCH_TwoCH_TwoProduces COO-resin. Next Then, the Fmoc group is removed by a usual method. The resin-bound initiator peptide is combined with about 10: 1 anhydride to initiator. Using the ratio, the carbohydrate of L-glutamic acid γ- (4-methoxybenzyl) ester in DMF Treated 6 times with xy anhydride (Hanabusa et al., 1984). This translates into about 40-50 Is sufficient to add a protected glutamic acid residue. The N-terminus is then Reaction with excess glutaric acid bis- (p-nitrophenyl) ester. The peptide is cleaved from the resin and deprotected as described in Example 1C. D The residue after evaporation is dissolved in dichloromethane and washed with water to give a small amount. Remove the amount of trifluoroacetic acid. The isolated polyacid is dissolved in DMF and Taxol^TM Treat with -7-alanine (Mathew et al., 1992). The reaction mixture was adjusted to pH 7.0 phosphate buffer. Solution and the product is purified by Q-Sepharo using a 0-1.0 M NaCl gradient. by ion exchange chromatography on se (Pharmacia, Piscataway, NJ) Purify. The material is then adsorbed on Amberchrome SD (TosoHaas), 0-80% Elution with a tonitrile gradient and lyophilization to form the sodium salt. To isolate. 6B.Preparation of amide-linked polypeptide-Taxol ^™ conjugate. Array (H_TwoN-ELLD- [LE LLD]₇LELLβ; β = β-alanine) together with a terminal amino group Prepared as in Examples 1 and 5. Taxol in a separate container^TMBy the method of Guerite-Vogelein et al. (1991). Glutaryl Taxol^TMConvert to This kind of carboxyl group is Of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide methoxide (Aldrich ) And 4-dimethylaminopyridine with N-hydroxysuccinimide As an N-hydroxysuccinimide ester. Excess reagents and secondary After washing to remove the product, the ester was isolated by evaporation, It is then mixed with the polypeptide in DMF. Evaporate the solution under vacuum to a minimum volume. Rate and leave at 42 ° C. for 24 hours. The product was simply isolated as in Example 3. Let go. 6C.Between the polypeptide and the 5 'end of the 20-mer morpholino antisense oligo Preparation of amide bond . Structure and subunits of morpholino oligos and polypeptides The bit sequence is as follows, with reference to FIG. R₁= -ELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLDLELLβ Where D = aspartic acid, E = glutamic acid, L = leucine, β = β-alanine R_Two= 5'-G^*G^*UG^*G^*UUC^*C^*UUC^*UC^*A^*G^*UC^*G^*G^*-Acetyl here A^*= Morpholino 6-benzoyl adenine C^*= Morpholino 6-benzoylcytosine G^*= Morpholino 6-phenylacetylguanine U = Morpholinouracil Step 1(Figure 13A): In Figure 13A1Summerton and Weller (1993) 17 mg (2 μMole) of base-protected morpholino antisense Rigo (MW 8361) is suspended in 200 μl NMP. Bis (p-nitrophenyl) succine 2 (7.2 mg; 20 μMol) was added and the preparation was incubated at 43 ° C. for 4 hours. Beate. Unreacted succinate was removed from 30 ml of acetonitrile using morpholino- Remove succinate product by settling out, centrifuge and discard supernatant Resuspend the pellet in 0.4 ml NMP, add to 30 ml acetonitrile, centrifuge Release, discard the supernatant, and pellet the morpholino-succinate under high vacuum. ProductThreeAllow to dry. Morpholino with succinate linker 3 (2 μMole) prepared above Antisense oligo,Four31 mg as defined above (6 μMo le) Deprotected 44-amino acid polypeptide R₁-NH_TwoWith 3mm magnetic Into a 0.75 ml vial containing a stirring bar and place the aqueous solution as described in Example 2B (iii). Which has a free amine moiety at the N-terminus. Add DMF (150μL) And the mixture is stirred in a warm water bath until dissolution is complete. Then the reaction mixture The mixture was incubated at 43 ° C. for 72 hours, diluted with 200 μL of NMP, and Transfer to screw cap vial. 600 μL concentrated NH_FourOH is added and the solution is Incubate at 43 ° C for 18 hours to purify morpholino antisense oligos And the pyrimidine base. ProductFiveIs purified as described in Example 8C. You. Step 2(Figure 13B): In this procedure, the activated succinate linker is The peptide is added and the adduct is reacted with the morpholino antisense oligo. Therefore, 180 mg of synthetic resin / polypeptide prepared as in Example 1 NMP suspension is treated with 20% piperidine in NMP and then washed repeatedly with NMP. Cleanse. Dissolve bis (p-nitrophenyl) succinate (150mg) in 0.9ml NMP , Add to the short frit column containing the resin / polypeptide preparation and bring to 43 ° C. And incubate for 2 hours. Wash off excess succinate linker, and The product is cleaved from the synthetic resin to give the polypeptide-screen as described in Example 1C. A sinate product (MW 5329) is obtained. 32 mg prepared as described above in a 0.75 ml vial containing a magnetic stir bar (6 μMole) of the polypeptide-succinate product and add 5 ′ secondary 17 mg (2 μMole) of a morpholino antisense oligo (1), And 150 μL of DMF. This mixture is placed in a warm water bath until dissolution is complete. Stir. The reaction mixture is then incubated at 43 ° C. for 48 hours. afterwards The reaction mixture is diluted with 200 μL of NMP and 2 ml screw cap by Transfer to Al. 600 μL concentrated NH_FourOH was added and the solution was incubated at 43 ° C for 18 hours. To remove the purine and pyrimidine bases of the morpholino antisense oligo. Protect. Product (Five) Is purified as described in Example 8C. Step 3(FIG. 13C): A morpholino antisense oligo was prepared. According to methods known in the art, the first subunit comprising 5'-SH is Linked to a synthetic resin via an amide bond. 2vut still with protected base hMorpholino oligos were added with 1% wt / vol dithiothreitol and 5% v / v triethyl Cleavage from synthetic resin using N-methylpyrrolidinone with amine. Eluted The oligo was precipitated with t-butyl methyl ether and the pellet was washed with t-butyl methyl ether. Washed twice with methyl ether and then dried under high vacuum to give 5'-SH and 3 ' A base protected morpholino oligo with acetyl is obtained. Sequence E, prepared as shown in FIG.₃₂Has MELMLβ (N-terminal to C-terminal) The polypeptide still on the synthetic resin is converted to chloroacetic anhydride in dichloromethane. Cap at the N-terminus using and wash the resin thoroughly. Then the polype Cleave the peptide and 49: 49: 2 TFA: CH_TwoCl_Two: H_TwoEluted from the resin with O, CH_TwoCl_TwoTo Remove under aspirator vacuum, 98: 2 TFA: H_TwoO, and bring the solution to 43 ° C And incubate for 4 hours. The polypeptide is then replaced with t-butylmethyl Precipitated with ether and washed the pellet twice with t-butyl methyl ether, After drying under high vacuum, the chloroacetylated polypeptide shown in FIG. Get the tide. The morpholino oligo and the polypeptide were replaced with 5 μmole of 5′-SH morpholino. Rigo, 10 μmol chloroacetyl polypeptide, and 400 μmol N, N-dimethyl Coupling by adding ethanolamine to 1 ml of formamide Stir until lysis is complete, then incubate at room temperature for 2 hours, In order 3 vuth, as shown in FIG.13C, the polypeptides linked by thioether bonds The peptide-morpholino oligo is obtained. The morpholino oligo base is replaced with 2 volumes of concentrated NH_FourO Deprotect by adding H to the reaction mixture and incubate at 43 ° C for 16 hours. Lab. Excess NH_ThreeAfter release of the product, the product is treated as described in Example 8C. Purify by anion exchange chromatography. Example 7A Amide bond to carboxyl moiety This example demonstrates an amide bond with a random length, high glutamate content peptide. Polypeptide-Taxol^TMThe preparation of the conjugate is described. High-glutamic acid content, random length peptide containing C-terminal initiator region Is first prepared as follows. Chlorotri preloaded with N-Fmoc-β-alanine (Novabiochem) Chilled resin using HBTU (Novabiochem) and diisopropylethylamide N-α-Fmoc-L-glutamic acid γ-t-butyl ester and N-α-Fmoc-L-leucine React with Fmoc-Leu-Glu (OtBu) LeuLeu-NHCH_TwoCH_TwoProduces COO-resin. Security The protected peptide was treated with 0.5% trifluoroacetic acid in dichloromethane. To remove from the resin. The residue is redissolved in dichloromethane and Treatment with azomethane (Kametani et al.) To form C-terminal diphenylmethyl ester And the product is precipitated with hexane. Dissolve the residue in dichloromethane and add The product is precipitated with ether / hexane. The precipitate is washed with 20% (v / v) piperidine. Dissolve in DMF containing The solution was evaporated and the amino-terminated initiator Ta -Prepare the peptide for extension. The initiator peptide is dissolved in DMF and L-glutamic acid γ- (4-methoxy (Cibenzyl) ester with carboxylic anhydride (Hanabusa et al.). Anhydrous The ratio of initiator to initiator was about 60: 1. This is about 40-50 protected gluta It is sufficient to add a formic acid residue to the peptide. The reaction proceeds with the addition of acetic anhydride. Thus, it is quenched, the solvent is removed by evaporation and the product is evaporated. Purification by repeated precipitation from dichloromethane using ether / hexane Was. The peptide was deprotected as described in Example 1C and 0.1 M Na_TwoHPO_FourDissolution in And then precipitated with formic acid as described in Example 5. Enough Taxol to dissolve the polyacid in DMF and displace 5-30% of the acid side chains^TM -7-alanine (Mathew et al.) And 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcar Treat with bodiimidomethiodide. Dilute the reaction mixture with pH 7.0 phosphate buffer. And the product was purified using Q-Sepharose (Pharma) using a 0-1.0 M NaCl gradient. Purification by ion exchange chromatography on cia). The substance is then Adsorption on nberchrome SD (TosoHaas), 0-80% acetonitrile gradient It is isolated as the sodium salt by elution and lyophilization. Example 7B Amide bond to N-terminal cysteine A very efficient coupling is performed according to the method of Dawson et al. Can be performed between a drug or other compound containing an ester and an N-terminal cysteine residue You. As shown in FIG. 11, this coupling proceeds in two steps. First thio Form amide bond after cysteine sulfhydryl attack on ester Intramolecular attack by N-terminal amine on thioester of product Continue. Example 8 Representative methods for purification and structural analysis of polymeric compound products A.Silica gel chromatography Many polypeptides whose polypeptide components determine the chromatographic properties of a composition For peptide-drug products, purification is by silica gel chromatography. Is easily achieved. About 1: 1 to 3: 1, isopropanol and 2 in the ratio v / v Mixtures with 5% aqueous triethylamine are typically good chromatographies. Provides resolution. B.Purification by partition Polypeptide compositions that partition well to octanol at reduced pH (generally, With less than 50% amino acid composition) By partitioning between aqueous buffers having a pH about 0.2 pH units below the transition pH, Often, unwanted undesirable sequences that occur during polypeptide assembly It can be separated effectively. The purified polypeptide is an aqueous Na_TwoHPO_FourDistribution to From the octanol phase and then precipitated with formic acid. Typically, this The purification procedure is performed prior to drug conjugation. This "purification by function (purification-by- function) "method, which involves the preparation of long polypeptides containing significant fractions of failed sequences. It has been found to be useful in manufacturing. C.Ion exchange / reverse phase chromatography A particularly versatile method for purifying polypeptide-drug products is ion exchange chromatography. Chromatography followed by reversed-phase chromatography, where the later steps remove salts Remove and provide further purification. The use of this purification method depends on the polypeptide- A morpholino antisense oligo product is described, the synthesis of which is described in Example 6C. Described and its structure is shown in FIG. The polypeptide-morpholino oligo preparation is placed in a rotovap flask Transfer and remove excess ammonia under aspirator vacuum. About 10ml of Tr is acetate buffer (0.1 M Trizma base, pH 8 with acetic acid) is added and the solution is Load onto a 2.5 cm x 15 cm column of rep Q anion exchange resin (BioRad Corp.). B After loading, the column was washed with Tris acetate buffer for 10 minutes (flow rate 5 ml / min), then Dissolve for 40 minutes in Tris acetate buffer to increase NaCl linearly from 0 to 1.0M Put out. The system uses a morpholino antisense oligo (monitored at 254 nm). Eluted in the first 15 minutes and the polypeptide-morpholino product Elution in 30 minutes. The polypeptide-morpholino peak was collected, followed by 2.5 c of 50 μm polypropylene. Demineralize with an mx 15 cm column (Polysciences Corp.). This reverse phase column is H_FourWash with OH for 15 minutes, then 1% concentrated NH_Four0-80% acetonitrile gradient in OH And elute at a flow rate of 5 ml / min over 40 minutes. Polypeptide-morpholino oligo raw The fractions containing the product are combined and briefly removed to remove acetonitrile and ammonia. Simply rotovaped and then lyophilized. D.Mass spectrum analysis For mass spectral analysis, a portion of the polypeptide-morpholino product was % Concentrated NH_FourSuspend at a concentration of 20 μM in OH. 3,4,5-trihydroxyacetophenone / This material co-crystallized with diammonium citrate (1: 2) Analyze by laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Representative analysis In the figure, 11,881 masses were found, which correspond to the polypeptide-morpholino shown in FIG. Almost exactly in agreement with the 11,861 calculated masses predicted for the product. Example 9 Evaluation of distribution characteristics In optimizing a polypeptide composition for a particular delivery application, the polypeptide It is often desirable to first conduct a partition study on the components alone. like this Studies generally involve quantifying the distribution of polypeptides between octanol and the aqueous phase. It is useful to add a chromophore or fluorophore tag for simplicity. to this In this regard, 5-carboxyfluorescein is readily quantified and of reasonable length Construct a tag that does not unduly affect the partitioning properties of the polypeptide. This tag Further benefits of providing easily visible signals suitable for cell invasion studies Has advantages. A representative distribution study is described below. Stock buffer 1 ｛0.1M citric acid (pK_a1 = 3.14; pK_a2= 4.77; pK_a3= 6.39), 0.1M N-morpholineethanesulfonic acid (MES ; PK_a= 6.1), and 0.1M phosphoric acid (pK_a1= 2.2; PK_a2= 7.2)｝ and Tok buffer 2 (0.1 M MES sodium salt, 0.1 M trisodium citrate, and 0.1 M Prepare 1M disodium phosphate). Drop stock buffer 1 with stock buffer 2 To form a series of buffers ranging from pH 4 to pH 8, increasing by about 0.2 pH units . Each vial contains 0.28 ml of one set of buffers and 0.3 ml of solvent. Prepare a 0.75 ml glass vial of the kit. The solvent contains less than about 50% acid amino acids. N-octanol and more than about 50% acidic amino acids for polypeptides N-pentanol for polypeptides. For each vial in this set, combine 20 μl of a 0.1 mM aqueous solution of the isolated carboxyfluorescein-containing polypeptide Added. Cap each of these vials, shake thoroughly, and then centrifuge. Separate the phases by separating the heart. Thereafter, 150 μl of the upper octanol phase was mixed with 150 μl of 85% isopropanol / 15% 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU ) And the absorbance of the solution is measured at 500 nm. Next, under 150μl Of the aqueous phase is added to 150 μl of 85% isopropanol / 15% DBU and the absorbance is determined. Measure. 14A-F show six exemplary fluorescein-tagged polypeptides of the invention. Shown is a plot of these absorbance values as a function of pH for And the six different polypeptides have octanol / water transition pH values in the range of 5.1 to 6.9. Is shown. Example 10 Evaluation of cytosol penetration A.Direct intrusion This example demonstrates the direct coupling of attached animal cells to the cytosol from extracellular media. Fluorescein-tagged polypeptides with or without combined drug A useful method for testing the transport of the composition is described. End site No noticeable cell invasion by cis should occur during the short period of this procedure (approximately 20 minutes). It should be noted that. Encapsulation media commonly used in fluorescence microscopy are cells Alters both the osmotic pressure and the pH of the environment, so that It is recommended that no land be used. Instead, use cells for water immersion And inspect. In addition, the culture medium for testing cells is phenol red (this is , Typically used as a pH indicator in the culture medium) New This is because this compound interferes with the fluorescent signal. The procedure for a direct cell invasion study is described below. Medium 1 was pH 6.5 with NaOH. Serum-free medium buffered with 20 mM MES (morpholineethanesulfonic acid) Including ground. Medium 2 was a serum-free medium buffered with 50 mM MES adjusted to pH 5.0 including. 150 μl aliquot of a 1 mM solution of the polypeptide composition tagged with fluorescein The plate was diluted in 1.9 ml of Medium 1 and a 0.5 ml portion was plated 24 h prior to Hela cells. Attached to 2 cm x 2 cm wells of four rated glass chamber slides Add. After 10 minutes, 375 μl of Medium 2 is added to wells 2, 3, and 4 (provide pH 6.0) ). After an additional 10 minutes, an additional 375 μl of Medium 2 was added to wells 3 and 4 (Giving a pH of 5.8). Ten minutes later, another 500 μl of Medium 2 was added to well 4 (Giving a pH of 5.6). After each addition, gently swirl slides Mix the solution thoroughly. Aspirate all wells 10 minutes after last addition And wash each well three times with 1 ml volume of DME-F12 culture medium + 10% FBS, pH 7.4 And observe the cells by fluorescence microscopy. Cytosolic invasion is generally due to diffuse fluorescence throughout the cell. Is shown. However, some compounds (eg, antisense oligomers) Subsequently, passing from the cytosol to the nucleus (where they accumulate preferentially) Attention should be paid to Therefore, nuclear accumulation in direct penetration experiments is also good. Evidence of safe cytosolic intrusion. In addition to the above quantitative assessment of cytosolic invasion by fluorescence microscopy, transported Qualitative and / or quantitative functional assays specific for the drug can also be performed in reduced-pH media. It should be understood that this can be done after treatment of the cells with a. The above procedure, if desired, includes the bound compound to be transported, How low must the pH be for transmembrane transport of a given polypeptide composition? Provide information about what must be done. If the polymer is triethylamine rather than an alkali metal base or ammonia Note that, when neutralized during purification, good invasion was generally obtained. Should. This effect may be due to a relatively lipophilic counterion. did Thus, the polypeptide to be tested will have any of the counterions in this result. It should be purified in a consistent manner to minimize such effects. B.Invasion by endocytosis Perinuclear when endocytosing fluorescently tagged polypeptides into cells Observation of the dot-like pattern of Indicates that it is localized in the statement. However, the fluorescence diffused throughout the cells That the peptide has achieved transport from the desired endosome to the cytosol, or Liposomes (when assembled from L-amino acids) are separated by lysosomal enzymes And could indicate that the fluorescent tag had diffused into the cytosol. Therefore, Cytosolic invasion by the endocytotic pathway results in the release of polypeptide-drug products. It is desired to be confirmed by a functional assay for the drug component. below Two examples utilize such a functional assay. 1.No endocytosis enhancer. Used in this functional assay Hela cells regulate the genetic code encoding the 5 'untranslated region of rabbit α-globin mRNA Mouse breast cancer virus promoter (inducible with dexamethasone) Plasmid containing coding sequence for luciferase (Partridge, 1996) Stably transfected. Cell-free and intracellular scraping-in-cells crape-load) The translation study showed that the morpholino antisense oligomer shown in FIG. Is very effective at blocking the translation of luciferase from this gene construct. It shows that it is fruitful. Therefore, the antisense oligomer of FIG. Gain access to the cytosol compartment of these transfected cells If dexamethasone is induced in untreated cells, luciferase activity Should result in a significant decrease in Measured as a relative light unit in an illuminometer Such a decrease in luciferase activity can be attributed to the good support of morpholino oligomers. 3 illustrates itosol delivery. To test cytosol delivery, a polypropylene prepared as in Example 6C The peptide-morpholino antisense oligonucleotide product was prepared at a concentration of 5 μM. Suspended in culture medium. Transfect Hela cells as above for 5 hours in suspension Treatment followed by dexamethasone for 16 hours to induce luciferase synthesis . In parallel, cells in separate wells are a) medium alone, b) morpholino antisense Treated with Soligo and c) polypeptide. Luciferase from cells in these four wells was quantified and the relative light The units are shown in Table 3. Table 3 Processing Relative light unit Medium alone 100 Polypeptide 105 Polypeptide-morpholino product 69 Morpholino antisense oligo 114 Luciferase activity in cells treated with polypeptide-morpholino product Inhibition of this means that the polypeptide is transferred from the endosomes of Hela cells to the cytosol This suggests that the chisense oligomer was transported. 2.With endocytosis enhancer. The experiment in the above embodiment is described below. Repeated with the following changes: a) the polypeptide-morpholino product in the medium The concentration was only 300 nM, and b) Transfectam (Promega Corp., Madison, W I) was added at a concentration of 20 μg / ml. Tetracationic Transfectam is a polyanion Binding electrostatically (in its high pH form) to the transgenic polypeptide and transfectam 2 The two long-chain alkane moieties are complexed on the cell surface as shown in Figure 12. Lipids for substantially increasing the effective concentration of peptide-morpholino product Acts as an anchor, thereby substantially increasing the rate of cell entry It was predicted. The results from this experiment are shown in Table 4.Table 4 processing Relative light unit Medium only. . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Transfectam. . . . . . . . . . . . . . . . 97 Transfectam + polypeptide-morpholino product 35 Cells treated with a combination of Transfectam and a polypeptide-morpholino product Increased inhibition of luciferase activity in vesicles also indicates that the polypeptide is Transporting this antisense oligo from the endosome of the vesicle to the cytosol, and And cytosol invasion increased by accelerating the initial endocytosis process Suggest that it can be added. Example 11 Enhanced transdermal delivery This example enhances the transdermal delivery of drugs that typically show very minimal passage across the epidermis. 5 illustrates the use of a representative polypeptide composition of the invention to enhance. Trichi Cyclosporin A metabolite 17 was prepared as described in Examples 3 and 4. The polypeptide is linked to a suitable polypeptide, and the polypeptide portion in its low pH form is A conjugate composition having a lipophilic fatty acid (eg, 10% linolenic acid / 90% propylene) Glycol)) in a suitable penetration enhancer solution. Combined polype Peptide-free tritylated cyclosporin A metabolite 17 is converted to an unmodified drug Suspend in the same penetration enhancer solution for comparative evaluation of transdermal transit speed . Each cyclosporin-containing solution is applied to a predetermined area of the skin of nude hairless mice. Touched and a small aliquot of blood was passed through the skin and into the circulatory system. Collect regularly for evaluation of the amount of chilled drug.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/337 Ａ６１Ｋ 31/335 ６０２ 31/74 31/74 // Ａ６１Ｋ 38/00 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ウェラー，ドワイトディー. アメリカ合衆国オレゴン 97330，コーバリス，エヌ．ダブリュー．エルムウッドストリート 3323──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61K 31/337 A61K 31/335 602 31/74 31/74 // A61K 38/00 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB , GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU (72) Inventor Weller, Dwight D. United States Oregon 97330, Corvallis, N. Wu. Elmwood Street 3323

Claims

[Claims] 1. Compound from low pH environment to higher pH aqueous compartment across lipid layer A composition for transporting (A) a polypeptide comprising one or more pairs of side chain carboxyl groups, wherein the polypeptide comprises so (I) the pair of carboxyl groups is separated by 0, 2 or 3 amino acids , (Ii) the polypeptide has a length of between about 8 and about 100 amino acid residues; (Iii) the polypeptide is effective to partition from the low pH environment to the lipid layer Lipophilic form and preferential separation from the lipid layer into the higher pH aqueous compartment Effective to undergo a reversible transition between a hydrophilic form that is effective to arrange And (Iv) the polypeptide promotes entry of a terminal region into the lipid layer, Including an initiator moiety in the terminal region of the polypeptide; Here, the initiator portion is (i) an initiator having 3 to 12 amino acid residues. Eater polypeptide sequences wherein the ratio of non-acid side chain residues to acid side chain residues is 1 Greater, sequence, (ii) effective at eliminating positive or negative charges at the N or C terminus At least one that is effective to protect polar sites near the terminus. A group covalently linked to the N or C terminus having two remote polar groups, (iii) delivery Selected from the group consisting of lipophilic compounds to be Selected; This allows the polypeptide to move from the lower pH environment to the higher pH compartment. A polypeptide capable of crossing the lipid layer to the (B) a compound to be transported, covalently linked to the polypeptide; A composition comprising: 2. The initiator moiety is the initiator polypeptide sequence The composition of claim 1. 3. 3. The composition of claim 2, wherein said sequence has 5 to 10 amino acid residues. 4. Amino acid residues in the initiator sequence are glutamic acid, leucine , Norvaline, methionine, alanine, α-aminobutyric acid, β-aminobutyric acid, and And β-alanine, where non-glutamic acid versus glutamic acid 3. The composition of claim 2, wherein the residue ratio is greater than one. 5. The group covalently linked to the N or C terminus allows for the synthesis of the polypeptide. A β-alanine moiety at the C-terminus used to initiate termination of the polypeptide The dicarboxylic acid at the N-terminus used for binding, and a combination of the two The composition of claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of: 6. 30 to 100 percent of the amino acid residues that form the polypeptide The composition of claim 1, wherein the composition is formic acid. 7. The polypeptide, wherein the polypeptide has an initiator moiety in the terminal region 7. The composition of claim 6, which is glutamic acid. 8. The initiator moiety is used to initiate synthesis of the polypeptide. The β-alanine moiety at the C-terminus used to terminate the polypeptide Selected from the dicarboxylic acids at the N-terminus used, and combinations of the two. The composition of claim 7, wherein the composition is 9. Non-acidic nature of the polypeptide not used for covalent attachment of the transported compound When the side chain residue is that the polypeptide is in a low pH α-helical conformation, The composition of claim 1, wherein the composition does not include a moiety that is cationic. 10. The non-acid side chain residue is phenylalanine, leucine, isoleucine, Thionine, valine, norvaline, alanine, α-aminobutyric acid, and asparagus 10. The composition of claim 9, which is selected from the group consisting of side chain esters of formic acid and glutamic acid. A composition according to claim 1. 11. The non-acid side chain residues are leucine, methionine, alanine, and α- The composition according to claim 10, wherein the composition is selected from minobutyric acid. 12. The polypeptide has a predetermined length of between about 24 and 100 amino acid residues. The composition of claim 1 having a composition. 13. The polypeptide has a predetermined length of between about 24 and 48 amino acid residues. 13. The composition according to claim 12, wherein 14． The polypeptide comprises between about 8 and about 100 glutamic acid and non-glutamic acid. 2. The composition according to claim 1, wherein the composition has a predetermined sequence of tamic acid residues. 15. The polypeptide of the predetermined sequence has less than 50% acid side chain amino acid residues. 15. The composition of claim 14, wherein the composition comprises: 16. 2. The composition of claim 1, wherein the compound / polypeptide ratio is 5: 1 or less. . 17． The composition comprises a polypeptide opposite to the end having the initiator moiety. Comprising a single linked compound attached at or near the end of the peptide Item 17. The composition according to Item 16. 18. Wherein the compound is taxol, cyclosporin, amphotericin B, and 2. The set of claim 1, wherein the set is selected from the group consisting of: Adult. 19. 19. The compound of claim 18, wherein the compound is a sequence-specific nucleic acid binding polymer. Composition. 20. Shifting from a low pH environment to a higher pH aqueous compartment across a lipid layer A method for promoting the transport of a compound, Covalently linking the compound to a polypeptide comprising one or more side chain carboxyl groups Process, where (I) the pair of carboxyl groups is separated by 0, 2 or 3 amino acids , (Ii) the polypeptide has a length of between about 8 and about 100 amino acid residues; (Iii) the polypeptide is effective to partition from the low pH environment to the lipid layer Effective in lipophilic form and preferential distribution to the higher pH aqueous compartment Effective to undergo a reversible transition between the final hydrophilic form and (Iv) the polypeptide promotes entry of a terminal region into the lipid layer, Including an initiator part in the terminal region, Here, the initiator portion is (i) an initiator having 3 to 12 amino acid residues. Eater polypeptide sequences wherein the ratio of non-acid side chain residues to acid side chain residues is 1 Greater than the pH at which polyglutamic acid of the same length forms an alpha helix A sequence, (ii) N or C, which is effective to form an alpha helix at high pH; Effective to eliminate positive or negative charges at the terminus, and a polar moiety near the terminus The N or having at least one remote polar group effective to protect the position A group covalently attached to the C-terminus, (iii) a lipophilic compound to be delivered, and (iv) Selected from the group consisting of: This causes the polypeptide and the bound compound to move away from the low pH compartment. It is possible to traverse the lipid layer from the compartment to the higher pH compartment, Process A method comprising: 21. The non-acid side chain residue of the polypeptide is phenylalanine, leucine, Soleucine, methionine, valine, norvaline, alanine, α-aminobutyric acid, Selected from the group consisting of side chain esters of aspartic acid and glutamic acid 21. The method of claim 20, wherein the method is performed. 22. The polypeptide is used to initiate synthesis of the polypeptide. A β-alanine moiety at the C-terminus, used to terminate the polypeptide A dicarboxylic acid at the N-terminus and a combination of the two. 21. The method of claim 20, which is a polyglutamic acid having a initiator moiety. 23. A predetermined sequence wherein said polypeptide has less than 50% acid side chain amino acid residues 21. The method of claim 20, which is a polypeptide of 24. 21. The method of claim 20, wherein the compound / polypeptide ratio is 5: 1 or less. Law. 25. Wherein the compound is taxol, cyclosporin, amphotericin B, and 25. The method of claim 24, wherein the nucleic acid is selected from the group consisting of Method. 26. A cell having a predetermined pH, wherein the compound to be delivered is a therapeutic compound The compound can be delivered from the external medium to the cytosol of cells having a higher pH. 21. The method of claim 20, for use in and. 27. The extracellular medium is gastric juice; pylori bacterial cells, And the combined compound is an antibacterial agent. of use in the treatment of pylori infection 27. The method of claim 26, for: 28. The cells are tumor cells present in an acidic extracellular medium, and 27. The method of claim 26, wherein the compound is an antineoplastic agent, for use in antitumor therapy. Method. 29. The cell is an acid-producing cariogenic bacterial cell, and Compound treatment is an effective antibacterial agent against cariogenic bacteria, treatment of tooth decay 27. The method of claim 26, for use in prophylaxis. 30. Wherein the lipid layer comprises the extracellular matrix of the stratum corneum, 21. The method of claim 20, for use in transdermal delivery.