【発明の詳細な説明】
植物の糖センサーおよびその使用 発明の背景
本出願は、植物の糖質代謝に関する。特に、糖感知シグナルを伝達する酵素、
それらをコードする遺伝子、およびそれらの使用に関する。
糖は、生理機能、代謝、細胞周期、発生、および遺伝子発現を制御することが
できる調節分子であるといわれている。発芽から開花、老化に至るまでの、高等
植物の生活環を通じて、糖は、成長と発生とに影響を与える。最近、糖が、光合
成、グリオキシル酸回路、呼吸、デンプンおよび糖の合成および分解、窒素の代
謝および貯蔵、病原体防御、傷害応答、細胞周期の進行、着色、ならびに老化な
どを含む、多くの重要な過程に関係する植物遺伝子を抑制したり活性化したりす
る生理学的なシグナルであることが明らかにされた（Sheen，Photosynthesis Re
s．39，427(1994);Thomas and Rodriguez，Plant Physiol．106，1235(1994);Kn
ight and Gray，Mol．Gen.Genet．242，586(1994);Lam et al.，Plant Physiol
．106，1347(1994);Chenet al.，Plant J．6，625(1994);Reynolds and Smith，
Plant Mol．Biol．29,885(1995);Herbers et al.，Plant Mol．Biol．29，1027(
1995);Mita et al.,Plant Physiol．107，895(1995)）。多様な植物種における
研究から、糖の恒常性は、緊密に調節されていると考えられることも示された。
糖濃度を上昇させると、生長阻害、光合成の低下、葉の巻き上がり、退緑、壊死
葉、およびアントシアニンの蓄積が起こる（キャスパー(Casper)ら、Plant Phys
iol．79，11(1985);フォン・シェウェン(von Shaewan)ら、EMBO J．9，3033(199
0);ディキンソン(Dickinson)ら、Plant Physiol．95，420(1991);ツヤマ(Tsuyam
a)ら、Plant Physiol．97，1414(1991);ゾンネヴァルト(Sonnewald)ら、Plant J
.1，95(1991);ヒュバレットとハンソン(Huberet and Hanson)、Plant Physiol．
99,1449(1992);ゾンネヴァルト(Sonnewald)ら、トランスジェニックタバコ植物
における、糖蓄積に対する植物の応答、246〜257頁、M．A．Madore（マドーレ）
、米国植物生理学会、メリーランド州ロックビル、W．J．Lucas（ルーカス）編
、「植物における炭素配分と炭素源の沈積の相互作用」（1995）より）。さらに
、CO2の上昇などの環境要因およびインベルターゼレベル
の違いなどの内因性的な遺伝子変異が、糖調節を通して、光合成能に影響を与え
ることが提示されている（スティット(Stitt)、Plant Cell Environ．14，741(1
991);スティット(Stitt)ら、Planta183，40(1991);バンオーステン(Van Oosten
ら、Plant Cell Environ．17，913(1994)；ニー(Nie)ら、Plant Physiol．108，
975(1995);ゴールドシュミットとフーバー(Goldschmit and Huber)、Plant Phys
iol．99，1443(1992)）。
発明の概要
植物のヘキソキナーゼ蛋白質（HXK）の発現を操作することによって、本発明
者らは、この蛋白質が、植物における多様な糖応答を媒介するセンサーであるこ
とを見出した。特に、本発明者らは、（a）アンチセンス・ヘキソキナーゼ遺伝
子の発現によって、ヘキソキナーゼ蛋白質の発現レベルを低下させ、それによっ
て糖に対して低い感受性を示すトランスジェニック植物、または（b）ヘキソキ
ナーゼ蛋白質の発現レベルを上昇させ、それによって糖に対して高い感受性を示
すトランスジェニック植物を作成した。本発明者らの所見は、作物の収量および
品質を向上させるためおよび生産費用を低減するために、農業用作物を操作する
ことに関して、広い意味をもつ。
一般的に、本発明は、トランスジェニック植物細胞（例えば、単子葉類、双子
葉類、または裸子植物に由来する細胞）の中でアンチセンス・ヘキソキナーゼの
塩基配列を発現させることを含む、トランスジェニック植物細胞における植物ヘ
キソキナーゼ蛋白質のレベルを低下させるための方法を特徴とする。これによっ
て、糖（例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、またはマンノース）
に対する感受性がより小さくなったトランスジェニック植物が作出される。
好ましい態様において、アンチセンス・ヘキソキナーゼの塩基配列は、トラン
スジェニック植物細胞のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子によってコードされ
ているが、このアンチセンス・ヘキソキナーゼ塩基配列は、植物のアンチセンス
・ヘキソキナーゼのDNA配列（例えば、図1F（配列番号：3）のAtHXK1の塩基配列
に基づく配列、または図1G（配列番号：4）のAtHXK2の塩基配列）を含み、また
この方法はさらに、トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物体
へと成長させることを含み、それによってトランスジェニック植物におけるヘキ
ソ
キナーゼ蛋白質のレベルが低下する。
関連する局面において、本発明は、アンチセンス・ヘキソキナーゼの塩基配列
を発現する植物細胞（例えば、単子葉類、双子葉類、または裸子植物由来の細胞
）と、発現調節領域に機能的に結合されたアンチセンス・ヘキソキナーゼ塩基配
列を含む植物の発現ベクターとを特徴とする。
さらに別の局面において、本発明は、トランスジェニック植物において、ヘキ
ソキナーゼの塩基配列を発現させることを含む、トランスジェニック植物細胞に
おけるヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを上昇させるための方法を特徴とする。好
ましい態様において、このヘキソキナーゼの塩基配列は植物に由来する（例えば
、図1F（配列番号：3）のAtHXK1の塩基配列と同一のDNA配列、または、図1G（配
列番号：4）のAtHXK2の塩基配列に実質的に同一のDNA配列）。この方法によって
、糖に対する感受性が上昇したトランスジェニック植物が作出される。
関連した局面において、本発明は、AtHXK1のアミノ酸配列（配列番号：1）、
またはAtHXK2のアミノ酸配列（配列番号：2）と実質的に同一なアミノ酸配列を
含む、実質的に純粋な植物HXKポリペプチドを特徴とする。これら二つの局面の
好ましい態様において、HXKポリペプチドは、単子葉植物（例えば、イネ、トウ
モロコシ、コムギ、またはオオムギ）、双子葉植物（例えば、ナス科の植物（例
えば、ジャガイモ）またはアブラナ科の植物（例えば、アラビドプシス（Arabid
opsis）、ブロッコリ、キャベツ、芽キャベツ、ナタネ、ケール、ハクサイ、カ
リフラワー、またはセイヨウワサビ））、および裸子植物を含むが、これらに限
定されない植物から得られる。
さらに別の関連する局面において、本発明は、AtHXK1（配列番号：1）またはA
tHXK2（配列番号：2）のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む植物
HXKポリペプチドをコードする、実質的に純粋なDNAを特徴とする。好ましい態様
において、このDNAは、図1F（配列番号：3）に示されている塩基配列を含むか、
または図1G（配列番号：4）に示されている配列と実質的に同一な塩基配列を含
む。このようなDNAは、単子葉植物（例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、ま
たはオオムギ）、双子葉植物（例えば、ナス科の植物（例えば、ジャガイモ）ま
たはアブラナ科の植物（例えば、アラビドプシス、ブロッコリ、キャベツ、芽キ
ャベ
ツ、ナタネ、ケール、ハクサイ、カリフラワー、またはセイヨウワサビ））、お
よび裸子植物を含むが、これらに限定されない植物から得られる。別の好ましい
態様において、本発明のDNAは、構成的プロモーターまたは調節的プロモーター
に機能的に結合されている。
さらに別の関連する局面において、本発明は、本発明に係る実質的に純粋なDN
Aのいずれかを含むベクターを特徴とし、このベクターは、それを含有する細胞
中でこのDNAによってコードされている蛋白質の発現を指向させることができる
。ここで、この細胞は、本発明のいずれかのDNAを含む、例えば、原核生物の細
胞（例えば、大腸菌細胞）、または真核生物の細胞（例えば、植物細胞）であり
、また、トランスジェニック植物（または、このようなトランスジェニック植物
から得られた細胞または種子）は、植物のゲノムに組み込まれた、トランスジェ
ニック植物の中で発現される、本発明のいずれかのDNAを含んでいる。
さまざまな好ましい態様において、植物細胞は、センス鎖方向にDNAを有する
と糖に対する感受性が上昇し、アンチセンス方向にDNAを有すると糖に対する感
受性が低下し、また、このDNAは、構成的なプロモーターまたは調節的なプロモ
ーターの制御下で発現される。
二つの別の局面において、本発明は、（a）細胞の中で発現されるように置か
れたAtHXK1のアミノ酸配列（配列番号：1）と実質的に同一なアミノ酸配列、ま
たはAtHXK2のアミノ酸配列（配列番号：2）と実質的に同一なアミノ酸配列のい
ずれかを含むポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された細胞を提供する
段階、（b）植物HXKポリペプチドを発現させる段階、および（c）植物HXKポリペ
プチドを回収する段階を含む、植物HXKポリペプチドを製造する方法を特徴とす
る。
「ヘキソキナーゼ」または「HXK」とは、ヘキソースのヘキソース-6-リン酸へ
のATP依存的な変換を触媒することができるポリペプチドを意味する。このよう
な酵素活性を測定するための方法は、例えば、本明細書において、レンツとステ
ィット（Renz andStitt）（Planta 190，166(1993)）によって説明されているよ
うに、当技術分野において既知である。
「植物ヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを低下させる」とは、対照用植物（例え
ば、野生型植物）におけるレベルと比較して、その植物ヘキソキナーゼ蛋白質の
レベルを、少なくとも30〜50％、好ましくは50〜80％、より好ましくは80〜95％
減少させることを意味する。ヘキソキナーゼ蛋白質レベルの低下は、トランスジ
ェニック植物におけるアンチセンス植物ヘキソキナーゼ塩基配列の発現によって
達成されうる。植物ヘキソキナーゼ蛋白質レベルを、免疫ブロッティング（例え
ば、本明細書で説明されているもの）を含むが、これに限定されない、いずれか
の標準的な技術によってモニターする。または、植物ヘキソキナーゼ蛋白質のレ
ベルを、標準的なヘキソースリン酸化アッセイ法（例えば、本明細書で説明され
ているもの）によって定量することができる。
「植物ヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを上昇させる」とは、対照用植物（例え
ば、野生型植物）におけるレベルと比較して、その植物ヘキソキナーゼ蛋白質の
レベルを、少なくとも50％、好ましくは100％、より好ましくは200％以上増加さ
せることを意味する。植物ヘキソキナーゼ蛋白質レベルを、免疫ブロッティング
（例えば、本明細書で説明されているもの）を含むが、これに限定されない、い
ずれかの標準的な技術によってモニターする。または、植物ヘキソキナーゼ蛋白
質のレベルを、標準的なヘキソースリン酸化アッセイ法（例えば、本明細書で説
明されているもの）によって定量することができる。
「アンチセンス・へキソキナーゼ配列」とは、植物ヘキソキナーゼのメッセン
ジャーRNAに相補的な塩基配列を意味する。一般的に、そのようなアンチセンス
配列は、通常、少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは約15〜200ヌクレオチド
、より好ましくは200〜2,000ヌクレオチドの長さである。アンチセンス配列は、
植物ヘキソキナーゼmRNA（例えば、本明細書において説明されているAtHXK1、お
よびAtHXK2のアンチセンス構築物）の塩基配列の全部または一部に対して相補的
であり、当業者には認識されているように、望ましい阻害の程度およびアンチセ
ンス配列の特異性によって、アンチセンス配列が結合する一つもしくは複数の特
定の部位およびアンチセンス配列の長さはさまざまに変化する。植物ヘキソキナ
ーゼのアンチセンス塩基配列を発現する転写用構築物には、転写の方向、プロモ
ーター、センス鎖上でアンチセンスRNAをコードしている配列、および転写終結
領域が含まれる。本明細書において説明されているようにして、または、例えば
ファンデルクロール（van der Krol）ら、Gene 72，45(1988);ロダメル（Roderm
el）
ら、FEBS Lett．268，427(1990);バイゲルとニルソン（Weigel and Nilsson、Na
ture 377，495(1995);シェウン（Cheung）ら、Cell 82，383(1995);および、米
国特許第5,107,065号）で説明されているようにして、アンチセンスHXK配列を構
築し発現させることができる。
「糖に対して、より感受性が低い」とは、典型的には、内部の糖濃度または外
部の糖濃度によって調節ないし制御される、発生的、生理的、または分子的なプ
ロセスが、糖（例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、またはスクロ
ース）の出現に対して、低下した応答を示すことを意味する。例えば、糖に対す
る感受性が低下した植物は、通常は、糖があると抑制される一群の遺伝子（例え
ば、光合成遺伝子）を活性化することができるか、または、このような植物以外
では、正常な発達が妨害または阻害されるような糖濃度の中でも、正常な成長を
続けることができる。さまざまなバイオアッセイ法（例えば、本明細書において
説明されているもの）を用いて、糖に対する植物の感受性の解析を行う。これら
のアッセイ法には、遺伝子発現、発芽、子葉の成長（例えば、子葉の伸長）、子
葉の緑化、葉の成長、胚根の発達、胚軸の伸長、アントシアニンの蓄積、デンプ
ンの蓄積、および開花までに要する時間を評価したりモニターすることが含まれ
るが、これらに限定はされない。野生型植物と候補植物（例えば、アンチセンス
・ヘキソキナーゼ遺伝子を発現する植物）の表現型を比較して、このような候補
トランスジェニック植物が、糖に対する感受性を低下させたか否かを、簡単に判
定することができる。例えば、糖は、光合成遺伝子（例えば、リブロースビスホ
スフェートカルボキシラーゼの小サブユニット、および集光性クロロフィルa/b
結合蛋白質）、および非光合成遺伝子（例えば、α-アミラーゼ、スクロースシ
ンターゼ、リンゴ酸シンターゼ、およびアスパラギン酸シンターゼ）の両方の発
現を抑制することが分かっている。したがって、糖に対する感受性がより低い植
物においては、糖で抑制されうる上記の遺伝子は、糖が媒介する抑制のレベルを
減少、低下、または減衰させる。
「上昇した感受性」とは、典型的には、内部の糖濃度または外部の糖濃度によ
って調節ないし制御される、発生的、生理的、または分子的なプロセスが、糖（
例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、またはスクロース）の出現に
対して、増加または上昇した応答を示すことを意味する。例えば、糖に対する感
受性が増加した植物は、通常は、糖があると活性化される一群の遺伝子（例えば
、栄養貯蔵蛋白質）の活性化を上昇、高揚または促進することができる。さまざ
まなバイオアッセイ法を用いて、糖に対する植物の感受性の解析を行う。これら
のアッセイ法には、遺伝子発現、発芽、子葉の成長（例えば、子葉の伸長）、子
葉の緑化、葉の成長、胚根の発達、胚軸の伸長、アントシアニンの蓄積、デンプ
ンの蓄積、および開花までに要する時間を評価したりモニターすることが含まれ
るが、これらに限定はされない。野生型植物と候補植物（例えば、ヘキソキナー
ゼ遺伝子の少なくとも一つの別のコピーを発現させる植物）の表現型を比較して
、このような候補トランスジェニック植物が、糖に対する感受性を上昇させたか
否かを、簡単に判定することができる。例えば、糖は、硝酸レダクターゼ、β-
アミラーゼ、スクロースシンターゼ、およびジャガイモの貯蔵蛋白質などの遺伝
子の発現を活性化させることが分かっている。したがって、糖に対して上昇した
感受性を示す植物では、前記の糖によって誘導される遺伝子が、糖によって媒介
される発現レベルを増加、上昇、または高揚させる。
「ポリペプチド」または「蛋白質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グ
リコシル化またはリン酸化）とは関係なしに、あらゆるアミノ酸の鎖を意味する
。
「AtHXK1に実質的に同一」とは、AtHXK1のN末端（図1Bのアミノ酸1〜61；配列
番号：1）と、少なくとも50％、好ましくは75％、より好ましくは85〜90％、最
も好ましくは95％一致するN末端を含む植物ヘキソキナーゼのポリペプチドを意
味する。比較する長さは、一般的には、少なくとも15アミノ酸、好ましくは少な
くとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも40アミノ酸、そして、最も好まし
くは60アミノ酸である。
「AtHXK2に実質的に同一」とは、AtHXK2のアミノ酸または塩基配列（図1Bおよ
び1G；配列番号：2および4）と、少なくとも86％、好ましくは90％、より好まし
くは95％、最も好ましくは99％の一致率を示す、植物ヘキソキナーゼのポリペプ
チドまたは塩基配列を意味する。
配列の同一性は、典型的には、配列解析用ソフトウェア（例えば、ジェネティ
クス・コンピュータ・グループ（Genetics Computer Group）の配列解析用ソフ
トウェア・パッケージ（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ウィ
スコンシン州53705、マディソン、ユニバーシティー通り1710）、BLAST、または
、PILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェア
は、さまざまな置換、欠失、置換、およびその他の修飾に対する相同性の程度を
指定して、類似する配列の比較を行なう。保存的な置換としては、典型的には、
以下のグループ内の置換が含まれる。すなわち、グリシン、アラニン；バリン、
イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；および、フェニルアラニン
、チロシン。
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自然の状態で付随している成分から分
離された、植物ヘキソキナーゼのポリペプチド（例えば、AtHXK1またはAtHXK2）
を意味する。典型的には、このポリペプチドが、重量で少なくとも60％、自然の
状態では結合している蛋白質および天然の有機分子を含まないとき、このポリペ
プチドは実質的に純粋である。好ましくは、この調製物は、少なくとも重量で75
％、より好ましくは少なくとも90％、および、最も好ましくは少なくとも99％が
、植物ヘキソキナーゼのポリペプチドである。実質的に純粋な植物ヘキソキナー
ゼのポリペプチドは、例えば、天然の供給源（例えば、植物細胞）から抽出する
ことによって、植物ヘキソキナーゼのポリペプチドをコードする組換え核酸を発
現させることによって、または、蛋白質を化学的に合成することによって得られ
る。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、またはHPLC分析などの適当な方法で測定することができる。
「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する生物の天然のゲノム中の
隣接する遺伝子から切り離されたDNAを意味する。したがって、この用語には、
例えば、ベクターの中、自律複製プラスミドもしくはウイルスの中、または原核
生物もしくは真核生物のゲノムDNAの中に組み込まれた組換えDNA、または、別個
の分子（例えば、PCRまたは制限酵素エンドヌクレアーゼ分解によって作出され
たcDNAまたは、ゲノムもしくはcDNAの断片）として、他の配列とは独立して存在
している組換えDNAが含まれる。別のポリペプチド配列をコードするハイブリッ
ド遺伝
子の一部である組換えDNAも含まれる。
「形質転換された細胞」とは、組換えDNA技術によって、その中に、（本明細
書において用いられるときは）HXKポリペプチド（例えば、AtHXK1またはAtHXK2
）をコードするDNA分子が導入されている細胞（またはその祖先に導入されてい
る細胞）を意味する。
「発現のために配置された」とは、配列の転写および翻訳を指令する（すなわ
ち、例えば、AtHXK1またはAtHXK2などの植物ヘキソキナーゼのポリペプチド、組
換え蛋白質、またはRNA分子の産生を促進する）DNA配列に隣接して配置されたDN
A分子を意味する。
「プロモーター」とは、転写を指令するのに十分な最小限の配列を意味する。
細胞特異的、組織特異的、または器官特異的な遺伝子発現を制御することのでき
る、プロモーター依存的な遺伝子発現をもたらすのに十分なプロモーター因子、
または外来のシグナルもしくは因子（例えば、光、病原体、傷害、またはホルモ
ンによって誘導される因子）によって誘導することができる因子が本発明に含ま
れるが、これらの因子は、本来の遺伝子の5'側か3'側の領域に位置している。
「機能的に結合された」とは、適当な分子（例えば、転写活性化蛋白質）が、
調節配列に結合した場合に遺伝子発現が可能になるような様式で遺伝子と制御配
列とが連結されていることを意味する。
「植物細胞」とは、プラスチドを有する、半透膜に結合された自己増殖する細
胞を意味する。さらに増殖させることが望ましければ、このような細胞には、細
胞壁が必要である。本明細書において用いられる場合、植物細胞には、藻類、シ
アノバクテリア、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、
茎、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子などが、無制約に含まれる。
「導入遺伝子」とは、人工的に細胞に挿入され、その細胞から発生する生物の
ゲノムの一部となったDNAの片を意味する。このような導入遺伝子は、部分的に
もしくは完全に、トランスジェニック生物とは異種性の（すなわち、外来の）遺
伝子を含んでいてもよく、または、その生物の内因性遺伝子と相同な遺伝子を表
していてもよい。
「トランスジェニック」とは、人工的に細胞中に挿入され、その細胞から発生
する生物のゲノムの一部になったDNA配列を含む細胞を意味する。本明細書にお
いて用いられるとき、トランスジェニック生物は、一般的にトランスジェニック
植物であり、DNA（導入遺伝子）が、人工的に核またはプラスチドゲノムの中に
挿入されている。
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の説明および請求の範囲
から明らかになると思われる。
詳細な説明
まず、図面について説明する。図面
図1A〜Eは、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のHXK遺伝子
の分子的な特徴のさまざまな局面を示す図である。図1Aは、A.タリアナ（A．tha
liana）のHXK相同体であるAtHXK1とAtHXK2をもつ、酵母のhxk1/hxs2二重変異体
（DBY2219と名付けらている）を用いた、機能的に相補するHXKの触媒活性を示し
ている。これらの相補実験で用いられた対照用ベクターとして、pFL61が示され
ている。図1Bは、A.タリアナ（A．thaliana）のヘキソキナーゼAtHXK2（配列番
号：2）、ヒトGLK（配列番号：5）、ラットGLK（配列番号：6）、サッカロマイ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）HXK1（酵母1）（配列番号：7）
、S．セレビシエ（S．cerevisiae）HXK2（酵母2）（配列番号：8）、およびクル
エベロマイセス・ラクチス（Kluveromyces lactis）RAG5（酵母3）（配列番号：
9）のアミノ酸配列比較を示す概略図である。下線部1と2は、保存されているリ
ン酸1および2の領域を示しており、点線の下線部は、アデノシン相互作用領域を
表している。アステリスクで下線を引いたアミノ酸は、糖結合ドメインを表して
いる。配列比較を、標準的なパラメータに設定して、PILEUP/PRETTYBOXプログラ
ムを用いて実行した。一致する残基と類似する残基を、それぞれ、四角で囲むか
、強調して表されている。図1Cは、アラビドプシスの染色体IVとII上の、AtHXK1
およびAtHXK2のマップ上の位置を示す概略図である。図1Dは、AtHXKがマルチジ
ーンファミリーによってコードされていることを示すDNAブロット解析の写真で
ある。このブロットは、AtHXK1（AtHXK1と名付けられ、左側に示されている）、
およびAtHXK2（AtHXK2と名付けられ、右側に示されている）の完全長のcDNAプロ
ーブによってハイ
ブリダイゼーションが行われた。ブロットの左に示されている数字は、キロベー
ス単位の分子量マーカーを表している。図1Eは、HindIIIで消化し、ゲル電気泳
動で分画し、ナイロン膜上に移し、低ストリンジェンシー条件下で、AtHXKの完
全長のcDNAプローブによってハイブリダイゼーションを行なった、A.タリアナ（
A．thaliana）のゲノムDNAのブロット解析の写真である。図1Fは、AtHXK1（配列
番号：3）の塩基配列を示す図である。図1Gは、AtHxK2（配列番号：4）の塩基配
列を示す図である。
図2A〜Bは、アラビドプシスにおけるHXKの発現を示す、一連の図である。図2A
は、葉（ロゼットと茎生の葉）、茎、花、長角果、および根の組織における、At
HXK1とAtHXK2の発現を示す、RNAブロットの写真である。図2Bは、AtHXK1とAtHXK
2の発現が、光と糖によって誘導されることを示す、RNAブロットの写真である。
図3A〜Fは、HXKが、植物における糖センサーであることの実例を示す、アラビ
ドプシスの芽のカラー写真である。図3Aは、6％グルコースを含む1/2MS培地上で
発芽させ、センス-AtHXK1（左）またはアンチ-AtHXK1（中央）構築物のいずれか
が発現を上昇させた、トランスジェニックアラビドプシスの芽の写真である。野
生型（対照）植物が、右側に示されている。図3Bは、0.8mM 2-dGlcを含む1/2MS
培地上で発芽させ、センス-AtHXK1（左）、またはアンチ-AtHXK1（中央）構築物
のいずれかが発現を上昇させた、トランスジェニックアラビドプシスの芽の写真
である。野生型（対照）植物が、右側に示されている。図3Cは、6％グルコース
を含む1/2MS培地上で発芽させた、センス-AtHXK1（左）、およびアンチ-AtHXK1
（中央）植物のT3ホモ接合集団を示す写真である。図3Dは、0.8mM 2-dGlcを含む
1/2MS培地上で発芽させた、センス-AtHXK1（左）、およびアンチ-AtHXK1（中央
）植物のT3ホモ接合集団を示す写真である。図3Eは、6％マンニトールを含む1/2
MS培地上で発芽させた、センス-AtHXK1（左）、アンチ-AtHXK1（中央）、および
対照（右）植物を示す写真である。図3Fは、6％3-MeGlcを含む1/2MS培地上で発
芽させた、センス-AtHXK1（左）、アンチ-AtHXK1（中央）、および対照（右）植
物を示す写真である。
図4A〜Cは、AtHXKが、芽の成長と発達に対する糖の効果を仲介することを示す
、一連のカラー写真である。さまざまなグルコース濃度（グルコース濃度（Glc
％
）2、3、4、5、または6％の増加として示されている）をもつ培地上で、暗黒下で6
日間、その後12時間照明して、芽を成長させた。図4Aは、野生（対照）植物にお
いて、子葉の緑化だけでなく、胚軸の伸長と展開も、グルコース濃度を上昇させ
るにつれて阻害されることを示す写真である。図4Bは、芽の発達に対する強力な
阻害効果で示されているように、グルコースに対して過敏感なセンス-AtHXK1植
物の写真である。図4Cは、野生型植物に較べると、芽の発達に与える阻害効果が
低下していることで示されているように、グルコースに対する感受性が、より少
ないアンチ-AtHXK1植物の写真である。
図5A〜Fは、対照用植物、センス植物、およびアンチセンス植物における、さ
まざまな遺伝子の発現を示す、一連の図である。図5Aは、6％グルコースを含む1
/2MS培地上で発芽させた、黄化芽を照明したものを用いた、RNAブロット解析の
写真である。UBQ発現を対照としてモニターした。図5Bは、外部からの糖なして
増殖させた、光の下で育てた緑色植物（明）から、および、暗黒に3日間適応さ
せ、その後、4時間照明した、光の下で育てた緑色植物（暗）から調製したRNAの
RNAブロット解析の写真である。図5Cは、トランスジェニック植物における、セ
ンス、およびアンチセンス構築物の発現を示す、いくつかのRNAブロットの写真
である。RNAは、6％グルコースを含む1/2MS培地上で育てた黄化芽から抽出した
。遺伝子、および鎖特異的なプローブを用いて、センス-AtHXK1（センス-1）、
センス-AtHXK2（センス-2）、アンチセンス-AtHXK1（アンチ-1）、およびアンチ
センス-AtHXK2（アンチ-2）の転写産物を明らかにした。センス-AtHXK1（センス
-1）の発現を示すブロットは、他のブロットよりも長い時間露光した。野生型植
物を対照として用いた。図5Dは、AtHxK1の発現を示す、蛋白質のブロット解析の
写真である。センス-AtHXK1植物は、AtHxK1発現の上昇を示し、アンチ-AtHXK1植
物は低下を示した。野生型植物を対照として用いた。図5Eは、黄化芽における、
ヘキソースの全リン酸化活性を示す棒グラフである。図5Fは、照明下で栽培した
植物の、ヘキソースの全リン酸化活性を示す棒グラフである。誤差バーは、標準
偏差を示す。
図6A〜Cは、糖シグナルが、糖代謝と共役していないことを示す一連の図であ
る。図6Aに示されているのは、2-dGlc/ラフィノース培地上では、野生型系統の
生長は阻害される（左）が、二重変異体hxk1/hxk2では阻害されないことを明ら
かにし
ている写真である。hxk1/hxk2系統で、AtHXK1またはAtHXK2のどちらの発現を上
昇させても、ベクター（pLF6）のみで形質転換された二重変異体（右）と同様の
、2-dGlc/ラフィノース培地上での、これらの系統に関する生長のレベルによっ
て示されているように、グルコース抑制を回復することはなかった。図6Bは、6
％グルコースを含む1/2MS培地上で7日間育てたトランスジェニックアラビドプシ
スの芽の中で、発現を上昇させた酵母HXK2（すなわち、YHXK2植物）の、優性な
干渉効果を示すカラー写真である。図6Cは、黄化もしくは緑化したYHXK2、セン
ス-AtHXKおよび対照用植物における、ヘキソースの全リン酸化活性を示す棒グラ
フである。誤差バーは、標準偏差を示す。
この後、本発明において有用な、2つのアラビドプシスHXKをコードするcDNAの
クローニングおよび特徴、ならびにそれらが糖代謝を調節する能力の特徴につい
て説明している。これらの実施例は、本発明を具体的に説明する目的で提供され
るものであり、本発明を制約するものと解すべきではない。アラビドプシスのHXK遺伝子の分子的な特徴
糖センサーとしてのHXKの役割を明らかにするために、酵母、サッカロマイセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の、HXK活性を欠失した系統であ
る（マとボットスタイン（Ma and Botstein）、Mol．Cell．Biol．6，4046(1986
)）、hxk1/hxs2二重変異体（DBY2219と名付けらている）を用いた機能的な相補
性によって、アラビドプシスのHXK遺伝子をクローニングした。この方法を用い
て、本発明者らは、２つのcDNAを同定し、AtHXK1（図1F；配列番号：3、GenBank
登録番号U28214）、およびAtHXK2（図1G；配列番号：4、GenBank登録番号U28215
）と名付けた。これらのcDNAは、それぞれ、2.0および1.9kbの長さであるが、ど
ちらも、酵母の二重変異体を、再現性をもって相補し、炭素源としてフルクトー
スのみを含む選択培地上で増殖できることが分かった。具体的な結果が、図1Aに
示されている。すなわち、AtHXK1またはAtHXK2のいずれかのcDNAで形質転換され
た変異酵母細胞は、選択培地上で増殖することができるが、このことは、これら
の遺伝子が、二重突然変異を相補したことを示している。これに対し、プラスミ
ドベクターPFL6のみで形質転換した変異体は、同じ選択培地上で増殖することが
できなかった（図1A）（ミネット（Minet）ら、Plant J．2，417(1992)）。
AtHXK1（図1F、配列番号：3）とAtHXK2（図1F、配列番号：4）のDNA配列の解
析から、それぞれ、496および502アミノ酸からなるオープンリーディングフレー
ムが推定された（図1B）。これらの遺伝子は、82％塩基配列が一致し、また、85
％アミノ酸が一致していることが判明した。さらに、データベース検索および配
列比較によって、これらのAtHXKが、ヒトおよびラットのGLKと、配列が34〜35％
一致し（ニシ（Nishi）ら、Diabetologia35，743(1989);マグヌソン（Magunuson
）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．86，4838(1989)）、いくつかの酵母HX
Kと36〜38％の範囲で配列が一致する（スタチェレク（Stachelek）ら、Nucl．Ac
ids Res．14，945(1986);プライアー（Prior）ら、Mol．Cell．Biol．13，3882(
1993)）ことが明らかになった。AtHXK遺伝子からの推定アミノ酸配列において、
ATP結合ドメインおよび糖結合ドメインも同定された。図1Bに示されているよう
に、ATP結合に関係する3つのドメインが同定された（ボーク（Bork）ら、Protei
n Sci．2，31 81993)）。また、図1Bには、哺乳動物のGLKに見られるグルコース
結合部位に類似する糖結合ドメインが示されている（ボーク（Bork）ら、Protei
n Sci．2，31 81993)）。一般的に、本発明者らが行なった配列比較によって、
アラビドプシスのHXKの全体的な配列および構造は、咄乳動物のGLKおよび酵母の
HXKの全体的な配列と構造に類似しているが、植物のフルクトキナーゼの全体的
な配列と構造とは異なっている（スミス（Smith）ら、Plant Physiol．102，104
3(1993)）ことが明らかになった。
本発明者らは、次に、組換え近交系統における、制限酵素断片長多型（RFLP）
の標準的な分離解析によって、AtHXK1遺伝子とAtHXK2遺伝子の染色体上の位置を
決定した（ナム（Nam）ら、Plant Cell 1，699(1989);リスターとディーン（Lis
ter and Dean，Plant J．4，745(1993);Haugeら、Plant J．3，745(1993);Schmi
dtら、Science 270，489(1995);Zachgoら、Genomic Res．6，19(1996)）。この
解析によって、本発明者らは、AtHXK1が4番染色体上にあり、染色体マーカーmi2
32とg8300に隣接していること（図1C）を見出し、AtHXK2が2番染色体上にあり、
染色体マーカーmi148とmi238に隣接していること（図1C）を見出した。
ゲノムDNA（サザン）ブロット解析によって、AtHXK遺伝子のコピー数が決定さ
れた。標準的な方法によって、A.タリアナ（A．thaliana）からゲノムDNAを調製
し（Landsberg er）、BgIII、EcoRI、HindIII、またはXbaIで制限酵素消化し、
ゲル電気泳動によって分画し、ナイロン膜上に移動させてから、AtHXK1またはAt
HXK2のいずれかの全長cDNAのランダムプライマーにより作製されたプローブを用
いてハイブリダイズさせた（Ausubelら、後記）。ゲノムDNAブロット解析によっ
て、AtHXK1は、2つのAtHXK遺伝子（図1D、AtHXK1と名付けられたブロット）と一
致する2つのDNA断片と、高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることが
明らかとなった。さらに、同じハイブリダイゼーション条件の下で、AtHXK2をプ
ローブとして用いると、同じブロット上に、もう一つ別の断片が、少なくとも一
つ見えた（図1D、AtHXK2と名付けられたブロット）。これと同じ方法を用いて、
第三のcDNA（AtHXK3）も同定され、３個の相同的なHXK遺伝子がアラビドプシス
に存在するという仮説が、さらに裏付けられた。低ストリンジェンシー条件では
、非常に多数の付加的なバンドも検出され、３つ以上の遺伝子が、AtHXK1と配列
の類似性を有することが示唆された（図1E）。AtHXK 遺伝子の発現
AtHXK遺伝子の発現を調べるために、以下のようにして、RNAブロット解析を行
なった。標準的な方法にしたがって、ロゼッタ葉、茎生葉、茎、花、長角果、お
よび根からRNAを抽出した。抽出したRNAをゲル分画して、ナイロン膜に移動させ
た（例えば、Ausubelら、後記で、説明されているとおり）。次に、標準的な技
術によって、AtHXK1、AtHXK2、またはユビキチン（UBQ）のプローブ（Greenberg
ら、Cell 77，551(1994)）を用いて、ブロットをハイブリダイズさせた。これら
の実験では、UBQプローブが対照として用いた。各レーンに等量のRNAを流した。
RNAブロット解析によって、AtHXK1とAtHXK2のプローブが、長さ約2kbのRNAバ
ンドを検出することが示された。図2Aで示されているように、AtHXK1とAtHXK2、
いずれの転写レベルも、長角果で最大、花とロゼット葉では中位、そして、茎と
茎生葉で最も低かった。根では、AtHXK1の発現がAtHXK2よりも強かった。AtHXK1
とAtHXK2の発現レベルが多様に変化するのは、例えば、ロゼット葉のような供給
用組織（例えば、糖を供給する組織）における光合成、ならびに、長角果および
花などの沈積用組織（例えば、糖を受容する組織）における糖代謝のフィードバ
ック調節のように、それらの生理学的な役割が多様であることを表している。
光合成によって糖を産生するためには光が必要であるため、本発明者らは、At
HXK遺伝子の発現に対する光の影響を調べた。野生型植物を暗黒下で生育させた
黄化植物体と、照明下で育て暗黒に適応させた植物体に、照明を当てたものと当
てないもの（図2Bで、それぞれ、暗と明と名付けられている）とから調製した全
RNAを用いて、上記に従って、RNAブロット解析を行った。特に、暗黒下で生育さ
せた黄化芽は、6％グルコースを含むかまたはそれを含まない、1/2ムラシゲおよ
びスクーグの（Murashige and Skoog）（MS）培地上で発芽させ、生育させた（
図2Bで、それぞれ、-糖および+糖と名付けられている）。暗黒下で6日間生育さ
せた植物に、その後4時間、白色光（120μEm-2S-1）を当てた。照明下で育て暗
黒に適応させた植物には、15日齢の照明下で栽培した植物を3日間暗黒に適応さ
せ、そのまま暗黒下に置いたもの、照明を当てたもの、さらに、3％グルコース
を流したもの（図2Bで、明+糖と名付けられている）とが含まれる。栽培条件は
、チェン（Cheng）らによって説明されたところ（Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.
A．89，1861(1992)）にしたがった。
図2Bに示されているように、光合成をしない黄化芽で、たとえ、4時間光を当
てた後でも、AtHXK1およびAtHXK2が両方とも非常に低いレベルで発現されている
ことが判明した。しかし、これらの発現は、外部から糖を加えることによって誘
導された。AtHXK1およびAtHXK2の転写レベルはともに、暗黒に適応させた緑色植
物では低かったが、光を当てると有意に誘導され、また、糖を与えると、さらに
促進された（図2B）。UBQ遺伝子の発現は、光と糖の両方によって影響されるこ
とが分かった。これらの結果によって、AtHXK発現が、糖の感知と代謝が必要と
される条件に結びついていることが明らかになったが、このことは、植物の糖の
定常性が、自律調節的なメカニズムを通して、AtHXKレベルによって調節される
ことを示している。植物における糖センサーとしてのAtHXK
天然の植物においてAtHXKが糖センサーとして作用するという仮説を調べるた
めに、AtHXKのレベルを変更するセンス鎖およびアンチセンス鎖の遺伝子を導入
して、トランスジェニック植物を構築した。標準的なアグロバクテリウム（Agro
bacterium）による根の形質転換プロトコール（Czako et al.，Mol．Gen．Genet
．23
5，33(1992)）を用いて、CaMV35Sプロモーターと、センス鎖AtHXK1（センス-AtH
XK1）、センス鎖AtHXK2（センス-AtHXK2）、アンチセンス鎖AtHXK1（アンチ-AtH
XK1）、またはアンチセンス鎖AtHXK2（アンチ-AtHXK2）とを融合させた遺伝子を
有するバイナリーベクターによって、野生型（ベンシャイム（Bensheim））アラ
ビドプシス（Arabidopsis）の植物体を形質転換させた。NPTIIの発現と、その結
果できるカナマイシン抵抗性、およびDNAブロット解析によって、導入遺伝子の
存在を判定した。さらに解析を行うため、センス鎖導入遺伝子またはアンチセン
ス鎖導入遺伝子に関してホモ接合である、T3世代のトランスジェニック系統をい
くつか選抜した。
6％グルコースまたは0.8mMの代謝不可能なグルコース類似化合物である2-デオ
キシグルコース（2-dGlc）を用いたバイオアッセイを行って、トランスジェニッ
ク植物の糖感受性を調べた。6％グルコース培地では、定常光下で栽培された対
照（野生型）アラビドプシスの実生で、子葉の伸長と展開、本葉の出現、および
胚軸と根の伸長とが抑制された（図3A、右）。グルコースが原因で起きるこれら
の阻害効果が、ベンシャイム（Bensheim）（BE）、C24、コロンビア（Columbia
）（Col）、ランズバーグ・エレクタ（Ler）、RLD、およびワシリースカヤ（Was
silewskiija）（WS）を含む、6種の異なるアラビドプシスの生態型で観察された
（データは示されていない）。さらに、対照用植物では、低い2-dGlc濃度で子葉
の緑化が阻害されることが分かった（図3B）。この表現型は、2-dGlcが、光合成
蛋白質をコードする遺伝子の全体的な抑制を開始させる強力な糖シグナルとして
作用しうるという知見と合致している。
対照用植物と比較すると、センス-AtHXK1植物は、子葉、胚軸、および根の発
育が阻害されることで示されているように、6％グルコースに対して過感受性を
示した（図3A、左）。これに対して、アンチ-AtHXK1植物は、緑色になって、正
常に伸長し（図3A、中央）、それらが、糖に対して、より感受性が低いことを示
していた。図3Cは、T3トランスジェニック植物の集団では、糖過感受性と非感受
性とが均一に示されることを図示している。グルコースアッセイにおけると同じ
ように、センス-AtHXK1植物は、子葉の緑化が重度に阻害されることで示されて
いるように、2-dGlcに対して過感受性である（図3B、左；図3D、左）。センス-A
tHXK1植物
は、糖に対する感受性がより低く、2-dGlcの存在下で発芽させたときも緑色に見
えた（図3B、中央；図3D、中央）。
表1（下記）に示したように、AtHXK1またはAtHXK2の、センス鎖、アンチセン
ス鎖のいずれから作出された、複数の独立のトランスジェニック系統においても
、同じような表現型が観察された。表1に示されたスコアをつけた表現型は、光
を当てて育てた、7日目の実生で、6％グルコースまたは0.8mMの2-dGlcを含む1/2
MS培地上で発芽させたものの調査に基づいて判定された。糖非感受性（Ins）の
、過感受性（Hyp）の、および不明瞭（A）な表現型にスコアを付けて、表にした
。この解析結果は、表1（下記）に示されている。
表1
T3ホモ接合トランスジェニック植物における糖感受性
*糖非感受性は、同時抑制によって生じると考えられている。
トランスジェニック植物と対照用植物との間の糖感知における差異が、浸透圧
作用によるものだという可能性を排除するために、対照実験で、マンニトールと
3-O-メチルグルコース（3-MeGlc）を用いた。6％マンニトール培地（図3E）で培
養しても、HXKによってリン酸化されないグルコース類似化合物である6％の3-Me
Glcの培地（図3F）で培養しても、対照用植物とトランスジェニック植物との間
に、明らかな差異は見られなかった。まとめると、マンニトールも3-MeGlcも、
グルコースに置き変わること、およびAtHXKと相互作用することができなかった
ため、これらの結果から、トランスジェニック植物における糖の感知が特異的な
ものであることが示された。AtHXK は、植物の生長および発達に対する糖の作用を媒介する
本発明者らは、次に、野生型植物およびトランスジェニック植物における、胚
軸と子葉の発達に対する糖の効果を比較した。これらの実験のために、アラビド
プシスの実生を、2〜6％のグルコースを含む培地上で6日間暗黒下で生育させた
。胚軸の伸長は、暗黒下の方が起こりやすいので、糖によってもたらされる阻害
効果を、眼で見て評価することができた。光によって、子葉の展開と緑化が起こ
るため、暗黒下で栽培したこれらの実生に光を12時間当てて、子葉の展開に対す
る糖の効果を判定した。本発明者らの結果は、図4に示されている。
特に、対照用植物においては、胚軸の長さは、グルコース濃度に反比例した（
図4A）。同様の生育条件で3〜6％のグルコースの存在下で生育させると、胚軸の
長さが短くなることによって明らかになるように、センス-AtHXK植物は、糖に対
して過感受性であった（図4B）。これに対して、アンチ-AtHXK植物は、5または6
％のグルコースの存在下でも、伸長することができた（図4C）。2％未満のグル
コース濃度では、他の養分が存在すれば、実生の生長が促進された（データは示
されていない）が、2％よりも高いグルコース濃度で、胚軸の生長が阻害された
のは、AtHXKによって媒介される糖感知によるものであった。
光とは対照的に、グルコース（4〜6％で）は、対照用植物における子葉の緑化
と展開を抑制した（図4A）。センス-AtHXK植物において、黄化子葉で示されてい
るように、この障害は、より大きかった（図4B）。しかし、アンチ-AtHXK植物は
、あらゆるグルコース濃度に対して感受性がより低く、正常に緑化する（図4C）
ことが判明した。糖による子葉の発達阻害は、糖が外部に豊富に存在するときに
は、子葉の展開と緑化に必要な成長を、自主栄養成長から従属栄養成長に切り換
える能力が植物にあることにより説明される。本発明者らはまた、暗黒下で生育
させた対照、およびアンチセンスの実生の根においては、糖による阻害がないこ
とも観察した（図1Aと図4C）。これは、センス植物では異所的なAtHXK発現によ
り、グルコース依存的な根の発育阻害が生じたため、暗黒下の根では、AtHXK発
現が低い結果であると考えられる（図4B）。これらの結果から、AtHXKの発現に
差異があるため、異なる組織においては異なる糖応答が起こりうることが示され
た（図2）。AtHXK は、糖による抑制と遺伝子発現の活性化を媒介する
HXKが、糖による遺伝子発現調節に関与しているか否かを決定するために、本
発
明者らは、糖によって抑制されうる2つの遺伝子である、集光性クロロフィルa/b
結合蛋白質（CAB1）とリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユ
ニット（RBCS）、および、糖によって誘導されうる遺伝子である硝酸レダクター
ゼ（NR1）遺伝子の発現レベルを、対照、センス-AtHXK、およびアンチ-AtHXK植
物の間で比較した（Sheen，Photosynthesis Res．39，427(1994);Chengら、Proc
．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89，1861(1992)）。
本発明者らは、まず、上記のような、6％グルコース上で生育させた、暗黒下
栽培の黄化芽を照明したものを調べた。アラビドプシス由来の、1.1kbのCAB1、0
.5kbのRBCS、および3.2kbのNR1のプローブを用いて、これも上述されているよう
にしてRNAブロット解析を行った。
CAB1およびRBCSの転写レベルは、対照用植物では低く、糖過感受性を示すセン
ス-AtHXK1およびセンス-AtHXK2植物では、いずれもほとんどなかった（図5A）。
これに対して、糖感受性を示す両アンチ-AtHXK植物では、この2つの遺伝子とも
、高レベルで発現していた。センス鎖のトランスジェニック植物が、糖に対して
過感受性であるという考えと矛盾なく、センス-AtHXK1およびセンス-AtHXK2植物
ではNR1が活性化されたが、アンチ-AtHXK植物と対照用植物とでは活性化されな
かった（図5A）。まとめると、これらのデータから、高等植物では、AtHXKが、
糖によって抑制される遺伝子発現および糖によって誘導される遺伝子発現の両方
のセンサーであることが示された。さらに、CAB1とRBCSの転写レベルは、糖の非
存在下で生育させたセンス-AtHXK1植物と対照用植物では同程度であった（デー
タは示されていない）が、このことは、AtHXKによる糖の検知が特異的なもので
あることを示しており、また、外来の糖が、照明された黄化芽における少なくと
も一つのシグナルであることを示している。
生理的条件下で、AtHXKによって調節される遺伝子発現を明らかにするために
、本発明者らは、（上記のように）外から糖を与えることなく、照明下で生育さ
せた植物におけるCAB1とRBCSの発現を調べた。これらの実験の結果、両方の遺伝
子とも、転写レベルが、アンチ-AtHXKおよび対照用植物におけるよりも、ほぼ5
倍低いことが判明した（図5B）。このような発現の違いは、どちらの遺伝子も、
トランスジェニック植物および対照用植物において、暗黒下で均一な発現低下を
示し
たことから、AtHXKの発現増加によって媒介される内因性の糖による光誘導性の
抑制が起こったためであると考えられる（図5B）（AtHXK2に関しては、データは
示されていない）。トランスジェニック植物におけるAtHXK発現の変化
トランスジェニック植物で観察された糖過感受性または糖非感受性が、導入遺
伝子の発現と相関していることを確かめるために、以下のようにして、RNAおよ
び蛋白質のブロット解析を行なった。RNAブロット解析は、トランスジェニック
植物中で発現されたセンス鎖構築物およびアンチセンス鎖構築物に対して、遺伝
子およびDNA鎖特異的なプローブを用いて行った。プローブは、グリーンバーグ
によって説明されている（Cell 77，551(1994)）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
法を用いて合成した。PCRプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドは、AtHXK
1（配列番号：3）とAtHXK2（配列番号:4）から設計し、それぞれのcDNA断片を増
幅するために用いた。センス鎖側プライマーは、AtHXK1およびAtHXK2それぞれに
ついて、5'-ATGGGTAAAGTAGCTGTT-3'（配列番号：10）および5'-ATGGGTAAAGTGGCA
GTTGCAA-3'（配列番号：11）であった。アンチセンス鎖側プライマーは、AtHXK1
およびAtHXK2それぞれについて、5'-TTAAGAGTCTTCAAGGTAGAG-3'（配列番号：12
）および5'-TTAACTTGTTTCAGAGTCATCTTC-3'（配列番号：13）であった。AtHXK1ま
たはAtHXK2の全長cDNAを含むプラスミド（登録商標ピー・ブルースクリプトKS-
）（pBluescriptTMKS-）をPCR反応用の鋳型に用いた。6％グルコース培地上で生
育させた黄化芽を照明したものからRNAを抽出し、ゲル分画し、ナイロン膜にブ
ロットして、上記の各プローブとハイブリダイズさせた。照明した黄化芽におい
ては、センスAtHXK1植物のAtHXK1（センス-1）、およびセンスAtHXK2植物のAtHX
K2（センス-2）の転写レベルが、対照用植物よりも20倍以上高かった（図5C）。
アンチセンス植物においては、AtHXK1（アンチ-1）およびAtHXK2（アンチ-2）の
アンチセンスRNAが、それぞれのアンチセンス鎖トランスジェニック植物におい
て発現されていた。これに対して、アンチ-AtHXK1およびアンチ-AtHXK2植物にお
ける、内因性のAtHXK1の転写産物は、対照レベルに較べて20％以上低くなってい
た（図5C）。センス-2のブロットの露光を長くすると、アンチ-AtHXK1およびア
ンチ-AtHXK2植物における内因性のAtHXK2の発現も低下することが明らかになっ
た（データは示さ
れていない）。これらの結果から、恐らく配列の同一性が高いため、アンチセン
スAtHXK1またはアンチセンスAtHXK2のRNAのいずれかが、AtHXK1とAtHXK2の内因
性のRNAレベルを低下させうることが示された。15日齢の照明下で生育させた緑
色のトランスジェニック植物を解析しても、同様の結果が得られた（データは示
されていない）。
6％グルコースを含むか、またはそれを含まない、1/2MS培地上で発芽させ、生
育させて、暗黒下で6日間生育させ、その後4時間、白色光（120μEm-2S-1）を当
てた実生を用いて、蛋白質のブロット解析も行った。これらの解析はまた、暗黒
に3日間適応させその後4時間照明した、15日齢の照明下で生育させた緑色植物か
ら抽出した蛋白質を用いて行った。これらの実験で用いた抗体は、以下のように
して調製された。完全なオープンリーディングフレームを含むAtHXK1を、標準的
な方法によって、大腸菌の中で同時発現させるために、プラスミドベクターpET-
19b（ノバジェン（Novagen）社）にサブクローニングした。そして、過剰発現し
たAtHXK1をゲル精製して、ウサギのポリクローナル抗体を作製するために用いた
。この抗体をアフィニティー精製してから、登録商標フォトトープ-スターウエ
スタンブロット検出キット（phototopeTMWesternBlot Detection Kit）（ニュー
イングランドバイオラブズ（New England Biolabs）社）を用いて、蛋白質ブロ
ット解析を行った。常法にしたがって、蛋白質を抽出した（Weiら、Cell 78，19
94;Totsら、EMBO J．6，1843(1987)）。
蛋白質ブロット実験の結果、AtHXK1発現は、センス-AtHXK1における方が、対
照用植物におけるよりも5倍から10倍高いことが明らかになった。アンチ-AtHXK1
植物では、AtHXK1のレベルは、完全には無くならなかったが、対照用植物におけ
るよりも有意に低かった（図5D）。トランスジェニック植物におけるヘキソースリン酸化活性
AtHXK発現の変化が、トランスジェニック植物において、ヘキソースをリン酸
化する全触媒活性に影響があるか否かを判定するために、本発明者らは、Renzと
stitt（Planta 190，166(1993)）によって説明されている、一連の標準的なヘキ
ソースリン酸化アッセイを行った。
照明した黄化実生（上記のようにして生育された）では、センス-AtHXK1植物
が
、最も高いヘキソースリン酸化活性を有することが判明したが、これに対して、
その他の植物は、低い活性を示した（図5E）。AtHXK遺伝子の発現を上昇させた
植物の中で、より高い活性が検出されたことは、AtHXK1がAtHXK2よりも高い触媒
活性を有することが示された酵母の形質転換実験の結果と一致していた（データ
は示されていない）。
本発明者らは、暗黒に3日間適応させその後4時間照明した、15日齢の照明下で
生育させた緑色植物を用いて、酵素的アッセイを行った。図5Fに示されているよ
うに、センス-AtHXK1植物もAtHXK2植物も、アンチ-AtHXK植物および対照用植物
よりも高いヘキソースリン酸化活性を有していた。まとめると、これらのデータ
から、アラビドプシスにおける糖感知および糖調節活性を変化させるにはAtHXK
発現を操作するだけで充分であるという結論が提供される。したがって、例えば
、AtHXK1およびAtHXK2などのHXKの全体的な酵素活性ではなく、糖とHXKとの間の
特異的な相互作用が、植物における糖感知機構の重要な決定因子であることが明
らかになった。糖シグナルは、植物における糖代謝とは連結していない
上記の観察により、HXKに関する調節機能が存在することと、糖シグナルが植
物における代謝とは連結していないこととが示唆された。この仮説を確かめるた
めに、本発明者らは、糖代謝については過剰な触媒活性を提供するが調節機能を
もたない異種由来のHXKの発現を上昇させようと試みた。酵母のHXK2（YHXK2）が
、触媒機能と調節機能とを有することが示されていたため、本実験にとって、よ
い候補であると考えられた（Entian，Mol．Gen．Genet．178，633(1980);Entian
and Frshlich，J．Bacteriol．158，29(1984);Entian et al.，Mol．Cell．Bio
l．5，3035(1985)）。本発明者らは、まず、AtHXKの発現上昇が、酵母のhxk1/hx
k2二重変異体（DBY2219）におけるグルコース抑制に及ぼす効果を調べることに
よって、YHXK2とAtHXKの推定調節機能が交換可能であるかどうかを判定した。こ
のアッセイ法は、2-dGlc/ラフィノース培地上で、YHXK2に媒介される増殖阻害（
すなわち、グルコース抑制）が、野生型酵母細胞で起こることに基づいていた。
Maら（Mol．Cell．Biol．9，5643(1989)）によって説明されているように、2-デ
オキシグルコース（0.02％）存在下で、炭素源として2％ラフィノースを含む
YP培地を用いて、グルコース抑制アッセイを行った。グルコースの類似化合物で
ある2-dGlcは、インベルターゼ遺伝子（SUC2）を強力に抑制するよう誘導するこ
とでは、グルコースを模倣するが、それ自体を炭素源として利用することはでき
ない。したがって、野生型の酵母菌株は、グルコース抑制を示し、これらのアッ
セイ条件の下では増殖することができないが、これに対して、hxk1/hxk2二重変
異体においては、SUC2発現は抑制されず、ラフィノースの加水分解と、アッセイ
用培地上で増殖するためのフルクトースの放出が起きる。図6Aに示されているよ
うに、YHXK2が存在せず、インベルターゼ遺伝子の抑制が起きないために、DBY22
19は、2-dGlc/ラフィノース培地上で増殖することができた。しかし、この菌株
の増殖は、YHXK2で形質転換し、グルコース抑制が回復すると阻害された（MaとB
ostein，Mol．Cell．Biol．6，4046(1986);Maら、Mol．Cell．Biol．9，5643(19
89)）。
植物における、YHXK2発現の上昇の効果を決定するために、上述のアグロバク
テリウムが介在するプロトコールを用いて、YHXK2を発現するトランスジェニッ
ク構築物であるpCaMV35S-YHXK2をアラビドプシスに導入した。YHXK2の発現を上
昇させたトランスジェニック植物（YHXK2植物）は、多くのアッセイ法において
、糖非感受性を示すことが観察された。例えば、YHXK2の実生は、対照用植物お
よびセンス-AtHXK植物よりも、6％グルコースに対する感受性が低かった。胚軸
の伸長、根の成長、および子葉の緑化が、センス-AtHXK1植物または対照用植物
では阻害されるが、YHXK2植物では阻害されないことが判明した（図6B）。RNAブ
ロット解析によって、YHXK2植物では、外部からグルコースを入れても入れなく
ても（データは示されていない）、CAB1とRBCSの転写産物が抑制されないことが
明らかになった。
YHXK2が、植物においてヘキソースのリン酸化活性を提供したことを確認する
ために、黄化トランスジェニック植物と緑色トランスジェニック植物の両方を用
いて、酵素アッセイを行った。図6Cは、YHXK2では、対照用植物におけるよりも
、全ヘキソースリン酸化活性がはるかに高く、センス-AtHXK植物よりも高いか同
程度であることを示している。しかし、YHXK2植物は、糖過感受性ではなく、糖
非感受性であった（図6B）。トランスジェニック植物におけるこの優性な干渉効
果は、恐らく、糖に関してAtHXKと競合するが、シグナルを伝達することができ
ないYHX
K2の発現の上昇によるものであると考えられる。本発明者らは、YHXK2植物にお
けるAtHXK1とAtHXK2の正常な発現に起因する遺伝子のサイレンシングが起きた可
能性を排除した（データは示されていない）。
これらの実験から、HXKの触媒機能が、酵母と植物の間では交換可能であるが
、糖シグナルに関する機能は交換可能でないことが示された。本発明者らの最近
の結果から、第三のAtHXKが、HXKの調節機能を相補しないことも明らかになった
（データは示されていない）。このように、グルコースシグナルは、広範な代謝
を必要とせず、植物の中でYHXK2が過剰に発現すると減少する。
すなわち、本発明者らは、AtHXK機能を獲得したかまたは欠失した植物で、か
つ優性の干渉YHXK2を有する植物の解析に基づいて、高等植物ではHXKが糖感知を
媒介していることを見出した。その他のHXK cDNAおよびゲノムDNAの単離
本明細書で説明した前記のHXK遺伝子およびポリペプチドの単離法に基づき、
当技術分野において周知の標準的な方法と技術とを用いて、さらに別の植物HXK
をコードする配列の単離が可能である。例えば、HXKポリペプチドのアミノ酸配
列の全部または一部を用いて、HXKの縮退オリゴヌクレオチドプローブ（すなわ
ち、所定のアミノ酸配列に関して、あらゆる可能なコーディング配列の混合物）
HXK特異的なオリゴヌクレオチドプローブを容易に設計することができる。これ
らのオリゴヌクレオチドは、DNA鎖およびHXK配列のあらゆる適当な部位の配列（
例えば、図1F-G;それぞれ、配列番号：3と4）に基づくものであってよい。例え
ば、Ausubelら、1996、分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in
Molecular Biology，Wiley Interscience，New York）および、BergerとKimmel
、分子クローニング技術の手引き（Guideto Molecular Cloning Techniques，19
87，Academic Press，New York）に、このようなプローブを設計し、調製するた
めの方法が提供されている。これらのオリゴヌクレオチドは、HXKに相補的な配
列とハイブリダイズすることができるプローブとして使用することによって、ま
たは例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニング法など、さまざまな増
幅技術のためのプライマーとして使用することによって、HXK遺伝子を単離する
のに有用である。
ハイブリダイゼーション技術およびスクリーニング法は、当業者に周知であり
、例えば、Ausubelら（前記）；BergerとKimmel（前記）；およびSambrookら、
分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所出版（
Molecular Cloning:Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，New York
）において説明されている。必要に応じて、異なるオリゴヌクレオチドプローブ
を、組換えDNAライブラリーのスクリーニングに用いることができる。オリゴヌ
クレオチドは、当技術分野において既知の方法を用いて、検出可能な標識で標識
して、組換えDNAライブラリーからのフィルターレプリカを検索するために用い
ることができる。組換えDNAライブラリーは、例えば、Ausubelら（前記）によっ
て説明されているような、当技術分野において周知の方法によって調製される。
または、市販の供給源から入手してもよい。
80％以上の同一性を有する近縁のHXK配列を検出または単離するために、好ま
しくは、高ストリンジェンシー条件が用いられるが、このような条件には、約65
℃および約50％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションで、最初の洗浄を、約
65℃、約２×SSC、および1％SDSで行い、その後、2回目の洗浄を、約65℃、約0.
1％SDS、および1×SSCで行うものが含まれる。本明細書で説明されているHXK遺
伝子に、約30〜50％の配列同一性を有するHXK遺伝子を検出するためのより低い
ストリンジェンシー条件には、例えば、ホルムアミドの非存在下における約45℃
でのハイブリダイゼーションで、最初の洗浄を、約45℃、約6×SSC、および約1
％SDSで行い、そして、2回目の洗浄を、約50℃、約6×SSC、および約1％SDSで行
うものが含まれる。これらのストリンジェンシー条件は、例示であり、当業者に
より、その他の適当な条件を決定することができる。
上記で考察したように、HXKオリゴヌクレオチドは、例えば、PCRを用いた、増
幅クローニング方法におけるプライマーとして使用することもできる。PCR法は
、当技術分野において周知であり、例えば、PCR技術（PCR Technology，Erlich
，ed.，StocktonPress，London，1989）；PCRプロトコール：方法と応用への手
引き（PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，e
ds.，Academic Press,Inc.，New York，1990）；およびAusubelら（前記）で説
明されている。プライマーは選択的には、（本明細書で説明されているように）
増幅された断片の5'端と3'端に適当な制限酵素部位を含ませることによって、増
幅され
た産物を適当なベクターの中にクローニングできるよう設計される。必要に応じ
て、HXKは、PCRの「RACE」法、すなわち、cDNA末端の迅速な増幅法（Rapid Ampl
ification of cDNA）を用いて単離することもできる（例えば、Innisら、前記）
。この方法によって、HXK配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーが、3'お
よび5'方向に向かい、重複するPCR断片を作製するために用いられる。これらの
重複する3'末端および5'末端RACE産物を組み合わせて、完全長のcDNAが作出され
る。この方法は、Innisら、（前記）；およびFrohmanら、Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA 85，8998，(1988)において説明されている。
または、本明細書において、MaとBostein，Mol．Cell．Biol．6，4046（1986
）で説明されているように、どのような植物の発現ライブラリーでも、酵母のhx
k1/hxk2二重変異体の機能的な相補性によってスクリーニングすることができる
。
有用なHXK配列を、適当な生物から単離することができる。機能的な相補性ア
ッセイ法および配列比較を含むが、これらに限定はされない、さまざまな従来か
らの方法によって、HXKポリペプチドファミリーとの配列の関連性の確認が行わ
れる。さらに、本明細書で説明されている技術にしたがって、HXK配列の活性を
評価することができる。ポリペプチド発現
適当な発現ベクターに入れたHXK cDNA（例えば、上述のcDNA）の全部もしくは
一部を用いて、または、インビボでHXKポリペプチド（前記）の発現を上昇させ
るように操作したプラスミド構築物を用いて、適当な宿主細胞を形質転換して、
HXKポリペプチドを製造することができる。
分子生物学分野の当業者は、非常に多様な発現系のいずれかを用いて、組換え
蛋白質が提供されることを理解しているはずである。用いられる宿主細胞が厳密
に何であるかは、本発明にとって重要ではない。HXK蛋白質は、例えば、大腸菌
などの原核生物宿主の中で、または真核生物宿主、例えば、サッカロマイセス・
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、哺乳動物宿主（例えば、COS1または
NIH3T3細胞）、または、藻類、樹木植物種、観賞植物種、温帯果実植物種、熱帯
果実植物種、蔬菜種、マメ科植物種、単子葉類、双子葉類、または、商業上もし
くは農業上重要な植物のいずれかを含むが、これらに限定はされない、多くの植
物
細胞のいずれの中で産生させたものでもよい。適当な植物宿主の特定の例には、
針葉樹、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス、レタス、
ヒマワリ、ナタネ、アマ、ワタ、テンサイ、セロリ、ダイズ、アルファルファ、
メディカゴ属（Medicago）、ハス、ビグナ属（Vigna）、キュウリ、ニンジン、
ナス、カリフラワー、ホースラディッシュ、アサガオ、ポプラ、クルミ、リンゴ
、アスパラガス、イネ、トウモロコシ、キビ、タマネギ、オオムギ、カモガヤ、
エンバク、ライムギ、およびコムギが含まれるが、これらに限定はされない。
これらの細胞は、米国基準培養コレクション（メリーランド州ロックランド）
を含む多様な範囲の供給源、または、例えば、W．アトリー・ブーピー種苗会社
（W．Atlee Burpee Seed Co.）（ペンシルバニア州ウォーミンスター）、パーク
種苗会社（Park Seed Co.）（サウスカロライナ州グリーンウッド）、ジョニー
種苗会社（Johnny Seed Co.）（メイン州アルビオン）、もしくはノースラップ
・キング種苗会社（Northup King Seed Co.）（サウスカロライナ州ハーストビ
ル）などの多くの種苗会社のいずれかから入手することができる。また、有用な
宿主細胞の説明と供給源とが、Vasil I.K.，植物の細胞培養、および体細胞遺伝
学（Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants）Vol I，II，III実験
手順と、その応用（Procedure and Their Applications）Academic Press，New
York，1984;Dixon，R．A.,植物細胞培養・実用的方法、IRL Press，Oxford Univ
ersity，1985;Green et al.,植物組織と細胞培養、Academic Press，New York，
1987;および、Fraley，Science 244，1293（1989）の中に見られる。
原核細胞で発現させるために、HXKポリペプチドをコードするDNAを、原核生物
宿主の中での発現を可能にする調節シグナルに機能的に結合されたベクターに組
み込む。必要に応じて、このコーディング配列には、発現された蛋白質を宿主細
胞の細胞周辺腔へ分泌させ、それによって、蛋白質の回収とその後の精製を容易
にすることができる既知のシグナル配列のいずれかをコードする配列が、その5'
末端に含まれる。最も頻繁に使用される原核生物は、大腸菌のさまざまな菌株で
あるが、別の微生物の菌株を使用することもできる。微生物宿主と親和性のある
生物種に由来する複製開始点、選択マーカー、および調節配列を含むプラスミド
が使用される。このようなベクターの例が、Pouwelsら、（前記）、Ausubelら、
（前記）にある。一般的に使用される原核生物の調節配列（「調節因子」ともい
われる）は、本明細書においては、リボソーム結合部位配列と並んで、転写開始
プロモーター、選択的にはオペレータを含むものとして定義されている。蛋白質
発現を行わせるために一般的に用いられるプロモーターには、ベータ-ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（lac）（Chang et al.，Nature 198：105
6(1977)）、トリプトファン（Trp）（Goeddel et al.，Nucl．Acids Res．8，40
57(1980)）、および、tacプロモーターシステム、また、ラムダ由来のPLプロモ
ーターとN-遺伝子のリボソーム結合部位（Simatake et al.，Nature 292，128(1
981)）が含まれる。
HXKポリペプチドを産生するための一つの特別のバクテリアの発現系は、大腸
菌のpET発現系である（ノバジェン社（Novagen Inc.）ウィスコンシン州マディ
ソン）。この発現系によれば、HXKポリペプチドをコードするDNAを、pETベクタ
ーの中に、発現が行われるように設計された方向に挿入する。HXK遺伝子は、T7
調節シグナルの制御下にあるため、HXKの発現は、宿主細胞の中でT7RNAポリメラ
ーゼの発現を誘導することにより誘導される。これは、典型的には、IPTG誘導に
応答して、T7RNAポリメラーゼを発現する宿主菌株を用いて行われる。産生され
たら、次に、組換えHXKポリペプチドを、例えば、本明細書で説明されている当
技術分野において既知の標準的な方法によって単離する。
HXKポリペプチドを産生するためのもう一つのバクテリアの発現系は、pGEX発
現系（ファルマシア社(Pharmacia)）である。このシステムは、遺伝子または遺
伝子断片が、迅速に精製でき、機能的な遺伝子産物が回収できる融合蛋白質とし
て高レベルで発現されるように設計されている、GST遺伝子の融合システムを用
いる。目的の蛋白質は、スキストソーマ・ジャポニカム（Schistosoma japonicu
m）に由来するグルタチオンS-トランスフェラーゼ蛋白質のカルボキシ末端に融
合されているので、バクテリアの破砕液から、グルタチオンセファロース（Glut
athione Sepharose）4Bを用いたアフィニティークロマトグラフィーで容易に精
製される。融合蛋白質は、グルタチオンで溶出することによって、穏やかな条件
の下で回収することができる。融合蛋白質から、グルタチオンS-トランスフェラ
ーゼ部位の上流に、部位特異的なプロテアーゼの認識部位があるため、この部位
を切断す
るのは容易である。例えば、pGEX-2Tプラスミドで発現される蛋白質は、トロン
ビンで切断することができ、pGEX-3Xで発現される蛋白質は、第Xa因子で切断す
ることができる。
真核生物で発現させるための形質転換の方法およびHXK蛋白質を発現させるた
めのベクターの選択は、選択する宿主のシステムに依存する。形質転換の方法は
、例えば、Ausubelら（前記）；WeissbachとWeissbach、植物分子生物学の方法
（Methods for Plant Molecular Biology）、Academic Press，1989；Gelvinら
、植物分子生物学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）、Kluwer Aca
demic Publishers，1990；Kindle，K.，Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A．87，1
228(1990)；Potrykus，I.，Annu．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biology 42
，205(1991)；および、バイオラド社（BioRad）（カリフォルニア州ハーキュリ
ーズ）技術速報#1687（パーティクルガンによる輸送システム（Biolistic Parti
cle Delivery System））に記載されている。発現ベクターは、例えば、クロー
ニングベクター：実験マニュアル（Cloning Vectors：ALaboratory Manual）（P
.H．Pouwels et al.，1985，Supp．1987）；Gasser and Fraley（前記）；クロ
ーンテック分子生物学カタログ（Clonetech Molecular BiologyCatalog）（カタ
ログ1992/93分子生物学者必携、カリフォルニア州パロアルト）；および上記で
引用した参考文献などで提供されているものから選択することができる。
好ましい真核生物の発現系の一つは、pMAMneo発現ベクター（クローンテック
社(Clonetech)）で形質転換させたマウス3T3繊維芽宿主細胞である。pMAMneoに
は、デキサメタゾンで誘導できるMMTV-LTRプロモーターに結合したRSV-LTRエン
ハンサー、哺乳動物のシステムの中での複製が可能になるSV40の複製開始点、選
抜可能なネオマイシン遺伝子、およびSV40のスプライシングならびにポリアデニ
ル化部位が提供されている。HXKポリペプチドをコードするDNAを、pMAMneoベク
ターの中に発現できるように設計された方向に挿入する。次に、組換えHXK蛋白
質を、下記で説明するようにして単離する。pMAMneo発現ベクターとともに用い
ることのできるその他の好ましい宿主細胞には、COS細胞とCHO細胞（それぞれ、
ATCC寄託番号：CRL 1650、およびCCL 61）とが含まれる。
または、必要に応じて、HXKポリペプチドは、安定的に形質転換された哺乳動
物
の細胞系によって産生される。哺乳動物細胞の安定的な形質転換に適した多くの
ベクターが、何人にも利用可能である。例えば、Pouwelsら、（前記）を参照の
こと。また、このような細胞系を構築する方法も、一般に利用可能である。例え
ば、Ausubelら（前記）。一例において、HXKポリペプチドをコードしているcDNA
を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターの中にクロー
二ングする。宿主細胞の染色体にプラスミドが組み込まれたもの、すなわち、HX
Kをコードしている遺伝子が組み込まれたものを、細胞培養培地の中に0.01〜300
μMのメトトレキセートを入れて（Ausubelら（前記）によって説明されているよ
うに）選抜する。この優性選抜は、ほとんどの細胞種で行うことができる。形質
転換された遺伝子のDHFR媒介による増幅によって、組換え蛋白質の発現を上昇さ
せることができる。遺伝子増幅された細胞系を選抜する方法は、Ausubelら（前
記）によって説明されており、このような方法は、一般的には、培地中のメトト
レキセートのレベルを徐々に上昇させてゆき培養期間を延長することを含む。こ
の目的で一般的に使用されるDHFRを含む発現ベクターには、pCVSEII-DHrFとpAdD
26SV(A)（Ausubelら（前記）によって説明されている）とが含まれる。上述した
宿主細胞中に、または、好ましくは、DHFRに欠陥のあるCHO細胞系（例えば、CHO
DHFR細胞、ATCC寄託番号：CRL 9096）が、安定的に形質転換された細胞系のDHF
R選抜、またはDHFR媒介による遺伝子増幅をするのに好ましい宿主細胞の一つで
ある。
最も好ましくは、HXKポリペプチドが、安定的に形質転換された植物細胞系、
またはトランスジェニック植物によって産生される。植物細胞の安定的な形質転
換、またはトランスジェニック植物を確立するのに適した多数のベクターが一般
に利用できるが、このようなベクターは、Pouwelsら、（前記）、WeissbachとWe
issbach（前記）、およびGelvinら（前記）において説明されている。このよう
な細胞系を構築するための方法は、例えば、WeissbachとWeissbach（前記）、お
よびGelvinら（前記）において説明されている。典型的には、植物発現ベクター
には、（1）5'および3'の調節配列の転写制御下にある、クローン化された植物
遺伝子と、（2）優性選択マーカーとが含まれる。また、このような発現ベクタ
ーは、必要に応じて、プロモーター調節領域（例えば、誘導的もしくは構成的な
発現、外部環境的もしくは発生的に調節された発現、または、細胞もしくは組織
特異的な
発現を付与するもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセッシン
グシグナル、転写終結部位、および/または、ポリアデニル化シグナルを含んで
いてもよい。
または、HXKポリペプチドは、一過的発現系を用いて産生させることができる
（例えば、Sheen Plant Cell2，1027(1990)によって説明されている、トウモロ
コシの一過的発現系）。
所望のHXKの塩基配列が得られたら、当技術分野において既知のさまざまな方
法で操作することができる。例えば、配列が、コード領域でない隣接配列を含ん
でいる場合、この隣接領域に突然変異誘発を行うことができる。
本発明のHXK DNAの配列は、必要に応じて、他のDNA配列とさまざまな方法で組
み合わせることができる。本発明のHXK DNAの配列は、通常は、HXK蛋白質と関連
している遺伝子の配列の全部または一部とともに用いることができる。その構成
部分において、HXK蛋白質をコードしているDNA配列は、宿主細胞の中で転写およ
び翻訳を促進することができる転写開始調節領域を有するDNA構築物と連結され
る。
一般的に、この構築物は、本明細書において考察されているように、HXK蛋白
質の産生を改変するために用意された、植物の中で機能する調節領域を含む。HX
K蛋白質またはその機能的断片をコードするオープンリーディングフレームの5'
末端を、HXK構造遺伝子の5'上流領域に天然に存在する配列のような、転写開始
調節領域に結合させる。構成的な調節または誘導的な調節のための、さまざまな
別の転写開始領域を使用することができる。
発生的、細胞、組織、ホルモン、または環境による発現が望ましい場合に適用
するためには、別の遺伝子、例えば、種子の発達、胚の発達、または葉の発達の
過程で調節されている遺伝子から、5'上流にある、適当な非コーディング領域を
得る。
調節的な転写終結領域も、本発明のDNA構築物の中で、同じように提供される
と考えられる。転写終結領域は、HXK蛋白質をコードするDNA配列によって提供さ
れるか、または別の遺伝子源に由来する簡便な転写終結領域でもよい。転写終結
領域には、好ましくは、その転写終結領域が由来する構造遺伝子の3'側の少なく
と
も1〜3kbの配列が含まれる。（センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの方向
に）発現させるための、目的のDNA配列としてHXKを有する植物の発現構築物を、
植物のさまざまな生活状態に用いることができ、特に、貯蔵物質の産生に関係す
る生活状態（例えば、炭素および窒素代謝を含む生活状態）に用いることができ
る。このように遺伝子工学的に作出された植物は、下記で説明するように、産業
および農業分野においてさまざまに応用する上で有用である。重要なのは、本発
明は、双子葉類および単子葉類に施用可能であり、新規のまたは改良された形質
転換法または再生法に対しても容易に施用可能でありうることである。
本発明に係る有用な植物プロモーターの例は、カウリモウイルスのプロモータ
ーで、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のプロモーターである。
これらのプロモーターは、ほとんどの植物組織において高レベルの発現をもたら
し、これらのプロモーターの活性は、ウイルスにコードされた蛋白質に依存しな
い。35Sと19Sの両方のプロモーターが、CaMVに由来している。トランスジェニッ
ク植物のほとんどの組織において、CaMV 35Sプロモーターは、強力なプロモータ
ーである（例えば、Odellら、Nature 313，810(1985)）。CaMVプロモーターはま
た、単子葉類でも高い活性を有する（例えば、Dekeyserら、Plant Cell 2，591(
1990);Terada and Shimamoto，Mol．Gen．Genet．220，389，(1990)参照）。そ
の上、CaMV 35Sプロモーターを重複させることによって、このプロモーターの活
性をさらに上昇させることができる（すなわち、2〜10倍の範囲で）（例えば、K
ayら、Science 236，1299(1987);Owら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．84，48
70(1987);およびFangら、Plant Cell 1，141(1989)）。
その他の有用な植物プロモーターには、ノパリンシンターゼプロモーター（An
ら、Plant Physiol．88，547(1988)）、およびオクトピンシンターゼプロモータ
ー（Frommら、Plant Cell 1，977(1989)）が含まれる。
一定の応用においては、HXK遺伝子産物を、適切な組織、適切なレベル、また
は、適切な発生時期に産生させることが望ましいかもしれない。このような目的
のために、各々が、その調節配列に具体化された明確な特徴を有し、環境、ホル
モン、および/または発生上の合図に応答して調節されていることが分かってい
る遺伝子プロモーターの取り合わせがある。これらには、温度によって調節され
る遺
伝子発現に関係する遺伝子プロモーター（例えば、Callisら、Plant Physiol．8
8，965(1988);TkahasiとKomeda，Mol．Gen．Genet．219，365(1989);および、Ta
kahashiら、Plant J．2，751(1992)を参照）、光調節遺伝子発現（例えば、Kuhl
emeierら、Plant Cell 1，471(1989)によって説明された、エンドウのrbcS-3A、
SchaeffnerとSheen、Plant Cell 3，997(1991)によって説明された、トウモロコ
シのrbcSプロモーター、またはSimpsonら、EMBO J．4，2723(1985)によって説明
された、エンドウで発見されたクロロフィルa/b結合蛋白質遺伝子）、ホルモン
によって調節される遺伝子発現（例えば、Marcotteら、Plant Cell 1，969(1989
)によって説明された、コムギのEm遺伝子に由来するアブシジン酸（ABA）反応性
配列；Straubら、Plant Cell 6，617(1994)、Shenら、Plant Cell 7，295(1994)
、およびYamaguchi-Shinozakiら、によって、オオムギとアラビドプシスに関し
て説明されている、ABAで誘導されるHVA1ならびにHVA22プロモーター、およびrd
29Aプロモーター）、傷害誘導による遺伝子発現（例えば、Siebertzら、Plant C
ell 1，961(1989)によって説明されているwunIの）、または、器官特異的な遺伝
子発現（例えば、Roshalら、EMBO J．6，1155(1987)によって説明されている、
塊茎特異的な貯蔵蛋白質遺伝子の発現；Schernthanerら、EMBO J．7，1249(1988
)によって説明されている、トウモロコシの23-kDaゼイン遺伝子；Bustosら、Pla
nt Cell 1，839(1989)によって説明されている、インゲンマメのβ-ファセオリ
ン遺伝子）が含まれる。
植物の発現ベクターはまた、選択的に、効率的なRNA合成と蓄積に重要である
ことが分かっている、例えば、イントロンのようなRNAプロセッシングシグナル
を含むことができる（Callisら、Genes and Dev．1，1183(1987)）。植物におい
て、RNAスプライス配列は、導入遺伝子の発現レベルに劇的な影響を与える。こ
の事実から考えると、遺伝子発現のレベルを調節するためには、導入遺伝子のHX
Kポリペプチドをコードしている配列の上流か下流にイントロンを置けばよい。
前述の5'調節制御配列に加えて、発現ベクターは、植物遺伝子の3'領域に一般
的に存在している調節制御配列を含んでいてもよい（Thornburgら、Proc．Natl
．Acad．Sci．U.S.A．84，744(1987);油ら、Plant Cell 1，977(1989)）。例え
ば、mRNAの安定性を高めるために、3'ターミネーター領域が、発現ベクターの中
に含まれうる。このようなターミネーター領域は、ジャガイモのPI−IIターミネ
ーター領域に由来するものであってもよい。さらに、この他に、一般的に用いら
れるターミネーターには、オクトピンまたはノパリンシンターゼのシグナルに由
来するものがある。
また、植物の発現ベクターには、典型的には、形質転換された細胞を同定する
ために用いられる優性の選択マーカーも含まれる。植物のシステムにとって有用
な選抜可能な遺伝子には、抗生物質抵抗性遺伝子をコードしている遺伝子、例え
ば、ヒグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシ
ン、またはスペクチノマイシンに対する抵抗性をコードしている遺伝子が含まれ
る。光合成に必要な遺伝子も、光合成欠陥系統における選択マーカーとして用い
ることができる。または、クラゲ、アクオレア・ビクトリア（Aequorea victori
a）から得られる緑色蛍光蛋白質を、選択マーカーとして用いることができる（S
heenら、Plant J．8:777，1995;Chiuら、Current Biology 6，325(1996)）。最
後に、除草剤抵抗性をコードしている遺伝子を、選択マーカーとして用いること
ができるが、有用な除草剤抵抗性遺伝子には、ホスフィノツリシン（phosphinot
hricin）・アセチルトランフェラーゼ酵素をコードし適用領域の広い除草剤、登
録商標バスタ（Basta）（ヘヒスト社（Hoechst）、ドイツのフランクフルト）に
対する抵抗性を付与するbar遺伝子が含まれる。
特定の選抜用薬剤に対する植物細胞の感受性を決定し、また、形質転換細胞の
、全部ではなくても、そのほとんどを効果的に殺傷するこの薬剤の濃度を決定し
ておくことによって、選択マーカーの効率的な使用が容易になる。タバコの形質
転換に関する抗生物質の有用な濃度には、例えば、75〜100μg/ml（カナマイシ
ン）、20〜50μg/ml（ヒグロマイシン）、または5〜10μg/ml（ブレオマイシン
）などがある。除草剤抵抗性に関する形質転換体を選抜するための有用な方法は
、例えば、Vasilら（前記）で説明されている。
分子生物学の技術分野、特に、植物分子生物学の技術分野の当業者には、遺伝
子発現のレベルは、プロモーターの組合せ、RNAプロセッシングシグナル、およ
び終結因子に依存するだけでなく、このような因子を、どのようにして選択マー
カーの遺伝子発現レベルを上昇させるのに用いるのかにも依存することが容易に
明
らかであると思われる。植物の形質転換
植物発現ベクターを構築するにあたって、ベクターを植物宿主に導入して、そ
れによってトランスジェニック植物を作製するために使用できる、いくつかの標
準的な方法がある。これらの方法には、（1）アグロバクテリウムが媒介する形
質転換（A.ツメファシエンス（A．tumefaciens）またはA.リゾゲネス（A．rhizo
genes））（例えば、LichtensteinとFuller，遺伝子工学（Genetic Engineering
）中、vol 6，PWJ Rigby編、London，Academic Press，1987;および、Lichtens
tein，C.P.とDraper，J．DNAクローニング（DNA Cloning）、Vol II，D.M．Glov
er編、Oxford，IRI Press，1985を参照のこと）、（2）粒子輸送システム（例え
ば、Gordon-Kammら、Plant Cell 2，603(1990);または、バイオラド社技術速報1
687、前記を参照のこと）、（3）マイクロインジェクションプロトコール（例え
ば、Greenら、前記を参照のこと）、（4）ポリエチレングリコール（PEG）法（
例えば、Draperら、Plant Cell Physiol．23，451(1982);または、例えば、Zhan
gとWu、Thor．Appl．Genet．76，835(1988)を参照のこと）、（5）リポソーム媒
介によるDNAの取り込み（例えば、Freemanら、Plant Cell Physiol．25，1353(1
984);参照のこと）、（6）エレクトロポレーションプロトコール（例えば、Gelv
inら、前記;Dekeyserら、前記;Frommら、Nature 319，791(1986);Sheen Plant
Cell 2，1027(1990);またはJangとSheen，Plant Cell 6，1665(1994)を参照のこ
と）、および（7）ボルテックス法（例えば、Kindle、前記を参照のこと）が含
まれる。形質転換の方法は、本発明にとって重要ではない。効果的な形質転換を
もたらす方法であれば、どの方法を用いてもよい。より新しい方法が、作物また
はその他の宿主細胞を形質転換するために使用できるようになれば、そのまま使
用することができる。
以下は、特定の技術の一つである、アグロバクテリウムが媒介する植物の形質
転換の例の概略である。この方法では、植物細胞のゲノムの中に導入される遺伝
子を操作するための一般的な処理が、2つの段階で行われる。第1段階では、クロ
ーニングとDNAの改変が、大腸菌の中で行われ、目的の遺伝子構築物を含有する
宇プラスミドが、接合またはエレクトロポレーションによって、アグロバクテリ
ウ
ムの中に導入される。第2段階では、この結果できたアグロバクテリウム菌株を
用いて、植物細胞を形質転換する。このように、一般化された植物発現ベクター
では、このプラスミドは、アグロバクテリウムの中で複製することのできる複製
開始点と、大腸菌の中で機能する複製開始点を多くのコピー数持っている。それ
によって、アグロバクテリウムに移行させて、続いて植物に導入する前に、大腸
菌の中で、導入遺伝子の産生と試験を簡単に行うことができる。抵抗性遺伝子、
例えば、ストレプトマイシンなど、バクテリアの中での選抜のための抵抗性遺伝
子と、例えば、カナマイシン抵抗性、または除草剤抵抗性をコードする遺伝子な
ど、植物の中で機能する別の抵抗性遺伝子をベクターに含ませることもできる。
また、ベクターには、1個以上の導入遺伝子を付加するための制限酵素部位と、
アグロバクテリウムの移行機能因子によって認識されると、植物に移行するDNA
領域を明確に区切る、方向性のあるT-DNAの境界配列とが存在する。
別の実施例においては、クローン化されたDNAを付着させたタングステン微小
発射体を細胞の中に打ち込んで、植物細胞を形質転換させることができる。打ち
込みに用いられるバイオリスティック装置（Biolistic Apparatus）（バイオラ
ド社）においては、火薬弾薬（22口径のパワーピストンツール用チャージ(Power
PistonToolCharge)）、または圧縮空気を動力とする爆発によって、銃身を通っ
て、プラスチック製の微小発射体を動かす。DNAが付着しているタングステン粒
子の等量懸濁液を、プラスチック製の微小発射体の前部に置く。後者は、発射体
が通過するには小さすぎる穴を有するアクリル停止板のところで爆発する。その
結果、プラスチック製の微小発射体が、停止板にぶつかり、タングステン微小発
射体は、この板の穴を通り抜けて標的に向かって進み続ける。本発明にとって、
標的は、植物細胞、組織、種子、または胚であると考えられる。細胞の中に導入
された、微小発射体DNAは、核またはクロロプラストの中に組み込まれる。
一般的に、植物細胞における導入遺伝子の移行と発現は、今日では、当業者に
とって日常的な作業となっており、植物で遺伝子発現実験を行うため、および、
農業目的または商業目的のために改良された植物変種を作出するための主要な手
段となっている。トランスジェニック植物の再生
標準的な植物組織培養技術によって、植物発現ベクターで形質転換された植物
細胞を、例えば、単細胞、カルス組織、または配列の切片から再生させることが
できる。ほとんどの植物から、さまざまな細胞、組織、および器官をうまく培養
して、完全な植物体に再生させることができることは、当技術分野において周知
であり、このような技術については、Vasilら、前記；Greenら、前記；Weissbac
hとWeissbach、前記；およびGelvinら、前記において説明されている。
特定の実施例において、35S CaMVプロモーターとノパリンシンターゼのターミ
ネーターの制御下にあり、選択マーカー（例えば、カナマイシン抵抗性）を含む
クローニングされたHXKポリペプチドまたはアンチセンス構築物を、アグロバク
テリウムの中に形質転換する。ベクターを含むアグロバクテリウムによる葉片の
形質転換（例えば、タバコの葉片）は、Horschらによって説明されているところ
に従って行われる（Science，227，1229(1985)）。数週間後（例えば、3から5週
間後）、カナマイシン（例えば、100μg/ml）を含む組織培養培地上で、形質転
換体と思われるものを選抜する。そして、カナマイシン抵抗性植物体を、温室で
生育させるために選抜する。必要に応じて、トランスジェニック植物を自家受精
させて採取した種子を、さらに、土を含まない培地に播種して、温室で育てるこ
ともできる。ホルモンを含まないカナマイシン添加培地上に、種子の表面を滅菌
して播種して、カナマイシン抵抗性後代を選抜する。標準的な技術によって、導
入遺伝子の組み込みの解析を行う（例えば、Ausubelら、前記；Gelvinら、前記
を参照のこと）。
次に、標準的な免疫ブロット、およびDNA検出技術によって、導入遺伝子DNAの
伝達に関して、選択マーカーを発現するトランスジェニック植物をスクリーニン
グする。陽性のトランスジェニック植物およびそのトランスジェニック後代は、
同じ導入遺伝子によって確立されたその他のトランスジェニック植物に較べて、
それぞれ違いが大きい。植物のゲノムDNAへの導入遺伝子の組み込みは、ほとん
どの場合でたらめで、組み込まれた部位が、導入遺伝子発現のレベルおよび組織
ならびに発生パターンに深く影響しうる。したがって、最も適当な発現プロファ
イルを有する植物を同定し選抜するために、通常は、数多くのトランスジェニッ
ク系統をスクリーニングする。
導入遺伝子の発現レベルについて、トランスジェニック系統の評価を行う。発
現が陽性である植物を同定して定量するために、まず、RNAレベルでの発現を判
定する。RNA解析に関する標準的な技術が用いられ、導入遺伝子の鋳型RNAのみを
増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅アッ
セイと、導入遺伝子特異的なプローブ（例えば、Ausubelら、前記を参照のこと
）を用いる溶液ハイブリダイゼーションアッセイとが含まれる。次に、HXK特異
的な抗体を用いたウエスタン免疫ブロット解析によって、蛋白質発現に関して、
RNA陽性の植物を解析する（例えば、Ausubelら、前記を参照のこと）。さらに、
標準的なプロトコールにしたがって、トランスジェニック組織の中での発現部位
の位置を決めるために、それぞれ、導入遺伝子特異的なヌクレオチドプローブと
抗体を用いて、インサイチューハイブリダイゼーションと免疫細胞化学解析を行
うことができる。
細胞またはトランスジェニック植物において、組換えHXK蛋白質が発現されれ
ば（例えば、上述したように）、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを
用いて、それを単離してもよい。一つの例としては、抗HXK抗体（例えば、Ausub
elら、前記において説明されているようにして、または標準的な技術によって産
生されたもの）をカラムに付着させて、ポリペプチドを単離するために用いるこ
とができる。標準的な方法（例えば、Ausubelら、前記を参照のこと）によって
、アフィニティークロマトグラフィーの前に、HXK産生細胞の破砕と分画を行っ
てもよい。単離されたら、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィー
（例えば、Fisher，生化学と分子生物学における実験技術、WorkとBurdon編、El
sevier，1980）を用いて組換え蛋白質をさらに精製することができる。
これらの一般的なポリペプチド発現および精製の技術を用いて、有用なHXK断
片またはその相同体を製造し単離することもできる。用途
本明細書で説明されている本発明は、作物収量の増加、作物および観賞植物の
品質改良、ならびに作物の生産費用の低減を含むが、これらに限定はされない、
さまざまな農業上および商業上の目的にとって有用である。例えば、本明細書で
説明されている方法、DNA構築物、蛋白質、およびトランスジェニック植物は、
食
味、質感、大きさ、色、酸味または甘味；栄養内容；病気抵抗性；および成熟作
用などの、果実および野菜の特性を改良するために有用である。
上述した本発明者らの結果は、植物の内因性ヘキソキナーゼのmRNAに相補的な
ヘキソキナーゼ配列の転写を行わせることによって、トランスジェニック植物に
おけるヘキソキナーゼ遺伝子発現を調節することができることを明らかにしてい
る。この方法で、さまざまな植物の作用を改変し、制御し、または操作すること
ができ、それによって、糖質（例えば、スクロースおよびデンプン）生産の向上
、植物の成長の変化、細胞の分化と発生、植物の表現型の変化、および炭素/窒
素の配分と蓄積の変更がもたらされる。さらに、上記で考察されたように、必要
に応じて、細胞特異的、組織特異的、器官特異的、または発生段階特異的な様式
で、アンチセンス発現を制御することができる。このように、アンチセンス制御
を利用して、ヘキソキナーゼ遺伝子の発現を実質的に阻害し、またはさまざまな
程度に発現を低下させることができる。この方法で、外来の蛋白質を産生させる
ことなく、また、特異的な遺伝子を特に狙って、細胞の表現型を変更することが
できる。
例えば、アンチセンスヘキソキナーゼRNA構築物を発現するトランスジェニッ
ク植物は、糖代謝物（例えば、光合成の最終産物であるスクロースとグルコース
）の蓄積によって起こる、光合成のフィードバック阻害（例えば、糖に誘導され
る光合成遺伝子の抑制による）をなくすために有用である。本明細書で示されて
いるように、アンチセンスヘキソキナーゼ遺伝子を発現しているトランスジェニ
ック植物は、糖に対する感受性が低いため、糖抑制（例えば、光合成遺伝子の発
現低下）の結果である成長制限および抑制を受けることがなくなる。特に、本発
明者らは、アンチセンスヘキソキナーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植
物は、典型的には、フィードバック阻害によって、植物の成長が制限および抑制
されるような条件の下で、正常に発生し、生長する（例えば、野生型植物では、
ヘキソース濃度が高いと、芽の発達が阻害されるが、アンチセンスヘキソキナー
ゼを発現するトランスジェニック植物では、芽の発達が正常に進む）。このよう
に、アンチセンスヘキソキナーゼを発現するトランスジェニック植物は、特に、
例えば、強い日照、高温、および高CO2などの、有害な環境条件下で、成長速度
なら
びに発生を促進し、発芽させ、開花刺激し、また、収穫率を向上させることを含
むが、これらに限定はされない、さまざまな農業上の目的にとって有用である。
さらに、上述の結果は、ヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを上昇させることによ
って、糖に対する植物の感受性を調節することができることを明らかにしている
。特に、本発明者らは、ヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを上昇させることは、糖
によって活性化される遺伝子（例えば、NR1）の発現の上昇を促進するために有
用であることを見出した。この方法で、さまざまな植物が有する糖によって制御
され、調節され、活性化される遺伝子を、その植物細胞、組織、または器官の中
で、ヘキソキナーゼ蛋白質のレベルを上昇させることによって調節または操作で
きる。このような遺伝子発現の遺伝子工学は、貯蔵蛋白質の蓄積、ならびに窒素
の蓄積を促進し、植物の傷害応答、ならびに病原体からの防御機構を向上させる
ために有用であり、また、観賞および園芸目的で、植物組織（例えば、果実およ
び花）の着色（例えば、アントシアニン）を改良するために有用である。例えば
、ヘキソキナーゼの発現を上昇させることは、ジャガイモの貯蔵蛋白質のパタチ
ン（patatin）、ダイズの栄養貯蔵蛋白質のスポラミン、プロテアーゼインヒビ
ターII、スクロースリン酸シンターゼ、イネおよびトウモロコシのスクロースシ
ンターゼ、カルコンシンターゼ、および硝酸レダクターゼを含むが、これらに限
定はされない蛋白質の組合せをコードしている、さまざまな、糖によって活性さ
れる遺伝子の発現を操作し、促進させるために有用である。
本明細書において言及されている出版物および特許文書はすべて、各出版物ま
たは特許文書が特別かつ個々に参照として組み入れられるよう示されているのと
同様に、参照として本明細書に組み入れられる。
その他の態様
以上の説明から、さまざまな用法および条件に適合させるために、本明細書で
説明されている本発明に、変更および修正を加えることができるのは明らかであ
る。そのような態様もまた、以下の請求の範囲に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
//(Ｃ１２Ｎ 9/12
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ
，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ