JP2000506526A

JP2000506526A - Programmed cell death and interleukin-1β

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Publication number: JP2000506526A
Application number: JP09532545A
Authority: JP
Inventors: ユアン，ジュニン; フリエドランデル，ロベルト
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2000-05-30
Also published as: CA2248551A1; EP0886525A1; WO1997033606A1

Abstract

(57)【要約】プログラムされた細胞死を調整する方法を提供する。アポトーシスは、様々な刺激により誘導され、ＩＬ−１βがその１型受容体に結合するのをブロックすることにより阻害できる。更に、ＩＬ−１βは、アポトーシス刺激にさらす前に、外来的に加えた場合、抗アポトーシス活性を有した。proＩＬ−１βのＩＣＥ切断は、アポトーシスにおける重要な工程であり、成熟ＩＬ−１βは、細胞死の正または負のメディエーターとして機能できる。 (57) [Summary] Methods for regulating programmed cell death are provided. Apoptosis is induced by various stimuli and can be inhibited by blocking IL-1β from binding to its type 1 receptor. In addition, IL-1β had anti-apoptotic activity when added exogenously prior to exposure to apoptotic stimuli. ICE cleavage of proIL-1β is a critical step in apoptosis, and mature IL-1β can function as a positive or negative mediator of cell death.

Description

【発明の詳細な説明】プログラムされた細胞死およびインターロイキン−１β 発明の背景合衆国支援研究開発の下に為された発明に対する権利についての陳述本発明の開発中に実施された研究の一部は、合衆国政府基金を利用した。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。発明の分野本発明は、プログラムされた細胞死の制御に関する分子生物学の分野である。背景技術の説明プログラムされた細胞死アポトーシスは、プログラムされた細胞死または調節された細胞死とも呼ばれ、生物体が不要な細胞を排除するプロセスである。このような細胞死は、組織ホメオスタシスや加齢と同じく動物発生の正常な様相として起こる(Glucksmann，A .,Biol．Rev．Cambridge Philos．Soc．26-:59-86(1950);Ellis et al.，Dev. 112:591-603(1991);Vaux et al.，Cell 76:777-779(1994))。プログラムされた細胞死はまた、細胞数を調節し、形態発生を促進し、有害あるいは異常細胞を除去し、そして既にこれらの機能を実行している細胞を排除する働きもできる。更に、プログラムされた細胞死は、低酸素症または虚血などの様々な生理学的ストレスに応答して起こると考えられている。アポトーシスの形態学的特徴には、原形質膜の水庖形成、核液および細胞質の凝縮およびヌクレオソーム間の間隔 (inter-nucleosomal intervals)での染色体ＤＮＡの劣化がある(Wyllie，A．H., in Cell Death in Biology and Pathology,Bowen and Lockshin,eds., Chapman and Hall (1981)，pp．9-34)。アポトーシスは、細胞自殺の内因性機構を介して成され(Wyllie，A．H.，in Cell Death in Bio1ogy and Pathology,Bowen and Lockshin,eds.,Chapman and Hall(1981)，pp．9-34)、内部または外部シグナルのいずれかの結果により、細胞がその内部にコードされた自殺プログラムを活性化すると起こる。自殺プログラムは、慎重に調節される遺伝子プログラムの活性化により遂行される (Wyllie,A.H.，et al.，Int．Rev．Cyt.68:251(1980);Ellis，R.E.，et al.，Ann．Rev．Cell Bio．7:663(1991))。細胞死はＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害により妨害できることから、多くの場合で遺伝子発現が要求されるようである(Coehn et al.，J．Immunol．32:38-42(1984);Stanisic et al., Invest．Urol．16:19-22(1978);Martin et al.，J．Cell Bio1．106:829-844 (1988))。プログラムされた細胞死の遺伝子的経路は、最初、線虫C.elegansにおいて同定された。この虫では、ced−３およびced−４遺伝子の産物が、細胞自殺のプログラムを実施する(Yuan & Horvitz，Dev．Bio．138:33(1990))。インターロイキン−１β変換酵素 ced-３遺伝子産物の哺乳動物相同物は、インターロイキン−１β(ＩＬ−１β) の活性化を担うシステインプロテアーゼであるインターロイキン−１β変換酵素 (ＩＣＥ)である(Thornberry，N．A.，et al.,Nature 356:768(1992); Yuan，J.，et al.，Cell 75:641(1993);Miura，M.，et al.，Cell 75:653 (1993))。このIce遺伝子は、遺伝子ファミリーの一員である。哺乳動物ＩＣＥ/C ed-3ファミリーは、現在、少なくとも６種：ＩＣＥ、ＩＣＨ−１/ＮＥＤＤ２、ＣＰＰ３２/Yama/Apopain、ＴＸ/ＩＣＥreIII／ＩＣＨ−２、ＩＣＥreIIIIおよびＭＣＨ２を含む(Yuan et al.，Cell 75:641-652(1993);Wang et al.，Cell 78:739-750(1994);Kumar et al.，Genes Dev．8:1613-1626(1994); Fernandes-Alnermi et al.，J．Biol．Chem．269:30761-30764(1994);Tewari, M.，et al.，Cell 81:801-809(1995);Nicholson，D.，et al.，Nature 376: 37-43(1995);Fausheu，C.，et al.，J．Biol．Chem．269:30761-30764 (1994);Munday，N.A.，et al.，J.Biol．Chem．270:15870-15876(1995); Kamens，J.，et al.，J．Biol．Chem．270:15250-15256(1995);Fernandes- Alnermi，et al.，Canc．Res 55:2737-2742(1994))。インターロイキン−１β変換酵素(ＩＣＥ)は、不活性な３１ＫＤプロインターロイキン−１βをＡsp¹¹⁶−Ａla¹¹⁷で切断し、カルボキシ末端１５３アミノ酸ペプチドを放出して、成熟１７．５ｋＤインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を生成する基質特異的システインプロテアーゼである(Kostura et al.，Proc. Natl．Acad．Sci.，USA 86:5227-5231(1989);Black et al.，FEBS Lett. 247:386-390(1989);Cerretti et al.，Science 256:97-100(1992); Thornberry et al.，Nature 356:768-774(1992))。これは、その活性部位システイン残基がＩＣＥ−媒介アポトーシスにとって不可欠であるプロテアーゼファミリーの一員であるから、これらのタンパク質分解活性は、細胞死媒介において重大である(Miura et al.，J．Cell 75:653-660(1993))。ＩＬ−１βは、炎症、敗血症ショック、損傷治癒、造血およびある種の白血病の増殖を含む広範囲の生物学的応答の媒介に関与するサイトカインでもある(Dinarello，C．A.，Blood 77:1627-1652(1991);diGiovine et al.，Today 11:13(1990))。ＩＣＥの特異的阻害因子である牛痘ウイルスのcrmＡ遺伝子産物は、ＩＬ−１ βのタンパク質分解活性化を妨害し(Ray et al.，Cell 69:597-604(1992))、宿主の炎症応答も阻害する(Ray et al.，Cell 69:597-604(1992))。crmＡ遺伝子の欠失した牛痘ウイルスは、ヒヨコ胎芽の炎症応答を抑制できず、ウイルス感染細胞数の低下をもたらし、宿主へ与える損傷も少ない(Palumbo et al., Virology 171:262-273(1989))。この観察結果は、炎症性応答を引き起こすＩＣＥの重要性を示している。ＩＣＥの過剰発現がアポトーシスを誘導し、細胞死の際に成熟ＩＬ−１βが放出されることも示されている(Miura，M.，et al.，Cell 75:653(1993);Miura, M.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．92:8318-8322，(1995))。セルピンファミリーの一員であり、ＩＣＥの阻害因子である牛痘ウイルス遺伝子産物Ｃ rmＡもまたアポトーシスを妨害する(Miura，M.，et al.，Cell 75:653(1993); Miura，M.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．(印刷中);Ray，C．A., et al.，Cell 69:597(1992);Gagliardini，V.，et al.，Science 263:826 (1993);Boudreau，N.，et al.，Science 267:891(1995);Enari，M.，et al., Nature 375:78(1995);Los，M.，et al.，Nature 375:81(1995))。更に、ＣrmＡのアポトーシス阻害能は、その成熟ＩＬ−１β産生阻害能と相関する。最近の報告では、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)誘導アポトーシスが、ＣrmＡ−阻害可能経路を経て媒介されることが示され、これはＩＣＥファミリーの関与を示唆している(Tewary，M.，et al.，J．Biol．Chem．270:3255(1995);Hsu，H., et al.，Cell 81:495(1995);Miura，M.，et al.，Natl．Acad．Sci．U.S.A. (印刷中))。細胞死におけるＩＣＥファミリーの重大な役割は、十分に認められているが、アポトーシスにおける成熟ＩＬ−１βの機能は、論争中である。ＩＬ−１βは、幾つかの系ではアポトーシスを誘導し(Onozaki et al.，Immun．135:3962-3968 (1985);Ankarcrona et al.，Exp．Cell Res．213:172-177(1994);Fratelli, M.，et al.，Blood 85:3532-3637(1995))、その他では妨害する(Be1izario & Dinarello，Cancer Res．51:2379-2385(1991);Strijbos & Rothwell，J. Neurosci．15:3468-3474(1985))ことが示されている。成熟ＩＬ−１βは、ＴＮＦ−α処理アポトーシス繊維芽細胞の培地にて検出されただけでなく、Shjgella flexneri感染の後にアポトーシスを受けるマクロファージの培地でも検出された(Zychlinsky，A.，et al.，J．Clin．Invest．94:1328(1994))。アポトーシス中の成熟ＩＬ−１β放出の検出は、ＩＣＥ欠損マウスで示されたようにインビボＩＣＥがproＩＬ−１βのプロセシングを担う主たる(そうでなければ唯一の)プロテアーゼであるから、細胞死においてＩＣＥ自身が活性化されていることの強力な証拠を提供するものである(Li，P.，et al.，Cell 80:401 (1995);Kuida，K.，et al.，Science 267:2000(1995))。腫瘍壊死因子腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、多能性殺腫瘍性サイトカインである (Tracey，K．J．et al.，Ann．Rev．Cell．Biol．9:317-343(1993))。ＴＮＦ− αのすばらしい機能の１つは、形質転換細胞のアポトーシスを誘導することである。非形質転換細胞では、ＴＮＦ−αは代謝阻害因子の存在下でもアポトーシスを誘導できる(Tracey，K．J．et al.，Ann．Rev．Cell．Biol．9:317-343 (1993))。ＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスは、bc1-2によっても抑制される。最も詳細にわたって研究されたＴＮＦ−α機能の１つは、広範囲の腫瘍細胞系に対するインビトロでのその細胞毒性である(Laster，S．M．et al.，J. Immunol．141:2629-2634(1988))。しかしながら、ＴＮＦによって誘導される細胞死の機構は、あまり知られていない。ヒーラー（HeLa）細胞は、細胞死シグナル形成を担うと考えられているｐ５５ＴＮＦ受容体を優先的に発現する (Englemann，H．et al.，J．Biol．Chem．265:14497-14504(1990))。更に、ヒーラー細胞は、代謝阻害因子シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下でＴＮＦ−αにより容易に殺される。ＴＮＦ−α/ＣＨＸにより誘導される細胞死は、ＤＮＡ断片化および細胞溶解を示し、これは、アポトーシスの典型的な特徴である (White，E．et al.，Mol．Cell．Biol．12:2570-2580(1992))。アデノウイルスＥＩＢ１９Ｋタンパク質の発現は、機能的にbcl-2と似ており、ヒーラー細胞においてＴＮＦにより誘導されるアポトーシスを阻害する(White，E．et al.,Mo l．Cell．Biol．12:2570-2580(1992))。発明の概要この度、ＩＬ−１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は栄養因子欠乏や低酸素症により誘導されるアポトーシスを阻害することが分かった。更に、成熟ＩＬ−１β自身は、ＣrmＡ感受性遺伝子活性とは無関係の経路により細胞死を誘導し、アポトーシスにおいてＩＣＥおよびＩＣＨ−１_Lと協同する。このように、本発明は、あらゆるアポトーシス誘導遺伝子の最初の基質としてproＩＬ−１ βを同定するものである。本発明は、第１に、ｍＩＬ−β受容体結合をブロックする工程を含む、プログラムされた細胞死の妨害方法に関する。好ましくは、ｍＩＬ−β受容体結合はＩＬ−ＩＲＡでブロックする。本発明は、更に、感染細胞におけるアポトーシスを刺激することを含む、発癌性形質転換の阻害方法に関する。好ましくは、アポトーシスはＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αで刺激する。本発明は、更に、ＩＣＥ経路およびｍＩＬ−１β産生を活性化することを含む、アポトーシスの調整方法に関する。本発明は、更に、ＩＬ−１がその受容体へ結合する前に細胞をプライミングすることを含む、アポトーシスの調整方法に関する。細胞のプライミングには、とりわけ、栄養因子欠乏、低酸素症、Ｇ１/Ｓ期停止の使用があり得る。その後、ＩＬ−１β処理する。本発明は、更に、ＩＬ−１受容体ブロッカーを使用する低酸素症誘導細胞死の阻害方法に関する。好ましくは、ＩＬ−１受容体ブロッカーは、ＩＬ−１Ｒａ、抗ＩＬ−１ポリクローナル中和抗体および抗ＩＬ−１Ｉ型受容体中和モノクローナル抗体からなる群から選択される。本発明は、更に、ＩＬ−１Ｒａの使用を含む、ＩＣＨ−１_Lから生じる細胞死の妨害方法に関する。使用法は提供されている。これらには、とりわけ、ヒトを含む動物の特定の身体器官の腫瘍を含む様々な病状の処理において細胞死を増大または低下するいずれかの方法がある。更に、発癌性細胞形質転換を阻害するためや、様々な器官において低酸素症または虚血に付随するアポトーシス関連の合併症を目的として、あるいはアポトーシスに影響を及ぼす作用物質をスクリーニングするために本発明を使用することができる。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｂ:低酸素症誘導アポトーシスは、ＣrmＡ、ＩＬ−１Ｒａ、抗ＩＬ −１Ａｂ、抗IＬ−１１型受容体抗体および成熟ＩＬ−１βにより阻害される。図１Ａ：ヒーラーおよびヒーラー/ＣrmＡ細胞を低酸素症条件下でＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１抗体およびＩＬ−１１型受容体抗体と共に１６時間インキュベーションした。結果は、４つの独立した実験の平均として表す。誤差バーは、ｓ. ｅ.ｍ.を示す。図１Ｂ：ＩＬ−ＩＲａは、ヒーラー細胞における¹²⁵ＩＩＬ− １β受容体をブロックする。図２：ＩＬ−１Ｒａは、栄養因子欠乏後のニューロン生存率を伸ばす。結果は、３つの独立した実験の平均として表す。誤差バーは、Ｓ.Ｅ.Ｍ.を示す。図３Ａ−３Ｉ：ＴＮＦ−αおよび成熟ＩＬ−１βにより誘導されるアポトーシスは、ＩＬ−１Ｒａ阻害可能経路により媒介される。図３Ａ：ＴＮＦ−α単独 (▲)およびＴＮＦ−α足すＩＬ−１Ｒａ(●)で処理したＬ９２９細胞における細胞死パーセント。図３Ｂ：ＨＵ停止ＴＮＦ−αにおける細胞死パーセント(記号は、図３Ａと同じ)。図３Ｃ：ＩＬ−処理ヒーラー細胞(▲)、ヒーラー/Ｃrm(■) およびＩＬ−１Ｒａで処理したヒーラー細胞(●)。結果は、３つの独立した実験の平均として表す。誤差バーは、Ｓ.Ｅ.Ｍ.を示す。凝縮し、断片化した核を示す、位相コントラストおよび蛍光顕微鏡写真：図３Ｄ：ＨＵ停止細胞、図３Ｅ：ＴＮＦ−αで処理、または図３Ｆ：ＩＬ−１β；およびヘキスト(Hoechst)染料で染色(図：３Ｇ−３Ｉ)。図４Ａ−４Ｄ：Ｉceは、ＣＯＳ細胞においてアポトーシスを誘導するために成熟ＩＬ−１β細胞外受容体結合を必要とする。細胞死パーセント(図４Ａ)およびＩce(図４Ｂ)、ＩceおよびProＩＬ−１β(図４Ｃ)、成熟ＩＬ−１βで処理したＩce(図４Ｄ)で３６時間トランスフェクション後、ＣＯＳ細胞のＸ−gal染色。結果は、３つの独立した実験の平均として表す。誤差バーは、ｓ.ｅ.ｍ.を示す。図５Ａ‐５Ｇ:proＩＬ−１β(図５Ａ−５Ｂ)、Ｉce(図５Ｃ−５Ｄ)またはpro ＩＬ−１βおよびＩce(図５Ｅ−５Ｇ)で一過性トランスフェクションさせたＣＯＳ細胞の免疫蛍光。proＩＬ−１βでトランスフェクションさせ、抗ヒトポリクローナルＩＬ−１抗体および二次ＲＩＴＣ結合抗体で免疫染色したＣＯＳ細胞は、それらの核形態と形態学的外観により示したとおり、生存状態である。Ｉceでトランスフェクションさせ、抗ヒトＩＣＥモノクローナル抗体および二次ＦＩＴＣコンジュゲート抗体で免疫染色した細胞は、形態学的に正常な外観であるが、その核は縮合しており、アポトーシス経路の開始が示唆されているが、ＩＬ−１ βの不在下では、それは完了できない。Ｉceと−proＩＬ−１βの両方が同時発現することにより、典型的なアポトーシスの特徴(縮合した核と丸い形態)が誘導される。図６Ａ−６Ｂ：図６Ａ：外来成熟ＩＬ−１β(ヒーラー/ＩＬ−１β)でのプレインキュベーションは、ヒーラー細胞における低酸素症媒介アポトーシスを阻害する。図６Ｂ：¹²⁵ＩＩＬ−１βは、ヒーラー細胞におけるＩＬ−１β受容体をダウンレギュレーションする。図７：Ｉch−Ｉ_LのｃＤＮＡ配列(配列番号１)およびＩch−Ｉ_Lタンパク質産物の推定アミノ酸配列(配列番号２)。詳細な説明下記の説明では、多くの用語を広義に使用している。明細書のより明瞭かつ矛盾のない理解を提供するために、下記説明を与える。定義Ｉce、ＩＣＥまたはＩchなどのイタリック体語は、遺伝子を表すのに対し、“ ＩＣＥ、ＩchまたはＩＣＨ”は対応する遺伝子によりコードされる遺伝子産物を表す。アポトーシスは、生物体が不要な細胞を排除するプロセスを表すと理解すべきである。このプロセスは、細胞プログラムにより慎重に調節される。アポトーシスにより、正常な発生、加齢、組織ホメオスタシスの際に、または低酸素症または栄養因子欠乏などの外部ストレスの負荷の後に、細胞を排除できる。低酸素症は、細胞が利用できる酸素濃度が正常レベルよりも低下する症状を表すと理解すべきである。最も極度の低酸素症は、殆ど全部の酸素が欠乏する(無酸素症と呼ぶ)。ＩＣＥ経路は、インターロイキン変換酵素がproＩＬβをＩＬ−βに変換し、最終的にプログラムされた細胞死をもたらす経路を表すと理解すべきである。ＩＬ−１媒介シグナル伝達をブロックするとは、ＩＬ−１受容体でＩＬ−１の作用をブロックするあらゆる化合物または化学を使用することを表すと理解すべきである。シグナル伝達は、例えば、抗ＩＬ−１ポリクローナル中和抗体または抗ＩＬ−１１型受容体中和モノクローナル抗体を含む免疫グロブリン(モノクローナルまたはポリクローナル抗体またはこのような抗体の活性フラグメントなど)によりブロックできる。あるいは、シグナル伝達は、例えば、ＩＬ−１受容体に結合する天然サイトカインであるＩＬ−１Ｒａを含む非免疫グロブリン化合物(ポリペプチド、有機化合物等など)によりブロックできる。あるいは、シグナル伝達は、ＩＬ−１βの競合または非競合阻害因子によりブロックできる。栄養因子欠乏は、細胞生存に欠かせない因子(例えば、血清またはＮＧＦ)の除去と理解すべきである。このような因子がなければアポトーシス経路は活性化される。Ｇ₁/Ｓ期停止は、細胞に起こる事象であり、細胞周期のＧ₁期からＳ期へ移行できないようにすると理解すべきである。Ｇ₁期からＳ期への移行は、細胞周期の最も重要な工程と考えられている(Chiarugi et al.，Cell．Mol．Biol．Res.4 0:603-612，1994)。アポトーシスを調整するとは、正または負方向のいずれかに細胞死のレベルを変えるあらゆる行為であると理解すべきである。このような変化を測定する方法は、当業者には容易に知られているが、とりわけ、トリパンブルー排除、クロミウム放出、原形質膜の水庖形成、核液および細胞質の凝縮およびヌクレオソーム間の間隔での染色体ＤＮＡの劣化を含む細胞形態の特定変化を含み得る。別の方法には、ＭＴＴ(３−[４,５−Ｄ,メチルーチアゾル−イル]−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー)アッセイなどの代謝アッセイまたはＦＡＣＳ分析による生存能測定がある。細胞をプライミングするとは、ＩＬ−１βが細胞死プログラムを活性化するのに必要な栄養因子欠乏、低酸素症またはＧ₁/Ｓ期停止などを細胞が受ける事象または処理であると理解すべきである。インビボでは、これに、細胞を“病気”、例えば病理学的状態にして、生物体から容易に除去されるようにするプロセスを含めてもよい。Ｉch−１_LおよびＩceは、細胞死遺伝子であると理解すべきである。Ｉch−１_L は、図７に示す配列(配列番号１および配列番号２)を有する。Ｉch−１_Lは、Ｉc h−１遺伝子のフラグメントである。このＩch−１遺伝子は、とりわけ、nedd２を含むその他の細胞死遺伝子と相同である。Ｉch−1は細胞死遺伝子のＱＡＣＲＧ配列特性を含有する。ヒトＩＣＥの配列は、Thornsberr et al.，Nature 356: 768-774，1992にみることができる。自然に起こる細胞死は、細胞数を調節し、形態発生を促進し、有害あるいは異常細胞を除去し、そして既にこれらの機能を実行している細胞を排除する働きをする。更に、プログラムされた細胞死は、低酸素症または虚血などの生理学的ストレスに応答して起こると考えられている。細胞死が急性的および慢性的に調節されないと、主要な多くのヒト疾患を導くと考えられている(Barr et al.，Biotech．12:487-493，1995)。これらの疾患には、限定ではないが、悪性および前悪性症状、神経学的疾患、心臓病、免疫系疾患、胃腸疾患、腎臓病および加齢がある。悪性および前悪性症状には、固腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球白血病、前立腺肥大、新生物発生前肝臓病巣および化学療法に対する耐性が含まれ得る。神経学的疾患には、発作、アルツハイマー病、プリオン関連疾患および毛細管拡張性運動失調が含まれ得る。心臓病には、虚血性心臓損傷および化学療法誘導心筋停止が含まれ得る。免疫系疾患には、ＡＩＤＳ、Ｉ型糖尿病、紅斑性狼瘉、シェーグレン症候群および糸球体腎炎が含まれ得る。胃腸疾患には、赤痢、炎症性腸疾患および放射線およびＨＩＶ誘導下痢が含まれ得る。腎臓病には、多嚢胞性腎臓疾患および貧血/赤血球生成が含まれ得る。調節されないアポトーシスを伴うこれらの病理学的症状に関する具体的な文献は、Barr et al.,前掲−表Ｉにみることができる。ＩＣＥ経路に関与する遺伝子や基質を知ることにより、細胞死に介入し、アポトーシスを変化させる手段が導かれる。このような知識はまた、アポトーシスプロセスに影響し得る作用物質のアッセイの開発も導くことができる。介入には、とりわけ、遺伝子産物の活性に影響を与える作用物質(例えば、受容体をブロックする作用物質)、アンチセンスオリゴヌクレオチド法などの遺伝子指向法を用いる遺伝子産物の調整、転写調節および遺伝子治療があり得る(Karp et al., Cancer Res．54:653-665(1994))。従って、アポトーシスは、治療的介入に対して敏感に反応すべきである。これに関し、我々は、プログラムされた細胞死の速度を増加させたいか、低下させたいかに合わせて、このプロセスを刺激することも阻害することもできる。ＩＣＥファミリーによるタンパク質分解性切断は、幾つかの方法でアポトーシスを導くこともあり得る。１つの可能性は、多数のタンパク質の切断が細胞機構を破壊することである。しかしながら、細胞がアポトーシスを受けるとき、殆どのタンパク質が無傷のままであるようなので、これは恐らく起こらない (Lazebnik et al.，Nature 371:346-347(1994))。第２の可能性は、極めて重要な１つの基質の切断により、細胞死が導かれることである。これもまた、proＩＬ−１βリボースポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)、Ｕ１−７０ｋＤリボ核タンパク質および核ラミンを含む多くのタンパク質がアポトーシス中に切断されるので、起こりそうにない(Miura，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．92:8318-8322 (1995);Lazebnik et al.，Nature 371:346-347(1994);Casciola-Rosen et al.，J．Biol．Chem．269:30757-30760(1994);Lazebnik，Y.A.，et al., Proc．Natl．Acad．Sci．92:9042-9046(1995)。これらのタンパク質の切断産物が、細胞死経路の下流事象を媒介するかどうか、またはこれらが単にアポトーシスの最終結果であるのかどうかは、(proＩＬ−１β以外は)明らかでない。第３の可能性は、ＩＣＥ経路の活性化であり、そのため、ＩＣＥファミリーは、数種の基質の切断をもたらすこともあり、幾つかは活性化され(細胞死を媒介し)、その他は破壊される(細胞生存に欠かせない)。この経路の活性化は、栄養因子欠乏、低酸素症、Ｇ₁/Ｓ停止またはＴＮＦ−α処理などの事象に起因して起こり得る。明細書の実施例で得られた結果は、最新の仮説に賛同するものであり、なぜならば、このデータは、体内で産生させた成熟ＩＬ−１βが細胞死に直接関与すること、および、その産物がアポトーシスカスケードの媒介において直接的な役割を果たす、アポトーシス誘導遺伝子の最初に同定された基質であることを示しているからである。しかしながら、この提唱された機構は、いかにしても本発明の請求の範囲を、このような機構による操作に対して限定するとみなすべきでない。更に、シグナル伝達機構の多くは、ＩＬ−１βの生物学的作用を媒介する。これらの二次メッセンジャーの幾つかは、アポトーシスに関係しており、ＩＣＥ活性化に続き、内因性成熟ＩＬ−１β受容体結合後の細胞死を媒介するらしい。そのため、受容体結合をブロックすることにより、アポトーシスは調整される。ＩＬ−１βは、ＥＬ４胸腺腫細胞におけるセラミド産生を誘導する(Mathias，S., et al.，Science 259:519-522(1993))。ＩＬ−１βもまた、膵臓Ｒ1m５Ｆ細胞において一酸化窒素産生を誘導するその能力に依存するある経路を介してアポトーシスを誘導する(Ankarcrona e tal.，Cell Res．213:172-177(1994))。セラミドおよび一酸化窒素はいずれも、アポトーシスの直接的なメディエーターとして強力な候補である(Ankarcrona et al.，Cell Res．213:172-177(1994); Haimovitz-Friedman，A.，et al.，J．Exp．Med．180:525-535(1994))。最近の報告では、ＰＣ１２細胞のＮＧＦ欠乏が、アポトーシスを誘導し、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの実質的な活性化を導くことが示された(Xia et al., Science 270:1326-1331(1995))。ＩＬ−１βは、ＪＮＫ−ｐ３８シグナル形成経路を活性化することが示されており、ＮＧＦ撤収(withdrawal)により、後にＪＮＫ−ｐ３８経路と細胞死を活性化するＩＬ−１βの分泌が誘導できる (Raingeaud，J.，et al.，J．Biol．Chem．270:7420-7426(1995))。ここまで、本発明を総括的に説明してきたが、例示目的で与えた、特記しない限り本発明の限定を意図するものではない、下記実施例を参照すれば、本発明はより容易に理解されるであろう。実施例Ｌ９２９およびヒーラー細胞中の一次脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンの栄養因子欠乏、低酸素症またはＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスにおける分泌成熟ＩＬ−１βの果たす役割を調べた。ＩＣＥおよびＩＣＨ−１_Lにより誘導されるアポトーシスにおけるproＩＬ−１βに対する要件もまた評価した。その結果は、体内で産生された成熟ＩＬ−１βがこれらのアポトーシスモデルにおいて肝要な役割を果たすことを示しており、ＩＣＥがproＩＬ−１βをプロセスする主要な(さもなければ唯一の)酵素であるから、これはアポトーシスにおけるＩＣＥの役割に対する更なる証拠を提供するものである。実施例１低酸素症の作用ＢＣＬ−２(Ｂ細胞リンパ腫−２遺伝子がコードするタンパク質)とｐ５３は、低酸素症媒介アポトーシスに関係している(Shimizu，S.，et al.，Nature 374: 811-813(1995);Jacobson & Raff，Nature 374:814-816(1995);Graeber，T. G.，et al.，Nature 379:88-91(1996))。ＩＣＥファミリーが低酸素症誘導アポトーシスに関与するかどうかを調べるために、ＣrmＡがこのプロセスを阻害できるかどうかを試験した。低酸素症誘導アポトーシスは、下記のようにして研究された。ヒーラーおよびヒーラー/ＣrmＡ細胞(Miura,M．et al.,Proc.Natl.Acad．Sci．U.S.A．92: 8318-8322，1995)を３５mm皿にＤＭＥＭ/１０％ＦＣＳ中６×１０⁴/皿の密度で接種し、一晩増殖させた。次いで、培地を変え、因子を加えた(ＩＬ−１Ｒａ(R& D，Minneapolis，MN)、ＩＬ−１抗体(Calbiochem，San Diego，CA)またはＩＬ −１１型受容体抗体(R & D，Minneapolis，MN))。皿をＢＢＬ GasPack Plus(B ecton-Dickenson，USA)付き嫌気性チャンバーに入れ、９０分以内に酸素濃度を１００p.p.m.以下に下げた。１６時間後、細胞をチャンバーから除き、直ちにトリプシン処理し、トリパン・ブルー排除により生存能についてスコアした。３７ ℃で２時間加えたＩＬ−１Ｒａによる¹²⁵ＩＩＬ−１βの阻害。培地にＢＳＡ( １mg/ml)を添加後、細胞を４℃で１５分間インキュベーションし、次いで、¹²⁵ ＩＬ−１β(１００ng/ml)を４℃で１時間加えた。¹²⁵ＩＬ−１β結合の検出用に、細胞を５０mMグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２.６で１分間処理し、γ−カウンティングにより定量した。低酸素症条件下で１６時間培養したヒーラー細胞の生存率は、ＣrmＡを安定に発現するヒーラー細胞(ヒーラー/ＣrmＡ)の生存率６９.０％と比べて１０.１％であった(図１ａ)。従って、ＩＣＥファミリーのＣrmＡ阻害可能構成員は、低酸素症誘導アポトーシスにおいて重要な役割を果たす。体内で産生された成熟ＩＬ −１βが低酸素症誘導細胞死において役割を果たすかどうかを目的として、ＩＬ −１がその受容体に結合するのを妨げる幾つかの方法を採用した。ＩＬ−１Ｒａ（ＩＬ−１受容体に結合し、ＩＬ−１媒介シグナル伝達をブロックする天然のサイトカイン)(Dripps，et al.，J．Biol．Chem．266:10331-10336(1991); Granowitz,et al.,J.Biol.Chem.266:14147-14150(1991))、抗ＩＬ−１ポリクローナル中和抗体および抗ＩＬ−１受容体中和モノクローナル抗体(１型受容体はＩＬ−１シグナル伝達を媒介する)を使用した。これらの試薬はそれぞれ低酸素症誘導細胞死を阻害し、このことは、低酸素症がＩＣＥ様ＣrmＡ阻害可能経路を活性化すること、および体内で産生された成熟ＩＬ−１βがＩＬ−１１型受容体に結合することにより低酸素症誘導細胞死においてある役割を果たすことを示している(図１ａ)。ＩＬ−１Ｒａが現実に¹²⁵ＩＬ−１β結合をブロックすることも評価および確認された(図１ｂ)(Dripps，e tal.，J．Biol．Chem. 266:10331-10336(1991);Granowitz，et al.，J．Biol．Chem．266:14147− 14150(1991))。実施例２脊髄神経節におけるアポトーシスおよび栄養因子欠乏次に、内因性ＩＬ−βのアポトーシスにおける役割を調べた。一次脊髄神経節 (ＤＲＧ)ニューロンは、ＮＧＦ撤収の際、培養中アポトーシスを受ける(Davies, A．M.，Development 100:1019(1987))。栄養因子欠乏によって誘導される鶏のＤＲＧニューロン死は、ＣrmＡにより阻害され、ＩＣＥファミリーの関与が示唆されることは既に示した(Gagliardi，V．et al.，Science 283:826-828 (1993))。体内で産生される成熟ＩＬ−１β、培養中ではニューロンによって産生される(Freidin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:10440-10443 (1994))、が栄養因子撤収媒介ＤＲＧニューロンアポトーシスにおいて何らかの役割を果たすかどうかを試験するために、ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト( ＩＬ−１Ｒａ)を使用した。ＩＬ−１ＲａはＩ型およびII型ＩＬ−１受容体に結合し、ＩＬ−１シグナルをブロックする(Dripps，D．J.，et al.，J．Biol. Chem．266:10331(1991);Granowitz，E．V.，et al.，J．Biol．Chem．266: 14147(1991))。ニューロン栄養因子欠乏は、下記のようにアッセイした。出生後１日のマウスＤＲＧニューロンを単離し、３７℃で１時間トリプシンで解離させ、８チャンバーポリリジン/ラミニン(Sigma，St．Louis，MO)コーティングスライドにのせる。ウェルにおよそ１０００ニューロン/ウェル(８ウェル／マウス)で接種する。ニューロンを、２０％ＦＣＳ(Biowhittaker，Walkesvill，MD)、ＮＧＦ(２００ ng/ml)(Sigma，St．Louis，MO)、ＢＤＮＦ(１００ng/ml)(Preprotech，Rocky Hill，NJ)、グリタミン(２ｍＭ)およびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したHam's栄養素Ｆ−１２中で培養した。培地は、飽和濃度のマウスＮＧＦモノクローナル抗体(１００ng/ml)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)およびＩＬ −ＩＲＡ(特記しない限り１００ng/ml)の存在下、栄養因子含有培地(ＴＦ(＋)＝２０％ＦＣＳおよびＮＧＦ(２００ng/ml))か栄養因子欠乏培地(ＴＦ(−)＝血清およびＮＧＦなしの培地)のいずれかと毎日取り替えた。培地交換後２４および４８時間で、位相差顕微鏡により健常ニューロンをカウントした。ＩＬ−ＩＲａ(１００ng/ml)は、栄養因子撤収誘導アポトーシスを２４および４８時間でそれぞれ６９.２％および３７.８％まで阻害した(図２)。ＩＬ−ＩＲａによるニューロンアポトーシスの阻害は、用量依存性であった(濃度４０ng/ml 、２４時間で４３.５％)。これらの結果は、体内で産生される成熟ＩＬ−１βが栄養因子撤収後に起こるニューロンアポトーシスにおいて役割を果たすことを示している。しかしながら、ニューロンが培養中に成熟ＩＬ−１βがを産生することが示されているとしても、この混合細胞集団における成熟ＩＬ−１βは非ニューロン起源のものでなとは言い切れない(Freidin，M.，et al.，Proc．Natl. Acad．Sci．U.S.A．89:10440(1992))。この理由で、幾つかの細胞ライン系を試験し、ＩＬ−１Ｒａが同様の抗アポトーシス特性を持つかどうかを測定した。実施例３ＴＮＦ−αおよびアポトーシスＴＮＦ−αは、ＣrmＡ阻害可能経路を経てアポトーシスを誘導する (Gagliardini，V.，et al.，Science 263:826(1993);Boudreau，N.，et al., Science 267:891(1995);Enari，M.，et al.，Nature 375:78(1995);Los, M．et al.，Nature 375:81(1995);Tewqry，M.，et al.，J．Biol．Chem. 270:3255(1955);Hsu，H.，et al.，Cell 81:495(1995))。更に、成熟ＩＬ −１βは、アポトーシスを受けているＴＮＦ−α処理細胞により分泌されることが示されており、これは、このプロセス中にＩＣＥが活性化されることを示唆している(Miura,M.，et al.，Proc．Natl.Acad．Sci．U.S.A．92:8318-8322, 1995)。Ｌ９２９およびヒーラー細胞のＴＮＦ−α誘導アポトーシスに役立つ分泌成熟ＩＬ−１βの役割を試験した。ヒーラー、ヒーラー/ＣrmＡおよびＬ９２９細胞を２４ウェルプレートに接種( ２×１０⁴)し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で一晩増殖させた。１２時間後、細胞を血清なしのＤＭＥＭで３回洗浄し、ヒドロキシ尿素(ＨＵ)(２.５ｍＭ)(Sigma，St．Louis，MO)をヒーラーおよびヒーラー/ＣrmＡ細胞に加えた (Meikrantz，W.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:3754(1994))。５時間後、ＩＬ−１Ｒａ(４０ng/ml)を適当なウェルに加え、１時間後、ＴＮＦ− αまたは成熟ＩＬ−１βのいずれかを加えた。２４時間後、ＩＬ−１Ｒａを適当なウェルに再度加え、ＨＵの初期添加後６０時間でトリパン・ブルー排除により細胞死を評価した。各条件は、二重に３回実施し、ウェル当り２００細胞をカウントした。写真用に細胞を２ウェルスライド上で増殖させ、核形態測定用に細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、ヘキスト(Hoechst)染料#33258(１０μg/ ml)(Sigma，St．Louis，MO)と共にインキュベーションした。ＩＬ−１Ｒａは、ＴＮＦ−α誘導死を６４.９％まで防御し、これは、成熟ＩＬ−１βの分泌および受容体結合がＴＮＦ−α誘導細胞死の肝要な成分であることを示唆している(図３ａ)。更に、ヒドロキシ尿素(ＨＵ)処理したＧ₁/Ｓ期停止ヒーラー細胞は、ＴＮＦ− αにより、プログラムされた細胞死を受けるように誘導される(Meikrantz，W.,e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:3754(1994))。この条件下でＩＬ− １Ｒａはまた、ヒーラー細胞死を５６.０％まで阻害した(図３ｂ)。ＴＮＦ−α およびシクロヘキサミドにより死滅するよう誘導されるヒーラー細胞はまた、ＩＬ−１Ｒａ並びに３種の異なる中和ＩＬ−１抗体(データ表示せず)により、防御された。ヒーラー/ＣrmＡ細胞は、５９.５％までＴＮＦ−α誘導アポトーシスから防御され、これは、ＩＣＥ様活性がこのサイトカインにより媒介される細胞死シグナル形成経路に関与することを示唆している(図３ｂ)。実施例４アポトーシスにおける成熟ＩＬ−１β 成熟ＩＬ−１β単独は、殆ど健常な増殖細胞(ヒーラーおよびＬ９２９を含む) のアポトーシスを誘導しない。ＩＬ−１βがＧ₁/Ｓ期停止細胞において細胞死を誘導するかどうかを試験するために、ＨＵ処理ヒーラー細胞をこのサイトカインに暴露した。外来成熟ＩＬ−１βで処理したＧ₁/Ｓ期停止ヒーラー細胞は、用量依存的(１００ng/mlで８３.７％)に死滅し、これはＩＬ−１Ｒａの添加により阻害された( 図３ｃ)。ＨＵ停止成熟ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α処理細胞は、細胞収縮、核凝縮および断片化という典型的なアポトーシス変化を受けた(図３ｄ−図３ｉ)。ヒーラー/ＣrmＡ細胞が成熟ＩＬ−１βから防御されないことは、それらがＴＮＦ−α殺傷由来であるので、興味深く、これは、成熟ＩＬ−１βがＩＣＥに対して遠位のアポトーシスカスケードを誘導すること、およびＨＵ処理細胞においてこのサイトカインがＩＣＥ依存経路を介して細胞死を引き起こすことを示唆している(図３ｃ)。これは、ＣrmＡは現実にＩＣＥ様機能をブロックすること、および成熟ＩＬ−１βの産生および分泌は、アポトーシスＴＮＦ−α/ＩＣＥカスケードの下流エフェクターであることを示している。しかしながら、成熟ＩＬ−１ β誘導アポトーシス対して過敏にさせる適当な細胞内環境を確立するためには、ヒーラー細胞を(この場合、ＨＵ停止で)プライミングさせる必要がある。ＨＵ処理は、アポトーシスカスケードの一部である細胞内シグナルと似ているようである。実施例５ proＩＬ−１βプロセシングおよびアポトーシス次に、proＩＬ−１βプロセシングがＩＣＥ媒介アポトーシスに必要であるかどうかを直接調べた。このために、ＣＯＳ細胞を使用した。この細胞は、ＩceおよびＩch−１_L過剰発現により誘導される細胞死に対して耐性であるので、珍しい(Wang,L.,et al.,Cell 78:739(1994))。ＣＯＳ細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、６ウェルプレートに入れた(２ ×１０⁴)。１２時間後、ウェルを血清および抗生物質なしの培地で洗浄し、Ｉce −ｌacＺ、Ｉch−１_L−ｌacＺ、βアクチン−ｌacＺ(１μg)またはProＩＬ−１ β(０.５μg)のいずれかで、３時間、リポフェクタミンを用いてトランスフェクションした。Ｉch−１_Lの配列は図７に示しており、ヒトＩＣＥおよびpro ＩＬ−１βの配列はそれぞれ、Thornsberry et al.，Nature 356:768-774 (1992)およびJ．Immunol．137:3644-3648，1986にある。次いで、培地を除去し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを加えた。次いで、適当なウェルにＩＬ−１Ｒａ (４０ng/ml)を加え、１時間後、ＩＬ−１β(１００ng/ml)を加えた。トランスフェクション後３６時間、Ｘ−gal反応を実施し、丸い青色(死滅)細胞の割合をスコアした(Miura，M.，et al.，Cell 75:653(1993))。Ｒat−１細胞へのＩceまたはＩch−１_Lのトランスフェクションは、２４時間以内に９４.２％および９２.１％の細胞死をそれぞれ誘導する(Wang，L.，et al.，Cell 78:739(1994))。反対に、一過的にＩce−ｌacＺ、Ｉch−１_L−ｌ acＺまたはproＩＬ−１β遺伝子を発現するＣＯＳ細胞は、それぞれ、９％、２１％および６.３％死滅した。しかしながら、Ｉce−ｌacＺおよびproＩＬ−１β またはＩch−１_L−ｌacＺおよびproＩＬ−１βを発現するＣＯＳ細胞は、それぞれ５１.０％および５７.３％死滅した。更に、Ｉce−ｌacＺまたはＩch−１_L− ｌacＺトランスフェクション細胞を成熟ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αで処理すると、効果的に細胞死を誘導した。Ｉce−ｌacＺトランスフェクション細胞をＩＬ −１βで処理した結果は、図４に示す。外来成熟ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αは、ＣＯＳ細胞におけるアポトーシスを誘導せず、これは、ＩＣＥおよびＩＣＨ− １_Lが細胞死に必要なproＩＬ−１β以外の基質を有すること、およびCＯＳ細胞では、ＩＣＥ活性化の後、アポトーシスを誘導するにはＩＬ−１βシグナル伝達が必要であることを示している。ＩＬ−１Ｒａは、細胞外ＴＮＦ−αまたは成熟ＩＬ−１βの存在下、Ｉce−ｌacＺおよびproＩＬ−１βまたはＩch−１_L−ｌac ＺおよびproＩＬ−１βを発現するＣＯＳ細胞の死滅と、Ｉce−ｌacＺまたはＩc h−１_L−ｌacＺの死滅を有意に阻害した。これは、ＩＣＥファミリー活性化後のアポトーシスの誘導における成熟ＩＬ−１βの役割を示している。ＩceおよびproＩＬ−１βで同時トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の(抗ＩＣＥおよび抗ＩＬ−１抗体での)二重免疫蛍光染色は、ＩＣＥおよびproＩＬ−１ βをいずれかのタンパク質単独ではなく両方発現する細胞のみが、アポトーシスを受けることを示している(図５)。Ｉceでトランスフェクションした細胞の核は、対照細胞の核よりも小さいことが一貫して注目された(図５ｃ)。これらの細胞は、その平坦な形態とプレートへの粘着性が示すとおり(図５ｄ)生存状態であり、これは、ＩＣＥはアポトーシスプロセスを始動するが、細胞死経路を完全に実行するには更なる因子(即ち、成熟ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−α)を必要とすることを示唆している。二重免疫蛍光染色法は、下記のとおりであった。ＣＯＳ細胞(１.５×１０⁴)をポリリジンコーティングした２チャンバースライドに置き、１２時間後、上記のようにトランスフェクションさせた。細胞を３６時間後、４％パラホルムアルデヒド(１５分)で固定し、ＰＢＳ中１％熱不活性化ヤギ血清/２％ＢＳＡで(２時間 )ブロックし、ウサギポリクローナルＩＬ−１(１：３００)(Calbiochem)およびハイブリドーマ上清マウスモノクローナルヒトＩＣＥ抗体でインキュベーションし、チャンバーをＰＢＳで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ−標識抗体、ヤギ抗ウサギＲＩＴＣ標識抗体(１：２００)(Cappel)およびヘキスト染料 #33258(１０μg/ml)と共に４５分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで３回濯いだ。スライドをaxioplan顕微鏡で調べ、４０×対物レンズで写真を撮った。実施例６低酸素症誘導アポトーシスの阻害外来成熟ＩＬ−１βプレインキュベーションは、ＩＣＥ活性化と成熟ＩＬ−１ β受容体結合がアポトーシスにとって重要である系において細胞死を阻害するかどうかを測定した。低酸素症は、実施例１に記載のようにして発症させた。細胞を低酸素状態チャンバー(１００p.p.m.の酸素濃度に到達するには９０分必要である)に入れながら、ＩＬ−１β(１００ng/ml)を加えた。ＩＬ−１受容体結合アッセイ：ヒーラー細胞(１０⁶)を１０cm皿に接種し、一晩増殖させた。次いで、培地を４℃で一時間、１mg/mlＢＳＡおよび１００ng/ml¹²⁵ＩＩＬ−１βを入れて交換した。冷培地で２回洗浄後、細胞を３７℃で０、３０、６０および１２０分間、新しい温培地と共にインキュベーションした。次いで、細胞を上記のようにグリシンで処理し、放射能をスコアした。外来ＩＬ−１βでプレインキュベーションしたヒーラー細胞は、顕著に低酸素症誘導細胞死から防御された(生存率１０.１％対５８.７％)(図６ａ)。ＩＬ−１ βによるアポトーシスの阻害を説明するために、アポトーシス刺激にさらす前にこの系において外来ＩＬ−１βと共にインキュベーションするとＩＬ−１受容体をダウンレギュレーションするかどうかを調べた。実際、受容体結合アッセイは、外来ＩＬ−１βがＩＬ−１受容体を有意にダウンレギュレーションしたことを示した(図６ｂ)。ＩＬ−１受容体のダウンレギュレーションは、アポトーシス誘導前に加えた場合の外来ＩＬ−１βの防御的役割を一部説明している。アポトーシスに対するＩＬ−１β受容体結合の作用は、ＩＣＥが活性である(細胞死を増強する)かどうか、またはＩＣＥが不活性である(ＩＬ−１受容体を一部ダウンレギュレーションすることにより胞死を阻害する)かどうかに左右される。実施例に与えた結果により、proＩＬ−１βは細胞死に直接関与するアポトーシス誘導遺伝子の第１基質であり、そのプロセシング、分泌および細胞外受容体結合はＩＣＥアポトーシスカスケードにおいて肝要な役割を果たすことが同定された。ＩＬ−１βは、共にアポトーシスに関与することが示されているセラミドおよび／または一酸化窒素産生を誘導することにより細胞死を引き起こすと考えられる(Mathias，S.，et al.，Science 259:519(1993);Haimovitz-Friedman, et al.，J．Exp．Med．180:525(1994);Ankarcrona，M.，et al.，Exp．Cell Res．213:172(1994))。これらの結果は、様々なアポトーシス刺激(栄養因子欠乏、低酸素症およびＴＮＦ−α)がＩＣＥ(またはその他のＩＬ−１β変換酵素)を活性化すること、および細胞死はＩＣＥ活性をＣrmＡでブロックするか、ＩＬ− １β受容体結合をＩＬ−１Ｒａでブロックするかのいずれかにより阻害できることを再確認するものである。ＩＬ−１Ｒａがアポトーシスを十分に阻害しなかったという事実は、恐らく次の理由から起こる。ほんの少し(細胞当りおよそ５)のＩＬ−１受容体の占有がＩＬ−１生物学的応答の完全な活性化に必要である(Dinarello，C.A.，FASEB J. 8:1314(1994))から、競合阻害因子であるＩＬ−１Ｒａは、恐らく、全てのＩＬ −１βをその受容体から十分にはずすのではなく、細胞の一部を単に保護するだけである。あるいは、ＩＣＥ活性化後、成熟ＩＬ−１βは、セラミドおよび／または一酸化窒素の誘導を介して、細胞死経路を増強し、そしてアポトーシスの遅延をもたらすこれらのシグナルを排除するという働きをするのかもしれない。更に、外来成熟ＩＬ−１βで処理した殆どの細胞は死滅せず、このことは、更なる基質のプロセシングを導くＩＣＥファミリー活性化が細胞死にとって必要条件であることを示唆している。明らかに、成熟ＩＬ−１βは、ＩＣＥファミリーを活性化できず、これが、ＴＮＦ−αとは違う特徴である。しかしながら、細胞を適切にプライミングする条件下、成熟ＩＬ−１β単独は、Ｇ₁/Ｓ期停止ヒーラー/ ＣrmＡ細胞において成熟ＩＬ−１βにより誘導されるアポトーシスにより示したようにＩＣＥ活性の不在下でさえ、細胞死を誘導する。更に、ＩＣＨ−１_Lは、成熟ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αにさらした際、ＣＯＳ細胞において活性化されるようになると思われる。意外にも、ＩＣＨ−１_Lは、proＩＬ−１βと同時発現した場合、ＩＬ−１Ｒａに感受性の細胞死を誘導し、このことは、ＩＣＨ−１_L が、それ自身で、またはもう一つのＩＣＥ様プロテアーゼの両方とも高濃度で存在する場合は、もう一つのＩＣＥ様プロテアーゼによるかのいずれかで、proＩＬ−１βをプロセスすることを示している。アポトーシスにおけるＩＣＥの明確な役割を指摘する上記結果からみて、ＩＣＥノックアウトマウスが発生的に正常であることは、興味深い(Li，P.，et al., Cell 80:401-411(1995);Kuida，K.，et al.，Science 267:2000-2002 (1995))。これまで、このマウスで報告されたアポトーシスに対する唯一の耐性は、抗Ｆａｓ媒介胸腺細胞死の場合である(kuida，K.，et al.，Science 267: 2000-2002(1995))。しかしながら、ＩＣＥ−ced-３ホモロジー数を常に増大している唯一の一員のみをノックアウトすると、顕著なアポトーシス表現型を産生しないことは、細胞自殺などの重要かつ最終的なプロセスの過剰さを考慮すれば、意外なことではない。ＩＬ−１βはまた、インビボでウイルス感染細胞におけるアポトーシスの誘導に関与し得る。幾つかのウイルスは、ＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−α活性のいずれかのサプレッサーを発現することが同定されている。牛痘ＣrmＡ遺伝子以外の例は、ポックスウイルスによって発現されるＴＮＦ−α結合タンパク質である(Smith，C．A.，et al.，Science 248:1019(1990))。ワクシニアおよび牛痘ウイルスは、分泌されたＩＬ−１β結合タンパク質を発現する(Spriggs，M. K.，et al.，Cell 71:145(1992);Alcami & Smith，Cell 71:153(1992))。これらのウイルスタンパク質は、免疫応答を下方調整することが示されており、これを欠失するとウイルス毒性は低下する。免疫調節作用以外に、これらのモデュレーターは、ＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αシグナルを排除して、細胞死前にウイルスが複製のために細胞機構を使用できるようにすることにより、感染細胞におけるアポトーシスを阻害できる。このことはまた、アポトーシスの阻害によるウイルス媒介発癌性形質転換にとって起こりうる機構を示唆している。このような機構を知ることにより、発癌性形質転換細胞を殺す方法を導くことができる。本結果の更なる関連性は、高レベルのＩＬ−１βメッセージが大脳虚血のラットモデルで検出されていることである(Lui，T.，et al.，Stroke 24:1746 (1993);Buttini，M．et al.，Molec．Brain．Res．23:126(1994))。別のラットモデルでは、ＩＬ−１Ｒａが虚血後５０％まで脳梗塞サイズを小さくすることが示された(Relton & Rothwell，Brain Res．Bull．29:243(1992))。更に、アルツハイマー病およびダウン症候群の患者の脳は、高レベルのＩＬ−１βを有する(S ue,W.，et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．86:7611(1989))。これらの事実は、成熟ＩＬ−１βが虚血症状下および神経変性疾患においてニューロン細胞死経路を媒介するのに関与していることを示唆する。このことは、成熟ＩＬ−１βが細胞死プログラムを活性化するために、細胞は(栄養因子欠乏ニューロンにおいて、低酸素症またはＧ₁/Ｓ期停止ヒーラー細胞において、更に、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βを持つＬ９２９細胞において)“プライミング”される必要があるという意見と類似するかもしれない。インビボで“プライミングされた”細胞という概念は、生物体の負担となる病気の細胞と言い換えることができ、細胞利他主義の例では、ＩＣＥ経路が活性化され、成熟ＩＬ−１βの産生を導き、細胞自殺において頂点に達する。成熟ＩＬ−１βは、細胞ホメオスタシスにおいて中枢的役割を果たす。それは、アポトーシスカスケードの調整と免疫系の活性化の両方であり、それぞれ不要な細胞の殺傷(execution)と排除に関与するプロセスである。結論インターロイキン−１β変換酵素(ＩＣＥ)ファミリーは、脊椎動物細胞死の調節において重要な役割を果たす。これまで、細胞死を媒介する、アポトーシス誘導遺伝子の基質は、なんら同定されていなかった。proＩＬ−１βは、ＩＣＥの唯一知られた生理学的基質である。ＩＣＥ媒介アポトーシスにおける成熟ＩＬ−１βの二重機能的役割が確認された。体内で(即ち、ＩＣＥ活性化の後)産生される場合、ＩＬ−１βは細胞死を媒介するが、外部から提供された場合、ＩＬ−１βは細胞死を刺激または阻害することができる。更に、成熟ＩＬ−１β自身は、ＣrmＡ感受性遺伝子活性とは無関係の経路を介して細胞死を誘導し、アポトーシスにおいてＩＣＥおよびＩＣＨ− １_Lと協同する。更に、ＩＬ−１βは、アポトーシス刺激への暴露前にその受容体に結合した場合、プログラムされた細胞死を(ＩＬ−１受容体をダウンレギュレーションすることにより)阻害したが、反対に、ＩＬ−１βは、ＩＣＥが活性化された後に結合した場合、細胞死を増強したことも示された。ＩＬ−１受容体アンタゴニスト (ＩＬ−１Ｒａ)は、一次ニューロンにおける栄養因子欠乏や繊維芽細胞における低酸素症またはＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスを阻害する。更に、Ｉceは、ＣＯＳ細胞においてアポトーシスを誘導するためにproＩＬ− １βの同時発現を必要とすることが明らかにされた。細胞死は、ＩＬ−１βがその受容体に結合するのをブロックすることによって阻害され、このことは、ＩＣＥ活性化後、ＣＯＳ細胞が自殺プログラム完了のためにＩＬ−１βシグナル伝達を必要としたことを示している。これらの結果は、体内で産生された成熟ＩＬ− １βは、ＩＣＥ媒介アポトーシスにおいて肝要な役割を果たすことを証明した。よって、１)ＩＬ−１βは、アポトーシス刺激にさらす前に外来的に添加すると、抗アポトーシス活性を持ち、これはＩＬ−１受容体ダウンレギュレーションに一部起因しており、２)proＩＬ−１βのＩＣＥ切断は、アポトーシスにおいて重要な工程であり、そして３)成熟ＩＬ−１βは、細胞死の正または負のメディエーターとして機能できる。これらの事実から、proＩＬ−１βはアポトーシス誘導遺伝子の第１基質であり、その切断生成物は、アポトーシスカスケードの下流メディエーターであって、アポトーシスにおけるＩＣＥの役割について更なる証拠を提供するものであると同定される。明細書中の文献は全て、出典明示により本明細書の一部とする。ここまで、本発明を明瞭な理解のために例示および実施例により十分に説明してきたが、ある種の変更や修飾が開示dq実施態様においてなされ得ること、およびこのような修飾が本発明の範囲内であると意図されることは当業者には明らかである。例として、好ましい実施態様は、請求の範囲の発明を実施するほんの一形態を構成しているにすぎない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Programmed cell death and interleukin-1β Background of the Invention STATEMENT OF RIGHTS TO INVENTIONS MADE UNDER UNITED STATES SUPPORTED R & D Some of the work performed during the development of the present invention utilized U.S. government funds. United States The government has certain rights in the invention. Field of the invention The present invention is in the field of molecular biology for the control of programmed cell death. Description of the background art Programmed cell death Apoptosis is also called programmed or regulated cell death The process by which an organism eliminates unwanted cells. Such cell death is It occurs as a normal aspect of animal development, similar to meostasis and aging (Glucksmann, A ., Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc. 26-: 59-86 (1950); Ellis et al., Dev. 112: 591-603 (1991); Vaux et al., Cell 76: 777-779 (1994)). Programmed Cell death also regulates cell number, promotes morphogenesis, and eliminates harmful or abnormal cells. And can eliminate cells that are already performing these functions. Change In addition, programmed cell death can be caused by various physiological strikes, such as hypoxia or ischemia. It is thought to occur in response to a response. The morphological features of apoptosis include Plasma membrane blistering, nuclear fluid and cytoplasmic condensation and internucleosomal spacing Chromosomal DNA degradation at (inter-nucleosomal intervals) (Wyllie, AH, in Cell Death in Biology and Pathology, Bowen and Lockshin, eds., Chapman and Hall (1981), pp. 9-34). Apoptosis is achieved via an endogenous mechanism of cell suicide (Wyllie, AH, in Cell Death in Bio1ogy and Pathology, Bowen and Lockshin, eds., Chapman and Hall (1981), pp. 9-34), depending on the result of either an internal or external signal Occurs when a cell activates a suicide program encoded within it. Suicide The program is accomplished by activation of a carefully regulated gene program (Wyllie, A.H., et al., Int. Rev. Cyt. 68: 251 (1980); Ellis, R.E., et. al., Ann. Rev. Cell Bio. 7: 663 (1991)). Cell death depends on RNA or protein synthesis. In many cases, gene expression is required because it can be blocked by inhibiting (Coehn et al., J. Immunol. 32: 38-42 (1984); Stanisic et al., Invest. Urol. 16: 19-22 (1978); Martin et al., J. Am. Cell Bio 1. 106: 829-844 (1988)). The genetic pathway of programmed cell death was first introduced into the nematode C. elegans. Was identified. In this worm, the products of the ced-3 and ced-4 genes cause cell suicide. (Yuan & Horvitz, Dev. Bio. 138: 33 (1990)). Interleukin-1β converting enzyme The mammalian homolog of the ced-3 gene product is interleukin-1β (IL-1β) -1β converting enzyme, a cysteine protease responsible for the activation of (ICE) (Thornberry, NA, et al., Nature 356: 768 (1992); Yuan, J., et al., Cell 75: 641 (1993); Miura, M., et al., Cell 75: 653. (1993)). This Ice gene is a member of a gene family. Mammal ICE / C The ed-3 family currently comprises at least six: ICE, ICH-1 / NEDD2, CPP32 / Yama / Apopain, TX / ICEreIII / ICH-2, ICEreIIII and And MCH2 (Yuan et al., Cell 75: 641-652 (1993); Wang et al., Cell 78: 739-750 (1994); Kumar et al., Genes Dev. 8: 1613-1626 (1994); Fernandes-Alnermi et al., J. Biol. Chem. 269: 30761-30764 (1994); Tewari, M., et al., Cell 81: 801-809 (1995); Nicholson, D., et al., Nature 376: 37-43 (1995); Fausheu, C., et al., J. Am. Biol. Chem. 269: 30761-30764 (1994); Munday, N.A., et al., J. Biol. Chem. 270: 15870-15876 (1995); Kamens, J., et al. Biol. Chem. 270: 15250-15256 (1995); Fernandes- Alnermi, et al., Canc. Res 55: 2737-2742 (1994)). Interleukin-1β converting enzyme (ICE) is an inactive 31 KD Leukin-1β to Asp¹¹⁶-Ala¹¹⁷At the carboxy terminal 153 amino acids Release the peptide to release the mature 17.5 kD interleukin-1β (IL-1β) It is a substrate-specific cysteine protease that is produced (Kostura et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 5227-5231 (1989); Black et al., FEBS Lett. 247: 386-390 (1989); Cerretti et al., Science 256: 97-100 (1992); Thornberry et al., Nature 356: 768-774 (1992)). This is because of its active site system. Protein family in which in residues are essential for ICE-mediated apoptosis Therefore, their proteolytic activity is critical in mediating cell death. (Miura et al., J. Cell 75: 653-660 (1993)). IL-1β is inflamed, defeated Wide range of organisms, including blood shock, wound healing, hematopoiesis and the development of certain leukemias Is also a cytokine involved in mediating biological responses (Dinarello, CA, Blood 77: 1627-1652 (1991); diGiovine et al., Today 11:13 (1990)). The crmA gene product of cowpox virus, a specific inhibitor of ICE, is IL-1 interferes with the proteolytic activation of β (Ray et al., Cell 69: 597-604 (1992)). It also inhibits the primary inflammatory response (Ray et al., Cell 69: 597-604 (1992)). crmA gene The deleted cowpox virus cannot suppress the inflammatory response of chick embryos, Causes a decrease in the number of cells and less damage to the host (Palumbo et al., Virology 171: 262-273 (1989)). This observation indicates that ICs that trigger an inflammatory response This shows the importance of E. ICE overexpression induces apoptosis and mature IL-1β is released upon cell death. (Miura, M., et al., Cell 75: 653 (1993); Miura, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8318-8322, (1995)). Serpi Cowpox virus gene product C, a member of the rmA also interferes with apoptosis (Miura, M., et al., Cell 75: 653 (1993); Miura, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (During printing); Ray, C.E. A., et al., Cell 69: 597 (1992); Gagliardini, V., et al., Science 263: 826. (1993); Boudreau, N., et al., Science 267: 891 (1995); Enari, M., et al., Nature 375: 78 (1995); Los, M., et al., Nature 375: 81 (1995)). Furthermore, CrmA Apoptosis-inhibiting ability correlates with its ability to inhibit mature IL-1β production. Recent news Reportedly, tumor necrosis factor-α (TNF-α) -induced apoptosis was reduced by CrmA-inhibition. Has been shown to be mediated via a possible pathway, suggesting involvement of the ICE family (Tewary, M., et al., J. Biol. Chem. 270: 3255 (1995); Hsu, H., et al., Cell 81: 495 (1995); Miura, M., et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. (During printing)). Although the critical role of the ICE family in cell death is well recognized, The function of mature IL-1β in apoptosis is controversial. IL-1β is Some systems induce apoptosis (Onozaki et al., Immun. 135: 3962-3968). (1985); Ankarcrona et al., Exp. Cell Res. 213: 172-177 (1994); Fratelli, M., et al., Blood 85: 3532-3637 (1995)), and others interfere (Be1izario & Dinarello, Cancer Res. 51: 2379-2385 (1991); Strijbos & Rothwell, J. Neurosci. 15: 3468-3474 (1985)). Mature IL-1β is derived from TN Not only was detected in the medium of F-α treated apoptotic fibroblasts, but also in Shjgella Detected even in macrophage media undergoing apoptosis after flexneri infection (Zychlinsky, A., et al., J. Clin. Invest. 94: 1328 (1994)). Apoptosis Of mature IL-1β release in mice was detected in vivo as shown in ICE-deficient mice. ICE is the primary (or otherwise only) processor responsible for processing proIL-1β. Because it is a Rotase, it is important that ICE itself is activated in cell death. Provides strong evidence (Li, P., et al., Cell 80: 401). (1995); Kuida, K., et al., Science 267: 2000 (1995)). Tumor necrosis factor Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a pluripotent tumoricidal cytokine (Tracey, K. J. et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 9: 317-343 (1993)). TNF- One of the great functions of α is to induce apoptosis in transformed cells. You. In untransformed cells, TNF-α is apoptotic even in the presence of metabolic inhibitors (Tracey, KJ et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 9: 317-343). (1993)). Apoptosis induced by TNF-α is also suppressed by bc1-2. It is. One of the most thoroughly studied TNF-α functions is the widespread tumor cell line Is its cytotoxicity in vitro against (Laster, SM et al., J. Am. Immunol. 141: 2629-2634 (1988)). However, the finesse induced by TNF The mechanism of blast death is poorly known. Healer (HeLa) cells, cell death signal Preferentially expresses the p55TNF receptor, which is thought to be responsible for the formation of (Englemann, H. et al., J. Biol. Chem. 265: 14497-14504 (1990)). In addition, Cells are converted to TNF-α in the presence of the metabolic inhibitor cycloheximide (CHX). Killed more easily. Cell death induced by TNF-α / CHX is due to DNA breaks. Shows hemilysis and cell lysis, which are typical features of apoptosis (White, E. et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2570-2580 (1992)). Adenovirus The expression of EIB 19K protein is functionally similar to bcl-2, Inhibits apoptosis induced by TNF in mice (White, E. et al., Mo. l. Cell. Biol. 12: 2570-2580 (1992)). Summary of the Invention This time, IL-1β receptor antagonist (IL-1Ra) has a nutritional factor deficiency and It was found to inhibit apoptosis induced by hypoxia. More mature IL-1β itself induces cell death by a pathway independent of CRMA-sensitive gene activity. ICE and ICH-1 in apoptosis_LCooperate with. in this way The present invention provides proIL-1 as the first substrate for any apoptosis-inducing gene. This is to identify β. The present invention provides a method comprising, first, blocking mIL-β receptor binding. A method of preventing rammed cell death. Preferably, the mIL-β receptor binding is I Block with L-IRA. The present invention further provides for carcinogenesis, including stimulating apoptosis in infected cells. A method of inhibiting sexual transformation. Preferably, apoptosis is IL-1β and And / or stimulate with TNF-α. The invention further includes activating the ICE pathway and mIL-1β production. And a method for regulating apoptosis. The invention further provides for priming the cell before IL-1 binds to its receptor. And a method for regulating apoptosis. For priming cells, In particular, trophic factor deficiency, hypoxia, the use of G1 / S arrest may be possible. afterwards, Perform IL-1β treatment. The present invention further provides for the prevention of hypoxia-induced cell death using IL-1 receptor blockers. It relates to the inhibition method. Preferably, the IL-1 receptor blocker is IL-1Ra, Anti-IL-1 polyclonal neutralizing antibody and anti-IL-1 type I receptor neutralizing monoclonal Selected from the group consisting of internal antibodies. The present invention further relates to ICH-1 comprising the use of IL-1Ra._LCell death resulting from About the method of interference. Usage is provided. These include, inter alia, the specific identity of animals, including humans. Does not increase or decrease cell death in the treatment of various medical conditions, including tumors of body organs There is one way. In addition, to inhibit carcinogenic cell transformation, For apoptosis-related complications associated with hypoxia or ischemia in Alternatively, to screen for agents that affect apoptosis Ming can be used. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1A-1B: Hypoxia-induced apoptosis is determined by CrA, IL-1Ra, anti-IL -1 Ab, inhibited by anti-IL-1 type 1 receptor antibody and mature IL-1β . FIG. 1A: Healer and Healer / CrmA cells were isolated from IL-1R under hypoxic conditions. a, Incubation with IL-1 antibody and IL-1 type 1 receptor antibody for 16 hours Was done. Results are expressed as the average of four independent experiments. Error bars are s. e.m. FIG. 1B: IL-IRa is expressed in healer cells¹²⁵I IL- Blocks 1β receptor. FIG. 2: IL-1Ra increases neuronal survival after trophic factor deficiency. Result is , Expressed as the average of three independent experiments. Error bars indicate SEM. Figures 3A-3I: Apoptosis induced by TNF-α and mature IL-1β Is mediated by the IL-1Ra inhibitory pathway. Fig. 3A: TNF-α alone (▲) and LNF cells treated with TNF-α plus IL-1Ra (●) Spore death percentage. Figure 3B: Percent cell death in HU-arrested TNF-α (symbol Is the same as FIG. 3A). Figure 3C: IL-treated healer cells (▲), healer / Crm (■) And Healer cells treated with IL-1Ra (●). The results are three independent experiments Expressed as the average of Error bars indicate SEM. Shows condensed and fragmented nuclei FIG. 3D: HU arrested cells, FIG. 3E: Treated with TNF-α, or FIG. 3F: IL-1β; and Hoechst dye (Figure: 3G-3I). Figures 4A-4D: Ice was formed to induce apoptosis in COS cells. Requires mature IL-1β extracellular receptor binding. Percent cell death (FIG. 4A) and Ice (FIG. 4B), Ice and ProIL-1β (FIG. 4C), treated with mature IL-1β X-gal staining of COS cells after transfection with Ice (FIG. 4D) for 36 hours. Results are expressed as the average of three independent experiments. Error bars indicate sem . 5A-5G: proIL-1β (FIGS. 5A-5B), Ice (FIGS. 5C-5D) or pro CO transiently transfected with IL-1β and Ice (FIGS. 5E-5G) Immunofluorescence of S cells. transfected with proIL-1β, COS cells immunostained with lonal IL-1 antibody and secondary RITC binding antibody , As shown by their nuclear morphology and morphological appearance. At Ice Transfected, anti-human ICE monoclonal antibody and secondary FIT Cells immunostained with the C-conjugated antibody have a morphologically normal appearance, The nucleus is condensed, suggesting the initiation of the apoptotic pathway, but IL-1 In the absence of β, it cannot be completed. Both Ice and -proIL-1β occur simultaneously Reveals typical apoptotic features (condensed nuclei and round morphology) Is done. 6A-6B: FIG. 6A: Pre-maturation with exogenous mature IL-1β (Healer / IL-1β). Incubation inhibits hypoxia-mediated apoptosis in healer cells I do. FIG. 6B:¹²⁵I IL-1β is an IL-1β receptor in healer cells Down-regulate. Figure 7: Ich-I_LCDNA sequence (SEQ ID NO: 1) and Ich-I_LProtein products Deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2). Detailed description In the description that follows, a number of terms are used in a broad sense. Clearer and inconsistent specification The following description is provided to provide an unobstructed understanding. Definition Italic words such as Ice, ICE or Ich represent genes, whereas " ICE, Ich or ICH "is the gene product encoded by the corresponding gene Represents Apoptosis should be understood as representing the process by which an organism eliminates unwanted cells It is. This process is carefully regulated by the cell program. Apotosi During normal development, aging, tissue homeostasis, or hypoxia or Can eliminate cells after external stress such as trophic factor deficiency. Hypoxia is a condition in which the level of oxygen available to cells drops below normal levels. It should be understood. The most extreme hypoxia is deprived of almost all oxygen (no Called oxygen.) In the ICE pathway, the interleukin converting enzyme converts proILβ to IL-β, It should be understood that it represents the pathway that ultimately leads to programmed cell death. Blocking IL-1 mediated signaling is the act of blocking IL-1 at the IL-1 receptor. It should be understood that this refers to the use of any compound or chemistry that blocks the action. It is. Signaling can be performed, for example, by neutralizing an anti-IL-1 polyclonal neutralizing antibody or Immunoglobulin (monoclonal antibody containing anti-IL-1 type 1 receptor neutralizing monoclonal antibody) Such as a clonal or polyclonal antibody or an active fragment of such an antibody. ). Alternatively, signal transduction is, for example, IL-1 receptor Non-immunoglobulin compounds comprising IL-1Ra, a natural cytokine that binds to the body Substance (polypeptide, organic compound, etc.). Or, Signa Transmission can be blocked by competitive or non-competitive inhibitors of IL-1β. Nutrient factor deficiency is a factor in factors that are essential for cell survival (eg, serum or NGF). Should be understood as removal. Without such factors, the apoptotic pathway is activated Is done. G₁/ S phase arrest is an event that occurs in the cell,₁Shift from period to period S It should be understood that it cannot be done. G₁The transition from phase to S phase is the cell cycle (Chiarugi et al., Cell. Mol. Biol. Res. 4 0: 603-612, 1994). Regulating apoptosis refers to the level of cell death in either the positive or negative direction. It should be understood as any action that changes. How to measure such changes Are readily known to those skilled in the art, but include, among others, trypan blue exclusion, Release, plasma membrane blistering, nuclear fluid and cytoplasmic condensation and nucleosomes It may involve specific changes in cell morphology, including degradation of chromosomal DNA at intervals between. Another person The method includes MTT (3- [4,5-D, methyl-thiazol-yl] -2,5-diphenyl Metabolic assays such as tetrazolium bromide; Indicates viability measurement by FACS analysis. Priming cells means that IL-1β activates a cell death program. Nutritional factor deficiency, hypoxia or G₁/ S phase arrest etc. Or process. In vivo, this translates into "disease" For example, the process of bringing a pathological condition so that it is easily removed from the organism May be included. Ich-1_LAnd Ice are to be understood as cell death genes. Ich-1_L Has the sequences shown in FIG. 7 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). Ich-1_LIs Ic It is a fragment of the h-1 gene. This Ich-1 gene is, inter alia, nedd2 And other cell death genes. Ich-1 is the cell death gene QACR Contains G sequence characteristics. The sequence of human ICE can be found in Thornsberr et al., Nature 356: 768-774, 1992. Naturally occurring cell death regulates cell number, promotes morphogenesis, Works to remove normal cells and eliminate cells that are already performing these functions I do. In addition, programmed cell death can cause physiological disorders such as hypoxia or ischemia. It is thought to happen in response to Torres. Uncontrolled cell death acutely and chronically leads to many major human diseases (Barr et al., Biotech. 12: 487-493, 1995). For these diseases Include, but are not limited to, malignant and pre-malignant conditions, neurological disorders, heart disease, immune system disorders There are illness, gastrointestinal disease, kidney disease and aging. Malignant and premalignant symptoms include solid tumors, B-cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, Prostate hyperplasia, preneoplastic liver foci, and resistance to chemotherapy may be included. God Transological disorders include seizures, Alzheimer's disease, prion-related disorders and capillary dilation Ataxia may be included. Heart disease includes ischemic heart damage and chemotherapy-induced myocardium An outage may be included. Immune system diseases include AIDS, type I diabetes, erythematous fox, -Glen's syndrome and glomerulonephritis can be included. Gastrointestinal disorders include dysentery, inflammatory bowel Diseases and radiation and HIV-induced diarrhea can be included. Polycystic kidney in kidney disease Includes organ disease and anemia / erythropoiesis. With unregulated apoptosis Specific literature on these pathological conditions can be found in Barr et al., Supra-Table I. be able to. By knowing genes and substrates involved in the ICE pathway, we can intervene in cell death and A means for changing the tosis is derived. Such knowledge can also be The development of assays for agents that can affect the process can also be guided. Interventions include: In particular, agents that affect the activity of the gene product (e.g., block the receptor) Use a gene-directed method such as the antisense oligonucleotide method. There may be regulation of gene products, transcriptional regulation and gene therapy (Karp et al., Cancer Res. 54: 653-665 (1994)). Therefore, apoptosis is Should be sensitive. In this regard, we consider the programmed rate of cell death. To stimulate this process according to whether you want to increase or decrease the degree Can also be inhibited. Proteolytic cleavage by the ICE family can be performed in several ways. Can lead to One possibility is that cleavage of many proteins is a cellular mechanism. Is to destroy. However, when cells undergo apoptosis, This probably won't happen, as some proteins will remain intact (Lazebnik et al., Nature 371: 346-347 (1994)). The second possibility is extremely important Cleavage of one substrate leads to cell death. This is also proI L-1β ribose polymerase (PARP), U1-70 kD ribonucleoprotein and Many proteins are cleaved during apoptosis, including nuclear and nuclear lamin, Unlikely (Miura, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 8318-8322). (1995); Lazebnik et al., Nature 371: 346-347 (1994); Casciola-Rosen et. al., J. et al. Biol. Chem. 269: 30757-30760 (1994); Lazebnik, Y.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 9042-9046 (1995). Cleavage products of these proteins Whether they mediate downstream events in the cell death pathway, or It is not clear (except for proIL-1β) whether this is the end result of the procedure. Third Is the activation of the ICE pathway, so that the ICE family Some may be activated (mediate cell death) and may be cleaved. Others are destroyed (essential for cell survival). Activation of this pathway leads to trophic factor deficiency , Hypoxia, G₁Can occur due to events such as / S suspension or TNF-α processing . The results obtained in the examples of the specification are in agreement with the latest hypothesis and why. The data suggest that mature IL-1β produced in the body is directly involved in cell death. And its products play a direct role in mediating the apoptotic cascade To be the first identified substrate of apoptosis-inducing gene Because there is. However, this proposed mechanism is in any way an object of the present invention. The claims should not be deemed to be limited to operation by such mechanisms. . In addition, many signaling mechanisms mediate the biological effects of IL-1β. This Some of these second messengers are involved in apoptosis and ICE activity Following sexualization, it appears to mediate cell death following endogenous mature IL-1β receptor binding. So Therefore, apoptosis is regulated by blocking receptor binding. I L-1β induces ceramide production in EL4 thymoma cells (Mathias, S., et al., Science 259: 519-522 (1993)). IL-1β is also a pancreatic R1m5F cell Apoptosis in some plants depends on its ability to induce nitric oxide production (Ankarcrona etal., Cell Res. 213: 172-177 (1994)). Cerami And nitric oxide are both direct mediators of apoptosis Strong candidate (Ankarcrona et al., Cell Res. 213: 172-177 (1994); Haimovitz-Friedman, A., et al. Exp. Med. 180: 525-535 (1994)). Recent It has been reported that NGF deficiency in PC12 cells induces apoptosis, and JNK and It has been shown to lead to substantial activation of p38 MAP kinase (Xia et al., Science 270: 1326-1331 (1995)). IL-1β is processed through JNK-p38 signal formation. Pathways, and withdrawal of NGF later resulted in JN Induces IL-1β secretion that activates the K-p38 pathway and cell death (Raingeaud, J., et al., J. Biol. Chem. 270: 7420-7426 (1995)). Up to this point, the present invention has been described in general terms. The present invention is not intended to limit the present invention as long as it is referred to the following examples. It will be more easily understood. Example Nutrition of primary spinal ganglion (DRG) neurons in L929 and healer cells Factors in apoptosis induced by factor deficiency, hypoxia or TNF-α The role played by the mature IL-1β was examined. ICE and ICH-1_LGuided by The requirement for proIL-1β in the induced apoptosis was also evaluated. That The results indicate that mature IL-1β produced in the body is not involved in these apoptotic models. ICE processes proIL-1β. Since this is the major (or otherwise only) enzyme, It provides further evidence for the role of CE. Example 1 Effects of hypoxia BCL-2 (protein encoded by the B cell lymphoma-2 gene) and p53 Involved in hypoxia-mediated apoptosis (Shimizu, S., et al., Nature 374: 811-813 (1995); Jacobson & Raff, Nature 374: 814-816 (1995); Graeber, T .; G., et al., Nature 379: 88-91 (1996)). ICE family is hypoxia-inducing apo To determine whether it is involved in toosis, CrmA can inhibit this process. Was tested. Hypoxia-induced apoptosis was studied as follows. Healer and Healer / CrmA cells (Miura, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8318-8322, 1995) in a 35 mm dish at 6 × 10 in DMEM / 10% FCS.^Four/ Dish density Inoculated and grown overnight. Then, the medium was changed and the factors were added (IL-1Ra (R & D, Minneapolis, MN), IL-1 antibody (Calbiochem, San Diego, CA) or IL -1 type 1 receptor antibody (R & D, Minneapolis, MN). Place the dish in BBL GasPack Plus (B ecton-Dickenson, USA) and put oxygen concentration within 90 minutes Reduced to 100p.p.m. or less. After 16 hours, remove the cells from the chamber and immediately Lipsinized and scored for viability by trypan blue exclusion. 37 By IL-1Ra added at 2 ° C. for 2 hours¹²⁵I Inhibition of IL-1β. BSA ( (1 mg / ml), the cells were incubated at 4 ° C. for 15 minutes, then¹²⁵ IL-1β (100 ng / ml) was added at 4 ° C. for 1 hour.¹²⁵For detection of IL-1β binding The cells were treated with 50 mM glycine-HCl, pH 2.6 for 1 minute, Quantification was carried out by aging. The survival rate of Healer cells cultured for 16 hours under hypoxic condition shows that CrmA is stable. 10.1% compared to 69.0% viability of expressed healer cells (Healer / CrmA) (FIG. 1a). Thus, the members of the ICE family that can inhibit CrA are low acid Plays an important role in predisposition-induced apoptosis. Mature IL produced in the body To determine whether -1β plays a role in hypoxia-induced cell death, IL Several methods were employed to prevent -1 from binding to its receptor. IL-1Ra (Natural proteins that bind to the IL-1 receptor and block IL-1 mediated signaling) Itokine) (Dripps, et al., J. Biol. Chem. 266: 10331-10336 (1991); Granowitz, et al., J. Biol. Chem. 266: 14147-14150 (1991)), anti-IL-1 polyclonal Neutralizing antibody and anti-IL-1 receptor neutralizing monoclonal antibody (type 1 receptor (Which mediates IL-1 signaling). Each of these reagents Inhibits hypoxia-induced cell death, which indicates that hypoxia can inhibit ICE-like CrmA Activating the pathway and mature IL-1β produced in the body Plays a role in hypoxia-induced cell death by binding to type 1 receptors (FIG. 1a). IL-1Ra is a reality¹²⁵Block IL-1β binding (FIG. 1b) (Dripps, et al., J. Biol. Chem. 266: 10331-10336 (1991); Granowitz, et al., J. Am. Biol. Chem. 266: 14147- 14150 (1991)). Example 2 Apoptosis and trophic factor deficiency in spinal ganglia Next, the role of endogenous IL-β in apoptosis was examined. Primary spinal ganglia (DRG) neurons undergo apoptosis in culture upon NGF withdrawal (Davies, A. M., Development 100: 1019 (1987)). Chicken D induced by trophic factor deficiency RG neuron death is inhibited by CrmA, suggesting involvement of the ICE family. (Gagliardi, V. et al., Science 283: 826-828 (1993)). Mature IL-1β produced in the body, produced by neurons in culture (Freidin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10440-10443 (1994)), but some of the factors in trophic factor withdrawal-mediated DRG neuron apoptosis To test whether it plays a role, a human IL-1 receptor antagonist ( IL-1Ra) was used. IL-1Ra binds to type I and type II IL-1 receptors And block the IL-1 signal (Dripps, DJ, et al., J. Biol. Chem. 266: 10331 (1991); Granowitz, E .; V., et al. Biol. Chem. 266: 14147 (1991)). Neuronal trophic factor deficiency was assayed as described below. Mouse one day after birth DRG neurons were isolated, dissociated with trypsin at 37 ° C. for 1 hour, 8 chambers. -Polylysine / Laminin (Sigma, St. Louis, MO) coated slides . Wells are inoculated with approximately 1000 neurons / well (8 wells / mouse). Neurons were treated with 20% FCS (Biowhittaker, Walkesvill, MD), NGF (200 ng / ml) (Sigma, St. Louis, MO), BDNF (100 ng / ml) (Preprotech, Rocky Hill, NJ), supplemented with Glitamine (2 mM) and Penicillin / Streptomycin And cultured in Ham's nutrient F-12. The medium was saturating mouse NGF monoclones. Lonal antibody (100 ng / ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) and IL -In the presence of IRA (100 ng / ml unless otherwise specified), nutrient factor-containing medium (TF (+) = 20% FCS and NGF (200 ng / ml) or nutrient factor deficient medium (TF (-) = serum And medium without NGF) daily. 24 after medium exchange and At 48 hours, healthy neurons were counted using a phase contrast microscope. IL-IRa (100 ng / ml) inhibited trophic factor withdrawal-induced apoptosis by 24 and It inhibited by 69.2% and 37.8% respectively at 48 hours (FIG. 2). IL-IR a inhibition of neuronal apoptosis was dose-dependent (concentration 40 ng / ml , 43.5% over 24 hours). These results indicate that mature IL-1β produced in the body Plays a role in neuronal apoptosis following trophic factor withdrawal are doing. However, neurons produce mature IL-1β in culture. However, mature IL-1β in this mixed cell population is non-nuclear. It cannot be said that it is of origin from Freon (Freidin, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10440 (1992)). For this reason, several cell line systems have been tried. To determine if IL-1Ra had similar anti-apoptotic properties. Example 3 TNF-α and apoptosis TNF-α induces apoptosis via the CrmA inhibitory pathway (Gagliardini, V., et al., Science 263: 826 (1993); Boudreau, N., et al., Science 267: 891 (1995); Enari, M., et al., Nature 375: 78 (1995); Los, M. et al., Nature 375: 81 (1995); Tewqry, M., et al., J. Am. Biol. Chem. 270: 3255 (1955); Hsu, H., et al., Cell 81: 495 (1995)). In addition, mature IL -1β is secreted by TNF-α treated cells undergoing apoptosis Is shown, suggesting that ICE is activated during this process. (Miura, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8318-8322, 1995). L929 and TNF-α induced apoptosis of healer cells The role of the mature IL-1β was tested. Inoculate Healer, Healer / CrmA and L929 cells into 24-well plate ( 2 × 10^Four) And grown overnight in DMEM containing 10% FCS. 12 hours later, The cells were washed three times with DMEM without serum and treated with hydroxyurea (HU) (2.5 m). M) (Sigma, St. Louis, MO) was added to Healer and Healer / CrmA cells (Meikrantz, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3754 (1994)). 5 After one hour, IL-1Ra (40 ng / ml) was added to an appropriate well, and one hour later, TNF-Ra was added. Either α or mature IL-1β was added. After 24 hours, IL-1Ra Again by adding trypan blue 60 hours after the initial addition of HU. Cell death was assessed. Each condition was performed in triplicate, yielding 200 cells per well. I did it. Cells were grown on two-well slides for photography and cells for nuclear morphometry. Was fixed in 4% paraformaldehyde and Hoechst dye # 33258 (10 μg / ml) (Sigma, St. Louis, MO). IL-1Ra protects TNF-α-induced death by 64.9%, indicating that mature I L-1β secretion and receptor binding are vital components of TNF-α-induced cell death. (FIG. 3a). Furthermore, hydroxyurea (HU) treated G₁/ S phase arrest healer cells are TNF- is induced to undergo programmed cell death by α (Meikrantz, W., e t al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3754 (1994)). Under these conditions, IL- 1Ra also inhibited Healer cell death by 56.0% (FIG. 3b). TNF-α Healer cells induced to die by cyclohexamide and cyclohexamide also Protected by L-1Ra and three different neutralizing IL-1 antibodies (data not shown) Was done. Healer / CrmA cells show up to 59.5% TNF-α induced apoptosis That ICE-like activity is mediated by this cytokine. It is suggested to be involved in the signal formation pathway (FIG. 3b). Example 4 Mature IL-1β in apoptosis Mature IL-1β alone produces almost healthy proliferating cells (including Healer and L929) Does not induce apoptosis of IL-1β is G₁Cell death in / S-phase arrested cells To test for induction, HU-treated healer cells were treated with this cytokine. Exposure. G treated with exogenous mature IL-1β₁/ S phase arrest healer cells are dose-dependent (1 (83.7% at 00 ng / ml), which was inhibited by the addition of IL-1Ra ( FIG. 3c). HU-arrested mature IL-1β and TNF-α treated cells show cell shrinkage, nuclear It undergoes typical apoptotic changes of condensation and fragmentation (FIGS. 3d-3i). The lack of protection of Healer / CrmA cells from mature IL-1β indicates that they Interesting because it is derived from F-α killing, this is because mature IL-1β To induce a distant apoptotic cascade and in HU-treated cells Suggesting that this cytokine causes cell death via an ICE-dependent pathway (FIG. 3c). This is because CrmA actually blocks ICE-like functions. Production and secretion of mature IL-1β is dependent on the apoptotic TNF-α / ICE This indicates that it is a downstream effector of the mode. However, mature IL-1 In order to establish a suitable intracellular environment that sensitizes against β-induced apoptosis, Healer cells need to be primed (in this case with HU arrest). HU place The theory appears to be similar to intracellular signals that are part of the apoptotic cascade. You. Example 5 proIL-1β processing and apoptosis Next, is proIL-1β processing required for ICE-mediated apoptosis? I checked directly. For this, COS cells were used. These cells are Ice and And Ich-1_LUnusual because it is resistant to cell death induced by overexpression (Wang, L., et al., Cell 78: 739 (1994)). COS cells were placed in 6-well plates in DMEM containing 10% FCS (2 × 10^Four). After 12 hours, the wells were washed with medium without serum and antibiotics and -LacZ, Ich-1_L-LacZ, β-actin-lacZ (1 μg) or ProIL-1 β (0.5 μg) for 3 hours using Lipofectamine Was taken. Ich-1_LThe sequence of is shown in FIG. The sequence of IL-1β is Thornsberry et al., Nature 356: 768-774, respectively. (1992) and J.M. Immunol. 137: 3644-3648, 1986. Then remove the medium DMEM containing 10% FCS was added. Then, IL-1Ra was added to an appropriate well. (40 ng / ml) and 1 hour later, IL-1β (100 ng / ml) was added. Troff An X-gal reaction was performed 36 hours after injection, and the percentage of round blue (dead) cells was determined. Cored (Miura, M., et al., Cell 75: 653 (1993)). Ice or Ich-1 on Rat-1 cells_L24 hours transfection Induces 94.2% and 92.1% cell death, respectively (Wang, L., et al. al., Cell 78: 739 (1994)). Conversely, transiently, Ice-lacZ, Ich-1_L−l COS cells expressing the acZ or proIL-1β genes are 9% and 2%, respectively. 1% and 6.3% died. However, Ice-lacZ and proIL-1β Or Ich-1_LCOS cells expressing lacZ and proIL-1β were Killed 51.0% and 57.3%. Further, Ice-lacZ or Ich-1_L− Treating lacZ transfected cells with mature IL-1β or TNF-α Effectively induced cell death. Ice-lacZ transfected cells were The result of processing with -1β is shown in FIG. Foreign mature IL-1β and TNF-α Does not induce apoptosis in COS cells, which is 1_LHas a substrate other than proIL-1β required for cell death, and COS cells Now, to induce apoptosis after ICE activation, IL-1β signaling Is required. IL-1Ra is extracellular TNF-α or mature Ice-lacZ and proIL-1β or Ich-1 in the presence of IL-1β_L−lac Killing COS cells expressing Z and proIL-1β, and Ice-lacZ or Ic h-1_L-It significantly inhibited the killing of lacZ. This is due to the ICE family activation Figure 2 illustrates the role of mature IL-1β in inducing apoptosis. Of COS cells co-transfected with Ice and proIL-1β (anti-I Double immunofluorescent staining (with CE and anti-IL-1 antibodies) was performed with ICE and proIL-1 Apoptosis occurs only in cells that express both β and not either protein alone (FIG. 5). The nucleus of cells transfected with Ice , Were consistently noted to be smaller than control cell nuclei (FIG. 5c). These cells Is alive as indicated by its flat morphology and adhesion to the plate (FIG. 5d). This indicates that ICE triggers the apoptotic process, but does not fully execute the cell death pathway. Requires additional factors (i.e., mature IL-1β or TNF-α) And suggests. The double immunofluorescence staining was as follows. COS cells (1.5 × 10^Four) Place on a polylysine-coated two-chamber slide and 12 hours later, As described above. After 36 hours, cells are treated with 4% paraformaldehyde. Hyd (15 min) and fixed with 1% heat-inactivated goat serum / 2% BSA in PBS (2 h ) Blocked, rabbit polyclonal IL-1 (1: 300) (Calbiochem) and Incubation with hybridoma supernatant mouse monoclonal human ICE antibody The chamber was washed three times with PBS and the goat anti-mouse FITC-labeled antibody, goat Anti-rabbit RITC-labeled antibody (1: 200) (Cappel) and Hoechst dye Incubated with # 33258 (10 μg / ml) for 45 minutes. Cells were washed with PBS 3 Rinsed twice. Slides were examined with axioplan microscope and photographed with 40x objective . Example 6 Inhibition of hypoxia-induced apoptosis The exogenous mature IL-1β pre-incubation is effective for ICE activation and mature IL-1 Does beta-receptor binding inhibit cell death in systems that are important for apoptosis? Was measured. Hypoxia was developed as described in Example 1. Reduce cells to hypoxia Into the chamber (it takes 90 minutes to reach an oxygen concentration of 100 p.p.m.) , IL-1β (100 ng / ml) was added. IL-1 Receptor Binding Assay: Healer Cells (10⁶) Was inoculated into a 10 cm dish and grown overnight. The medium is then temporarily stored at 4 ° C Between 1 mg / ml BSA and 100 ng / ml¹²⁵I IL-1β was added and replaced. cold After washing twice with medium, cells were incubated at 37 ° C. for 0, 30, 60 and 120 minutes in fresh warm water. Culture medium And incubated with it. The cells are then treated with glycine as described above. , Radioactivity was scored. Healer cells pre-incubated with exogenous IL-1β showed marked hypoxia. Protected against disease-induced cell death (viability 10.1% vs. 58.7%) (FIG. 6a). IL-1 Before Exposure to Apoptotic Stimuli to Explain the Inhibition of Apoptosis by β Incubation with exogenous IL-1β in this system results in IL-1 receptor Was examined to determine whether it was down-regulated. In fact, the receptor binding assay Show that exogenous IL-1β significantly down-regulated IL-1 receptor. (FIG. 6b). Down-regulation of IL-1 receptor induces apoptosis Partly describes the protective role of exogenous IL-1β when added before induction. Apoto The effect of IL-1β receptor binding on cis is that ICE is active (increases cell death). ICE is inactive (partially down-regulates the IL-1 receptor). Regulation of bleeding death). According to the results given in the examples, proIL-1β is directly involved in cell death. The first substrate of the cis-inducible gene, its processing, secretion and extracellular receptors Binding Identified to Play a Critical Role in the ICE Apoptosis Cascade Was. IL-1β is a ceramide that has both been shown to be involved in apoptosis And / or induces cell death by inducing nitric oxide production (Mathias, S., et al., Science 259: 519 (1993); Haimovitz-Friedman, et al., J. Amer. Exp. Med. 180: 525 (1994); Ankarcrona, M., et al., Exp. Cell Res. 213: 172 (1994)). These results indicate that various apoptotic stimuli (trophic factor deficiency) , Hypoxia and TNF-α) may cause ICE (or other IL-1β converting enzymes) Activating and cell death can be achieved by blocking ICE activity with CrmA or IL- That 1β receptor binding can be inhibited either by blocking with IL-1Ra. And reconfirmation. The fact that IL-1Ra did not sufficiently inhibit apoptosis probably suggests that Happens for reasons. Only a small (about 5 per cell) occupancy of the IL-1 Required for full activation of L-1 biological response (Dinarello, C.A., FASEB J. 8: 1314 (1994)), the competitive inhibitor IL-1Ra is probably all IL Rather than fully remove -1β from its receptor, it simply protects a part of the cell It is. Alternatively, after ICE activation, mature IL-1β may contain ceramide and / or Enhances cell death pathways and induces apoptosis through induction of nitric oxide It may act to reject these signals that cause prolongation. Change In addition, most cells treated with exogenous mature IL-1β did not die, indicating that ICE family activation leading to substrate processing is a prerequisite for cell death Suggest that there is. Clearly, mature IL-1β activates the ICE family. This is a different feature from TNF-α. However, cells Under conditions of acute priming, mature IL-1β alone is G₁/ S period stop healer / Indicated by apoptosis induced by mature IL-1β in CrmA cells Induces cell death, even in the absence of ICE activity. Furthermore, ICH-1_LIs Activated in COS cells when exposed to mature IL-1β or TNF-α I think it will be. Surprisingly, ICH-1_LIs co-expressed with proIL-1β Induced cell death that is sensitive to IL-1Ra, indicating that ICH-1_L Are present at high concentrations on their own or both of the other ICE-like proteases If present, either with another ICE-like protease, proI It shows that L-1β is processed. In view of the above results, which point out a clear role of ICE in apoptosis, IC It is interesting that E knockout mice are developmentally normal (Li, P., et al., Cell 80: 401-411 (1995); Kuida, K., et al., Science 267: 2000-2002. (1995)). Until now, the only resistance to apoptosis reported in this mouse Is the case of anti-Fas-mediated thymocyte death (kuida, K., et al., Science 267: 2000-2002 (1995)). However, always increasing the number of ICE-ced-3 homology Knocking out only one member produces a pronounced apoptotic phenotype. The lack is that given the excess of important and final processes such as cell suicide, Not surprising. IL-1β also induces apoptosis in virus-infected cells in vivo May be involved. Some viruses have IL-1β and / or TNF-α activity Has been identified to express any of the above suppressors. Cowpox CRMA gene Other examples are the TNF-α binding proteins expressed by poxviruses. (Smith, CA, et al., Science 248: 1019 (1990)). Vaccinia and cowpox The virus expresses a secreted IL-1β binding protein (Spriggs, M .; K., et al., Cell 71: 145 (1992); Alcami & Smith, Cell 71: 153 (1992)). these Of viral proteins have been shown to down-regulate the immune response, Deletion reduces viral toxicity. In addition to immunomodulatory effects, these Exclusion of IL-1β and / or TNF-α signals prior to cell death By allowing the virus to use cellular machinery for replication, infected cells Can inhibit apoptosis in This is also due to the inhibition of apoptosis. Suggest a possible mechanism for virus-mediated oncogenic transformation. This Knowing such mechanisms can lead to ways to kill oncogenically transformed cells . A further relevance of this result is that high levels of IL-1β messages are (Lui, T., et al., Stroke 24: 1746 (1993); Buttini, M .; et al., Molec. Brain. Res. 23: 126 (1994)). Another rat In a model, IL-1Ra can reduce cerebral infarct size by 50% after ischemia (Relton & Rothwell, Brain Res. Bull. 29: 243 (1992)). In addition, Alz The brains of patients with Heimer's disease and Down's syndrome have high levels of IL-1β (S ue, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 7611 (1989)). These facts Mature IL-1β is a neuronal cell death pathway under ischemic conditions and in neurodegenerative diseases Suggests that it is involved in mediating This indicates that mature IL-1β Cells are activated in trophic factor-deficient neurons to activate the blast death program. , Hypoxia or G₁In healer cells arrested in / S phase, TNF-α or Need to be "primed" (in L929 cells with IL-1β) May be similar. "Primed" cells in vivo The concept can be paraphrased as diseased cells that burden the organism. In the example of cellular altruism, the ICE pathway is activated, leading to the production of mature IL-1β. Guide and culminate in cell suicide. Mature IL-1β is responsible for cellular homeostasis Plays a pivotal role in It regulates the apoptotic cascade and the immune system Are both involved in the execution and elimination of unwanted cells. Process. Conclusion The interleukin-1β converting enzyme (ICE) family regulates vertebrate cell death. Plays an important role in clauses. To date, apoptosis has been induced to mediate cell death. No substrate for the transgene was identified. proIL-1β is from ICE It is the only known physiological substrate. Dual Functional Role of Mature IL-1β in ICE-Mediated Apoptosis Confirmed Was. When produced in the body (ie, after ICE activation), IL-1β mediates cell death. IL-1β stimulates or inhibits cell death when provided externally be able to. Furthermore, mature IL-1β itself is independent of the activity of the CrmA sensitive gene. Induces cell death through the pathway of engagement and induces ICE and ICH- in apoptosis. 1_LCooperate with. Furthermore, IL-1β binds to its receptor prior to exposure to an apoptotic stimulus. If programmed cell death (down-regulates IL-1 receptor) Conversely, IL-1β was bound after ICE activation. When combined, it was also shown to enhance cell death. IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is expressed in trophic factor deficiency in primary neurons and in fibroblasts. Inhibits apoptosis induced by hypoxia or TNF-α. In addition, Ice is proIL- to induce apoptosis in COS cells. It was revealed that co-expression of 1β was required. Cell death occurs when IL-1β By blocking binding to the receptor for After E-activation, COS cells undergo IL-1β signaling to complete the suicide program It is indicated that it was necessary. These results indicate that mature IL- produced in the body 1β has proven to play a vital role in ICE-mediated apoptosis. Therefore, 1) IL-1β may be added exogenously prior to exposure to apoptotic stimuli. Has anti-apoptotic activity, which is responsible for IL-1 receptor down regulation. 2) ICE cleavage of proIL-1β is critical in apoptosis. A key step, and 3) mature IL-1β is a positive or negative mediator of cell death. Can function as a From these facts, proIL-1β is the first substrate of the apoptosis-inducing gene. And its cleavage products are downstream mediators of the apoptotic cascade Provides further evidence for the role of ICE in apoptosis Is identified. All documents in the specification are hereby incorporated by reference. So far, the book Although the invention has been fully described by way of illustration and example for a clear understanding, That various changes and modifications can be made in the disclosed dq embodiments, and that such modifications It will be apparent to one skilled in the art that the decoration is intended to be within the scope of the present invention. As an example Thus, the preferred embodiments constitute only one mode of carrying out the claimed invention. It's just that.

Claims

[Claims] 1. A method of preventing programmed cell death, comprising blocking IL-1β receptor binding. 2. 2. The method of claim 1, wherein IL-1Ra is used for receptor blocking. 3. 2. The method of claim 1, wherein cell death is blocked in a vertebrate. 4. 3. The method of claim 2, wherein the method blocks cell death in a vertebrate. 5. A method of modulating apoptosis, comprising activating the ICE pathway and IL-1β production. 6. 6. The method of claim 5, comprising priming the cells prior to activation of the ICE pathway. 7. Priming, nutritional factor deprivation, hypoxia, is selected from the group consisting of G ₁ / S phase arrest, the method according claim 6. 8. Cells are treated with IL-l [beta] after the G ₁ / S phase arrest Method according Claim 7. 9. A method of preventing cell death resulting from ICH-1 _L comprising the use of IL-1Ra. 10. A method of altering the level of hypoxia-induced cell death, comprising blocking IL-1 mediated signaling. 11. 11. The method of claim 10, wherein the agent is selected from the group consisting of IL-1Ra, an anti-IL-1 polyclonal neutralizing antibody and an anti-IL-1 type 1 receptor neutralizing monoclonal antibody. 12. A method of killing oncogenically transformed cells, comprising stimulating apoptosis with IL-1β or TNF-α. 13. A method of inhibiting hypoxia-induced cell death comprising cell transfection with CrmA. 14． A method of regulating apoptosis by down-regulating the IL-1 receptor.