JP2000502734A - 分離剤として充填可能ポリマー溶液を使用するキャピラリー電気泳動分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ５０から６００mPa・sの粘性を有する、(ａ)１０から３０重量％の１０００００より小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー、(ｂ)５０重量％までの水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少なくとも２０重量％の水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物、本組成物は荷電有機化合物、特に低分子量オリゴヌクレオチドの混合物を分離するためのキャピラリー電気泳動装置のキャピラリーにおける固定相として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 分離剤として充填可能ポリマー溶液を使用する キャピラリー電気泳動分離法 本発明は、５０から６００mPa・sの粘性を有する、(ａ)１０から３０重量％ の１０００００より小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー、 (ｂ)５０重量％までの水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少な くとも２０重量％の水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物；キャピラリ ーの固定相として本組成物を使用することを含む、少なくとも３００から約５０ ０００の範囲の分子量を有する有機化合物の混合物のキャピラリー電気泳動分離 法；固定相として本組成物を使用する電気泳動分離装置用キャピラリーおよび電 気泳動分離装置のキャピラリーに再充填できる固定相としての本組成物の使用に 関する。 例えば、オリゴヌクレオチドの分離のために固定相としてゲルを使用するキャ ピラリー電気泳動は既知であり、とりわけA．Paulus et al.，Journal of Chrom atography 507，(1990)，113-123頁に記載されている。ポリアクリルアミドを基 本にするゲルは、キャピラリーに重合可能で架橋可能な水性緩衝液を直接充填し 、続いて重合化させることにより製造する。ポリマーはキャピラリー表面に、典 型的にメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランである架橋剤で共有結合し ている。約１２から５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの場合に良好 な分離が達成される。反復分離操作後、キャピラリーの浄化が費用が懸かりすぎ るか、不可能であり、またキャピラリーの固定相を置換(廃棄する)ことができな いため、キャピラリーは、更に使用することができない。分離過程中、小泡がし ばしば形成され、分離を完全に損なうか、不可能なほど減じ、従って、固定相の 置換が必要となる。固定相はまた、分離を常に新しい固定相で行うことができな い場合、記載方法でのように必要な高い再生が保証できない程、試験サンプルに より不純となる。 ＷＯ９５／１８８１３は、少なくとも１２％(重量／容量)のポリマー、尿素、 有機溶媒および適当な場合、１６.２％までの水を含むキャピラリー電気泳動用 組成物を記載し、その組成物によりオリゴヌクレオチドが分離できる。この場合 のポリマーはまたキャピラリー中で製造し、移動できないように共有結合してい る。この組成物において分子量および粘性は、架橋が可能でありさえすれば、重 要ではない。少なくとも５molの高尿素含量は変性のために作用し、多くの場合 効率的な分離に必要ない。相対的に長い溶出時間および低い分離がまた欠点であ る。良好な分離性能は、高容量の有機溶媒を使用した時のみに見られる。 Applied and Theoretical Electrophoresis(1994)，4，39-41頁において、C.H eller et al.は、直鎖ポリアクリルアミドが平均分子量８００００を有する場合 、得られる粘性に依存して、水性緩衝液中のポリアクリルアミドの１０％を、キ ャピラリー電気泳動において充填可能で除去可能な移動相として使用できると述 べている。オリゴヌクレオチドの少ない移動性により、長い溶出時間が見られる 。分析(ピークの広がりおよび重なり)は、また、特に短い鎖のオリゴヌクレオチ ドの場合、不十分に終わる。 驚くべきことに、本発明により、好ましくは少なくともほぼ３００から、約５ ００００Ｄａの範囲の分子量を有する、電気的に荷電した有機化合物の混合物の 場合、特定の粘性の充填可能で除去可能なポリマー溶液を水と混和可能な有機溶 媒を更に加えて使用した場合、実質的に高能力化された分離およびより速い移動 が得られることが判明した。加えて、再現性(有機化合物の溶出時間)が驚くべき ことに高く、これらの移動相が、一方では、自動化のために、他方では、未知の 化合物混合物の定性分析の標準化に適している。驚くべきことに、オリゴヌクレ オチドを分離する場合、リン酸化体がチオリン酸化体または他の修飾オリゴヌク レオチドからでさえ分離され、これは合成オリゴヌクレオチドを試験する場合、 非常に重要である。多くの場合、分析は非常に高程度であり、一つの単位または 他の一つの構造要素が異なるのみのオリゴマー化合物が分離および測定できる。 一つの態様において、本発明は、(ａ)１０から３０重量％の１０００００より 小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー、(ｂ)５０重量％まで の水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少なくとも２０重量％の 水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物に関する。 重量パーセントは常に１００％となる。分子量は、例えば、既知の分子量のポ リアクリルアミドの既知の標準を使用したゲル浸透クロマトグラフィーで測定す る。粘性は回転粘度計(Low Shear 30//MS 1/1;Gontraves)で３０℃で測定する。 多くの適当な水溶性ポリマーが既知である。粘性をポリマーの選択およびその 分子量ならびに組成物におけるその濃度から測定する。必要な分子量は特異的合 成または、例えば、高分子量ポリマーの加水分解的分解により達成できる。ポリ マーは選択した分離条件下で安定でなければならない。合成および天然ポリマー を使用することが可能である。典型的な例は、所望によりエーテル化またはエス テル化されているポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレ ートまたはポリメタクリレート(これらは所望によりＮ−モノアルキル化または Ｎ−ジアルキル化されている)、ポリエチレングリコールまたは１,２−プロピレ ングリコールのようなエチレングリコールと１,２−ジオールのコポリマー；セ ルロースまたはセルロースエーテル、デンプン、デキストランおよびカラゲナン のようなポリサッカライドまたはポリサッカライド誘導体である。デンドリマー がまたポリマーとして適当である。 好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドお よびポリビニルアルコールである。 分子量は、好ましくは５０００から１０００００、より好ましくは１００００ から８００００、特に好ましくは２００００から６００００である。 本質的に尿素非含有は、分離に慣用的に使用する水性緩衝液システムが尿素を 含み得るが、組成物に大量の尿素を添加しないことを意味する。 有機溶媒の量は、同様に、組成物の粘性を調節するためだけでなく、分離性能 に影響するよう使用できる。組成物は、好ましくは５から５０重量％、好ましく は５から４０重量％、より好ましくは１０から４０重量％、特に好ましくは１０ から３０重量％の溶媒を含む。溶媒は、例えば、極性およびプロトン性または好 ましくは非プロトン性溶媒であり得る。説明的例は、非置換またはメトキシ−ま たはエトキシ−置換アルカノールおよびポリオール、典型的にメタノール、エタ ノール、プロパノールおよびブタノール、メトキシエタノールおよびエトキシエ タノール；エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、シクロヘ キサンジオールのようなジオール；グリセロールまたはトリメチロオールプロパ ンのようなトリオール；およびペンタエリスリトールのようなテトロール；Ｎ− 原子が２個または１個のメチルまたはエチル置換を含み得るカルボキシアミドお よびラクタム、典型的にホルムアミド、アセトアミド、カプロラクタム、ジメチ ルホルムアミド、ジメチルアセトアミドおよびＮ−メチルピロリドン、ケトンお よびアルデヒド、典型的にアセトアルデヒドまたはアセトン、ジメチルスルホン 、ジエチルスルホンおよびテトラメチレンスルホンのようなスルホン；スルフオ キシド、典型的にジメチルスルフオキシド、ジエチルスルフオキシドおよびテト ラメチレンスルフオキシド；およびアセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロ ニトリルおよびベンゾニトリルのようなニトリルである。 組成物は、好ましくは２０から８５重量％、より好ましくは２０から８０重量 ％、特に好ましくは２５から７０重量％および最も好ましくは３０から６０重量 ％の水性緩衝液を含む。水性緩衝液のｐＨは２から１２、好ましくは４から９の 範囲であり得る。 緩衝液のタイプ、量および濃度は、キャピラリー電気泳動システムの性能が約 ５ワットまで、好ましくは３ワットまでおよび特に好ましくは１ワットまでであ るように選択する。適当な緩衝液はリン酸およびホウ酸を基本にしたもの、例え ば１０から５００mmolのＴＲＩＳ(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)およ び１０から５００mmolのホウ酸である。ＢＩＳ(ビス(２−ヒドロキシエチル)ア ミノトリスヒドロキシメチルメタン)の使用または付加的使用も可能である。 組成物の粘性は好ましくは５０から５００mPa・s、より好ましくは１００から ５００mPa・s、特に好ましくは１５０から４００mPa・sである。 本発明の組成物は透明で粘性な溶液であり、キャピラリー電気泳動装置への充 填に適しており、その組成物は分離の後に除去(廃棄)でき、更なる測定のために 再びキャピラリーに充填できる。装置は従って再使用可能であり、かなりの経済 的利点である。これは商品として利用可能なキャピラリーと分離機の完全なシス テム(いわゆるキット)を製造する可能性を開く。 本発明はまた本発明の組成物が充填された電気泳動分離装置用キャピラリーに も関する。 検出装置(例えば、ＵＶ吸収測定)を備えたキャピラリー電気泳動装置は既知で あり、技術的文献に記載され、異なる製造者から、例えば、ベックマン、フレル トン、ＣＡ、ＵＳＡから提供されるＰ／ＡＣＥ５０００またはヒューレット・パ ッカード、ワルドブロン、ドイツから提供される^3DＣＥのように、商品として入 手可能である。固定相のｐＨ値で電気浸透流を防止するために、キャピラリー壁 を、例えば、ポリビニルアルコールの薄層で被覆する。この層は簡便にはリンカ ーにより結合している。 キャピラリーの内部直径は、例えば、５から２００μm、および好ましくは５ ０から１５０μmである。キャピラリーの長さは、例えば２から１００cm、好ま しくは５から５０cmである。本発明の組成物は簡便には、典型的に約１０⁵から １０⁷Ｐａの範囲の加圧下でキャピラリーに充填する。 キャピラリーは電気絶縁体、例えばガラス、石英またはテフロンのようなプラ スチック物質である物質から形成され得る。単一キャピラリーはしばしば、典型 的にポリイミドから成る損傷に対する防御層を備える。エッチング法、平面単体 の打ち出しまたは平削りにより得られるキャピラリーまたはキャピラリーシステ ムもまた使用可能である。 電気泳動分離装置のための新規キャピラリーは、特に、少なくともほぼ３００ から約５００００、好ましくは１０００から３００００Ｄａ、特に好ましくは１ ５００から１５０００Ｄａ、非常に好ましくは１５００から８００００Ｄａの範 囲の分子量を有する生物有機化合物の荷電した有機化合物の分離に非常に適して いる。本発明の組成物をキャピラリー内で置換することにより、その装置は再使 用できる。組成物は、例えば、水、有機溶媒または水と有機溶媒の混合物を使用 した加圧下の単純な方法で廃棄できる。 有機化合物は、天然または合成化合物混合物、例えば、約１００までのヌクレ オチド単位を有するオリゴヌクレオチド、約１００までのヌクレオチド単位を有 するオリゴマーＲＮＡまたはＤＮＡ配列、約１００までの糖単位を有するオリゴ マー炭化水素ならびに約８０までのアミノ酸単位を有するオリゴマーペプチドお よびタンパク質であり得る。 本発明はまた有機化合物の溶液でのキャピラリー電気泳動装置の荷電、少なく とも５０ボルト／cmの電場の確立および続く有機化合物の検出を含む方法であり 、そのキャピラリーが本発明の組成物で充填されている、ほぼ少なくとも３００ から約５００００Ｄａの範囲の分子量を有する電気的荷電有機化合物のキャピラ リー電気泳動による分離法にも関する。 電場は、例えば、５０から２０００ボルト／cm、好ましくは１００から１５０ ０ボルト／cm、特に好ましくは２００から１２００ボルト／cm、もっとも好まし くは２００から６００ボルト／cmであり得る。 有機化合物の検出は、簡便には光学法、例えば、ほとんどの場合ＵＶ範囲であ る波長での吸収測定またはレーザー誘導蛍光のような蛍光検出；またマススペク トルまたはＮＭＲ−スペクトル法により行う。 試験サンプル(溶液)中の有機化合物の濃度はミリモルからマイクロモルおよび フェムトモル範囲までであり得る。 測定は通常、典型的に０から１００℃、好ましくは２０から５０℃の範囲の一 定温度で行う。 有機化合物は水、水性緩衝液もしくは水または緩衝液と水混和性有機溶媒との 混合物に溶解できる。キャピラリーを荷電するために、その一端を試験サンプル に浸し、ボルト数を短時間(例えば、１から１０秒)かけることができ、有機化合 物が電気泳動により吸着される。荷電はまたキャピラリー端の間に圧力差を作る ことによる水力学的方法でも製造できる。吸着された量は数分子からアトモルお よびピコモル範囲までであり得る。 本発明はまたキャピラリー電気泳動装置のキャピラリーにおける固定相として の新規組成物の使用にも関する。 以下の実施例は本発明を説明する。 図１および２は、５から２５単位の配列を含むチミジンチオホスフェートの２ ５量体の合成混合物の分離のエレクトロフェログラムを示す。図１は溶媒非添加 での分離を示すが、一方図２はアセトニトリル２０重量％を使用する。実質的に 改善された分離性能が明らかに見られる。Ａ)ポリマーの作業実施例 実施例Ａ１： ポリアクリルアミドの製造 アクリルアミド５ｇを水４５mlに溶解し、溶液をヘリウムで３０分脱気する。 過硫酸アンモニウム３００mgおよびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレンジアミン３ ００mgを次いで添加し、混合物を一晩２５℃の温度で重合化する。次いでポリマ ー溶液を透析して低分子量生産物、過硫酸アンモニウムおよびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'− テトラメチレンジアミンを除去する。次いでメタノール２００mlを精製ポリマー 溶液に添加し、沈殿したポリアクリルアミドを乾燥させる。平均分子量は：Ｍ_w ＝６００００；Ｍ_n＝４００００である。ポリマーを貯蔵し、使用前に所望の緩 衝液に溶解することができる。Ｂ)キャピラリーの製造 実施例Ｂ１： 固定相中のポリエチレングリコールでのキャピラリーの製造 ポリビニルアルコールで被覆し、１００μmの内部直径、３３.８cmの長さおよ び２５.４cmの検出窓を有するガラスキャピラリー(融解石英)(製造者ヒューレッ ト・パッカード)を７・１０⁵Ｐａの圧力で１０分、ポリマー溶液[水５５mlに溶 解し、１時間脱気し、次いでアセトニトリル２０ｇで荷電した２５％のポリエチ レングリコール(フルカのＰＥＧ３５００Ｏ０)、１.２３ｇのホウ酸および４.１ ８ｇのBIS-TRIS(ビス(２−ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキシ)メタン) の混合物]でフラッシュする。重量パーセントは全組成物を基本にする。比較実施例： キャピラリーを実施例Ｂ１に従ってフラッシュするが、溶媒としてのアセトニ トリルを除く。ポリエチレングリコールの量はまた約２５重量％である。Ｃ)使用実施例 実施例Ｃ１： オリゴヌクレオチド合成混合物の分離 実施例Ｂ１に従った装置をｐ(ｄＴ)_6-25チミジンのホスホロチオエート(ｐ(ｄ Ｔ)_6-25の１０^-5モル水溶液)で荷電する。荷電(カソード側)を１０⁵Ｐａの異な る圧力での２４秒の水力学で行う。電気泳動装置はヒューレット・パッカード( タイプ^3DＣＥ)から得る。使用するボルト数は−２５kVであり、電流は１２μＡ である。分離を３０℃で行い、検出を２６０nmでのＵＶ吸収により行う。 同じ分離を、比較実施例の装置を使用して行う。結果は図１および２に示す。 エレクトロフェログラム(ｙ軸吸収、ｘ軸時間)は溶出時間が短縮され、分離の程 度が実質的に改善され、ホスフェートでさえチオホスフェートの存在を検出でき るという比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バルメ，イーリス ドイツ連邦共和国デー―79576バイル・ア ム・ライン、アルテ・シュタットゲルトネ ライ５番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．５０から６００mPa・sの粘性を有する、(ａ)１０から３０重量％の１００ ０００より小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー、(ｂ)５０ 重量％までの水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少なくとも２ ０重量％の水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物。 ２．ポリマー(ａ)がポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドおよびポリ ビニルアルコールからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。 ３．ポリマー(ａ)の平均分子量が２００００から６００００である、請求項１ 記載の組成物。 ４．有機溶媒(ｂ)の量が１０から４０重量％である、請求項１記載の組成物。 ５．有機溶媒(ｂ)が極性でプロトン性または非プロトン性溶媒である、請求項 １記載の組成物。 ６．有機溶媒(ｂ)がアセトニトリルである、請求項１記載の組成物。 ７．水性緩衝液(ｃ)が２０から８５重量％の量である、請求項１記載の組成物 。 ８．水性緩衝液(ｃ)が３０から６０重量％である、請求項１記載の組成物。 ９．粘性が５０から５００mPa・sである、請求項１記載の組成物。 １０．５０から６００mPa・sの粘性を有する、(ａ)１０から３０重量％の１０ ００００より小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー、(ｂ)５ ０重量％までの水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少なくとも ２０重量％の水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物を充填された電気泳 動装置用キャピラリー。 １１．２から１００cmの長さである、請求項１０記載のキャピラリー。 １２．有機化合物の溶液でのキャピラリー電気泳動装置の荷電、少なくとも５ ０ボルト／cmの電場の確立および続く有機化合物の検出を含む方法であり、その キャピラリーは．５０から６００mPa・sの粘性を有する、(ａ)１０から３０重量 ％の１０００００より小さい平均分子量を有する実質的に非架橋水溶性ポリマー 、(ｂ)５０重量％までの水と混和性の少なくとも一つの有機溶媒、および(ｃ)少 なくとも２０重量％の水性緩衝液を含む実質的に尿素非含有の組成物で充填され て いる、ほぼ少なくとも３００から約５００００Ｄａの範囲の分子量を有する電気 的荷電有機化合物のキャピラリー電気泳動による分離法。 １３．キャピラリー電気泳動装置のためのキャピラリーにおける固定相として の請求項１記載の本発明の組成物の使用。