JP2000502244A - トキソプラズマ・ゴンディ糖複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、トキソプラズマ．ゴンディ抗体に免疫反応性の糖複合体、これらの糖複合体に対する（モノクローナル）抗体、およびモノクローナル抗体を産生し得る細胞系に関する。本発明はさらに、Ｔ．ゴンディまたはＴ．ゴンディに対する抗体の検出のための、免疫化学試薬および方法にも関する。さらに、本発明は、Ｔ．ゴンディ寄生虫の複製の阻害のための治療試薬、および弱毒Ｔ．ゴンディ生ワクチンの製造方法にも関する。一般式： ［式中：Ｒ１は、水素、−ＰＯ₃−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂（エタノールアミン−ホスフェート）、または−ＰＯ₃−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｘ［式中、ＸはＴ．ゴンディ特異的抗原］；Ｒ２は、ホスファチジルイノシトール膜アンカーのイノシトール部分に必要によりα（１−６）結合した、α−Ｏ−Ｒ４、α（１−４）−Ｏ−アンヒドロマンニトールまたはα（１−４）−Ｏ−グルコサミン；Ｒ３は、単糖部分；Ｒ４は、水素または−Ｌ−Ｒ５［式中、Ｌは、二価有機ラジカル、および、Ｒ５は、担体への結合を可能にする官能基］］で示される、グリカン中核構造を含んで成る、いくつかの糖複合体が、トキソプラズマ．ゴンディ特異的抗体に免疫反応性であることが、当分野における先行文献と違って、見い出された。単糖部分の好ましい実施態様は、ヘキソース部分であり、より好ましくはグルコース部分であり、最も好ましくはα−１，４グリコシド結合によってＧａｌＮＡｃ部分に結合しているグルコース部分である。本発明の糖複合体が、Ｔ．ゴンディに感染しているヒトの診断に特に適していることが見い出された。

Description

【発明の詳細な説明】 トキソプラズマ・ゴンディ糖複合体 本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ） （以後、Ｔ．ゴンディと称する）抗体に免疫反応性の糖複合体、これらの糖複合 体に対する（モノクローナル）抗体、およびモノクローナル抗体を産生し得る細 胞系に関する。本発明はさらに、免疫化学試薬、およびＴ．ゴンディまたはＴ． ゴンディに対する抗体の検出方法にも関する。さらに、本発明は、Ｔ．ゴンディ 寄生虫の複製の阻害のための治療試薬、および弱毒Ｔ．ゴンディ生ワクチンの製 造方法にも関する。発明の分野 トキソプラズマ．ゴンディは、世界中で見い出され、哺乳動物全種および特定 の種の全ての型を感染させることができる、細胞内原生動物門寄生虫である。Ｔ ．ゴンディは、無性および有性の２つの生育環を有するコクシジア目として分類 される。 無性段階においては、Ｔ．ゴンディは、種々の形態、例えば、タキゾイト（ｔ ａｃｈｙｚｏｉｔｅｓ）、シュ−ドシスト（ｐｓｅｕｄｏｃｙｓｔｓ）、ブラジ ゾイト（ｂｒａｄｙｚｏｉｔｅｓ）、およびオーシスト（ｏｏｃｙｓｔｓ）の形 態で、存在する。タ キゾイトは、急性感染を特徴とするＴ．ゴンディの絶対的細胞内寄生形態である 。ヒト宿主細胞に関するＴ．ゴンディの感染段階は、シュードシストである。シ ュードシストは、直径３０〜１００マイクロメートルを有し、ブラジゾイトと称 される感染単位を含有する。感染は、生のまたは未調理の未凍結肉に存在するシ ュードシストの摂取によって開始されることが多い。さらに、感染は、活性腸内 感染しているネコの糞の中のオーシストの摂取によっても起こり得る。感染はま た、輸血または白血球注入によって、臓器移植によって、あるいは妊娠中の経胎 盤感染によって起こる場合もある（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５ １，３２８−３４６，１９８０）。宿主消化酵素によって、それぞれシュードシ ストまたはオーシストのいずれかの壁が小腸の中で破壊され、ブラジゾイトまた はスポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）を放出し、次いで円柱上皮を通過す る。ブラジゾイトまたはスポロゾイトが、それらがクッパー細胞によって摂取さ れる血行ルートによって、肝臓に到達することもある。一旦、細胞内に入ると、 これらの生物体はタキ ＆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｉｍｍｕｎ．ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；編集者Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｋ．Ｓ Ｌｏ ｎｄｏｎ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂＩｉｃａｔｉｏｎ ｓ ｐｐ．３５６−４２１，１９８２； ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｐａｒｔ ＩＩ，編集者Ｎａｈｍｉａ ｓ，Ａ．Ｊ．， Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．Ｊ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ ＢｏｏｋＣｏｍｐａｎｙ，ｐｐ．３２７−３７１，１９８２ ）。 宿主細胞に入ると直ぐに、複製が開始される。宿主において、マクロファージ がブラジゾイトを全身に運ぶ。ブラジゾイトは、リソソームのそれとの融合を防 止することによって、生き残り、マクロファージ寄生虫保持腔（ｍａｃｒｏｐｈ ａｇｅｐａｒａｓｉｔｏｐｈｏｒｏｕｓ ｖａｃｕｏｌｅ）内で複製する。複製 は、宿主細胞の溶解を生じさせる。生物体は、新たなマクロファージまたは他の 細胞型によって食菌され、このサイクルが繰り返される。 Ｔ．ゴンディ有性段階は、ネコ科宿主においてのみ起こる（Ｍｉｌｌｅｒら、 Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，５８，Ｐ．９２８−９３７，１９７２）。中間 宿主（例えば、マウス）は オーシストまたはシュードシストのいずれかを摂取することによって感染する。 マウスは、それ自身の組織中にシュードシストを発生させる。ネコは、シュード シストに感染した肉（例えば、ネズミの組織）を食べたとき、またはオーシスト を摂取したときに、感染する。ブラジゾイトまたはスポロゾイトは、円柱上皮細 胞を通過し、メロゾイトに分化する。複製に続いて、メロゾイトが、感染した上 皮細胞を破壊し、近接する細胞を感染させる。メロゾイトの内には、大生殖母細 胞（雌性型）および小生殖母細胞（雄性型）と称される、前有性（ｐｒｅ−ｓｅ ｘ）む細胞に分化するものもある。小生殖母細胞は、大生殖母細胞と融合して、 オーシストと称される接合体を形成する（Ｄｕｂｅｙ ＆ Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｊ ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．１９：１５５−１７７，１９７２）。オーシストは小脳 の内腔に入り、排出される。各オーシストが、土壌において胞子形成し、中間宿 主の感染段階である、８個の感染性スポロゾイトを産生する。 ブラジゾイトは、生体内取得後約８〜１０日で包嚢に包まれ、感染の慢性的、 潜伏段階を特徴とする。従って、ブラジゾイト形態は、腸上皮サイクルを開始さ せる能力を有する唯一の段階 １９８２）。 Ｔ．ゴンディは、健康な成人においては緩慢なまたは不明瞭な疾患を誘発する が、先天的感染児、および免疫弱化患者においては、重大な疾患、トキソプラズ マ症、さらには死をも引き起こす。妊婦の一次感染は、ヨーロッパの国々におい ては、０．２〜１．０％の頻度で起こる。そのうちの約４０〜５０％において、 胎児が感染している。妊娠中の胎児の感染（そのうちの約１０％）は、新生児死 、または重度多障害児を発生させるが、そのうちの９０％においては、子供が無 症候性、潜伏性感染をもって生まれる（Ｄｅｓｍｏｎｔｓ ａｎｄ Ｃｏｕｖｒ ｅｕｒ，Ａｎｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１９８４，３１，８０５−８０９；Ａｌｆｏ ｒｄら、Ｂｕｌｌ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｍｅｄ．１９７４，５０，１６０−１８１ ）。潜伏先天性トキソプラズマ症の患者の最大８５％が、活性脈絡網膜炎の１つ またはそれ以上の症状の発現を含む重度の後遺症を発病するであろう。他の臨床 的症状は、炎症、リンパ節炎、脳炎、および発熱である。 先天性トキソプラズマ症は、核酸増幅法によって、新生児抗Ｔ．ゴンディＩｇ Ｍおよび／またはＩｇＡ抗体、またはＴ．ゴンディ特異性ヌクレオチドの存在を 示すことによって診断することができる（Ｂｕｒｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，１７８７−１７９２，１９８９；Ｓａｖｖａら、 Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３２，２５−３１，１９９０）。 いくつかの既知のＴ．ゴンディ株が存在する。最も重要な株の１つは、高度に 毒性であり、当初人間の脳細胞から単離されたＲＨ株である。 Ｔ．ゴンディに関する過去の調査のほとんどは、タキゾイト特異性抗体の同定 および分子特性化に焦点が当てられていた。１０００種より多くのＴ．ゴンディ 特異性タンパク質が同定されている。Ｔ．ゴンディの、膜アンカー表面タンパク 質、および分泌／放出タンパク質は、非常に免疫原性であるので、広範囲に研究 されている。表面タンパク質の中で、ｐ３０が最も多く存在し、Ｔ．ゴンディＲ Ｈ菌の合計タキゾイトタンパク質の約５％を占めている。ｐ３０タンパク質は、 ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体によって集中的に認識され（Ｄｅ ｃｏｓｔｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３，３７６−３８２ ， １９８８；Ｇｏｄａｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８，２４４６−２ ４５０，１９９０）、従って診断目的に有用である。ｐ３０に対するモノクロー ナル抗体を用いて、抗トキソプラズマＩｇＭ（Ｃｅｓｂｒｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８３，１５１−１５８，１９８５）およびＩｇＡ（Ｄ ｅｃｏｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ，１１０４−１１０６，１９８８）抗体 の検出のために、２つの免疫捕獲試験が開発された。分子量４〜１０ｋＤａを有 するＴ．ゴンディの他の免疫優性抗原が、同定されている。４〜１０ｋＤａ抗原 は主に、ヒトＩｇＭによって認識され、それより少ない程度にヒトＩｇＧ抗体に よって認識される（Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：９７７−９ ８３，１９８３）。さらに、糖成分上のビシナルヒドロキシル基を酸化すること で知られる試薬ＮａＩＯ₄での膜成分の処置が、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧ抗体と のＴ．ゴンディ抗原の免疫反応性を、かなり減少させることがＥＬＩＳＡにおい て観察された（Ｎａｏｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４１，３３１−３３８ ，１９８３）。Ｓｈａｒｍａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：９７７−９８３ ，１９８３）は、ＮａＩＯ₄処置トキソプラズマ超音波処理、ま たはＳＤＳゲル上で分離された膜強化画分が、免疫優性Ｔ．ゴンディ抗原と、ヒ トＩｇＭおよびＩｇＧ抗体との免疫反応性において、劇的な減少を示すことを観 察した。 特に、４〜１０ｋＤａ抗原とヒト抗Ｔ．ゴンディ抗体との免疫反応性は、Ｎａ ＩＯ₄処置後に完全に破壊された。さらに、４〜１０ｋＤａ分子は、プロナーゼ およびトリプシン処置に非感受性であるが、リパーゼには感受性であり、このこ とは、それが糖脂質構造を構成することを示す。要するに、前記に略説した研究 は、Ｔ．ゴンディの炭水化物分子が、感染宿主において効果的な免疫応答を誘起 させるのに重要な役割を果たしていることを示す。グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）の糖生物学 寄生性原虫を含むウイルス、バクテリアおよび真核生物細胞の表面膜タンパク 質の、構造、生合成および生物学的機能において、少糖類および糖脂質によるタ ンパク質の翻訳後修飾が、重要な役割を果たすことが今や広く認識されている。 発生期のタンパク質が粗エンドプラズマレテイキュラムの内腔へ移動する間の 、脂質二重層（トランスメンブラン）にまた がる疎水性アミノ酸のストレッチによって、またはグリコシル−ホスファチジル イノシトール（ＧＰＩ）分子との共有結合によって、タンパク質を膜につなぎ止 めることができる。報告されている全ての場合において、脂質アンカーが、タン パク質のカルボキシル末端において、主に疎水性アミノ酸の短配列と置き換わっ ており、従って、１型膜タンパク質のトランスメンブランポリペプチドドメイン への代替的アンカリング機構として考えられる（ＦｅｒｇｕｓｏｎおよびＷｉｌ ｌｉａｍｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０，１９８ ８；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉ ｏｌ．，１、５２２、１９９１） 糖脂質膜アンカーの構造および生合成に関する情報のほとんどが、寄生性原虫 トリパノソーマ・ブルーセイの、変異表面糖タンパク質（ＶＳＧ）およびＧＰＩ の研究から得られている。１つのＶＳＧ（ＶＳＧ１１７）の糖脂質アンカーが、 完全に化学的に定義されており、主鎖配列エタノールアミン−ホスフェート−６ Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎα１−４ＧｌｃＮα１−６−イノシトール から成る。イノシトール残基は、ホスホジエステル結合によって、ジミリストイ ルグリセロールに 結合し、エタノールアミン基は、成熟タンパク質のカルボキシル末端アミノ酸に アミド結合し、ガラクトース側鎖は、グルコサミンに隣接するマンノース残基に 結合している。種々の側鎖修飾および親油性基を有する類似の主鎖構造が、いく つかの他のタンパク質の脂質アンカーに関して記載されている（再考のため、Ｆ ｅｒｇｕｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５ ７，２８５−３２０，１９８８；Ｃｒｏｓｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ ｏｌ．６：１−３９，１９９０；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １、５２２−５２９、１９９１ を参照）。Ｔ．ゴンディのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー 最近まで、トキソプラズマ．ゴンディの糖生物学に関して、ほんのわずかしか 知られておらず、トキソプラズマの主要な表面成分としての糖タンパク質の存在 に関して、かなりの論議がなされている。Ｈａｎｄｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．１２４，２５７８−２５８３，１９８０）は、ＣｏｎＡ−セファロースカラ ム上での、放射性ヨウ素化寄生虫の界面活性剤溶解物の通過後の、膜抗原の組成 における差異を何ら観察するこ とができなかった。これに対して、Ｊｏｈｎｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１００，９３４−９４３，１９８１）および Ｍａｕｒａｓら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９ ７，９０６−９１２，１９８０）は、放射能標識ＣｏｎＡを用いて、このレクチ ンのトキソプラズマへの結合を検出した。 詳細な生合成経路を確立するために、タンパク質結合ＧＰＩと、それらの推定 先駆体分子との比較は、基本的に重要である。Ｓｃｈｗａｒｚら（ＮＡＴＯ Ａ ＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ． ＳｅｒｉｅｓＨ：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ． ７８，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９３．ｐ．１０９−１２１）によ って示されるデータは、Ｔ．ゴンディ．タキゾイトのｐ２３が、哺乳動物のＴｈ ｙ−１アンカーと類似した、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン残基として同定され た側鎖修飾を有するエタノールアミン−ＰＯ₄−６Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１− ６Ｍａｎα１−４ＧｌｃＮα１−６ＰＩから成る、高度に保存された主鎖を有す ることを示唆している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：７５３− ７５９，１９８８； Ｚｉｎｅｃｋｅｒら、Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ，Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｂｕｒｇ，１９９２を参照）。 ｐ３０に関して、比較できる分析がなされ、同様の結果を得た（Ｔｏｍａｖｏ ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１１７２１−１１７２８，１９９２）。 従って、両方のタンパク質のアンカーが、それらの炭水化物成分に関して、同一 である。ｐ３０のグリカンに関して、いくつかの微小異質性が示されており（Ｚ ｉｎｅｃｋｅｒら，１９９２）、これがトキソプラズマのＧＰＩ膜アンカーの共 通の特徴であるかどうかに関してまだ調査がなされていない。 Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカーに対する抗体が、他の原虫種のＧＰＩアンカー に結合しないので、Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカーは、より基本的なエタノール アミン−Ｐ−６Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎα１−４ＧｌｃＮα１−６ イノシトール中核（ｃｏｒｅ，コアー）構造に加えて、独特の構成成分を有して いると考えられる。 従って、ＧＰＩ膜アンカーの構造を、それらのグリカンおよび脂質部分に関し て、詳細に解明すること、および哺乳動物細胞に見い出されない構造的特徴を探 求することが重要である。 Ｔ．ゴンディの主要表面タンパク質が、ＧＰＩアンカーによって、寄生虫表面に つなぎとめられることが明らかになったとき（Ｔｏｍａｖｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ．９：４５７６−４５８０，１９８９； Ｎａｇｅｌら，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５６９−５５７４，１９８９）、これらの膜アンカ ー、特に、それらの推定先駆体の、生物学的機能および生合成が、当分野におい て重要になった。さらに、高度免疫原性４〜１０ｋＤａ抗原が、未複合または遊 離グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの先駆体種を代表するという 観察によって、Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカーの、生化学的構造の解明およびエ ピトープのマッピングに対する関心が高まった。Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカー の、構造および免疫原性エピトープに関する情報は、診断アッセイにおいて、人 工ＧＰＩアンカーを化学的に合成し適用することを可能にするであろう。天然Ｇ ＰＩアンカーに対して、免疫反応性部位の似ている人工炭水化物分子を、化学的 に修飾して、リンカー分子によって酵素結合体へ直接結合できるようにすること ができる。 従って、Ｔ．ゴンディでの感染の種々の段階においてなされる信頼性のある診 断を可能にする特異的および高感度方法の開 発のために、特異的膜抗原の正確なアンカリングを担う免疫優性糖複合体を同定 することが、非常に重要である。 Ｔ．ゴンディＧＰＩアンカーの構造を解明することにより、関わる酵素の機能 ／活性を阻止またはブロックすることによって、独特の炭水化物置換基の、ＧＰ Ｉ中核構造への生合成および結合を妨げることができるであろう。このことは、 Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカー合成の特異的阻止またはブロッキングが、結果的 に、タンパク質の細胞表面発現を減少させ、究極的に寄生虫を死なせることを意 味する。例えば、Ｔ．ブルーセイのＧＰＩ先駆体は、その脂肪酸に関して、改造 される。この改造は、トリパノソームに独特であり、トリパノソームに対して選 択的毒性を示すミリステート類似体１０−（プロポキシ）デカン酸のようなレモ セラピューティックス（ｒｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の開発のための 良好な標的になる（Ｄｏｅｒｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２，１８５１−１ ８５４，１９９１；Ｍａｓｔｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ６２，７３−８０，１９ ９０）。 寄生虫の生物学および病理学におけるＧＰＩの役割は、詳細な解明がまだなさ れていない。しかし、ＧＰＩアンカーの構造 を解明するにとによって、寄生虫特異性炭水化物構造の阻止に基づく、抗トキソ プラズマ薬の開発において、新たなアプローチが可能になる。 ＧＰＩアンカーの主な機能は、プラズマ膜、稀な場合においては分泌顆粒の内 腔面と、タンパク質との安定した会合を与えることである。ＧＰＩアンカーのこ の特徴は、Ｔ．ゴンディの表面上に、異種遺伝子コード化タンパク質を発現させ るために使用することができる。いくつかの研究は、膜標的およびターンオーバ ーの効率が、ＧＰＩアンカーによってのみ決定されることを示している。従って 、Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカーの構造を解明することによって、ＧＰＩアンカ ーに効率的に結合されるように異種遺伝子を修飾することができ、それによって 、膜標的が可能になるであろう。究極的に、寄生虫Ｔ．ゴンディの、異種遺伝子 発現系としての適用性は、ワクチン開発の効率的かつ信頼性のあるアプローチを 導き得る。さらに、ＧＰＩアンカータンパク質は、膜との安定な会合を有するが 、内因性膜タンパク質よりも容易に、界面活性剤溶解される場合がある（Ｈｏｏ ｐｅｒおよびＴｕｒｎｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５０，８６５−８６９， １９８８）。ＧＰＩアンカーとのタ ンパク質キメラを発現させるために、Ｔ．ゴンディを異種遺伝子発現系として使 用することによって、容易に拡大することができる信頼性のある抗原源を作るこ とができ、発現された異種タンパク質は界面活性剤（ＣＨＡＰＳ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４）を用いて容易に抽出することができる。 Ｂ細胞欠失（ＩｇＭ抑止）ＢＡＬＢ／Ｃマウスを用いた実験の結果は、抗トキ ソプラズマ抗体が、急性感染の回復にとって必須ではないが、長期トキソプラズ マ症の制御において必要であることを意味している（ＦｒｅｎｋｅｌおよびＴａ ｙｌｏｒ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３８， ３６０−３６ ７，１９８２）。データは、糖脂質構造が、Ｔヘルパー細胞非依存性Ｂ細胞マイ トジェンであり、その結果として、Ｂ細胞を産生する連続的ＩｇＭ抗体になるこ とを示した。従って、Ｔ．ゴンディのＧＰＩアンカーの構造に関する詳細な情報 は、Ｔ．ゴンディの可能宿主における保護抗体応答の誘起においてマイトゲンと して適用し得る、適切なリガンドに結合した人工ＧＰＩアンカー分子の合成を可 能にするであろう。発明の詳細な説明 一般式： ［式中： Ｒ１は、水素、−ＰＯ₃−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂（エタノールアミン−ホスフェー ト）、または−ＰＯ₃−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｘ［式中、ＸはＴ．ゴンディ特異 的抗原］； Ｒ２は、ホスファチジルイノシトール膜アンカーのイノシトール部分に必要によ りα（１−６）結合した、α−Ｏ−Ｒ４、α（１−４）−Ｏ−アンヒドロマンニ トールまたはα（１−４）−Ｏ−グルコサミン； Ｒ３は、単糖部分； Ｒ４は、水素または−Ｌ−Ｒ５［式中、Ｌは、二価有機ラジカル、および、Ｒ５ は、担体への結合を可能にする官能基］］ で示される、グリカン中核構造を含んで成る、いくつかの糖複合体が、トキソプ ラズマ．ゴンディ特異的抗体に免疫反応性であることが、当分野における先行文 献と違って、見い出された。 本発明による用語「二価有機ラジカル」は通常、官能基Ｒ５がそれを介してグ リカン中核に結合しているリンカー構造を含んで成る。好適な二価有機ラジカル は、例えば、メチレン［−ＣＨ₂−］、エチレン［−ＣＨ₂−ＣＨ₂−］、あるい は好ましくはプロピレン［−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−］のような、置換または非 置換アルキレン基またはアラルキレン基である。 本発明による用語「担体への結合を可能にする官能基」は通常、本発明のグリ カン中核構造の担体への共有結合に使用することができる反応性官能基、または 、その目的のために反応性官能基に変換することができる官能基を含んで成る。 特異的官能基はメルカプト（−ＳＨ）、アミノ（−ＮＨ₂）、ピリジルジチオ、 Ｓ−アセチル−メルカプトアセチル（ＳＡＴＡ）、マレイミド、カルボン酸官能 基またはその活性化エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドから誘導 されるエステル、 ｐ−ニトロフェノールまたはペンタフルオロフェノール、ブロモアセタミド、ビ ニルピリジン、ヒドラジド、アルデヒドまたはヒドロキシである。さらに好適な 官能基は、結合化学の分野の当業者に既知である。 本発明による用語「担体」は通常、本発明のグリカン中核構造が結合し得るど のような物質をも含み、例えば、タンパク質（例えば、アルブミンまたはアオガ イヘモシアニン）および、診断試薬に使用される固体支持体を含む。 本発明の好ましい実施態様は、前記単糖部分がへキソース部分である糖複合体 である。 本発明の他の好ましい実施態様は、前記ヘキソース部分がグルコース部分であ る糖複合体である。 本発明の他の好ましい実施態様は、前記グルコース部分が、α−１，４グリコ シド結合によってＧａｌＮＡｃ部分に結合している糖複合体である。 本発明の他の好ましい実施態様は、糖複合体が、図１５に示される構造を含ん で成る糖複合体である。 本発明の他の好ましい実施態様は、下記の段階 −タキゾイト膜の破壊、および −得られるタキゾイト懸濁液の、クロロホルム／メタノール／水（Ｃ／Ｍ／Ｗ ；１／１／０．３ｖ／ｖ）混合物での抽出、から成る単離方法によって、Ｔ．ゴ ンディタキゾイトから得られる糖複合体である。 本発明の他の好ましい実施態様は、寄託番号９５０９０６０８または９５０９ ０６０９として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），ポートン ダウン（英国）に寄 託されている不死化細胞系によって産生されるヒトモノクローナル抗体と免疫反 応性の糖複合本である。 糖複合体は、炭水化物部分（モノ−、オリゴ−、またはポリサッカリド）が、 脂質またはボリペプチドのような他の（生体）分子に共有結合している分子を記 述するために使用される一般的用語である。しかし、炭水化物中核構造も、糖複 合体の意義の範囲内に含まれると考えるべきである。 脂質（例えば、アルキル／アシルグリセロール、ジアシルグリセロール、スフ ィンゴシン、セラミド、またはドリコール）に結合したオリゴ糖は、糖脂質とし て既知である（ＩＵＢ−ＩＵＰＡＣ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ， １９ ７６， （１９７６）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９，１１４）。糖タンパク質は、オリ ゴ糖がＮ−および／またはＯ−グリコシド結合によって結合し、炭水化物が全重 量の２〜６０％を占めているポリペプチドである（Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌら、１９ ８２，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１９ Ｂ，ｐａｒｔ ＩＩ，ｐ．１、編集者Ｆｌｏｒｋｉｎ，Ｇ．）。これらのポリペ プチドに存在するオリゴ糖部分は、分離した、特異的な、および保存された構造 である。この特性は、可変数の反復構造単位から成る炭水化物鎖にアミノ酸が結 合しているプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ムコタンパク質、および ペプチドグリカンのような他の糖複合体から、それらを区別する。（ＩＵＢ−Ｉ ＵＰＡＣ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，１９８０，（１９８２）Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３３５２）。 糖複合体の他の種類は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂 質アンカーである（Ｌｏｗら、１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ ｉ．１１，２１２）。これらは、オリゴ糖ブリッジを介して、細胞表面糖タンパ ク質を膜脂質に結合させる。従って、糖タンパク質は、Ｎ−およびＯ −結合オリゴ糖、ならびにＧＰＩアンカーによって、グリコシル化されていても よい（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，７５３−７５ ９）。 糖複合体は、天然資源から単離および精製することができる（例えば、本発明 においては、Ｔ．ゴンディ寄生虫、好ましくは、Ｔ．ゴンディ．タキゾイトから ）。実施例に記載されている単離方法を使用することができる。しかし、当分野 において既知である他の単離方法も使用することができ、従って、本発明の範囲 に含まれる。 本発明の糖複合体を得るための他の方法は、当分野において頻繁に使用される 既知の方法を用いる化学合成経路である。実施例の１つにおいて、１つの合成経 路が例示されている。しかし、当分野で既知である他の合成経路も、同等である と見なすべきであり、従って、本発明の範囲に含まれる。 本発明の糖複合体に対する抗体も、本発明の一部である。 前記のように製造され、記載される糖複合体は、ポリクローナルおよびモノク ローナルの両方の抗体を産生するために使用することができる。本発明の糖複合 体に対するモノクローナル抗体は、当業者によって容易に製造することができる 。 本発明のモノクローナル抗体は、従って、Ｔ．ゴンディ感染の診断に、新たな 手段を提供する。 本発明の好ましい抗体は、Ｔ．ゴンディ糖複合体のエピトープに結合するモノ クローナル抗体であり、このエピトープは、寄託番号９５０９０６０８および９ ５０９０６０９としてそれぞれＥＣＡＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託さ れているハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体ＴＯＸ． ＨｕＯＴ−１またはＴＯＸ−ＨｕＯＴ−２によって認識される。 本発明の好ましい抗体は、寄託番号９５０９０６０８および９５０９０６０９ としてそれぞれＥＣＡＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託されているハイブ リドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−１ま たはＴＯＸ−ＨｕＯＴ−２である。 本発明のモノクローナル抗体を産生することができる不死化細胞系も、本発明 の一部である。 モノクロナール抗体を産生する細胞系の製造は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒおよび Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル 抗体産生ハイブリドーマ を生成する方法を考案した（Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９））、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで の形質転換、または発ガン性ＤＮＡでのＢ−リンパ球の直接形質転換、ヒトまた はマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系のいずれかである融合パートナーとの 、ヒトＢ−リンパ球の直接融合、または前記骨髄腫細胞系でのＥＢＶ−形質転換 Ｂ細胞系の直接融合によって行うことができる。 本発明の好ましい細胞系は、寄託番号９５０９０６０８および９５０９０６０ ９として、ＥＣＡＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託されている細胞系であ る。 これらのバイブリドーマ細胞系は、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＥＢ Ｖ）の補助によって製造された。ＥＢＶは、ヒトＢ−リンパ球を、形質転換およ び不死化することができる。不死化ヒトＢ−リンパ球は、ＥＢＶの補助により、 骨髄腫パートナー細胞を必要とせずに、得ることができる。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ ａｒｒウイルスは、種々の源から得ることができる。最も一般的に使用されるＥ ＢＶ源は、Ｂ９５−８マーモセット細胞 系である。Ｂ９５−８細胞系は自発的に、ＥＢＶを培地に放出する。 Ｔ．ゴンディの糖複合体に対するモノクローナル抗体は、生体内および生体外 の両方における細胞および細胞抽出物中のＴ．ゴンディ発現の検出、精製目的、 ならびにこれらのタンパク質の機能を研究するための種々の生化学的および免疫 学的分析方法のための、有用な手段である。 本発明の糖複合体または抗体を含んで成る免疫化学試薬も、本発明の一部であ る。 本発明による用語「免疫化学試薬」は通常、本発明の糖複合体の１種またはそ れ以上、および適切な支持体または標識物質を含んで成る。 使用し得る支持体は、例えば、ミクロ試験プレート穴またはキュベットの内壁 、管または毛細管、膜、フィルター、試験細片、あるいは、例えば、ラテックス 粒子、アルデヒド粒子（例えば、活性アルデヒド表面基を有するセラミック磁化 可能粒子）のような粒子の表面、赤血球、色素ゾル、金属ゾルまたはゾル粒子と しての金属化合物、ＢＳＡまたはＫＬＨのような担体タンパク質である。 使用し得る標識物質は、特に、放射性同位体、発光化合物、酵素、色素ゾル、 金属ゾルまたはゾル粒子としての金属化合物である。 サンプル中のＴ．ゴンディに対する抗体の検出方法において、本発明の免疫化 学試薬がサンプルと接触される。その後、サンプル中に、複合脂質と抗体との間 に形成される免疫複合体の存在が検出され、この検出によって、サンプル中のＴ ．ゴンディ抗体の存在が知られ、定量的に測定することができる。 免疫化学試薬の性質およびその他の特徴に依存して、生じる免疫化学反応は、 いわゆる、サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応、または阻害反応と称される 。 サンプル中のＴ．ゴンディの検出のために、本発明の複合糖質を含有する本発 明の免疫化学試薬を、サンプルおよび抗Ｔ．ゴンディ抗体と接触させ、その後に 、形成される免疫複合体の存在を検出し、これから、サンプル中のＴ．ゴンディ の存在を決定することができる。 サンプル中のＴ．ゴンディの検出の特に好適な方法は、標識物質を与えた本発 明の糖複合体とＴ．ゴンディ抗原（サンプル中に存在）との間の競合反応に基づ いており、それによって、 糖複合体と抗原が、固体支持体に付着したＴ．ゴンディに対する抗体と競合する 。 本発明はさらに、本発明の抗体をサンプルと接触させ、その後に、形成される 免疫複合体の存在を検出し、これがサンプル中のＴ．ゴンディの存在の尺度とな ることを特徴とする、サンプル中のＴ．ゴンディの検出方法を含む。 本発明の試験キットは、必須構成要素として、前記の免疫化学試薬を含んで成 る。Ｔ．ゴンディ抗体の検出のために、サンドイッソチ反応を実施する場合は、 その試験キットは、例えば、固体支持体、例えばミクロ試験プレート穴の内壁に 被覆された本発明の糖複合体、および、本発明の標識糖複合体または標識された 抗−抗体を含んで成ることができる。 競合反応を実施するために、試験キットは、固体支持体に被覆された本発明の 糖複合体、Ｔ．ゴンディに対する標識抗体、好ましくは、前記糖複合体に対する モノクローナル抗体を含んで成ることができる。 凝集反応においては、試験キットは、粒子またはゾルに被覆された本発明の糖 複合体を含んで成ってもよい免疫化学試薬を含んで成る。 試験キットの他の実施態様は、例えば、Ｔ．ゴンディに対する抗体の結合部位 に関する、検出すべきＴ．ゴンディ抗原との競合反応において、固体支持体に被 覆された本発明の標識糖複合体を免疫化学試薬として使用することである。 本発明はさらに、Ｔ．ゴンディ寄生虫の複製阻止のための治療試薬を含み、該 治療試薬は、本発明の糖複合体の生合成を阻止する特異的阻害剤を含んで成る。 特異的阻害剤の例は、Ｔ．ゴンディ糖複合体におけるグルコース部分の組み込み に関して特異的および必須の酵素を阻害することができる化合物である。この化 合物は、化学化合物であってもよいが、特異的酵素を阻害する能力が既知である 他の化合物を使用することもできる。ＧＰＩアンカー（生）合成の阻止は、ＧＰ Ｉ−アンカー合成に関わる酵素をコードする遺伝子を除去する遺伝的操作によっ て行うことができる（ノックアウト突然変異体）。これは、転写または翻訳の段 階で行うことができる。 本発明はさらに、前記に説明した本発明の治療試薬によって、ＧＰＩアンカー 抗原の表面発現をブロックまたは阻止する弱毒Ｔ．ゴンディ生ワクチンの製造方 法を含む。ＧＰＩアンカー抗原の表面発現の阻止またはブロッキングは、Ｔ．ゴ ンディの毒 性を減少させる。さらに、ＧＰＩアンカー合成のいわゆるノックアウト突然変異 体は、弱毒生ワクチンとして適用することができる。 トキソプラズマ．ゴンディに対する保護のワクチンも本発明の一部である。こ れらのワクチンは、本発明の糖複合体、および細胞分裂促進特性を有する医薬的 に許容される担体を含んで成る。 ある場合には、これらの糖複合体自体を用いることによって、保護免疫性を上 昇させる能力が低下することがある。それらの免疫原性を上昇させるために、こ れらの糖複合体の担体分子への結合が好ましい。この目的のための好適な担体は 、巨大分子であり、例えば、天然ポリマー（アオガイヘモシアニン、アルブミン 、トキシンのようなタンパク質）、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアラニン） のような合成ポリマー、またはサポニンのような両親媒性化合物のミセルである 。 本発明のワクチンは、通常の能動免疫法において投与することができる：用量 処方に適合する方法での、および、予防的に有効な量での、即ち、毒性のトキソ プラズマ．ゴンディ寄生虫による免疫誘発に対する免疫を誘起する、抗原または その抗原 を発現し得る組み換え微生物を免疫化する量での、単一または反復投与。免疫は 、非予防摂取群と比較した、ある集団における予防摂取後の有意レベルの保護の 誘起として定義される。 ワクチンの投与は、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、ま たは鼻腔内投与によって、行うことができる。 さらに、ワクチンは、例えば、活性および／または貯蔵寿命を増加させるため に、他の成分と混合されていることが多い水性媒質または水含有懸濁液を含有す ることができる。これらの成分は、塩、ｐＨ緩衝剤、安定剤（脱脂乳またはカゼ イン水解物）、乳化剤、免疫応答を向上させる補助剤（例えば、油、ムラミルジ メプチド、アルミニウムヒドロキシド、サポニン、ポリアニオン、および両親媒 性物質）および防腐剤である。 本発明はさらに以下の実施例によって例示される：実施例： 実施例１ トキソプラズマゴンディタキゾイトの大規模生産 トキソプラズマ・ゴンディ（以下Ｔ．ゴンディと称する）のＲＨ株はトキソプ ラズマの研究において最も一般的に使用される実験用株である。Ｔ．ゴンディタ キゾイトの大規模生産を、 Ｖｅｒｏ細胞を含む細胞ファクトリー（６０００ｃｍ²）を０．３０−１．０の 感染多重度でタキゾイトに感染させることによって実施した。３７℃で３日間培 養した後、培地を取り除き、細胞を新鮮培地で再増殖させた。感染後６日目に、 細胞の上清を採集し、残存しているＶｅｒｏ細胞をリン酸緩衝生理食塩水液２０ ０ｍｌ（ＰＢＳ）で洗浄した。上清をプールし、タキゾイトを１０μｍのポリカ ルボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ） で濾過して、ＰＢＳで２回洗浄した。タキゾイトを遠心分離にかけ（１２００ｘ ｇ、５分間）、−７０℃で保存した。 基本的にＴｏｍａｖｏら（１９９２、ＪＢＣ、２６７、１１７２１−１１７２ ８）が述べたようにしてタキゾイトの代謝標識を行った。簡単に述べると、Ｖｅ ｒｏ細胞の集密単層（２５０ｃｍ²）を、２％ウシ胎児血清を補足したダルベッ コ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５×１０⁷のタキゾイトに感染させた。感 染後７２時間目に、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むグルコース不含のＤ ＭＥＭで細胞培養を２回洗浄した。０．５ｍＣｉ［³Ｈ］グルコサミンを補足し た同じ培地を用いて３７℃で４時間標識を行った。標識後、Ｄｏｕｎｃｅホモジ ナイザにおい て２０ストロークで宿主細胞から寄生生物を遊離させた。以前に述べられている ように（Ｇｒｉｍｗｏｏｄら、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．４８、２８２−２ ８６、１９７９）ガラスウール濾過によってタキゾイトを精製した。実施例２ 糖複合体の免疫反応性 精製したタキゾイトをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（硫酸ドデシルナトリウム−ポリアク リルアミドゲル電気泳動）およびウエスタンブロット法で分析して、ヒト抗トキ ソプラズマＩｇＭ抗体に関する糖複合体、特にＧＰＩ分子の免疫反応性を明らか にした。２０％ウシ胎児血清を補足したリン酸緩衝生理食塩水液（ＰＢＳ）と共 にニトロセルロースフィルターを常温で１時間インキュベートして、フィルター 上の結合部位をブロックした。その後、フィルターの細片を以前に報告された（ Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１、９７７−９８３、１９８３）ト キソプラズマの４−１０ｋＤａ分画に対するヒト抗トキソプラズマＩｇＭモノク ローナル抗体と共にインキュベートした。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ ４ ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＬＫＢ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓ ａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）をリガンドとして用いた親和性クロマトグラフィーによって得た ５つのヒト抗トキソプラズマＩｇＭ分画のプールを同様にして評価した。室温で ２時間インキュベートした後、細片をリン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ^R（ＰＢ ＳＴ）液で洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体と共に１ 時間インキュベートした。フィルター細片を洗浄し、５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリルホスフェートとニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ 、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えて免疫複合体を明 らかにした。ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−１およびＴＯＸ．ＨｕＯＴ−２と称されるどち らのヒト抗トキソプラズマＩｇＭモノクローナル抗体も、少なくとも３つのバン ドで表わされる低分子量の抗原を認識した（図１、レーン１および２）。プール したＩｇＭ抗体が種々のＴ．ゴンディ抗原を認識したのに対し、ヒトＩｇＭモノ クローナル抗体は、免疫優性抗原ｐ３０のようなＴ．ゴンディタンパク質に結合 したＧＰＩ分子を認識しない。モノクローナル抗体ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−１および ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−２に加えて、他の２つのモノクローナルＩｇＭ抗体を産生す る細胞系を同一のＴ．ゴンディ感染患者から調製した。ＴＯＸ． ＨｕＯＴ−３およびＴＯＸ．ＨｕＯＴ−８と称されるこれらのＩｇＭ抗体は、Ｔ ｏｘｏｎｏｓｔｉｋａ^R ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋ ａ Ｎ．Ｖ．，Ｂｅｌｇｉｕｍ）においてトキソプラズマ抗原と反応性であった が、ウエスタンブロット細片上のＧＰＩ分子とは反応しない（図１、レーン３お よび４）。 さらに、ｍＡｂ Ｔ５４Ｅ１０およびｍＡｂ Ｔ３３Ｆ１２と称される２つの マウスモノクローナル抗体がＴ．ゴンディの糖脂質分画向けられる（図１、レー ン５および６）。糖脂質に対するヒトおよびマウスのモノクローナル抗体はいず れも、結合していないＧＰＩ分子だけを認識する。たとえばｐ３０のようなＴ． ゴンディタンパク質に結合したＧＰＩ分子は、試験したモノクローナル抗体によ って認識されなかった。マウス抗ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（レーン７ ）および５つのヒト抗トキソプラズマＩｇＭ分画のプール（レーン８）を各々陰 性および陽性対照として使用した。 これらのデータは、ＧＰＩがタンパク質の末端アミノ酸のα−ＣＯＯＨ基にア ミド結合で共有結合するか、あるいはタンパク質−エタノールアミンブリッジの 形成後にＧＰＩが破壊され た時には、ＧＰＩ分子上のヒトＩｇＭエピトープならびにマウス抗体エピトープ はどちらも、もはや立体障害によりアクセスできないことを強く示唆している。実施例３ ＧＰＩ種の同定 Ｔ．ゴンディタキゾイトを、以前に述べられているように（Ｔｏｍａｖｏら、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１１７２１−１１７２８、１９９２；Ｔｏ ｍａｖｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、２１４４６−２１４５８、１ ９９２）、³Ｈ−グルコサミン、³Ｈ−マンノース、³Ｈ−パルミチン酸、³Ｈ−ミ リスチン酸、³Ｈ−ステアリン酸および³Ｈ−エタノールアミンで標識した。以前 に公表されている抽出手法（Ｍｅｎｏｎら、ＥＭＢＯ．Ｊ．、９、４２４９−４ ２５８、１９９０；Ｔｏｍａｖｏら、１９９２）に従って糖脂質を単離した。簡 単に述べると、タキゾイトをクロロホルム／メタノール（ＣＭ；２：１）で２回 抽出し、中性脂肪、リン脂質および極性の低い糖脂質を除去した。次に、より極 性の高い脂質を得るため、ＣＭ残留ペレットをクロロホルム／メタノール／水（ ＣＭＷ；１０：１０：３）で２回抽出した。ＣＭＷ抽出した糖脂質をプ ールし、水と水分飽和ｎ−ブタノール間で分配することによって精製した。ヒト ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を含有する血清サンプルならびに２つのマウスモノクロ ーナル抗体、Ｔ３３Ｆ１２とＴ５４Ｅ１０を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニ トロセルロース膜での電気泳動的移動を実施した後、ｎ−ブタノール分画の免疫 反応性を分析した。この試験により、ヒト抗トキソプラズマＩｇＭ抗体がＧＰＩ 種を強く認識したのに対し、ヒトＩｇＧはほとんど認識しないことが明らかにな った（図２）。 上述した生体内標識から得たｎ−ブタノール相を含む糖脂質を、あらかじめ用 意したシリカ６０ ＨＰＴＬＣプレート（１０×２０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ）上に個 々にスポットし、溶媒系ｎ−ヘキサン／クロロホルム／メタノール／水／酢酸（ ３：１０：１０：２：１）で展開した。 クロマトグラムを乾燥させ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ２８４２線形分析器を用 いて放射能を走査した。³Ｈ−グルコサミン、³Ｈ−マンノース、³Ｈ−ステアリ ン酸あるいは³Ｈ−パルミチン酸のいずれかで代謝標識したタキゾイトのｎ−ブ タノール分画を分析すると、６つの異なるピークがＴＬＣプレート上で一貫して 検出された（図３）。しかし、タキゾイトを³Ｈ−エタ ノールアミンで標識した時には放射能の３つのピークだけしか明らかにすること ができず（図３Ｄ）、６つの別々のＧＰＩ種の内の３つ、すなわちピーク分画Ｉ 、ＩＩ、ＩＩＩがエタノールアミン−リン酸塩分子を含むことを示唆した。 ³Ｈ−グルコサミンで標識した糖脂質を含むブタノール相を乾燥させ、１単位 ＰＩ−ＰＬＣ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ウ サギ血清１０μｌ（ＰＬＤのソースとして）、５０単位ＰＬＡ２（ハチ毒、Ｓｉ ｇｍａ）あるいは緩衝液１０μｌを各々補足した、０．１％デオキシコール酸ナ トリウムおよび２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む１ＯＯｍN4 トリス／ＨＣｌ ｐＨ７ ．４中に取った。サンプルを３７℃で１２時間インキュベートし、５分間煮沸し て酵素を不活化した。反応混合物を水とブタノール間で分配し、ブタノール相を ＴＬＣで分析した。すべての糖脂質がそれらのＧＰＩ構造を確認するＧＰＩ−Ｐ ＬＤおよびＰＩ−ＰＬＣに対して感受性であった。ＰＬＡ２に対する感受性は、 Ｔ．ゴンディ糖脂質の脂質成分がジアシルグリセロールを含むことを示唆してい る。実施例４ 種々のＧＰＩ種の免疫反応性 どのピーク分画がヒトＩｇＭ抗体によって認識されるＧＰＩ種であるかを示す ため、³Ｈ−グルコサミンで代謝標識した糖脂質をトレーサとして用いた予備的 ＴＬＣにより、個々の糖脂質種を精製した。展開したＴＬＣプレートの放射能の ピークに相当する部分を削り取り、ＣＭＷ １．５ｍｌで２回再抽出し、水と水 分飽和ｎ−ブタノール間で分配して残留シリカを除去した。種々のＧＰＩ種（２ ×１０⁷タキゾイトから誘導された物質を表わす）を、ブタノール１０μｌ中の 補強したニトロセルロース膜（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ） 上にスポットした。ニトロセルロース細片を３７℃で乾燥させ、５％ｗ／ｖ脱脂 粉乳のトリス緩衝生理食塩水液（１５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ｗ／ｖトゥイーン２０）中で一晩ブロックした。ブロッ トをトキソプラズマ患者血清ならびにｍＡｂ Ｔ５４Ｅ１０と共にインキュベー トした。洗浄した後、ブロットを適当な抗Ｉｇアルカリホスファターゼあるいは 抗Ｉｇペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートし、アルカリホスファター ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ） についてはＢＣＩＰとＮＢＴで、あるいは、ペルオキシダーゼ（ＥＣＬ，Ａｍｅ ｒｓｈａｍ）については供給業者のプロトコールに従って化学ルミネセンス検出 法を用いて展開した。図４および５に示すように、ヒト抗体、特にヒトＩｇＭお よびＩｇＧ抗体はピーク分画Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶと一貫して反応した。ｍＡ ｂ Ｔ５４Ｅ１０はピーク分画ＩおよびＩＩと反応した（図４）。 遊離エタノールアミン−リン酸基がＧＰＩ分子上のヒトＩｇＭエピトープの一 部であるかどうかを明らかにするため、ＥＬＩＳＡ阻害−結合試験を実施した。 ｎ−ブタノール分画のＧＰＩ種を、ウエル当り１０⁶タキゾイトに相当する被覆 濃度でマイクロタイターウエル上に被覆した。図６に示すように、ｍＡｂ Ｔ５ ４Ｅ１０のｎ−ブタノール種への結合だけがエタノールアミン−リン酸塩によっ て阻害された。エタノールアミン（１０ｍＭ）自体はｍＡｂ Ｔ５４Ｅ１０の結 合を５０％阻害することができた。試験した他のすべての化合物はモノクローナ ル抗体の結合を阻害することができなかった。しかし、ヒト抗トキソプラズマ抗 体の結合は試験した化合物のいずれによっても影響されなかった。実施例５ 代謝標識し、ＴＬＣ精製した糖脂質を用いたＧＰＩ種の構造についての分析 親水性頭基を生成するため、［³Ｈ］グルコサミンで標識したＴＬＣ精製糖脂 質を乾燥させ、０．２５Ｍ ＮａＮＯ₂を含む新鮮調製した０．１Ｍ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ３．５）４００μｌ中に懸濁して、室温で４時間インキュベートした 。０．４Ｍホウ酸３００μ１を加えて反応を停止させた。ブタノール／水相分配 後、脂質部分を欠く物質を水相に回収した。ＮａＢＨ₄を用いてこの物質を還元 し、以前に述べられているように（Ｆｉｅ１ｄ ＆ Ｍｅｎｏｎ，タンパク質の 脂質修飾、Ｈｏｏｐｅｒ＆ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ、１５５−１９０、１ ９９２）ＡＧ５０Ｗ−Ｘ１２で脱塩した。０．２ｍＭ ＺｎＣｌ₂、０．０２％ アジナトリウムおよび０．５Ｕジャック豆α−マンノシダーゼ（ＪＢＡＭ）ある いは緩衝液を含む５０ｍＭ ＮａＡｃ１００μｌ、ｐＨ４．５中に頭基を懸濁し 、３７℃で２４時間インキュベートした。個々の各糖脂質の親水性頭基を、ＪＢ ＡＭ処理前と処理後にバイオゲル Ｐ４ゲル濾過によって分析した。サンプルを 部分的に加水分解したデキストラン１５０μｌ （１５０ｍｇ／ｍｌ、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３ 、１０５−１２６、１９８２）と混合し、平衡させたＢｉｏｇｅｌ Ｐ４（Ｂｉ ｏｒａｄ）の１４０×１ｃｍカラムに充填して、２００ｍＭ酢酸アンモニウムで 溶出した。前述したように（Ｔｏｍａｖｏら、１９９２）オルシノール染色によ って標準的な検出を行った。６つの異なる糖脂質の内で、４つのサイズ型の親水 性頭基（各々９．５、８．５、７および６ＧＵ）が検出できた。ＪＢＡＭは、い ずれの末端の、置換されていないα−Ｄ−マンノース残基についても広い特異性 を持つ。糖脂質Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩから誘導される頭基は、マンノシダーゼ処理に 感受性のない糖脂質ＩＶ、ＶおよびＶＩから誘導されるものとは対照的であり、 これは標識データと共に、糖脂質Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの末端マンノースに結合 したリン酸エタノールアミンの存在を示唆している。 ＧＰＩ種の中核グリカンを単離するため、［³Ｈ］グルコサミン標識したＴＬ Ｃ精製糖脂質を脱リン酸化し、脱アミノ化して、基本的に以前に述べられている 方法に従って（Ｍａｙｏｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１、２ ９７−３０５、１９９０）還元した。簡単に述べると、４８％水性 ＨＦと共に０℃で６０分間インキュベートして脱リン酸化を実施し、凍結ＬｉＯ Ｈで中和して停止させた。反応混合物を脱塩し、脱アミノ化して、上述したよう にして還元し、最後にＡＧ５ＯＷ−Ｘ１２ １ｍｌならびにＣｈｅｌｅｘ１００ （Ｎａ⁺）０．４ｍｌ、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ１２（Ｈ⁺）０．２ｍ１、ＡＧ３−Ｘ４（ ＯＨ^-）０．４ｍｌおよびＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＯＨ−）０．２ｍｌの縦 列イオン交換カラムで脱塩して、０．２５μｍフィルターで濾過した。バイオゲ ル Ｐ４ゲルクロマトグラフィー、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＡＥＣおよびレクチン親 和性クロマトグラフィーによって中核グリカンを分析した。 放射標識した中核グリカンをＤｉｏｎｅｘ バイオ リキッド クロマトグラ フ（ＨＰＡＥＣ）で分析した。サンプルを部分的に加水分解したデキストランと 混合した後、１００ｍＭＮａＯＨで平衡させたＣａｒｂｏｐａｋ ＰＡ１カラム に充填した。１００％緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＯＨ）で６分間、その後緩衝 液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＯＨ、０．２５Ｍ ＮａＯＡｃ）を１ｍｌ／分の流速で ３０分間に０〜３０％まで直線的に増加させて溶出を実施した。０．４ｍｌの分 画を収集した。６つの糖脂質種すべてから中核グリカンが３ＤＵ（デキストラン 単位、 ここではＧｌｃ³）基準で同時溶出した。この溶出位置は単純なＭａｎ３−ＡＨ Ｍ中核グリカンの２．５ＤＵ溶出位置とは明らかに異なり、Ｔ．ゴンディＧＰＩ のグリカンの置換を示唆している。 ＴＬＣ精製したＧＰＩから誘導された放射標識中核グリカンを上述したように ＪＢＡＭ処理に供し、その後脱塩したサンプルをＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣによ って再分析した。主要反応産物の溶出位置は６種すべての糖脂質について２．４ ＤＵであった。この溶出位置は、トリマンノシル中核に結合した非マンノース置 換物質による遮断のためＪＢＡＭに対するグリカンの感受性がごく限られている ことと一致する（置換されていない中核グリカンはＪＢＡＭ処理後０．９ＤＵと して溶出する）。この置換物質の性質を調べるため、放射標識中核グリカンの単 糖類分析を実施した。[³Ｈ］グルコサミン標識した糖脂質ＩＩおよびＩＩＩから 誘導された中核グリカンを乾燥させ、４Ｎ ＨＣｌにより１００℃で４時間加水 分解した。冷却した反応混合物を乾燥させ、メタノール５％酢酸で２回、さらに メタノールで２回フラッシュ蒸発させた。加水分解産物を、各々の単糖類１０ｎ ｍｏｌを含む単糖類標準混合物と混合し、１ ｍｌ／分の流速で１５ｍＭ ＮａＯＨによる等力溶出を用いてＤｉｏｎｅｘ−Ｈ ＰＡＥＣによって分析し、０．２５ｍｌの分画を採集した。パルス電流滴定検出 法を用いて個々の単糖類標準物質の溶出位置を検出した。２つの放射標識単糖類 、アンヒドロマンニトールとガラクトサミンを同定した。アンヒドロマンニトー ルは、ＧＰＩの脱アミノして還元したアセチル化していないグルコサミンの誘導 体である。グルコサミンの所見は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ ）をＧＰＩ中核グリカンのさらなる成分として提案している。 末端ＧａｌＮＡｃ残基の存在を明らかにするため、６つの糖脂質種全部からの 中核グリカンを、末端β結合Ｎ−アセチルヘキソースアミンを開裂するエキソグ リコシダーゼである、βーＮ−アセチルヘキソサミニダーゼと共にインキュベー トした。簡単に述べると、０．５Ｕ組換え酵素（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ４．５１００μｌ中にサンプ ルを懸濁し、３７℃で１２時間インキュベートして、煮沸し、脱塩し、中核グリ カンに関して上述したようにＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣによって分析した。糖脂 質ＩＩＩおよびＶＩからの中核グリカンはヘキソサミニダーゼ処 理に対して感受性があった。ＨＰＡＥＣによる処理後、ＧａｌＮＡｃ（１ＤＵ） およびＭａｎ３−ＡＨＭ（２．５ＤＵ）と同時溶出する２つの分画が同定され、 これらのグリカン上にＮ−アセチルガラクトサミンが存在することのさらなる証 拠を提供した。ＧａｌＮＡｃがマンノシダーゼ活性を遮断する置換物質であるこ とを示すため、ヘキソサミニダーゼとＪＢＡＭによる連続的な処理を行った。こ のように処理した糖脂質ＩＩＩおよびＶＩからのグリカンのＨＰＡＥＣ分析は、 ＧａｌＮＡｃおよびアンヒドロマンニトールと同時溶出する２つのピークを生じ 、それらはＧａｌＮＡｃ残基の除去後、グリカンの完全なマンノシダーゼ感受性 を示した。これに対し、糖脂質Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶから誘導された中核グリ カンは、単糖類分析によってｎ−アセチルガラクトサミンが存在することが示さ れたが、ヘキソサミニダーゼ処理に対して感受性がなかった。 中核グリカンのバイオゲル Ｐ４ゲル濾過分析は、中核グリカンのサイズの不 均一性を示した。糖脂質ＩＩＩおよびＶＩから誘導された中核グリカンは、Ｍａ ｎ３ＧａｌＮＡｃ−ＡＨＭ標準形態ラット脳Ｔｈｙ１抗原膜アンカーおよび６Ｇ Ｕ標準物質（中核グリカンＡと称する）と同時溶出した。ヘキソサミニ ダーゼ非感受性糖脂質種Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶからのグリカンは、７ＧＵ標準 物質（中核グリカンＢと称する）と同時溶出した。これらの所見は、ＧａｌＮＡ ｃの酵素的除去を妨げるＧａｌＮＡｃ残基の付加的置換基の存在を示している。 これらのデータは、末端β１，４結合ＧａｌＮＡｃに特異的なレクチンである Ｗｉｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ凝集素を用いたレクチン親和性クロマ トグラフィーによって確認された。レクチン親和性クロマトグラフィーは以前に 述べられているように実施した（Ｎａｋａｎｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１１、１１７−１２６、１９９４）。簡単に述べると、糖脂 質ＩＩ、ＩＩＩから誘導される放射標識した中核グリカン（各々中核グリカンＡ およびＢ）とラット脳ＴＨＹ１膜アンカーを、０．０２％アジナトリウムを含む ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に平衡させたＷ．ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ 凝集素アガロース（５ｍｇレクチン／ｍｌゲル）の１ｍｌカラムに適用した。平 衡緩衝液２５ｍｌを使用し、次に１００ｍＭ Ｎ−アセチルガラクトサミンを特 異的阻害因子として含む同じ緩衝液１５ｍｌによって溶出を行った。中核グリカ ンＡとＭａｎ３ＧａｌＮＡｃＡＨＭ標準物質は カラムに結合し、特異的阻害因子ＧａｌＮＡｃで溶出しなければならなかったの に対し（図７）、中核グリカンＢはレクチンに対する親和性を示さず、これらの 種においてＧａｌＮＡｃは、存在するがさらなる置換物質のためにレクチンにア クセスできないことを明らかにした。実施例６ タキゾイト無細胞系を用いた生体外標識による中核グリカンＢの成分としてのグ ルコースの同定 生体外標識の実験的アプローチは、細胞培養においてタキゾイトの生体内標識 に関してしばしば遭遇する問題を克服することができる。これらの問題は主とし て、細胞内寄生生物を取り巻く様々な膜系（宿主細胞の細胞膜、寄生虫保持胞お よびタキゾイト膜）を通しての標識の移送効率が低いことおよび／あるいは過度 の異化代謝作用あるいは標識した糖のエピメリゼーションであり、これらすべて が効率の低い非特異的な標識につながる。ここではＴ．ゴンディＧＰＩの糖鎖形 成を示すために生体外標識を使用した。 感染させたＶｅｒｏ細胞培養からタキゾイトを単離し、上述したようにガラス ウール濾過によって宿主細胞膜から精製した。 Ｍａｓｔｅｒｓｏｎら（Ｃｅｌｌ ５６、７９３−８００、１９８９）のプロト コールに修正を加えて、生体外標識のための無細胞系を調製した。簡単に述べる と、ロイペプチン１μｇ／ｍｌと０．１ｍＭのトシルリシンクロロメチルケトン （ＴＬＣＫ）を含む氷冷水３７５μｌ中に、２×１０⁹のタキゾイトを氷上で５ 分間低張的に溶解し、その後Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザ３ｍｌ中５０ストローク で均質化した。溶解産物を等量の２倍濃縮したインキュベーション緩衝液（５０ ｍＭ ＮａＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 ０．１ｍＭ ＴＬＣＫおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン）と混合し、再び簡単に 均質化した。２×１０⁸タキゾイトを示すこのタキゾイト無細胞膜標本調製７５ μｌを各々のインキューベションチューブ（前乾燥させた糖ヌクレオチド、Ｃｏ ＡおよびＡＴＰを含む。下記参照）に加えて、３７℃で２時間インキュベートし た。インキュベーションチューブは１ｍＭ ＡＴＰ、ＣｏＡ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮ Ａｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧＤＰ−Ｍａｎ（ＧＤＰ−３Ｈ−Ｍａｎ以外 の標識の場合）および２μＣｉのＧＤＰ−３Ｈ−Ｍａｎあるいは５μＣｉのＵＤ Ｐ−３Ｈ−Ｇｌｕｃを含んだ。ＣＭ ２ｍｌを加えてイン キュベーションを停止させ、その後前述したようにＧＰＩの抽出を実施した。ブ タノール相に含まれる糖脂質から、上述したように脱リン、脱アミノ化および還 元によって中核グリカンを調製した。生じた中核グリカンをＤｉｏｎｅｘ−ＨＰ ＡＥＣおよびアミノプロピルＨＰＬＣによって分析した（図８）（実験の詳細に ついては実施例５参照）。 ＧＤＰ−３Ｈ−Ｍａｎによる生体外標識は、先に示されているように（Ｔｏｍ ａｖｏら、１９９２）Ｍａｎ３ＡＨＭを持つ中核グリカンおよび中核グリカンＡ （Ｍａｎ３（ＧａｌＮＡｃ）ＡＨＭ）を含む糖脂質の形成をもたらし、中核グリ カンＢはこれらの条件下では合成されない（図８Ｄ）。これに対し、ＵＤＰ−３ Ｈ−Ｇｌｃによる標識は、中核グリカンＢと同時溶出するアミノプロピル−ＨＰ ＬＣピークを生じ（図８Ｈ）、中核グリカンＡおよびＭａｎ３ＡＨＭは標識され なかった。ＵＤＰ−３Ｈ−Ｇｌｃにより標識した中核グリカンＢをアミノプロピ ル−ＨＰＬＣによって精製した。精製した標識グリカンをｒｅａｃｔｉ ｖｉａ ｌ^TMで乾燥させ、２Ｎトリフルオロ酢酸２００μｌを加えて加水分解を行い、１ ００℃で４時間インキュベートした。加水分解産物を脱塩し、上述したように Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣ単糖類分析に供した。すべての放射能がグルコース標 準物質と同時溶出した（図９）。このデータは、中核グリカンＢ中の付加的な置 換物質がグルコースであることを示す。この所見を確認するため、標識していな いＵＤＰ−Ｇｌｃによる刺激実験を実施した。上述したように調製したタキゾイ ト膜の無細胞系に１ｍＭ ＵＤＰ−Ｇｌｃを補足し、ＧＤＰ−３Ｈ−Ｍａｎで標 識した。これらの条件下で調製した中核グリカンの分析は、Ｍａｎ３ＡＨＭと中 核グリカンＡの存在の他に、中核グリカンＢの形成も示した（図８Ｆ）。実施例７ 中核グリカンＡおよびＢの完全な構造の解明 Ｔ．ゴンディＧＰＩ中核グリカンの構造解明のために選択した戦略は次の通り であった： １．抽出とブタノール／水相分離による多数のタキゾイトからの糖脂質の分離、 ２．６種すべての糖脂質を含むブタノール相からの脱リン、脱アミノおよび還元 による中核グリカンの調製、 ３．アミノプロピル相での中核グリカンＡおよびＢの予備的ＨＰＬＣ精製、およ び ４．メタノリシス／ＧＣ、ＦＡＢ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲによる精製グ リカンのさらなる分析。 中核グリカンＡおよびＢはＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣカラムで同時溶出し、バ イオゲル Ｐ４で不完全ながら分析されるので、アミノプロピル−ＨＰＬＣでサ ンプルを分離することにより、大量の各グリカン種を均一になるまで精製した。 Ｗａｔｅｒｓ ５１０ ＨＰＬＣ系を用いて中核グリカンを分析し、精製した 。分離系を確立するため、放射標識した中核グリカンを水５０μｌに入れて平衡 させたＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＮＨ２カラム（４．９×２５０ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ ）に充填し、水２８％、アセトニトリル７２％により１ｍｌ／分の流速で等力的 に溶出した。１ｍｌの分画を採集し、個々のグリカンの溶出位置をシンチレーシ ョン計数によって同定した（図１０Ａ）。ピークＡおよびＢを含む分画をプール し、バイオゲル Ｐ４ゲルクロマトグラフィー（図１０Ｅ、Ｇ）およびＤｉｏｎ ｅｘ−ＨＰＡＥＣ（図１０Ｄ、Ｆ）を用いて分析した。これらの実験は、ピーク Ａが中核グリカンＡ（バイオゲル Ｐ４で６ＧＵ標準物質と同時溶出する）と同 一であり、ピークＢが中核グリカンＢ（７ＧＵ標準物質と同時溶出する）と同一 であることを示 した。 標識していない物質の精製全体を通してトレーサとして使用するための放射標 識した中核グリカンを大量に得るため、化学的放射標識を実施した。２×１０⁹ から得た糖脂質を上述のように脱リン酸化し、脱アミノ化した。ｐＨを１０．５ に調整し、０．１Ｎ ＮａＯＨ１０μｌ中５ｍＣｉのＮａＢ［³Ｈ］Ｈ₄を加えて 放射標識を行った。酢酸で酸性化した後、サンプルを上述のように脱塩した。ア ミノプロピルＳｅｐ Ｐａｋ^TM−カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅ ｒｓ） １ｍｌでの固相抽出を適用して、放射化学的不純物を除去した。注射器 を用いて水８ｍｌ、エタノール２ｍｌおよびブタノール５ｍｌでカートリッジを 予備洗浄した。サンプルを水４０μｌ中に取り、ブタノール２ｍｌと混合してカ ートリッジに適用し、その後ブタノール２ｍｌ、ブタノール／エタノール（２： １）４ｍｌ、エタノール１８ｍｌおよび水３ｍｌを用いて溶出した。精製した放 射標識中核グリカンを水中で回収した。この物質を、Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣ 、バイオゲル Ｐ４およびアミノプロピル−ＨＰＬＣにより、代謝標識したＧＰ Ｉから生成される中核グリカンと並行して分析した。これらの分析は、２ｎｍｏ ｌ のグリカンを出発物質として代謝標識した糖脂質から誘導されるグリカンと同一 の純粋な放射標識物質（１．５×１０⁷ｃｐｍ）が得られることを示した。 予備的な目的で、中核グリカン２５ｎｍｏｌを各々５０，０００ｃｐｍの放射 性トレーサと混合した。１．５×１０¹¹タキゾイトからの中核グリカンをＨＰＬ Ｃによって精製し、およそ３０ｎｍｏｌのグリカンＡと１５０ｎｍｏｌのグリカ ンＢを産生した。この物質を単糖類分析と種々の質量分析およびＮＭＲ手法によ ってさらに分析した。 上述したようにメタノリシス溶解を実施した（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＧＰＩ膜ア ンカー：分離と分析；ｉｎ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者ＦｕｋｕｄａおよびＫｏｂａｔａ、ＩＲＬ Ｐｒ ｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ．第８章、３４９−３８３、１９ ９３）。簡単に述べると、各々２×１０¹⁰タキゾイトから誘導した中核グリカン ＡおよびＢを含むサンプルを乾燥させ、１Ｎ ＨＣｌを含む無水メタノールに懸 濁し、８５℃で２４時間インキュベートした。冷却した反応混合物をＡｇ₂ＣＯ₃ で中和し、無水酢酸２５μｌを加えて１５時間インキュベートすることにより再 び Ｎアセチル化した。遠心分離にかけた後、上清をｓｐｅｅｄｖａｃ^TM（Ｓａｖａ ｎｔ）で乾燥させ、新鮮調製したピリジン／ヘキサメチルジシラザン／トリメチ ルクロロシラン（Ｐｉｅｒｃｅ）５：１：１ ４０μｌを加えて３０分間反応さ せ、誘導を実施した。２５ｍ×０．３２ｍｍのＦｕｓｅｄＳｉｌｉｃａ ＣＰ− ＳＩＬ−５ＣＢカラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ ５８９０ガスク ロマトグラフを用いて、誘導された単糖類を分析した。最初の炉の温度は１３０ ℃で、４℃／分の割合で２２０℃まで上昇させ、水素炎イオン化検出した。 どちらのサンプルについても、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよ び２．５アンヒドロマンニトールがおよそ３：１：１の割合で検出され（図１１ ）、ＧａｌＮＡｃによって置換されたトリマンノシル中核構造の存在を示唆した 。中核グリカンＢを含むサンプルではＧａｌＮＡｃ １モル当りキシロース２． ８モルとグルコース２モルが同定され、中核グリカンＡを含むサンプルではグル コース１．３モルが同定された。どちらの糖も単糖類分析における頻度の高い夾 雑物であるが、ＡとＢの間で他の単糖類に相違がないことは、中核グリカンＢ中 に存在するＧａｌＮＡｃの置換物質としてキシロースあるい はグルコースのいずれかが想定される。この疑問に答えるために質量分析法を適 用した。 高速原子衝撃マススペクトロメトリ（ＦＡＢ−ＭＳ）による分析に先立って、 Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、７５３、１９８８）が述べたよ うにＣｉｕｃａｎｕ ＆Ｋｅｒｅｋ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ． １３１、２ ０９、１９８４）の方法に従って中核グリカンサンプルを過メチル化した。簡単 に述べると、サンプルを乾燥させ、粉末ＮａＯＨ１２０ｍｇ／ｍｌを含むジメチ ルスルホキシド（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌに懸濁した。絶えず撹拌しながらメ チルヨウ素（Ｓｉｇｍａ）２０μｌを３回加え、各々の添加後に１０分間のイン キュベーションを行った。チオ硫酸ナトリウムで反応を停止させ、過メチル化し たグリカンをクロロホルムで抽出し、水で洗浄して濃縮した。サンプルをメタノ ール５μ１に懸濁し、グリセロールのマトリックスに負荷した。ＷＡＴＶセシウ ムガンを取り付けたＦｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ９０マススペクトロメータ（Ｗａ ｇｎｅｒ Ａｎａｌｙｓｅｎ Ｔｅｃｈｎｉｋ）を２２ｋＶと２μＡで操作して スペクトルを得た。 過メチル化した中核グリカンＡについて記録されたＦＡＢス ペクトル（図１２）は、ｍ／ｚ １０７８．４の分子イオンおよびｍ／ｚ １１ ００．４の各々のナトリウム付加物を示した。この質量はグリカンＡについての Ｍａｎ−Ｍａｎ−（ＧａｌＮＡｃ）Ｍａｎ−ＡＨＭという提案した構造と一致す る。グリカンＢの分析は、各々のＭ⁺Ｎａ⁺イオンについてｍ／ｚ １２８２．７ およびｍ／ｚ １３０４．５のＭ⁺Ｎａ⁺イオンの検出をもたらした。従って過メ チル化した中核グリカンＡとＢの質量差は２０４．１Ｄであり、これは正確にグ リカンＢ上の付加的なヘキソース残基を証明している（Ｄｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆｕｋｕｄａ ＆ Ｋｏｂａｔａ（編集）、Ｏｘｆｏｒｄ、１ ８７−２２２、１９９３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリによる誘 導されないグリカンの分析はこの所見を確認した（データは示していない）。 １０¹¹タキゾイトから分離し、精製した中核グリカンＡおよびＢを、組成、ア ノメリーおよび連鎖型を確認し、定義するために核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）に 供した。Ｈａｒｄら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆｕｋｕｄａ ＆ Ｋｏｂａ ｔａ（編集）、Ｏｘｆｏｒｄ、２２１−２４２、１９９３）が述べたようにして 一次元５００ｍＨｚスペクトルを得、Ｍａｒｉｏｎ ら（Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．８５、３９３−３９９、１９８９）が述べた方法 に従って２Ｄ ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ Ｈａｒｍａｎｎ−Ｈａｈｎ（ＨＯＨＡ ＨＡ）スペクトルを、またＢｏｔｈｎｅｒ−Ｂｙら（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｅｍ．Ｓ ｏｃ．１０６、８１１−８１３、１９８４）に従って２Ｄ Ｒｏｔａｔｅｄ ｆ ｒａｍｅｎｕｃｌｅａｒ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果（ＲＯＥＳＹ）を得た。 中核グリカンＡおよびＢについて得たＩＤスペクトルを、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、７５３−７５９、１９８ ８）およびラット脳ＴＨＹ１（Ｈｏｍａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３３３、２６９ −２７２、１９８８）ＧＰＩ膜アンカーについて得られた公表されているスペク トルならびにデータベースと比較して解釈した。中核グリカンＡについては、３ つのα結合マンノース残基、アンヒドロマンニトールおよび１つのβ結合Ｇａｌ ＮＡｃからのアノマー陽子のシグナルが検出された（図１３）。中核グリカンＢ は、サッカロースおよびマルトースと比較してα結合グルコースと同定された付 加的なαアノマーシグナルを示した。これらの所見は、中核グリカンＢに関する ＨＯＨＡＨＡ分光を用いて確認 され、さらなる陽子に拡大された。中核グリカンＡおよびＢについて同定された 陽子のｐｐｍ値を表１に要約する。 表１：１Ｄおよび２Ｄ ＨＯＨＡＨＡ ＮＭＲによって得た中核グリカンＡおよ びＢからの陽子配列 中核グリカンＡ： 中核グリカンＢ： ＲＯＥＳＹ分光を中核グリカンＢに適用し、グリコシド結合に関わる各々の単 糖類残基の炭素原子を同定した。表２は関連する交叉ピークをまとめたものであ る。 表２：中核グリカンＢにおけるグリコシド結合を同定するＲＯＥＳＹ交叉ピーク これらのデータは、Ｔ．ゴンディ中核グリカンＡおよびＢのマンノースバック ボーンが、以前に述べられた進化的保存構造Ｍａｎα１，２−Ｍａｎα１，６− Ｍａｎα１，４−ＡＨＭ（ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅ ＆ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４、３０５−３２４、１９９３）と同じであることを示し ている。中核グリカンＢにおいて、ＧａｌＮＡｃは最初のマンノース（ＡＨＭの 近位）にβ−１，４結合しており、グルコースはＧａｌＮＡｃにα−１，４結合 している。中核グリカンＡの構造はラット脳ＴＨＹ１膜アンカーのマンノシル化 して いない中核グリカンの構造に類似しているが（Ｈｏｍａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ３ ３３、２６９−２７２、１９８８）、中核グリカンＢはＧａｌＮＡｃに連結した α結合グルコースを含む、まだ文献中では記述されていない構造を持つ。 グリコシド結合の位置に関するＮＭＲ分光学によって得られたデータは、以前 に公表された手法（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、７５３−７５ ９、１９８８）に従って実施したメチル化分析によって確認された。簡単に述べ ると、８０ｎｍｏｌの中核グリカンＢを過メチル化し、酸加水分解して、生じた 過メチル化単糖類を還元し、アセチル化した。この処理後に、部分的に過メチル 化されたアルジトールアクタル（ＰＭＡＡ）が得られる。この物質は、加水分解 の前に有していたグリコシド結合の数と位置に依存して、メチル化対Ｏアセチル 化の度合が異なる。これらのＰＭＡＡはガスクロマトグラフィー−マススペクト ロスコピー（ＧＣ−ＭＳ）を用いて分離し、数量化することができる。個々のピ ークの総イオン流動クロマトグラムと質量スペクトルを図１４に示す。ＧＣ保持 時間と質量スペクトルにより、２つの末端ヘキソース残基（末端マンノースとグ ルコースを表わす）、すなわち１つは炭素１、２ で結合しているヘキソース、１つは炭素１、４、６で結合しているヘキソースで あり、さらに炭素１、４で結合しているＮ−アセチルヘキソサミンのＰＭＡＡと して、４つのＧＣピークが検出され、同定された。得られた構造も図１４に示し ているが、ＮＭＲおよびエキソグリコシダーゼ配列決定によって得られたデータ と一致する。 Ｔ．ゴンディ不含ＧＰＩの構造分析において得られたすべてのデータが図１５ に示す構造と一致する。 グリカン中核構造ＡおよびＢの構造説明を図１６に示す。実施例８ 中核グリカンＡおよびＢの糖複合体構造の化学的合成と結合 合成： 化合物ＡおよびＢならびにそれらの類似化合物は種々の経路によって合成する ことができる。一例として五糖類１３の合成を概説する。化合物Ｂの後者の類似 化合物においては、五糖類と高分子担体を結合しやするくするために、可欠アン ヒドロマンニトール単位を３−アミノプロピルリンケージハンドルによって置換 する。その代わりに、異なる鎖の長さを持つ、あるいは結合目的に適した他の官 能基（たとえばカルボキシル酸、チ オールあるいはハロゲン化物）を含むリンケージハンドルを使用してもよい。合 成は、市販のエチル１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシドから標準的な手法によ って（たとえばｐ−トルエンスルホン酸の存在下で、ｐ−メトキシベンズアルデ ヒドジメチルアセタールにより４，６−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン基を導入 し、その後生じた２，３ジオールを臭化ベンジルと水素化ナトリウムでベンジル 化する）容易にアクセスできる、マンノース単位１から出発する。Ｎ−ヨードス クシニミド（ＮＩＳ）と触媒性トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）の存 在下で（Ｖｅｅｎｅｍａｎら、１９９０、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、 ３１、１３３１）、化合物１と３−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノープロ パン−１−オルを反応させると（Ｂｅｒｎｔｓｓｏｎら、１９７７、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ．Ｓｕｅｃ．、１４、２２９）、化合物２が形成される。化合物２を （ＤＭＦ）中でＮａＢＨ₃ＣＮおよび無水ＣＦ₃ＣＯＯＨで処理して（Ｊｏｈａｎ ｓｓｏｎら、１９８４、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ 、２３７１）、選択的に除去できる６−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル（Ｍｂｎ）官 能基を持つ化合物３を生成する。３と、グルコサミンについて報告 された（Ｂｌａｔｔｅｒら、１９９４、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．、 ２６０、１８９）のと同様の手法によって調製したＮ−トリクロロアセチル−（ ＴＣＡ）ガラクトサミン誘導体４をトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホ ネート（ＴＭＳＯＴｆ）の存在で結合させると、二糖類５が生じる。Ｂｕ₃Ｓｎ Ｈと２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）によって トリクロロアセチル（ＴＣＡ）基をアセチル基に転換させる。３つのＯ−アセテ ートのけん化によって対応するトリオールにアクセスすることができ、その４− および６−ＯＨ官能基は２段階の工程を用いて選択的にベンジル化することがで きる：１）過剰のＢｕ₂ＳｎＯによる処理および２）ＣｓＦの存在下でのＢｎＢ ｒとの反応。生じる誘導体は、（ＮＩＳ）および触媒性ＴｆＯＨの存在下で（Ｖ ｅｅｎｅｍａｎら、１９９０、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３１、１ ３３１）、３−ＯＨ官能基においてグルコース単位６と連結してトリマー７を生 じる。７を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤ Ｑ）で処理すると（Ｏｉｋａｗａら、１９８２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ ｔｔ．、２３、８８５）化合物８を生じる。ＮＩＳ− ＴｆＯＨの存在下で８をマンノース単位９と反応させると（Ｅｌｉｅら、１９９ ０、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４６、８２４３）テトラマー１０を生じ、その２ −Ｏ−ベンゾイルをＮａＯＭｅでけん化して除去すると１１が生成される。１１ を９で縮合すると五糖類１２を導く。最後に、炭素上で１０％Ｐｄの存在下に１ ）ＮａＯＭｅおよび２）水素添加によって保護基を除去すると、標的とする化合 物１３が得られる。 結合： 五糖類１３は、以前に述べられているように（Ｅｖｅｎｂｅｒｇら、１９９２ 、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６５、Ｓ１５２−Ｓ１５５）タンパク質担体 に容易に連結することができる。まず最初に、１３を市販されているアセチルチ オ酢酸のヒドロキシスクシニミドエステルと反応させて、１４を生成する。次に 化合物１４をヒドロキシルアミンの存在下でブロモアセチル化したタンパク質（ たとえばＢＳＡ、ＫＬＨ、破傷風トキソイド）に連結して、複合体１５を生成す る。その代わりに、グルタルジアルデヒドの存在下で１３を直接タンパク質に連 結して五糖類−タンパク質複合体を生成することもできる。 上述した合成および結合は、反応の概要を表わした図１７に 例示されている。図面の簡単な説明： 図１．Ｔ．ゴンディの精製タキゾイトの総溶解産物のウエスタンブロット分析に よって明らかにされたようなモノクローナルおよびポリクローナル抗体の抗原特 異性。糖脂質に対する２つのヒト抗トキソプラズマＩｇＭモノクローナル抗体Ｔ ＯＸ．ＨｕＯＴ−１とＴＯＸ．ＨｕＯＴ−２（各々レーン１とレーン２）、陰性 対照として２つのヒト抗トキソプラズマＩｇＭモノクローナル、ＴＯＸ．ＨｕＯ Ｔ−３とＴＯＸ．ＨｕＯＴ−８（レーン３、４）、マウス抗糖脂質モノクローナ ル抗体Ｔ５４Ｅ１０とＴ３３Ｆ１２（各々レーン５と６）、マウス抗ヒト絨毛性 ゴナドトロピンホルモン（レーン７）および陽性対照として５つのヒト抗トキソ プラズマＩｇＭ分画のプール（レーン８）と共に、フィルターをインキュベート した。 図２：Ｔ．ゴンディ糖脂質（ブタノール相）のウエスタンブロット分析；ヒトセ ロコンバーション血清ＩｇＭ（Ａ）およびＩｇＧ（Ｂ）とマウスモノクローナル 抗体Ｔ３３Ｆ１２（Ｃ）とＴ５４Ｅ１０（Ｄ）（Ｔｏｍａｖｏら、Ｐａｒａｓｉ ｔｏｌ．１０８：１３９−１４５、１９９４） 図３：Ｔ．ゴンディ糖脂質のＴＬＣ分析：³Ｈ−グルコサミン（Ａ）、³Ｈ−パル ミチン酸（Ｂ）、³Ｈ−マンノース（Ｃ）および³Ｈ−エタノールアミン（Ｄ）で 代謝標識した寄生生物から誘導したブタノール相。 図４：ＴＬＣ精製したＴ．ゴンディ糖脂質のドットブロット分析：ＴＬＣ精製し た糖脂質をニトロセルソースにスポットし、５つのヒトα−Ｔｏｘ ＩｇＭ分画 のプールおよびマウスα−糖脂質ｍＡｂ Ｔ５４Ｅ１０と反応させた。 図５：ＴＬＣ精製したＴ．ゴンディ糖脂質のドットブロット分析：ＴＬＣ精製し た糖脂質をニトロセルロースにスポットし、ヒトセロコンバーション血清と反応 させた。 図６：阻害ＥＬＩＳＡ：抗原としてブタノール相に含まれる糖脂質とｍＡｂ Ｔ ５４Ｅ１０を用いた阻害ＥＬＩＳＡ 図７：Ｗｉｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ凝集素アガロースでの、³Ｈ− グルコサミンで標識したＴＬＣ精製糖脂質から誘導した中核グリカンの分析：中 核グリカンＡ（Ａ）、中核グリカンＢ（Ｂ）、ラット脳Ｔｈｙ１アンカーからの Ｍａｎ４ＧａｌＮＡｃＡＨＭ（Ｃ）、矢印は緩衝液の変更を示す。 図８：タキゾイト無細胞系を用いて生体外で標識した糖脂質か ら誘導した中核グリカンのＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＡＥＣおよびアミノプロピル−Ｈ ＰＬＣ分析：左側の列はＨＰＡＥＣ分析、右側の列はアミノプロピル−ＨＰＬＣ 分析を示す；Ａ、Ｂ：生体内で標識した糖脂質から誘導した中核グリカン；標識 していないＵＤＰ−Ｇｌｃの不在下（Ｃ、Ｄ）および存在下（Ｅ、Ｆ）でＧＤＰ −３Ｈ−Ｍａｎにより生体外で標識した糖脂質から誘導した中核グリカン；Ｇと ＦはＵＤＰ−３Ｈ−Ｇｌｃにより生体外で標識した糖脂質から誘導した中核グリ カンを示す。 図９：ＵＤＰ−３Ｈ−Ｇｌｃを通して生体外で標識したＨＰＬＣ精製中核グリカ ンＢのＨＰＡＥＣ単糖類分析：中核グリカンＢを２Ｎ ＴＦＡにより１００℃で ４時間加水分解し、脱塩して、１５ｍＭ ＮａＯＨでの等力的溶出を用いたＨＰ ＡＥＣにより分析した。 図１０：ブタノール相から直接の中核グリカンの予備的ＨＰＬＣ精製：³Ｈ−グ ルコサミンで標識した糖脂質（ブタノール相）から誘導した中核グリカンをＬｉ ｎｃｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ₂（Ａ）で分離し、当量の物質（Ｂ、Ｃ）およびピー クＡ（Ｄ、Ｅ）とＢ（Ｆ、Ｇ）の下でプールした分画をＨＰＡＥＣ（左側の欄） とバイオゲル Ｐ４（右側の欄）によって分析した。ア ラビア数宇はデキストラン加水分解産物内部標準の位置を示す。 図１１：中核グリカンサンプルのＧＣ単糖類分析：中核グリカンＡ（Ａ）および Ｂ（Ｂ）を含むＨＰＬＣ分画をメタノール分解し、再びＮ−アセチル化して、Ｔ ＭＳ誘導し、ＧＣによって分析した。 図１２：中核グリカンの高速原子衝撃マススペクトロスコピー（ＦＡＢ−ＭＳ） ：ＨＰＬＣ精製した中核グリカンＡ（Ａ）およびＢ（Ｂ）を過メチル化し、ＦＡ Ｂ−ＭＳによって分析した。 図１３：中核グリカンＡおよびＢの５００ｍＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル 図１４：中核グリカンＢのメチル化分析：中核グリカンＢ ８０ｎｍｏｌを過メ チル化し、加水分解し、還元し、アセチル化して、生じたＰＭＭＡをＧＣ−ＭＳ によって分析した。この数字は総イオンクロマトグラムを表わす。 図１５：Ｔ．ゴンディ糖複合体構造の概要図。構造は本発明に従った糖複合体を 示す。糖複合体は、末端エタノールアミンホスフェートおよび／あるいはその脂 質部分の存在あるいは不在によって異なりうる。 図１６：トキソプラズマ糖複合体構造の構造説明。構造は本発 明に従った糖複合体を示す。Ａは独自のグルコース残基が存在しない中核グリカ ンであり、Ｂは固有のグルコース残基が存在する中核グリカンである。Ｒ１およ びＲ２基は明細書中に述べられている。糖複合体は末端エタノールアミンホスフ ェートおよび／あるいはその脂質部分の存在あるいは不在によって異なりうる。 図１７：反応概要図。反応概要図の中で、本発明に従った糖複合体の合成および 結合を実施例８に従って詳細に示す。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタベスト条約 国際書式 宛先 この頁の下に証明される国際受託局 オルガノン テクニカ によって、規定７．１に従って発行 バイオサイセンス リサーチ された原寄託の受託証 ユニット（Ｆ１２１１） ボセインド １５ ５２８１ Ｒｍ ボックステル、オランダ国 寄託者の氏名および住所 ¹ 規定６．４（ｄ）が適用される場合は、その日付は、国際受託局が資格を得 た日付である。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタベスト条約 国際書式 宛先 次頁に証明される国際受託局によっ オルガノン テクニカ て、規定１０．２に従って発行され バイオサイセンス リサーチ る生存能力申告書 ユニット（Ｆ１２１１） ボセインド １５ ５２８１ Ｒｍ ボックステル、オランダ国 生存能力申告書が発行される者の 氏名および住所 ¹ 原寄託日、あるいは新規寄託または移転がなされた場合は、最も最近の関連 する日付（新規寄託日または移転日）を示す。² 規定１０．２（ａ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において言及される場合は、 最も最近の生存能力試験日に言及する。³ 該当する箱にＸ印をつける。 ⁴情報が要請された場合、および試験結果が陰性であった場合に記入。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタベスト条約 国際書式 宛先 この頁の下に証明される国際受託局 オルガノン テクニカ によって、規定７．１に従って発行 バイオサイセンス リサーチ された原寄託の受託証 ユニット（Ｆ１２１１） ボセインド １５ ５２８１ Ｒｍ ボックステル オランダ国 寄託者の氏名および住所 ¹ 規定６．４（ｄ）が適用される場合は、その日付は、国際受託局が資格を得 た日付である。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタベスト条約 国際書式 宛先 次頁に証明される国際受託局によっ オルガノン テクニカ て、規定１０．２に従って発行され バイオサイセンス リサーチ る生存能力申告書 ユニット（Ｆ１２１１） ボセインド １５ ５２８１ Ｒｍ ボックステル オランダ国 生存能力申告書が発行される 者の氏名および住所 ¹ 原寄託日、あるいは新規寄託または移転がなされた場合は、最も最近の関連 する日付（新規寄託日または移転日）を示す。² 規定１０．２（ａ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において言及される場合は、 最も最近の生存能力試験日に言及する。³ 該当する箱にＸ印をつける。 ⁴情報が要請された場合、および試験結果が陰性であった場合に記入。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 15/207 Ｃ０７Ｈ 15/207 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｐ 19/44 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ストリーペン，ボリス アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19104、 フイラデルフイア、ロウカスト・ストリー ト・4247 (72)発明者 シユバルツ，ラルフ・テー ドイツ国、デー−35435・ベツテンベルク ヘーエンシユトラーセ・31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式： ［式中： Ｒ１は、水素、−ＰＯ₃−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂（エタノールアミン−ホスフェー ト）、または−ＰＯ₃−ＣＨ₃−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｘ［式中、ＸはＴ．ゴンディ特異 的抗原］； Ｒ２は、ホスファチジルイノシトール膜アンカーのイノシトール部分に必要によ りα（１−６）結合した、α−Ｏ−Ｒ４、α（１−４）−Ｏ−アンヒドロマンニ トールまたはα（１−４）−Ｏ−グルコサミン； Ｒ３は、単糖部分； Ｒ４は、水素または−Ｌ−Ｒ５［式中、Ｌは、二価有機ラジカル、および、Ｒ５ は担体への結合を可能にする官能基］］ で示されるグリカン中核構造を含んで成る糖複合体。 ２．該単糖成分がヘキソース成分であることを特徴とする請求項１に記載の糖複 合体。 ３．該ヘキソース成分がグルコース成分であることを特徴とする請求項２に記載 の糖複合体。 ４．該グルコース成分が、α−１，４グリコシド結合によって、ＧａｌＮＡｃ成 分に結合されることを特徴とする請求項３に記載の糖複合体。 ５．該糖複合体が、下記構造： ［式中、ＸはＴ．ゴンディ特異的抗原である］ を含んで成ることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の糖複合体。 ６．該糖複合体が、下記段階： −タキゾイト膜の破壊、および −得られるタキゾイト懸濁液の、クロロホルム／メタノール ／水（Ｃ／Ｍ／Ｗ：１／１／０．３ｖ／ｖ）混合物での抽出、から成る単離方法 によってＴ．ゴンディタキゾイトから得られることを特徴とする請求項１〜５の いずれか１つに記載の糖複合体。 ７．該糖複合体が、寄託番号９５０９０６０８または９５０９０６０９として、 ＥＣＡＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託されている不死化細胞系によって 産生されるヒトモノクローナル抗体に免疫反応性である請求項１から６のいずれ か１つに記載の糖複合体。 ８．該抗体が、請求項１〜７のいずれか１つに記載の糖複合体に免疫反応性であ ることを特徴とするＴ．ゴンディ糖複合体に対する抗体。 ９．該抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８に記載の抗 体。 １０．Ｔ．ゴンディ糖複合体のエピトープに結合するモノクローナル抗体であっ て、このエピトープが、寄託番号９５０９０６０８および９５０９０６０９とし てそれぞれＥＣＡＣＣ，ポートンダウン（英国）に寄託されているハイブリドー マ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−１または ＴＯＸ−ＨｕＯＴ−２によって認識されるモノクローナル抗体。 １１．寄託番号９５０９０６０８および９５０９０６０９としてそれぞれＥＣＡ ＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託されているハイブリドーマ細胞系によっ て産生されるモノクローナル抗体ＴＯＸ．ＨｕＯＴ−１またはＴＯＸ−ＨｕＯＴ −２。 １２．請求項９〜１１のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体を産生するこ とができる不死化細胞系。 １３．寄託番号９５０９０６０８および９５０９０６０９としてそれぞれＥＣＡ ＣＣ，ポートン ダウン（英国）に寄託されてい不死化細胞系。 １４．請求項１〜７のいずれか１つに記載の糖複合体を含んで成ることを特徴と する免疫化学試薬。 １５．請求項８〜１１のいずれか１つに記載の抗体を含んで成ることを特徴とす る免疫化学試薬。 １６．試験液が請求項９〜１１のいずれか１つに記載の抗体と接触され、その後 に、免疫複合体の存在が検出されることを特徴とする、試験液中のＴ．ゴンディ の検出方法。 １７．請求項１４に記載の免疫化学試薬が、試験液と接触され、該試験液中に形 成される免疫複合体の存在が検出されることを 特徴とするＴ．ゴンディに対する抗体の検出方法。 １８．請求項１５に記載の免疫化学試薬が試験液と接触され、それにＴ．ゴンデ ィに対する抗体が接触され、形成される免疫複合体の存在が検出されることを特 徴とする試験液中のＴ．ゴンディの検出方法。 １９．試験キットが、請求項１４に記載の免疫化学試薬を含んで成ることを特徴 とするＴ．ゴンディ感染の検出のための試験キット。 ２０．試験キットが、請求項１５に記載の免疫化学試薬を含んで成ることを特徴 とするＴ．ゴンディ感染の検出のための試験キット。 ２１．治療試薬が、請求項１〜７のいずれか１つに記載の糖複合体の生合成を阻 害する特異的阻害剤を含んで成ることを特徴とする、Ｔ．ゴンディ寄生虫の複製 の阻害のための治療試薬。 ２２．請求項２１に記載の治療試薬によって、ＧＰＩアンカー抗原の表面発現が ブロックまたは阻害されることを特徴とする、弱毒Ｔ．ゴンディ生ワクチンの製 造方法。