JP2000500968A

JP2000500968A - CRF analogs and their use in photoaffinity labeling of CRF receptors

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Publication number: JP2000500968A
Application number: JP9518589A
Authority: JP
Inventors: シュピース，ヨアヒム; リューマン，アンドレアス; ケップケ，アンドレアス
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・アインゲトラーゲナー・フェアアイン
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 2000-02-02
Also published as: EP0866856A1; WO1997018306A1; CA2237548A1

Abstract

(57)【要約】本発明は光活性化可能成分と標識を持つＣＲＦまたはその類縁体、ＣＲＦレセプターおよびＣＲＦ結合タンパク質の検出ならびにその結合部位の同定におけるそれらの使用に関する。 (57) SUMMARY The present invention relates to the detection of CRF or analogs thereof having a photoactivatable component and a label, CRF receptors and CRF binding proteins, and their use in identifying binding sites.

Description

【発明の詳細な説明】ＲＦ類縁体およびＣＲＦレセプターの光親和性標識におけるそれらの使用本発明は光活性化可能成分と標識（ラベル）とを保持するＣＲＦまたはその類縁体、ならびにＣＲＦレセプタータンパク質およびＣＲＦ結合タンパク質の検出とその結合部位の同定および特徴づけにおけるそれらの使用に関する。副腎皮質剌激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）は、ＣＮＳ内のストレスに対する内分泌反応、自律神経反応、免疫反応および行動反応を統合しているようである。この41アミノ酸からなるポリペプチド（1）は、当初、副腎皮質からの糖質コルチコイドの分泌を剌激することが知られている副腎皮質剌激ホルモン（ＡＣＴＨ）（2）の放出を剌激するというその下垂体剌激活性に基づいて特徴づけられた。ＣＲＦが視床下部-下垂体-副腎（ＨＰＡ）軸の主な制御因子であり、ストレスにさらされた時に糖質コルチコイドの放出をもたらすことは、広く認められている。内分泌、自律神経および免疫系におけるＣＲＦの様々な機能は、種々のレセプタータンパク質によって媒介される。これらレセプターの多くは研究され、ＣＲＦファミリーのいくつかの相同体が、その結合親和力と生物効力について調べられている。ＣＲＦはＧタンパク質共役レセプターを介してその活性を発揮する。主として下垂体と脳内に認められるＣＲＦレセプター１型（ＣＲＦＲ１）は、ヒト、マウスおよびラットの脳ならびにヒトクッシング副腎皮質剌激細胞腫から独立してクローン化されている（３−６）。ＣＲＦレセプター２型の２つのスプライス変種（ＣＲＦＲ２ａとＣＲＦＲ２ｂ）をコードするｃＤＮＡは、脳、心臓および骨格筋からクローン化された（７−１０）。最近、天然に存在するＣＲＦ類縁体ウロコルチン（urocortin; Ucn）は、ＣＲＦＲ２の内因性リガンドであると提唱されている（１１）。ＣＲＦ受容体とは別に、３７kＤaのＣＲＦ結合タンパク質が特徴づけられている。ＣＲＦＲ１やＣＲＦＲ２の既知のスプライス変種のいずれとも相同でないこのタンパク質は、ヒト／ラットＣＲＦ（ｈ／ｒＣＲＦ）に高い親和力で結合するが、ヒツジＣＲＦ（ｏＣＲＦ）には高い親和力で結合しないことが示されている（１２）。ｈ／ｒＣＲＦに基づくアミノ酸配列を持つ極めて強力なＣＲＦ拮抗薬アストレッシン（astressin）、シクロ（３０−３３）［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38 ,Ｇlu³⁰，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１２−４１）、はＣＲＦＲ１に対してｈ／ｒＣＲＦと同様の結合親和力を示すが、ＣＲＦ結合タンパク質には結合しなかった（１３）。試験管内下垂体細胞培養アッセイでアストレッシンがＣＲＦ媒介性ＡＣＴＨ放出を阻害する生物効力は、ｈ／ｒＣＲＦのアミノ酸５〜３６から伸びる、αヘリックスと推定されるぺプチド部分の末端に組込まれたラクタム橋によるものとされた（１３，１４）。意外なことに、それと同じラクタム橋モチーフをぺプチドに導入しても、ｈ／ｒＣＲＦが下垂体細胞のＡＣＴＨ分泌を剌激する効力は有意に増大しなかった。したがって、ＣＲＦレセプター活性化と分子全体のαらせん性の誘導は、ＣＲＦのＮ−末端によるものと考えられた（１３）。最近、ｒＣＲＦＲ１とラット成長ホルモン放出因子レセプター（ｒＧＲＦＲ）のキメラレセプターを一時的に発現させるＣＯＳＭ６細胞を用いた結合試験で、ｒＣＲＦＲ１のＮ末端（ｒＣＲＦＲ_N）に対するアストレッシンの高親和性結合が示された。ＣＲＦぺプチド作用薬ｈ／ｒＣＲＦとウロコルチンがｒＣＲＦＲ_N／ｒＧＲＦＲに結合すると、やはりｃＡＭＰ生産が起こるが、その程度はｒＣＲＦＲ１のＣＲＦ剌激より低かった（１５）。別の７回膜貫通型Ｇタンパク質共役レセプターの特徴づけに関する研究では、部位特異的突然変異導入法により、性腺剌激ホルモン放出ホルモンの作用薬結合と拮抗薬結合の結合部位が異なることが明示された（１６）。ＣＲＦが重要な機能を数多く持つことから、ＣＲＦのそのレセプターに対する作用薬および拮抗薬結合をより詳しく調べるためには、ＣＲＦ結合に直接関与するアミノ酸配列を同定すると共に、ＣＲＦレセプターとＣＲＦ結合タンパク質がリガンドと結合した後にたどる細胞生物学的運命を、高い親和力でＣＲＦを結合するタンパク質に共有結合した標識として役立つＣＲＦ類縁体を用いて研究することが有益だろう。［¹²⁵Ｉ］Ｔyr⁰ｏＣＲＦによる化学的架橋は、その架橋効率が極めて低く、しかも架橋後の化学的および酵素的切断によって、標識が架橋されたＣＲＦレセプターから除去されるので、実際の結合部位を特徴づけるには適さないことがわかっている。ウシ下垂体前葉膜（１７）、ＡｔＴ−２０マウス下垂体腫瘍細胞（１８）、ラットの脳および下垂体前葉（１９，２０）の膜に二官能性試薬を適用することにより、５８,０００〜７５,０００の範囲の分子量を持ついくつかのＣＲＦレセプター架橋体が特徴づけられている。しかし、現在までに報告されているＣＲＦ架橋体はすべて、極めて低収率（＜１％）でしか得られなかった。単官能性光親和性プローブによる標識は、二官能性試薬を用いる化学的架橋法による標識より高い収率を与えると期待される。また光活性化は、カルベンやナイトレンのように反応性の高い分子種を、照射により温和な条件下で選択的に生成することができるので、熱的活性化よりも優れていると思われる。生成したカルベンやナイトレンは、Ｘ−Ｈ結合中に挿入できるので、化学的な親和性標識（アフィニティーラベル）に対しては通常不活性な基を攻撃することができる。光親和性標識（フォトアフィニティーラベル；ＰＡＬ）技術を用いるすべての実験にとって必要な条件は、光活性化可能なリガンドが高い親和力でレセプターに結合し、しかも、そのレセプターがその標識の活性化に使用する光によって破壊または不活化されないことである（２１，２２）。最近、温和な条件での光化学分解が可能な新しい種類の光活性化可能化合物アリールジアジリン（aryldiaz irine）類が開発された。したがって、本発明の根底にある技術的課題は、レセプターに効率よく高い親和力で結合し、そのレセプターの不可逆的な標識をもたらすＣＲＦまたはその類縁体を提供することである。この技術的課題に対する解答は、請求の範囲に特徴づける態様によって与えられる。したがって、本発明は、光活性化可能成分と標識とを保持するＣＲＦまたはその類縁体を提供する。この場合、「類縁体」という用語は、ＣＲＦリガンド結合活性を保持するＣＲＦの任意の変種または断片を包含する。特定の態様では、その光活性化可能成分と標識が互いに隣接する。光活性化可能成分は、好ましくは、光親和性標識を温和な条件下に適当な波長で行ないうるような性質を持つべきである。光活性化可能成分の例は、４−（１ −アジ−２，２，２−トリフルロエチル）べンゾイル残基またはそのフェニルアラニン類縁体である。標識は、例えば¹²⁵Iなどの放射活性マーカーや、フルオレセインなどの蛍光マーカー、あるいは蛍光基を持つアビジンと相互作用するビオチンによるものであってもよい。本発明の好ましい態様は、ＣＲＦ作用薬４−（１−アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）べンゾイルー［¹²⁵Ｉ］−チロシン⁰ｏＣＲＦ（化合物３）と、アストレッシンのアミノ酸配列に基づくＣＲＦ拮抗薬であって、４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）−ベンゾイル（ＡＴＢ）残基と、特異的放射標識に適したヒスチジンまたはチロシンとを持つもの、例えばＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［¹²⁵Ｉ−Ｈis¹³，Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物６）やＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38 ，Ｇlu³⁰，¹²⁵Ｉ−Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物７）である。本発明化合物の合成は、光活性可能成分（例えばＡＴＢ）をＣＲＦまたはＣＲＦ類縁体に結合し、次に標識（例えばヨウ素化）することによって、行なうことができる。例えば、４−（１−アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）安息香酸をシクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）とシクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38,Ｇlu³⁰,Ｔyr³²,Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）に結合することによって、化合物４と化合物５を合成する。ジアジリン基はテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）に対して感受性であると思われるので（２３）、ぺプチドのＮ−末端にフェニルジアジリンを結合する前に樹脂上でぺプチドの環化を行なう。次に、ヒスチジン¹³ またはチロシン³²を¹²⁵Ｉでヨウ素化することにより、それぞれ８２ＴＢｑ／m molの比活性を持つ化合物６と化合物７を得る。本発明の好ましい態様では、［¹²⁵Ｉ］Ｔyr⁰ｏＣＲＦ類縁体が、リガンド結合を最も妨害しないと考えられるそのＮ−末端（２，２４，２５）に、４−（１ −アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）ベンゾイル残基を持つ。光活性化可能部分がその分子中の放射活性トレーサーのすぐ近くにあれば、光親和性標識実験後のぺプチド断片の同定と精製が容易になる。この新しいＣＲＦ類縁体によって、ＣＲＦＲ１遺伝子で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に、約７５kＤaの分子量を持つＣＲＦ−Ｒ１が検出された。本発明の化合物は、ＣＲＦレセプターとＣＲＦ結合タンパク質の検出、およびそれらタンパク質の結合部位の同定に使用することができる。本発明の光親和性標識技術は、光活性化可能リガンドの照射によって寿命の短い分子種が生成し、それが高収率でそのレセプターと不可逆的に結合するので、レセプター分子内のリガンド結合部位を同定する場合、化学的な架橋法より有利である。その標識によって同定される親和性標識されたレセプターポリペプチドは安定であるので、例えばＨＰＬＣなどによってさらに精製することができる。次に、それを切断して断片化し、アミノ酸配列分析によってその結合部位を同定することができる。図面の簡単な説明図１資料（２６）による光活性化可能なジアジリン１と、それをＴyr⁰ｏＣＲＦ１−４１に結合して２およびその¹²⁵ヨウ素化類縁体３を得る合成経路。図２（Ａ）形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合した［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦの、ｏＣＲＦ（●）またはヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）による置換。データは、代表的実験における各点３つの値の平均である。（挿入図）ｏＣＲＦ（● ）とヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）の結合に関するスキャッチャードプロット。（Ｂ）ｏＣＲＦ（●）とヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）による、形質移入ＨＥＫ２９３細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の剌激。データは代表的実験における各点３つの値の平均である。誤差線はＳＥＭを表わし、記号のサイズより小さい場合は示していない。図３ｏＣＲＦ（●）、ヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）、および１００ｎＭ組換えヒト［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38］ＣＲＦ−（１２−４１）存在下のヒツジ・フォトＣＲＦ２（×）による、Ｙ７９細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の剌激。データは代表的実験における各点２つの値の平均±ＳＥＭ値（線）である。図４ＨＥＫ２９３細胞膜ホモジネートに対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ３の光親和性架橋。レーン１〜５はｒＣＲＦＲ１をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクションされた細胞の抽出物。レーン６〜７は非形質移入ＨＥＫ２９３細胞の抽出物。放射活性ヒツジ・フォトＣＲＦを、ｏＣＲＦの不在下（レーン１、５または６）、または１００ｎＭ（レーン２）、１μＭ（レーン３）、１０μＭ（レーン４とレーン７）ｏＣＲＦもしくは１μＭ血管作用性小腸ぺプチド（レーン５）の存在下に結合させた。５０μgの全膜タンパク質を約１００,０００ｃｐｍのヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦで標識し、２０００単位のＰＮＧaseの存在下（レーン９）または不在下（レーン８）に保温した（３７℃，３０分）。図５（Ａ）ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ３で共有結合的に標識し、ＲＰＨＰＬＣで精製した膜成分の放射活性を示す図。（Ｂ）プールした画分を７.５％ゲルでのＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。化合物２と化合物３を用いる作用薬結合試験Ａ．予備実験ＣＲＦＲ１形質移入ＨＥＫ２９３細胞膜での３による光親和性標識実験を最適化するために、１のジアジリン官能基を使って予備実験を行なった。光分解は１００ｓの半減期で進行し、１２分後にはすべてのジアジリンがそのカルベンまたはジアゾ原子価異性体に変換された（８０％カルベン原子価異性体、２０％ジアゾ原子価異性体（２６））。この光分解は、５つの１５ワットランプを装着したＵＶ Stratalinker（Stratagene社）を用いて３６０ｎｍの波長で行い、ＵＶ分光光度計（Beckman ＤＵ６５０分光器，フラートン）でモニターした。ランプから１４ｃｍの距離で、１は、１次速度論的に半減期１００秒（４℃）で光分解された（ｃ＝１ｍＭ（エタノール中），Ｖ＝３８０μＬ，１mＬ石英キュベット）。３を膜と共に様々な時間保温した後、光分解し、その光産物をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析したところ、同じ結果が得られた。Ｂ．結合およびｃＡＭＰアッセイヒツジ・フォトＣＲＦ２の結合親和力と生物効力を決定するために、ｒＣＲＦＲ１をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から永久細胞系を樹立した。次の実験では、ＨＥＫ細胞クローンのプールを使用した。個々のＨＥＫ細胞クローンを用いて得られる結合結果は、細胞クローンプールを用いた結合実験の結果と有意に異ならなかった。スキャッチャード分析から、ｏＣＲＦが高親和性部位に７.８±６.３ｎＭのＫ_d値で結合し、低親和性部位に１３７±９０ｎＭのＫ_d値で結合したことがわかった。Ｂ_max値はそれぞれ３０ｆmol／μgタンパク質と３４７ｆmol／μgタンパク質であり、発現効率が高いことを示した。［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦを置換するヒツジ・フォトＣＲＦ２についても、同様のＫ_d値５.６±２.６ｎＭ（Ｂ_max＝１２ｆmol／μgタンパク質）が認められた。スキャッチャード分析は、ヒツジ・フォトＣＲＦが高親和性部位にのみ結合することを示した（図２Ａ）。ｏＣＲＦまたはヒツジ・フォトＣＲＦを形質移入ＨＥＫ２９３細胞に適用すると、ｃＡＭＰの蓄積が用量依存的に刺激された。ｏＣＲＦとフォトＣＲＦのＥＣ₅₀値は、それぞれ０．５±０．２ｎＭと０.４±０．１ｎＭであった（図２Ｂ）。非形質移入細胞は有意な結合またはｃＡＭＰ蓄積を示さなかった。この観察結果は光親和性標識実験でも確認された。ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ３は非形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合しなかった（図４参照）。内因性の機能的なＣＲＦレセプター（２７）を持つことが知られているヒトＹ７９網膜芽腫細胞から得た膜調製物を用いる実験では、ｏＣＲＦまたはヒツジ・フォトＣＲＦ２について２ｎＭ（Ｂ_max＝０．１９ｆmol／μg タンパク質）のＫ_d値が認められた。Ｙ７９細胞では、いずれのＣＲＦ類縁体についても、高親和性部位のみが検出された。ヒツジ・フォトＣＲＦとｏＣＲＦは、Ｙ７９細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を、それぞれ２.３±０.５ｎＭおよび１．３±０.６ｎＭのＥＣ₅₀値で剌激した（図３）。これらの結合およびｃＡＭＰデータをＡＮＯＶＡプログラムで統計的に分析したところ、ｏＣＲＦとフォトＣＲＦのＫ_dおよびＥＣ₅₀に有意差がないことがわかった。ヒツジ・フォトＣＲＦの剌激作用の特異性は、このぺプチドの剌激効力が、特異的ＣＲＦ拮抗薬である組換えヒト［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38］ＣＲＦ−（１２−４１）の存在下で低下したという観察結果によって、さらに立証された。この拮抗薬に関する見かけ上の阻害定数（Ｋ_i）は１０.３±５.０ｎＭだった（図３）。Ｃ．光親和性標識実験このレセプターの標識はＢＳＡによって妨害されることがわかっているので（１７，２８）、新たに調製したトレーサー３を担体タンパク質を一切含まない状態で保存し、ＢＳＡを含まない緩衝溶液中で光親和性標識実験を行なった。ｒＣＲＦＲ1で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の膜とヒツジ¹ ²⁵ Ｉ−フォトＣＲＦ３の混合物を３６０ｎｍで照射した後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを行なうことにより、７５kＤaの架橋体が同定された（図４）。３６０ｎｍでの照射を行なわない場合、架橋体は認められなかった。市販の［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦと酒石酸ジスクシンイミジルを用いて、７５kＤaタンパク質を化学的架橋実験で標識した。当該レセプターに対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦの結合は、１μＭｏＣＲＦの添加によって効率よく阻害できたが、１μＭ血管作用性小腸ぺプチドでは阻害されず、その結果は、想定されるこの光プローブの特異性と合致した。上述のように、非形質移入ＨＥＫ２９３膜に対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦの光親和性架橋は検出されなかった。７５kＤaタンパク質架橋体をＰＮＧaseで脱グリコシル化すると、４６kＤaタンパク質の生成が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで検出された（図４）。分離用の光親和性標識実験では、ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦに架橋した膜タンパク質をＲＰＨＰＬＣで精製した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により、空隙容量後に溶出した放射活性画分が、７５kＤa ＣＲＦＲ１タンパク質架橋体を含むことがわかった（図５）。この架橋操作の収率を計算するために、標識されたレセプターを、出発物質として使用したＨＥＫ細胞膜に特異的に結合したヒツジ¹²⁵Ｉ −フォトＣＲＦの放射活性によって分割した。これによれば、収率は少なくとも２０〜３０％と推定された。化合物４〜７を用いる拮抗薬結合試験Ａ．結合およびｃＡＭＰアッセイ光活性化可能なＣＲＦ拮抗薬４および５の結合親和力と生物効力を測定するために、ｒＣＲＦＲ１をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系と、内因性ＣＲＦレセプター（ＣＲＦＲ１）を発現させるヒトＹ７９網膜芽腫細胞系を使用した。その結果を表Ｉに示す。スキャッチャード分析は、Ｙ７９細胞の膜ホモジネートに対するｏＣＲＦの高および低親和性結合（Ｋ_d1＝１．１±０．７ｎＭ；Ｋ_d2＝１．１±１．３μＭ）と、アストレッシンの高および低親和性結合（Ｋ_d1＝０.９±１.０ｎＭ；K_d2＝１.６±１.６μＭ）を示した。化合物４はアストレッシンと同様の結合特性を示した（Ｋ_d1＝０．６ ±０．５ｎＭ；Ｋ_d2＝３.４±２.２μＭ）。化合物５はこの細胞系のＣＲＦＲ１に対して低い結合親和力を示した（Ｋ_d1＝２６±２３ｎＭ）。ｏＣＲＦ）アストレッシン、化合物４、化合物５を形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜ホモジネートに結合させた場合にも同様の結果が得られ、そのＫ_d値はそれぞれ３.３±０.５ｎＭ、７.７±２.６ｎＭ、３.２±２.７ｎＭ、１２±３．６ｎＭだった。この細胞系ではｏＣＲＦだけが、低親和性部位に対して、Ｋ_d値１４７±７８ｎＭの結合を示した。Ｙ７９細胞とＨＥＫ２９３細胞にｏＣＲＦを適用するとｃＡＭＰの蓄積が容量依存的に剌激され、そのＥＣ₅₀値はそれぞれ３．８±２．６ｎＭと０．４±０．１ｎＭだった。ヒツジＣＲＦによって刺激されるｃＡＭＰ生産は、Ｙ７９細胞で、５ｎＭ拮抗薬の存在下に効率よく阻害できた。アストレッシン、化合物４、化合物５に関して測定された阻害定数（Ｋ_i）は、それぞれ０．５±０．３ｎＭ、１．０±０．３ｎＭ）６．０±２．８ｎＭだった。形質移入ＨＥＫ２９３細胞におけるｏＣＲＦ剌激性ｃＡＭＰ蓄積を１００ｎＭＣＲＦ拮抗薬の存在下で阻害した場合にも、同様の結果が得られた。アストレッシン、化合物４、化合物５について、１０１±９２ｎＭ、５１±５２ｎＭ、４９７±７２ｎＭのＫ_i 値を得た。形質移入ＨＥＫ２９３細胞における高親和性レセプターの発現量（ｏＣＲＦ：Ｂ_max1＝１６±５ｆｍｏｌ／μg;Ｂ_max2＝１９７± １５ｆmol／μg）はＹ７９細胞（oＣＲＦ：B_max1＝0．３±０．３ｆmol／μg;B_m _ax2 ＝３５±５７ｆmol／μg）より５０倍高いので、ＨＥＫ２９３でｏＣＲＦ剌激性ｃＡＭＰ生産の有意な減少を観察するには、より高用量のＣＲＦ拮抗薬を適用する必要があった。非形質移入細胞は有意な結合またはｃＡＭＰ蓄積を示さなかった。この観察結果は光親和性標識実験でも確認された。化合物７は非形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合しなかった。上記結合およびｃＡＭＰデータをＡＮＯＶＡプログラムで統計的に分析したところ、アストレッシンと化合物のＫ_d およびＫ_iには有意差がないことがわかった。どちらのぺプチドも、形質移入ＨＥＫ２９３細胞とＹ７９細胞内でｃＡＭＰを生産させるというｏＣＲＦの剌激効力を減少させる効力が高かった。しかし化合物５は、両細胞系におけるｃＡＭＰ生産を阻害する効力が、アストレッシンまたは化合物４と比較して５〜１０倍低く、ＣＲＦＲ１に対するその結合親和力が弱いことと合致した。Ｂ．光親和性標識実験上述のように、新たに調製したトレーサー７を担体タンパク質を含まない状態で保存し、ＢＳＡを含まない緩衝溶液中で光親和性標識実験を行なった。ｒＣＲＦＲ１で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の膜と化合物７の混合物を３６０ｎｍで照射した後、ＳＤＳＰＡＧＥを行なうことにより、６６kＤaの架橋体が同定された。３６０ｎｍで光活性化しない場合、架橋体は認められなかった。レセプターに対する化合物７の結合は、１μＭＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（３１ −４１）（化合物５）の添加によって効率よく阻害できたが、１μＭ血管作用性小腸ぺプチド（ＶＩＰ）では阻害されず、その結果は、想定されるこの光プローブの特異性と合致した。上述のように、非形質移入ＨＥＫ２９３膜に対する化合物７の光親和性架橋は検出されなかった。６６kＤaタンパク質架橋体をＰＮＧas eで脱グリコシル化すると、３８kＤaタンパク質の生成がＳＤＳＰＡＧＥで検出された。したがって本発明の化合物は、様々な組識膜中のレセプターまたはＣＲＦ結合タンパク質の特異的不可逆的標識と追跡、ならびに、２、４または５の蛍光類縁体を用いた細胞学的研究（例えば細胞選別、レセプター内部移行、輸送に関する研究）に使用することができる。下記実施例により本発明を説明する。実施例１４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）安息香酸（１）の合成暗所で、４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）べンジルアルコール４２０ｍg（１．９mmol：４−ブロモベンジルアルコールから出発して７段階合成で総合収率４４％）（２６）をジオキサン１．４ｍLと０．２ＮＫＯＨ水溶液１２ｍLに溶解した。次に、ＫＭnＯ₄（４６２ｍg；２．９mmol）を少しずつ加え、その混合物を周囲温度で２時間攪拌した。沈澱したＭｎＯ₂を濾過によって除去し、メタノールで数回洗浄し、合わせた濾液を減圧下に濃縮した。残ったアルカリ溶液をエーテルで抽出し、１ＮＨ₂ＳＯ₄水溶液でｐＨ２〜３に酸性化し、再びエーテルで抽出した。その有機相を中性になるまで水で洗浄し、無水Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥し、溶媒を減圧下に留去した。生成物をヘキサンから結晶化し、２３０ｍgの１（１．Ommol；５３％）を得た：融点１２３〜１２５℃,発泡（Ｎ₂）と共に分解；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl，ＴＭＳ）７．７２（ＡＡＢＢ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣl¹³，ＴＭＳ）２８．４６（ｍ,Ｊ＝４１Ｈｚ），１２１．８５（ｍ，Ｊ＝２７４Ｈｚ），１２６．４９（ｍ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），１３０．３２（ｍ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），１３０．５４（ｓ）,１３４．７８（ｓ），１７０．８１（ｓ)；¹⁹Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆,ＣＦＣl₃ ） −６４．００；ＵＶ（エタノール）λ（ε）３４８ｎｍ（２４８）；ＭＳｍ／ｚ（相対強度）２２９（１００，［Ｍ−Ｈ］⁺），２０１（２１，［Ｍ−Ｎ₂］⁺），１５７（５１），１３７（８）；ＨＲＭＳ計算値（Ｃ₉Ｈ₅ Ｎ₂Ｆ₃Ｏ₂として）２２９．０２４９，実測値２２９．０２２８。実施例２４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイルーチロシン⁰ｏＣＲＦ１−４１（２）の合成暗所で、ＮＭＰ０．２ｍL中の１（２６ｇ，０．１１mmol）を、０．２ｍL の０．４５ＭＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（ＤＭＦ中）（６分）と０．１ｍLの２ＭＤＩＥＡ（ＮＭＰ中）（２分）で活性化した。８３ｍgのぺプチド樹脂（TentaGeｌＳＲＡＭ樹脂上の７．００μｍｏｌ側鎖保護［Tyr⁰］ｏＣＲＦ１−４１；容量０．２２mmo1／ｇ）を加え、その混合物を１５分間反応させた。その樹脂を濾過し、０．５ｍLのＮＭＰで３回洗浄し、７５０μLの切断混合液（結晶性フェノール７５μg，ＥＤＴ２５μL，チオアニソール５０ｐLとｄＨ₂Ｏ５０μL，ＴＦＡ１ｍL）に加え、１．４時間攪拌した。その樹脂を濾過し、ぺプチドを２０ｍLの氷冷エーテル中で沈澱させた。濾過した後、その粗製ぺプチドをＴＦＡ２ｍLと０．１％ＴＦＡ／水中の２０％ＭｅＣＮ５０ｍLに溶解し、凍結乾燥した。３８ｍgの粗生成物のうち２８ｍgを調製用逆相ＨＰＬＣで精製し、２．７ｍg の２（０．５４μｍｏｌ，１４％）を得た：ＥＳＩＭＳ計算値５０４５．７；実測値５０４５．１。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水と溶媒Ｂ：８０％ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ／水を用い、１ｍL／分の流速で、４０％Ｂを５分間の後、２５分間で４０−９０％Ｂの条件下に、ＶｙｄａｃＣ₁₈シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）で行なった。Ｒ_t＝１９．６２分。実施例３４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイルー［¹²⁵Ｉ］− チロシン⁰ｏＣＲＦ１−４１（３）の合成文献（２９）の方法にわずかな変更を加えて、２をヨウ素化した。０．０１ＮＨＯＡｃに溶解した２の１００μＭ溶液４μLが入ったチューブに、次の試薬を一定の順序で加えた：０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０μL、約２０ＭＢｑの¹²⁵Ｉ（ＩＭＳ３０，Amersham社，英国）、０．０５Ｍリン酸緩衝液５ μL中のクロラミンＴ１２．５μg。１５秒後に０．５Ｍリン酸緩衝液１００μL 中のＢＳＡ１０ｍgと０．０５Ｍリン酸緩衝液中のＫＩ１ｍgを加えることにより、反応を停止した。その混合物を、ＭｅＯＨ５ｍLと０．１％ＴＦＡ／水５ｍLで順次濡らしておいたBond ElutＣ₁₈カートリッジ（Varian Associates 社）にピペットで移した。ヨウ素化されたぺプチドを遊離のヨウ素およびＢＳＡから分離するために、そのカラムにｄＨ₂Ｏ５ｍLを流し、次に０．１％ＴＦＡ／水５ｍLを流した。次に、０．１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ中の８０％ＭｅＣＮ５ｍ Lを添加することにより、ヨウ素化ぺプチドをカラムから溶出した。そのぺプチド画分の体積をSpeed Vac（Christ）で約２００μLに減らし、Vydac Ｃ₁₈シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）に載せ、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）と溶媒Ｂ（８０％ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ／水）を用いて１ｍL／分の流速で溶出した。溶出は、４５％Ｂで５分間の後、２５分間の４０−９５％Ｂで行なった。３の保持時間はＲ_t＝１７．３６分だった。液体シンチレーターフローセルを装着したBeckman１７１放射性同位体検出器を使用した。ぺプチドの比活性：８２ＴＢｑ／mmol。放射活性のピーク試験管をプールし、β−メルカプトエタノールを０．５Ｍの最終濃度で加えた。ヨウ素化トレーサー３（図１）を小分けして−２０℃で保存し、通例２ヶ月間、結合アッセイと光親和性標識実験に使用した。実施例４ヒツジＣＲＦ、シクロ（３０−３３）［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｌys³ ³ ］ｈ／ｒＣＲＦ−（１２−４１）（アストレッシン）、ＡＴＢ−シクロ（３０ −３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物４）、ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｔyr³², Lys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物５）の合成 TentaGel ＳＲＡＭ樹脂でのＦｍｏｃ化学（０．１ミリモルスケール，Ｒａｐｐ社，ドイツ連邦共和国チュービンゲン）を用いて、モデルＡＢＩ４３３Ａぺプチド合成装置（Applied Biosystems社）でＣＲＦぺプチドを合成した。ぺプチドを樹脂から切断した後、その粗製ぺプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液とＭｅＣＮの混合液を用いてWaters Prep Nova-Pak ＨＲＣ₁₈シリカゲルカラム（５×３０ｃｍ，粒子サイズ６μｍ，ポアサイズ６ｎｍ）で調製用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）を行なうことにより、精製した。精製したぺプチドの質量スペクトルは、Micromass AutoSpec−Ｔタンデム質量分析計でＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン）ＭＳにより測定した。環化ＣＲＦ類縁体の合成には、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ｇlu（ＯＡｌ）−ＯＨとＦｍｏｃ−Ｌys（Ａｌｏｃ）−ＯＨ（PerSeptive Biosystems社，ドイツ連邦共和国ハンブルグ）を使用した。側鎖保護ぺプチドを、ＨＯＡｃ／Ｎ−メチルアニリン／ジクロロメタン（ｖ／ｖ；２：１：４０）中でＰｄ⁰［ＰＰｈ₃］₄ と３時間反応させた後、ＤＭＦ中のＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとＮＭＰ中のＤＩＥＡで８時間環化した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基をＮＭＰ中のピペリジンで除去した後、４− （１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）安息香酸を、暗所で、ＤＭＦ中のＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとＮＭＰ中のＤＩＥＡを用いて、ぺプチド樹脂のＮ末端に結合した。次に、ぺプチドを樹脂から切断し、調製用ＲＰＨＰＬＣで精製した。精製したＣＲＦぺプチドを、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ−水）と溶媒Ｂ（８０％ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ−水）を用いて、１ｍL／分の流速で、Vydac Ｃ₁ ₈ シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）での分析用ＲＰＨＰＬＣにかけた。試料は、５％Ｂで５分間溶出させた後、３０分間にわたる５−９５％Ｂの直線勾配で溶出させた。（ｏＣＲＦ：ＥＳＩＭＳ計算値４６７０．４，実測値４６６９．２，Ｒ_t＝２５．９分；アストレッシン：ＥＳＩＭＳ計算値３５６５．１，実測値３５６３．１，Ｒ_t＝２４．８分;４：ＥＳＩＭＳ計算値３５６２．１，実測値３５６１．１，Ｒ_t＝３０．２分；５：ＥＳＩＭＳ計算値３５６４．２，実測値３６５３．７，Ｒ_t＝２９．６分）。ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［¹²⁵Ｉ−Ｈis¹³,Ｎle^21,38,Ｇlu³⁰,Ａla³²,Ｌys³³ ］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物６）およびＡＴＢ−シクロ（３０− ３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，¹²⁵Ｉ−Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３− ４１）（化合物７）化合物６と化合物７を既述の如くヨウ素化した（２９，３０）。ぺプチドをBo nd E1ut Ｃ₁₈カートリッジ（Analytichem社，米国カリフォルニア州ハーバーシティ）で部分精製した後、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ−水）と溶媒Ｂ（８０％ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ−水）を用いて、流速１ｍL／分で、Vydac Ｃ₁₈ シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）でのＲＰＨＰＬＣを行なうことにより、精製した。試料は、４５％Ｂで５分間溶出させた後、２５分間にわたる４５−９５％Ｂの直線勾配で溶出させた（６：Ｒ_t＝２１．９分；７：Ｒ_t＝２０．４分）。液体シンチレーションフローセルを装着したBeckman１７１放射性同位体検出器（Beckman社，米国カリフォルニア州フラートン）を用いて、放射活性をモニターした。ぺプチドの比活性は８２ＴＢｑ／mmolだった。実施例５ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション１０％ウシ胎児血清（Sigma社，米国ミズーリ州セントルイス，カタログ番号Ｆ−７５２４）を添加し、４ｍＭＬ−グルタミン（GIBC0 BRL社，カタログ番号０４３−０５０３０）、０．４５％グルコースの最終濃度にしたダルベッコ改良イーグル培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ，カタログ番号０４１−０１８８５Ｍ）中で、ヒト胚腎細胞２９３（Graham，Smil ey，RussellおよびNaim，1977）（ソーク研究所（ラホーヤ）のC．Stevens博士とG．Sharmaから入手）を生育した。それを既述の如く維持した（３１）。ラットＣＲＦＲ１遺伝子断片（１２８４ｂｐ，ＢamＨＩ，ＥcＩＩ２６ＩＩ断片）をベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社，米国カリフォルニア州サンディエゴ）にサブクローニングした。その組換えプラスミド（ｐＣＤＮＡ３−ｒＣＲＦ₁）を単離し、Qiagenプラスミド調製システム（Qiagen社，ドイツ・ヒルデン）で精製した。連結部位をＤＮＡ配列分析によって確認した。カルシウム／ＢＢＳトランスフェクション法（３２）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＤＮＡ３−ｒＣＲＦ−Ｒ１でトランスフェクションした。トランスフェクションの１６時間後に、培地を除去し、選択培地（６００μg／ｍLジェネテシン／培地）に置換した。細胞をコンフルエントまで生育し、１：２に分割して、さらに選択した。選択条件下で１〜２週間の生育後は、すべての細胞がジェネテシン耐性であり、正常に生育した。実施例６粗製膜の調製実施例５に従って得た細胞を細胞培養フラスコから細胞スクレーパーで氷冷ＰＢＳ緩衝液中に掻き出した。その細胞を１５０ｇ、４℃で１０分間沈降させ、１ ×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞ぺレットの湿重量を測定した。その細胞を、細胞１ｇあたり３ｍLのＣＲＦ膜緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ／Ｃl，５ｍＭＭｇＣl₂，２ｍＭＥＧＴＡ，５００μL トラシルオール（Trasylol；ＦＢＡ，米国ニューヨーク），１mＭＤＴＴ，ｐＨ７．４）に懸濁し、中サイズのポリトロン装置（出力レベル５）で１０ストローク（各２秒）の処理を行なった。冷却下に６００ｇで５分間、核を沈降させた。上清をパスツールピペットで注意深く取り出し、氷上に集めた。同じポリトロン処理を用いて、ぺレットを同量の膜緩衝液で再抽出した。その懸濁液から再び核を上述のように沈降させた。合わせた上清を１０,０００ｇで１５分間遠心分離することにより、膜を沈降させた。そのぺレットを、細胞１ｇあたり３ｍLの貯蔵緩衝液（２０％グリセロールを含む膜緩衝液）に、ガラステフロンホモジナイザーで１０ストロークすることによって再懸濁した。その懸濁液のうち２μLと４μLを用いて、マイクロＢＣＡアッセイ（Pierce社，米国ロックフォード）を行い、総タンパク質濃度を見積もった（約２．５μg／μL）。膜を液体窒素で凍結し、使用するまで−７０℃で保存した。実施例７ｏＣＲＦ、アストレッシン、化合物２、４および５を用いる結合アッセイ保温緩衝液（ＢＳＡを１ｍｇ／ｍLとなるように添加した膜緩衝液）２００ｐL 中のぺプチド（ｃ＝０〜１μＭ）と１００,０００ｃｐｍまたは２００,０００ｃｐｍの［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦを含むチューブに、２５μgのタンパク質（ＨＥＫ２９３細胞）または１００μgのタンパク質（Ｙ７９細胞）を含む膜懸濁液１００μLを加えた。保温（１時間，２３℃）後、膜緩衝液（１ｍL）を加えた。１４，０００×ｇで遠心分離（４℃，５分）した後、ぺレットを膜緩衝液１ｍL で２回洗浄した。放射活性を１４７０ WIZARD自動ガンマカウンター（Berthold 社，ハノーバー）で測定した。データ分析は、非線形カーブフィッティングプログラムＬＩＧＡＮＤで行なった。実施例８ａ）３を用いた光親和性標識実験光親和性標識実験は、使用した保温緩衝液がＢＳＡを含まないことを除いて、原則的に上述と同じ方法で行なった。一連の濃度のｏＣＲＦ（０、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）またはＶＩＰ（１μＭ）と１チューブあたり１８０，０００ｃｐｍの３に、形質移入細胞または非形質移入細胞のＨＥＫ２９３膜ホモジネート（７５μgタンパク質／チューブ）を加え、表記の時間、保温した。光分解の前にぺレットを３回洗浄し、緩衝液３００μLに再懸濁し、３６０ｎｍで３０分間照射した（４℃，ランプから距離８ｃｍ）。光分解後、緩衝液１ｍLを加え、そのぺレットを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。そのぺレットをｄＨ₂Ｏ１５μLと２×ＳＤＳ１５μLに再懸濁し、１００℃で５分間加熱した。その試料を７．５％ＳＤＳゲルでの電気泳動にかけ、FujixＢＡＳ２０００スキャナー（Raytest社）を用いてＢＡＳ−ＩＰＮＰ２０４０Ｐイメージングプレート上でオートラジオグラフィーを行なった。市販マーカー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥハイレンジマーカー，BioRad）と比較したゲル移動度から、見かけ上の分子量を見積もった。ゲルの考証はプログラムＴＩＮＡ（シュトラウベンハルト）とＷＩＮＣＡＭ（Cybertech社）で行なった。ｂ）化合物２を用いた光親和性標識実験ＢＳＡを使用しない点以外は結合アッセイと同様にして、光親和性標識実験を行なった。試料（２５μｇタンパク質／チューブ）をリガンドと共に保温（１時間，２３℃）した後、３６０ｎｍで３０分間照射（４℃，ランプからの距離８ｃｍ）した。いくつかの実験では、光標識されたレセプターをＰＮＧase（New Eng land Biolabs社，シュヴァルバッハ）で脱グリコシル化した。次に、試料を加熱（１００℃，５分）し、ＳＤＳＰＡＧＥにかけた。オートラジオグラフィーはＢＡＳ−ＩＰＮＰ２０４０Ｐイメージングプレートで行なった。Fujix ＢＡＳ２０００スキャナー（Raytest社，シュトラウベンハルト）を用いて放射活性をモニターした。ゲルの考証はＴＩＮＡプログラム（Raytest社）で行なった。実施例９ｃＡＭＰ剌激ＨＥＫ２９３細胞とヒトＹ７９網膜芽腫細胞（American Type Cell Culture, ロックヴィル）を、それぞれ１ｍＭまたは５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチンの存在下に種々のＣＲＦ類縁体と保温した（３７℃，３０分）。Ｙ７９細胞の保温培地には、さらに１ｍg／ｍL ＢＳＡと０．０５ｍg／ｍLアスコルビン酸を追加した。化合物２または光活性化可能なアストレッシン類縁体を使用する場合は、すべての実験を暗所で行なった。培地を除去した後、細胞を６％トリクロロ酢酸水溶液で溶解した（１００℃，５分）。細胞溶解液は、ＲＩＡキット（Amersham社，リトルチャルフォント）でアッセイするまで、−７０℃で保存した。データ分析はシグモイド用量応答曲線フィッティングプログラムＡＬＬＦＩＴで行なった。一方向分散分析により、群間の統計的有意性を決定した。実施例１０７５kＤaタンパク質架橋体の精製と特徴づけ膜タンパク質（２５０μg）を１．１×１０⁷ｃｐｍの３（２．８２mmol）で標識した。その試料の１０分の１を５０％ギ酸／エタノール溶液（１００μL）に溶解し、Vydac Ｃ₄シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）によるＲＰＨＰＬＣにかけた。溶出は、０．５％トリフルオロ酢酸水溶液とエタノールの混合液で行なった。資料 1） Spiess,J.,Rivier,J.,Rivier,C.およびVale,W.(1981)Proc.Natl.Acad．Sci ．USA 78，6517-6521. 2） Vale,W.,Spiess,J.,Rivier,C.およびRivier,J．(1981)Science 213,1394-13 97. 3） Vita，N.,Laurent，P.，Lefort，S.，Chalon,P.,Lelias，J.-M.，Kaghad,M. ,Le Fur,G.,Caput,D.およびFerrara,P．(1993),FEBS Lett.335，1-5. 4） Chen,R.,Lewis,K.A.,Perrin,M.H.およびVale,W．(1993)Proc．Natl.Acad．S ci．USA 90，8967-8971. 5） Perrin,M.H.,Donaldson，C．J.,Chen,R.,Lewis,K.A.およびVale，W.(1993)E ndocrinology 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Detection of analogs and CRF receptor proteins and CRF binding proteins And their use in identifying and characterizing binding sites. Adrenocorticotropic hormone-releasing factor (CRF) It appears to integrate secretory, autonomic, immune and behavioral responses. The polypeptide (1), consisting of 41 amino acids, was initially synthesized from carbohydrates from the adrenal cortex. Adrenocorticotropic hormone (ACTH) which is known to stimulate the secretion of ticoids ) Characterized by its pituitary-stimulating activity of stimulating the release of (2) . CRF is the main regulator of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis and stress Is widely recognized to result in the release of glucocorticoids when exposed to You. The various functions of CRF in the endocrine, autonomic nervous and immune systems are different receptors. Mediated by the terprotein. Many of these receptors have been studied and Several homologs of the F family have been examined for their binding affinity and biological potency. Have been. CRF exerts its activity via a G protein-coupled receptor. mainly CRF receptor type 1 (CRFR1) found in the pituitary gland and brain is Independently from human and rat brain and human Cushing adrenocortical stimulating cell tumors It has been loaned (3-6). Two splice variants of CRF receptor type 2 CDNAs encoding (CRFR2a and CRFR2b) can be Cloned from muscle (7-10). Recently, the naturally occurring CRF analog uro Cortin (urocortin; Ucn) has been proposed to be an endogenous ligand for CRFR2. (11). Apart from the CRF receptor, a 37 kDa CRF binding protein has been characterized. You. Must not be homologous to any of the known splice variants of CRFR1 or CRFR2 Proteins bind with high affinity to human / rat CRF (h / rCRF) Does not bind with high affinity to sheep CRF (oCRF) (12). Extremely potent CRF antagonist with amino acid sequence based on h / rCRF Astressin, cyclo (30-33) [D-Phe¹², Nle^21,38 , Glu³⁰, Lys³³H / rCRF- (12-41), h / r Shows similar binding affinity to rCRF but does not bind to CRF binding proteins (13). Astressin is CRF-mediated in pituitary cell culture assays in vitro The biological efficacy of inhibiting ACTH release extends from amino acids 5-36 of the h / rCRF. The lactam bridge incorporated at the end of the peptide part, (13, 14). Surprisingly, the same lactam bridge Mochi H / rCRF stimulates ACTH secretion of pituitary cells even when transfected into peptides Did not increase significantly. Therefore, CRF receptor activation and whole molecule The induction of the body's alpha helix was thought to be due to the N-terminus of CRF (13). Recently, rCRFR1 and rat growth hormone releasing factor receptor (rGRFR) In a binding test using COSM6 cells transiently expressing a chimeric receptor, r N-terminus of CRFR1 (rCRFR_N) Has high affinity binding of astressin to Indicated. CRF peptide agonist h / rCRF and urocortin are rCRFR_N/ Binding to rGRFR also results in cAMP production, but to a lesser extent rCRF It was lower than the R1 CRF stimulation (15). Another seven transmembrane G-protein coupled proteins In studies on characterization of sceptors, site-directed mutagenesis Different binding sites for agonist and antagonist binding of stimulating hormone-releasing hormone Specified (16). Because CRF has many important functions, To investigate agonist and antagonist binding more closely, Amino acid sequence and the CRF receptor and CRF binding protein Binds CRF with high affinity following cell biological fate following ligand binding To study with CRF analogs that serve as labels covalently attached to a growing protein That would be beneficial. [¹²⁵I] Tyr⁰Chemical cross-linking by oCRF has very low cross-linking efficiency, CRF receptor whose label has been cross-linked by chemical and enzymatic cleavage after cross-linking Is not suitable for characterizing the actual binding site because it is removed from the ing. Bovine anterior pituitary membrane (17), AtT-20 mouse pituitary tumor cells (18), LA Applying bifunctional reagents to the membranes of the rat brain and anterior pituitary gland (19, 20) Some CRF receptors with molecular weights ranging from 58,000 to 75,000 Ter crosslinked products have been characterized. However, the CRF frame reported to date All bridges were obtained only in very low yields (<1%). Labeling with a monofunctional photoaffinity probe is a chemical crosslinking method using a bifunctional reagent. It is expected to give higher yields than labeling with. In addition, photo activation is Highly reactive molecular species such as itrene can be selectively produced under mild conditions by irradiation. It seems to be better than thermal activation as it can be done. Generated mosquito Rubens and nitrenes can be inserted into the XH bond, so that chemical affinity labels ( Affinity Labels) can attack normally inactive groups. All using photoaffinity labeling (photoaffinity label; PAL) technology The conditions required for the experiment are that the photoactivatable ligand has a high affinity for the receptor. And its receptors are destroyed by the light used to activate the label. It is not destroyed or inactivated (21, 22). Recently, lightening under mild conditions A new class of photoactivatable compounds that can be chemically degraded irine) was developed. Therefore, the technical problem underlying the present invention is to provide a highly efficient CRF or the like that binds by force and results in irreversible labeling of the receptor To provide an edge. The answer to this technical problem is given by the mode characterized in the claims. It is. Accordingly, the present invention relates to a CRF or label carrying a photoactivatable component and a label. Provides analogs of In this case, the term "analog" refers to a CR that retains CRF ligand binding activity. Includes any variant or fragment of F. In certain embodiments, the photoactivatable component and the label are adjacent to each other. The photoactivatable component is preferably used to convert the photoaffinity label under mild conditions to an appropriate wavelength. It should have properties that can be done with An example of the photoactivatable component is 4- (1 -Azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl residue or its phenyla It is a lanin analog. Signs, for example¹²⁵Radioactive markers such as I and fluorescent markers such as fluorescein. Or biotin which interacts with avidin having a fluorescent group. You may. A preferred embodiment of the present invention relates to a CRF agonist 4- (1-azi-2,2,2-trifur Oroethyl) Benzoyl [¹²⁵I] -Tyrosine⁰oCRF (compound 3) A CRF antagonist based on the amino acid sequence of trescin, comprising 4- (1-azi-2 , 2,2-trifluoroethyl) -benzoyl (ATB) residue and a specific radiolabel With histidine or tyrosine suitable for insight, such as ATB-cyclo (3 0-33) [¹²⁵I-His¹³, Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², Lys³³] H / rCR F- (13-41) (compound 6) or ATB-cyclo (30-33) [Nle^21,38 , Glu³⁰,¹²⁵I-Tyr³², Lys³³H / rCRF- (13-41) (compound 7 ). The synthesis of the compounds of the present invention is accomplished by converting a photoactive component (eg, ATB) to CRF or CR. What to do by binding to the F analog and then labeling (eg, iodinating) Can be. For example, 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoic acid is (30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², Lys³³H / rCRF- (1 3-41) and cyclo (30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Tyr³², Lys³³] H / r Compound 4 and compound 5 are synthesized by binding to CRF- (13-41). You. The diazirine group is based on tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (23), phenyl was added to the N-terminal of the peptide. Cyclization of the peptide is performed on the resin before coupling the diazirine. Next, histidine¹³ Or tyrosine³²To¹²⁵By iodination with I, 82 TBq / m Compounds 6 and 7 having a specific activity of mol are obtained. In a preferred embodiment of the present invention,¹²⁵I] Tyr⁰oCRF analog binds ligand At its N-terminus (2,24,25), which is believed to be least disruptive, -Azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl residue. Light-activated Photoaffinity labeling experiments when the moiety is in close proximity to the radioactive tracer in the molecule The subsequent identification and purification of the peptide fragment is facilitated. With this new CRF analog HEK293 cells transfected persistently with the CRFR1 gene CRF-R1 having a molecular weight of about 75 kDa was detected. The compounds of the present invention can be used to detect CRF receptors and CRF binding proteins, and It can be used to identify the binding site of those proteins. Photoaffinity of the present invention Labeling techniques involve the irradiation of photoactivatable ligands to produce short-lived molecular species, It binds irreversibly to its receptor in high yield, Identifying ligand binding sites is advantageous over chemical cross-linking methods. On that sign Since the affinity-labeled receptor polypeptide thus identified is stable, For example, it can be further purified by HPLC or the like. Then cut it And its binding site can be identified by amino acid sequence analysis.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. Photoactivatable diazirine 1 according to document (26) and Tyr⁰oC 2 and its binding to RF1-41¹²⁵Synthetic route to obtain iodinated analog 3. FIG. (A) Bound to the membrane of transfected HEK293 cells [¹²⁵I-Tyr⁰] OC Replacement of RF with oCRF (●) or sheep photo CRF2 (□). Day Data is the average of three values for each point in a representative experiment. (Inset) oCRF (● ) And Scatchard plot for binding of sheep photo CRF2 (□). (B) Transfection H using oCRF (●) and sheep photo CRF2 (□) Stimulation of intracellular cAMP accumulation in EK293 cells. Data are for representative experiments Is the average of the three values at each point. Error bars represent SEM, smaller than symbol size Not shown.FIG. oCRF (●), sheep photo CRF2 (□), and 100 nM group Replaced human [D-Phe¹², Nle^21,38] Sheep in the presence of CRF- (12-41) Stimulation of intracellular cAMP accumulation in Y79 cells by photo CRF2 (x). Data are means ± SEM value (line) of two values for each point in a representative experiment. FIG. Sheep against HEK293 cell membrane homogenate¹²⁵I-Photo CRF Photoaffinity crosslinking of 3. Lanes 1 to 5 are stable with cDNA encoding rCRFR1 Extract of transfected cells. Lanes 6-7 are untransfected HEK2. Extract of 93 cells. The radioactive sheep photo CRF was placed in the absence of oCRF (Laye 1, 5 or 6), or 100 nM (lane 2), 1 μM (lane 3), 1 0 μM (lane 4 and lane 7) oCRF or 1 μM vasoactive intestinal peptide Ligation was performed in the presence of (lane 5). 50 μg of total membrane protein was added to about 100,00 0 cpm sheep¹²⁵Labeled with I-Photo CRF and stored 2000 units of PNGase Incubation was performed in the presence (lane 9) or in the absence (lane 8) (37 ° C., 30 minutes). FIG.(A) Sheep¹²⁵Covalently labeled with I-photo CRF3, RPHP The figure which shows the radioactivity of the membrane component refine | purified by LC. (B) 7.5% pooled fractions Underwent SDS / PAGE.Compound 2 And compounds 3 Drug binding test usingA.Preliminary experiment Optimized photoaffinity labeling experiments with CRFR1 transfected HEK293 cell membranes with 3 A preliminary experiment was performed with one diazirine functional group to achieve this. Photolysis is 1 Progresses with a half-life of 00s, and after 12 minutes all diazirine has its carbene or Was converted to diazo valence isomer (80% carbene valence isomer, 20% dia Zo-valent isomer (26)). This photolysis was fitted with five 15 watt lamps UV was performed using a Stratalinker (Stratagene) at a wavelength of 360 nm. Monitoring was performed with a photometer (Beckman DU650 spectrometer, Fullerton). run At a distance of 14 cm from the pump, 1 has a first-order kinetic half-life of 100 seconds (4 ° C.) Degraded (c = 1 mM (in ethanol), V = 380 μL, 1 mL quartz cuvette ). 3 was incubated with the membrane for various periods of time, then photolyzed, and the photoproduct was converted to SDS / Analysis by PAGE gave the same results. B.Binding and cAMP assays To determine the binding affinity and biopotency of sheep photo CRF2, rCRF HEK293 cells stably transfected with cDNA encoding R1 Established a permanent cell line. The next experiment uses a pool of HEK cell clones did. The binding results obtained with individual HEK cell clones were And did not differ significantly from the results of binding experiments using Scatchard analysis? Show that oCRF has 7.8 ± 6.3 nM K at the high affinity site._dBinding by value, low affinity part 137 ± 90 nM K in place_dIt was found to be bound by value. B_maxValues are 3 each 0 fmol / μg protein and 347 fmol / μg protein, high expression efficiency That was shown. [¹²⁵I-Tyr⁰] Sheep photo CRF2 replacing oCRF About K_dValue 5.6 ± 2.6 nM (B_max= 12 fmol / μg protein) Was observed. Scatchard analysis shows that sheep photo CRF has high affinity sites (FIG. 2A). oCRF or Sheep Photo CRF Applied to transfected HEK293 cells stimulated cAMP accumulation in a dose-dependent manner. Was done. oCRF and Photo CRF EC₅₀The values are 0.5 ± 0.2 nM, respectively. 0.4 ± 0.1 nM (FIG. 2B). Non-transfected cells have significant binding or c No AMP accumulation was shown. This observation was also confirmed in a photoaffinity labeling experiment. Sheep¹²⁵I-photo CRF3 does not bind to the membrane of untransfected HEK293 cells (See FIG. 4). Known to have endogenous functional CRF receptor (27) Experiments with membrane preparations obtained from human Y79 retinoblastoma cells 2 nM (B for F or sheep photo CRF2_max= 0.19fmol / μg Protein) K_dValues were observed. In Y79 cells, any of the CRF analogs Again, only high affinity sites were detected. Sheep Photo CRF and oCRF , Y79 cells were capped at 2.3 ± 0.5 nM and 1.3 ± 0.6 nM EC₅₀Stimulated by value (FIG. 3). These binding and cAM Statistical analysis of P data by ANOVA program showed oCRF and photo CRF K_dAnd EC₅₀Was found not to be significantly different. Sheep Photo CR The specificity of the stimulating effect of F is that the stimulating effect of this peptide is a specific CRF antagonist. Recombinant human [D-Phe¹², Nle^21,38] Low in the presence of CRF- (12-41) The observation that they made it was further substantiated. Apparent about this antagonist The above inhibition constant (K_i) Was 10.3 ± 5.0 nM (FIG. 3). C.Photoaffinity labeling experiment Since the labeling of this receptor has been shown to be disturbed by BSA ( 17, 28), with the newly prepared tracer 3 containing no carrier protein. Photoaffinity labeling experiments were performed in a buffer solution containing no BSA. rC Membrane and sheep of HEK293 cells persistently transfected with RFR1¹ ^{twenty five} After irradiating the mixture of I-photo CRF3 at 360 nm, SDS / PAGE was performed. As a result, a crosslinked product of 75 kDa was identified (FIG. 4). Illumination at 360nm When irradiation was not performed, no crosslinked product was observed. Commercially available [¹²⁵I-Tyr⁰] OC Chemically crosslinks 75 kDa protein using RF and disuccinimidyl tartrate Labeled in the experiment. Sheep against the receptor¹²⁵The coupling of the I-photo CRF is The addition of 1 μM oCRF could be efficiently inhibited, but 1 μM vasoactive small intestine It is not inhibited by the peptide and the results are consistent with the expected specificity of this optical probe. I did. As described above, sheep against untransfected HEK293 membranes¹²⁵I-Fo No photoaffinity cross-linking of CRF was detected. 75 kDa protein cross-linked Deglycosylation with Gase resulted in the production of a 46 kDa protein, SDS / PAG E (FIG. 4). For photoaffinity labeling experiments for separation, sheep¹²⁵Film cross-linked to I-photo CRF The protein was purified by RPHPLC. After void volume by SDS / PAGE analysis The radioactive fraction eluted in the above contains a 75 kDa CRFR1 protein cross-linked product (FIG. 5). To calculate the yield of this crosslinking operation, the labeled receptor Sheep specifically bound to the HEK cell membrane used as starting material¹²⁵I -Divided by radioactivity of photo CRF. According to this, the yield is at least It was estimated to be 20-30%.Antagonist binding test using compounds 4 to 7 A.Binding and cAMP assays To determine the binding affinity and biopotency of photoactivatable CRF antagonists 4 and 5 Transfected stably with cDNA encoding rCRFR1 The HEK293 cell line and a human expressing the endogenous CRF receptor (CRFR1). A Y79 retinoblastoma cell line was used. The results are shown in Table I. Scatchard The assay demonstrates high and low affinity binding of oCRF to the membrane homogenate of Y79 cells. (K_d1= 1.1 ± 0.7 nM; K_d2= 1.1 ± 1.3 μM) and astressin High and low affinity binding (K_d1= 0.9 ± 1.0 nM; K_d2= 1.6 ± 1.6 μM) showed that. Compound 4 showed binding properties similar to astresin (K_d1= 0.6 ± 0.5 nM; K_d2= 3.4 ± 2.2 μM). Compound 5 is the CRFR1 of this cell line. Showed a low binding affinity for (K_d1= 26 ± 23 nM). oCRF) Ast Resin, Compound 4 and Compound 5 in membrane homogenates of transfected HEK293 cells Similar results are obtained when they are combined,_dEach value is 3.3 ± 0.5n M, 7.7 ± 2.6 nM, 3.2 ± 2.7 nM, 12 ± 3.6 nM. This cell In the system, only oCRF has a K_dBinding of value 147 ± 78 nM showed that. When oCRF is applied to Y79 cells and HEK293 cells, cAMP is accumulated. The product is stimulated in a volume-dependent manner and its EC₅₀The values are 3.8 ± 2.6 nM and 0. It was 4 ± 0.1 nM. CAMP production stimulated by sheep CRF is Y7 Nine cells were able to inhibit efficiently in the presence of 5 nM antagonist. Astressin, compound Inhibition constant (K_i) Is 0.5 ± 0. (3 nM, 1.0 ± 0.3 nM) 6.0 ± 2.8 nM. Transfected HEK29 OCRF-stimulated cAMP accumulation in 3 cells with the presence of 100 nM CRF antagonist Similar results were obtained with inhibition below. Astressin, Compound 4, Chemical For compound 5, a K of 101 ± 92 nM, 51 ± 52 nM, 497 ± 72 nM._i Value. High affinity receptor in transfected HEK293 cells Expression level (oCRF: B_max1= 16 ± 5 fmol / μg; B_max2= 197 ± 15 fmol / μg) was obtained from Y79 cells (oCRF: B_max1= 0.3 ± 0.3 fmol / μg; B_m _ax2 = 35 ± 57 fmol / μg), and the oCRF stimulation with HEK293. To observe a significant decrease in vigorous cAMP production, higher doses of CRF antagonist are appropriate. Had to be used. Non-transfected cells show no significant binding or cAMP accumulation won. This observation was also confirmed in a photoaffinity labeling experiment. Compound 7 is non-transfected It did not bind to the membrane of the input HEK293 cells. The above binding and cAMP data are Statistical analysis with the NOVA program showed that K_d And K_iWas found to have no significant difference. Both peptides were transfected H Stimulating effect of oCRF to produce cAMP in EK293 and Y79 cells The effect of reducing power was high. However, compound 5 does not inhibit cAMP in both cell lines. 5-10 fold lower potency to inhibit production compared to astresin or compound 4 Consistent with its weak binding affinity for CRFR1. B.Photoaffinity labeling experiment As described above, freshly prepared tracer 7 was prepared without carrier protein. And subjected to photoaffinity labeling experiments in a buffer solution without BSA. rCR HEK293 cell membrane transfected with FR1 and compound 7 After irradiating the mixture at 360 nm with SDS PAGE, 6 A 6 kDa crosslinked product was identified. When not photoactivated at 360 nm, a crosslinked product was observed. I couldn't. Binding of compound 7 to the receptor was 1 μM ATB-cyclo (30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Tyr³², Lys³³H / rCRF- (31 -41) Although it could be efficiently inhibited by the addition of (Compound 5), 1 μM vasoactive It is not inhibited by small intestinal peptide (VIP) and the result is Was consistent with the specificity of As described above, compounds against untransfected HEK293 membranes No photoaffinity cross-linking of product 7 was detected. The 66 kDa protein cross-linked product was replaced with PNGas When deglycosylated with e, the production of 38 kDa protein is detected by SDS PAGE Was done. Thus, the compounds of the present invention may be used to bind receptor or CRF binding in various tissue membranes. Specific irreversible labeling and tracking of proteins, and 2, 4 or 5 fluorescents Cytologic studies using alleles (eg cell sorting, receptor internalization, transport Research). The following examples illustrate the invention.Example 1 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoic acid (1) Synthesis In the dark, 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzyl alcohol 420 mg (1.9 mmol: starting from 4-bromobenzyl alcohol (26) was combined with 1.4 mL of dioxane and 0.2 N K Dissolved in 12 mL of OH aqueous solution. Next, KMnO_Four(462 mg; 2.9 mmol) And the mixture was stirred at ambient temperature for 2 hours. MnO precipitated_TwoThe filtration And washed several times with methanol, and the combined filtrates were concentrated under reduced pressure. The remaining alkaline solution was extracted with ether and 1N H_TwoSO_FourPH 2-3 with aqueous solution Acidified and extracted again with ether. Wash the organic phase with water until neutral, Anhydrous Na_TwoSO_Four, And the solvent was distilled off under reduced pressure. Crystallize product from hexane To give 230 mg of 1 (1.0 mmol; 53%): mp 123-125 ° C. Foam (N_Two) And disassembly;¹H-NMR (CDCl, TMS) 7.72 (AABB , 4H, Ar-H);¹³C-NMR (CDCl¹³, TMS) 28.46 (m, J = 41 Hz), 121.85 (m, J = 274 Hz), 126.49 (m, J = 1.3 Hz), 130.32 (m, J = 2.9 Hz), 130.54 (s), 1 34.78 (s), 170.81 (s);¹⁹F-NMR (DMSO-d₆, CFCl_Three -64.00; UV (ethanol) λ (ε) 348 nm (248); MS m / z (relative intensity) 229 (100, [MH]⁺), 201 (21, [M-N_Two]⁺), 157 (51), 137 (8); HRMS calculated value (C₉H_Five N_TwoF_ThreeO_Two229.0249, found 229.0228.Example 2 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl-tyrosine⁰o Synthesis of CRF 1-41 (2) In a dark place, 1 (26 g, 0.11 mmol) in 0.2 mL of NMP was added to 0.2 mL. 0.45M HBTU / HOBt in DMF (6 min) and 0.1 mL of 2MD Activated with IEA (in NMP) (2 min). 83 mg of peptide resin (Tentagel 7.00 μmol side chain protection on SRAM resin [Tyr⁰OCRF 1-41; A volume of 0.22 mmol / g) was added and the mixture was allowed to react for 15 minutes. That resin Filter, wash three times with 0.5 mL NMP, and 750 μL of the cleavage mixture (Crystalline 75 µg of ethanol, 25 µL of EDT, 50 pL of thioanisole and dH_TwoO 50μL, TFA (1 mL) and stirred for 1.4 hours. The resin is filtered and two peptides are added. Precipitated in 0 mL ice-cold ether. After filtration, the crude peptide was Dissolved in 2 mL and 50 mL of 20% MeCN in 0.1% TFA / water and lyophilized . Of 38 mg of crude product, 28 mg was purified by preparative reverse phase HPLC and 2.7 mg 2 (0.54 μmol, 14%): ESIMS calc. 5045.7; Found 5045.1. Analytical RP-HPLC was carried out with solvent A: 0.1% TFA / water. Medium B: 40% using 80% MeCN-0.1% TFA / water at a flow rate of 1 mL / min. % B for 5 minutes and then Vydac C under the conditions of 40-90% B for 25 minutes.₁₈Shi Rica gel column (0.46 × 25 cm, particle size 5 μm, pore size 30 nm ). R_t= 19.62 minutes.Example 3 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl- [¹²⁵I]- Tyrosine⁰oCRF 1-41 (3) Synthesis 2 was iodinated with minor modifications to the method of reference (29). 0.01N The following reagents were placed in a tube containing 4 μL of a 100 μM solution of 2 dissolved in HOAc. Added in a fixed order: 10 μL of 0.5 M phosphate buffer (pH 7.4), about 20 MBq¹²⁵I (IMS 30, Amersham, UK), 0.05 M phosphate buffer 5 12.5 μg of chloramine T in μL. After 15 seconds, 100 μL of 0.5 M phosphate buffer To add 10 mg of BSA and 1 mg of KI in 0.05M phosphate buffer The reaction was stopped. The mixture was combined with 5 mL of MeOH and 0.1% TFA / water. Bond ElutC wetted sequentially with 5mL₁₈Cartridge (Varian Associates Pipette. Free iodinated peptides and free iodine and BSA DH to the column to separate_TwoO 5 mL, then 0.1% TF A / 5 mL of water was passed. Next, 0.1% TFA / H_Two80% MeCN in O 5m By adding L, the iodinated peptide was eluted from the column. That Petit The volume of the fraction was reduced to about 200 μL with Speed Vac (Christ), and Vydac C₁₈silica Gel column (0.46 × 25cm, particle size 5μm, pore size 30nm) Load, solvent A (0.1% TFA / water) and solvent B (80% MeCN-0.1% T FA / water) at a flow rate of 1 mL / min. Elution is at 45% B for 5 minutes Followed by 25 minutes at 40-95% B. The retention time of 3 is R_t= 17.3 It was six minutes. Beckman 171 radioisotope equipped with a liquid scintillator flow cell A body detector was used. Specific activity of peptide: 82 TBq / mmol. Radioactive peak The test tubes were pooled and β-mercaptoethanol was added to a final concentration of 0.5M. . Iodinated tracer 3 (FIG. 1) is stored in aliquots at -20 ° C., typically for 2 months Used for binding assays and photoaffinity labeling experiments.Example 4 Sheep CRF, cyclo (30-33) [D-Phe¹², Nle^21,38, Glu³⁰, Lys^Three ^Three H / rCRF- (12-41) (astrescine), ATB-cyclo (30 −33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², Lys³³H / rCRF- (13-41 ) (Compound 4), ATB-cyclo (30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Tyr³², Lys³³Synthesis of h / rCRF- (13-41) (Compound 5) Fmoc chemistry on TentaGel S RAM resin (0.1 mmol scale, Rap p company, Tübingen, Germany) using the model ABI 433A CRF peptide was synthesized using a peptide synthesizer (Applied Biosystems). Paper After cutting the tide from the resin, the crude peptide was converted to 0.1% trifluoroacetic acid ( Waters Prep Nova-Pak HR C using a mixture of TFA) aqueous solution and MeCN₁₈Shi Prepared with a Rica gel column (5 × 30 cm, particle size 6 μm, pore size 6 nm) The product was purified by reverse phase HPLC (RPHPLC). Refined pipe The mass spectrum of the tide was determined by ESI on a Micromass AutoSpec-T tandem mass spectrometer. (D (Retrospray ion) MS. For the synthesis of cyclized CRF analogs, the amino acid derivative Fmoc-Glu (OAl) -O H and Fmoc-Lys (Aloc) -OH (PerSeptive Biosystems, Germany) (Republic of Hamburg, Japan) was used. HOAc / N-methyl Pd in aniline / dichloromethane (v / v; 2: 1: 40)⁰[PPh_Three]_Four With HOBt / HBTU in DMF and DIEA in NMP Cyclized for 8 hours. After removing the N-terminal Fmoc group with piperidine in NMP, 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoic acid in DMF in the dark HOBt / HBTU and DIEA in NMP to N-terminal of peptide resin Joined. Next, the peptide was cleaved from the resin and purified by preparative RPHPLC. The purified CRF peptide was mixed with solvent A (0.1% TFA-water) and solvent B (80% MeCN-0.1% TFA-water) at a flow rate of 1 mL / min and Vydac C₁ ₈ Silica gel column (0.46 × 25 cm, particle size 5 μm, pore size 30 nm) under analytical RPHPLC. The sample was eluted with 5% B for 5 minutes This was followed by elution with a linear gradient of 5-95% B over 30 minutes. (OCRF: ESI MS calc. 4670.4, found 4669.2, R_t= 25.9 minutes; Astressin: ESI MS calc. 3565.1, found 3563.1. R_t= 24.8 min; 4: ESI MS calc. 3562.1, found 3561. 1, R_t= 30.2 min; 5: ESI MS calcd 3564.2, found 36. 53.7, R_t= 29.6 minutes). ATB-cyclo (30-33) [¹²⁵I-His¹³, Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², Lys³³ H / rCRF- (13-41) (compound 6) and ATB-cyclo (30- 33) [Nle^21,38, Glu³⁰,¹²⁵I-Tyr³², Lys³³] H / rCRF- (13- 41) (Compound7) Compound 6 and compound 7 were iodinated as previously described (29, 30). Peptide Bo nd E1ut C₁₈Cartridge (Analytichem, Harbour, California, USA) After partially purifying in (T), solvent A (0.1% TFA-water) and solvent B (80% MeCN-0.1% TFA-water) at a flow rate of 1 mL / min.₁₈ Silica gel column (0.46 × 25 cm, particle size 5 μm, pore size 30 n Purified by performing RPHPLC in m). Sample is 5 minutes at 45% B Followed by a linear gradient of 45-95% B over 25 minutes ( 6: R_t= 21.9 minutes; 7: R_t= 20.4 minutes). Liquid scintillation Beckman 171 radioisotope detector equipped with a low cell (Beckman, Calif, USA) (Fullerton, OR) was used to monitor radioactivity. Specific activity of peptide Was 82 TBq / mmol.Example 5 Transfection of HEK293 cells 10% fetal calf serum (Sigma, St. Louis, Mo., USA, catalog number F-7524), and added 4 mM L-glutamine (GIBC0 BRL, catalog number) 043-05030), Dulbecco improvement to a final concentration of 0.45% glucose Eagle's medium (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA) Cat # 041-01885M) in human embryonic kidney cells 293 (Graham, Smil). ey, Russell and Naim, 1977) (Dr. C. Stevens of the Soak Institute, La Jolla) And G. (Obtained from Sharma). It was maintained as previously described (31). Luck The CRFR1 gene fragment (1284 bp, BamHI, EcII26II fragment) Vector pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) Subcloned. The recombinant plasmid (pCDNA3-rCRF₁) Isolate and purify with Qiagen plasmid preparation system (Qiagen, Hilden, Germany) did. The ligation site was confirmed by DNA sequence analysis. HEK29 using the calcium / BBS transfection method (32) Three cells were transfected with pCDNA3-rCRF-R1. Trance Sixteen hours after transfection, the medium was removed and the selection medium (600 μg / mL gene Tesin / medium). Cells were grown to confluence, split 1: 2 And more selected. After 1-2 weeks of growth under selected conditions, all cells are It was netesin resistant and grew normally.Example 6 Preparation of crude membrane The cells obtained according to Example 5 were removed from the cell culture flask with an ice cold P It was scraped out in BS buffer. The cells were sedimented at 150 g for 10 minutes at 4 ° C. Resuspended in × PBS buffer and centrifuged again. Remove the supernatant completely and remove the cells. The wet weight of the kit was measured. The cells are washed with 3 mL of CRF membrane buffer per gram of cells. (50 mM Tris / Cl, 5 mM MgCl_Two, 2 mM EGTA, 500 μL Trasylol (FBA, New York, USA), 1 mM DTT, pH 7.4) suspended in a medium-sized polytron device (output level 5) with 10 straws (2 seconds each). The nuclei were sedimented at 600 g for 5 minutes under cooling. The supernatant was carefully removed with a Pasteur pipette and collected on ice. Same polytron Using the procedure, pellets were re-extracted with the same volume of membrane buffer. Nuclei again from that suspension Was allowed to settle as described above. Centrifuge the combined supernatant at 10,000g for 15 minutes This caused the membrane to settle. Store the pellet in 3 mL per gram of cells. Storage buffer (membrane buffer containing 20% glycerol) in glass Teflon homogenizer And resuspended by 10 strokes. 2 μL of the suspension Micro BCA assay (Pierce, Rockford, USA) was performed using 4 μL. A total protein concentration was estimated (approximately 2.5 μg / μL). Freeze membrane with liquid nitrogen And stored at -70 ° C until use.Example 7 Binding assay using oCRF, astressin, compounds 2, 4 and 5 200 pL incubation buffer (membrane buffer with BSA added to 1 mg / mL) 100,000 cpm or 200,000 c with peptide (c = 0-1 μM) in pm [¹²⁵I-Tyr⁰] In a tube containing oCRF, 25 μg of protein (H EK293 cells) or membrane suspension containing 100 μg protein (Y79 cells) 100 μL was added. After incubation (1 hour, 23 ° C.), a membrane buffer (1 mL) was added. After centrifugation at 14,000 × g (4 ° C., 5 minutes), pellet was added to 1 mL of membrane buffer. And washed twice. Radioactivity is measured by 1470 WIZARD automatic gamma counter (Berthold Co., Hannover). Data analysis is a non-linear curve fitting pro Performed in Gram LIGAND.Example 8 a)3Photoaffinity Labeling Experiments Photoaffinity labeling experiments were performed except that the incubation buffer used did not contain BSA. In principle, the procedure was as described above. A series of concentrations of oCRF (0, 100 nM, 1 μM, 10 μM) or VIP (1 μM) and 180,000 per tube cpm 3 contains the HEK293 membrane homogenate of transfected or non-transfected cells. (75 μg protein / tube) was added, and the mixture was incubated for the indicated time. Photolytic Wash the pellets three times before, resuspend in 300 μl of buffer and 30 min at 360 nm (4 ° C., distance 8 cm from lamp). After photolysis, add 1 mL of buffer, The pellet was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes. The pellet is dH_TwoO Resuspended in 15 μL and 15 μL of 2 × SDS and heated at 100 ° C. for 5 minutes. That trial The sample was subjected to electrophoresis on a 7.5% SDS gel, and a Fujix BAS2000 scanner was used. (Raytest) on BAS-IP NP 2040P imaging plate Autoradiography was performed at Commercially available marker (SDS-PAGE Estimate the apparent molecular weight based on the gel mobility compared with the biomarker (BioRad). Was. The proof of the gel is the program TINA (Straubenhardt) and WINCA M (Cybertech). b) Compound2Photoaffinity Labeling Experiments Photoaffinity labeling experiments were performed in the same manner as the binding assay, except that BSA was not used. Done. Incubate sample (25 μg protein / tube) with ligand (1 hour (23 ° C.), and then irradiate at 360 nm for 30 minutes (4 ° C., distance 8c from lamp) m). In some experiments, photolabeled receptors were converted to PNGase (New Eng land Biolabs, Schwalbach). Next, heat the sample (100 ° C., 5 minutes) and subjected to SDS PAGE. Autoradiography is Performed on a BAS-IP NP 2040P imaging plate. Fujix BA Radioactivity using S2000 scanner (Raytest, Straubenhard) Was monitored. Verification of the gel was performed with the TINA program (Raytest).Example 9 cAMP stimulation HEK293 cells and human Y79 retinoblastoma cells (American Type Cell Culture, Rockville) with 1 mM or 5 mM 3-isobutyl-1-methyl, respectively. Various CRF analogs were incubated in the presence of xanthine (37 ° C., 30 minutes). Y7 The incubation medium for 9 cells further contained 1 mg / mL BSA and 0.05 mg / mL ascord. Vinic acid was added. Uses compound 2 or a photoactivatable astressin analog If so, all experiments were performed in the dark. After removing the medium, the cells are It was dissolved with an aqueous solution of lichloroacetic acid (100 ° C., 5 minutes). The cell lysate is Stored at -70 ° C until assayed with Amersham (Little Chalfont) did. Data analysis was performed using the sigmoidal dose response curve fitting program ALLF. Performed at IT. Statistical significance between groups was determined by one-way analysis of variance.Example 10 Purification and characterization of cross-linked 75 kDa protein 1.1 × 10 5 membrane proteins (250 μg)⁷cpm at 3 (2.82 mmol) I knew. One-tenth of the sample was added to a 50% formic acid / ethanol solution (100 μL). Dissolve, Vydac C_FourSilica gel column (0.46 × 25 cm, particle size 5 μm , 30 nm pore size). Elution is 0.5% trif The reaction was performed with a mixed solution of an aqueous solution of fluoroacetic acid and ethanol. Document 1) Spiess, J., Rivier, J., Rivier, C. and Vale, W. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 78, 6517-6521. 2) Vale, W., Spiess, J., Rivier, C. and Rivier, J .; (1981) Science 213,1394-13 97. 3) Vita, N., Laurent, P., Lefort, S., Chalon, P., Lelias, J.-M., Kaghad, M. , Le Fur, G., Caput, D. and Ferrara, P .; (1993), FEBS Lett. 335, 1-5. 4) Chen, R., Lewis, K.A., Perrin, M.H. and Vale, W. (1993) Proc. Natl. Acad. S ci. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ケップケ，アンドレアスドイツ連邦共和国デー−37176ネルテン− ハルデンベルク、クラッペンベルクヴェーク８番──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // C12N 5/10 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12N 5/00 B (72) Inventor Kepke, Andreas Germany Day-37176 Nerten-Haldenberg, Kappenberg Berg No. 8

Claims

[Claims] 1. CRF or an analog thereof having a photoactivatable component and a label. 2. 2. The CRF or analog of claim 1, wherein the photoactivatable component and the label are adjacent to each other. 3. The CRF or analog according to claim 1 or 2, wherein the photoactivatable component is a 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl residue. 4. The CRF or analog according to any one of claims 1 to 3, wherein the label is a radioactive marker. 5. 5. The CRF or analog of claim 4, wherein the label is ^125I . 6. The CRF or analog according to any one of claims 1 to 3, wherein the label is a fluorescent marker. 7. The CRF or analog according to any one of claims 1 to 5, which is 4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl- [ ^125I ] -tyrosine ⁰ oCRF. 8. ATB- cyclo ^{(30-33) [125 I-His} 13, Nle 21,38, Glu 30, A la 32, Lys 33] h / rCRF- (13-41) at which claims 1-5 or C RF or analog. 9. The CRF or the analog according to any one of claims 1 to 5, which is ATB-cyclo (30-33) [Nle ^21,38 , Glu ³⁰ , ¹²⁵ I-Tyr ³² , Lys ³³ ] h / rCRF- (13-41). . 10. Use of the CRF according to any one of claims 1 to 9 or an analog thereof for detecting a CRF receptor and a CRF binding protein. 11. Use of CRF or an analog thereof according to any one of claims 1 to 9 for identifying a binding site of a CRF receptor or a CRF binding protein. 12. The use according to claim 10 or 11, wherein the receptor protein is detected in a tissue membrane. 13. 13. Use according to any of claims 10 to 12, wherein said receptor protein is detected in the membrane of HEK293 cells. 14． 14. Use according to any of claims 10 to 13, wherein said CRF receptor protein has a molecular weight of 66 or 75 kDa. 15. A method for purifying a CRF receptor protein, comprising reacting a membrane preparation containing the protein with the CRF of any one of claims 1 to 9 or an analog thereof, performing photolysis, and purifying the obtained product by HPLC. The method that consists of doing. 16. A method for characterizing a binding site of a CRF receptor or a CRF binding protein, comprising purifying the CRF binding protein or the CRF receptor by the method of claim 15, fragmenting the purified product, and determining the amino acid sequence of the relevant fragment. A method consisting of: 17． 17. A CRF receptor or CRF binding protein whose binding site has been identified by the method of claim 16.