JP2000500021A

JP2000500021A - Ultra-high resolution comparative nucleic acid hybridization with combed DNA fiber

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Publication number: JP2000500021A
Application number: JP9518705A
Authority: JP
Inventors: アーロン、ベンシモン; トーマス、クレマー; ユルゲン、クラウス; ペータ、リヒター
Original assignee: アンスティテュ、パストゥール
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2000-01-11
Also published as: EP0861331A1; AU7329096A; CA2235395A1; WO1997018326A1; NZ320546A

Abstract

(57)【要約】（Ａ）標的核酸配列を支持マトリックス上でコーミングすることにより固定し、（Ｂ）コームド核酸配列を試験される異なって標識された核酸プローブおよび参照核酸プローブとの１：１混合物と接触させて、ハイブリッド形成させ、（Ｃ）コームド核酸配列上に位置する個別標識ハイブリッド形成ドットをカウントし、（Ｄ）試験プローブからの総ドット数と参照プローブからの総ドット数との比を計算して、検出および定量される核酸配列の数を決定することからなる、ゲノム中における核酸配列の存在を検出および定量するための方法。 (57) [Summary] (A) immobilizing the target nucleic acid sequence by combing on a support matrix, and (B) contacting the combed nucleic acid sequence with a 1: 1 mixture of differently labeled nucleic acid probes to be tested and a reference nucleic acid probe, Hybridize, (C) count the individually labeled hybridization dots located on the combed nucleic acid sequence, and (D) calculate the ratio of the total number of dots from the test probe to the total number of dots from the reference probe to detect And a method for detecting and quantifying the presence of a nucleic acid sequence in a genome, comprising determining the number of nucleic acid sequences to be quantified.

Description

【発明の詳細な説明】コームドＤＮＡ繊維との超高解析度比較核酸ハイブリッド形成発明の背景本発明はゲノム中における遺伝子の存在の検出および定量に関する。具体的には、本発明はヒト癌遺伝子の検出および定量に関する。比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）(Kallioniemi et al.1992；du Manoir et al.1993；Joos et al.1993)と称される最近開発された方法は、（例えば、腫瘍標品から得られた）ゲノムＤＮＡでＤＮＡ配列の非ランダム獲得および喪失について検出するための新規な手段を提供する。ＣＧＨの場合、ゲノム腫瘍ＤＮＡはハプテン（例えば、ビオチン）でまたは直接に蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ）で標識される。（患者または他者の）正常細胞から得られたゲノムＤＮＡは、別なハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）でまたは直接に別な蛍光色素（例えば、ＴＲＩＴＣまたはテキサスレッド）で異なって標識される。標識された腫瘍およびコントロールＤＮＡは等量で混合される。この混合物は、健康な男性または女性から得られた正常中期スプレッド（標的染色体）と、過剰の未標識ｃｏｔ１ ‐ＤＮＡの存在下でハイブリッド形成される。過剰のｃｏｔ１‐ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに存在する標識された散在およびタンデム反復配列、並びに標的染色体に存在するこのような配列とハイブリッド形成する。この工程は標的染色体との反復配列の望ましくないハイブリッド形成を抑制する上で必須である（Lichter et al.1988；Pinkel et al.1988）。ハイブリッド形成と洗浄工程の後に、標準検出操作が２つの異なる蛍光色素でハプテン化配列を視覚化させるために適用される（Lichter and Cremer,1992）。この工程は蛍光色素で直接標識されたＤＮＡ‐プローブの場合には省略される。例えば、いくつかの一染色体もしくは三染色体または染色体セグメントを除く、本質的に二倍体核型の腫瘍を考えてみる。腫瘍ＤＮＡおよび正常コントロールＤＮＡからの大きさ数百塩基対の標識されたＤＮＡ断片は、それらの各標的配列と等しい確率でハイブリッド形成する。偽二倍体腫瘍細胞中に２コピーで存在する染色体または染色体セグメントからの標識ＤＮＡ断片は、二倍体細胞のゲノムＤＮＡからの異なって標識された断片と一緒になり、各標的染色体または染色体セグメントにおいてある色の混合物を形成し、例えば染色体または染色体セグメントが腫瘍ＤＮＡおよび正常ＤＮＡからのハイブリッド形成断片を各々表す等数の緑色および赤色蛍光色素で標識されたときには黄色である。腫瘍中に３以上のコピー数で存在する染色体セグメントの場合には、この色はより緑っぽくなり、一方セグメントの喪失はより赤色になる。これらの変色は、標的染色体に沿って蛍光比分布を測定することにより、定量的に記録できる（du Manoir et al.1994；Piper et al.1994）。シグナル強度を測定するために適した装置の選択は重要である。検出器は広範囲にわたり直線的な強度測定を行えるべきである。ＣＣＤ‐カメラがこの点で特に有用である。すべてのデータはデジタル方式で蓄積されるため、それらは蛍光比の計算のためにマイクロプロセッサーで使用できる。こうして、コピー数核型が確定できる。ＣＧＨは保管されたパラフィン包埋組織から抽出されたＤＮＡで行える。ゲノムＤＮＡの均一な微小量が縮重オリゴヌクレオチドプライマーでの増幅（ＤＯＰ ‐ＰＣＲ）後にこの目的に用いることができる（Telenius et al.1992 ；Speich er et al.1993 ；Isola et al.1994）。組織セクションから腫瘍細胞を含む領域を微量切り出して、それをＤＯＰ‐ＰＣＲ増幅ＤＮＡで行われたＣＧＨによりゲノム物質の獲得および喪失についてスクリーニングすることが可能である（Spei cher et al.1994）。腫瘍でＤＮＡコピー数の変化を検出する上でＣＧＨの有用性を証明している研究の数は急増している。公表された研究は、様々な形の急性および慢性白血病、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎臓癌、神経芽腫、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、ブドウ膜黒色腫を含めた多様な腫瘍についてこれまで既に表している（例えば、du Manoir et al.1993,1994 ；Isola et al.1994a,b ；Jo os et al.1993 ；Kallioniemi et al.1992,1993,1994a,b ；Muleris et al.1994 ；Ried et al.1994 ；Schrock et al.1994,Speicher et al.1993,1994,1995および我々の未発表データ）。今まで未知の多数の領域、特に増幅部位がこれらの研究でみつけられてきており、各腫瘍関連遺伝子をクローニングすることに努力を集中させるようになるであろう。異なる腫瘍実体は非ランダム変化の明確に異なるパターンを通常示し、臨床追跡研究では特定の獲得および喪失が所定腫瘍の臨床経過および予後とどの程度まで相関しうるのかを示す。単一コピー数変化がＣＧＨにより現在検出できる染色体セグメントの最小サイズは１０Ｍｂｐ程度である（Joos et al.1993 ；du Manoir et al.1994；Piper et al.1994）。おそらく、ＣＧＨが前中期染色体で行われるときには、解析度はやや改善させることができる。増幅されたＤＮＡ配列の場合、ＣＧＨの検出限度は現在２Ｍｂｐである（増幅反復数はアンプリコンサイズに合わせる）。なお、染色体セグメントの境界が獲得または喪失に関与する精度は、標的染色体のバンド解析により制限される。このため、ＣＧＨ開発の現状では、単一腫瘍関連遺伝子（例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子）のコピー数表示を明らかにすることは行えない。これはかなり不均衡な染色体異常の検出へのＣＧＨの適用を制限している。発明の概要本発明は、下記の新しい必須の特徴により最新の比較ゲノムハイブリッド形成とは異なる超高比較ゲノムハイブリッド形成の方法を提供することにより、当業界でこれらの必要性を満たす上で役立つ。その手法は参照染色体の代わりにコームド（combed）ＤＮＡ繊維で行われ、コームド繊維ＣＧＨと称される。コームド繊維ＣＧＨでは、（既に公表された方法としてＭｂ対範囲の代わりにｋｂ対範囲で）超高解析度でゲノム試験ＤＮＡにおける（コームドＤＮＡ繊維で表示される）特定配列のコピー数表示の分析を行える。この改善により、コームド繊維ＣＧＨは単一遺伝子またはその部分のコピー数表示を研究する上で非常に有用な方法になる。コームド繊維ＣＧＨは、蛍光が全ＤＮＡ‐スポットから測定されるときに生じるバックグラウンド問題を蛍光測定で排除するために特に適している。コームド繊維ＣＧＨの場合には、正確にＤＮＡ繊維上に位置するハイブリッド形成ドットだけが試験または参照ゲノムＤＮＡから誘導される測定シグナルに関与するように、蛍光測定の範囲が単一繊維に合わせられる。この改善は、蛍光測定が支持マトリックスに結合された不規則標的ＤＮＡ配列の全ＤＮＡ‐スポットから得られるＣＧＨアプローチと比較して、コームド繊維ＣＧＨの非常に顕著な利点を提供している。標準操作により個別コームド標的ＤＮＡ繊維で行える蛍光強度測定に加えて、コームド繊維ＣＧＨではコームドＤＮＡ繊維上に位置するハイブリッド形成ドットのカウントを行える。このアプローチにより、ハイブリッド形成した試験および参照ゲノムＤＮＡに起因する十分に大きな一連の標的ＤＮＡ繊維におけるドットの総数がカウントでき、試験ゲノムＤＮＡからの総ドット数と参照ゲノムＤＮＡからの総ドット数との比（または差異）が試験および参照ゲノムＤＮＡにおけるコームド標的ＤＮＡ配列のコピー数表示の尺度として計算できる。このアプローチはこれまでＣＧＨ実験で実現されておらず、得られたシグナルが単一ＤＮＡ繊維で蛍光比の有意な測定を行うには弱すぎる状況下でコームド繊維ＣＧＨ実験の評価を行える。試験および参照ゲノムＤＮＡの１：１混合物の代わりに、同数の試験および参照細胞を表すＲＮＡ調製物（ＲＮＡ調製物から合成されたｃＤＮＡ）の１：１混合物も、コームド標的ＤＮＡ繊維、例えば対象遺伝子のコード配列を表すｃＤＮＡ繊維と抑制条件下でハイブリッド形成できる（標準ＣＧＨ操作参照）。実験の評価は上記のように行われる。このアプローチでは、試験細胞（例えば、腫瘍細胞）および参照細胞（例えば、腫瘍細胞の正常始原細胞）でｍＲＮＡの相対コピー数表示の評価を行える。標的ＤＮＡ繊維、例えば対象遺伝子（の一部）を含むコスミドは、散在反復配列が不十分な抑制ハイブリッド形成の問題を避ける上で除かれるように遺伝子工学処理される（注意：ハイブリッド形成混合物中に含まれる散在反復配列ではなく、標的繊維特異性単一コピー配列だけが、これらの処置下でコームド標的ＤＮＡ繊維とハイブリッド形成できる）。個別標的ＤＮＡ繊維の位置が各繊維に沿う多くのシグナルドットの並び方により容易に特定できない場合には、ハイブリッド形成された試験および参照ゲノムＤＮＡ断片の視覚化で示される蛍光色素の発光スペクトルと明確に識別される発光スペクトルを有した蛍光色素で、いくつかの操作が明確な標的繊維同定のために行える。ａ）繊維は適切な蛍光ＤＮＡ染色で染色できる。ｂ）標的繊維ＤＮＡは、繊維の直接視覚化のため蛍光色素標識ＤＮＡヌクレオチドの存在下で、または例えば間接的免疫蛍光による間接的視覚化のためにハプテン修飾ヌクレオチド、例えばＢＲｄＵ、ビオチン、ジゴキシゲニンの存在下でクローニングすることができる。ｃ）標的繊維ＤＮＡは、コームド繊維ＣＧＨに用いられるハイブリッド形成混合物への適量の標識された標的ＤＮＡ配列の添加により視覚化できる。この場合には、標識された標的配列の量は、標的特異性標識試験およびゲノムＤＮＡ配列のハイブリッド形成を抑制するほど過剰であるべきではない。ｄ）ベクター配列を有する標的繊維ＤＮＡは、ハイブリッド形成混合物に加えられた標的ベクター配列とハイブリッド形成できる。所望であれば、ハイブリッド形成混合物への標識リンカーＤＮＡ配列の添加から誘導されるシグナルによりコームド標的繊維のコースと向きを特定することを可能にするように、異なる鎖長のリンカーＤＮＡが標的繊維ＤＮＡに加えることができる。異なる発光スペクトルを有する蛍光色素の代わりに、蛍光寿命の異なる蛍光色素も用いてよい。蛍光色素の選択は、できるだけ多く支持マトリックスからのバックグラウンド蛍光を避けるために、特定の参照で行われる。好ましい態様の詳細な説明本発明は、ゲノム中に存在する遺伝子のマルチコピーの検出および定量のためのＤＮＡアライメント法の使用に関する。マルチコピーとはゲノム当たり少くとも約１００コピーの視覚化を意味し、非常に良好な結果ではゲノム当たり約２０００コピーである。コームドＤＮＡ繊維との超高解析度比較核酸ハイブリッド形成下記部分において、我々は単一遺伝子レベルで解析を行えるＣＧＨ試験の開発について記載している。この試験は十分に自動化させて、臨床面で広く用いることができる。新規試験は、全染色体の代わりに、特定の標識核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）がいずれか望ましい幾何学的方式でガラスまたはプラスチック物質のような支持マトリックスに固定される、という考え方に基づいている。標的核酸（ＴＮＡ‐）スポットの数および各ＴＮＡスポットの配列複雑さは、試験の具体的目標に応じて選択できる（下記適用例参照）。所定マトリックス‐ＣＧＨ試験に含まれるＴＮＡ‐スポットの数は、数個のスポットから数百または数千さえのスポットまでにわたる（可能な適用例については下記参照）。典型的ＴＮＡ‐スポットは対象遺伝子またはその一部を表す単一コスミドからのＤＮＡを含んでいても、あるいは対象となる染色体セグメントまたはその全染色体さえも表すＤＮＡの複合混合物を含んでいてもよい。後者の場合に、マトリックスＣＧＨ試験は参照中期染色体に対するＣＧＨの解析よりも優れた解析度を示さないであろう。下記において、我々は最高の考えうる解析度を有するマトリックスＣＧＨ試験、即ち選択遺伝子の組でコピー数変化を検出する試験の開発に対する我々の考察を主に述べていく。上記のようなＴＮＡ‐スポットを有するマトリックスは、ｋｂｐ範囲まで小さな遺伝子不均衡について試験腫瘍または他の試験ＤＮＡに使用できる。この目的のため、異なって標識された試験および参照ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ調製物）の１：１混合物からなるハイブリッド形成プローブが、固定されたＴＮＡ‐スポットの組に対する抑制条件下でハイブリッド形成される。各個別ＴＮＡ‐スポットにおける蛍光比の測定では、参照ＤＮＡ（または参照ＲＮＡ）と比較して、試験ＤＮＡ（または試験ＲＮＡ）における各標的配列のコピー数表示の評価を行えるはずである（測定の更なる詳細については下記参照）。このような試験の開発に成功するかどうかは、３つの要件、即ち支持マトリックス、例えばガラスまたはプラスチックに標的核酸をしっかり固定させる能力、マトリックスの低い自己蛍光、および所定ＴＮＡ‐スポットと特異的にハイブリッド形成する配列について十分に高いシグナル／ノイズ比に依存している。特に、２つの異なって標識されたゲノムＤＮＡを用いるＣＧＨ実験において、所定ＴＮＡ‐スポットに特異的な標識ＤＮＡ断片のフラクションは一般的に非常に少ない。マトリックスへの標識配列または検出試薬の非特異的結合は、有意な蛍光比の測定をそこなったりまたは阻止さえすることがある。このような有害作用は、特に特定シグナルがバックグラウンドと比較して比較的小さい場合に、全ＴＮＡ ‐スポットで蛍光比を測定する試みにおいて制限ファクターになるかもしれない。蛍光比測定でバックグラウンド問題を最小にするために、我々は“分子コーミング”（molecular combing）と称される操作（Bensimon et al.1994）を用いる。この手法は信頼されており、引用することによりその全体で本明細書の開示の一部とされる。この操作により、ＤＮＡ標的繊維はコームの使用により毛髪のように延ばして並行に整列させることができる。このために、ＤＮＡ繊維は固体表面に一端で結合され、後退する空気‐水界面により“コーミングされ”、最後に乾燥表面上に固定される（Bensimon et al.1994）。こうして、各ＴＮＡ‐スポットのＤＮＡは一連の“コームド”標的ＤＮＡ繊維で表すことができ、すべてが対象の特定ＤＮＡ配列、例えば対象遺伝子からのコスミドクローンを表している。適切な厳格条件下で標準蛍光 in situ抑制ハイブリッド形成技術を用いると、ハイブリッド形成プローブ中に存在する相補配列はこれらの標的配列と特異的にハイブリッド形成する。各ＴＮＡ‐スポットについて、蛍光はＣＣＤ‐カメラのような適切なカメラを用いて一連の個別コームド標的ＤＮＡ繊維で双方の蛍光色素に関して別々に記録される。評価の場合、各標的配列はハイブリッド形成ＤＮＡ断片の標識／視覚化に適用された蛍光色素の蛍光を調べるために、狭く適用された方形視野に囲まれる。バックグラウンド蛍光は測定される各標的配列のすぐ近くで測定され、差し引かれる。バックグラウンド減算後に、蛍光比がマイクロプロセッサーで各個別標的配列について求められる。各ＴＮＡ‐スポットについて、いくつかのコームド標的ＤＮＡ繊維で得られた蛍光比の偏差が求められる。試験および参照ゲノムＤＮＡ双方において正常なコピー数で表示される標的配列が、増加または減少したコピー数表示の指標である比について信頼しうる閾値を得るために用いられる。試験‐ＤＮＡで過剰または過少表示される標識配列を表すＴＮＡ‐スポットでは、それに対応して増加または減少した蛍光比を得るはずであり、一方均衡のとれた領域はコントロール実験の限界内にある比を得るはずである。蛍光比はＴＮＡ‐スポット中に存在する個別標的ＤＮＡ繊維から記録されるため、新規な試験では各ＴＮＡ‐スポット中における標的ＤＮＡの総量の偏差に対して不明確である。モデル実験では、異なる比のビオチン標識およびジゴキシゲニン標識コスミド配列からなるプローブ混合物（例えば、１：１（２０ｎｇ＋２０ｎｇ）、２：１（２０ｎｇ＋１０ｎｇ）、５：１（２０ｎｇ＋４ｎｇ）および１０：１（２０ｎｇ＋２ｎｇ））が調製された。プローブ混合物中にある配列の各選択比について、同様のコスミドが標的配列として用いられた。比較ハイブリッド形成後に、約５０の標的ＤＮＡ繊維が例中で記載されたように評価された。結果は異なるプローブ混合物について得られた平均蛍光比値の高い有意差を証明している。個別標的ＤＮＡ繊維の使用は、ＣＧＨ実験の評価に関してもう１つのアプローチの可能性を提供する。全標的ＤＮＡ繊維からの蛍光強度を測定する代わりに、個別の蛍光ハイブリッド形成ドットを簡単にカウントすることが可能である。このような各ドットは数百ｂｐの個別プローブＤＮＡ断片のハイブリッド形成をおそらく表示している。ゲノムＤＮＡの１：１ハイブリッド形成混合物からの異なって着色されたドットによるコームド標的ＤＮＡ配列のカバーは推計学的現象である。したがって、一連の標的ＤＮＡＤＮＡ繊維についてカウントされた２つの異なって標識されたゲノムＤＮＡに関するドット数は、比較ハイブリッド形成に用いられた２つのゲノムＤＮＡにおける標的ＤＮＡ配列のコピー数表示を反映している。特に、このような手法を用いると、有意な蛍光測定を行う上で各標的配列について異なる標識ゲノムＤＮＡから十分なシグナルを得ることは不要である。試験ゲノムＤＮＡは平均で５つの特異的ハイブリッド形成ドットを生じるが、参照ゲノムＤＮＡは標的ＤＮＡ配列当たり１つの特異的ドットを生じることを考えてみる。そのときには、問題となる標的配列のコピー数表示は試験ゲノムＤＮＡで５倍高い、という結論が妥当であろう。所定ＴＮＡ‐スポットに含まれる一連の標的ＤＮＡＤＮＡ繊維についてカウントされた試験および参照ゲノムＤＮＡからのドットの比は、いくつかの理由から試験および参照ゲノムＤＮＡ中における標的配列のコピー数表示の実際比からずれていることがある。１：１ハイブリッド形成混合物中の異なって標識されたＤＮＡは、同様のサイズ分布に切断されるべきである。標的配列付近におけるバックグラウンドドットの数は、試験および参照双方のゲノムＤＮＡについてほぼ同様のはずである。必要ならば、標的ＤＮＡ配列で偶然のバックグラウンドドットに起因すると予想されるドットの数は、標的ＤＮＡ配列を囲んだ領域から計算されて、全体のカウントドット数から差し引かれる。コームド標的ＤＮＡ配列に沿い整列して正確に並んだバックグラウンドドットだけが、実際のシグナルドットと混同されうる。こうしてコームドＤＮＡ標的ＤＮＡ繊維に沿うドットを測定するように提案されたアプローチは、一連のコームド標的ＤＮＡ繊維に沿う特異的ハイブリッド形成ドットの数をカウントする精度を低下させるバックグラウンドドットの数を最少にする上でかなり役立つ。これは、蛍光比が多数の非コームドＤＮＡ繊維により作られた全ＤＮＡ‐スポットから求められる試験と比較して、提案された試験の決定的な利点である。更に、提案された試験はいくつかのＴＮＡ‐スポットについて蛍光またはドット数比の比較を行えることが強調されるべきである。試験および参照双方のゲノムＤＮＡに等コピー数で存在するコームド標的ＤＮＡ繊維を含んだＴＮＡ‐スポットは、参照ゲノムＤＮＡから得られる蛍光またはドット数による各個別ＴＮＡ ‐スポットにおける内部標準化に関するだけでなく、試験および参照ゲノムＤＮＡに等しいおよび異なるコピー数で存在するコームド標的ＤＮＡ繊維を表す異なるＴＮＡ‐スポット間のデータの標準化に関しても、蛍光比およびドット比を各々標準化するように働くことができる。各標的ＤＮＡＤＮＡ繊維が多くの特異的ドットでカバーされている場合には、標的繊維はドットの直線的並びとして容易に識別することができる。コームド標的ＤＮＡ繊維の明確な同定が少数のドットをカウントする上で絶対的に必須の要件であり、ドット数比（または減算で得られる差異）は一連の標的ＤＮＡ繊維から得られたときだけ有意である。したがって、標的繊維は、ハイブリッド形成ＤＮＡ（またはＲＮＡ）断片の同定に用いられた蛍光色素と識別しうる発光スペクトルを有した特異的ＤＮＡ蛍光色素を含めて、ドットの数が少ないときに、他の手段により視覚化される必要がある。標的ＤＮＡ繊維は、ハイブリッド形成混合物への標識された標的ＤＮＡの混合により視覚化させることもできる。この場合には、第三の標識が試験および参照ゲノムＤＮＡに関する２つの標識に加えて要求される。標識された標的配列の混合は、試験および参照ゲノムＤＮＡに存在する標識された標的配列のハイブリッド形成の多すぎる抑制を避けるために、慎重に調整されねばならない。リンカーが特異的リンカープローブとのハイブリッド形成により視覚化できる標的ＤＮＡ配列と適合させられるならば、この問題は避けられる。そのときに問題となるコームド標的ＤＮＡ配列は、２つの蛍光標識リンカー配列に囲まれるようになる。一方、標的ＤＮＡ配列は、ＢｒｄＵのようなハプテン修飾ヌクレオチドの存在下でクローニングして、免疫細胞化学的に視覚化させてもよい。有用な標的ＤＮＡ配列の選択のためには、散在反復シグナル、例えばＡｌｕ要素を含む配列が、例えば過剰の未標識Ｃｏｔ１‐ＤＮＡとの抑制ハイブリッド形成を要することを考慮すべきである。問題となるゲノム領域と完全に特異的である標的ＤＮＡ繊維を用いるか、または散在反復要素を欠いた標的ＤＮＡ繊維を構築することが好ましいかもしれない。コームドＤＮＡ繊維でのＣＧＨは超高解析度ＣＧＨの可能性を有している。下記シナリオを考えてみる：既知ＤＮＡ配列のＤＮＡ繊維は数百塩基対を含んだ対象標的領域を含んでいる。この標的領域のコピー数が可変的であり、参照ゲノムＤＮＡと比較して試験ゲノムＤＮＡの方が高い（または低い）であろうと、我々は考えている。ＤＮＡ繊維に沿う標的およびコントロール領域の位置は正確に地図化され、ＤＮＡ繊維はその５′‐３′配向が例えば異なるサイズのリンカーアダプターに対するプローブにより視覚化できるように工学処理されると、我々は更に考えている。このようなシナリオにおいて、標的領域は各ＤＮＡ繊維で分別鎖長測定により地図化できる。したがって、標的領域とのハイブリッド形成現象を表すドットを特定して、一連のＤＮＡ繊維でこのような現象の数をカウントすることができる。この数はゲノム試験および参照ＤＮＡにおける標的配列の表示と相関するはずである。標的配列数が参照ゲノムＤＮＡと比較して試験ゲノムＤＮＡで増加している場合には、各ドット比はＤＮＡ繊維の他の領域と対比してこの領域で増加しているはずであり、その際に我々は試験および参照双方のゲノムＤＮＡで等しいコピー数表示を想定している。モデル系として、所定ＤＮＡ繊維の２領域についてＰＣＲ増幅プローブを作製することができる。各プローブからのＤＮＡ部分は異なって標識され、様々なハイブリッド形成混合物が作製されて、その場合に異なって標識された部分は異なる比で存在する。一連のＤＮＡ繊維で２つの標的領域にわたりハイブリッド形成ドットをカウントすることにより、異なって標識されたプローブ部分の比をドット数比がどの程度まで反映するかを調べることができる。この例は、蛍光比がもはや妥当でない非常に小さな標的配列のコピー数表示を求める上で、ドットカウントに基づくアプローチが実施可能であることを説明している。この利点は、下記シナリオにより再強調される。対象の小さな（３００ｂｐ）標的配列を含む１本鎖ＤＮＡ配列を考えてみる。異なって標識された相補的３００ｂｐ配列との４つのＣＧＨプローブ混合物が適用される。各個別繊維では、対象の標的配列は１回ハイブリッド形成できるだけであり、即ちそれは１色だけのドットを有する。標的が二本鎖変性ＤＮＡで表されるならば、双方の鎖が変性二本鎖プローブの標的として働く。したがって、標的領域はせいぜい２つの３００ｂｐ断片とハイブリッド形成するだけである。得られるドットは同様の色または異なる色のいずれかである。単一繊維の標的領域にわたる蛍光比の測定は明らかに無意味であるが、標的領域が一連のＤＮＡ繊維で同様の（例えば、緑または赤）または異なる色（例えば、黄色）のドットによりカバーされる頻度は、ハイブリッド形成混合物で異なって標識された標識配列の頻度に関して高度に情報性があるにちがいない。一方、数百塩基対の標的配列を表すＤＮＡがマトリックスに固定されて、標的スポットおよび蛍光比が全スポットから調べられる。しかしながら、この場合には、バックグラウンドが主要問題になる。これらの考慮から、十分な数の個別ＤＮＡ繊維で行われたドットカウントアプローチが超高解析度ＣＧＨの場合に優れていて、唯一の実施可能な手法でさえある、と我々は結論付けている。参照中期スプレッドにおいてＣＧＨで考慮される個別標的染色体のかなり可変的なサイズ、形および相対位置と対照的に、コームド標識ＤＮＡ繊維の鎖長および配向は厳格にコントロールすることができる。コームド標識ＤＮＡ繊維のこれら画定されたパターンは、それらの完全に自動化された評価をかなり容易にする。多数のＴＮＡ‐スポットの場合には、蛍光比またはドット比測定の着色プリントアウトが過剰または過少表示されたゲノム領域の研究者認識を容易にするために勧められる。このプリントアウトにおいて、各ＴＮＡ‐スポットは着色スポットで表される。１つの色は試験‐ＤＮＡ中に均衡のとれたコピー数で存在する配列を見掛上表す蛍光比の範囲でＴＮＡ‐スポットを反映し、第二の色は増加したコピー数で存在する配列を有したＴＮＡ‐スポットを反映するが、第三の色は減少したコピー数で存在する配列を有するＴＮＡ‐スポットを反映する。所望であれば、カラー強度は過剰または過少表示の相対度を反映させることができる。物理的に地図化された配列を含んだ一連のＴＮＡ‐スポットの場合、カラースポットは染色体上の地図化位置を反映するように並べることができる。例えば、着色スポットの直線的並びはコームドＤＮＡ繊維ＣＧＨに用いられるコンティグ（contig）でクローンの順序を表す。全染色体数がＴＮＡ‐スポットで表される場合に、得られるカラースポットは（染色体１〜２２、ＸおよびＹを表す）２４の直線的並びとして配列される。所定並び内のカラースポットは、各染色体内のクローンの物理的順序を表す。そのとき、研究者は染色体または染色体サブ領域が均衡のとれた増加または減少コピー数で存在するかどうかを一見でみることが可能になる。コームド標的ＤＮＡ繊維を有するマトリックスでＣＧＨの可能な適用例このセクションで、我々はコームド標的ＤＮＡ繊維でＣＧＨの可能な適用例を考えてみる。腫瘍ＤＮＡサンプルで行いうる研究に加えて、我々は臨床遺伝学および細胞遺伝学での適用例も含むようになるだろう。遺伝子特異的ＴＮＡ‐スポットの試験では、特定遺伝子のコピー数変化について腫瘍サンプルからの試験ＤＮＡの迅速なスクリーニングを行える。ＴＮＡ‐スポットの自動評価に適した装置があれば、妥当な価格で対象遺伝子の全組のコピー数表示を行う多数のスポットによるＤＮＡスポットマトリックスを評価することが実施可能となる。最高可能レベルの解析度での全ゲノムの調査には、このような手法が実施不可能なほど多くのスポットを要する。実施目的には、解析度を増加させた一連の試験により未知の獲得および喪失を有した試験ゲノムＤＮＡの調査を行うことが有利であり、中期スプレッドでＣＧＨにより開始してから、特定染色体セグメントに向かっていく。参照染色体でのＣＧＨに加えて、全染色体、染色体アームまたはバンドの混成ＤＮＡ配列を表すスポットを有したマトリックスも適用してよい。標的ＤＮＡ繊維で直接行われるＣＧＨは最大レベルの解析度をＣＧＨに付与し、試験ゲノムＤＮＡでコピー数変化に関して標的ＤＮＡ配列の非常に特異的なサブセットのスクリーニングが要される場合のみに妥当する。下記例ではこのような方法がどのように適用されるかを説明している。参照染色体スプレッドでのＣＧＨでは、例えば、ある腫瘍実体についてある染色体セグメントの非ランダム喪失を明らかにする。共通領域はこの欠失を示すすべての腫瘍の比較により解明できる。しかしながら、腫瘍のかなりのフラクションはこのレベルの解析度（＞１０Ｍｂｐ）だとどんな検出しうる欠失も示さない。かなり小さな欠失についてもこれらの腫瘍をスクリーニングするためには、共通領域を表すＴＮＡ‐スポットを有したマトリックスが用いられる。解析度は、所定マトリックスにより表される標的配列のサイズおよび直線的ゲノム距離に依存する。多くの場合に、一連のＴＮＡ‐スポットにより染色体領域を表わせればスクリーニング目的にとり十分であり、各スポットは例えば次のＴＮＡ‐スポットに含まれる標的ＤＮＡ配列から数百ｋｂ離れたコスミド配列を明らかにする。最高の可能な解析度に達するためには、全コンティグさえも一連のＴＮＡ‐スポットで表してよい。対象領域を表す高解析度マトリックスで行われる蛍光比測定はコスミドを明らかにする上で役立ち、特定腫瘍実体を有する患者から得られた全一連のゲノム試験ＤＮＡについてこの対象領域で検出しうる最小欠失を表す。この最小欠失は腫瘍核への各コスミドのＦＩＳＨにより確かめられる。こうして、推定腫瘍サプレッサー遺伝子の部位クロニーングの努力がかなり容易になる。このような目的のためには、対象の染色体セグメントを表すコスミドクローンの正確な直線的順序を知ることが不要である。減少した蛍光比を有する３つのＴＮＡ‐スポットが最小の検出しうる欠失を明らかにするならば、伸長クロマチン繊維に対するこれら３クローンのＦＩＳＨでそれらの付近を確認することが期待できる。後者のアプローチはこれらコスミドの直線的順序を地図化するために用いることもできる。同様に、染色体サブ領域を表す物理的に地図化されたコスミドを有するマトリックスは、増幅領域を明らかにする上で役立つ。増幅に関与する遺伝子の部位クローニングは、このような増幅の伸長が正確に地図化されるならば、かなり容易となるであろう。染色体バンドが参照中期スプレッドに対するＣＧＨにより増幅配列源として特定されることを考えてみる。問題となる染色体バンドを表す一連の物理的に地図化されたクローンを有するマトリックスを適用すれば、ＤＮＡ配列を表すいかなるＴＮＡ‐スポットについても蛍光比増加を示すはずであり、それは実際に増幅されている。通常の蛍光比がすべての他のＴＮＡ‐スポットについて測定されるべきである。増幅の程度は、最も近いおよび最も遠い地図化クローンを表す、増加した蛍光比の２つのＴＮＡ‐スポットにより明らかにされる。将来になれば、癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子のコピー数表示についてコームド標的ＤＮＡ繊維を有するＴＮＡ‐スポットを含んだマトリックスが開発できる。所定マトリックスに関する標的配列の選択は、腫瘍実体と試験の要求に依存する。例えば、マトリックスは予後の評価のため獲得または喪失（例えば、神経芽腫でＮ‐ｍｙｅ増幅またはｌｐ３６欠失）を確認できるように特に開発することができる。一部の腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍の場合に、腫瘍発生および進行に関与する関連遺伝子の知識はこのような方法の開発を考える上で既に十分に進んでいるようである。他の腫瘍の場合、我々はこのような知識をまだ欠いている。コームドＤＮＡ繊維でのＣＧＨは、将来このような知識を得る上で、更にはゲノムＤＮＡ配列の相対コピー数変化（および特定ｍＲＮＡ数の変化）のパターンの相関関係を求める目的で行われる大規模試験を行う上で役立つ。理想的には、問題となる腫瘍実体の生物学的性質に関連したすべての遺伝子を表すＴＮＡ ‐スポットを含んだマトリックスが開発されるべきである。高解析度マトリックスは臨床細胞遺伝学でも新たな道が開ける。２つの例があれば、可能な適用範囲を明らかにする上で十分であろう。ＣＧＨ試験マトリックスは、不均衡染色体異常の疑いがある表現型を有した患者からのＤＮＡをスクリーニングするために開発できる。不均衡な転位が末端染色体セグメントをよく含むことを考慮にいれると、各個別染色体末端からのクローン化配列を表すコームド標的ＤＮＡ繊維を使ったＴＮＡ‐スポットを含むＣＧＨ‐マトリックスは、大きな臨床的価値をもつようになる。もう１つの例として、Ｘ関連劣性疾患に関するキャリア分析の場合を考えてみる。Duchennu筋ジストロフィーにかかった少年が、家族でその疾患の最初の罹患者である。その場合の約６０％において、欠失が変異の原因としてみられる。彼の疾患が生殖細胞変異によるのか、または彼の母親が既にキャリアであるかについての疑問に答えられねばならない。遺伝カウンセリングの結果は全体的に異なり、後者の場合で他の女性メンバー、例えば少年の母親の姉妹も彼女らのキャリア状態について心配している。全ジストロフィン遺伝子にわたる一連のコスミドを有したマトリックスによれば、ＤＭＤの欠失しがちな場合のキャリアスクリーニングで信頼しうる自動化操作を可能性として提供できる。コームドＤＮＡ繊維における比較ＲＮＡハイブリッド形成：腫瘍関連遺伝子の発現レベルの評価のための新規方法コームドＤＮＡ繊維のＣＧＨは欠失または増幅遺伝子に関する情報を与えるが、それらの正常な対相手と比較して腫瘍細胞で遺伝子の沈黙または過剰発現を検出することはない。我々はコームドＤＮＡ繊維で比較ＲＮＡハイブリッド形成により遺伝子の発現状態を研究するアプローチを提供する。例えば、増幅が所定腫瘍実体で検出されるシナリオを考えてみる。アプリコンは大きく、いくつかの遺伝子を含んでいる。これら遺伝子が強く発現されるかどうかは明らかでない。問題となる全遺伝子のコード配列に関するコームドｃＤＮＡ繊維を含んだＤＮＡ‐ スポットマトリックスは、腫瘍および正常参照組織からの異なって標識されたＲＮＡ調製物（または対応ｃＤＮＡ調製物）との比較核酸ハイブリッド形成に用いることができる。得られた蛍光またはドット数比から、正常組織と比較した、腫瘍での試験遺伝子の（相対的）発現状態をみることができる。同様のアプローチが、遺伝子の解明を妨げる点変異を検出するために用いられる。本発明は下記例で更に詳細に記載されている。例１コームドＤＮＡ繊維を有するガラススライドの調製いかなるクローン化ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡまたは他の精製ＤＮＡも、比較ハイブリッド形成実験の目的に応じて、ＤＮＡコーミングに用いることができる。ＴＮＡ‐スポット当たりで必要なＤＮＡの量は少なく、その理由は少数のＤＮＡ繊維がコームド繊維ＣＧＨ実験での評価に必要とされるだけだからである（例えば、コスミドＤＮＡ（４０ｋｂ）１ｎｇは２．４×１０２の分子を含んでいる）。以下において、我々はコスミドＤＮＡによる典型的実験を説明している。標的ＤＮＡ繊維の結合には、既に記載されたような塩処理により前処理されたガラス表面を要する（Bensimon et al.1994）。それらの結合前に、コスミドは室温で１時間かけてＹＯＹＯ‐１で染色することができる（モレキュラープローブ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｙ‐３６０１）。染色溶液は下記のように新らしく調製した：Ｔ₄₀Ｅ₂に１：１００希釈された１ｍｌＤＮＡ（１ mg/ml）＋３３ｍｌＹＯＹＯ‐１＋６６ｍｌＴ₄₀Ｅ₂；Ｔ₄₀Ｅ₂緩衝液は４０ｍＭトリス‐酢酸、２ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を含有している。ＹＯＹＯ‐１染色コスミドＤＮＡをｐＨ５．５の５０ｍＭＭＥＳ緩衝液で希釈し、その後ガラス表面に結合させた（ｐＨが結合の成功にとり最も重要な点であることに注意せよ）。我々の本実験において、各ガラススライド（２２×２２ｍｍ）は１タイプのコームドＤＮＡ繊維だけを含んでいた。適宜に、異なる配列のＤＮＡ繊維を含んだいくつかのガラススライドを並行して処理した。コームドＤＮＡ繊維をもつ一連のＴＮＡスポットを有した単一マトリックスの調製の場合には、ガラス表面の塩処理はＴＮＡスポットの位置について選択された領域に制限することができる。各々が所定領域に必要なＤＮＡ標的配列をもつＤＮＡ繊維を有した一連の小滴を、これらの前選択領域に置ける。各小滴に含まれた標的繊維は、表面と結合することができる。非結合繊維を含む過剰液体は、表面を濡らせておくことに注意しながら除去する。ＤＮＡ繊維結合後、コーミングを記載されたように行った（Bensimon et al.1 994）。ＹＯＹＯ‐１染色繊維の顕微鏡観察で、結合繊維の密度および方向のコントロールを行った。コームドＤＮＡ繊維のスライドを６０℃で少くとも４時間焼き、２×ＳＳＣ中３％ＢＳＡからなる“ブロック溶液”により３７℃で３０分間処理した。２×ＳＳＣで簡単な洗浄後に、スライドを一連の７０％、９０％、１００％ＥｒＯＨに各々２分間とおして、風乾させた。乾燥スライドの貯蔵は密封ボックス中＋４℃で勧められる。例２コームドＤＮＡ繊維との比較ハイブリッド形成：コームドＤＮＡ繊維との比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）は、中期染色体のＣＧＨについて他で記載されたように本質的に行った（du Manoir et al.19 93,1995）。簡単に言えば、試験および参照ゲノムＤＮＡを各々ビオチンおよびジゴキシゲニンでニックトランスレートした。一方、ＤＮＡは適切な蛍光色素複合化ヌクレオチドで直接標識してもよい。コームドＤＮＡ繊維をｐＨ７．０の７０％ＦＡ／０．６×ＳＳＣ中７２℃で２分間変性させた。その後、スライドを一連の氷冷ＥｒＯＨ（７０％、９０％、１００％）にとおして、風乾させた。ハイブリッド形成混合液１０ｍｌ（５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣおよび１０％硫酸デキストラン中に試験および参照ゲノムＤＮＡ各５００ｎｇ、ヒトＤＮＡのＣｏｔ１フラクション（BRL/Life Technologies）５０ｍｇおよび音波処理サケ試験ＤＮＡ（Sigma）５５ｍｇを含有している）をコームドＤＮＡ繊維保有の各ガラススライド（２２×２２ｍｍ）にのせた。もう１枚のやや小さなガラススライド（１８×１８ｍｍ）を上にのせて、fixogum でシールした。ハイブリッド形成を３７℃で一夜行った。ビオチンおよびジゴキシゲニン標識配列の洗浄および検出操作は、わずかな変更を加えて記載されたように行った（Lichter and Cremer.1992,du Manoir et al.1993,1995）。スライドを５０％ＦＡ／ＳＳＣで３×５分間および２×ＳＳＣで３×５分間室温で洗浄した。４× ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中３７℃で平衡化後、スライドを３％ＢＳＡ／４× ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中で３０分間にわたり３７℃でインキュベートした（バックグラウンドを減少させるブロック工程）。次いでスライドを４×ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中で５分間にわたり３７℃で洗浄し、ＦＩＴＣ（Vector L aboratories）に複合化されたアビジンＤＣＳと共に３７℃で４５分間インキュベートして、ビオチン標識プローブを視覚化させた。ジゴキシゲニン標識プローブを一次抗体としてマウス抗ジゴキシンＩｇＧ抗体（Sigma）とのインキュベート、その後蛍光色素ＣＹ３と複合化されたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体とのインキュベートにより検出した。これら工程の間に、スライドを４×ＳＳＣ／０．１％ Tween２０で５分間にわたり３７℃で各々洗浄した。必要であれば、アビジン‐ＦＩＴＣシグナルを記載されたように増幅させた（ Pinkel et al.1986）。最後に、スライドを風乾して、アンチフェード（antifad e）としてVectashield （Vector Laboratories）にのせた。一連のモデル実験において、異なる比のビオチン標識およびジゴキシゲニン標識コスミド配列からなるプローブ混合物（例えば、１：１（２０ｎｇ＋２０ｎｇ）、２：１（２０ｎｇ＋１０ｎｇ）、５：１（２０ｎｇ＋４ｎｇ）および１０：１（２０ｎｇ＋２ｎｇ））を、標的配列と同様のコスミドを表すコームドＤＮＡ繊維とのin situ ハイブリッド形成に用いた。例３比較ハイブリッド形成に付されたコームドＤＮＡ繊維の評価（Ａ）画像入手グレーレベル画像を各蛍光色素について冷却された黒色および白色ＣＣＤカメラ（Photometrics）で別々に記録した。最適露出時間および光学的設定を実験で決めて、その後所定実験で記録される全組のＤＮＡ繊維について一定に保った。画像はＦＩＴＳ方式で蓄積した。（Ｂ）画像処理（１）蛍光比の測定デジタル画像をＮＩＨ画像により処理した（バージョン１．５９ｂ９）。方形マスクを各ＤＮＡ繊維に適用した。マスク内で、２つの積分された蛍光値をすべての画素についてグレーレベル値の合計として得た。バックグラウンド蛍光強度は所定ＤＮＡ繊維のすぐ近くまでマスクをシフトさせた後に調べた。蛍光強度をバックグラウンド減算により補正した。各繊維の蛍光比は、補正ＦＩＴＣ蛍光強度を補正Ｃｙ３蛍光強度で割ることにより計算した。５０のＤＮＡ繊維を典型的実験で評価して、平均蛍光比値を計算した。（２）ドットカウント特に、上記実験でコームドＤＮＡ繊維に沿い観察される標識は均一ではない。シグナルの代わりに、ハイブリッド形成標識ＤＮＡ断片をおそらく表すドットがこれらの繊維で識別しうる。ドットカウントの場合には、デジタル画像は限界にあり、比重中心を調べた。要約すると、本発明ではコームドＤＮＡ繊維比較ハイブリッド形成（ＣＦＣＨ）と称される操作を提供する。この新規な操作の場合には、以下が得られる：１）キロ塩基対範囲の解析度で、即ち単一遺伝子のレベルで、異なって標識された正常ゲノムＤＮＡのコピー数表示と比較して、標識されたゲノム試験ＤＮＡ（例えば、腫瘍ＤＮＡ、不均衡タイプの染色体異常の患者からのＤＮＡ）からのＤＮＡ配列の相対コピー数表示を測定しうる可能性。逆に、前記のようなＣＧＨではメガ塩基対範囲でコピー数変化を検出できるだけである。２）試験および参照細胞から得られたｍＲＮＡの混合物の比較ハイブリッド形成により、特定遺伝子から転写されたｍＲＮＡのコピー数差異を測定しうる可能性。３）下記のような配置を自動評価にとり特に有用なものとさせる幾何学的方式におけるハイブリッド形成混合物の相対コピー数表示について多数配列の同時試験に適したマトリックス上における、対象のゲノムまたはｃＤＮＡ試験配列を表すコームドＤＮＡ繊維を有した標的ＤＮＡスポットの配置。本発明は真核細胞で遺伝子疾患の検出に特に有用である。参考文献 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Ultra-high resolution comparative nucleic acid hybridization with combed DNA fiber Background of the Invention The present invention relates to the detection and quantification of the presence of a gene in a genome. Specifically The invention relates to the detection and quantification of human oncogenes. Comparative genomic hybridization (CGH) (Kallioniemi et al. 1992; du Manoir A recently developed method, referred to as Joos et al. 1993) (for example, Non-random acquisition and loss of DNA sequences in genomic DNA (obtained from tumor preparations) Provide a new means for detecting For CGH, genomic tumor DN A is a hapten (eg, biotin) or directly a fluorescent dye (eg, FITC) ). Genomic DNA obtained from normal cells (of a patient or others) With another hapten (eg, digoxigenin) or directly with another fluorescent dye (eg, , TRITC or Texas Red). Labeled tumor And control DNA are mixed in equal amounts. This mixture is for healthy men or Normal metaphase spread (target chromosome) obtained from a woman with excess unlabeled cot1 Hybridizes in the presence of DNA. Excess cot1-DNA is Interspersed and tandem repeats present in DNA and target chromosomes Hybridizes with such a sequence present at This step involves the Essential for suppressing unwanted hybridization of repetitive sequences (Lichter et al. 1988; Pinkel et al. 1988). After the hybridization and washing steps, the standard A detection procedure was applied to visualize the haptenized sequence with two different fluorochromes (Lichter and Cremer, 1992). This step involves DN directly labeled with a fluorescent dye. Omitted for A-probe. Eg excluding some mono- or tri-chromosomes or chromosome segments Consider, essentially, a diploid karyotype tumor. Tumor DNA and normal controls Labeled DNA fragments of several hundred base pairs in size from the DNA are labeled with their respective target sequences. Hybridize with a probability equal to Present in two copies in pseudodiploid tumor cells The labeled DNA fragment from the chromosome or chromosome segment Each target chromosome or chromosome is combined with a differently labeled fragment from the DNA. Form a mixture of colors in the segment, e.g. chromosomes or chromosome segments Equal to the number of hybridizing fragments from tumor DNA and normal DNA, respectively. Yellow when labeled with green and red fluorescent dyes. 3 or more in the tumor For chromosome segments that exist at copy number, this color becomes more greenish, Segment loss, on the other hand, becomes more red. These discolorations are quantified by measuring the fluorescence ratio distribution along the target chromosome. (Du Manoir et al. 1994; Piper et al. 1994). Signal strength The choice of a suitable device to measure is important. Detector is linear over a wide range Should be able to perform strong intensity measurements. CCD-cameras are particularly useful in this regard. You Since all data is stored digitally, they are used to calculate the fluorescence ratio. Available with microprocessor. Thus, the copy number karyotype can be determined. CGH can be performed on DNA extracted from stored paraffin-embedded tissues. Geno Amplification with degenerate oligonucleotide primers (DOP) -PCR) can be used for this purpose afterwards (Telenius et al. 1992; Speich er et al. 1993; Isola et al. 1994). Area containing tumor cells from tissue section And excise it by CGH performed with DOP-PCR amplified DNA. It is possible to screen for acquisition and loss of nome substances (Spei cher et al. 1994). Research Demonstrating Usefulness of CGH in Detecting DNA Copy Number Changes in Tumors The number of people is increasing rapidly. Published studies show various forms of acute and chronic leukemia, Bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, glioblastoma, kidney cancer, neuroblastoma, prostate cancer, small cells And a variety of tumors, including non-small cell lung cancer and uveal melanoma (Eg, du Manoir et al. 1993, 1994; Isola et al. 1994a, b; Jo) os et al. 1993; Kallioniemi et al. 1992, 1993, 1994a, b; Muleris et al. 1994 Ried et al. 1994; Schrock et al. 1994, Speicher et al. 1993, 1994, 1995 and And our unpublished data). Many unknown regions, especially amplification sites, have been Efforts to clone each tumor-related gene. Will be focused. Different tumor entities are distinctly different in non-random changes Pattern, and clinical follow-up studies indicate that certain gains and losses It shows how much it can be correlated with bed course and prognosis. The minimum size of a chromosome segment for which a single copy number change is currently detectable by CGH Is about 10 Mbp (Joos et al. 1993; du Manoir et al. 1994; Piper et al. 1994). Probably, when CGH is performed on the pre-metaphase chromosome, the resolution is Can be slightly improved. In case of amplified DNA sequence, CGH detection limit Is currently 2 Mbp (the number of amplification repeats matches the amplicon size). In addition, The accuracy with which chromosome segment boundaries contribute to gain or loss depends on the target chromosome band. Limited by code analysis. For this reason, in the current state of CGH development, single tumor-related genetic To reveal copy number indications of offspring (eg, oncogenes, tumor suppressor genes) I can't. This limits the application of CGH to the detection of fairly unbalanced chromosomal abnormalities. I have. Summary of the Invention The present invention provides advanced comparative genomic hybridization with the following new essential features: By providing a method for ultrahigh comparative genomic hybridization that differs from Help meet these needs in the world. The method uses a code instead of a reference chromosome. It is performed on a combed DNA fiber and is called combed fiber CGH. Combed In fiber CGH, (Kb vs. range instead of Mb vs. range as published method (Indicated by combed DNA fiber in genomic test DNA with ultra-high resolution) ) Analysis of the copy number display of a specific sequence can be performed. With this improvement, the combed fiber CG H is a very useful method for studying the copy number representation of a single gene or a part thereof become. Combed fiber CGH occurs when fluorescence is measured from total DNA-spots. It is particularly suitable for eliminating background problems in fluorescence measurements. Combed In the case of fiber CGH, hybridization dots located exactly on the DNA fiber Only involved in the measured signal derived from the test or reference genomic DNA In addition, the range of the fluorescence measurement is adapted to a single fiber. This improvement is due to the Obtained from all DNA-spots of a random target DNA sequence bound to a trix Offers a very significant advantage of combed fiber CGH compared to the CGH approach are doing. In addition to fluorescence intensity measurements that can be performed on individual combed target DNA fibers by standard procedures, In the case of combed fiber CGH, the hybridization dot located on the combed DNA fiber is used. Can be counted. This approach allows hybrid testing and And a set of sufficiently large target DNA fibers due to the reference genomic DNA. The total number of dots can be counted, the total number of dots from the test genomic DNA and the reference genome DN. The ratio (or difference) from the total number of dots from A to the test and reference genomic DNA It can be calculated as a measure of the copy number representation of the combed target DNA sequence. This appro Has not been realized in the CGH experiment, and the signal obtained is a single DNA Combed fiber CGH experiment under conditions that are too weak to make a significant measurement of the fluorescence ratio on the fiber Can be evaluated. Instead of a 1: 1 mixture of test and reference genomic DNA, an equal number of test and reference 1: 1 mix of RNA preparations representing control cells (cDNA synthesized from RNA preparations) The compound may also be a combed target DNA fiber, such as cDN representing the coding sequence of the gene of interest. It can hybridize with A-fiber under suppressed conditions (see standard CGH procedure). Experimental The evaluation is performed as described above. In this approach, test cells (eg, tumor cells) Cells) and a reference cell (eg, a normal progenitor cell of a tumor cell). You can evaluate the number display. A cosmid containing (a part of) the target DNA fiber, for example, the gene of interest, is Gene engineering so that rows are eliminated in order to avoid the problem of poor inhibitory hybridization (Note: not interspersed repeats contained in the hybridization mixture) In addition, only the target fiber-specific single copy sequence is the only target fiber specific combo target DN under these treatments. A can be hybridized with the A fiber). The position of individual target DNA fibers depends on the arrangement of many signal dots along each fiber. If not easily identified, the hybridized test and reference genome An emission spectrum clearly distinguished from the emission spectrum of the fluorescent dye shown in the visualization of the DNA fragment. Fluorescent dye with optical spectrum, several operations for clear identification of target fiber Can be done. a) The fibers can be stained with a suitable fluorescent DNA stain. b) Target fiber DNA Can be used in the presence of fluorochrome-labeled DNA nucleotides for direct visualization of the fiber, and Are hapten-modified nucleotides for indirect visualization, for example by indirect immunofluorescence For example, cloning in the presence of BRdU, biotin, digoxigenin Can be. c) The target fiber DNA is a hybrid fiber used for combed fiber CGH. Can be visualized by adding an appropriate amount of the labeled target DNA sequence to the mixture. In this case, the amount of labeled target sequence is determined by the target specificity labeling test and the genomic D It should not be too great to suppress NA sequence hybridization. d) Baek The target fiber DNA having the target sequence is the target fiber DNA added to the hybridization mixture. Can hybridize with vector sequences. Hybridization mixing, if desired object Target by the signal derived from the addition of a labeled linker DNA sequence to the combed target Linkers of different chain lengths so that the course and orientation of the fiber can be specified DNA can be added to the target fiber DNA. Fluorescent colors with different fluorescence lifetimes instead of fluorescent dyes with different emission spectra Element may also be used. The choice of fluorescent dye should be as large as possible from the support matrix. Performed with a specific reference to avoid background fluorescence. Detailed description of preferred embodiments The present invention is directed to the detection and quantification of multiple copies of a gene present in the genome. The use of the DNA alignment method. Multi-copy means less per genome Also means about 100 copies of visualization, with very good results being about 20 copies per genome. 00 copies. Ultra-high resolution comparative nucleic acid hybridization with combed DNA fiber In the following part, we will develop a CGH test that can analyze at the single gene level Is described. This test should be fully automated and widely used in clinical settings. Can be. A new test shows that instead of all chromosomes, a specific labeled nucleic acid (DNA or RNA) Support mats, such as glass or plastic materials, in any desired geometric manner It is based on the idea that it is fixed to tricks. Target nucleic acid (TNA-) The number of spots and the sequence complexity of each TNA spot depends on the specific goals of the test (See the application example below). Predetermined matrix-T included in CGH test The number of NA-spots can range from a few spots to hundreds or even thousands of spots (See below for possible applications). A typical TNA-spot is from a single cosmid representing the gene of interest or a portion thereof. Chromosome segment or its entire dye It may contain a complex mixture of DNAs that even represent chromosomes. In the latter case, The CGH test provides a better resolution than the analysis of CGH on the reference metaphase chromosome. Will not show. In the following, we describe the matrix with the highest possible resolution. To develop the CGH test, a test that detects copy number changes in a set of selected genes We will mainly discuss our considerations. Matrices with TNA-spots as described above are small to the kbp range. Can be used on test tumors or other test DNA for any genetic imbalance. This purpose For differently labeled test and reference genomic DNA (or RNA or Hybridization preparation consisting of a 1: 1 mixture of Will hybridize under suppression conditions to the paired TNA-spots. each For the measurement of the fluorescence ratio at the individual TNA-spots, the reference DNA (or reference RN) Copy of each target sequence in test DNA (or test RNA) compared to A) An evaluation of the numerical representation should be possible (see below for further details of the measurement). The success of developing such a test depends on three requirements: the support matrix. The ability to immobilize the target nucleic acid firmly on a box, such as glass or plastic, Low matrix auto-fluorescence and specific hybridization to a given TNA-spot It depends on a sufficiently high signal / noise ratio for the sequences that form the pads. In particular In a CGH experiment using two differently labeled genomic DNAs, The fraction of labeled DNA fragments specific for NA-spots is generally very low No. Non-specific binding of the labeled sequence or detection reagent to the matrix is significant Measurement may be compromised or even discouraged. Such adverse effects include: Especially when the specific signal is relatively small compared to the background, the total TNA -May be the limiting factor in attempts to measure fluorescence ratio at the spot . To minimize background problems in fluorescence ratio measurements, we use “molecular Using an operation called molecular combing (Bensimon et al. 1994) . This technique is trusted and is incorporated herein by reference in its entirety. Be part of. By this operation, the DNA target fiber is turned into hair by using a comb. And can be aligned in parallel. Because of this, DNA fibers are solid Bonded at one end to the surface and "combed" by the receding air-water interface Fixed on a dry surface (Bensimon et al. 1994). Thus, each TNA- Pot DNA can be represented by a series of "combed" target DNA fibers, Represents a specific DNA sequence of interest, for example, a cosmid clone from the target gene. You. Standard Fluorescence Under Appropriate Stringent Conditions Using In Situ Suppression Hybridization Technology The complementary sequence present in the hybridization probe is specific for these target sequences Hybridize to For each TNA-spot, the fluorescence requires a suitable camera, such as a CCD-camera. Record separately for both fluorochromes in a series of individual combed target DNA fibers using Is done. For evaluation, each target sequence is labeled / visualized for the hybridized DNA fragment Surrounded by a narrowly applied rectangular field to examine the fluorescence of the applied fluorescent dye You. Background fluorescence is measured in close proximity to each target sequence measured, and Drawn. After background subtraction, the fluorescence ratios are individually calculated with a microprocessor. Asked for the target sequence. Several combs for each TNA-spot The deviation of the fluorescence ratio obtained with the target DNA fiber is determined. Test and reference genomes The target sequence represented by a normal copy number in both DNAs increases or decreases. Used to obtain a reliable threshold for the ratio, which is an indicator of the number of copies displayed . Testing-TNA-spots representing labeled sequences that are over- or under-represented in DNA Should give a correspondingly increased or decreased fluorescence ratio, while the equilibrium and Regions that should be obtained should obtain ratios that are within the limits of control experiments. The fluorescence ratio is TN A-New test because it is recorded from individual target DNA fibers present in the spot Is unclear for the deviation of the total amount of target DNA in each TNA-spot You. In model experiments, different ratios of biotin- and digoxigenin-labeled cosmids were used. A probe mixture consisting of sequences (eg, 1: 1 (20 ng + 20 ng), 2: 1 (20 ng + 10 ng), 5: 1 (20 ng + 4 ng) and 10: 1 (20 ng + 20 ng) g + 2 ng)) was prepared. For each selectivity of sequences in the probe mixture , A similar cosmid was used as the target sequence. After comparative hybridization, Fifty target DNA fibers were evaluated as described in the examples. Results are different professional This demonstrates a high significant difference in the mean fluorescence ratio values obtained for the probe mixture. The use of individual target DNA fibers is another approach for evaluating CGH experiments. Offer the potential of the switch. Instead of measuring the fluorescence intensity from all target DNA fibers, It is possible to easily count individual fluorescent hybridization dots. This Each dot, such as, indicates the hybridization of several hundred bp of individual probe DNA fragments. It is probably displayed. Differentiating genomic DNA from a 1: 1 hybridization mixture Of the combed target DNA sequence by dots colored is there. Thus, two counts for a series of target DNA DNA fibers Dot numbers for differently labeled genomic DNAs were compared for hybridization Reflects the copy number indication of the target DNA sequence in the two genomic DNAs used for are doing. In particular, using such a technique, each target sequence must be identified for significant fluorescence measurements. It is not necessary to obtain sufficient signals from different labeled genomic DNA. test Genomic DNA yields an average of 5 specific hybridization dots, whereas the reference genome Consider that nome DNA produces one specific dot per target DNA sequence. You. At that time, the copy number of the target sequence in question is 5 The conclusion that it is twice as high would be reasonable. A series of target DNAs contained in a given TNA-spot Do the ratios of dots from the printed test and reference genomic DNA From the actual ratio of the target sequence copy number representation in the test and reference genomic DNA It may be off. Differently labeled in the 1: 1 hybridization mixture DNA should be cut into similar size distributions. A buffer near the target sequence The number of background dots is approximately the same for both test and reference genomic DNA. Should be similar. If necessary, accidental background docking with the target DNA sequence The number of dots expected to be caused by the target DNA is calculated from the area surrounding the target DNA sequence. Is subtracted from the total number of counted dots. For combed target DNA sequences Only those background dots that are aligned exactly along the Can be confused with Measure the dots along the combed DNA target DNA fiber The proposed approach is to provide a unique set of combed target DNA fibers Background that reduces the accuracy of counting the number of hybrid dots formed It is quite helpful in minimizing the number of dots. This is because the non-comb Comparison with tests required from total DNA-spots made by de-DNA fibers , Is the decisive advantage of the proposed test. In addition, the proposed test shows fluorescence or docking for some TNA-spots. It should be emphasized that the comparison of the number ratios can be made. Geno for both test and reference TNA-spons containing combed target DNA fiber present at equal copy number in DNA The set is the individual TNA by fluorescence or dot number obtained from the reference genomic DNA. -Test and reference genomic DNs as well as for internal standardization in spots A representing different numbers of combed target DNA fibers present at equal and different copy numbers. For standardization of data between TNA and spot, the fluorescence ratio and dot ratio Can work to standardize on each. If each target DNA DNA fiber is covered with many specific dots The target fiber can be easily identified as a linear array of dots. Combed Unambiguous identification of the target DNA fiber is absolutely essential for counting a small number of dots Is a requirement and the dot number ratio (or the difference obtained by subtraction) is Or Significant only when obtained. Therefore, the target fiber is hybridized D Emission spectrum that can be distinguished from the fluorescent dye used to identify the NA (or RNA) fragment When the number of dots is small, including specific DNA fluorescent dyes with Need to be visualized by means. The target DNA fiber is a mixture of the labeled target DNA into the hybridization mixture. Can also be visualized. In this case, the third label is the test and reference Required in addition to two labels for genomic DNA. Mixed labeled target sequences If the test and reference genomic DNA present a labeled target sequence hybridized Care must be taken to avoid too much suppression of the formation of crystals. Linker DNA that can be visualized by hybridization with a specific linker probe This problem is avoided if matched to the sequence. The problem is that The naked target DNA sequence becomes surrounded by two fluorescently labeled linker sequences. On the other hand, the target DNA sequence is expressed in the presence of a hapten-modified nucleotide such as BrdU. And visualized immunocytochemically. For selection of useful target DNA sequences, interspersed repetitive signals, such as Alu The sequence containing the element is, for example, an inhibitory hybrid form with excess unlabeled Cot1-DNA. Need to be considered. Completely specific to the genomic region of interest Use target DNA fibers or construct target DNA fibers lacking interspersed repeat elements. It may be preferable to build. CGH on combed DNA fibers has the potential of ultra-high resolution CGH. under Consider the above scenario: DNA strands of a known DNA sequence are pairs containing several hundred base pairs. Includes elephant target area. The copy number of this target region is variable, Whether test genomic DNA is higher (or lower) compared to DNA, Is thinking. The location of the target and control regions along the DNA fiber is precisely The DNA fiber has a 5′-3 ′ orientation, eg, linkers of different sizes. When engineered so that it can be visualized by a probe to the adapter, we Thinking more. In such a scenario, the target area is separated by each DNA fiber It can be mapped by chain length measurement. Therefore, the phenomenon of hybridization with the target region And identify the number of such phenomena in a series of DNA fibers. Can be This number is a representation of the target sequence in genomic tests and reference DNA Should correlate with When the number of target sequences is compared with the reference genomic DNA, If increasing in NA, each dot ratio should be compared to the rest of the DNA fiber. Should be increased in the region of the It is assumed that the DNA has the same copy number display. As a model system, PCR amplification probes are prepared for two regions of a predetermined DNA fiber can do. The DNA portion from each probe is labeled differently and various An hybrid formation mixture is made, in which case the differently labeled moieties are different Exist in a certain ratio. Hybridization across two target regions with a series of DNA fibers By counting the dots, the ratio of the differently labeled probe portions is You can check to what extent the number ratio is reflected. In this example, the fluorescence ratio In determining the copy number display of a very small target sequence that is Explains that a project-based approach is feasible. This advantage is The scenario is re-emphasized. Consider a single-stranded DNA sequence containing a small (300 bp) target sequence of interest. A mixture of four CGH probes with differently labeled complementary 300 bp sequences is suitable. Used. For each individual fiber, the target sequence of interest can only hybridize once That is, it has dots of only one color. Target is represented by double-stranded denatured DNA If available, both strands will serve as targets for the denatured double-stranded probe. Therefore, the target The target region only hybridizes with at most two 300 bp fragments. Profit The resulting dots are either of the same or different colors. Single fiber target area The measurement of the fluorescence ratio over time is clearly meaningless, but the target area is a series of DNA fibers. With dots of similar (eg, green or red) or different colors (eg, yellow) The frequency with which the labeled sequence is labeled differently in the hybridization mixture Must be highly informative about the frequency of On the other hand, DNA representing a target sequence of several hundred base pairs is immobilized on the matrix, Spot and fluorescence ratios are checked from all spots. However, in this case In the background, the background is a major issue. From these considerations, a sufficient number of individual D Excellent dot count approach with NA fiber for ultra-high resolution CGH And we conclude that it is even the only viable approach. Significant variability of individual target chromosomes considered in CGH in reference metaphase spread Chain length and length of combed labeled DNA fibers, as opposed to their typical size, shape and relative position. And orientation can be strictly controlled. This of combed labeled DNA fiber Defined patterns make their fully automated evaluation considerably easier . In the case of a large number of TNA-spots, the colored To make it easier for researchers to identify genomic regions that are over- or under-displayed Recommended for. In this printout, each TNA-spot is a colored spot. Represented by One color is the distribution present in the test-DNA at a balanced copy number. The second color increased, reflecting the TNA-spot in the range of fluorescence ratios that apparently represent the column Reflects TNA-spots with sequences present at copy number, but the third color is reduced Reflects TNA-spots with sequences present at low copy numbers. Desired If so, the color intensity can reflect the relative degree of over or under display. For a series of TNA-spots containing a physically mapped array, the color Pots can be arranged to reflect the mapping location on the chromosome. For example, The linear arrangement of the colored spots is the contig used for combed DNA fiber CGH. (Contig) indicates the order of clones. Total chromosome number is represented by TNA-spot In some cases, the resulting color spot is 24 (representing chromosomes 1-22, X and Y). Are arranged in a straight line. The color spots in the predetermined array are Represents the physical order of the clones. At that time, the researcher can At a glance whether or not exists at a balanced increase or decrease copy number Will be possible. Possible applications of CGH in matrices with combed target DNA fibers In this section, we review possible applications of CGH in combed target DNA fibers. I'll think about it. In addition to studies that can be performed on tumor DNA samples, we And applications in cytogenetics. In gene-specific TNA-spot tests, changes in copy number of specific genes For rapid screening of test DNA from tumor samples. TNA-S If there is equipment suitable for automatic pot evaluation, copy all target gene sets at a reasonable price. -Evaluate the DNA spot matrix with a large number of spots Can be implemented. Such techniques are not feasible for whole genome studies at the highest possible resolution Requires as many spots as possible. The purpose of the implementation was a series of trials with increased resolution. Investigation of test genomic DNA with unknown gains and losses Starting with CGH at mid-term spread and then Going towards. In addition to CGH on the reference chromosome, all chromosomes, chromosome arms or May also apply a matrix with spots representing the hybrid DNA sequence of the band . CGH performed directly on the target DNA fiber imparts the highest level of resolution to CGH Very specific support for target DNA sequences with respect to copy number changes in test genomic DNA Relevant only if screening of busts is required. In the example below, Explains how different methods are applied. CGH on a reference chromosome spread may, for example, show some staining for a tumor entity. Account for non-random loss of color body segments. The consensus region indicates this deletion. It can be clarified by comparing all tumors. However, a significant fraction of the tumor Does not show any detectable deletions at this level of resolution (> 10 Mbp) . In order to screen these tumors for very small deletions, A matrix with TNA-spots representing the communication areas is used. The resolution is Depending on the size of the target sequence represented by a given matrix and the linear genomic distance Exist. In many cases, a chromosomal region can be represented by a series of TNA-spots Each spot is sufficient for screening purposes, for example: Cosmid sequence several hundred kb away from the target DNA sequence contained in the target. To reach the highest possible resolution, even all contigs have a series of TNA-scans. It may be represented by a pot. Fluorescence ratio measurement performed on a high-resolution matrix representing the target area Can help identify cosmids and can be obtained from patients with a particular tumor entity. Represents the smallest detectable deletion in this region of interest for the entire set of genomic test DNA . This minimal deletion is confirmed by FISH of each cosmid into the tumor nucleus. Thus, efforts at site cloning of putative tumor suppressor genes are considerable. Becomes easier. For this purpose, a cosmid representing the chromosomal segment of interest It is not necessary to know the exact linear order of the clones. Has reduced fluorescence ratio If three TNA-spots reveal the smallest detectable deletion, an extension Confirm the vicinity of these three clones by FISH for romatin fiber. Can be expected. The latter approach maps the linear order of these cosmids Can also be used for Similarly, matrices with physically mapped cosmids representing chromosomal subregions Box helps to define the amplification region. Sites of genes involved in amplification Roning is fairly easy if such amplification extensions are correctly mapped. It will be. Chromosome band amplified by CGH against reference metaphase spread Consider being identified as an array source. A series representing the chromosome band in question Applying a matrix with physically mapped clones of the DNA Any TNA-spots representing a row should show an increase in fluorescence ratio, It is actually amplified. Normal fluorescence ratios for all other TNA-spots Should be measured. The degree of amplification depends on the nearest and farthest mapping And two TNA-spots of increased fluorescence ratio, representing the In the future, copy number indications for oncogenes and tumor suppressor genes Matrix containing TNA-spots with combed target DNA fibers Can emit. The choice of target sequence for a given matrix depends on the tumor entity and the requirements of the test. Depends on. For example, a matrix may be acquired or lost (eg, Developed specifically to confirm N-mye amplification or lp36 deletion in neuroblastoma can do. In the case of some tumors, such as colorectal tumors, Knowledge of related genes involved in progression is already sufficient to consider the development of such methods It seems to be proceeding. For other tumors, we still lack such knowledge I have. CGH on combed DNA fiber will provide further Is the pattern of relative copy number change (and change in specific mRNA number) of the genomic DNA sequence. It is useful for large-scale tests that are performed for the purpose of determining the correlation between regions. Ideally Is a TNA that represents all genes related to the biological properties of the tumor entity in question -A matrix containing spots should be developed. High-resolution matrices open new avenues in clinical cytogenetics. There are two examples Would be sufficient to clarify the possible scope. CGH test matrix Screens DNA from patients with a phenotype suspected of having an imbalanced chromosomal abnormality. Can be developed for training. Unbalanced translocations often include terminal chromosome segments The combs representing cloned sequences from each individual chromosome end CGH-matrix with TNA-spots using target DNA fibers Have clinical value. Another example relates to X-related recessive diseases. Consider the case of a career analysis. Boy with Duchennu muscular dystrophy Is the first affected individual in the family. In about 60% of the cases, Appears to be the cause of the mutation. Whether his disease was due to a germline mutation or his You have to answer the question of whether your mother is already a career. Genetic cow The outcome of the canceling is totally different, and in the latter case other female members, e.g. The older mother's sisters are also worried about their career status. All dystrophy According to a matrix with a series of cosmids across the gene, deletion of DMD Possibility of reliable automatic operation in carrier screening in the case where it is apt Can be provided. Comparative RNA hybridization on combed DNA fibers: A new method for assessing the expression level of tumor-associated genes CGH of combed DNA fiber gives information about deleted or amplified gene Detect silence or overexpression of the gene in tumor cells compared to their normal counterparts I will not give it out. We use combed DNA fiber for comparative RNA hybridization It provides an approach to study the expression status of genes more. For example, if the amplification is Consider the scenario detected in the tumor entity. Apricon is big and some remains Contains a gene. It is not clear whether these genes are strongly expressed. Question DNA containing combed cDNA fiber for coding sequence of all genes of interest- The spot matrix contains differently labeled R from tumor and normal reference tissues. Used for comparative nucleic acid hybridization with NA preparation (or corresponding cDNA preparation) Can be From the obtained fluorescence or dot number ratio, the tumor was compared with normal tissue. The (relative) expression status of the test gene in the tumor can be seen. A similar approach Is used to detect point mutations that interfere with gene elucidation. The invention is described in further detail in the following examples.Example 1 Preparation of glass slides with combed DNA fibers Compare any cloned DNA, PCR amplified DNA or other purified DNA Can be used for DNA combing depending on the purpose of the hybridization experiment . TNA-The amount of DNA required per spot is small, due to the small number of DNs A fiber is only required for evaluation in combed fiber CGH experiments (eg For example, 1 ng of cosmid DNA (40 kb) contains 2.4 × 102 molecules. ). In the following, we describe a typical experiment with cosmid DNA. Binding of target DNA fibers was pretreated by salt treatment as described previously. Requires a glass surface (Bensimon et al. 1994). Before their binding, cosmids It can be stained with YOYO-1 for 1 hour at room temperature (Molecular Pro Cat. No. Y-3601). Staining solution was freshly prepared as follows : T₄₀E_Two1 ml DNA (1 mg / ml) diluted to 1: 100 + 33 ml Y OYO-1 + 66ml T₄₀E_Two; T₄₀E_TwoBuffer is 40mM Tris-acetic acid, 2m Contains M EDTA, pH 8.0. YOYO-1 stained cosmid DNA Diluted with 50 mM MES buffer at pH 5.5, then bound to glass surface (Note that pH is the most important point for successful binding). In our experiments, each glass slide (22 x 22 mm) was one type of core. It contained only the native DNA fiber. Where appropriate, DNA strands of different sequences were included Several glass slides were processed in parallel. Single matrix with a series of TNA spots with combed DNA fibers In the case of preparation, the salt treatment of the glass surface is selected for the location of the TNA spot. Area can be restricted. Each has a required DNA target sequence in a given region A series of droplets with DNA fibers can be placed in these preselected areas. Included in each droplet The targeted fibers can bind to the surface. Excess liquid containing unbound fibers Remove, taking care to keep the surface wet. After DNA fiber binding, combing was performed as described (Bensimon et al. 1). 994). Microscopic observation of the YOYO-1 dyed fiber showed that the density and Control. Combed DNA fiber slides at 60 ° C for at least 4 hours Bake with a "block solution" consisting of 3% BSA in 2 × SSC at 37 ° C. for 30 minutes For a while. After a brief wash with 2 × SSC, slides were run in a series of 70%, 90%, Air dried in 100% ErOH for 2 minutes each. Dry slide storage is tight Recommended at + 4 ° C in a sealed box. Example 2 Comparative hybridization with combed DNA fiber: Comparative genomic hybridization (CGH) with combed DNA fibers is a metaphase stain Performed essentially as described elsewhere for body CGH (du Manoir et al. 19 93,1995). Briefly, test and reference genomic DNA were converted to biotin and Nick translated with digoxigenin. DNA, on the other hand, is It may be directly labeled with a combined nucleotide. Combed DNA fiber was treated with 7 at pH 7.0. Denatured in 0% FA / 0.6 × SSC at 72 ° C. for 2 minutes. Then slide one Air dried through a series of ice cold ErOH (70%, 90%, 100%). Yes 10 ml of a bridging mixture (50% formamide, 1 × SSC and 10% sulfuric acid) 500 ng each of test and reference genomic DNA in acid dextran, C of human DNA ot1 fraction (BRL / Life Technologies) 50mg and sonication salmon test Test DNA (containing 55 mg of Sigma). The sample was placed on a lath slide (22 × 22 mm). Another slightly smaller glass sly (18 × 18 mm) was placed on top and sealed with fixogum. Hybridization was performed overnight at 37 ° C. Biotin and digoxigenin labeling Sequence washing and detection procedures were performed as described with minor modifications. (Lichter and Cremer. 1992, du Manoir et al. 1993, 1995). 50% slide Washed at room temperature for 3 × 5 minutes with FA / SSC and 3 × 5 minutes with 2 × SSC. 4x After equilibration at 37 ° C. in SSC / 0.1% Tween20, slides were washed with 3% BSA / 4 × Incubated for 30 minutes at 37 ° C. in SSC / 0.1% Tween 20 (Blocking step to reduce background). Then slide 4 × SSC /0.1% Tween 20 for 5 minutes at 37 ° C., FITC (Vector L aboratories) at 37 ° C for 45 minutes with avidin DCS conjugated. The biotin-labeled probe was visualized. Mouse anti-digoxin IgG antibody using digoxigenin-labeled probe as primary antibody (Sigma), followed by sheep anti-conjugated with the fluorescent dye CY3 Detection was performed by incubation with mouse IgG antibody. During these steps, The ids were each washed with 4 × SSC / 0.1% Tween 20 at 37 ° C. for 5 minutes . If necessary, the avidin-FITC signal was amplified as described ( Pinkel et al. 1986). Finally, air-dry the slides for antifad e) Mounted on Vectashield (Vector Laboratories). In a series of model experiments, different ratios of biotin and digoxigenin labels were used. Probe mixture consisting of a cosmid sequence (eg, 1: 1 (20 ng + 20 ng) ), 2: 1 (20 ng + 10 ng), 5: 1 (20 ng + 4 ng) and 10: 1 (20 ng + 2 ng)), and combed DNA representing a cosmid similar to the target sequence. Used for in situ hybridization with fiber. Example 3 Evaluation of combed DNA fibers subjected to comparative hybridization (A)Image acquisition A gray level image is obtained by cooling the black and white CCD camera for each fluorescent dye. Recorded separately in LA (Photometrics). Experiments to determine optimal exposure time and optical settings Once determined, it was kept constant for all sets of DNA fibers recorded in a given experiment. Images were stored using the FITS method. (B)Image processing (1) Measurement of fluorescence ratio Digital images were processed with NIH images (version 1.59b9). square A mask was applied to each DNA fiber. Within the mask, all two integrated fluorescence values Obtained as the sum of the gray level values for all pixels. Background fluorescence intensity Was examined after shifting the mask to the immediate vicinity of a given DNA fiber. Fluorescence intensity Corrected by background subtraction. The fluorescence ratio of each fiber is the corrected FITC fluorescence intensity The degree was calculated by dividing by the corrected Cy3 fluorescence intensity. Typical 50 DNA fibers The average fluorescence ratio value was calculated by evaluation in the experiment. (2) Dot count In particular, the labels observed along the combed DNA fibers in the above experiments are not uniform. Instead of a signal, a dot that probably represents the hybridization labeled DNA fragment These fibers can be identified. In the case of dot count, digital images are at their limits Yes, the specific gravity center was examined. In summary, the present invention provides combed DNA fiber comparative hybridization (CFCH). ) Is provided. With this new operation, we get: 1) Differently labeled at resolutions in the kilobase pair range, ie at the level of a single gene. Labeled genomic test DNA as compared to the labeled copy number of normal genomic DNA (Eg, tumor DNA, DNA from patients with imbalanced chromosomal abnormalities) Possibility to measure relative copy number representation of DNA sequences. Conversely, CGH as described above Can only detect copy number changes in the megabase pair range. 2) Comparative hybrid form of a mixture of mRNA obtained from test and reference cells Can measure copy number differences of mRNA transcribed from specific gene sex. 3) Geometric methods that make the following arrangements particularly useful for automatic evaluation Of multiple sequences for the relative copy number representation of hybridization mixtures in yeast Displays the genomic or cDNA test sequence of interest on a matrix suitable for the test. Placement of target DNA spots with combed DNA fibers. The invention is particularly useful for detecting genetic disorders in eukaryotic cells.References

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者トーマス、クレマードイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、328 ユニバーシティ、オブ、ハイデルベルク、ラボラトリウム、フュール、モレクラーレ、ツィトゲネティック、インスティトゥート、フュール、ファーマンゲネティック、ウント、アントロポロジー (72)発明者ユルゲン、クラウスドイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、328 ユニバーシティ、オブ、ハイデルベルク、ラボラトリウム、フュール、モレクラーレ、ツィトゲネティック、インスティトゥート、フュール、ファーマンゲネティック、ウント、アントロポロジー (72)発明者ペータ、リヒタードイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、280 ドイチェ、クレープスフォルシュングスツェントルム（デーカーエフツェット）、オルガニザチオン、コンプレクサー、ゲローメ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), AU, BR, CA, J P, KR, MX, NZ, US (72) Inventor Thomas, Klemmer Heidelberg, Im, Germany, Neuenheimer, Felt, 328 Uni Varsity, Ob, Heidelberg, Lab Latrium, fur, molecure, tu Itogenetic, Institute, Fur, Firman Genetic, Eun G, anthropology (72) Jürgen, Claus Heidelberg, Im, Germany, Neuenheimer, Felt, 328 Uni Varsity, Ob, Heidelberg, Lab Latrium, fur, molecure, tu Itogenetic, Institute, Fur, Firman Genetic, Eun G, anthropology (72) Inventor Peter, Richter Heidelberg, Im, Germany, Neuenheimer, felt, 280 doi Che, Krebs Forsungszen Tolm (Deker Evset), Olga Nizathion, Complexer, Gerome

Claims

[Claims] 1. A method for detecting and quantifying the presence of a nucleic acid sequence in a genome. What (A) immobilization by combing the target nucleic acid sequence on a support matrix , (B) differently labeled nucleic acid probes to be tested for combed nucleic acid sequences; Contacting with a 1: 1 mixture of reference nucleic acid probes to hybridize, (C) Counting individually labeled hybridization dots located on the combed nucleic acid sequence And (D) Ratio of the total number of dots from the test probe to the total number of dots from the reference probe To determine the number of nucleic acid sequences to be detected and quantified A method that includes: 2. Target sequence combing (A) fixing the ends of the sequence to a support matrix, (B) contacting the fixed array with a liquid to form a meniscus; (D) Comb the above array with the receding air-water interface The method of claim 1 comprising: 3. The liquid has a pH of about 5 to about 10 for forming a meniscus; The method according to claim 2. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the target sequence is labeled. . 5. The combed-labeled sequence is DNA and the test and reference probes are RNA- A cDNA, or a genomic DNA-preparation. The method described in. 6. The nucleic acid sequence to be detected and quantified is a human oncogene. A method according to any one of the preceding claims.