JP2000333671A - クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ - Google Patents
クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５
（ＧＡＤ６５）ポリペプチド、及びＧＡＤ６５ポリペプ
チドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用
する方法を提供する。 【解決手段】 以下の（ａ）−（ｃ）から選択される組
換えＧＡＤ６５ポリペプチド： （ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）
由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ活性を有するタンパク質。
（ＧＡＤ６５）ポリペプチド、及びＧＡＤ６５ポリペプ
チドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用
する方法を提供する。 【解決手段】 以下の（ａ）−（ｃ）から選択される組
換えＧＡＤ６５ポリペプチド： （ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）
由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ活性を有するタンパク質。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明はグルタミン酸デカル
ボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ポリペプチドの発現の
ために、ＧＡＤ６５で宿主生物を形質転換する組換えＤ
ＮＡ手法の使用に関する。また、ＧＡＤ６５ポリペプチ
ドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用す
る方法をも包含する。
ボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ポリペプチドの発現の
ために、ＧＡＤ６５で宿主生物を形質転換する組換えＤ
ＮＡ手法の使用に関する。また、ＧＡＤ６５ポリペプチ
ドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用す
る方法をも包含する。
【０００２】
【従来の技術】インシュリン−依存性真性糖尿病（ｉｎ
ｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ
ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普
遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、
ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見
られ、免疫的研究によると、この疾患は増加しているこ
とを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産
性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれ
ば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓の（ラ
ンゲルハンス）島細胞に浸潤し、β−細胞を選択的に破
壊する、“インスリティス”という状態を特徴とする。
典型的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリン−生産性
β−細胞の少なくとも８０％が失われた後に、初めて現
れる。残りのβ−細胞は引きつづく数年間に破壊され
る。
ｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ
ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普
遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、
ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見
られ、免疫的研究によると、この疾患は増加しているこ
とを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産
性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれ
ば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓の（ラ
ンゲルハンス）島細胞に浸潤し、β−細胞を選択的に破
壊する、“インスリティス”という状態を特徴とする。
典型的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリン−生産性
β−細胞の少なくとも８０％が失われた後に、初めて現
れる。残りのβ−細胞は引きつづく数年間に破壊され
る。
【０００３】インシュリン治療によって大半のＩＤＤＭ
患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不
完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すもの
ではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官
の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を
受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細
胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要とな
る時（即ち、β−細胞の８０％が破壊されたとき）との
間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与
によって）が極めて望ましい。従って、β−細胞破壊の
開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を
伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（Silver
stein et al., New England Journal of Medicine, 31
9:599-604, 1988）、それによってインシュリン補充に
よる副作用の開始を遅らせることができる。
患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不
完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すもの
ではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官
の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を
受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細
胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要とな
る時（即ち、β−細胞の８０％が破壊されたとき）との
間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与
によって）が極めて望ましい。従って、β−細胞破壊の
開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を
伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（Silver
stein et al., New England Journal of Medicine, 31
9:599-604, 1988）、それによってインシュリン補充に
よる副作用の開始を遅らせることができる。
【０００４】ＩＤＤＭ患者の多くは、６４ｋＤ分子（Ba
ekkeskov et al., J. Clin. Invest. 79:926-934, 198
7; Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 199
0）、島細胞細胞質（ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（Ｉ
ＣＳＡ）分子（Bottazzo et al., Lancet, 1:668-672,
1980）、或いはインシュリン（Palmer et al., Scienc
e, 222:1137-1139, 1983; Atkinson et al., Diabetes,
35:894-898, 1986）に対する抗体を含む血清を有して
いる。Ａｔｋｉｎｓｏｎとその共同研究者ら（Atkinson
et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）は、ヒト血清
中における６４ｋＤ分子に対する抗体の存在が、ＩＤＤ
Ｍ症状が実際に起きる始まりについての、最も初期でか
つ最も信頼できる指標であることを示した。
ekkeskov et al., J. Clin. Invest. 79:926-934, 198
7; Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 199
0）、島細胞細胞質（ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（Ｉ
ＣＳＡ）分子（Bottazzo et al., Lancet, 1:668-672,
1980）、或いはインシュリン（Palmer et al., Scienc
e, 222:1137-1139, 1983; Atkinson et al., Diabetes,
35:894-898, 1986）に対する抗体を含む血清を有して
いる。Ａｔｋｉｎｓｏｎとその共同研究者ら（Atkinson
et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）は、ヒト血清
中における６４ｋＤ分子に対する抗体の存在が、ＩＤＤ
Ｍ症状が実際に起きる始まりについての、最も初期でか
つ最も信頼できる指標であることを示した。
【０００５】
【発明が解決するための課題】最近になって、Ｂａｅｋ
ｋｅｓｋｏｖとその共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つか
の共通の抗原エピトープを有しており、従ってこれらは
同じものであるか、或いは非常によく似た分子である、
ということを確立した。この同定は重要な発見ではある
が、ＧＡＤの分子生物学に関する知識が未知である限り
は、この情報をＩＤＤＭ予知の診断法として用いること
は極めて厄介であり、かつ限定されている。結果とし
て、大量の６４ｋＤ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に
実質的に同一なＧＡＤ分子をクローニングし、次いで量
産することができれば、ＩＤＤＭ予知のための診断キッ
トの開発が可能となろう。本発明は、かかる結果を達成
するための手段を提供する。
ｋｅｓｋｏｖとその共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つか
の共通の抗原エピトープを有しており、従ってこれらは
同じものであるか、或いは非常によく似た分子である、
ということを確立した。この同定は重要な発見ではある
が、ＧＡＤの分子生物学に関する知識が未知である限り
は、この情報をＩＤＤＭ予知の診断法として用いること
は極めて厄介であり、かつ限定されている。結果とし
て、大量の６４ｋＤ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に
実質的に同一なＧＡＤ分子をクローニングし、次いで量
産することができれば、ＩＤＤＭ予知のための診断キッ
トの開発が可能となろう。本発明は、かかる結果を達成
するための手段を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、組換えＤＮＡ
手法を用いて真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの生産が可
能であり、かつＧＡＤ６５ポリペプチドを自己免疫疾患
の患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいて
なされた。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ６５ポ
リペプチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤ
Ｍ）を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診
断に用いることに関する。
手法を用いて真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの生産が可
能であり、かつＧＡＤ６５ポリペプチドを自己免疫疾患
の患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいて
なされた。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ６５ポ
リペプチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤ
Ｍ）を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診
断に用いることに関する。
【０００７】本発明の主な利点は、天然の真核性ＧＡＤ
６５ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ６５ポリ
ペプチドから分離する際に、その単離に関して生じる問
題を回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真
核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの容易な生産源を当業界に
提供することである。その他の真核性非−ＧＡＤ６５ポ
リペプチドが存在しないことは、ＧＡＤ６５ポリペプチ
ドと特異的に反応する抗体のみを検出する試験システム
の開発が可能となるので、重要である。
６５ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ６５ポリ
ペプチドから分離する際に、その単離に関して生じる問
題を回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真
核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの容易な生産源を当業界に
提供することである。その他の真核性非−ＧＡＤ６５ポ
リペプチドが存在しないことは、ＧＡＤ６５ポリペプチ
ドと特異的に反応する抗体のみを検出する試験システム
の開発が可能となるので、重要である。
【０００８】宿主細胞中にある真核性ＧＡＤ６５ポリペ
プチドを提供する他の利点は、そうすることによって天
然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量
のポリペプチドを得ることが可能となることである。そ
の結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのよう
な自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類すること
が可能となるばかりでなく、診断システムに使用するた
めの商業的に使用可能な量のＧＡＤ６５ポリペプチドを
提供することも可能となる。
プチドを提供する他の利点は、そうすることによって天
然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量
のポリペプチドを得ることが可能となることである。そ
の結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのよう
な自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類すること
が可能となるばかりでなく、診断システムに使用するた
めの商業的に使用可能な量のＧＡＤ６５ポリペプチドを
提供することも可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に対する自己抗体と結合
するための、１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定
基）の１次構造コンホメーションの一部又は全てを有す
るポリペプチドの生産を可能にする組換え手法によっ
て、遺伝的物質を操作することに関する。これらのポリ
ペプチドは、これと反応する自己抗体を免疫学的に検出
するのに極めて有用である。なぜなら、このような自己
抗体は、インシュリン依存性真性糖尿病や“スティッフ
マン（ｓｔｉｆｆ ｍａｎ）”症候群のような自己免疫
疾患の指標となるからである。これらのポリペプチド
は、ＧＡＤ機能を変えるようなスクリーニング医薬とし
て、また、ＧＡＤ６５を診断的に検出するために用いる
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造用として
も使用できる。
キシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に対する自己抗体と結合
するための、１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定
基）の１次構造コンホメーションの一部又は全てを有す
るポリペプチドの生産を可能にする組換え手法によっ
て、遺伝的物質を操作することに関する。これらのポリ
ペプチドは、これと反応する自己抗体を免疫学的に検出
するのに極めて有用である。なぜなら、このような自己
抗体は、インシュリン依存性真性糖尿病や“スティッフ
マン（ｓｔｉｆｆ ｍａｎ）”症候群のような自己免疫
疾患の指標となるからである。これらのポリペプチド
は、ＧＡＤ機能を変えるようなスクリーニング医薬とし
て、また、ＧＡＤ６５を診断的に検出するために用いる
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造用として
も使用できる。
【００１０】ＤＮＡベクター中にスプライシングするた
めの真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードする特異的
ＤＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例
えば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ
配列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとっ
て必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に
製造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離した
ｍＲＮＡの逆転写によってｉｎ ｖｉｖｏで二本鎖ＤＮ
Ａ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用
いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと
一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形
成される。
めの真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードする特異的
ＤＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例
えば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ
配列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとっ
て必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に
製造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離した
ｍＲＮＡの逆転写によってｉｎ ｖｉｖｏで二本鎖ＤＮ
Ａ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用
いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと
一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形
成される。
【００１１】所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の
全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしば
しば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸
残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接
製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成
である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準
的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細
胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラス
ミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがあ
る。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、ま
れな発現産物でもクローニングすることができる。ポリ
メラーゼのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合に
は、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配
列と二重になるような、ラベルした一本鎖又は二本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一
本鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上
で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用い
ることができる（Jay et al., Nucleic Acid Research,
11:2325, 1983）。
全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしば
しば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸
残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接
製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成
である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準
的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細
胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラス
ミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがあ
る。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、ま
れな発現産物でもクローニングすることができる。ポリ
メラーゼのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合に
は、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配
列と二重になるような、ラベルした一本鎖又は二本鎖Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一
本鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上
で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用い
ることができる（Jay et al., Nucleic Acid Research,
11:2325, 1983）。
【００１２】ラベルした混合合成オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いることによって（ここで各プローブは、変
性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼー
ションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な
相補体である可能性がある）、ハイブリタイゼーション
法は組換え体クローンをスクリーニングするのに有用で
ある。このようなスクリーニングのためには、ハイブリ
ダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二本
鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このよう
な方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮＡ
配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来するｃ
ＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言い
換えると、非特異的な結合を避けるためのストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件を用いることによっ
て、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体であ
る、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオート
ラジオグラフで可視化することができるようになる（Wa
llace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 198
1）。
ローブを用いることによって（ここで各プローブは、変
性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼー
ションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な
相補体である可能性がある）、ハイブリタイゼーション
法は組換え体クローンをスクリーニングするのに有用で
ある。このようなスクリーニングのためには、ハイブリ
ダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二本
鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このよう
な方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮＡ
配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来するｃ
ＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言い
換えると、非特異的な結合を避けるためのストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件を用いることによっ
て、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体であ
る、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオート
ラジオグラフで可視化することができるようになる（Wa
llace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 198
1）。
【００１３】更に、各種ｃＤＮＡをオーサイト（ｏｏｃ
ｙｔｅｓ）に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起
きるのに十分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現
産物の存在を、例えばＧＡＤ６５ポリペプチドに特異的
な抗体を用いるか、或いはＧＡＤ６５酵素活性の機能ア
ッセイを用いることによって試験することにより、ＧＡ
Ｄ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが
できる。
ｙｔｅｓ）に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起
きるのに十分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現
産物の存在を、例えばＧＡＤ６５ポリペプチドに特異的
な抗体を用いるか、或いはＧＡＤ６５酵素活性の機能ア
ッセイを用いることによって試験することにより、ＧＡ
Ｄ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが
できる。
【００１４】若しくは、ＧＡＤ６５に対する抗体を用い
て、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ６５ペ
プチドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスク
リーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.
Neurosci., 8:2123, 1988）。このような抗体は、ポリ
クローナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ６ ５
ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用する
ことができる。ＧＡＤ ６５のＮ−末端部分の最初の１０
０アミノ酸にみられるエピトープに対する抗体が好まし
い。
て、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ６５ペ
プチドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスク
リーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.
Neurosci., 8:2123, 1988）。このような抗体は、ポリ
クローナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ６ ５
ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用する
ことができる。ＧＡＤ ６５のＮ−末端部分の最初の１０
０アミノ酸にみられるエピトープに対する抗体が好まし
い。
【００１５】遺伝子組換えにおいて使用できる、特定の
ＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、ゲ
ノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。これ
は、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいとい
う場合には、イントロンの存在のために、特にそうであ
る。
ＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、ゲ
ノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。これ
は、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいとい
う場合には、イントロンの存在のために、特にそうであ
る。
【００１６】本発明は、ＧＡＤ６５に対する抗体への少
なくとも１個のスピトープを有する１次構造コンホメー
ション、即ち、アミノ酸残基の連続的配列の一部又は全
てを有する、ＧＡＤ６５の新規ポリペプチドを提供す
る。
なくとも１個のスピトープを有する１次構造コンホメー
ション、即ち、アミノ酸残基の連続的配列の一部又は全
てを有する、ＧＡＤ６５の新規ポリペプチドを提供す
る。
【００１７】ＧＡＤ６５に対する自己抗体を検出するた
めには、完全なＧＡＤ６５よりもむしろ本発明のポリペ
プチド断片を用いることができる。ＧＡＤ６５ポリペプ
チドに用いる場合の“ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ
６５に対する自己抗体へのエピトープを有するいかなる
アミノ酸配列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本
発明のｃＤＮＡ配列の一部又は全てによってコードされ
る。
めには、完全なＧＡＤ６５よりもむしろ本発明のポリペ
プチド断片を用いることができる。ＧＡＤ６５ポリペプ
チドに用いる場合の“ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ
６５に対する自己抗体へのエピトープを有するいかなる
アミノ酸配列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本
発明のｃＤＮＡ配列の一部又は全てによってコードされ
る。
【００１８】本発明のＤＮＡ配列の微生物発現から得ら
れるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは
天然の細胞環境中で、又は血漿（Ｐｌａｓｍａ）や尿の
ような細胞外液体中で、ＧＡＤ６５と関連している他の
汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
れるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは
天然の細胞環境中で、又は血漿（Ｐｌａｓｍａ）や尿の
ような細胞外液体中で、ＧＡＤ６５と関連している他の
汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
【００１９】本発明者による研究により、ＧＡＤ６５が
ＧＡＤ６７とは別々の遺伝子でコードされ、例えば、共
通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾されるこ
とによって生産されるのではないことが明白に確立され
た。ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７とが別々の遺伝子によって
コードされることを示す証拠には以下のものが含まれ
る：（ａ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの間の正
確に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７
ヌクレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ６５及びＧＡ
Ｄ６７からのｃＤＮＡは、低ストリンジェントな条件下
で（２．０×ＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３℃）お互
いにクロスハイブリダイゼーションしないし、またお互
いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーションしな
い、そして（ｃ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡ
は、それぞれＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５をコードする単
離したゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーショ
ンしない。
ＧＡＤ６７とは別々の遺伝子でコードされ、例えば、共
通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾されるこ
とによって生産されるのではないことが明白に確立され
た。ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７とが別々の遺伝子によって
コードされることを示す証拠には以下のものが含まれ
る：（ａ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの間の正
確に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７
ヌクレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ６５及びＧＡ
Ｄ６７からのｃＤＮＡは、低ストリンジェントな条件下
で（２．０×ＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３℃）お互
いにクロスハイブリダイゼーションしないし、またお互
いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーションしな
い、そして（ｃ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡ
は、それぞれＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５をコードする単
離したゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーショ
ンしない。
【００２０】“宿主”の語は、原核生物のみでなく、酵
母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞
のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ６５のイント
ロンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるもの
を意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物
が好ましい。
母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞
のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ６５のイント
ロンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるもの
を意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物
が好ましい。
【００２１】“原核生物”の語は、ＧＡＤ６５の発現の
ための遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされ
る全てのバクテリアを含む。原形生物宿主は、グラム陰
性菌や、例えばＥ．ｃｏｌｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌
を含む。
ための遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされ
る全てのバクテリアを含む。原形生物宿主は、グラム陰
性菌や、例えばＥ．ｃｏｌｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌
を含む。
【００２２】ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードする組換
えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、
宿主を形質転換又はトランスフェクションすることがで
きる。特に好ましいのは、ＧＡＤ６５コーディング配列
を含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原形生物の
形質転換又はトランスフェクションのために用いること
である。
えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、
宿主を形質転換又はトランスフェクションすることがで
きる。特に好ましいのは、ＧＡＤ６５コーディング配列
を含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原形生物の
形質転換又はトランスフェクションのために用いること
である。
【００２３】融合し、作動するように連結した遺伝子を
調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方法は
当業者に公知である（Maniatis et. al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labo
ratory, Cold Spring Habor,NY, 1989）。ここで記載す
る遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中でのＧＡＤ
６５の発現に用いることができる。
調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方法は
当業者に公知である（Maniatis et. al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labo
ratory, Cold Spring Habor,NY, 1989）。ここで記載す
る遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中でのＧＡＤ
６５の発現に用いることができる。
【００２４】一般に、挿入された真核生物性遺伝子配列
の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発
現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクター
は典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネー
ター、並びに形質転換細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐ
ｉｃ）選択を与えることのできる特定遺伝子を含む。形
質転換された原核生物宿主は、発酵槽中で成長させて、
当業者に公知の方法によって最適成長条件で培養するこ
とができる。次いで本発明のポリペプチドを成育培地、
細胞分解物、又は細胞膜分画から単離することができ
る。
の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発
現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクター
は典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネー
ター、並びに形質転換細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐ
ｉｃ）選択を与えることのできる特定遺伝子を含む。形
質転換された原核生物宿主は、発酵槽中で成長させて、
当業者に公知の方法によって最適成長条件で培養するこ
とができる。次いで本発明のポリペプチドを成育培地、
細胞分解物、又は細胞膜分画から単離することができ
る。
【００２５】微生物で発現された本発明のポリペプチド
の単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグ
ラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の
使用を含む免疫学的分離のようないかなる慣用的方法に
よってもよい。
の単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグ
ラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の
使用を含む免疫学的分離のようないかなる慣用的方法に
よってもよい。
【００２６】ＧＡＤ６５のアミノ酸残基の配列を提供し
たことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ酸
残基の種類又は位置において天然型と異なっており、か
つ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトープ
を共有する、ＧＡＤ６５のポリペプチド類似体又は誘導
体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供す
る。
たことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ酸
残基の種類又は位置において天然型と異なっており、か
つ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトープ
を共有する、ＧＡＤ６５のポリペプチド類似体又は誘導
体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供す
る。
【００２７】本発明の新規なＤＮＡ配列は、ＧＡＤ６５
に対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以
上のエピトープのための１次構造コンホメーションの少
なくとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真
核生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を
含み、該ＧＡＤ６５は以下のものと理解される：（ａ）
図２−図４又は図５−図８に示されるＤＮＡ配列、又は
その相補的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又は
この断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）
遺伝暗号の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義した
ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に
（ｂ）で定義したものは、ＧＡＤ６５の対立遺伝子変異
型をコードするゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）
では特に、そのＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍ
ＲＮＡの翻訳を容易にするコドンを導入するような、Ｇ
ＡＤ６５、ＧＡＤ６５断片、及びＧＡＤ６５類似体をコ
ードするＤＮＡ配列を製造するものと理解される。
に対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以
上のエピトープのための１次構造コンホメーションの少
なくとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真
核生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を
含み、該ＧＡＤ６５は以下のものと理解される：（ａ）
図２−図４又は図５−図８に示されるＤＮＡ配列、又は
その相補的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又は
この断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）
遺伝暗号の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義した
ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に
（ｂ）で定義したものは、ＧＡＤ６５の対立遺伝子変異
型をコードするゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）
では特に、そのＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍ
ＲＮＡの翻訳を容易にするコドンを導入するような、Ｇ
ＡＤ６５、ＧＡＤ６５断片、及びＧＡＤ６５類似体をコ
ードするＤＮＡ配列を製造するものと理解される。
【００２８】本発明のｃＤＮＡ配列は本質的にヒト又は
ラットＧＡＤ６５分子をコードするものであるので、こ
れからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又はヒト又
はラットＧＡＤ６５に対する自己抗体のための少なくと
も１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ配列
を調製し、サブクローニングし、そして発現させること
は今や日常的なことである。次いでクローン化ポリペプ
チド上にこのようなエピトープが存在することを、例え
ばＧＡＤ６５に対する自己抗体を有する患者からの血清
を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例と
しては、ＧＡＤ ６５のＮ−末端からの最初の約１００ア
ミノ酸がある（図１１に示す）。このアミノ酸配列には
本質的にＧＡＤ６７が欠けている。
ラットＧＡＤ６５分子をコードするものであるので、こ
れからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又はヒト又
はラットＧＡＤ６５に対する自己抗体のための少なくと
も１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ配列
を調製し、サブクローニングし、そして発現させること
は今や日常的なことである。次いでクローン化ポリペプ
チド上にこのようなエピトープが存在することを、例え
ばＧＡＤ６５に対する自己抗体を有する患者からの血清
を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例と
しては、ＧＡＤ ６５のＮ−末端からの最初の約１００ア
ミノ酸がある（図１１に示す）。このアミノ酸配列には
本質的にＧＡＤ６７が欠けている。
【００２９】本発明のＧＡＤ６５はイムノアッセイに用
いるのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して
使用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ
６５は各種の方法で検出できるように標識することがで
きる。
いるのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して
使用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ
６５は各種の方法で検出できるように標識することがで
きる。
【００３０】本発明のＧＡＤ６５を用いるイムノアッセ
イの例としては、直接又は間接法における、競合的又は
比競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッ
セイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
サンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットア
ッセイがある。本発明のＧＡＤ６５と結合する抗体の検
出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを
含む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイ
ムノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧ
ＡＤ６５の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用す
る検出可能な標識の性質に依って変化する。しかしなが
ら、どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせ
よ、使用するＧＡＤ６５の濃度は定法を用いて、当業者
には容易に決定できる。
イの例としては、直接又は間接法における、競合的又は
比競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッ
セイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
サンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットア
ッセイがある。本発明のＧＡＤ６５と結合する抗体の検
出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを
含む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイ
ムノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧ
ＡＤ６５の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用す
る検出可能な標識の性質に依って変化する。しかしなが
ら、どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせ
よ、使用するＧＡＤ６５の濃度は定法を用いて、当業者
には容易に決定できる。
【００３１】本発明のＧＡＤ６５は多くの種類の担体と
結合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体
の存在を検出することができる。よく知られた担体の例
としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキ
ストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロ
ース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタ
イトがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶
性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ
６５と結合するためのその他の適当な担体を知ることが
できるし、また定法によってこれを確認することができ
る。
結合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体
の存在を検出することができる。よく知られた担体の例
としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキ
ストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロ
ース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタ
イトがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶
性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ
６５と結合するためのその他の適当な担体を知ることが
できるし、また定法によってこれを確認することができ
る。
【００３２】多くの異なる標識及び標識法が当業者には
公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例とし
ては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合
物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例とし
ては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合
物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
【００３３】更に、本発明のポリペプチドはＧＡＤ酵素
活性を測定することによって、ＧＡＤ６５に対する抗体
を検出することができる。例えば、ＧＡＤ６５と、ＧＡ
Ｄ６ ５に対する抗体を有している疑いのある標本とを、
一定期間、ＧＡＤ６５と抗体との間に結合を起こさせる
に十分な条件下にインキュベーションする。反応生成物
を沈殿化して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
活性を測定することによって、ＧＡＤ６５に対する抗体
を検出することができる。例えば、ＧＡＤ６５と、ＧＡ
Ｄ６ ５に対する抗体を有している疑いのある標本とを、
一定期間、ＧＡＤ６５と抗体との間に結合を起こさせる
に十分な条件下にインキュベーションする。反応生成物
を沈殿化して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
【００３４】本発明の目的のためには、本発明のＧＡＤ
６５と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に
存在する。検出可能な量のＧＡＤ６５に対する抗体を含
むいかなるサンプルも用いることができる。普通、サン
プルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体であ
るか、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
６５と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に
存在する。検出可能な量のＧＡＤ６５に対する抗体を含
むいかなるサンプルも用いることができる。普通、サン
プルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体であ
るか、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
【００３５】本発明のアッセイに用いる物質は、そのま
まキットの製造にも適している。このようなキットは、
バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を
密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容
器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの
１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結
合したＧＡＤ６５を含む。第２の容器は可溶性の検出可
能な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
まキットの製造にも適している。このようなキットは、
バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を
密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容
器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの
１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結
合したＧＡＤ６５を含む。第２の容器は可溶性の検出可
能な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
【００３６】更に、担体手段はまた複数の容器を含み、
各容器は異なる、あらかじめ定められた量のＧＡＤ６５
を含む。次いでこの後者の容器を用いて標準曲線を描
き、これに未知の量のＧＡＤ６５に対する自己抗体を含
むサンプルから得られた結果を挿入する。
各容器は異なる、あらかじめ定められた量のＧＡＤ６５
を含む。次いでこの後者の容器を用いて標準曲線を描
き、これに未知の量のＧＡＤ６５に対する自己抗体を含
むサンプルから得られた結果を挿入する。
【００３７】キットを使用するに当たって使用者がしな
ければならないことは、測定可能であるが、未知の量の
検出されるべきＧＡＤ６５に対する自己抗体を含む、あ
らかじめ測定した量の検出用サンプルと、第１の容器中
に存在するあらかじめ測定した量の担体結合したＧＡＤ
６５と、第２の容器中に存在するあらかじめ測定した量
の検出可能な標識化第２抗体とを容器に加えることであ
る。若しくは、検出不能な標識化ＧＡＤ６５を容器に付
けて提供し、これにサンプルと、検出可能な標識化第２
抗体とを加えることもできる。適当な時間インキュベー
ションした後、免疫複合体が形成され、これを上澄み液
から分離し、免疫複合体又は上澄み液を、放射能カウン
トするか、又は酵素基質を加えて発色させるなどによっ
て検出する。
ければならないことは、測定可能であるが、未知の量の
検出されるべきＧＡＤ６５に対する自己抗体を含む、あ
らかじめ測定した量の検出用サンプルと、第１の容器中
に存在するあらかじめ測定した量の担体結合したＧＡＤ
６５と、第２の容器中に存在するあらかじめ測定した量
の検出可能な標識化第２抗体とを容器に加えることであ
る。若しくは、検出不能な標識化ＧＡＤ６５を容器に付
けて提供し、これにサンプルと、検出可能な標識化第２
抗体とを加えることもできる。適当な時間インキュベー
ションした後、免疫複合体が形成され、これを上澄み液
から分離し、免疫複合体又は上澄み液を、放射能カウン
トするか、又は酵素基質を加えて発色させるなどによっ
て検出する。
【００３８】“改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）”の
語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害
な効果を減少することを意味する。“治療的に有効な”
の語は、使用するＧＡＤ６５ポリペプチドの量が自己免
疫応答による疾患誘発を改善するのに十分な量であるこ
とを意味する。
語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害
な効果を減少することを意味する。“治療的に有効な”
の語は、使用するＧＡＤ６５ポリペプチドの量が自己免
疫応答による疾患誘発を改善するのに十分な量であるこ
とを意味する。
【００３９】本発明の組換えＧＡＤ６５ポリペプチド
は、ＧＡＤ６５に対する自己免疫応答を有する患者の治
療に用いることもできる。このような治療は、例えば、
組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを投与することによって
実施できる。このような投与には非標識化又は標識化Ｇ
ＡＤ６５ポリペプチドを用いることができる。非標識化
ＧＡＤ６５ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、
例えば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免
疫応答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分
大きい断片の形でＧＡＤ６５ポリペプチドを投与する。
例えば、ＧＡＤ６ ５をエピトープーサイズのペプチド
（典型的には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化
して、自己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細
胞の表面上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
は、ＧＡＤ６５に対する自己免疫応答を有する患者の治
療に用いることもできる。このような治療は、例えば、
組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを投与することによって
実施できる。このような投与には非標識化又は標識化Ｇ
ＡＤ６５ポリペプチドを用いることができる。非標識化
ＧＡＤ６５ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、
例えば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免
疫応答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分
大きい断片の形でＧＡＤ６５ポリペプチドを投与する。
例えば、ＧＡＤ６ ５をエピトープーサイズのペプチド
（典型的には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化
して、自己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細
胞の表面上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
【００４０】或いは、本発明の組換えＧＡＤ６５ポリペ
プチドは、治療剤で標識して投与することができる。こ
れらの治療剤は本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと直接
又は間接にカップリングさせることができる。間接的カ
ップリングの一例はスペーサー部分を用いることであ
る。このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であること
ができ（Diener et al., Science, 231:148, 1986）、
ターゲット部分でＧＡＤ ６５ポリペプチドから医薬の放
出をできるように選択される。免疫治療用に本発明のＧ
ＡＤ６５ポリペプチドとカップリングすることができる
治療剤の例としては、医薬、放射性同位体、レクチン、
及び毒素がある。
プチドは、治療剤で標識して投与することができる。こ
れらの治療剤は本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと直接
又は間接にカップリングさせることができる。間接的カ
ップリングの一例はスペーサー部分を用いることであ
る。このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であること
ができ（Diener et al., Science, 231:148, 1986）、
ターゲット部分でＧＡＤ ６５ポリペプチドから医薬の放
出をできるように選択される。免疫治療用に本発明のＧ
ＡＤ６５ポリペプチドとカップリングすることができる
治療剤の例としては、医薬、放射性同位体、レクチン、
及び毒素がある。
【００４１】本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと結合す
ることができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノル
ビシン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼
ばれていたものを含む。
ることができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノル
ビシン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼
ばれていたものを含む。
【００４２】免疫治療用に放射性同位体と結合した本発
明のＧＡＤ６５ポリペプチドを使用する際には、白血球
の分布、安定性及び放射のような要因に依って、一定の
同位体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免
疫応答に依って、一定の放射体が他のものよりも好まし
いことがある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射
性の放射性同位体が好ましい。２１２Ｂｉのような近距
離、高エネルギーのα放射体が好ましい。治療の目的の
ために本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと結合すること
ができる放射性同位体の例としては、１２５Ｉ，１３１
Ｉ，９０Ｙ，６ ７Ｃｕ，２１２Ｂｉ，２１１Ａｔ，
２１２Ｐｂ，４７Ｓｃ，１０９Ｐｄ及び１８ ８Ｒｅがあ
る。
明のＧＡＤ６５ポリペプチドを使用する際には、白血球
の分布、安定性及び放射のような要因に依って、一定の
同位体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免
疫応答に依って、一定の放射体が他のものよりも好まし
いことがある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射
性の放射性同位体が好ましい。２１２Ｂｉのような近距
離、高エネルギーのα放射体が好ましい。治療の目的の
ために本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと結合すること
ができる放射性同位体の例としては、１２５Ｉ，１３１
Ｉ，９０Ｙ，６ ７Ｃｕ，２１２Ｂｉ，２１１Ａｔ，
２１２Ｐｂ，４７Ｓｃ，１０９Ｐｄ及び１８ ８Ｒｅがあ
る。
【００４３】レクチンは通常植物から単離されるタンパ
ク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチ
ンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができ
る。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いら
れてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であ
るリシンのα−ペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、
毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
ク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチ
ンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができ
る。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いら
れてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であ
るリシンのα−ペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、
毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
【００４４】毒素は植物、動物、又は微生物によって産
出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死
に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって
産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニッ
トからなっており、一定条件下に分離できる。
出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死
に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって
産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニッ
トからなっており、一定条件下に分離できる。
【００４５】毒素Ａ部分は、ＧＡＤ６５ポリペプチドと
結合させて、ＧＡＤ６５ポリペプチドに対するリセプタ
ーを発現する白血球への部分特異的な配給に用いられ
る。
結合させて、ＧＡＤ６５ポリペプチドに対するリセプタ
ーを発現する白血球への部分特異的な配給に用いられ
る。
【００４６】本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドとカップ
リングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ ｖｉ
ｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又
は当業者によって容易に確認できる。
リングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ ｖｉ
ｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又
は当業者によって容易に確認できる。
【００４７】本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドの投与量
は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるよう
な所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、
好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏
症）などの副作用を引き起こす程大きいものであっては
ならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患
者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定
される。万一何か好ましくない症状があった場合には、
投与量は個々の医師によって調節される。投与量は、一
回の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ２から約２０００ｍ
ｇ／ｍ２まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２から約５
００ｍｇ／ｍ２までで、１日に１回又は数回、１日又は
数日間投与する。
は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるよう
な所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、
好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏
症）などの副作用を引き起こす程大きいものであっては
ならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患
者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定
される。万一何か好ましくない症状があった場合には、
投与量は個々の医師によって調節される。投与量は、一
回の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ２から約２０００ｍ
ｇ／ｍ２まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２から約５
００ｍｇ／ｍ２までで、１日に１回又は数回、１日又は
数日間投与する。
【００４８】本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドは、注射
又は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与され
る。本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドは、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
又は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与され
る。本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドは、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
【００４９】非経口的投与のための製剤は、滅菌水性、
又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非
水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエ
チルオレエートのような注射可能な有機エステルがあ
る。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコ
ール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非
経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキス
トロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化
リンガー液、又は不揮発性油を含む。
又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非
水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエ
チルオレエートのような注射可能な有機エステルがあ
る。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコ
ール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非
経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキス
トロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化
リンガー液、又は不揮発性油を含む。
【００５０】静脈内担体は、液体及び栄養補充物、電解
補充物（リンガーのデキストロースに基づくようなも
の）などを含む。保存料、及びその他の添加物、例えば
抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスな
ども存在する。
補充物（リンガーのデキストロースに基づくようなも
の）などを含む。保存料、及びその他の添加物、例えば
抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスな
ども存在する。
【００５１】本発明はまた、本発明のＧＡＤ６５ポリペ
プチドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、
該医薬はＧＡＤ６５に対する自己免疫応答の治療に使用
する。
プチドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、
該医薬はＧＡＤ６５に対する自己免疫応答の治療に使用
する。
【００５２】上記の記載は本発明を一般的に述べたもの
である。以下の特定の実施例を参照することによって、
より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説
明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。
である。以下の特定の実施例を参照することによって、
より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説
明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。
【００５３】
【実施例】実施例１：ＧＡＤ６５のクローニング及び発
現 Ａ．組換えＤＮＡ手法 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なｃＤＮＡプローブ
を得るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:52
94, 1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニ
ジンイソチオシアネート−セシウムグラジエントによっ
て、全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）による
実験書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロ
ース上で精製した。ポリｄ（Ｎ６）−ｍｅｒｓ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）プライマーとして用いた以外は、指示さ
れた条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を
用いて一本鎖合成を行った。このｃＤＮＡ−ＲＮＡ混合
物を６５℃で１５分間加熱して不活性化して、−２０℃
に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サンプルの１／５０を
反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃＤＮＡから）（Ko
bayashi et al., J.Neurosci., 7:2768, 1987）及びラ
ット（ペプチドから）（Chang and Gottlieb, J. Neuro
sci. 8:2123, 1988）ＧＡＤ（図１）の下線を施した共
通のアミノ酸配列をコードするために変性（ｄｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合成した（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各変性オリゴヌクレ
オチドの５′末端配列は、ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
（５′末端オリゴ）又はＳｓｔＩ及びＳｓｔＩＩ（３′
末端オリゴ）のいずれかによって認識されるＤＮＡ配列
の１本鎖を含む。これらのプライマーを用いて、Gould
et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:1934, 1989
に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型のポリメラー
ゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣＲ産物をＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＳｓｔＩで二重消化されたＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサ
ブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ）に形質転換して、
標準法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual, Cold Spring HaborLaboratory, Cold S
pring Habor, NY, 1989）によってプレートした。
現 Ａ．組換えＤＮＡ手法 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なｃＤＮＡプローブ
を得るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:52
94, 1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニ
ジンイソチオシアネート−セシウムグラジエントによっ
て、全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）による
実験書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロ
ース上で精製した。ポリｄ（Ｎ６）−ｍｅｒｓ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）プライマーとして用いた以外は、指示さ
れた条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を
用いて一本鎖合成を行った。このｃＤＮＡ−ＲＮＡ混合
物を６５℃で１５分間加熱して不活性化して、−２０℃
に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サンプルの１／５０を
反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃＤＮＡから）（Ko
bayashi et al., J.Neurosci., 7:2768, 1987）及びラ
ット（ペプチドから）（Chang and Gottlieb, J. Neuro
sci. 8:2123, 1988）ＧＡＤ（図１）の下線を施した共
通のアミノ酸配列をコードするために変性（ｄｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合成した（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各変性オリゴヌクレ
オチドの５′末端配列は、ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
（５′末端オリゴ）又はＳｓｔＩ及びＳｓｔＩＩ（３′
末端オリゴ）のいずれかによって認識されるＤＮＡ配列
の１本鎖を含む。これらのプライマーを用いて、Gould
et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:1934, 1989
に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型のポリメラー
ゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣＲ産物をＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＳｓｔＩで二重消化されたＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサ
ブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ）に形質転換して、
標準法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual, Cold Spring HaborLaboratory, Cold S
pring Habor, NY, 1989）によってプレートした。
【００５４】ネコＧＡＤ６７に特異的な５′−３２Ｐ末
端標識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼ
ーションを行った（Kobayashi et al., J. Neurosci.,
7:2768, 1987）。ニトロセルロースフィルターを５０℃
で１５分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in
Guide to Molecular Cloning Techniques; Berger et
al., Eds. in Methods of Enzymology; Abelson et a
l., Eds. Academic Press, Inc. San Diego, 432-442,
1987）記載のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標
識、ハイブリダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施
した。ハイブリダイゼーションで陽性及び陰性であった
コロニーを個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培
地中で一夜成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12,
1987）。煮沸法（Maniatis et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）を用いてＤＮＡを
単離し、０．２Ｎ ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙ１ Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）で精製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、
Ｔ７−シークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用
いて、鎖−末端法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74:5463, 1977）によって行った。
端標識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼ
ーションを行った（Kobayashi et al., J. Neurosci.,
7:2768, 1987）。ニトロセルロースフィルターを５０℃
で１５分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in
Guide to Molecular Cloning Techniques; Berger et
al., Eds. in Methods of Enzymology; Abelson et a
l., Eds. Academic Press, Inc. San Diego, 432-442,
1987）記載のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標
識、ハイブリダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施
した。ハイブリダイゼーションで陽性及び陰性であった
コロニーを個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培
地中で一夜成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12,
1987）。煮沸法（Maniatis et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）を用いてＤＮＡを
単離し、０．２Ｎ ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙ１ Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）で精製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、
Ｔ７−シークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用
いて、鎖−末端法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74:5463, 1977）によって行った。
【００５５】図１に示すように、ＰＣＲで生じたラット
ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡをプローブとして用
いて、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）によって、Ｓ．Ｈ
ｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）か
ら供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ラ
ット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２４００
ヌクレオチドのＧＡＤ６５ｃＤＮＡ（最大クローン）を
単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するように“ザ
ッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクローニン
グした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧＡＤ
６７ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ６７ｃ
ＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行っ
た。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７について両方の方向にＥ
ｘｏ ＩＩＩ削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984）を
行って、鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行
った。ライブラリースクリーニングにおいて単離された
元のｃＤＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７ｍＲＮＡの残りの５′末端をクロー
ニングするために、アンカーＰＣＲを行った（Frohman
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998,198
8）。これらのクローンの配列決定を行ったところ、Ｇ
ＡＤ６５又はＧＡＤ ６７ｍＲＮＡのいずれも、フレーム
中に元のｃＤＮＡクローンの開始コドンであると以前に
同定されたものと共に、更に別の開始コドン（ＡＵＧ）
をなんら含んでいないことが明らかとなった。
ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡをプローブとして用
いて、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）によって、Ｓ．Ｈ
ｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）か
ら供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ラ
ット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２４００
ヌクレオチドのＧＡＤ６５ｃＤＮＡ（最大クローン）を
単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するように“ザ
ッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクローニン
グした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧＡＤ
６７ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ６７ｃ
ＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行っ
た。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７について両方の方向にＥ
ｘｏ ＩＩＩ削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984）を
行って、鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行
った。ライブラリースクリーニングにおいて単離された
元のｃＤＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７ｍＲＮＡの残りの５′末端をクロー
ニングするために、アンカーＰＣＲを行った（Frohman
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998,198
8）。これらのクローンの配列決定を行ったところ、Ｇ
ＡＤ６５又はＧＡＤ ６７ｍＲＮＡのいずれも、フレーム
中に元のｃＤＮＡクローンの開始コドンであると以前に
同定されたものと共に、更に別の開始コドン（ＡＵＧ）
をなんら含んでいないことが明らかとなった。
【００５６】実施例２：クローン化ＧＡＤ６５の特徴 Ａ．ノーザンブロットハイブリダイゼーション ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５ｃＤＮＡは２個の異なるｍＲ
ＮＡに由来するのかどうかを決定するために、２個のＰ
ＣＲ−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを
含むノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。
ＲＮＡは実施例１に記載したように抽出した。ホルムア
ルデヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離
し、Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００
μｍ／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al.,
J.Neurosci., 16:311, 1986に記載の方法によってハイ
ブリダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstei
n,Anal. Biochem., 132:6, 1983に記載のオリゴラベリ
ング法によって、プローブを約１０９ｄｐｍ／μｇまで
標識した。次いでＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの
全長クローンで同じ結果が得られた。
ＮＡに由来するのかどうかを決定するために、２個のＰ
ＣＲ−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを
含むノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。
ＲＮＡは実施例１に記載したように抽出した。ホルムア
ルデヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離
し、Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００
μｍ／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al.,
J.Neurosci., 16:311, 1986に記載の方法によってハイ
ブリダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstei
n,Anal. Biochem., 132:6, 1983に記載のオリゴラベリ
ング法によって、プローブを約１０９ｄｐｍ／μｇまで
標識した。次いでＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの
全長クローンで同じ結果が得られた。
【００５７】図１１に示すように、レーン１及び２は、
ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを
含む。レーン１はネコＧＡＤ６７（Kobayashi et al.,
J. Neurosci., 7:2768, 1987）のラット起源のｃＤＮＡ
プローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、
レーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ６５と対応す
る）のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ
たものである。
ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを
含む。レーン１はネコＧＡＤ６７（Kobayashi et al.,
J. Neurosci., 7:2768, 1987）のラット起源のｃＤＮＡ
プローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、
レーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ６５と対応す
る）のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ
たものである。
【００５８】ラットペプチド配列のｃＤＮＡプローブは
５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方
ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７
ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、
ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７が同じｍＲＮＡに由来するもの
ではないことを示している。
５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方
ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７
ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、
ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７が同じｍＲＮＡに由来するもの
ではないことを示している。
【００５９】Ｂ．ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５のゲノム性
ハイブリダイゼーション ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５が別々の遺伝子に由来する可
能性を調べるために、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方
のｃＤＮＡを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットと
ハイブリダイゼーションした。
ハイブリダイゼーション ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５が別々の遺伝子に由来する可
能性を調べるために、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方
のｃＤＮＡを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットと
ハイブリダイゼーションした。
【００６０】サザンブロットのために、ゲノム性ＤＮＡ
はKaiser et al., in DNA Cloning,vol.1, A Practical
Approach, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-4
0,1985 に記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製
造者（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指
示する条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）を
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．
８％アガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳
動を行ったＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液の代わりに５μｇ／ｍｌのＣａｒｎａｔｉｏ
ｎドライミルクを用いた以外は、Gatti et al., Biotec
hniques, 2:148, 1984の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔ
ａ−Ｐｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブ
リダイゼーションし、洗浄した。サザンブロットのため
のプローブは、上記実施例１に記載したように標識し
た。
はKaiser et al., in DNA Cloning,vol.1, A Practical
Approach, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-4
0,1985 に記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製
造者（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指
示する条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）を
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．
８％アガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳
動を行ったＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液の代わりに５μｇ／ｍｌのＣａｒｎａｔｉｏ
ｎドライミルクを用いた以外は、Gatti et al., Biotec
hniques, 2:148, 1984の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔ
ａ−Ｐｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブ
リダイゼーションし、洗浄した。サザンブロットのため
のプローブは、上記実施例１に記載したように標識し
た。
【００６１】図１２に示すように、ＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＥｃｏＲＩで消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレー
ン１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ６７ｃＤＮＡは
レーン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方Ｇ
ＡＤ６５ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼー
ションさせた。ゲル横にある数字はキロベースで表した
ＤＮＡ断片サイズである。
ＥｃｏＲＩで消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレー
ン１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ６７ｃＤＮＡは
レーン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方Ｇ
ＡＤ６５ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼー
ションさせた。ゲル横にある数字はキロベースで表した
ＤＮＡ断片サイズである。
【００６２】このデータは、２個のｃＤＮＡは、異なる
サイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示して
いる。更に、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７ｃＤＮＡとの同一
のヌクレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たっ
た１７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ
６７とＧＡＤ６５とは２個の異なる遺伝子によってコー
ドされている。
サイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示して
いる。更に、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７ｃＤＮＡとの同一
のヌクレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たっ
た１７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ
６７とＧＡＤ６５とは２個の異なる遺伝子によってコー
ドされている。
【００６３】Ｃ．ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の酵素的比
較 ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の活性におけるＰＬＰの効果
を比較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡ
をバクテリア中でその発現がてきるようなベクター中に
サブクローニングした（Studier et al., J. Mol. Bio
l., 189:113, 1986）。ＧＡＤ６５ｃＤＮＡをｐＥＴ−
８ｃベクターのＮｃｏＩ部位にサブクローニングし、か
つＧＡＤ６７ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅ
Ｉ部位にサブクローニングすることによって、“融合し
ない（ｆｕｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ６５及びＧＡＤ
６７の過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を実施
した（Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113, 198
6）。
較 ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の活性におけるＰＬＰの効果
を比較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡ
をバクテリア中でその発現がてきるようなベクター中に
サブクローニングした（Studier et al., J. Mol. Bio
l., 189:113, 1986）。ＧＡＤ６５ｃＤＮＡをｐＥＴ−
８ｃベクターのＮｃｏＩ部位にサブクローニングし、か
つＧＡＤ６７ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅ
Ｉ部位にサブクローニングすることによって、“融合し
ない（ｆｕｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ６５及びＧＡＤ
６７の過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を実施
した（Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113, 198
6）。
【００６４】両方のｃＤＮＡを正しいフレーム内でサブ
クローニングするための両立性の付着末端を得るため
に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中にお
ける２００μＭ ｄＮＴＰｓと１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡＱ
（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０サ
イクルでアニーリングした。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７
に特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏＩ及びＳｐｅ
Ｉ認識部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡＤ６７
のコーディング領域にはＮｈｅＩ制限部位があるので、
ＳｐｅＩ（ＮｈｅＩと両立性）を用いた。
クローニングするための両立性の付着末端を得るため
に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中にお
ける２００μＭ ｄＮＴＰｓと１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡＱ
（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０サ
イクルでアニーリングした。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７
に特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏＩ及びＳｐｅ
Ｉ認識部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡＤ６７
のコーディング領域にはＮｈｅＩ制限部位があるので、
ＳｐｅＩ（ＮｈｅＩと両立性）を用いた。
【００６５】ＰＣＲ産物をそれぞれのｐＥＴベクターに
サブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のよ
うにプレートした（Maniatis et al., Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）。コロニーを取り
出して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培
地中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクロ
ーンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier
et al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986）に形質転換し
た。ネガティブコントロールとして、挿入物をもたない
ｐＥＴ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個
のコロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピ
ル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）で
誘導して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning
a Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory
Press, Cold Spring Habor, 17. 15-17. 16, 1989）記
載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
サブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のよ
うにプレートした（Maniatis et al., Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laborato
ry, Cold Spring Habor, NY, 1989）。コロニーを取り
出して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培
地中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクロ
ーンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier
et al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986）に形質転換し
た。ネガティブコントロールとして、挿入物をもたない
ｐＥＴ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個
のコロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピ
ル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）で
誘導して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning
a Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory
Press, Cold Spring Habor, 17. 15-17. 16, 1989）記
載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００６６】ＧＡＤ活性を測定するために、ＯＤ６００
−０．５のバクテリア培養物１０ｍｌを１ｍＭのＩＰＴ
Ｇで誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心し
て、ホモジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニ
ルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ 臭化２−ア
ミノエチルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍ
Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁し
て、超音波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で
除去し、上澄み（少量の上澄みを−７０℃で貯蔵した）
中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal. Bioc
hem., 72:248, 1986）。文献（Legay et al., J.Neuroc
hem., 46:1478, 1986）記載のように脳のホモジェネー
トを調製した。Krieger et al., J.Neurochem., 33:29
9, 1984の記載に従って、０．２ｍＭ ＰＬＰの存在
下、又は不存在下に、インキュベーション混合物中に脳
ホモジェネート又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れ
て、ＧＡＤ活性を測定した。バクテリア溶菌物中の１４
ＣＯ２の生産量は、インキュベーション時間及びタンパ
ク質濃度に比例していた。
−０．５のバクテリア培養物１０ｍｌを１ｍＭのＩＰＴ
Ｇで誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心し
て、ホモジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニ
ルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ 臭化２−ア
ミノエチルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍ
Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁し
て、超音波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で
除去し、上澄み（少量の上澄みを−７０℃で貯蔵した）
中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal. Bioc
hem., 72:248, 1986）。文献（Legay et al., J.Neuroc
hem., 46:1478, 1986）記載のように脳のホモジェネー
トを調製した。Krieger et al., J.Neurochem., 33:29
9, 1984の記載に従って、０．２ｍＭ ＰＬＰの存在
下、又は不存在下に、インキュベーション混合物中に脳
ホモジェネート又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れ
て、ＧＡＤ活性を測定した。バクテリア溶菌物中の１４
ＣＯ２の生産量は、インキュベーション時間及びタンパ
ク質濃度に比例していた。
【００６７】
【表１】
【００６８】表１に示すように、ＧＡＤ６５又はＧＡＤ
６７を含むバクテリア溶菌物は［１−１４Ｃ］−グルタ
ミン酸と、ＧＡＢＡ及び１４ＣＯ２との変換を触媒す
る。ＰＬＰは、ＧＡＤ６７よりもＧＡＤ６５の酵素活性
を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔｉｎ
及びその共同研究者（Martin, Cell. Mol. Neurobiol.,
7:237, 1987）が提唱した不活化サイクルを通して、Ｇ
ＡＤ６５がより速く循環することを示している。このよ
り速い循環は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−ＧＡ
Ｄのプールに、ＧＡＤ６５がより貢献していることを示
している（Miller et al., Brain Res. Bull., 5(Supp
l. 2):89, 1980）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏではＰＬＰ
は、ＧＡＤ６７活性よりもＧＡＤ６５活性をより制御し
ていると考えられる。
６７を含むバクテリア溶菌物は［１−１４Ｃ］−グルタ
ミン酸と、ＧＡＢＡ及び１４ＣＯ２との変換を触媒す
る。ＰＬＰは、ＧＡＤ６７よりもＧＡＤ６５の酵素活性
を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔｉｎ
及びその共同研究者（Martin, Cell. Mol. Neurobiol.,
7:237, 1987）が提唱した不活化サイクルを通して、Ｇ
ＡＤ６５がより速く循環することを示している。このよ
り速い循環は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−ＧＡ
Ｄのプールに、ＧＡＤ６５がより貢献していることを示
している（Miller et al., Brain Res. Bull., 5(Supp
l. 2):89, 1980）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏではＰＬＰ
は、ＧＡＤ６７活性よりもＧＡＤ６５活性をより制御し
ていると考えられる。
【００６９】バクテリア溶菌物中のＧＡＤ６５活性は、
ラット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧ
ＡＤ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et
al.,J. Neurochem., 33:533, 1979）。いずれのＧＡＤ
も、粗ラット脳ホモジェネート中のＧＡＤ活性よりもバ
クテリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテ
リア溶菌物の内在ＰＬＰの濃度は、ラット脳ホモジェネ
ートよりも少ないかも知れない。
ラット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧ
ＡＤ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et
al.,J. Neurochem., 33:533, 1979）。いずれのＧＡＤ
も、粗ラット脳ホモジェネート中のＧＡＤ活性よりもバ
クテリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテ
リア溶菌物の内在ＰＬＰの濃度は、ラット脳ホモジェネ
ートよりも少ないかも知れない。
【００７０】Ｄ．ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の免疫学的
同定 上記のようにしてラット脳ホモジェネートとバクテリア
溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold
Spring Habor, NY, 1988に記載されたように、各サン
プルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ中
の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タン
パク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し
た（Harlow et al., Antibodies, A Labratory Manual,
Cold Spring Habor Laboratory,Cold Spring Habor, N
Y, 1988）。未反応部位を、２％ウシ血清アルブミン
（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％トリトン
−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢ
Ｓ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄
後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断
し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レ
ーン１から４は、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方を認
識するOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の
抗血清の１／２０００希釈液と共に；レーン５から８
は、ＧＡＤ６５のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０
００希釈液と共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ６５に
特異的なＧＡＤ−６モノクローナル抗体（Chang et a
l., J. Neurosci., 8:2123, 1988）の１／２０００希釈
液と共にインキュベーションした。全てのフィルターを
よく洗浄して、適当な二次抗体をインキュベーションし
て、洗浄した。結合した抗体を１２５Ｉ−標識蛋白質Ａ
及びオートラジオグラフィーにより検出した。各レーン
は以下のものを含んでいた：レーン１、５及び９は、Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ６７；レーン２、６
及び１０は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡ
Ｄ６５；レーン３、７及び１１は、ラット脳ホモジェネ
ート；そしてレーン４、８及び１２は、ＢＬ２１（ＤＥ
３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
同定 上記のようにしてラット脳ホモジェネートとバクテリア
溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold
Spring Habor, NY, 1988に記載されたように、各サン
プルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ中
の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タン
パク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し
た（Harlow et al., Antibodies, A Labratory Manual,
Cold Spring Habor Laboratory,Cold Spring Habor, N
Y, 1988）。未反応部位を、２％ウシ血清アルブミン
（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％トリトン
−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢ
Ｓ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄
後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断
し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レ
ーン１から４は、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方を認
識するOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の
抗血清の１／２０００希釈液と共に；レーン５から８
は、ＧＡＤ６５のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０
００希釈液と共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ６５に
特異的なＧＡＤ−６モノクローナル抗体（Chang et a
l., J. Neurosci., 8:2123, 1988）の１／２０００希釈
液と共にインキュベーションした。全てのフィルターを
よく洗浄して、適当な二次抗体をインキュベーションし
て、洗浄した。結合した抗体を１２５Ｉ−標識蛋白質Ａ
及びオートラジオグラフィーにより検出した。各レーン
は以下のものを含んでいた：レーン１、５及び９は、Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ６７；レーン２、６
及び１０は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡ
Ｄ６５；レーン３、７及び１１は、ラット脳ホモジェネ
ート；そしてレーン４、８及び１２は、ＢＬ２１（ＤＥ
３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
【００７１】バクテリア産出性のＧＡＤ６５及びＧＡＤ
６７のイムノブロットは、ＧＡＤ６ ５が脳抽出物中の小
さいＧＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ６７は大きい形
とよく対応することを示している（図１３）。これまで
の研究は、ＧＡＤ６７がネコＧＡＤ６７及びマウスＧＡ
Ｄ６７にとっての大きいＧＡＤと対応することを示して
いる（Katarova et al., Eur. J.Neurosci., 2:190, 19
90; 235, 1987）。バクテリア産出性のＧＡＤ６５及び
ＧＡＤ６７の可動性（Oertel et al., Neuroscience,
6:2689, 1981の抗血清で検出した場合）は、ラット脳ホ
モジェネートに見られる免疫反応ダブレットと同じであ
る。
６７のイムノブロットは、ＧＡＤ６ ５が脳抽出物中の小
さいＧＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ６７は大きい形
とよく対応することを示している（図１３）。これまで
の研究は、ＧＡＤ６７がネコＧＡＤ６７及びマウスＧＡ
Ｄ６７にとっての大きいＧＡＤと対応することを示して
いる（Katarova et al., Eur. J.Neurosci., 2:190, 19
90; 235, 1987）。バクテリア産出性のＧＡＤ６５及び
ＧＡＤ６７の可動性（Oertel et al., Neuroscience,
6:2689, 1981の抗血清で検出した場合）は、ラット脳ホ
モジェネートに見られる免疫反応ダブレットと同じであ
る。
【００７２】ラット脳中のＧＡＤの低分子量及び高分子
量形は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの
産物と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その
結果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ６５とＧＡ
Ｄ６７である。このデータから、既に報告されているタ
ピア（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、Ｐ
ＬＰ−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem.,
29:519, 1977）は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７
と分子的に同じものである、と結論付けることができ
る。Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al.,
Brain Res., 421:235, 1987）は、ラット脳ＧＡＤには
４つの運動力学的に異なる形が存在することを報告して
いる。しかしながら、これらの形のイムノブロッティン
グ試験（ここで用いたような抗血清を用いる）について
は報告されていない。
量形は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの
産物と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その
結果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ６５とＧＡ
Ｄ６７である。このデータから、既に報告されているタ
ピア（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、Ｐ
ＬＰ−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem.,
29:519, 1977）は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７
と分子的に同じものである、と結論付けることができ
る。Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al.,
Brain Res., 421:235, 1987）は、ラット脳ＧＡＤには
４つの運動力学的に異なる形が存在することを報告して
いる。しかしながら、これらの形のイムノブロッティン
グ試験（ここで用いたような抗血清を用いる）について
は報告されていない。
【００７３】Ｅ．脳組織中のＲＮＡにおけるＧＡＤ６５
及びＧＡＤ６７の分布 インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーショ
ンを用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ６５及びＧＡ
Ｄ６７の分布を決定するための実験を行った。ＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡからの、それぞれ３．２ｋ
ｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuenschell et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 83:6193, 1986 の方法に従
って、３５Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの加水分解
断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブリダイズ
させた。動物はハロタンで麻酔して断首した。脳をドラ
イアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクション（１
２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（ＰＢＳ；１
３０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３０分間固
定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水し、−７
０℃で貯蔵した。
及びＧＡＤ６７の分布 インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーショ
ンを用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ６５及びＧＡ
Ｄ６７の分布を決定するための実験を行った。ＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡからの、それぞれ３．２ｋ
ｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuenschell et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 83:6193, 1986 の方法に従
って、３５Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの加水分解
断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブリダイズ
させた。動物はハロタンで麻酔して断首した。脳をドラ
イアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクション（１
２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（ＰＢＳ；１
３０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３０分間固
定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水し、−７
０℃で貯蔵した。
【００７４】組織の透過性を増加するために、セクショ
ンを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９
５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中
に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．０２Ｎ
ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の０．
０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２×５
分）；１μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（７．５分）；及
びＰＢＳ中のグリシン（プロテイナーゼＫを阻害するた
め）（３×５分）。プロテイナーゼＫは使用前に３７℃
で３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０
％ホルムアミド、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，０．２％ ＳＤＳ，０．０２％ＢＳＡ、０．０
０２％ フィコル、０．０２％ ポリビニルピロリド
ン、２５０μｇ／ｍｌ イーストｔＲＮＡ、２５０μｇ
／ｍｌ ポリＡ、及び２５ｍＭ ＰＰＥＳ（ｐＨ６．
８）中でインキュベーションした。
ンを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９
５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中
に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．０２Ｎ
ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の０．
０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２×５
分）；１μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（７．５分）；及
びＰＢＳ中のグリシン（プロテイナーゼＫを阻害するた
め）（３×５分）。プロテイナーゼＫは使用前に３７℃
で３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０
％ホルムアミド、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，０．２％ ＳＤＳ，０．０２％ＢＳＡ、０．０
０２％ フィコル、０．０２％ ポリビニルピロリド
ン、２５０μｇ／ｍｌ イーストｔＲＮＡ、２５０μｇ
／ｍｌ ポリＡ、及び２５ｍＭ ＰＰＥＳ（ｐＨ６．
８）中でインキュベーションした。
【００７５】ハイブリダイゼーションのためには、１０
０ｍＭ ＤＴＴ、１０％ 硫酸デキストラン、及びセン
ス又はアンチセンスの３５Ｓ−ＲＮＡを、プレハイブリ
ダイゼーション溶液に加えた。プローブ（センス又はア
ンチセンス）約３ｎｇ（１０ ６ｃｐｍ）を含むハイブリ
ダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）をスライド上に
加えた。各スライドはカバーをして、５０℃で１６時間
インキュベーションし、次いでシリコン処理したカバー
を４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ−１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６
０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で短時間洗
浄することによって除去した。
０ｍＭ ＤＴＴ、１０％ 硫酸デキストラン、及びセン
ス又はアンチセンスの３５Ｓ−ＲＮＡを、プレハイブリ
ダイゼーション溶液に加えた。プローブ（センス又はア
ンチセンス）約３ｎｇ（１０ ６ｃｐｍ）を含むハイブリ
ダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）をスライド上に
加えた。各スライドはカバーをして、５０℃で１６時間
インキュベーションし、次いでシリコン処理したカバー
を４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ−１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６
０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で短時間洗
浄することによって除去した。
【００７６】次いでセクションをリボヌクレアーゼＡ
（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ チオ硫酸ナトリウ
ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処
理して、２×ＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍ
Ｍ チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスし
た。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で
脱脂して、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンでコーテ
ィングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫ
ｏｄａｋ Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレ
ットで対比染色した。
（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ チオ硫酸ナトリウ
ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処
理して、２×ＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍ
Ｍ チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスし
た。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で
脱脂して、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンでコーテ
ィングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫ
ｏｄａｋ Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレ
ットで対比染色した。
【００７７】反射偏光を用いてオートラジオグラフ粒子
を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナラ
イザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが
低いために、細胞が“標識された”と定義するための基
準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ
標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細
胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によっ
て覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域
数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におか
れた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光
と透過光との両方を用いて、高倍率（８００×）で分析
を行った。数は、“ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であ
る。
を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナラ
イザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが
低いために、細胞が“標識された”と定義するための基
準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ
標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細
胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によっ
て覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域
数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におか
れた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光
と透過光との両方を用いて、高倍率（８００×）で分析
を行った。数は、“ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であ
る。
【００７８】
【表２】
【００７９】全ての神経性細胞タイプにおいて、ＧＡＤ
６７ｍＲＮＡレベルの方が大きい。ｉｎ ｓｉｔｕでの
ハイブリダイゼーションにおける観察は、小脳中の非依
存性ＧＡＤ活性に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳
領域中で最も低いものの一つである、という従来の知見
（Nitsch, J. Neurochem., 34:822, 1980; Denner eta
l., J. Neurochem., 44:957, 1985; Itoh et al, Neuro
chem. Res. 6:1283, 1981）と一致している。更に、表
２に示すように、ＧＡＤ６７ｍＲＮＡに対する量は、プ
ルキニエ＞ゴルジＩＩ＞籠＞星細胞の順であり、一方Ｇ
ＡＤ６５に対する量は、ゴルジＩＩ＞プルキニエ＞籠＞
星細胞の順である。
６７ｍＲＮＡレベルの方が大きい。ｉｎ ｓｉｔｕでの
ハイブリダイゼーションにおける観察は、小脳中の非依
存性ＧＡＤ活性に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳
領域中で最も低いものの一つである、という従来の知見
（Nitsch, J. Neurochem., 34:822, 1980; Denner eta
l., J. Neurochem., 44:957, 1985; Itoh et al, Neuro
chem. Res. 6:1283, 1981）と一致している。更に、表
２に示すように、ＧＡＤ６７ｍＲＮＡに対する量は、プ
ルキニエ＞ゴルジＩＩ＞籠＞星細胞の順であり、一方Ｇ
ＡＤ６５に対する量は、ゴルジＩＩ＞プルキニエ＞籠＞
星細胞の順である。
【００８０】このようにＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｍＲ
ＮＡの発現はニューロンのクラスによって異なる。つま
り、全ＧＡＤ活性に対するそれぞれの貢献度が、いかに
ＧＡＢＡ生産が制御されているかに影響している。例え
ば、黒質は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最
も高いＰＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, J. Neuro
chem., 34:822, 1980）。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を
局部的に注射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ
濃度を増加させることは、発作感受性（ｓｅｉｚｕｒｅ
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効で
ある（Gale, Fed. Proc., 44:2414, 1985）。従って、
ＰＬＰ−アンタゴニストによって誘導される発作を受け
る実験動物は、特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ
６５の阻害のために、発作の伝達を阻害することができ
ない。
ＮＡの発現はニューロンのクラスによって異なる。つま
り、全ＧＡＤ活性に対するそれぞれの貢献度が、いかに
ＧＡＢＡ生産が制御されているかに影響している。例え
ば、黒質は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最
も高いＰＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, J. Neuro
chem., 34:822, 1980）。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を
局部的に注射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ
濃度を増加させることは、発作感受性（ｓｅｉｚｕｒｅ
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効で
ある（Gale, Fed. Proc., 44:2414, 1985）。従って、
ＰＬＰ−アンタゴニストによって誘導される発作を受け
る実験動物は、特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ
６５の阻害のために、発作の伝達を阻害することができ
ない。
【００８１】Ｆ．ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の無細胞系
配置 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の分布をＳ２及びシナプトソ
ーム無細胞分画において評価した。Ｓ２は、脳中の全細
胞の細胞質ゾルからなる高速上澄みであり、一方シナプ
トソーム分画は、主として神経終末からなる（Gray et
al., J.Anat.,Lond, 96:79, 1962）。これらの研究のた
めには、全ラット脳分画を、Booth andClark（Booth, e
t al.）Biochem.J., 176:365, 1978に記載するように行
った。タンパク質濃度をSchaffner and Weissman (Scha
ffner et al., Anal. Biochem.56:502, 1973）の方法に
よって測定した。Kaise et al., DNA Cloning, Vol. 1,
A Practical Approach, D. M. Glover ed., IRL Pres
s, Oxford, 1985, pp. 38-40 に記載の方法でサンプル
を調製し、ＧＡＤ−６モノクローナル抗体及びＫ−２抗
血清を用いて上記のようにしてイムノブロッティングを
行った。等量のタンパク質（１６μｇ）を各レーンに加
えた。オートラジオグラフィーは、１、３、１０、３
０、１００μｇのタンパク質濃度で、Ｋ−２抗血清及び
ＧＡＤ−６モノクローナル抗体の両方と抗体結合した
１２５Ｉ−タンパク質Ａの量が線状に増加する応答を示
している（データ示さず）。
配置 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の分布をＳ２及びシナプトソ
ーム無細胞分画において評価した。Ｓ２は、脳中の全細
胞の細胞質ゾルからなる高速上澄みであり、一方シナプ
トソーム分画は、主として神経終末からなる（Gray et
al., J.Anat.,Lond, 96:79, 1962）。これらの研究のた
めには、全ラット脳分画を、Booth andClark（Booth, e
t al.）Biochem.J., 176:365, 1978に記載するように行
った。タンパク質濃度をSchaffner and Weissman (Scha
ffner et al., Anal. Biochem.56:502, 1973）の方法に
よって測定した。Kaise et al., DNA Cloning, Vol. 1,
A Practical Approach, D. M. Glover ed., IRL Pres
s, Oxford, 1985, pp. 38-40 に記載の方法でサンプル
を調製し、ＧＡＤ−６モノクローナル抗体及びＫ−２抗
血清を用いて上記のようにしてイムノブロッティングを
行った。等量のタンパク質（１６μｇ）を各レーンに加
えた。オートラジオグラフィーは、１、３、１０、３
０、１００μｇのタンパク質濃度で、Ｋ−２抗血清及び
ＧＡＤ−６モノクローナル抗体の両方と抗体結合した
１２５Ｉ−タンパク質Ａの量が線状に増加する応答を示
している（データ示さず）。
【００８２】この結果は、どちらの分画にも等量のＧＡ
Ｄ６７が存在することを示している。Ｓ２分画は神経膠
（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク
質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ６７
の濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における
方が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ６ ５
の濃度はＳ２よりもシナプトソームにおける方が大き
い。これらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ６５とは対照的
に、神経末端よりもニューロンの細胞体部において、は
るかに大きいＧＡＤ６７分画が存在することを示唆して
いる。従って、免疫組織化学的研究におけるのと同様
に、無細胞分画化は、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ ６７が異な
る無細胞分布を有していることを示している。
Ｄ６７が存在することを示している。Ｓ２分画は神経膠
（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク
質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ６７
の濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における
方が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ６ ５
の濃度はＳ２よりもシナプトソームにおける方が大き
い。これらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ６５とは対照的
に、神経末端よりもニューロンの細胞体部において、は
るかに大きいＧＡＤ６７分画が存在することを示唆して
いる。従って、免疫組織化学的研究におけるのと同様
に、無細胞分画化は、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ ６７が異な
る無細胞分布を有していることを示している。
【００８３】ＧＡＢＡの合成及び分解阻害剤を用いるｉ
ｎ ｖｉｖｏの実験において、ニューロン細胞体部にお
けるＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡブー
ルとは異なることを示唆している（Iadarola et al., M
ol. Cell. Biochem., 39:305, 1981）。ＧＡＤ６７によ
って生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧ
ＡＢＡシャントにおいて）、そして神経細胞樹状突起シ
ナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起と共
に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, Physi
ol.Rev., 52:864, 1972）、そして多分ＧＡＢＡを放出
している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 1971）
嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血清で
強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球にお
いてはＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７ｍＲＮＡレベルの方
が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分
布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプ
トソームにではなく、Ｓ２及びＰ１（粗核ペレット）に
存在する、という知見（Quinn et al., Neurochem., 3
5:583, 1980）と一致している。
ｎ ｖｉｖｏの実験において、ニューロン細胞体部にお
けるＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡブー
ルとは異なることを示唆している（Iadarola et al., M
ol. Cell. Biochem., 39:305, 1981）。ＧＡＤ６７によ
って生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧ
ＡＢＡシャントにおいて）、そして神経細胞樹状突起シ
ナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起と共
に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, Physi
ol.Rev., 52:864, 1972）、そして多分ＧＡＢＡを放出
している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 1971）
嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血清で
強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球にお
いてはＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７ｍＲＮＡレベルの方
が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分
布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプ
トソームにではなく、Ｓ２及びＰ１（粗核ペレット）に
存在する、という知見（Quinn et al., Neurochem., 3
5:583, 1980）と一致している。
【００８４】ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７の無細胞分布の相
違は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ
ａｎｃｈｏｒｉｎｇ) 又は未知のタンパク質標的機構に
よるものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質
では、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６ ７で似た分布を有してい
る。例えば、培養交感神経細胞において、Peng et al.,
J. Cell. Biol., 102:252, 1986は、タウの８４％は軸
索に存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及
び樹状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タ
ンパク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコ
リンレセプターをその下にある膜細胞体質に係留するた
めのものである、と考えられている（Flucher et al.,
Neuron, 3:163, 1989）。
違は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ
ａｎｃｈｏｒｉｎｇ) 又は未知のタンパク質標的機構に
よるものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質
では、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６ ７で似た分布を有してい
る。例えば、培養交感神経細胞において、Peng et al.,
J. Cell. Biol., 102:252, 1986は、タウの８４％は軸
索に存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及
び樹状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タ
ンパク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコ
リンレセプターをその下にある膜細胞体質に係留するた
めのものである、と考えられている（Flucher et al.,
Neuron, 3:163, 1989）。
【００８５】実施例３：臨床標本中のＧＡＤ自己抗体の
検出 Ａ．材料及び方法 １．患者標本： Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びその共同研究者
（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）の
以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。
このグループは以下のものからなる：グループ（１）以
前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威
あるＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｔａ
Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Di
abetes, 36:578-584, 1987）に従って診断された、１人
の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫
疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択され
た小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）ネガテ
ィブの非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤ
Ｄの発病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収
集されてきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コン
トロール及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人
達；及びグループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ
発病には至っていない３人の患者。この後者のグループ
は、ＩＤＤ発端者の第１級親族５０００人以上、及び一
般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）の
継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
検出 Ａ．材料及び方法 １．患者標本： Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びその共同研究者
（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）の
以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。
このグループは以下のものからなる：グループ（１）以
前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威
あるＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｔａ
Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Di
abetes, 36:578-584, 1987）に従って診断された、１人
の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫
疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択され
た小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）ネガテ
ィブの非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤ
Ｄの発病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収
集されてきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コン
トロール及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人
達；及びグループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ
発病には至っていない３人の患者。この後者のグループ
は、ＩＤＤ発端者の第１級親族５０００人以上、及び一
般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）の
継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
【００８６】２．小島細胞自己抗体： 血液型Ｏのクリ
オカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩ
ＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:135
7-1360, 1990）。全ての結果をコードしたサンプルで、
各バッチにおけるネガティブ及びポジティブコントロー
ル血清と比較しつつ解釈した。ＩＣＡポジティブの程度
はＩＣＡ標準化（Gleichman et al., Diabetes, 36:578
-584, 1987）のためのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立さ
れたガイドラインに沿って分析した。全てのポジティブ
な血清を端点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）希釈によって滴定
し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会
（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調製しておいた標準血清との
比較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告
する研究においては、ポジティブなＩＣＡ結果とは１０
ＪＤＦユニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
オカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩ
ＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:135
7-1360, 1990）。全ての結果をコードしたサンプルで、
各バッチにおけるネガティブ及びポジティブコントロー
ル血清と比較しつつ解釈した。ＩＣＡポジティブの程度
はＩＣＡ標準化（Gleichman et al., Diabetes, 36:578
-584, 1987）のためのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立さ
れたガイドラインに沿って分析した。全てのポジティブ
な血清を端点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）希釈によって滴定
し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会
（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調製しておいた標準血清との
比較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告
する研究においては、ポジティブなＩＣＡ結果とは１０
ＪＤＦユニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
【００８７】３．ＨＬＡ ＤＲタイピング： ＤＲトレ
イ（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、Van Rood
and Van Leuwen （Nature, 262:795-797, 1976 ）に記
載の方法でＨＬＡ ＤＲタイピングを実施した。
イ（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、Van Rood
and Van Leuwen （Nature, 262:795-797, 1976 ）に記
載の方法でＨＬＡ ＤＲタイピングを実施した。
【００８８】４．ヒトの小島細胞： ヒト膵臓小島をカ
ダベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上
記したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-42
0, 1988）ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ２）３５Ｓメ
チオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
ダベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上
記したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-42
0, 1988）ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ２）３５Ｓメ
チオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
【００８９】５．小島細胞の抽出及び免疫沈降： Atki
nson et al., （Lancet, 335:1357-1360, 1990）に記載
の方法で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免
疫沈降の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１００
０小島細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μ
ｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J. Neuro., 8:2
123-2130, 1988）（トリスバッファー９９μｌ中に１μ
ｌ）（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 199
0）のいずれかと共にインキュベーションする（２時
間、４℃）ことによって、２度前処理した。次いで免疫
複合体を、過剰のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、
非結合性（前処理した）溶解物を含む１０００個の小島
細胞を含む少量を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５
μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al.,J.Neuro., 8:2
123-2130, 1988 ）（トリスバッファー２５μｌ中に１
μｌ）でインキュベーションした。タンパク質Ａセファ
ロースＣＬ−４Ｂでもう一度インキュベーションした
（１時間、４℃）後、複合体を０．１％ ＳＤＳ、１．
０％トリトンＸ−１１４、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む
５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次
いで二重蒸留水で１回洗浄した。タンパク質Ａセファロ
ースＣＬ−４Ｂを次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッフ
ァー（Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970）中で煮沸
し、そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃ
ｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を用い
る蛍光ラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ，Ｘ−ｏｍａｔ
ＡＲ５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥ
ＴＡＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）アナライザーによっ
て分析した。６４ＫＡのポジティブ又はネガティブの血
清を各アッセイで用いて、アッセイ内コントロールとし
た。全ての蛍光ラジオグラフィーを分析して、既知のア
ッセイ内コントロールと比較してポジティブ又はネガテ
ィブと区分けした。ポジティブな血清サンプルは、もし
もサンプルが６４，０００Ｍｘバンドの低い強度の免疫
沈降であったなら、これを１とし、もしも中程度の強度
のバンドが観察されたら２とし、そしてもしも免疫沈降
タンパク質の強度が大きいときは、これを３とした。免
疫沈降した３５Ｓ−ＧＡＤ６５及び３５Ｓ−ＧＡＤ６７
に対応するバンドの強度についても同様の区分けを用い
た。
nson et al., （Lancet, 335:1357-1360, 1990）に記載
の方法で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免
疫沈降の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１００
０小島細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μ
ｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J. Neuro., 8:2
123-2130, 1988）（トリスバッファー９９μｌ中に１μ
ｌ）（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 199
0）のいずれかと共にインキュベーションする（２時
間、４℃）ことによって、２度前処理した。次いで免疫
複合体を、過剰のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、
非結合性（前処理した）溶解物を含む１０００個の小島
細胞を含む少量を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５
μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al.,J.Neuro., 8:2
123-2130, 1988 ）（トリスバッファー２５μｌ中に１
μｌ）でインキュベーションした。タンパク質Ａセファ
ロースＣＬ−４Ｂでもう一度インキュベーションした
（１時間、４℃）後、複合体を０．１％ ＳＤＳ、１．
０％トリトンＸ−１１４、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む
５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次
いで二重蒸留水で１回洗浄した。タンパク質Ａセファロ
ースＣＬ−４Ｂを次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッフ
ァー（Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970）中で煮沸
し、そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃ
ｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を用い
る蛍光ラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ，Ｘ−ｏｍａｔ
ＡＲ５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥ
ＴＡＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）アナライザーによっ
て分析した。６４ＫＡのポジティブ又はネガティブの血
清を各アッセイで用いて、アッセイ内コントロールとし
た。全ての蛍光ラジオグラフィーを分析して、既知のア
ッセイ内コントロールと比較してポジティブ又はネガテ
ィブと区分けした。ポジティブな血清サンプルは、もし
もサンプルが６４，０００Ｍｘバンドの低い強度の免疫
沈降であったなら、これを１とし、もしも中程度の強度
のバンドが観察されたら２とし、そしてもしも免疫沈降
タンパク質の強度が大きいときは、これを３とした。免
疫沈降した３５Ｓ−ＧＡＤ６５及び３５Ｓ−ＧＡＤ６７
に対応するバンドの強度についても同様の区分けを用い
た。
【００９０】６．免疫沈降： ３５Ｓ−ＧＡＤ６５又は
３５Ｓ−ＧＡＤ６７、及びヒト脳ホモジェネートからの
ＧＡＤを含むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒ
ト小島細胞抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に
行った。
３５Ｓ−ＧＡＤ６７、及びヒト脳ホモジェネートからの
ＧＡＤを含むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒ
ト小島細胞抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に
行った。
【００９１】７．ＧＡＤアッセイ： ヒト脳ホモジェネ
ートを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血
清と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タ
ンパク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採
取し、ＧＡＤ活性をKrieger etal., Neurochem. 33:29
9, 1984に記載のように測定した。簡単に言うと、タン
パク質Ａアガロースビーズを（１−１４Ｃ）−グルタミ
ン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベー
ション混合物（Krieger et al., Neurochem., 33:299,
1984）中でインキュベーションし、液体シンチレーショ
ンカウンターで１ ４ＣＯ２の生産を定量した。
ートを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血
清と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タ
ンパク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採
取し、ＧＡＤ活性をKrieger etal., Neurochem. 33:29
9, 1984に記載のように測定した。簡単に言うと、タン
パク質Ａアガロースビーズを（１−１４Ｃ）−グルタミ
ン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベー
ション混合物（Krieger et al., Neurochem., 33:299,
1984）中でインキュベーションし、液体シンチレーショ
ンカウンターで１ ４ＣＯ２の生産を定量した。
【００９２】８． ３５Ｓ−ＧＡＤ６５及び３５Ｓ−ＧＡ
Ｄ６７の生産： ラットＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤ
ＮＡを上記したようにバクテリア発現系にサブクローン
した。 ３５Ｓ−ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテ
リア（最小培地で成育）をＴＲＡＮ３５Ｓ−ラベル（Ｉ
ＣＮ）１５分間パルスすることによって行った。次いで
培養物を遠心して、ホモジェナイズバッファー［１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１
ｍＭ ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド
（ＡＥＴ）及び６０ｍＭ リン酸カリウム、ｐｈ７．
１］中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理の
後、遠心によって細胞カスを除去し、上澄み（上澄みは
−７０℃で少量貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定し
た（Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986）。
Ｄ６７の生産： ラットＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤ
ＮＡを上記したようにバクテリア発現系にサブクローン
した。 ３５Ｓ−ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテ
リア（最小培地で成育）をＴＲＡＮ３５Ｓ−ラベル（Ｉ
ＣＮ）１５分間パルスすることによって行った。次いで
培養物を遠心して、ホモジェナイズバッファー［１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１
ｍＭ ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド
（ＡＥＴ）及び６０ｍＭ リン酸カリウム、ｐｈ７．
１］中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理の
後、遠心によって細胞カスを除去し、上澄み（上澄みは
−７０℃で少量貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定し
た（Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986）。
【００９３】Ｂ．ＩＤＤＭ標本の免疫反応性 ＩＤＤＭを有する患者からの血清を用いて、ヒト脳ホモ
ジェネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
ジェネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
【００９４】
【表３】
【００９５】表３に示すように、ＩＤＤＭの危険がある
か、或いはＩＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清
は、コントロール患者の血清よりも、有意に大量のヒト
脳抽出物の酵素的に活性がＧＡＤと結合している。更
に、患者のうちの１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に
採取されており、従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤ
ＤＭ症状の発病前に存在していたことになる（下のＣ参
照）。
か、或いはＩＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清
は、コントロール患者の血清よりも、有意に大量のヒト
脳抽出物の酵素的に活性がＧＡＤと結合している。更
に、患者のうちの１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に
採取されており、従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤ
ＤＭ症状の発病前に存在していたことになる（下のＣ参
照）。
【００９６】更に別の実験（結果を示さず）では、ＩＤ
ＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清
は、組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ６５を免疫沈
降させるが、一方組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ
６７は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そし
てこれは３５Ｓ−ＧＡＤ６５よりも弱い）ことを示し
た。またそれ以降の研究で、神経病の合併症を有するＩ
ＤＤＭ患者の血清中には、ＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７
自己抗体の力価が大きいことが見いだされた（ここでは
示さず）。
ＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清
は、組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ６５を免疫沈
降させるが、一方組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ
６７は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そし
てこれは３５Ｓ−ＧＡＤ６５よりも弱い）ことを示し
た。またそれ以降の研究で、神経病の合併症を有するＩ
ＤＤＭ患者の血清中には、ＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７
自己抗体の力価が大きいことが見いだされた（ここでは
示さず）。
【００９７】患者ＤＡの血清を用いる別の研究におい
て、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチド
を認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの
電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒト
ＩＤＤＭ（Baekkeskov et al.,Nature, 298:167-169, 1
982）及び動物モデル（Baekkeskov et al., Science,22
4:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1
587-1590, 1988）で示されたような、６４ｋＤの成分に
対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ６５を
認識するが、ＧＡＤ６７は認識しない、ＧＡＤ−６モノ
クローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ
６５でこれらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋ
Ｄの膵臓ポリペプチドを血清が認識する能力が失われ
る。従って６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によっ
て認識されるエピトープがＧＡＤ６５中に存在し、この
ことは該自己抗原がＧＡＤ６５であることを示唆してい
る。ＧＡＤ６５の予測される値を調査するために、ＩＤ
ＤＭの臨床的発現の発病前の患者から血清を採取して、
このＧＡＤ６５に対する自己抗体を調べた。
て、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチド
を認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの
電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒト
ＩＤＤＭ（Baekkeskov et al.,Nature, 298:167-169, 1
982）及び動物モデル（Baekkeskov et al., Science,22
4:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1
587-1590, 1988）で示されたような、６４ｋＤの成分に
対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ６５を
認識するが、ＧＡＤ６７は認識しない、ＧＡＤ−６モノ
クローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ
６５でこれらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋ
Ｄの膵臓ポリペプチドを血清が認識する能力が失われ
る。従って６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によっ
て認識されるエピトープがＧＡＤ６５中に存在し、この
ことは該自己抗原がＧＡＤ６５であることを示唆してい
る。ＧＡＤ６５の予測される値を調査するために、ＩＤ
ＤＭの臨床的発現の発病前の患者から血清を採取して、
このＧＡＤ６５に対する自己抗体を調べた。
【００９８】
【表４】
【００９９】表４に示すように、１２標本中の９標本
（７５％）は３５Ｓ−ＧＡＤ６５と免疫反応性であっ
た。更に、２人の患者（ＪＡ及びＶＣ）はこの条件下で
ＧＡＤ６ ７と免疫反応性であったが、ＧＡＤ６５とは免
疫反応性でなかった。従って、組み合わせると、これら
の患者の血清の１２例中、１１例（９１％）にＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７に対する自己抗体が存在した。この
ことは、ＧＡＤ６５に対する自己抗体はＧＡＤ６７に対
する自己抗体よりも一般的であるが、アッセイにおいて
両方の組換えＧＡＤ（ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７）を用
いると、ＩＤＤＭをより広く予測できるようになること
を示唆している。これらの血清についての以前の試験
（Atkinson et al., Langet, 335:1357-1360, 1990）
は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒト膵臓小島
細胞からの３５Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性であるこ
とを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可能な自己
抗体を含むが、ＧＡＤ６５に対する自己抗体は含んでい
ない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価（又は
“１”）を含む血清であった。従って、ここで得られた
誤りのネガティブはこのアッセイの感度が低いために起
きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対し
てネガティブな１人の患者（ＢＲ）においてＩＤＤＭを
予測している。
（７５％）は３５Ｓ−ＧＡＤ６５と免疫反応性であっ
た。更に、２人の患者（ＪＡ及びＶＣ）はこの条件下で
ＧＡＤ６ ７と免疫反応性であったが、ＧＡＤ６５とは免
疫反応性でなかった。従って、組み合わせると、これら
の患者の血清の１２例中、１１例（９１％）にＧＡＤ
６５及びＧＡＤ６７に対する自己抗体が存在した。この
ことは、ＧＡＤ６５に対する自己抗体はＧＡＤ６７に対
する自己抗体よりも一般的であるが、アッセイにおいて
両方の組換えＧＡＤ（ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７）を用
いると、ＩＤＤＭをより広く予測できるようになること
を示唆している。これらの血清についての以前の試験
（Atkinson et al., Langet, 335:1357-1360, 1990）
は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒト膵臓小島
細胞からの３５Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性であるこ
とを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可能な自己
抗体を含むが、ＧＡＤ６５に対する自己抗体は含んでい
ない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価（又は
“１”）を含む血清であった。従って、ここで得られた
誤りのネガティブはこのアッセイの感度が低いために起
きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対し
てネガティブな１人の患者（ＢＲ）においてＩＤＤＭを
予測している。
【０１００】これらの結果は、ヒト膵臓のβ−細胞中に
同定された６４ｋＤ分子は、ラットＧＡＤ６５とサイズ
及び抗原性が同一であることを示している。更に、ＩＤ
ＤＭ発病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ６５に対
する自己抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ６５組
換え分子は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用
である。実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断で
きるということは、疑いもなくインシュリン治療が必要
となるまでの時間がおおいに伸びる結果となる。このよ
うな免疫アッセイの感度は、膵臓のβ−細胞に存在する
ＧＡＤ形を表すヒト由来の組換えＧＡＤ６５を用いて改
良されるであろう。
同定された６４ｋＤ分子は、ラットＧＡＤ６５とサイズ
及び抗原性が同一であることを示している。更に、ＩＤ
ＤＭ発病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ６５に対
する自己抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ６５組
換え分子は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用
である。実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断で
きるということは、疑いもなくインシュリン治療が必要
となるまでの時間がおおいに伸びる結果となる。このよ
うな免疫アッセイの感度は、膵臓のβ−細胞に存在する
ＧＡＤ形を表すヒト由来の組換えＧＡＤ６５を用いて改
良されるであろう。
【０１０１】ここに本発明を十分に開示したので、本発
明の範囲を逸脱することなく、多くの変更並びに修飾が
可能なことが当業者には明らかであろう。
明の範囲を逸脱することなく、多くの変更並びに修飾が
可能なことが当業者には明らかであろう。
【図１】 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７特異的ｃＤＮＡプ
ローブを得るためのクローニング手順を示す。
ローブを得るためのクローニング手順を示す。
【図２】 ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応する
アミノ酸配列を示す（その１）。図２−図４が連続して
ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配
列を示すものである。
アミノ酸配列を示す（その１）。図２−図４が連続して
ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配
列を示すものである。
【図３】 ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応する
アミノ酸配列を示す（その２）。
アミノ酸配列を示す（その２）。
【図４】 ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応する
アミノ酸配列を示す（その３）。
アミノ酸配列を示す（その３）。
【図５】 ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するア
ミノ酸配列を示す（その１）。図５〜図８が連続してヒ
トＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を
示すものである。
ミノ酸配列を示す（その１）。図５〜図８が連続してヒ
トＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を
示すものである。
【図６】 ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するア
ミノ酸配列を示す（その２）。
ミノ酸配列を示す（その２）。
【図７】 ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応する
アミノ酸配列を示す（その３）。
アミノ酸配列を示す（その３）。
【図８】 ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応する
アミノ酸配列を示す（その４）。
アミノ酸配列を示す（その４）。
【図９】 ラットＧＡＤ６５とヒトＧＡＤ６５のアミノ
酸配列の比較を示す（その１）。
酸配列の比較を示す（その１）。
【図１０】 ラットＧＡＤ６５とヒトＧＡＤ６５のアミ
ノ酸配列の比較を示す（その２）。
ノ酸配列の比較を示す（その２）。
【図１１】 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの異な
るサイズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す。
るサイズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す。
【図１２】 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なｃＤ
ＮＡプローブでハイブリダイスしたサザンブロットを示
す。
ＮＡプローブでハイブリダイスしたサザンブロットを示
す。
【図１３】 ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の免疫学的同定
を示す。
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｎ 11/00 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ 1/68 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｃ１２Ｎ 1/21 33/573 Ａ６１Ｋ 37/56 // Ｃ１２Ｎ 1/21 43/00 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 マーク ジー アーランダー アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 91356、タルザナ、エーピーティー．204番 レセダ ボールブワード 5830 (72)発明者 ダニエル エル カーフマン アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 90404、サンタモニカ、エーピーティー. Ｃ センティネラ 1453
Claims (28)
- 【請求項１】 以下の（ａ）−（ｃ）から選択される組
換えＧＡＤ６５ポリペプチド： （ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）
由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】 （ａ）サンプルをＧＡＤポリペプチドと
接触させ、ここで該ポリペプチドは非−ＧＡＤ真核生物
性ポリペプチドを実質的に含まないものであり； （ｂ）工程（ａ）の成分を、自己抗体がポリペプチドと
結合するのに十分な条件下で、一定時間インキュベーシ
ョンし； （ｃ）ポリペプチドと結合した自己抗体をサンプルから
分離し；そして （ｄ）ポリペプチドと結合した自己抗体の存在を検出す
る、ことからなる、ＧＡＤに対する自己抗体の検出方
法。 - 【請求項３】 ＧＡＤがＧＡＤ６５である、請求の範囲
第２項に記載の方法。 - 【請求項４】 ＧＡＤ６５が以下の（ａ）−（ｃ）から
選択されるタンパク質をコードするｃＤＮＡでコードさ
れるものである請求項３記載の方法： （ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク
質； （ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）
由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項５】 ＧＡＤ６５がヒトＧＡＤ６５である、請
求項３記載の方法。 - 【請求項６】 ＧＡＤがＧＡＤ６７である、請求項２記
載の方法。 - 【請求項７】 ＧＡＤ６７がヒトＧＡＤ６７である、請
求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ＧＡＤがＧＡＤ６５とＧＡＤ６７との混
合物である、請求項２記載の方法。 - 【請求項９】 サンプルがヒト由来のものである、請求
項２記載の方法。 - 【請求項１０】 自己抗体と結合することのできる検出
可能な標識タンパク質を用いて検出を行う、請求項２記
載の方法。 - 【請求項１１】 結合タンパク質が検出可能な標識され
た第２抗体である、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 検出可能な標識が、放射性同位体、蛍
光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、生物発光化
合物、及び酵素からなる群から選択される、請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１３】 治療的に有効量のＧＡＤポリペプチド
を含み、ここで該ＧＡＤポリペプチドはリセプターと結
合するものである、自己免疫応答を改善するための医薬
組成物。 - 【請求項１４】 ＧＡＤがＧＡＤ６５である、請求項１
３記載の医薬組成物。 - 【請求項１５】 ＧＡＤがＧＡＤ６７である、請求項１
３記載の医薬組成物。 - 【請求項１６】 ＧＡＤがＧＡＤ６５とＧＡＤ６７との
混合物である、請求項１３記載の医薬組成物。 - 【請求項１７】 ＧＡＤがヒトＧＡＤである、請求項１
３記載の医薬組成物。 - 【請求項１８】 リセプターが、抗体及びＴ−ヘルパー
細胞からなる群から選択される、請求項１３記載の医薬
組成物。 - 【請求項１９】 自己免疫疾患が、ＩＤＤＭ及びスティ
ッフマン病からなる群から選択される、請求項１３記載
の医薬組成物。 - 【請求項２０】 非経口的に投与される、請求項１３記
載の医薬組成物。 - 【請求項２１】 非経口的投与を、皮下、筋肉内、腹腔
内、空洞内、経皮、又は静脈内注射によって行う、請求
項２０記載の医薬組成物。 - 【請求項２２】 投与を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／回か
ら約２０００ｍｇ／ｋｇ／回までの投与量で行う、請求
項１３記載の医薬組成物。 - 【請求項２３】 組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを治療
的に標識する、請求項１３記載の医薬組成物。 - 【請求項２４】 治療的標識が、放射性同位体、医薬、
レクチン、及び毒素からなる群から選択される、請求項
２３記載の医薬組成物。 - 【請求項２５】 １又はそれ以上の容器を密に封じ込め
るために仕切られた担体からなり、ここで、 （ａ）第１の容器はＧＡＤ６５を含み；そして （ｂ）第２の容器は検出可能な標識された第２抗体を含
み、ここで該第２抗体は自己抗体上に存在するエピトー
プ性決定基と結合する、ＧＡＤ６５に対する自己抗体の
検出に使用するキット。 - 【請求項２６】 ＧＡＤ６５が担体と結合する、請求項
２５記載のキット。 - 【請求項２７】 担体が不溶性である、請求項２６記載
のキット。 - 【請求項２８】 第１の容器が更にＧＡＤ６７を含む、
請求項２５記載のキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/586,536 US6682906B1 (en) | 1990-09-21 | 1990-09-21 | Cloned glutamic acid decarboxylase |
| US07/586536 | 1990-09-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3518259A Division JPH05503220A (ja) | 1990-09-21 | 1991-09-23 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007079164A Division JP2007236390A (ja) | 1990-09-21 | 2007-03-26 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP3518259A Pending JPH05503220A (ja) | 1990-09-21 | 1991-09-23 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
| JP2000107604A Pending JP2000333671A (ja) | 1990-09-21 | 2000-04-10 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
| JP2007079164A Pending JP2007236390A (ja) | 1990-09-21 | 2007-03-26 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3518259A Pending JPH05503220A (ja) | 1990-09-21 | 1991-09-23 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007079164A Pending JP2007236390A (ja) | 1990-09-21 | 2007-03-26 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
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| DE (1) | DE69131419T2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| WO1992004632A1 (en) * | 1990-09-07 | 1992-03-19 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis and treatment of diabetes |
| US6682906B1 (en) | 1990-09-21 | 2004-01-27 | The Regents Of The University Of California | Cloned glutamic acid decarboxylase |
| EP0572478B1 (en) | 1991-02-22 | 2005-09-07 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Hbgad and higad polypeptides and nucleic acids and their use for the diagnosis and treatment of gad autoantigen associated diseases |
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| IL101872A0 (en) * | 1991-05-15 | 1992-12-30 | Univ Washington | Cloning and expression of human islet glutamic acid decarboxylase autoantigen |
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