JP2000166593A - ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法 - Google Patents
ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法Info
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- JP2000166593A JP2000166593A JP10349756A JP34975698A JP2000166593A JP 2000166593 A JP2000166593 A JP 2000166593A JP 10349756 A JP10349756 A JP 10349756A JP 34975698 A JP34975698 A JP 34975698A JP 2000166593 A JP2000166593 A JP 2000166593A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性に優れたヒトＴ
ＳＨＲを、従来以上に大量に製造することにより、放射
性同位元素に代えて酵素等を標識物質として使用し得る
抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定試薬を実現すること。 【解決手段】ピキア酵母を宿主として用いることを特徴
とする、組換え甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法に
より前記課題を解決する。
ＳＨＲを、従来以上に大量に製造することにより、放射
性同位元素に代えて酵素等を標識物質として使用し得る
抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定試薬を実現すること。 【解決手段】ピキア酵母を宿主として用いることを特徴
とする、組換え甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法に
より前記課題を解決する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ピキア酵母を宿主
として用いることを特徴とする、組換え甲状腺刺激ホル
モン受容体の製造方法に関するものである。本発明によ
り製造される組換えＴＳＨＲは、甲状腺機能異常等の疾
患を引き起こす、抗ＴＳＨＲ自己抗体を測定するための
試薬として有用である。
として用いることを特徴とする、組換え甲状腺刺激ホル
モン受容体の製造方法に関するものである。本発明によ
り製造される組換えＴＳＨＲは、甲状腺機能異常等の疾
患を引き起こす、抗ＴＳＨＲ自己抗体を測定するための
試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】甲状腺刺激ホルモン受容体（Ｔｙｒｏｉ
ｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ；以下、甲状腺刺激ホルモン受容体をＴＳＨ
Ｒと略記する）は、甲状腺刺激ホルモン（Ｔｙｒｏｉｄ
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ；以下、Ｔ
ＳＨと略記する）の受容体であり、脳下垂体から分泌さ
れたＴＳＨが甲状腺ろ胞細胞膜上にあるＴＳＨＲに結合
すると、甲状腺は代謝機能の調節ホルモンであるＴ３及
びＴ４を分泌する。ヒトＴＳＨＲの構造等については詳
細が明らかにされているが、それによれば、その分子量
は約８万７千で、７回膜貫通型のレセプターであり、細
胞外ドメインの分子量は約４万５千である。
ｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ；以下、甲状腺刺激ホルモン受容体をＴＳＨ
Ｒと略記する）は、甲状腺刺激ホルモン（Ｔｙｒｏｉｄ
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ；以下、Ｔ
ＳＨと略記する）の受容体であり、脳下垂体から分泌さ
れたＴＳＨが甲状腺ろ胞細胞膜上にあるＴＳＨＲに結合
すると、甲状腺は代謝機能の調節ホルモンであるＴ３及
びＴ４を分泌する。ヒトＴＳＨＲの構造等については詳
細が明らかにされているが、それによれば、その分子量
は約８万７千で、７回膜貫通型のレセプターであり、細
胞外ドメインの分子量は約４万５千である。
【０００３】バゼドウ氏病は、甲状腺ホルモンの生成、
分泌の亢進による甲状腺機能亢進症である。その原因の
一つは、甲状腺ホルモンの分泌を促す刺激物質が血清中
に存在することにある。これまでの研究により、バゼド
ウ氏病患者の血清中には、甲状腺成分に対する自己抗体
が存在し、これが甲状腺ホルモンの生成、分泌を促し、
最終的に甲状腺組織の崩壊を引き起こすことが明らかに
なっている。
分泌の亢進による甲状腺機能亢進症である。その原因の
一つは、甲状腺ホルモンの分泌を促す刺激物質が血清中
に存在することにある。これまでの研究により、バゼド
ウ氏病患者の血清中には、甲状腺成分に対する自己抗体
が存在し、これが甲状腺ホルモンの生成、分泌を促し、
最終的に甲状腺組織の崩壊を引き起こすことが明らかに
なっている。
【０００４】バゼドウ氏病に代表される甲状腺自己免疫
疾患を診断し、早期治療を実施するための試薬として、
例えば甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロ
ブリン（Ｔｇ）そしてＴＳＨＲ等に対する自己抗体を測
定する試薬が知られている。抗ＴＳＨＲ自己抗体は、前
記疾患を伴う種々の疾患に強く関与することが知られて
いることから、前記試薬の中でも、ＴＳＨＲに対する自
己抗体測定用の試薬は重要である。
疾患を診断し、早期治療を実施するための試薬として、
例えば甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロ
ブリン（Ｔｇ）そしてＴＳＨＲ等に対する自己抗体を測
定する試薬が知られている。抗ＴＳＨＲ自己抗体は、前
記疾患を伴う種々の疾患に強く関与することが知られて
いることから、前記試薬の中でも、ＴＳＨＲに対する自
己抗体測定用の試薬は重要である。
【０００５】従来から市販されている抗ＴＳＨＲ自己抗
体測定用の試薬は、スミスら（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７４、４０５−４２０、１９８１
年及びＥｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、９、１０６−１２０、
１９８８年）により提案された方法を用いたものであ
る。これら試薬では、125Ｉで標識したウシＴＳＨと患
者血清中の抗ＴＳＨＲ自己抗体を、ブタの甲状腺膜画分
中のＴＳＨＲに競合的に結合させることにより、当該患
者血清中の抗ＴＳＨＲ自己抗体の存在や存在量を測定す
るものである。
体測定用の試薬は、スミスら（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７４、４０５−４２０、１９８１
年及びＥｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、９、１０６−１２０、
１９８８年）により提案された方法を用いたものであ
る。これら試薬では、125Ｉで標識したウシＴＳＨと患
者血清中の抗ＴＳＨＲ自己抗体を、ブタの甲状腺膜画分
中のＴＳＨＲに競合的に結合させることにより、当該患
者血清中の抗ＴＳＨＲ自己抗体の存在や存在量を測定す
るものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来市販されている抗
ＴＳＨＲ自己抗体測定用の試薬では、125Ｉという放射
性同位元素が標識物質として使用されているため、保存
条件や実施条件等、試薬の取扱いが面倒である、測定後
の廃液までも厳密に管理しなければならない、等の課題
がある。また、ブタの甲状腺膜画分中のＴＳＨＲを必須
の成分とするため、工業的な量産が困難であるという課
題もある。更には、ブタの甲状腺膜画分中のＴＳＨＲと
測定対象物であるヒトの抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性
が、ヒトのＴＳＨＲとヒトの抗ＴＳＨＲ自己抗体との反
応性と同一ではない、という課題もある。
ＴＳＨＲ自己抗体測定用の試薬では、125Ｉという放射
性同位元素が標識物質として使用されているため、保存
条件や実施条件等、試薬の取扱いが面倒である、測定後
の廃液までも厳密に管理しなければならない、等の課題
がある。また、ブタの甲状腺膜画分中のＴＳＨＲを必須
の成分とするため、工業的な量産が困難であるという課
題もある。更には、ブタの甲状腺膜画分中のＴＳＨＲと
測定対象物であるヒトの抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性
が、ヒトのＴＳＨＲとヒトの抗ＴＳＨＲ自己抗体との反
応性と同一ではない、という課題もある。
【０００７】近年になって、ヒトＴＳＨＲ遺伝子を含む
発現ベクターを用いてＣＨＯ細胞やミエローマ細胞を形
質転換し、これら細胞を培養することでヒトＴＳＨＲを
工業的に生産する試みが報告されている。しかしなが
ら、これまでのところ大量のヒトＴＳＨＲを生産したと
の報告は成されておらず、前記したような、高感度検出
が可能な放射性同位元素を標識物質として用いる測定試
薬には十分であっても、かかる測定試薬が内包する課題
を解決すべく、例えば酵素等を標識物質として用いよう
とするには量的に不十分である、という課題があった。
また一方では、大腸菌を宿主としてヒトＴＳＨＲを発現
する試みも成されてきたが、大腸菌が生産するヒトＴＨ
ＳＲでは反応性が悪く、抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定用試
薬に使用するのが困難であるという課題がある。
発現ベクターを用いてＣＨＯ細胞やミエローマ細胞を形
質転換し、これら細胞を培養することでヒトＴＳＨＲを
工業的に生産する試みが報告されている。しかしなが
ら、これまでのところ大量のヒトＴＳＨＲを生産したと
の報告は成されておらず、前記したような、高感度検出
が可能な放射性同位元素を標識物質として用いる測定試
薬には十分であっても、かかる測定試薬が内包する課題
を解決すべく、例えば酵素等を標識物質として用いよう
とするには量的に不十分である、という課題があった。
また一方では、大腸菌を宿主としてヒトＴＳＨＲを発現
する試みも成されてきたが、大腸菌が生産するヒトＴＨ
ＳＲでは反応性が悪く、抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定用試
薬に使用するのが困難であるという課題がある。
【０００８】一般に、放射性同位元素に代え、感度は低
いものの取扱いの簡便な酵素等を標識物質として使用
し、かつ、放射性同位元素を標識物質として用いた場合
と同等の感度を得るためには、抗ＴＳＨＲ自己抗体との
反応性が高いＴＳＨＲを、最低でも１ｍｇのオーダーで
製造できなければならない、と言われている。
いものの取扱いの簡便な酵素等を標識物質として使用
し、かつ、放射性同位元素を標識物質として用いた場合
と同等の感度を得るためには、抗ＴＳＨＲ自己抗体との
反応性が高いＴＳＨＲを、最低でも１ｍｇのオーダーで
製造できなければならない、と言われている。
【０００９】そこで本発明の目的は、抗ＴＳＨＲ自己抗
体との反応性に優れたヒトＴＳＨＲを、従来以上に大量
に製造することにより、放射性同位元素に代えて酵素等
を標識物質として使用し得る抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定
試薬を実現することにある。
体との反応性に優れたヒトＴＳＨＲを、従来以上に大量
に製造することにより、放射性同位元素に代えて酵素等
を標識物質として使用し得る抗ＴＳＨＲ自己抗体の測定
試薬を実現することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、前記目的を達
成するために成されたものであり、ピキア酵母を宿主と
して用いることを特徴とする、組換え甲状腺刺激ホルモ
ン受容体の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明
する。
成するために成されたものであり、ピキア酵母を宿主と
して用いることを特徴とする、組換え甲状腺刺激ホルモ
ン受容体の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明
する。
【００１１】天然のＴＳＨＲでは、その細胞外領域に糖
鎖が結合し、抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性に大きな影
響を与えている。そこで本発明は、外来遺伝子の発現に
際し、発現蛋白質に対してヒト型糖鎖と類似した糖鎖を
付与でき、しかも外来遺伝子産物の発現量が大きいピキ
ア酵母を宿主として利用することにより完成したもので
ある。
鎖が結合し、抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性に大きな影
響を与えている。そこで本発明は、外来遺伝子の発現に
際し、発現蛋白質に対してヒト型糖鎖と類似した糖鎖を
付与でき、しかも外来遺伝子産物の発現量が大きいピキ
ア酵母を宿主として利用することにより完成したもので
ある。
【００１２】ピキア酵母に導入するＴＳＨＲ遺伝子は、
ＴＳＨＲの全長をコードするもののほか、その一部に変
異が導入されたＴＳＨＲをコードするものであっても良
い。また全長のＴＳＨＲをコードするものに加え、その
一部分をコードするものであっても良い。一部分をコー
ドするものとしては、例えば、ＴＳＨＲの膜外領域部分
をコードする遺伝子が例示できる。
ＴＳＨＲの全長をコードするもののほか、その一部に変
異が導入されたＴＳＨＲをコードするものであっても良
い。また全長のＴＳＨＲをコードするものに加え、その
一部分をコードするものであっても良い。一部分をコー
ドするものとしては、例えば、ＴＳＨＲの膜外領域部分
をコードする遺伝子が例示できる。
【００１３】ＴＳＨＲ遺伝子は、ピキア酵母における発
現量が特に顕著な他の蛋白質、例えばヒト血清アルブミ
ンやウサギ血清アルブミン等、をコードする遺伝子の
３’末端に結合して使用することもできる。この場合に
は、製造されたＴＳＨＲの回収を容易にする目的で、当
該他の蛋白質をコードする遺伝子とＴＳＨＲをコードす
る遺伝子を直接結合するのではなく、任意の蛋白質分解
酵素により特異的に分解されるアミノ酸残基配列をコー
ドする遺伝子を介して結合することが好ましい。この場
合、当該他の蛋白質をコードする遺伝子は、当該他の蛋
白質の全てをコードしている必要はない。例えば後の実
施例で示したように、ウサギ血清アルブミンを使用する
場合には、その９５％程度をコードする遺伝子を使用す
ることもできる。
現量が特に顕著な他の蛋白質、例えばヒト血清アルブミ
ンやウサギ血清アルブミン等、をコードする遺伝子の
３’末端に結合して使用することもできる。この場合に
は、製造されたＴＳＨＲの回収を容易にする目的で、当
該他の蛋白質をコードする遺伝子とＴＳＨＲをコードす
る遺伝子を直接結合するのではなく、任意の蛋白質分解
酵素により特異的に分解されるアミノ酸残基配列をコー
ドする遺伝子を介して結合することが好ましい。この場
合、当該他の蛋白質をコードする遺伝子は、当該他の蛋
白質の全てをコードしている必要はない。例えば後の実
施例で示したように、ウサギ血清アルブミンを使用する
場合には、その９５％程度をコードする遺伝子を使用す
ることもできる。
【００１４】また更に、ピキア酵母において高発現する
シグナルペプチドをコードする遺伝子の３’末端にＴＳ
ＨＲをコードする遺伝子を結合することもできる。
シグナルペプチドをコードする遺伝子の３’末端にＴＳ
ＨＲをコードする遺伝子を結合することもできる。
【００１５】ＴＳＨＲ遺伝子の３’末端には、ターミネ
ータ等を配置して、当該部分でｍＲＮＡへの転写が終了
するようにする。以上のような遺伝子を適当な発現ベク
ターに導入した後、該ベクターを用いてピキア酵母を形
質転換するが、発現ベクターとしては、該酵母中で増殖
し、かつ、該酵母中で外来遺伝子を発現せしめることが
可能なものであれば特に制限はない。好ましくは、形質
転換酵母を選択可能とする指標となる遺伝子を有してい
ると良い。前記遺伝子を導入するためにはアルコールオ
キシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列を有しているこ
とが好ましく例示でき、形質転換酵母の選択のための指
標としてはヒスチジン合成遺伝子を有していることが好
ましく例示でき、前記遺伝子を発現せしめるためにはア
ルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列を有す
ることが好ましく例示できる。このような好ましい発現
ベクターの一例として、市販のベクター（ｐＰＩＣ９、
インビトロジェン社製）を例示することができる。
ータ等を配置して、当該部分でｍＲＮＡへの転写が終了
するようにする。以上のような遺伝子を適当な発現ベク
ターに導入した後、該ベクターを用いてピキア酵母を形
質転換するが、発現ベクターとしては、該酵母中で増殖
し、かつ、該酵母中で外来遺伝子を発現せしめることが
可能なものであれば特に制限はない。好ましくは、形質
転換酵母を選択可能とする指標となる遺伝子を有してい
ると良い。前記遺伝子を導入するためにはアルコールオ
キシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列を有しているこ
とが好ましく例示でき、形質転換酵母の選択のための指
標としてはヒスチジン合成遺伝子を有していることが好
ましく例示でき、前記遺伝子を発現せしめるためにはア
ルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列を有す
ることが好ましく例示できる。このような好ましい発現
ベクターの一例として、市販のベクター（ｐＰＩＣ９、
インビトロジェン社製）を例示することができる。
【００１６】宿主として使用する酵母は、ピキア酵母で
あれば特に制限はない。中でも、メタノールを唯一の炭
素源として生育できる酵母であり、ＣＨＯ細胞のような
動物細胞と比較して経済的に培養できるという利点を有
するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ）種の酵母を使用することが特に好ましい。
あれば特に制限はない。中でも、メタノールを唯一の炭
素源として生育できる酵母であり、ＣＨＯ細胞のような
動物細胞と比較して経済的に培養できるという利点を有
するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ）種の酵母を使用することが特に好ましい。
【００１７】形質転換操作は、リチウムクロライド法、
スフェロプラスト法、エレクトロポーション法等の通常
の方法に従うことができる。操作を終えた酵母は、ヒス
チジン合成遺伝子の働き等を指標として形質転換された
ものとそうでないものを分けた後、好ましくは３０℃以
下で培養することによりＴＳＨＲを発現させることが可
能となる。形質転換されたピキア・パストリス種の酵母
を培養する操作は、ジャーファーメンターを用いる通常
の操作のほか、本出願人による特許出願（特願平９−３
５９８３８号、特願平１０−１４７８号）に記載された
方法を採用することができる。培養操作を継続する中
で、発現用ベクター中の遺伝子が発現し、培養液中にＴ
ＳＨＲが蓄積される。培養液から発現された融合蛋白質
を取得するには、通常の蛋白質の分離・精製方法を適用
すれば良いが、処理能力の高さや操作に要する時間が短
いという利点を有することから、ゲル濾過、疎水クロマ
ト等の複数種の液体クロマトグラフィー操作を組み合わ
せることが特に好ましい。
スフェロプラスト法、エレクトロポーション法等の通常
の方法に従うことができる。操作を終えた酵母は、ヒス
チジン合成遺伝子の働き等を指標として形質転換された
ものとそうでないものを分けた後、好ましくは３０℃以
下で培養することによりＴＳＨＲを発現させることが可
能となる。形質転換されたピキア・パストリス種の酵母
を培養する操作は、ジャーファーメンターを用いる通常
の操作のほか、本出願人による特許出願（特願平９−３
５９８３８号、特願平１０−１４７８号）に記載された
方法を採用することができる。培養操作を継続する中
で、発現用ベクター中の遺伝子が発現し、培養液中にＴ
ＳＨＲが蓄積される。培養液から発現された融合蛋白質
を取得するには、通常の蛋白質の分離・精製方法を適用
すれば良いが、処理能力の高さや操作に要する時間が短
いという利点を有することから、ゲル濾過、疎水クロマ
ト等の複数種の液体クロマトグラフィー操作を組み合わ
せることが特に好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
るために実施例を記載するが、これら実施例は本発明の
一実施形態であり、本発明を限定するものではない。
るために実施例を記載するが、これら実施例は本発明の
一実施形態であり、本発明を限定するものではない。
【００１９】実施例１ ヒトＴＳＨＲ遺伝子の取得 ｍ−ＲＮＡの抽出、ＤＮＡの制限酵素による切断等、以
下の一連の遺伝子組換え操作はマニアティスらの方法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８２年）及びハーウィンらの方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖ
ｏｌ．１、ｐ４９、Ｏｘｆｏｒｄ １９８５年）に記載
された方法に従った。またラムダｇｔ１１ ｃＤＮＡラ
イブラリーの抗体によるスクリーニングは、市販のベク
ター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、商品名 ｌａｍｂｄａ
Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔ
ｏｒ）を用いて行った。
下の一連の遺伝子組換え操作はマニアティスらの方法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８２年）及びハーウィンらの方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖ
ｏｌ．１、ｐ４９、Ｏｘｆｏｒｄ １９８５年）に記載
された方法に従った。またラムダｇｔ１１ ｃＤＮＡラ
イブラリーの抗体によるスクリーニングは、市販のベク
ター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、商品名 ｌａｍｂｄａ
Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔ
ｏｒ）を用いて行った。
【００２０】まず、ヒト甲状腺細胞（甲状腺摘出組織）
からｍ−ＲＮＡを抽出し、ラムダｇｔ１１（クローンテ
ック社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
次に、ＴＳＨＲに対するヒト由来のモノクローナル抗体
（ＴＲＭｏ、Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６３巻、ｐ１６８３４１、
１９８８年参照）を用いて約５０万個のクローンを抽出
した。
からｍ−ＲＮＡを抽出し、ラムダｇｔ１１（クローンテ
ック社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
次に、ＴＳＨＲに対するヒト由来のモノクローナル抗体
（ＴＲＭｏ、Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６３巻、ｐ１６８３４１、
１９８８年参照）を用いて約５０万個のクローンを抽出
した。
【００２１】抽出したクローンを解析した結果、Ｒａｐ
ｏｐｏｒｔら（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６５巻、ｐ１１８
４、１９８９年）によって報告されたヒトＴＳＨＲ遺伝
子と同一の配列を有していることが確認された。
ｏｐｏｒｔら（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６５巻、ｐ１１８
４、１９８９年）によって報告されたヒトＴＳＨＲ遺伝
子と同一の配列を有していることが確認された。
【００２２】実施例２ ヒトＴＳＨＲ細胞外領域発現ベ
クターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＴＳＨＲが持つシグナルペプチドを利用しつつ、ＴＳＨ
Ｒの細胞外領域を発現するためのベクターを構築した。
クターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＴＳＨＲが持つシグナルペプチドを利用しつつ、ＴＳＨ
Ｒの細胞外領域を発現するためのベクターを構築した。
【００２３】まず、ＴＳＨＲの全長をコードするｃＤＮ
Ａを市販のベクター（宝酒造（株）製、ｐＵＣ１１８）
にクローニングした後、ＴＳＨＲの細胞外領域末端に終
始コドンを、更に該終始コドンの直ぐ下流にＥｃｏＲＩ
サイトを導入するために、配列番号１のオリゴマーを合
成し、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、商品名ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅ
ｍ）を用いて導入した。
Ａを市販のベクター（宝酒造（株）製、ｐＵＣ１１８）
にクローニングした後、ＴＳＨＲの細胞外領域末端に終
始コドンを、更に該終始コドンの直ぐ下流にＥｃｏＲＩ
サイトを導入するために、配列番号１のオリゴマーを合
成し、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、商品名ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅ
ｍ）を用いて導入した。
【００２４】オリゴマーの導入後、ベクターをＥｃｏＲ
Ｉで処理して断片を取り出し、市販のピキア発現用のベ
クター（インビトロジェン社製、商品名 ｐＨＩＬ Ｎ
１）のＥｃｏＲＩサイトに導入してＴＳＨＲをピキア酵
母で発現するための発現ベクターｐＨＩＬ Ｎ１−ＴＳ
ＨＲを構築した。
Ｉで処理して断片を取り出し、市販のピキア発現用のベ
クター（インビトロジェン社製、商品名 ｐＨＩＬ Ｎ
１）のＥｃｏＲＩサイトに導入してＴＳＨＲをピキア酵
母で発現するための発現ベクターｐＨＩＬ Ｎ１−ＴＳ
ＨＲを構築した。
【００２５】実施例３ ウサギ血清アルブミン（ＲＳ
Ａ）とヒトＴＳＨＲ細胞外領域の融合蛋白質を発現する
ための発現ベクターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＲＳＡのＮ末端１番目のメチオニンから５８２番目のシ
ステインをコードする遺伝子に続き、ＴＳＨＲのＮ末端
２２番目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコー
ドする遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調
製した。
Ａ）とヒトＴＳＨＲ細胞外領域の融合蛋白質を発現する
ための発現ベクターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＲＳＡのＮ末端１番目のメチオニンから５８２番目のシ
ステインをコードする遺伝子に続き、ＴＳＨＲのＮ末端
２２番目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコー
ドする遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調
製した。
【００２６】まず、ＴＳＨＲの全長をコードするｃＤＮ
Ａを市販のベクター（宝酒造（株）製、ｐＵＣ１１８）
にクローニングした後、ＴＳＨＲのシグナルペプチドの
下流にＥｃｏＲＶサイトを、ＴＳＨＲの細胞外領域末端
に終止コドンを、更に該終止コドンの直ぐ下流にＥｃｏ
ＲＩサイトを導入するために、配列番号２及び配列番号
３のオリゴマーを合成し、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製、商品名 ｉｎｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて導入し、ｐＵＣＴＳＨＲ
−ｅｃｄ２を得た。
Ａを市販のベクター（宝酒造（株）製、ｐＵＣ１１８）
にクローニングした後、ＴＳＨＲのシグナルペプチドの
下流にＥｃｏＲＶサイトを、ＴＳＨＲの細胞外領域末端
に終止コドンを、更に該終止コドンの直ぐ下流にＥｃｏ
ＲＩサイトを導入するために、配列番号２及び配列番号
３のオリゴマーを合成し、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製、商品名 ｉｎｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて導入し、ｐＵＣＴＳＨＲ
−ｅｃｄ２を得た。
【００２７】次に、ＲＳＡをピキア酵母で発現するため
のベクター（ｐＹＲＳＡ３；柿谷及び金子ら、東ソー研
究報告３６、３巻、１９９２年）をＰｓｔＩで切断し、
クレノウ酵素で平滑末端化してＲＳＡをコードする遺伝
子を含む断片を得た。
のベクター（ｐＹＲＳＡ３；柿谷及び金子ら、東ソー研
究報告３６、３巻、１９９２年）をＰｓｔＩで切断し、
クレノウ酵素で平滑末端化してＲＳＡをコードする遺伝
子を含む断片を得た。
【００２８】ＲＳＡをコードする遺伝子断片を、Ｅｃｏ
ＲＶで処理したｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２に導入し、Ｒ
ＳＡ遺伝子の下流にＴＳＨＲの細胞外領域をコードする
遺伝子が結合されたベクターを得た。このベクターをＳ
ｍａＩ及びＥｃｏＲＩで処理した得たフラグメントを、
前記ｐＹＲＳＡ３をＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで切断して
得たベクターに結合させ、ＲＳＡとＴＳＨＲの融合蛋白
質をピキア酵母で発現するための発現ベクターＲＳ１−
ＴＳＨＲを調製した。
ＲＶで処理したｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２に導入し、Ｒ
ＳＡ遺伝子の下流にＴＳＨＲの細胞外領域をコードする
遺伝子が結合されたベクターを得た。このベクターをＳ
ｍａＩ及びＥｃｏＲＩで処理した得たフラグメントを、
前記ｐＹＲＳＡ３をＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで切断して
得たベクターに結合させ、ＲＳＡとＴＳＨＲの融合蛋白
質をピキア酵母で発現するための発現ベクターＲＳ１−
ＴＳＨＲを調製した。
【００２９】実施例４ ＲＳＡとヒトＴＳＨＲ細胞膜領
域の融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＲＳＡのＮ末端１番目のメチオニンから５７番目のリジ
ンをコードする遺伝子に続き、ＴＳＨＲのＮ末端２２番
目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコードする
遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調製し
た。
域の融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
ＲＳＡのＮ末端１番目のメチオニンから５７番目のリジ
ンをコードする遺伝子に続き、ＴＳＨＲのＮ末端２２番
目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコードする
遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調製し
た。
【００３０】まず、前記ベクターｐＹＲＳＡ３をＢｓｐ
１２８６Ｉで切断し、クレノウ酵素で平滑末端化してＲ
ＳＡのＮ末端付近をコードする約２３０ｂｐの断片（以
下、ＲＳ２断片とする）を得た。これを、ＥｃｏＲＶで
切断した前記ベクターｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２に結合
させ、ＲＳ２断片の下流にＴＳＨＲ細胞外領域をコード
する遺伝子が結合した遺伝子を含むベクターを調製し
た。
１２８６Ｉで切断し、クレノウ酵素で平滑末端化してＲ
ＳＡのＮ末端付近をコードする約２３０ｂｐの断片（以
下、ＲＳ２断片とする）を得た。これを、ＥｃｏＲＶで
切断した前記ベクターｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２に結合
させ、ＲＳ２断片の下流にＴＳＨＲ細胞外領域をコード
する遺伝子が結合した遺伝子を含むベクターを調製し
た。
【００３１】このベクターをＮｓｐ７５２４ＶとＥｃｏ
ＲＩで処理してＲＳ２断片の下流にＴＳＨＲ細胞外領域
をコードする遺伝子が結合した断片を回収し、 Ｎｓｐ
７５２４ＶとＥｃｏＲＩ前記ピキア酵母発現用ベクター
ｐＨＩＬ Ｎ１に導入し、ＲＳＡとＴＳＨＲの融合蛋白
質をピキア酵母で発現するための発現ベクターＲＳ２−
ＴＳＨＲを調製した。
ＲＩで処理してＲＳ２断片の下流にＴＳＨＲ細胞外領域
をコードする遺伝子が結合した断片を回収し、 Ｎｓｐ
７５２４ＶとＥｃｏＲＩ前記ピキア酵母発現用ベクター
ｐＨＩＬ Ｎ１に導入し、ＲＳＡとＴＳＨＲの融合蛋白
質をピキア酵母で発現するための発現ベクターＲＳ２−
ＴＳＨＲを調製した。
【００３２】実施例５ αファクターのシグナルペプチ
ドを用いたヒトＴＳＨＲ細胞外領域発現ベクターの調製 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
αファクターのシグナル配列の下流にＴＳＨＲのＮ末端
２２番目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコー
ドする遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調
製した。
ドを用いたヒトＴＳＨＲ細胞外領域発現ベクターの調製 実施例１で抽出したヒトＴＳＨＲ遺伝子を材料として、
αファクターのシグナル配列の下流にＴＳＨＲのＮ末端
２２番目のメチオニンから４１４番目のチロシンをコー
ドする遺伝子が結合した遺伝子を含む発現ベクターを調
製した。
【００３３】αファクターのシグナル配列を有する市販
のピキア酵母発現ベクター（インビトロジェン社製、商
品名 ｐＰＩＣ９Ｋ）をＳｎａＢＩとＥｃｏＲＩで切断
し、前記ベクターｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２をＥｃｏＲ
Ｖ及びＥｃｏＲＩで処理して得た断片を導入し、ｐＰＩ
Ｃ９Ｋ−ＴＳＨＲを得た。
のピキア酵母発現ベクター（インビトロジェン社製、商
品名 ｐＰＩＣ９Ｋ）をＳｎａＢＩとＥｃｏＲＩで切断
し、前記ベクターｐＵＣＴＳＨＲ−ｅｃｄ２をＥｃｏＲ
Ｖ及びＥｃｏＲＩで処理して得た断片を導入し、ｐＰＩ
Ｃ９Ｋ−ＴＳＨＲを得た。
【００３４】実施例６形質転換体のスクリーニング ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）ＧＳ１１５株（インビトロジェン社製）から、市販
のキット（インビトロジェン社製、商品名 ＥａｓｙＣ
ｏｍｐ． Ｔｒａｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用
いてコンピタントセルを調製し、線状化したｐＨＩＬ
Ｎ１−ＴＳＨＲ、ＲＳ１−ＴＳＨＲ、ＲＳ２−ＴＳＨＲ
又はｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＳＨＲを導入した。形質転換菌
は、最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った
形質転換菌を選別した。また比較のため、前記発現ベク
ターｐＨＩＬ Ｎ１で形質転換した酵母についても同様
の操作を行った。
ｓ）ＧＳ１１５株（インビトロジェン社製）から、市販
のキット（インビトロジェン社製、商品名 ＥａｓｙＣ
ｏｍｐ． Ｔｒａｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用
いてコンピタントセルを調製し、線状化したｐＨＩＬ
Ｎ１−ＴＳＨＲ、ＲＳ１−ＴＳＨＲ、ＲＳ２−ＴＳＨＲ
又はｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＳＨＲを導入した。形質転換菌
は、最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った
形質転換菌を選別した。また比較のため、前記発現ベク
ターｐＨＩＬ Ｎ１で形質転換した酵母についても同様
の操作を行った。
【００３５】実施例７ 発現の確認 実施例６で取得した酵母を、それぞれ試験管を用いて５
％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含むＢＭＧＹ培地（１％
（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２ｇ（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．
３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００ｍＭリ
ン酸カルシウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセ
ロール）３ｍｌ中で、３０℃で１２０時間培養し、遠心
により上清を取得した。
％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含むＢＭＧＹ培地（１％
（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２ｇ（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．
３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００ｍＭリ
ン酸カルシウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセ
ロール）３ｍｌ中で、３０℃で１２０時間培養し、遠心
により上清を取得した。
【００３６】培養上清は１０倍に濃縮した。酵母はＯＤ
１００となるようにＢｒｅａｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ
（破砕緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．２ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）、１ｍＭ２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙ
ｌｉｓｏｔｈｉｏｕｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ａ
ＥＴ）、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）で希釈した後、同体積のガラスビー
ズを添加して４℃で３０秒攪拌後攪拌を３０秒停止する
という操作を８回繰り返して細胞を破砕し、遠心分離し
て上清のみを回収した。
１００となるようにＢｒｅａｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ
（破砕緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．２ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）、１ｍＭ２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙ
ｌｉｓｏｔｈｉｏｕｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ａ
ＥＴ）、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）で希釈した後、同体積のガラスビー
ズを添加して４℃で３０秒攪拌後攪拌を３０秒停止する
という操作を８回繰り返して細胞を破砕し、遠心分離し
て上清のみを回収した。
【００３７】培養上清及び細胞破砕物上清をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに供し、その後、ウエスタンブロッティングを行
い、抗ＴＳＨＲ抗体を用いてＴＳＨＲの発現状況を観察
した。
ＡＧＥに供し、その後、ウエスタンブロッティングを行
い、抗ＴＳＨＲ抗体を用いてＴＳＨＲの発現状況を観察
した。
【００３８】細胞破砕物についての結果を図１に示す。
図１から明らかなように、本発明の４種類全ての形質転
換酵母において、細胞膜外領域のみからなる可溶性ＴＳ
ＨＲが菌体内に蓄積されていることが確認された。また
その分子量から、発現されたＴＳＨＲは切断されておら
ず、細胞膜外領域を含むものであることが分かる。
図１から明らかなように、本発明の４種類全ての形質転
換酵母において、細胞膜外領域のみからなる可溶性ＴＳ
ＨＲが菌体内に蓄積されていることが確認された。また
その分子量から、発現されたＴＳＨＲは切断されておら
ず、細胞膜外領域を含むものであることが分かる。
【００３９】なお、培養上清には可溶性ＴＳＨＲの分子
量に該当する産物は存在していなかった。
量に該当する産物は存在していなかった。
【００４０】
【発明の効果】本発明の発現ベクターによれば、ヒトＴ
ＳＨＲを大量に製造することが可能である。しかも製造
されるヒトＴＳＨＲは、ヒト血清中に見いだされる抗Ｔ
ＳＨＲ自己抗体との反応性において、ブタ甲状腺膜画分
中のＴＳＨＲや大腸菌で製造されたヒトＴＳＨＲに比較
して優れた反応性を示すものである。
ＳＨＲを大量に製造することが可能である。しかも製造
されるヒトＴＳＨＲは、ヒト血清中に見いだされる抗Ｔ
ＳＨＲ自己抗体との反応性において、ブタ甲状腺膜画分
中のＴＳＨＲや大腸菌で製造されたヒトＴＳＨＲに比較
して優れた反応性を示すものである。
【００４１】このように、大量のヒトＴＳＨＲの製造を
可能とすることにより、放射性同位元素を標識物質とし
て使用しない、抗ＴＳＨＲ自己抗体を測定するための試
薬を提供することが初めて可能となる。かかる試薬は、
放射性同位元素を標識物質として使用する試薬と比較し
て取扱いが容易である等の効果を有する。また前記の通
り、抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性に優れたヒトＴＳＨ
Ｒを提供することにより、ブタ甲状腺膜画分中のＴＳＨ
Ｒや大腸菌で製造されたヒトＴＳＨＲを用いる試薬と比
較して、信頼性の高い試薬を提供することも可能とな
る。
可能とすることにより、放射性同位元素を標識物質とし
て使用しない、抗ＴＳＨＲ自己抗体を測定するための試
薬を提供することが初めて可能となる。かかる試薬は、
放射性同位元素を標識物質として使用する試薬と比較し
て取扱いが容易である等の効果を有する。また前記の通
り、抗ＴＳＨＲ自己抗体との反応性に優れたヒトＴＳＨ
Ｒを提供することにより、ブタ甲状腺膜画分中のＴＳＨ
Ｒや大腸菌で製造されたヒトＴＳＨＲを用いる試薬と比
較して、信頼性の高い試薬を提供することも可能とな
る。
【００４２】またヒトＴＳＨＲの大量製造を可能とする
本発明は、大量のヒトＴＳＨＲを要求する、ポリクロー
ナル及びモノクローナル抗ヒトＴＳＨＲ抗体の製造も容
易にするものである。
本発明は、大量のヒトＴＳＨＲを要求する、ポリクロー
ナル及びモノクローナル抗ヒトＴＳＨＲ抗体の製造も容
易にするものである。
【００４３】
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法 <130> ＰＡ２１０−９６６５ <160> 3 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> 変異導入用オリゴマー <400> 1 caattctcag gaattcttag tagcccatta tgtc 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> 変異導入用オリゴマー <400> 2 caattctcag gaattcttag tagcccatta tgtc 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> 変異導入用オリゴマー <400> 3 gacgaacacc ccatgatatc cgcccaggtc cctg 34
【図１】図１は、実施例７の結果を示すものである。図
中第１のレーンは、比較のために用いたｐＨＩＬＮ１で
形質転換した酵母についての、第２のレーンはｐＨＩＬ
Ｎ１−ＴＳＨＲで形質転換した酵母についての、第３の
レーンはＲＳ１−ＴＳＨＲで形質転換した酵母について
の、第４のレーンはＲＳ２−ＴＳＨＲで形質転換した酵
母についての、そして第５のレーンは、 ｐＰＩＣ９Ｋ
−ＴＳＨＲで形質転換した酵母についての結果を、それ
ぞれ示すものである。図中左の数字は、別途ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに供した分子量マーカーから算出した分子量を示
し、図中矢印は発現されたヒトＴＳＨＲ（又はヒトＴＳ
ＨＲとＲＡＳの融合蛋白質）を示すものである。
中第１のレーンは、比較のために用いたｐＨＩＬＮ１で
形質転換した酵母についての、第２のレーンはｐＨＩＬ
Ｎ１−ＴＳＨＲで形質転換した酵母についての、第３の
レーンはＲＳ１−ＴＳＨＲで形質転換した酵母について
の、第４のレーンはＲＳ２−ＴＳＨＲで形質転換した酵
母についての、そして第５のレーンは、 ｐＰＩＣ９Ｋ
−ＴＳＨＲで形質転換した酵母についての結果を、それ
ぞれ示すものである。図中左の数字は、別途ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに供した分子量マーカーから算出した分子量を示
し、図中矢印は発現されたヒトＴＳＨＲ（又はヒトＴＳ
ＨＲとＲＡＳの融合蛋白質）を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA03 DA12 EA04 FA18 GA11 HA15 4B064 AG20 CA06 CA19 CC24 DA13 4B065 AA77X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA20 CA40 DA50 EA50 FA74 GA01 GA15
Claims (1)
- 【請求項１】ピキア酵母を宿主として用いることを特徴
とする、組換え甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349756A JP2000166593A (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349756A JP2000166593A (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000166593A true JP2000166593A (ja) | 2000-06-20 |
Family
ID=18405898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10349756A Pending JP2000166593A (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | ピキア酵母による甲状腺刺激ホルモン受容体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000166593A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011136911A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-14 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターの安定化方法 |
-
1998
- 1998-12-09 JP JP10349756A patent/JP2000166593A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011136911A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-14 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターの安定化方法 |
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