JP2000166542A - ＩκＢまたはβカテニンのユビキチン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボックスタンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトを含む高等生物の生理機能にとって重要
な分子であるIκBやβカテニンのユビキチン化の分子メ
カニズムを解明し、該ユビキチン化を特異的に司る酵素
ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体、特にそのＦ−ボック
スタンパクを提供する。 【解決手段】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ1タンパク、
およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ４０リピートモチー
フを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合
体）から構成され、ＩκＢまたはβカテニンのユビキチ
ン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−
ボックスモチーフタンパクであって、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列を有するタンパク；該ユビキチンリ
ガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボックスタンパクであって、
配列番号：２または配列番号：３のアミノ酸配列を有す
るタンパク；ならびに、それらのＦ−ボックスモチーフ
タンパクまたはＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝
子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩκＢまたはβカ
テニンのユビキチン化を促進する酵素に関し、特に、Ｓ
ＣＦ複合体から構成されるユビキチンリガーゼのＦ−ボ
ックスタンパクに関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質の発現量は合成速度と分解速
度によって決定されている。特に迅速なレスボンスの求
められるタンパク質はユビキチン−プロテアソーム系と
いう分解システムを用いて破壊されることが知られてい
る。このシステムは分解すべき標的タンパク質にユビキ
チンという分子を多数結合させ（ポリユビキチン化また
は単にユビキチン化）、ユビキチン化されたタンパク質
はプロテアソームという巨大なタンパク質分解酵素複合
体によって破壊するというものである。つまりユビキチ
ン化とは分解すべきタンパク質にユビキチンという「荷
札」をつけて分解工場へ送るようなものである。このユ
ビキチン化はいろいろなタンパク質で行われていること
がわかっているが、高等生物において特に有名なのはＩ
κＢとβカテニンという２つの分子である。

【０００３】ＩκＢは、ＮＦ−κＢ（nuclear factor k
appa B）という転写因子に結合してその機能を阻害する
分子で、ＩκＢがユビキチン・プロテアソーム系で破壊
されるとＮＦ−κＢが開放されて活性化される。このＮ
Ｆ−κＢという分子は炎症性サイトカインによって活性
化される転写因子であり、炎症の発生メカニズムにとっ
て非常に重要であることが示唆されている。炎症性サイ
トカインからのシグナルはＩκＢをユビキチン化するこ
とがわかっているが、その分子メカニズムは明らかでは
ない。

【０００４】一方、βカテニン（β−catenin）は、多
くの大腸癌で異常な貯留が認められている分子である。
家族性に大腸に多数のポリープ・癌を発生する家族性大
腸腺腫症という遺伝病の原因遺伝子はＡＰＣ(adenomato
us polyposis coli)という分子をコードすることが知ら
れているが、このＡＰＣ分子はβカテニンのユビキチン
化を促進することが数年前に明らかとなった。しかしな
がらβカテニンをユビキチン化する酵素の本体は現在ま
で全く謎であった。

【０００５】以上のように高等生物においてユビキチン
化という現象は医学、生物学的に非常に重要であること
は容易に推察できるが、ユビキチン化反応については不
明の点が多い。

【０００６】タンパク質のユビキチン化は、一般に、一
連の酵素群、すなわち、ユビキチン活性化酵素
（Ｅ_１）、ユビキチン複合化酵素（Ｅ_２）およびユビキ
チンリガーゼ（Ｅ_３）によって進み、これらの酵素によ
ってユビキチン化されたタンパク質が２６Ｓプロテアソ
ームにより分解されるものと解されている。このうち、
ユビキチンリガーゼ（Ｅ_３）が特定のタンパク質をユビ
キチン化する特異性に最も関与すると考えられている
が、高等生物におけるユビキチンリガーゼの構造や機能
の詳細は殆ど不明であるのが現状である。

【０００７】最近、酵母のような下等生物における研究
を通じて、ＳＣＦと称される複合体から構成される新し
いタイプのユビキチンリガーゼ（Ｅ_３）が見出されてい
る。このＳＣＦ複合体タイプのユビキチンリガーゼ（以
下、ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体と記す）は、３量
体、すなわち、Ｓｋｐ１と称されるサブユニットタンパ
ク、Ｃｕｌ１（または、その上位概念のCullin）と称さ
れるサブユニットタンパク、およびＦ−ボックス（Ｆ−
box）と称されるサブユニットタンパクから構成される
複合酵素であり、各サブユニットタンパクの頭文字をと
ってＳＣＦと名づけられた。

【０００８】このうち、Ｓｋｐ１タンパクおよびＣｕｌ
１タンパクの機能は未だ完全には明らかでないが、その
アミノ酸配列は保存され、どのような基質に対しても一
定である。一方、Ｆ−ボックスタンパクは、基質によっ
て変化し得るものであり、ユビキチン化の対象となる標
的タンパク質に応じたＦ−ボックスタンパクが存在し、
基質特異性を決定するものと考えられている。

【０００９】このＦ−ボックスタンパクは、一般に、Ｆ
−ボックスと呼ばれる領域（モチーフ）と、40個程度の
アミノ酸配列の繰り返しから成るＷＤ４０リピートと呼
ばれる領域（モチーフ）またはロイシンの多いＬＲＲリ
ピートと呼ばれる領域（モチーフ）を含み、ＷＤ４０リ
ピートモチーフまたはＬＲＲリピートモチーフがリン酸
化された標的タンパク質を認識し結合するとともに、Ｆ
−ボックスモチーフがＳｋｐ１およびＣｕｌ１と結合し
て該タンパク質のユビキチン化に寄与するものと考えら
れている。

【００１０】このようなユビキチンリガーゼＳＣＦ複合
体として代表的なものは、酵母の細胞周期を停止させる
分子Siclを特異的に分解するユビキチンリガーゼであ
り、このユビキチンリガーゼはＳｋｐ１／Ｃｄｃ53／Ｃ
ｄｃ４の組み合わせから成り、Ｃｄｃ４がＦ−ボックス
タンパクとしてSiclに対する基質特異性を付与している
ものと考えられている。酵母については、このような細
胞周期に関与するタンパク質のみならず、その他の生理
機能に関与するタンパク質とそれに基質特異的なＳＣＦ
複合体が幾つか発見されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒトを
含む高等生物におけるユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体
の機能については、未だ充分に検討されていない。特
に、前述したようなＩκＢやβカテニンのようなタンパ
ク質を特異的にユビキチン化する反応のメカニズム、お
よび該反応を担う酵素の構造や機能が明らかにされれ
ば、新しい医薬の開発や癌の治療法等に対して極めて有
用な情報を提供し得るものと期待されるが、そのような
目的に目指した研究は殆ど見当たらない。

【００１２】本発明の目的は、ヒトを含む高等生物の生
理機能にとって重要な分子であるＩκＢやβカテニンの
ユビキチン化の分子メカニズムを解明し、該ユビキチン
化を特異的に司る酵素ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合
体、特にそのＦ−ボックスタンパクを提供することにあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＩκＢおよ
びβカテニンに特異的なユビキチンリガーゼＳＣＦ複合
体のＦ−ボックスタンパクの特性を解明し、本発明を導
き出し上記のごとき目的を達成したものである。

【００１４】かくして、本発明は、Ｓｋｐ１タンパク、
Ｃｕｌ１タンパク、およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ
４０リピートモチーフを含むＦ−ボックスタンパクの複
合体（ＳＣＦ複合体）から構成され、ＩκＢまたはβカ
テニンのユビキチン化を促進するユビキチンリガーゼＳ
ＣＦ複合体のＦ−ボックスモチーフタンパクであって、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク
を提供する。

【００１５】さらに、本発明は、Ｓｋｐ１タンパク、Ｃ
ｕｌ１タンパク、およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ４
０リピートモチーフを含むＦ−ボックスタンパクの複合
体（ＳＣＦ複合体）から構成され、ＩκＢまたはβカテ
ニンのユビキチン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣ
Ｆ複合体のＦ−ボックスタンパクであって、配列番号：
２または配列番号：３のアミノ酸配列を有するタンパク
を提供する。

【００１６】本発明は、さらに別の側面として、それら
の配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３の
アミノ酸配列から成るF-ボックスモチーフタンパクまた
はＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子も提供す
る。

【００１７】

【発明の実施の形態】ヒトなど高等生物におけるユビキ
チンリガーゼＳＣＦ複合体に関する知見は少ないが、最
近、ヒトのＦ−ボックス（ｈ−βＴｒＣＰ）がエイズウ
イルス（ＨＩＶ−１）由来のタンパク質Ｖｐｕの分解に
関与していることが報告されている（Margottin, F.
他、Mollec. Cell, 1, 565-574 (1998)）。本発明者ら
は、マウスのＥＳＴ（expression sequence tag）デー
タベースに基づき、Ｆ−ボックスタンパクの探索を行い
マウス由来のいくつかのＦ−ボックスタンパクの配列を
見出した。そのうちの１つ（以下、ｍ−ＦＷＤ１と記
す）は、ヒト由来のＦ−ボックスタンパク（ｈ−βＴｒ
ＣＤ）と実質的に同一であり、これらのＦ−ボックスタ
ンパク（ｍ−ＦＷＤ１またはｈ−βＴｒＣＰ）から構成
されるＳＣＦ複合体は、ＩκＢをユビキチン化し分解を
促進し、さらに、βカテニンもユビキチン化することを
見出した。

【００１８】図１および図2は、これらのＦ−ボックス
タンパクのアミノ酸配列を対比して示すものである。図
中、最上段はマウス由来のＦ−ボックスタンパク（ｍ−
ＦＷＤ１）のアミノ酸配列（明細書末尾の配列表で配列
番号：２として示すもの）、中段はヒト由来のＦ−ボッ
クスタンパク（ｈ−βＴｒＣＰ、図ではｈ−ＦＷＤ１と
記す）のアミノ酸配列（配列表で配列番号：３として示
すもの）、そして、最下段はマウス由来の別のＦ−ボッ
クスタンパク（ｍ−ＦＷＤ２と記す）のアミノ酸配列を
それぞれ示す。図中、四角で囲んだところは類似アミノ
酸を示す。ｍ−ＦＷＤ２はｍ−ＦＷＤ１と同じくＦ−ボ
ックスモチーフ（二重下線を施している）とＷＤ４０リ
ピートモチーフ（下線を施している）を７つ含む構造を
もつタンパク質であるが、ｍ−ＦＷＤ１との相同性は僅
かに13％しかない。一方、ｍ−ＦＷＤ１とｈ−ＦＷＤ１
は99％一致しており、特にＦ−ボックスモチーフは100
％同じである。（このＦ−ボックスモチーフのタンパク
のアミノ酸配列は、明細書末尾の配列表では配列番号：
１として示している。）

【００１９】配列番号：１のアミノ酸配列から成るＦ−
ボックスモチーフタンパクをコードする遺伝子の塩基配
列は、マウス由来のものについては図１４、ヒト由来の
ものについては、図１５、また、配列番号：２から成る
マウス由来のＦ−ボックスタンパク（ｍ−ＦＷＤ１）を
コードする遺伝子の塩基配列は図１６、配列番号：３の
ヒト由来のＦ−ボックスタンパク（ｈ−ＦＷＤ１または
ｈ−βＴｒＣＰ）をコードする遺伝子塩基配列は図１７
に、それぞれ示している。なお、ｍ−ＦＷＤ１およびｈ
−βＴｒＣＰをコードする遺伝子（塩基配列）は、GenB
ank（米国厚生省データベース）に、それぞれ、アクセ
ション番号（accession number）ＡＦ081887およびＹ14
153として寄託されている。

【００２０】後の実施例に詳述するように、本発明者
は、これらのＦ−ボックスタンパクが発現されるように
したインビボおよびインビトロの実験系を用い、ＩκＢ
およびβカテニンのユビキチン化のメカニズムを解明
し、次のように総括される知見を得た。

【００２１】（１）本発明者が明らかにしたＦ−ボック
スタンパク（ｍ−ＦＷＤ１またはｈ−ＦＷＤ１）は、Ｓ
ｋｐ１タンパクおよびＣｕｌ１タンパクと結合してＳＣ
Ｆ複合体を形成し、リン酸化酵素の存在下に、ＩκＢま
たはβカテニンをユビキチン化し、分解を促進する。そ
の結合様式は、Ｆ−ボックスタンパクがＳｋｐ１タンパ
クに直接結合し、これにＣｕｌ1タンパクが結合してい
る。

【００２２】（２）ＩκＢおよびβカテニンのユビキチ
ン化のためには、本発明によって定義されるＦ−ボック
スタンパク（ｍ−ＦＷＤ１またはｈ−ＦＷＤ１）のＦ−
ボックスモチーフおよびＦＤ４０リピートモチーフが必
須である。Ｆ−ボックスモチーフタンパクは、Ｓｋｐ１
／Ｃｕｌ１タンパクに結合し、一方、ＷＤ４０リピート
モチーフはリン酸化されたＩκＢまたはβカテニンを結
合させて、ユビキチン化反応を進行させる。

【００２３】すなわち、本発明のＦ−ボックスモチーフ
が欠失すると、ＷＤ４０リピートモチーフが存在しても
ＩκＢまたはβカテニンのユビキチン化は起こらない。
また、本発明で定義される以外のＦ−ボックスモチーフ
とＦＤ４０リピートモチーフを有するＦ−ボックスタン
パク（例えば、ｍ−ＦＷＤ２）には、ＩκＢまたはβカ
テニンをユビキチン化する能力はない。

【００２４】以上の知見から、本発明のＦ−ボックスタ
ンパク（ｍ−ＦＷＤ１、配列番号：２；またはｈ−ＦＷ
Ｄ１、配列番号：３）およびそのＦ−ボックスモチーフ
（配列番号：１）は、ＩκＢとβカテニンのユビキチン
化に特異的に関与しており、この特性を利用して、新し
い医薬の開発や治療法に関して次のような有用な情報が
得られるものと期待される。

【００２５】ＩκＢをユビキチン化し分解するメカニズ
ムが明らかになれば全く新しい作用機序に基づく抗炎症
薬の開発に役立つものと思われる。例えば、本発明のＦ
−ボックスタンパク（または、本発明のＦ−ボックスモ
チーフと他の適当なリピート配列を有するＦ−ボックス
タンパク）に結合し、その活性を阻害するような低分子
化合物をスクリーニングできれば、該化合物は、ＩκＢ
の分解を抑制することによって炎症性サイトカインのＮ
Ｆ−κＢのシグナルを遮断する抗炎症薬となり得る可能
性がある。

【００２６】また、βカテニンは現在大腸癌の発癌にお
いて最も重要な分子であり、その分解機能が明らかにな
れば大腸癌の診断・治療・予防に貢献する可能性が大き
い。たとえば、ウイルスベクターに本発明のＦ−ボック
スタンパクを組み込んで大腸癌に対して遺伝子治療を行
うことが期待できる。

【００２７】このような医薬や治療法の開発に当たって
採用される実験系への本発明のＦ−ボックスタンパク等
の導入は、後述の実施例によって示唆されているよう
に、従来から当業者に知られた各種の手法を用いて容易
に行うことができる。

【００２８】例えば、本発明のＦ−ボックスタンパク
（またはそのＦ−ボックスモチーフタンパク）、Ｓｋｐ
１タンパクおよびＣｕｌ１タンパク、ならびにその他の
必要物質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を組み込んだプ
ラスミドまたはファージをリポフェクションまたはリン
酸カルシウム法のような方法で適当な細胞系（例えば、
２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞）にトランスフェ
クションすることによってインビボの実験系が構築でき
る。

【００２９】また、例えば、本発明のＦ−ボックスタン
パク（またはＦ−ボックスモチーフタンパク）、および
その他の必要物質を予め合成するか、または適当な発現
系（大腸菌発現系、バキュロウイルス発現系など）を用
いて発現させた後、Ｓｋｐ１タンパクやＣｕｌ１タンパ
クの産生能のある細胞抽出液（２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ
細胞、Ｌ細胞などの抽出液）に混合すればインビトロの
実験系が得られる。

【００３０】

【実施例】以下の実施例は、ＩκＢとβカテニンのユビ
キチン化には本発明のＦ−ボックスタンパクを含むユビ
キチンリガーゼＳＣＦ複合体が関与していることを示す
インビボおよびインビトロの実験結果である。

【００３１】この実施例では、マウス由来のＦ−ボック
スタンパク〔ｍ−ＦＷＤ１（配列番号：２）、以下、単
にＦＷＤ１と記す〕を用いているが、ヒト由来のＦ−ボ
ックスタンパク〔ｈ−ＦＷＤ１（配列番号：３）〕を用
いた場合でも同様の結果が得られる。なお、以下の説明
および図中、ＦＷＤ１（△Ｆ）、ＦＷＤ１（△ＷＤ）、
ＦＷＤ１（△Ｎ／Ｆ）と記しているのは、ＦＷＤ１か
ら、それぞれ、Ｆ−ボックスモチーフ、ＷＤ４０リピー
ト、Ｎ末端領域（140個のアミノ酸から成る）とＦ−ボ
ックスモチーフを人工的に欠失させたものである。

【００３２】インビボの実験系では、リン酸カルシウム
法で処理した293Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓細胞由来細胞
株）を、ＦＷＤ１またはその一部を欠失させたもの、Ｓ
ｋｐ１、Ｃｕｌ１、標的タンパク質（ＩκＢα、βカテ
ニン）、リン酸化酵素（ＩＫＫ−２、Ａｘｉｎ、ＧＳＫ
−３β）、または対照（コントロール）用タンパク〔Ｆ
ＷＤ２（ｍ−ＦＷＤ２）、ｐ57（細胞増殖阻害性タンパ
ク）〕をコードする各ｃＤＮＡ〔それぞれ、後の免疫沈
降法やウエスタンブロッティングに供するためＮ末端に
常用のタグ（tag）を付けた〕を含む発現プラスミド
〔ｐｃＤＮＡ３（米国Invitrogen社製）またはｐＣＩｎ
ｅｏ（米国Promega社製）〕を用いてトランスフェクシ
ョンした。

【００３３】インビトロの実験系では、米国Clontech社
から入手したバキュロウイルス発現系を採用した。すな
わち、ＦＷＤ１またはその一部を欠失させたもの、リン
酸化酵素または標的タンパク質をコードする各ｃＤＮＡ
（後の免疫沈降法やウエスタンブロッティングに供する
ためN末端にタグを付けた）をバキュロウイルストラン
スファーベクターｐＢａｃＰＡＫ９に組み込み、Ｓｆ９
細胞（カイコ由来株化細胞）へ形質転換した後、組換え
体プラークを採集、ＰＣＲ法で増殖することによりサブ
クローニングした。得られた各ｃＤＮＡを含む組換えｐ
ＢａｃＰＡＫ９をバキュロウイルスＤＮＡ ＢａｃＰＡ
ＫとともにＳｆ９細胞に形質転換、増殖させることによ
り、各タンパク質を発現させ、これを所定の細胞の抽出
液（溶解液）と混合した。

【００３４】これらの実験に用いたＦＷＤ１またはその
変異体の遺伝子（ＤＮＡ塩基配列）は如上の記載から明
らかであろう。また、ＳＣＦ複合体のその他のタンパク
をコードする遺伝子は下記のように寄託されている：Ｓ
Ｋｐ１（GenBank、アクセション番号ＡＦ083214）およ
びＣｕｌ１（GenBank、ＡＦ083216）。

【００３５】本実施例では、主として免疫沈降法（Immu
noprecipitation、以下の説明および図中ではIPと略称
する）およびウエスタンブロッティング法（Immunoblot
ting、以下の説明および図中ではIBと略称する）を利用
して各タンパク質間の結合やユビキチン化反応を検討し
た。すなわち、目的のタンパク質に付いたタグ（tag）
に対する抗タグ抗体を用いて各タンパク質を沈降させる
とともに該タンパク質に結合している別のタンパク質を
共沈降させ（IP）、その後、沈降物を電気泳動させてそ
れぞれのタンパク質に対する抗体を用いて各タンパク質
の存否を検出（IB）した。

【００３６】IPおよびIBに用いた抗体（Ａｂ）は以下の
とおりであり、括弧内に入手先を示す：anti-Myc Ab (9
E10 : Boehringer Mannheim) , anti-Flag Ab (M5 : IB
I) ,anti-HA Ab (12CA5 : Boehringer Mannheim) , ant
i-Ub（ユビキチン） Ab (1B3 : MBL), およびanti-β-c
atenin Ab (Santa Cruz, cat. # SC-1496)。

【００３７】実施例１：ＦＷＤ１によるIκB（ＩκＢ
α）のユビキチン化と分解促進 図３ ：図３は、本発明のF-ボックスタンパク（ＦＷＤ
１）のＳｋｐ１タンパクとの結合を検討したＩＰおよび
ＩＢの実験結果の１例を示す電気泳動図である。

【００３８】Ｓｋｐ１ｃＤＮＡのＮ末端にMyc-tagを付
けたもの（以下、Myc-Skp1と記す）を次の３つの内の１
つと一緒に293T細胞にトランスフェクションを行った：
レーン(lane)１、ｐ57ｃＤＮＡのＮ末端にFlag-tagを付
けたもの（以下、Flag-ｐ57）；レーン２、ＦＷＤ１ｃ
ＤＮＡのＮ末端にFlag-tagを付けたもの（以下、Flag-F
WD１）；レーン３、ＦＷＤ１（△Ｆ）ｃＤＮＡのＮ末端
にFlag-tagを付けたもの(以下、Flag-ＦＷＤ１（△
Ｆ）)。

【００３９】トランスフェクションから48時間後に細胞
を回収して界面活性剤で溶解し、細胞抽出液を得た。こ
の細胞抽出液に抗Ｍｙｃ抗体（anti-Ｍｙｃ、その他の
抗体も図中ではこのように表記している）を加え、さら
にプロテインＧ−セファロースを加えると、Ｍｙｃ−ta
gの付いたタンパク（ここではＭｃｙ−Ｓｋｐ１）が抗
Ｍｙｃ抗体に結合し、それがさらにプロテインＧ−セフ
ァロースと結合するので、Ｍｙｃ−Ｓｌｐ１を沈殿させ
ることができる。このＩＰによりＭｙｃ−Ｓｋｐ１が沈
降してくるが、Ｍｙｃ−Ｓｋｐ１に結合しているタンパ
クもまた沈降（共沈降）してくる。以下の多くの実験は
この共沈降という現象を通じてタンパク質の結合を調べ
たものである。

【００４０】図の一番上は抗Ｍｙｃ抗体でＩＰした後、
沈降物を電気泳動して、抗Ｆｌａｇ抗体でＩＢを行った
ものである。このときレーン２のみにバンドが出ている
ことから、抗Ｍｙｃ抗体でＩＰされるもの（つまりＭｙ
ｃ−Ｓｋｐ１）にFlag−ＦＷＤ１がついてくることを示
す。しかしFlag−ｐ57はＭｙｃ−Ｓｋｐ1に結合してい
ない。さらに、Flag−ＦＷＤ１（△Ｆ）も結合していな
い。このことからＦＷＤ1のＦ−ボックスモチーフがＳ
ｋｐ１との結合に必須であることがわかる。

【００４１】その下の10％inputとは、ＩＰをせずに細
胞抽出液の1／10をそのまま電気泳動して抗Flag抗体で
ＩＢしたものである。これはＦｌａｇ−ｐ57、Flag-Ｆ
ＷＤ１、Flag-ＦＷＤ１（△Ｆ）が本当に存在している
かどうかを確認するためのコントロールである。すなわ
ち、Ｆｌａｇ−ｐ57やFlag-ＦＷＤ１（△Ｆ）は細胞抽
出液中には存在しているが、Ｍｙｃ−Ｓｋｐ1の免疫沈
降物の中には含まれていないということを示している。

【００４２】以下の各図においても10％inputとは、各
タンパクの実在を確認した結果である。なお、各電気泳
動図において、右端に各タンパク質の標準位置を示して
いる。その下（3段目）の実験は、一番上の実験の裏を
とったもの、すなわち、抗Flag抗体でＩＰし、抗Ｍｙｃ
抗体でＩＢしたものである。これはFlag-ＦＷＤ１の免
疫沈降物にＭｙｃ−Ｓｋｐ1が含まれていることの証明
である。つまりこれは一番上の列の実験を逆から行った
もので、同じ結果となっている。一番下の段は10％inpu
tを抗Ｍｙｃ抗体でＩＢしたものである。全てのレーン
にＭｙｃ−Ｓｋｐ1が存在しているのがわかる。

【００４３】図4：図4は、本発明のＦ−ボックスタンパ
ク（ＦＷＤ１）のＳｋｐ１およびＣｕｌ１との結合様式
を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果の1例を示す電気
泳動図である。図の見方は、図3に関して上述したのと
同様である。

【００４４】293Ｔ細胞にFlag-ＦＷＤ１、ＨＡ−Cull、
Ｍｙｃ−Ｓｋｐ１をトランスフェクションした（図の上
部の＋サインがあるのは、当該タンパクをトランスフェ
クションしたことを示す）。但しコントロールとしてレ
ーン１はFlag-ＦＷＤ１の変わりにFlag-Ｐ27を、レーン
４はＨＡ−Cullの代わりにHA−E2−25ｋをトランスフェ
クションした。レーン１〜４は細胞抽出液を抗Flag抗体
でＩＰしたもの、レーン５〜８はＩＰする以前の細胞抽
出液の1／10をそのまま電気泳動してウエスタンブロッ
ティング法で検出したものである。抗ＨＡ抗体でＩＢし
たもの（最上段）は、Flag-ＦＷＤ１にＨＡ−Ｃｕｌ１
が結合していることを示す。この量はＭｙｃ−Ｓｋｐ１
をトランスフェクションしたもの（レーン３）の方がし
ていないもの（レーン２）よりも多いことから、Ｓｋｐ
１の存在がＦＷＤ１−Ｃｕｌ１の安定化に役立っている
と考えられる。このときFlag-ｐ27とＨＡ−Ｃｕｌ１の
結合は検出されない。さらにFlag-ＦＷＤ１とＨＡ−Ｅ
２−25ｋの結合も検出されないことから、ＦＷＤ１−Ｃ
ｕｌ１の結合は特異的なものであることが明かである。

【００４５】次に抗Flag抗体でＩＰしたものを抗Ｍｙｃ
抗体でＩＢした。Flag-ＦＷＤ１とＭｙｃ−Ｓｋｐ1があ
れば、ＨＡ−Ｃｕｌ１がない状態でも（レーン４）Ｍｙ
ｃ−Ｓｋｐ１が検出できることから、Flag-ＦＷＤ１と
Ｍｙｃ−Ｓｋｐ１はＨＡ−Ｃｕｌ１を介さずに直接結合
していることが理解される。10％input（レーン５〜
８）では全てのトランスフェクションしたタンパクが発
現して存在していることを示している。

【００４６】図５：図５は、本発明のF-ボックスタンパ
ク（ＦＷＤ１）のＩκＢおよびリン酸化酵素との結合を
検討したＩＰおよびＩＢの実験結果の１例を示す電気泳
動図である。293Ｔ細胞にFlag−IκBα、Flag−IKK−
２、Ｍｙｃ−ＦＷＤ２（レーン１，２）またはＭｙｃ−
ＦＷＤ１（レーン３〜８）をトランスフェクションした
（図の上部の＋サイン）。ＩＫＫ−２はＩκＢαに対す
るリン酸化酵素である。まずこの細胞抽出液を抗Ｍｙｃ
抗体でＩＰし、抗Flag抗体でＩＢした。その下の段は抗
リン酸化ＩκＢαでＩＢした。どちらも結果は同じであ
る（レーン４のみに特異的なリン酸化ＩκＢαのバンド
が検出される）。Flag−ＩＫＫ−２はこの図では見えな
い（もっと上方に存在する）。

【００４７】Ｍｙｃ−ＦＷＤ２をトランスフェクション
した細胞ではFlag-ＩＫＫ−２の有無に関わらずＭｙｃ
−ＦＷＤ２にFlag−IκBαは結合していない（レーン
１、２）。レーン３はリン酸化酵素であるFlag−ＩＫＫ
−２が存在しないが、この状態ではＦＷＤ１はＩκＢに
結合することはできない。これはＦＷＤ１はリン酸化さ
れたＩκＢαのみに結合することを示唆する。レーン４
ではＦＷＤ１はリン酸化されたＩκＢαのみに結合する
ことが明らかにされている。レーン５ではFlag-ＩＫＫ
−２に点変異を導入して、リン酸化活性を失わせたもの
をトランスフェクションしたものであるが、ＦＷＤ１は
ＩκＢαに結合しない。このことはＩＫＫ−２のリン酸
化活性が重要であることを意味する。さらにレーン７で
はＩＫＫ−２は存在するがＩκＢαのリン酸化サイトに
点変異を入れてリン酸化できなくしたものを正常ＩκＢ
αの代わりに入れている。この場合もやはりＦＷＤ１は
ＩκＢαに結合しない。レーン８はＩκＢαを入れてい
ないので当然何も検出できない。以上からＦＷＤ１はリ
ン酸化されたＩκＢαのみに結合することが明らかであ
る。

【００４８】さらに下の２段は10％inputを調べたもの
であるが、重要なのはレーン４のみIκBαの量が極端に
減少していることである。これはＩＫＫ−２とＦＷＤ１
の存在下でＩκＢαの分解が亢進していることを示す。

【００４９】図６：図６は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ＦＷＤ１）のＩκＢに対するユビキチン化能を検
討したＩＰおよびＩＢの実験結果の１例を示す電気泳動
図である。293Ｔ細胞にＩＫＫ−２（全レーン）、正常
ＩκＢα（ＷＴ；レーン１〜３）またはＩκＢαのリン
酸化サイトに点変異を入れて（32位および36位のセリン
をアラニンに置換）リン酸化できなくしたもの（32／36
ＳＡ；レーン4〜６）、mock(ベクターのみ；レーン1〜
４)、Flag-ＦＷＤ２(レーン２、５)またはFlag-ＦＷＤ
１(レーン３，６)をトランスフェクションした。細胞抽
出液を抗Ｍｙｃ抗体(ＩκＢα)でＩＰし、抗ユビキチン
抗体(最上段)、抗Ｍｙｃ抗体(第2段；ＩκＢαを検
出)、抗Flag抗体(第3段；ＦＷＤ１またはＦＷＤ２を検
出)でＩＢした。正常ＩκＢαはＩＫＫ−２とＦＷＤ１
の存在下で高度にユビキチン化されている(レーン3)。
しかしＦＷＤ２ではこの効果はない。また32／36ＳＡ型
変異が入っているＩκＢαでは、ＦＷＤ１があってもユ
ビキチン化は起こらない。レーン３では前図と同様にＩ
κＢαの発現量の減少が観察される(第2段目)。

【００５０】図7：図7は、本発明のＦ−ボックスタンパ
ク（ＦＷＤ１）のＩκＢに対するユビキチン化能を検討
したＩＰおよびＩＢの実験結果の別の例を示す電気泳動
図である。293Ｔ細胞にＩκＢαとＩＫＫ−２（全レー
ン）、Flag-ＦＷＤ２(レーン１)、Flag-ＦＷＤ１(レー
ン２)またはFlag-ＦＷＤ１(△Ｆ)(レーン３)をトランス
フェクションした。レーン２では図６のレーン３と同様
にＭｙｃ−ＩκＢαが高度にユビキチン化されている。
しかしこの現象はFlag-ＦＷＤ１(△Ｆ)では認められな
いことから、ユビキチン化するためにはＦ−ボックスモ
チーフタンパクが必要なことが明かである。またレーン
２では図６と同様にＩκＢαの発現量の減少が観察され
る(第２段目)。また第３段目ではＦＷＤ１(△Ｆ)はＩκ
Ｂαと結合していることがわかった（レーン３）。つま
りＦＷＤ１(△Ｆ)はＩκＢαと結合する能力は保持して
いるが、ユビキチン化する能力は失われていることがわ
かる。ＦＷＤ１がＩκＢαと結合する領域はＦ−ボック
スモチーフタンパクではないと理解される。

【００５１】図８：図８は、如上のアッセイがインビボ
(細胞内)であったのに対し、インビトロで本発明のＦ−
ボックス（ＦＷＤ１）タンパクにおけるタンパク質間結
合やユビキチン化を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果
の１例を示す電気泳動図である。

【００５２】カイコの細胞（ｓｆ９）に組換えバキュロ
ウイルスによって発現させたタンパク質（ＩκＢα、Ｉ
ＫＫ−２、ＦＷＤ１）と293Ｔ細胞から得た細胞抽出液
を100,000ｇで超遠心した上清(Ｓ100)を試験管内で混合
した。上段はその混合物を抗ＩκＢα抗体でＩＰし、抗
ユビキチン抗体でＩＢしたものである。Ｓ100以外のも
のを混合しても全くＩκＢαのユビキチン化は認められ
ない。逆にＩκＢαとＳ100を混合するだけで若干のユ
ビキチン化は認められる（つまり弱いユビキチン化活性
がＳ100に存在する）。これにＩＫＫ−２かＦＷＤ１の
どちらか一方を加えても大きな変化はないが、ＩＫＫ−
２とＦＷＤ１の両者を加えると非常に強いユビキチン化
が認められる。

【００５３】下段は抗ＩκＢα抗体でＩＰし、抗Ｍｙｃ
抗体でＩＢしたものである。するとインビトロでＦＷＤ
１とＩκＢαはＩＫＫ−２がある条件下のみ結合する
(レーン３，７)。この結合にＳ100は不要である(レーン
３)。ＩＫＫ−２がないと結合しない(レーン６)。

【００５４】図9：図9は、本発明のＦ−ボックスタンパ
ク（ＦＷＤ１）のＩκＢに対する分解速度を検討したＩ
Ｂ実験結果の1例を示す電気泳動図である。Ａは293Ｔ細
胞にＭｙｃ−ＩκＢαをトランスフェクションし、³⁵Ｓ
−メチオニンで合成した全タンパクを放射ラベルし、そ
の後³⁵Ｓ−メチオニンを洗い流すことにより、放射ラベ
ルされたタンパクが分解する時間を調べたものである。
ＦＷＤ１もＩＫＫ−２もトランスフェクションしていな
いものでは最上段のようにＭｙｃ−ＩκＢαが減少す
る。この減少率はＦＷＤ１を一緒にトランスフェクショ
ンしたものでもあまり変化ない(第２段)。ＩＫＫ−２を
トランスフェクションしたものでは分解が少々速まる
(第３段)。さらにＩＫＫ−２とＦＷＤ１の両者を加える
と非常に速い分解が認められる(最下段)。

【００５５】Ｂは、Ａと同じ実験であるが、最上段はＩ
ＫＫ−２をトランスフェクションしたもの、第２段はＩ
ＫＫ−２とＦＷＤ１の両者を加えたもので結果はＡと同
じである。さらに、ここでＦＷＤ１(△Ｆ)を大量発現し
てやると、ＦＷＤ１(△Ｆ)は内在性のＦＷＤ１よりも量
が多く、殆どのＩκＢαと結合するが、Ｓｋｐ１やＣｕ
ｌ１とは結合できないために結果的にＩκＢαのユビキ
チン化による分解を阻害する(最下段)。

【００５６】図10：図10は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ＦＷＤ１）を用いてＩκＢがユビキチン化、分解
されるとＮＦ−κＢが細胞内で移行する様子を調べるた
めに行った蛍光抗体法による実験の結果を示す図であ
る。

【００５７】ＩκＢαが分解されれば、細胞質でＩκＢ
αと結合しているＮＦ−κＢは自由になって核へ移行で
きるようになる。そこでＮＦ−κＢの細胞内分布とＦＷ
Ｄ１やＩＫＫ−２との関係を追ってみた。Flag-ＦＷＤ
１をトランスフェクションしたもの(上段；塗りつぶし
矢印)は抗ｐ65／ＲｅｌＡ（ＮＦ−κＢの一部）抗体で
細胞を染色するとＮＦ−κＢは細胞質に存在することが
わかる（左列）。空き矢印はトランスフェクションされ
なかった細胞を示す(抗Flag抗体で染まらない；中央
列)。右列は、全ての細胞核をHoechst33258という色素
で染色したものである(核の位置を見るために便利であ
る)。左・中・右は、同じ細胞を違うフィルターで見て
いるものであるから、細胞の位置は完全に一致してい
る。

【００５８】第2段目はＩＫＫ−２をトランスフェクシ
ョンしたものである。結果は第1段目と同じである。

【００５９】第3段目はＦＷＤ１とＩＫＫ−２を両方ト
ランスフェクションしたものである。するとトランスフ
ェクションされた細胞では明らかにＮＦ−κＢが核に移
行している。隣のトランスフェクションされていない細
胞では依然細胞質に存在する。このことからＦＷＤ１と
ＩＫＫ−２は共同してＩκＢαを分解し、細胞質でＩκ
Ｂαと結合していたＮＦ−κＢを開放して核へ移行でき
るようにすると考えられる。

【００６０】実施例２：ＦＷＤ１によるβカテニンのユ
ビキチン化 実施例1のＩκＢの場合と同様に、βカテニンについて
も本発明のＦ−ボックスタンパク（ＦＷＤ１）によるタ
ンパク質間結合およびユビキチン化反応をインビボまた
はインビトロの実験系で検討した。以下の説明では、省
略している部分もあるが、ＳＣＦ複合体の結合状態やＦ
−ボックスにおける各領域(モチーフ)の機能、標的タン
パク質(基質：βカテニン)およびリン酸化酵素との結合
の様子は、基本的にはＩκＢの場合に類似している。但
し、βカテニンの場合は、リン酸化酵素Axinやリン酸化
酵素複合体（ＧＳＫ−３β／Axin／ＡＰＣ）とＦＷＤ１
とβカテニンが特に強く結合していることが示された。

【００６１】以下、幾つかの実験例の結果を図に沿って
示す。各図の見方は、実施例1の場合と同様であるので
簡単に説明する。図11 ：図11は、本発明のＦ−ボックスタンパク（ＦＷＤ
１）のβカテニンおよびAxinとの結合を検討したＩＰお
よびＩＢの実験結果の1例を示す電気泳動図である。

【００６２】本発明のＦ−ボックスタンパクＦＷＤ１
は、βカテニンおよびAxinに結合することができ（レー
ン２）、この結合能はＦ−ボックスモチーフが欠失して
も保持されるが（レーン６）、その他の領域が欠失する
と損なわれる（レーン3〜５）。コントロールのＦＷＤ
２は、βカテニンおよびAxinのいずれに対しても結合能
を有しない（レーン1）。

【００６３】図示していない他のＩＰ／ＩＢ実験から、
本発明のＦＷＤ１はAxinがあればβカテニンと結合する
ことが確認されている。また、本発明のＦＷＤ１はβカ
テニンおよびリン酸化酵素複合体（ＧＳＫ−3β／Axin
／ＡＰＣ）と強く結合することも明らかにされている。
AxinはGSK−３βおよびβカテニンとコンプレックスを
形成してGSK−３βによるβカテニンのリン酸を促進す
ることが知られている〔Ikeda他、EMBO J, 17, 1371-13
84 (1998)〕。したがって、本発明のＦＷＤ１は、リン
酸化酵素（またはリン酸化酵素複合体）およびβカテニ
ンとコンプレックスを形成してユビキチン化を促進し、
その際のリン酸化酵素（複合体）／ βカテニンとの結
合部位はＦ−ボックスモチーフではないものと解され
る。

【００６４】図12：図12は、プロテアソームインヒビタ
ーの存在下における本発明のＦ−ボックスタンパク（Ｆ
ＷＤ１）のユビキチン化能を検討したＩＰおよびＩＢの
実験結果の１例を示す電気泳動図である。

【００６５】プロテアソームインヒビター（ＬＬｎＬ）
で処理し、ユビキチン化されたβカテニンの蓄積状況を
見た。本発明のＦＷＤ１はＬＬｎＬで処理されるとユビ
キチン化が著しく増強されており（レーン２）、高いユ
ビキチン化能を有することが明かであるが、コントロー
ル（対照）のＦＷＤ２ではユビキチン化は僅かしか生じ
ていない（レーン１）。また、Ｆ−ボックスモチーフが
欠失したＦＷＤ１（△Ｆ）では、βカテニンのユビキチ
ン化が抑制されてしまう（レーン３）。

【００６６】図13：図13は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ＦＷＤ１）のβカテニンに対する分解を検討した
インビトロ実験の結果を示すグラフである。既述したよ
うにバキュロウイルス発現系を用いてβカテニン、Ｍｙ
ｃ−AxinおよびFlag-ＦＷＤ１を発現させたＳｆ９細胞
を溶解緩衝液で処理してリゼイト（溶解液）を調製し
た。SW480細胞のリゼイトに上記Ｓｆ９細胞リゼイトを
分解混合液〔50ｍMのトリスHCｌ（ｐH8.3）、3.2ｍMの
ＤＴＴ、５ｍMのＭｇＣｌ₂、2.5ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭ
のホスホクリアチン、500Ｕ／ｍｌのホスホクレアチン
キナーゼ、25μｇ／ｍｌユビキチンアルデヒド、1.5ｍ
ｇ／ｍｌのユビキチン、および10μｇ／ｍｌのプロテア
ーゼインヒビター〕とともに37℃で０〜２時間インキュ
ベーションすることによってβカテニンの分解能を調べ
た。ＳＷ480細胞は、ヒトの結腸癌細胞由来の細胞株で
あり、ＡＰＣの機能が欠損しているためにβカテニンの
蓄積をもたらす。

【００６７】図に示すように、AxinおよびＦＷＤ１が存
在しないコントロールでは、βカテニンは分解されず経
時的に増大している。Axinが導入されると、βカテニン
の分解が起こり、特にAxinとＦＷＤ１が併存するとその
効果が顕著である。しかし、Ｆ−ボックスモチーフが欠
失したＦＷＤ１(図中、「＋Axin＋△F」と記す)では、A
xinによって誘起された分解活性が阻害されていること
が理解される。

【００６８】同様の結果は、蛍光抗体法を用いたインビ
ボの実験系でも確認されており、ＳＷ480細胞にAxinま
たはＦＷＤ１を導入すると細胞質のβカテニンが消失す
るが、ＦＷＤ２はβカテニンの減少に効果を発揮しなか
った（図示せず）。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> F-box protein of ubiquitin ligase SCF complex which promotes the ubiquitination of IκB or β-catenin <130> P0363T <160> 3 <210> 1 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens, or Mus musculus <400> 1 Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile Leu Ser Tyr １ 5 10 15 Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys Lys Glu Trp 20 25 30 Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu 35 40 <210> 2 <211> 569 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met １ 5 10 15 Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys 20 25 30 Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala 35 40 45 Arg Leu Cys Ile Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Thr Ser Thr Ala Met 50 55 60 Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Ala Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser 65 70 75 80 Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys 85 90 95 Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp 100 105 110 Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln 115 120 125 His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys 165 170 175 Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu 180 185 190 Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu 195 200 205 Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Glu 210 215 220 Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile 225 230 235 240 Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser 245 250 255 Leu Gln Arg Ile His Cys Arg Ser Glu Thr Ser Lys Gly Val Tyr Cys 260 265 270 Leu Gln Tyr Asp Asp Gln Lys Ile Val Ser Gly Leu Arg Asp Asn Thr 275 280 285 Ile Lys Ile Trp Asp Lys Ser Thr Leu Glu Cys Lys Arg Ile Leu Thr 290 295 300 Gly His Thr Gly Ser Val Leu Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Arg Val Ile 305 310 315 320 Ile Thr Gly Ser Ser Asp Ser Thr Val Arg Val Trp Asp Val Asn Ala 325 330 335 Gly Glu Met Leu Asn Thr Leu Ile His His Cys Glu Ala Val Leu His 340 345 350 Leu Arg Phe Asn Asn Gly Met Met Val Thr Cys Ser Lys Asp Arg Ser 355 360 365 Ile Ala Val Trp Asp Met Ala Ser Pro Thr Asp Ile Thr Leu Arg Arg 370 375 380 Val Leu Val Gly His Arg Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp 385 390 395 400 Lys Tyr Ile Val Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Asn 405 410 415 Thr Ser Thr Cys Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Gly His Lys Arg Gly 420 425 430 Ile Ala Cys Leu Gln Tyr Arg Asp Arg Leu Val Val Ser Gly Ser Ser 435 440 445 Asp Asn Thr Ile Arg Leu Trp Asp Ile Glu Cys Gly Ala Cys Leu Arg 450 455 460 Val Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg Phe Asp Asn 465 470 475 480 Lys Arg Ile Val Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Lys Ile Lys Val Trp Asp 485 490 495 Leu Met Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Gly Thr Leu Cys Leu 500 505 510 Arg Thr Leu Val Glu His Ser Gly Arg Val Phe Arg Leu Gln Phe Asp 515 520 525 Glu Phe Gln Ile Val Ser Ser Ser His Asp Asp Thr Ile Leu Ile Trp 530 535 540 Asp Phe Leu Asn Asp Pro Ala Ala His Ala Glu Pro Pro Arg Ser Pro 545 550 555 560 Ser Arg Thr Tyr Thr Tyr Ile Ser Arg 565 <210> 3 <211> 569 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met １ 5 10 15 Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys 20 25 30 Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala 35 40 45 Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met 50 55 60 Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser 65 70 75 80 Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys 85 90 95 Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp 100 105 110 Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln 115 120 125 His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys 165 170 175 Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu 180 185 190 Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu 195 200 205 Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly 210 215 220 Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile 225 230 235 240 Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser 245 250 255 Leu Gln Arg Ile His Cys Arg Ser Glu Thr Ser Lys Gly Val Tyr Cys 260 265 270 Leu Gln Tyr Asp Asp Gln Lys Ile Val Ser Gly Leu Arg Asp Asn Thr 275 280 285 Ile Lys Ile Trp Asp Lys Asn Thr Leu Glu Cys Lys Arg Ile Leu Thr 290 295 300 Gly His Thr Gly Ser Val Leu Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Arg Val Ile 305 310 315 320 Ile Thr Gly Ser Ser Asp Ser Thr Val Arg Val Trp Asp Val Asn Thr 325 330 335 Gly Glu Met Leu Asn Thr Leu Ile His His Cys Glu Ala Val Leu His 340 345 350 Leu Arg Phe Asn Asn Gly Met Met Val Thr Cys Ser Lys Asp Arg Ser 355 360 365 Ile Ala Val Trp Asp Met Ala Ser Pro Thr Asp Ile Thr Leu Arg Arg 370 375 380 Val Leu Val Gly His Arg Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp 385 390 395 400 Lys Tyr Ile Val Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Asn 405 410 415 Thr Ser Thr Cys Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Gly His Lys Arg Gly 420 425 430 Ile Ala Cys Leu Gln Tyr Arg Asp Arg Leu Val Val Ser Gly Ser Ser 435 440 445 Asp Asn Thr Ile Arg Leu Trp Asp Ile Glu Cys Gly Ala Cys Leu Arg 450 455 460 Val Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg Phe Asp Asn 465 470 475 480 Lys Arg Ile Val Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Lys Ile Lys Val Trp Asp 485 490 495 Leu Val Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Gly Thr Leu Cys Leu 500 505 510 Arg Thr Leu Val Glu His Ser Gly Arg Val Phe Arg Leu Gln Phe Asp 515 520 525 Glu Phe Gln Ile Val Ser Ser Ser His Asp Asp Thr Ile Leu Ile Trp 530 535 540 Asp Phe Leu Asn Asp Pro Ala Ala Gln Ala Glu Pro Pro Arg Ser Pro 545 550 555 560 Ser Arg Thr Tyr Thr Tyr Ile Ser Arg 565

【図面の簡単な説明】

【図1】マウス由来およびヒト由来のＦ−ボックスタン
パクのアミノ酸配列を対比して示す。

【図2】Ｆ−ボックスタンパクのアミノ酸配列を対比し
て示す図1の続きである。

【図3】本発明のＦ−ボックスタンパクのＳｋｐ１タン
パクとの結合を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果の1
例を示す電気泳動図である。

【図4】本発明のＦ−ボックスタンパクのＳｋｐ１およ
びＣｕｌ１との結合様式を検討したＩＰおよびＩＢの実
験結果の1例を示す電気泳動図である。

【図5】本発明のＦ−ボックスタンパクのＩκＢおよび
リン酸化酵素との結合を検討したＩＰおよびＩＢの実験
結果の1例を示す電気泳動図である。

【図6】本発明のＦ−ボックスタンパクのＩκＢに対す
るユビキチン化能を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果
の1例を示す電気泳動図である。

【図7】本発明のＦ−ボックスタンパクのＩκＢに対す
るユビキチン化能を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果
の別の例を示す電気泳動図である。

【図8】インビトロで本発明のＦ−ボックスタンパクに
おけるタンパク質間やユビキチン化を検討したＩＰおよ
びＩＢの実験結果の1例を示す電気泳動図である。

【図9】本発明のＦ−ボックスタンパクのＩκＢに対す
る分解速度を検討したＩＢ実験結果の1例を示す電気泳
動図である。

【図10】本発明のＦ−ボックスタンパクを用いてＩκＢ
がユビキチン化、分解されるとＮＦ−κＢが細胞内で移
行する様子を調べるために行った蛍光抗体法による実験
の結果を示す図である。

【図11】本発明のＦ−ボックスタンパクのβカテニンお
よびAxinとの結合を検討したIPおよびＩＢの実験結果の
1例を示す電気泳動図である。

【図12】プロテアソームインヒビターの存在下における
本発明のＦ−ボックスタンパクのβカテニンに対するユ
ビキチン化能を検討したＩＰおよびＩＢの実験結果の1
例を示す電気泳動図である。

【図13】本発明のＦ−ボックスタンパクのβカテニンに
対する分解能を検討したインビトロ実験の結果を示すグ
ラフである。

【図14】本発明のF-ボックスモチーフタンパク（マウス
由来）をコードする遺伝子の塩基配列の1例を示す。

【図15】本発明のF-ボックスモチーフタンパク（ヒト由
来）をコードする遺伝子の塩基配列の1例を示す。

【図16】本発明のF-ボックスタンパク(マウス由来)をコ
ードする遺伝子の塩基配列の1例を示す。

【図17】本発明のF-ボックスタンパク(ヒト由来)をコー
ドする遺伝子の塩基配列の1例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北川 雅敏 福岡県福岡市東区馬出３−１−１ 九州大 学 生体防御医学研究所内 (72)発明者 畠山 鎮次 福岡県福岡市東区馬出３−１−１ 九州大 学 生体防御医学研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 BA80 GA30 4B050 CC03 DD11 LL01 LL05

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ１タンパク、
   およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ４０リピートモチー
   フを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合
   体）から構成され、ＩκＢまたはβカテニンのユビキチ
   ン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−
   ボックスモチーフタンパクであって、配列番号：１で表
   されるアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパ
   ク。
2. 【請求項２】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ１タンパク、
   およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ４０リピートモチー
   フを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合
   体）から構成され、ＩκＢまたはβカテニンのユビキチ
   ン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−
   ボックスタンパクであって、配列番号：２のアミノ酸配
   列を有することを特徴とするタンパク。
3. 【請求項３】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ１タンパク、
   およびＦ−ボックスモチーフとＷＤ４０リピートモチー
   フを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合
   体）から構成され、ＩκＢまたはβカテニンのユビキチ
   ン化を促進するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−
   ボックスタンパクであって、配列番号：３のアミノ酸配
   列を有することを特徴とするタンパク。
4. 【請求項４】 配列番号：１のアミノ酸配列から成る請
   求項1のＦ−ボックスモチーフタンパクをコードする遺
   伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：２のアミノ酸配列から成る請
   求項２のＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子。
6. 【請求項６】 配列番号：３のアミノ酸配列から成る請
   求項３のＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子。