JP2000166411A - トランスジェニック植物による経口的免疫化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物抗原遺伝子を有するトランスジェニッ
ク植物及びその使用方法の提供。 【解決手段】 病原性微生物の抗原遺伝子を導入したト
ランスジェニック植物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 組み換えDNA 技術における進歩は、植物の形質転換およ
び再生における利点と組み合わさって、新しい遺伝子物
質を植物の細胞、植物および植物組織に導入することを
可能とし、こうして植物または植物の組織の価値を増大
する新しい特性、例えば、表現型の導入を可能とした。
本発明は、動植種の粘膜表面上でコロニナイゼイション
するか、あるいはそれを通して侵入する病原体のコロニ
ナイゼイション抗原またはビルレンス抗原またはそれら
の部分をコードする遺伝子を植物の中に導入することに
関する。本発明は、また、このようなコロニナイゼイシ
ョン抗原またはビルレンス抗原またはそれらの部分を植
物により産生することに関する。本発明は、さらに、ヒ
トまたは他の動物の経口的免疫化のために、このような
コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原および
他の動物を含有する植物物質を使用して、病原体により
動物またはヒトの感染を抑制することに関する。

【０００２】Ａ．感染性疾患および免疫性の一般的外観 感染症は、動物およびヒトの両者の健康のための増加す
る問題となるようになった。ギレスピー（Gillespie)
Ｊ．ら、家畜の感染症（Infectious Diseases ofDomest
ic Animals)、コムストック・プレス（Comstock Press)
、ニューヨーク州イタカ（1981）；マンデル（Mandel
l)G.L.ら、感染症の原理およびプラクティス（Principl
es and Practices of Infectious Diseases)、第２版、
ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（John Wiley and S
ons)、ニューヨーク（1985）。バクテリアの病原体によ
り引き起こされる病気は、とくに抗生物質耐性病原体の
増加のために面倒である。大部分の病原体は、昆虫によ
り伝播する病原体または傷を通して体に入るものを除外
して、粘膜表面上にまたはそれを通して入る。

【０００３】前者の病原体は次のものを包含するが、こ
れらに限定されない：バクテリアのアクチノミセス属
（Actinomyces)、アエロモナス属（Aeromonas)、バチル
ス属（Bacillus) 、バクテリオデス属（Bacteriodes)、
ボルデテラ属（Bordetella) 、ブルセラ属（Brucella)
、カンピロバクテル属（Campylobacter)、カプノイシ
トファガ属（Capnocytophaga) 、クラミジア属（Clamyd
ia) 、クロストリジウム属（Clostridium)、コリネバク
テリウム属（Corynebakuterium) 、エイケネラ属（Eike
nella)、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix) 、
エシェリキア属（Escherichia)、フサバクテリウム（Fu
sabacterium)、ヘモフィルス属（Hemophilus) 、クレブ
シエラ属（Klebsiella) 、レジュネラ属（Legionella)
、レプトスピラ属（Leptospira) 、リステリア（Liste
ria) 、マイコバクテリウム属（Mycobacterium)、マイ
コプラズマ属（Mycoplasma) 、ネイセリア属（Neisseri
a)、ノカルジア属（Nocardia) 、パスツレラ属（Pasteu
rella)、

【０００４】プロテウス属（Proteus)、シュードモナス
属（Pseudomonas)、リケッチア属（Rickettsia) 、サル
モネラ属（Salmonella) 、セレノモナス属（Selenomona
s)、赤痢菌属（Shigella) 、ブドウ球菌属（Staphyloco
ccus) 、連鎖球菌属（Streptococcus)、トレポネーマ属
（Trepnonema) 、ビブリオ属（Vibrio) 、およびエルジ
ニア属（Yersinia) における病原体の種、アデノウイル
ス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソ
ウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオ
ウイルス、レトロウイルス、ロタウイルスの群からの病
原性ウイルスの株、アスペルギルス属（Aspergillus)、
ブラストミセス属（Blastomyces)、カンジダ属（Candid
a)、コクシジオイデス属（Coccidioides) 、クリプトコ
ッカス属（Cryptococcus) 、ヒストプラズマ属（Histop
lasma)およびフィコミセス属（Phycomyces) からの病原
性菌・かび類、アイメリア属（Eimeria)、アメーバ属
（Entamoeba)、ジアルジア属（Giardia)、およびトリコ
モナス属（Tricomonas) における病原性寄生体。

【０００５】感染症の予防は、感染症がいったん起こっ
てから感染を処理する試みより、非常にコスト的に有効
であることは一般に認識されている。こうして、増加し
た感染はヒトまたは他の動物の有効な免疫化のためのワ
クチンの開発に関係づけられている。ゲルマニール（Ge
rmanier)、R.、バクテリアのワクチン（Bacterial Vacc
ines) 、アカデミック・プレス（Academic Press) 、ロ
ンドン（1984）；ブラウン（Brown)、F.アナルス・オブ
・リビュード・マイクロバイオロジー（Ann.Rev.Microb
iol.)38 、221(1984) 。

【０００６】病原体により感染した動物およびヒトの宿
主は、病原体を克服するための試みにおいて免疫応答を
獲得する。免疫系の３つのブランチが存在する：粘膜、
体液および細胞。フード（Hood) 、L.E.ら、イムノロジ
ー（Immunology) 、第２版、ベンジャミン・パプリシン
グ・カンパニー（Benjamin Publishing Co.)、カリフォ
ルニア州メンロパーク（1984) 。

【０００７】粘膜の免疫性は、気道、胃腸管および尿生
殖器管のすべての粘膜表面をうるおす分泌およびすべて
の分泌腺からの分泌における、分泌IgA(sIgA) 抗体の産
生から生ずる。マクゲー（McGhee) 、J.R.ら、アナルス
・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス
（Annals NY Acad.Sci.)、（1983) 。これらのsIgA抗体
は、粘膜表面上の病原体のコロニナイゼイションを防止
する作用をし〔ウィリアムス（Williams) 、R.C.ら、サ
イエンス（Science)177 、697(1972);マクナブ（McNab
b) 、P.C.ら、アナルス・オブ・リビュード・マイクロ
バイオロジー（Ann.Rev.Microbiol.)35 、477(1981) 〕
こうして粘膜表面を通してのコロニナイゼイションおよ
び侵入を防止する。sIgAの産生は、分泌の腺または組織
の局所的免疫化によるか、あるいは腸に関連するリンパ
系組織（GALTまたはパイアー斑（または気管支に関連す
るリンパ系組織（BALT) への抗原の提示によって刺激す
ることができる。

【０００８】ゲブラ（Gebra)、J.J.ら、コールド・スプ
リング・ハーバー・シンポジウム・オン・コンティテイ
ティブ・バイオロジー（Cold Spring Harbor Symp.Quan
t.Biol.)41、210(1976);ビーネンストック（Bienenstoc
k)、J.M.、アドバンシズ・イン・メディカル・バイオロ
ジー（Adv.Exp.Med.Biol.)107 、53(1978); ワイスズ−
カリングトン（Weisz-Carrington) 、P.ら、ジャーナル
・オブ・イムノロジー（J.Immunol)、123 、1705(197
9); マクコーガン（McCaughan)、G.ら、インターナショ
ナル・リビュー・オブ・フィジオロジー（Internal.Re
v.Pysiol.)28 、131(1983) 。膜のマイクロフォルド（m
icrofold)細胞は、Ｍ細胞として知られている以外、GAL
TおよびBALTの表面を覆い、そして他の分泌粘膜表面に
関連づけることができる。

【０００９】Ｍ細胞は粘膜表面に隣接する管腔の空間か
らの試料の抗原に作用し、そしてこのような抗原を抗原
提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）へ移し、次
いで後者は抗原をＴリンパ球（Ｔ依存性抗原の場合にお
いて）提示し、これはコミッテット（committed)Ｂ細胞
への提示のために抗原をプロセスする。次いで、Ｂ細胞
は刺激されて増殖し、移動し、そして究極的に提示され
た抗原に対するIgA を産生する抗体分泌血漿細胞に形質
転換される。抗原がGALTおよびBALTの上に横たわるＭ細
胞により取り上げられるとき、一般化された粘膜免疫性
は生じ、抗原に対するsIgAは体中のすべての分泌組織に
より産生される。セブラ（Cebra)ら、前掲；ビーネンス
トック（Bienenstock)ら、前掲；ワイスズ−カリングト
ン（Weisz-Carrington) ら、前掲；マクコーガン（McCa
ughan)ら、前掲。したがって、経口的免疫化は一般化粘
膜免疫応答を刺激しそして、さらに、口腔および胃腸管
における分泌免疫応答の局所的刺激に導く。

【００１０】体液の免疫性は血清中のIgG およびIgM の
産生物から生じ、そして病原体の食作用、ウイルスの中
和、または病原体の補体仲介細胞障害性を増強する〔フ
ード（Hood) ら、前掲〕。病原体に対する免疫性は、鳥
類および哺乳動物において、卵または初乳における分泌
の抗体の放出によるか、あるいは哺乳動物の場合におい
て血清の抗体の胎盤の転移により、母から子孫に伝達さ
れることができる。マクギー（McGee)ら、前掲、マクナ
ブ（McNabb) ら、前掲；メステッキー（Mestecky) 、
J.、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロジー（J.
Clin.Immunol. ７、265(1987) 。

【００１１】細胞の免疫性は２つの型をもつ：１つは遅
延型過敏反応であり、これはＴリンパ球がマクロファー
ジを刺激してバクテリア、寄生体および真菌の病原体を
殺させるようにする。他方の型において、細胞障害性Ｔ
リンパ球はウイルスで感染した宿主細胞を殺すように指
令される。フード（Hood) ら、前掲。

【００１２】分泌IgA 抗体は、粘膜の上皮細胞および宿
主の歯への微生物の付着を直接阻止する。エイブラハム
（Abraham)、S.N.ら、宿主防御機構における進歩（Adva
ncesIn Defense Mechanisms) 、レイブン・プレス（Rav
en Press)、ニューヨーク、４、63(1985)。リルジェマ
ーク（Liljemark)、W.F.ら、インフェクション・アンド
・イミュニイー（Infect.Immun.)26、1104(1979)。レイ
ホルト（Reiholdt) 、J.ら、ジャーナル・オブ・デンタ
ル・リサーチ（J.Dent.Res.)66、492(1987) 。

【００１３】これは微生物の凝集、疎水性の減少、マグ
ヌッソン（Mugnusson)、K.E.ら、イムノロジー（Immuno
logy)36 、439(1979) 、または陰電荷および微生物の付
着のブロッキングにより実施することができる。これら
の抗付着作用は、他の因子、例えば、分泌糖タンパク
質、表面上皮の連続的落屑およびフローラの上皮により
増幅される。アブラハム（Abraham)、S.N.ら、前掲。シ
ェドロフスキー（Shedlofsky) 、S.ら、ジャーナル・オ
ブ・インフェクシャス・ディジージス（J.Infec.Dis.)1
29、296(1974) 。例えば、不活性化ビブリオ・コレラエ
（Vibrio Cholerae)に対して経口的免疫化して分泌免疫
応答を誘発すると、腸価（intestinal number)が10〜30
倍減少する。

【００１４】ヒトの経口的ポリオウイルスワクチンおよ
び獣医学において適用されるいくつかの経口的または鼻
内のウイルスのワクチンを使用する臨床的経験は、sIgA
が気道および腸のウイルスの感染に対する粘膜の免疫系
により保護作用において決定的なある割合を演ずること
を示す。ルーセル−ジョンズ（Rusel-Jones)、G.J.ら、
インターナショナル・アーチーブス・オブ、アレルギー
・アンド・イムノロジー（Int.Arch.Allergy Appl.Immu
nol.)66 、316(1981) 。オグラ（Ogra) 、P.L.ら、肺お
よび上部の気道の免疫学的（Immunology of the Lung a
nd Upper Respiratory Respiratory Tract) 、ビーネン
ストック（Bienenstock)（編）、マクグロー−ヒル（Mc
Graw-Hill)、ニューヨーク、242(1984) 。

【００１５】sIgAの作用は、付着の防止よりむしろ宿主
細胞中のウイルスの進入を阻害するという作用であるよ
うに思われる。タイラー（Taylor) 、H.P.ら、ジャーナ
ル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Me
d.)161、198(1985) 。キリアン（Kilian) 、M.ら、マイ
クロバイオロジカル・リビューズ（Microbipl.Rev.)52
、296(1988) 。

【００１６】Ｂ．植物の形質転換の一般的外観 植物および植物組織の遺伝子の形質転換（すなわち、外
来DNA の植物中の安定な導入）の種々の方法が、この分
野において知られている。これらは、アグロバクテリウ
ム（Agrobacterium)属による形質転換および直接の遺伝
子の転移による形質転換を包含する。

【００１７】１．アグロバクテリウム（Agrobacterium)
仲介の形質転換 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefacien
s)は、広い範囲の双子葉植物および裸子植物の病気であ
る、グラウンコールの病因学的因子であり、デクリーン
（DeCleene) 、M.ら、ボタニカル・リビュー（Bot.Re
v.)42 、389(1976) 、感染の部位において植物組織にお
ける腫瘍またはゴールを形成する。アグロバクテリウム
（Agrobacterium)は、通常植物を傷付いた部位において
感染し、Ti（腫瘍誘発）、プラスミドと呼ぶ大きい染色
体外要素を有する。

【００１８】Tiプラスミドは腫瘍発生に要求される２つ
の領域を含有する。１つの領域はT-DNA(転移DNA)であ
り、これは植物のゲノムDNA に安定に転移されることが
究極的に発見されるDNA 配列である。腫瘍発生に要求さ
れる他方の領域は、転移機構に関係づけられたvir(ビル
レンス）領域である。vir 領域は安定な転移に絶対的に
要求されるが、virDNAは感染した植物に実際に転移され
ない。チルトン（Chilton)、M-D.ら、細胞（Cell)11 、
263(1977) 、トマショウ（Thomashow)、M.F.ら、細胞
（Cell)19 、729(1980) 。アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（A.tumefaciens)で感染することにより仲介
される植物細胞の形質転換および引き続くT-DNA 単独の
転移は、文献により記載されてきている。参照、例え
ば、ベバン（Beva) 、M.W.ら、インターナショナル・リ
ビュー・オブ・ジェネティックス（Int.Rev.Genet.)16
、357(1982) 。

【００１９】多数の研究所における数年の徹底的な研究
後、種々の植物組織の日常の形質転換を可能とするアグ
ロバクテリウム（Agrobacterium)系が開発された。参
照、例えば、シェル（Schell) 、J.ら、バイオ／テクノ
ロジー（Bio ／Technology) １、175(1983);チルトン
（Chilton)、M-D 、サイアンティフィック・アメリカン
（Sci.Amercan)248 、50(1983)。この方法において形質
転換された代表的な組織は、次のものを包含する：タバ
コ、バートン（Barton) 、K.A.ら、細胞（Cell)32、103
3(1983); トマト、ファラッチ（fillatti) 、J.ら、バ
イオ／テクノロジー（Bio ／Technology) ５、726(198
7);ヒマワリ、エベレッット（Evwrett)、N.P.ら、バイ
オ／テクノロジー（Bio ／Technology) ５、1201(198
7); ワタ、ウンベック（Umbeck) 、P.ら、バイオ／テク
ノロジー（Bio ／Technology) ５、263(1987);菜種、プ
ア（Pua)、E.C.ら、バイオ／テクノロジー（Bio ／Tech
nology) ５、815(1987);ジャガイモ、ファシオッチ（Fa
cciotti)、D.ら、バイオ／テクノロジー（Bio ／Techno
logy) ３、241(1985);ポプラ、ピトウド（Pythoud)、F.
ら、バイオ／テクノロジー（Bio ／Technology) ３、13
23(1987); およびダイズ、ヒンチェー、M.A.ら、バイオ
／テクノロジー（Bio ／Technology) ６、915(1988)。

【００２０】アグロバクテリウム・リゾゲネ（Agrobact
erium rhizogenes) は、また、植物の形質転換のために
ベクターとして使用されてきている。このバクテリア
は、多数の双子葉植物種において根毛の形成を刺激し、
Ri（根の誘発）プラスミドと呼ぶ大きい染色体外の要素
を有し、このプラスミドはアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（A.tumefaciens)のTiプラスミドに類似する
方法で機能する。アグロバクテリウム・リゾゲネス（A.
rhizogenes) を使用する形質転換は、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)のそれと同様に
開発され、そして、例えば、アルファルファ、スカピン
ダ（Sukhapinda) 、K.ら、プラント・モレキュラー・バ
イオロジー（Plant Mol.Biol.)８、209(1987);ソラヌム
・ニグルム（Solanum nigrum)L. 、ウェイ（Wei)、Z-H
ら、プラント・セル・リポーツ（Plant Cell Reports)
５、93(1986); およびポプラ、ピトウド（Pythoud)ら、
supra 、を形質転換するために首尾よく利用されてきて
いる。

【００２１】２．直接の遺伝子の形質転換 植物および植物の組織を形質転換するために、いくつか
のいわゆる直接の遺伝子の形質転換が開発された。原形
質体の直接形質転換において、原形質体中の外因性遺伝
子物質の取込みは、化学因子または電場の使用により増
強することができる。次いで、外因性物質は核のゲノム
の中に組み込むことができる。初期の研究は双子葉植物
のニコチアナ・タバクム（Nicotina tabacum)(タバコ）
において実施され、ここで外来DNA は子孫の植物の中に
組み込まれおよび転移されることが示された。パスズコ
ウスキー（Paszkowski) 、J.ら、EMBOジャーナル（J.)
３、2717(1984); およびポトリクス（Potrykus) 、I.
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molec.Gen.Genet.)199、169(1985) 。

【００２２】単子葉植物の原形質体は、また、この手順
により形質転換されてきている：例えば、トリチクム・
モノコクム（Triticum monococcum)、ロルズ（Lorz) 、
H.ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティ
ックス（Molec.Gen.Genet.)199、178(1985);ロリウム・
ムルチフロルム（Lolium multiflorum)(イタリアのライ
グラス）、ポトリクス（potrykus) 、I.ら、モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molec.Ge
n.Genet.)199、183(1985);トウモロコシ、ロウデス（Rh
odes) 、C.ら、バイオ／テクノロジー（Bio ／Technolo
gy) ５、56(1988); およびブラック・メキシカン・スウ
ィート・コーン（Black Mexican sweetcorn) 、フロム
（Fromm)、M.ら、ネイチャー（Nature)319、791(1986)
。

【００２３】ニコチアナ・タバクム（N.tabacum)の原形
質体中のDNA の導入は、原形質体を電気パルスで適当な
DNA の存在下にエレクトロポレイションと呼ぶ方法にお
いて処理することによって実施する。フロム（Fromm)、
M.E.、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods in E
nzymology)、ウ（Wn) 、R.およびグロスマン（Grossma
n) 、L.編、アカデミック・プレス（Academic Press)
、フロリダ州オーランド、Vol.153 、307(1987) およ
びシリト（Shilito)、R.D.およびポトリクス（Potryku
s) 、I.、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods i
n Enzymology)、ウ（Wn) 、R.およびグロスマン（Gross
man) 、L.編、アカデミック・プレス（Academic Press)
、フロリダ州オーランド、Vol.153 、283(1987) 。原
形質体を分離し、そしてマンニトール溶液中に懸濁す
る。スーパーコロイド化したまたは円形のプラスミドDN
A を添加する。この溶液を混合し、そして室温において
約400 Ｖ／cmのパルスに10〜100 μsec 間暴露する。膜
の可逆的物理学的破壊はDNA を原形質体の中に取込ませ
る。

【００２４】DNA のウイルスは遺伝子のベクターとして
使用されてきている。修飾されたバクテリアのメトトレ
キセート抵抗性遺伝子を有するカリフラワーのモザイク
ウイルスは、植物の感染に使用された。外来遺伝子は植
物の中において組織的に広がった。ブリッソン（Brisso
n)、N.ら、ネイチャー（Nature)310、511(1984) 。この
系の利点は、感染の容易さ、植物内の組織的広がり、お
よび細胞当たりの遺伝子の多数のコピーである。

【００２５】リポソームの融合は、また、植物細胞の形
質転換の方法であることが示された。膜が没入すると
き、外来遺伝子は原形質体に転移される。デハイス（De
hayes)、A.ら、EMBOジャーナル（J.) ４、2731(1985)。
ポリエチレグリコール（PEG)仲介形質転換は、ニコチア
ナ・タバクム（N.tabacum)双子葉植物およびロリウム・
ムルチフロルム（Lolium multiflorum) 単子葉植物にお
いて実施された。それはMg²⁺, PEG 、および多分Ca²⁺の
相互作用に基づく直接の遺伝子の転移の化学的手順であ
る。ネグルチウ（Negrutiu) 、R.ら、プラント・モレキ
ュラー・バイオロジー（Plant Mol.Biol.)８、363(198
7) 。

【００２６】あるいは、外因性DNA はマイクロインジェ
クションにより細胞または原形質体の中に導入すること
ができる。プラスミドのDNA の溶液は、微細に引かれる
ガラス針で細胞の中に直接注入される。この方法におい
て、アルファルファの原形質体は種々のプラスミドによ
り形質転換された、レイチ（Reich)、T.J.ら、バイオ・
テクノロジー（Bio ／Technology) ４、1001(1986)。

【００２７】直接遺伝子の転移のより最近開発された手
順は、DNA を有する微細な投射体による細胞の衝突を包
含する。クレイン（Klein)、T.M.ら、ネイチャー（Natu
re)3 27、70(1987)。粒子の加速と呼ぶこの手順におい
て、外因性DNA で被覆したタングステンまたは金の粒子
を標的細胞に向かって加速される。少なくとも一時的発
現はタマネギにおいて達成される。この手順は、懸濁培
養におけるブカック・メキシカン・スウィート・コーン
の細胞およびトウモロコシ未成熟の胚の中およびダイズ
の原形質体の中にDNA を導入するために利用された。

【００２８】クレイン（Klein)、T.M.ら、バイオ・テク
ノロジー（Bio ／Technology) ６、559(1988) 。マクケ
イブ（McCabe) 、E.E.ら、バイオ・テクノロジー（Bio
／Technology) ６、923(1988) 。トウモロコシおよびタ
バコの安定に形質転換された培養物は、微細な投射体の
衝突により得られた。クレイン（Klein)、T.M.ら(198
8)、supra 。安定に形質転換されたダイズの植物は、こ
の手順により得られた。マクケイブ（McCabe) 、D.E.
ら、前掲。

【００２９】Ｃ．植物の再生の一般的外観 ちょうど上のように、植物組織の形質転換の種々の方法
が存在し、植物組織から植物を再生する種々の方法が存
在する。再生の特定の方法は、出発植物組織および再生
すべき特定の植物種に依存する。近年において、植物の
移植片から誘導されたカルスの組織からの多数の種の植
物を再生することができるようになった。カルスから再
生することができる植物は、次のものを包含する：単子
葉植物、例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、コム
ギおよびライムギ、および双子葉植物、例えば、ヒマワ
リ、ダイズ、ワタ、菜種およびタバコ。

【００３０】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（A.tumefaciens)で形質転換した組織から植物の再生
は、いくつかの種の植物について実証された。これらは
次のものを包含する：ヒマワリ、エベレット（Everet
t)、M.P.ら、前掲：トマト、フィラッチ（Fillatti) 、
J.J.ら、前掲；ホワイトクローバー（Whiteclover)、ホ
ワイト（White)、D.W.R.ら、プラント・モレキュラー・
バイオロジー（Plant Mol.Biol.)８、461(1987);菜種、
プア（Pua)、E-C.ら、前掲；ワタ、ウンベック（Umbec
k) ら、前掲；タバコ、ホルシュ（Horsch) 、R.B.ら、
サイエンス（Science)22 5 、1299(1985)およびヘレラ−
エストレラ（Hererra-Estrella) 、L.ら、ネイチャー
（Nature)303、209(1983);およびポプラ、プトウド（Py
thoud)ら、前掲。アグロバクテリウム・リゾゲネス（A.
rhizogenes) で形質転換した組織からのアルファルファ
の再生は、スクハピンダ（Sukhanpinda)、K.ら、前掲。

【００３１】原形質体からの植物の再生はとくに有用な
技術である。参照、エバンス（Evans)、D.A.ら、植物細
胞培養のハンドブック（Handbook of Plant Cell Cultu
re)１、124(1983) 。植物種を原形質体から再生するこ
とができるとき、直接遺伝子転移手順を利用することが
でき、そして形質転換はアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（A.tumefaciens)の使用に依存しない。

【００３２】原形質体からの植物の再生は、次の植物に
ついて実証された：イネ、アブダラ（Abdullah) 、R.
ら、バイオ・テクノロジー（Bio ／Technology) ４、10
87(1987); タバコ、ポトリクス（Potrykus) 、I.ら、前
掲；菜種、カンシャ（Kansha)ら、プラント・セル・リ
ポーツ（Plant Cell Reports) ５、101(1986);ジャガイ
モ、タバッザ（Tavazza)、R.ら、プラント・セル・リポ
ーツ（Plant Cell Reports) ５、243(1986);ナス、シハ
チャキ（Sihachaki)、D.ら、植物細胞、組織、器官培養
（Plant, Cell, Tissue, Organ Culture)11 、179(198
7);キュウリ、ジア（Jia)、S-R.ら、ジャーナル・オブ
・プラント・フィジオロジー（J.Plant Physiol.)124、
393(1986);ポプラ、ラッセル（Russel) 、J.A.ら、プラ
ント・サイエンス（Plant Sci.)46 、133(1986);トウモ
ロコシ、オウデス（Rhodes) 、C.ら、前掲；およびダイ
ズ、マクケイブ（McCabe) 、D.E.ら、前掲。

【００３３】Ｄ．分泌免疫応答を誘発する手段 腸に関連するリンパ系組織（GALT) のパイアー斑の上に
横たわるＭ細胞は、種々の抗原物質および粒子を取り上
げることができる〔スネラー（Snellar)、M.C.およびス
トロウバー（Strober)、W.、ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディジージス（J.Infec.Dis.)154、737(19
86) 〕。ラテックスおよびポリスチレンの球、木炭、マ
イクロカプセルおよび他の可溶性および粒状物質を取り
上げる能力をもつために、種々の物質を放出すべき物質
の任意の特異的付着型の性質に対して独立に放出するこ
とができる。

【００３４】この場合において、GALTへの抗原の放出は
粘膜表面上の抗原に対するsIgAの産生およびすべての分
泌腺により、一般化した粘膜の免疫応答に導く。また、
粘膜表面へまたは分泌腺へ抗原を放出することによっ
て、局所的分泌免疫応答を刺激することができる。この
ような局在化分泌免疫応答を発生する機構はそれほど理
解されていない。

【００３５】最近の証拠、ブラック（Black)、R.E.ら、
インフェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Imm
un.)55、1116(1987); エルソン（Elson)、C.O.、カレン
ト・トピックス・オブ・マイクロバイオロジカル・イム
ノロジー（Curr.Top.Microbiol.Immnol.)146、29(1989)
は、コレラの毒素のＢサブユニットを抗原とともに経口
的に投与したとき、アジュバントとして保護の免疫応答
を増強するように働くことを示す。したがって、コレラ
の毒素ならびにE.coliの熱不安定性エンテロトキシンの
Ｂサブユニットは腸の上皮のGM-1ガングリオシドへ付着
しそして上皮の膜を横切って転位することができるの
で、このようなパイロットタンパク質またはターゲティ
ングタンパク質は局所的分泌免疫応答の引き出しにおい
て重要でありうるといえる。

【００３６】もちろん、次のことを考えることができ
る：所定のコロニナイゼイション抗原および／またはビ
ルレンス抗原をコレラの毒素のＢサブユニット、熱不安
定性エンテロトキシンを特定するＮ末端およびＣ末端の
配列に融合すること、ヤマモト、T.ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.)25
9、5037(1984)、α−Ｄ−ガクラトピラノシル−（１，
４）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドに特異的に結合する
PapGタンパク質の付着、ランド（Lund) 、B.ら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 、84、5898(1
987)、あるいはエルジニア・シュードツベルクロシス
（Yersinia pseudotuberculosis)、イスバーグ（Isber
g) 、R.R.ら、細胞（Cell)50 、769(1987) 、赤痢菌属
（Shigella) およびサルモネラ属（Salmonella) 、ガラ
ン（Galan)、J.ら、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.)USA 、86、6383(1989); カーチス（Curtiss)、
R.III ら、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイ
オロジカル・イムノロジー（Curr.Top.Microbiol.Immno
l.)146、35(1989)の中で固定されかつそれからクローニ
ングされた、上皮細胞膜を通してバクテリアを浸透させ
る侵入。

【００３７】各場合において、遺伝子の融合の産生物
は、腸粘膜の細胞の中により容易に移送され、そして局
所的分泌免疫応答を増強することを予測することができ
る。また、この形態の遺伝子の融合は、GALTへの抗原の
取込みおよび提示を促進することがありうる。特定の抗
原に対するsIgAの産生は、さらに、経口的に投与したア
ジュバント、例えば、微生物の細胞壁の構成成分の添加
により増強することができる、ミカレク（Michalek)
ら、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイオロジ
カル・イムノロジー（Curr.Top.Microbiol.Immnol.)14
6、51(1989)。

【００３８】したがって、局所的および一般化された性
質の両者の特異的sIgAの応答の刺激は、精製したタンパ
ク質、タウブマン（Taubman)、M.A.およびD.J.スミス
（Smith)、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイ
オロジカル・イムノロジー（Curr.Top.Microbiol.Immno
l.)146、187(1989) 、マイクロカプセル化した微生物の
産生物およびウイルス、エルドリッジ（Eldrige)、J.H.
ら、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイオロジ
カル・イムノロジー（Curr.Top.Microbol.Immnol.)146
、59(1989)、殺した全バクテリア、ミカレク（Michale
k) ら、サイエンス（Science)191 、1238(1976)の経口
的投与により、および生きている弱毒化したウイルス、
セブラ（Cebra)ら、前掲、およびバクテリア、カーチス
（Curtiss)、R.III ら、プロシーディング・オブ・ザ・
テンス・インターナショナル・コンボケイション・オン
・イムノロジー（Proceedings of the Tenth Internati
onal Convocation on Immunology) 、261 、H.コーラー
（Kohler) ら編、ラングマン・サイエンティフィック・
アンド・テクニカル（Longman Scientific and Technic
al) 、ハーロン、エセックス、英国（1987) の摂取する
ことによって達成することができる。

【００３９】体中の抗体分泌細胞の80％がsIgAを産生す
ること、およびIgG より２倍程度に覆いsIgAが毎日産生
された循環系に入ることを認識すると、分泌免疫系の相
対的重要性は明らかとなる。ブランドツアグ（Brandtza
eg) 、P.、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイ
オロジカル・イムノロジー（Curr.Top.Microbol.Immno
l.)146 、13(1989)。

【００４０】微生物のストレプトコッカス・ムタンス
（Streptococcus mutans) 群は、むしばの主な病因学的
因子を構成する。ギボンス（gibbons)、S.ら、アナルス
・オブ・リビュード・マイクロバイオロジー（Ann.Rev.
Microbiol.)26 、121(1975);ハマダ、S.ら、マイクロバ
イオロジカル・リビューズ（Microbipl.Rev.)44 、331
(1980) 。それらは歯の表面でコロニナイゼイション
し、そしてその寿命を通して止まる。殺したストレプト
コッカス・ムタンス（S.mutans) の経口的摂取は、唾液
中のストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) の抗原
に対するsIgAの産生に導き、ミカレク（Michalek) 、S.
M.ら、サイエンス（Science)191 、1238(1976); マステ
ッキイ（Masteckey)、J.ら、ジャーナル・オブ・クリニ
カル・イベスティゲイション（J.Clin.Invest.)61 、73
1(1978) そしてこれは齧歯類および霊長類の歯上のスト
レプトコッカス・ムタンス（S.mutans) のコロニナイゼ
イションの防止において有効であり、したがって虫歯の
誘発を防止することが示された。

【００４１】ミカレク（Michalek) 、supra ；チャラコ
ンベ（Challacomb) 、S.J.ら、アーチーブス・オブ・オ
ーラル・バイオロジー（Arch.Oral Biol.)24、917(198
0) 。sIgAはコロニナイゼイションが有効となる前に存
在しなくてはならないので、コロニナイゼイションが起
こった後、ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans)
のコロニナイゼイション抗原に対するsIgAを産生するよ
うに免疫化された個体は、バクテリアが歯科の予防の間
に機械的に除去されないかぎり、ストレプトコッカス・
ムタンス（S.mutans) で連続的にコロニナイゼイション
されるであろう。カーチス（Curtiss)、R.III ら、カレ
ント・トピックス・オブ・マイクロバイオロジカル・イ
ムノロジー（Curr.Top.Microbol.Immnol.)118 、253(19
85) 。

【００４２】多数の技術を使用して、病原体の表面のど
の構成成分がその病原体によるコロニナイゼイションお
よびビルレンスの発現に対して重要であるかを決定する
ことができる。こうして、突然変異体を分離し、そして
コロニナイゼイションするか、あるいは病気を引き起こ
す能力について試験することができる。遺伝子のクロー
ニングを使用して、異種微生物において遺伝子産生物を
産生することができる。発現された遺伝子産生物を使用
して、動物を免疫化して、病原体によるコロニナイゼイ
ションおよび／またはビルレンスが開始されるかどうか
を決定することができる。

【００４３】このような研究に基づいて、科学者は種々
のコロニナイゼイション抗原およびビルレンス抗原に対
する相対的重要性を推定し、これによりワクチン組成物
における使用に適当なものを選択して、ヒトまたは他の
動物の宿主を免疫化し、そして病原体によるコロニナイ
ゼイションおよび感染を予防することができる。このよ
うな研究は、微生物のストレプトコッカス・ムタンス
（S.mutans) 群を使用して実施して、表面タンパク質抗
原Ａ（SpaA; また、抗原Ｉ／II、ＢおよびPlとして知ら
れている）、グリコシルトランスフェラーゼ、デキスト
ラーゼおよびグルカン結合タンパク質の決定的な重要性
を実証した。カーチス（Curtiss)、1985、前掲。

【００４４】表面タンパク質抗原Ａ（SpaA) は、ストレ
プトコッカス・ムタンス（S.mutans) の表面上の主要な
タンパク質抗原を構成する。カーチス（Curtiss)、R.II
I ら、連鎖球菌属の遺伝学（Streptococcal Genetics)
、フェレッチ（Ferretti) 、J.J.ら編、アメリカン・
ソサイアティ・フォー・マイクロバイオロジー（Americ
an Society for Microbiolgy) 、ワシントンD.C.pp.212
-216(1987)。spaA増殖培地はクローニングされ、ホルト
（Holt) 、R.G.ら、インフェクション・アンド・イミュ
ニイー（Infect.Immun.)38、147(1982) 、部分的に配列
決定されそして主要な抗原決定基はマッピングされた。

【００４５】ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutan
s) の経口的摂取により意図的にまたは自然に免疫化さ
れたマウスおよびヒトは唾液中でSpaAタンパク質に対す
るsIgAを産生することは知られている。さらに、抗原Ｉ
／II〔本質的にSpaAに免疫学的に同一である、ホルト
（Holt) ら、前掲〕によるサルの免疫化は、ストレプト
コッカス・ムタンス（S.mutans) のコロニナイゼイショ
ンおよびストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) 誘
発むしばに対する保護的免疫性を生ずることは知られて
いる、ラッセル（Russel)M.W. ら、イムノロジー（Immu
nology)40 、97(1980)。

【００４６】侵入性サルモネラ属（Salmonella) 、例え
ば、ネズミチフス菌（S.typhimurium)およびチフス菌
（S.typhi)は、それぞれ、マウスおよびヒトにおける腸
チフスの病因学的因子を構成する。それらは、経口的摂
取後、GALTへの付着、侵入および増殖により、深い組織
へのアクセスを獲得する。カーター（Carter) およびコ
リンズ（Collins)、ジャーナル・オブ・イクスペリメン
タル・メディシン（J.Exp.Med.)139、1189(1974)。サル
モネラ属（Salmonella) は、既知の遺伝子の中に突然変
異を導入することによって、無毒性として病気を誘発し
ないようにすることができる。

【００４７】ジャーニール（Germanier)、R.ら、インフ
ェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Immun.)
４、663(1971) ；ジャーニール（Germanier)、R.らジャ
ーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス（J.In
fec.Dis.)131、553(1975) ；ホイセト（Hoiseth)および
ストッカー（Stocker)、ネイチャー（Nature)291、238
(1981) ；カーチス（Curtiss)ら、インフェクション・
アンド・イミュニイー（Infect.Immun.)55、3035(198
7)。このような突然変異は、経口的に投与したとき、免
疫原性であり、そしてGALTに対するそれらの組織の屈性
を保持する。

【００４８】カーチス（Curtiss)、R.III ら、プロシー
ディング・オブ・ザ・テンス・インターナショナル・コ
ンボケイション・オン・イムノロジー（Proceedings of
theTenth International Convocation on Immunology)
、261 、H.コーラー（Kohler) ら編、ラングマン・サ
イアンティフィック・アンド・テクニカル（LongmanSci
entific and Technical) 、ハーロン、エセックス、英
国（1987）；カーチス（Curtiss)、R.III ら、インフェ
クション・イミュニイー（Infect.Immun.)55、3035(198
7)。

【００４９】それらを無毒性とする種々の欠失突然変異
を有する、ある数のネズミチフス菌（S.typhimurium)お
よびチフス菌（S.typhi)の菌株は、いくつかの病原体か
らコロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス
抗原を産生する能力を使用して構成された。経口的免疫
化は、発現された抗原に対するsIgAおよびIgG の応答の
生成に導く。フォーマル（Formal) 、S.B.ら、インフェ
クション・アンド・イミュニイー（Infect.Immun.)34、
746(1981) ；ステベンソン（Stevenson)、G.ら、FEMSマ
イクロバイオロジカル・レターズ（Microbiol.Lett.)2
8、317(1985) ；クレンツ（Clements) 、J.D.J.D.ら、
インフェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Imm
un.)53、685(1986) ；マスケル（Maskell)、D.ら、ワク
チン（Vaccine)86、ゴールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spring Harb
or Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor) 、ニューヨーク、pp.213-217(198
6)。

【００５０】ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutan
s)SpaA およびグルコシルトランスフェラーゼタンパク
質を発現する組み換え無毒性サルモネラ属（Salmonell
a) は構成された。カーチス（Curtiss)ら、分泌免疫系
（The Secretory Immunity System)、J.R.マクゲー（Mc
Ghee) およびJ.メステッキー（Mestecky) 編、アナレス
・ニューヨーク・アカデミー・ソサイアティー（Ann.N.
Y.Acad.Sci.)409 、688(1983) ；カーチス（Curtiss)前
掲（1986）；カーチス（Curtiss)ら、前掲（1987）；カ
ーチス（Curtiss)ら、ワクチン（Vaccine)６、155(198
8) 。

【００５１】SpaAに対する分泌抗原（sIgA) は、ストレ
プトコッカス・ムタンス（S.mutans)SpaA タンパク質を
発現する無毒性サルモネラ属（Salmonella) 菌株で経口
的免疫化後、唾液の中に産生された、カーチス（Curtis
s)、R.III ら、ストレプトコッカス・ムタンスの分子微
生物学的免疫学（Mol.Microbiol.Immunol of Streptoco
ccus mutans)、ハマダ（Hamada) 、S.ら編、エルシビー
ア、ニューヨーク、pp.173-180(1986)；カッツ（Katz)
、J.ら、粘膜の免疫学的における最近の進歩（Recent
Advances In Mucosal Immunology)、部Ｂ、メステッキ
イ（Mestecky) 、J.ら編、プレナム・パブリッシング・
コーポレーション（Plenum Publishing Corp.)pp.1741-
1747(1987)；カーチス（Curtiss)ら、1987、前掲。

【００５２】発明の要約 本発明は病原性微生物のコロニナイゼイション抗原、ビ
ルレンス抗原、その抗原決定基またはその融合タンパク
質の遺伝情報を指定するDNA 配列を含有するトランスジ
ェニック植物に関する。本発明は、さらに、ヒトおよび
動物における分泌免疫性の刺激に有用な組成物に関す
る。本発明は、また、組成物をつくる方法およびトラン
スジェニック植物を産生する方法および分泌免疫性を刺
激する方法に関する。

【００５３】さらに詳しくは、本発明は、病原性微生物
のコロニナイゼイション抗原、ビルレンス抗原またはそ
れらの抗原決定基を発現することができるトランスジェ
ニック植物に関する。トランスジェニック植物は、ヒト
および動物を経口的免疫化して、ヒトまたは動物におい
て分泌免疫応答を引き出して、前記病原性微生物による
粘膜表面を通るコロニナイゼイションおよび／または侵
入を阻止するために有用である。

【００５４】トランスジェニック植物は、病原性微生物
の抗原の遺伝情報を指定する少なくとも１つのDNA 配列
を含有する植物形質転換ベクターで、植物を形質転換す
ることによって産生される。抗原はコロニナイゼイショ
ン抗原、ビルレンス抗原、いずれかの抗原の抗原決定
基、あるいは抗原または決定基を含有する融合タンパク
質であることができる。抗原または抗原決定基に加え
て、融合タンパク質は抗原の活性を安定化および／また
は増強するポリペプチドを含有することができる。融合
タンパク質は、また、１または２以上の抗原であること
ができる。

【００５５】植物形質転換ベクターは、問題の抗原の遺
伝情報を指定する１または２以上のDNA 配列を植物の形
質転換に適するベクターの中に挿入することによって調
製される。ベクターは、直接遺伝子転移のために、ある
いはDNA 配列を所望の植物の中に挿入するためのアグロ
インフェクション（agroinfection)のために使用するこ
とができる。DNA 配列は、自然または合成であることが
でき、そして抗原の遺伝情報を指定する遺伝子全体また
は遺伝子の断片からなることができる。

【００５６】分泌免疫応答を引き出すために有用な組成
物は、トランスジェニック植物それ自体またはその植物
から誘導された物質であることができる。例えば、トラ
ンスジェニック植物はヒトまたは動物が直接摂取するこ
とができるか、あるいは処理してヒトまたは動物により
摂取される食物産生物をつくることができる。組成物は
ヒトまたは動物を、抗原が対応する病原性微生物に対し
て免疫化するために有用である。

【００５７】図面の簡単な説明 図１は、プラスミドpSUN450 の構成を図解する。図２
は、プラスミドpSUN470 の構成を図解する。図３は、プ
ラスミドpSUN221 の構成を図解する。図４は、プラスミ
ドpSUN473 の構成を図解する。図５は、プラスミドpSUN
475 の構成を図解する。図６〜図８は、プラスミドpSUN
339, pSUN340, pSUN341, pSUN342, pSUN343 の構成を図
解する。図９は、プラスミドpSUN387, pSUN390, pSUN39
1, pSUN392, pSUN393 およびpSUN394 の構成を図解す
る。

【００５８】図10〜図12は、pSUN387 の全体の4,643 塩
基対のヌクレオチドを描写する。図13は、E.coli DH5α
（レーン２）およびプラスミドpSUN341(レーン３）、pS
UN342(レーン４）、pSUN343(レーン５）、pSUN344(pSUN
343 に類似するか、あるいはそれと同一である；レーン
６）、pSUN345(pSUN343 に類似するか、あるいはそれと
同一である；レーン７）およびpSUN346(pSUN341 に類似
するか、あるいはそれと同一である；レーン８）を含有
するE.coli DH5αにおいて、ウサギ抗SpaA血清により検
出された、SpaAタンパク質の合成のウェスタン・ブロッ
ト分析の結果を示す。前以て染色した分子量マーカーを
レーン１に含める。

【００５９】図14は、pYA177, pYA178, pYA179およびpY
A180を含有するE.coli X2991およびpSUN390, pSUN391,
pSUN392, pSUN393およびpSUN394 を含有するE.coli DH5
αにおいて、ウサギ抗SpaA血清との反応により明らかに
された、SpaAタンパク質の合成のウェスタン・ブロット
分析の結果を示す。レーン１は前以て染色した分子量標
準を含有する。図15は、トランスジェニックタバコ植物
により合成されたSpaAタンパク質の量のデンシトメータ
ーの定量を示す。

【００６０】図16はSDS ポリアクリルアミドゲルのウェ
スタン・ブロット分析の結果を示し、この結果はSpaAタ
ンパク質を産生するタバコの試料をSpaAタンパク質を産
生しないタバコの試料と比較しそして、また新鮮な試
料、凍結乾燥しそして−20℃において貯蔵した試料、室
温において貯蔵した試料、および商業的マウスの飼料と
混合した試料を比較する。レーン１は、前以て染色した
分子量の標準を含有する。レーン２は、SpaAを産生しな
いタバコの細胞抽出物からの150 μｇのタンパク質を含
有する。レーン３は、SpaAを産生するタバコの細胞抽出
物からの150 μｇのタンパク質を含有する。

【００６１】レーン４は、凍結乾燥し、そして−20℃に
おいて13日間貯蔵したSpaAを産生しないタバコの細胞抽
出物からの150 μｇのタンパク質を含有する。レーン５
は、凍結乾燥し、そして−20℃において13日間貯蔵した
SpaAを産生するタバコの細胞抽出物からの150 μｇのタ
ンパク質を含有する。レーン６は、凍結乾燥し、そして
室温において13日間貯蔵したSpaAを産生しないタバコの
細胞抽出物からの150 μｇのタンパク質を含有する。レ
ーン７は、凍結乾燥し、そして室温において13日間貯蔵
したSpaAを産生するタバコの細胞抽出物からの150 μｇ
のタンパク質を含有する。レーン８は、マウスの飼料と
凍結乾燥したSpaAを産生しないタバコとの１：１混合物
の300 μｇのタンパク質抽出物を含有する。タバコは室
温において13日間貯蔵した。レーン９は、マウスの飼料
と凍結乾燥したSpaAを産生するタバコとの１：１混合物
の300 μｇのタンパク質抽出物を含有する。タバコは室
温において13日間貯蔵した。レーン10は、マウスの飼料
の150 μｇのタンパク質抽出物を含有する。

【００６２】発明の詳細な説明 本発明は、（ａ）病原体のコロニナイゼイション抗原お
よび／またはビルレンス抗原、および／またはそれらの
抗原決定基および／または抗原または抗原決定基の融合
タンパク質を発現することができる植物、種子、および
植物組織；（ｂ）ヒトまたは他の動物における分泌免疫
応答の刺激に有用な組成物；（ｃ）ヒトおよび他の動物
において分泌免疫応答を刺激して、病原体による粘膜表
面を通るコロニナイゼイションおよび／または侵入を阻
止する方法；（ｄ）コロニナイゼイション抗原またはビ
ルレンス抗原の遺伝情報を指定するDNA 配列を含有する
独特ベクター；および（ｅ）植物において病原性微生物
のコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原を産
生する方法を包含する。明細書および請求の範囲の明瞭
なかつ首尾一貫した理解、用語に与えた範囲を包含す
る、を提供するために、次の定義を与える：

【００６３】抗原：ヒトまたは他の動物の中に導入した
とき、抗体の産生を刺激することができる高分子物質。
ここで使用するとき、抗原は抗原それ自体、前記抗原の
抗原決定基、または前記抗原または抗原決定基を含有す
る融合タンパク質を意味する。抗原決定基 ：抗原−抗体の反応の特異性を決定する、小
さい化学的複合体。病原体のコロニナイゼイション抗原
および／またはビルレンス抗原は、１または２以上の抗
原決定基を含有する。

【００６４】コロニナイゼイション抗原（colonization
antigen) またはビルレンス抗原（virulence antige
n)：これらは、病原性微生物の表面上にあって、それぞ
れ、該病原体のコロニー形成または宿主への侵入のため
に必須な抗原である。本明細書および請求の範囲におい
ては、コロニナイゼイション抗原もしくはビルレンス抗
原または両抗原に言及するであろう。病原体はコロニナ
イゼイション抗原もしくはビルレンス抗原またはこれら
の両抗原を有することができ、このためには、これらの
抗原一方または両方をコードするDNA 配列をベクターに
移行せしめ、そしてこのベクターにより植物を形質転換
することにより該植物に一方または両方の抗原を発現せ
しめる。

【００６５】キメラの配列または遺伝子：少なくとも２
つの異種部分、例えば、それらの先在する状態に関連し
ない先在するDNA 配列から誘導されるか、あるいはそれ
に対して実質的な配列の相同性を有する部分、を含有す
るDNA 配列。先在するDNA 配列は、自然または合成の由
来であることができる。コードDNA 配列 ：ペプチド分子、mRNAまたはtRNAを作る
情報がそれから転写されるDNA 配列。DNA 配列は遺伝
子、遺伝子の組み合わせまたは遺伝子断片であることが
できる。

【００６６】食物：食物または飼料、植物またはヒトお
よび他の動物が摂取する植物から得られる物質である。
この用語は、ヒトおよび他の動物に直接供給することが
できる生の植物物質、あるいはヒトおよび他の動物に供
給される処理した植物物質を包含する。植物から得られ
る物質は、ヒトまたは他の動物により究極的に摂取され
る植物の任意の成分を包含することを意図する。

【００６７】外来DNA ：形質転換すべき微生物または植
物に対して外因性であるか、あるいはそれらの中に天然
に存在しないDNA 。このような外来DNA は、ウイルス、
原核生物および真核生物のDNA を包含し、そして天然に
産生するDNA 、化学的に合成されたDNA, cDNA 、突然変
異したDNA またはそれらの組み合わせであることができ
る。本発明の外来DNA は、病原性微生物およびウイルス
のDNA から誘導されるか、あるいはそれに対して実質的
な配列の相同性を有することができる。遺伝子 ：明確な細胞産生物の原因となる明確な染色体の
領域。微生物 ：次のクラスの１つの構成員：バクテリア、菌・
かび、原生物またはウイルス。

【００６８】植物組織：植物または培養物における植物
の組織。この用語は、次のものを包含するが、これらに
限定されない：全植物、植物の細胞、植物の器官、植物
の種子、原形質体、カルス、細胞の培養物、および構造
的単位および／または機能的に有機化される植物細胞の
群。上に列挙したか、あるいはそうでなければこの定義
により包含される、植物組織と関連するか、あるいはそ
の不存在で、この用語の使用は、植物組織の他の型を排
除することを意図しない。

【００６９】植物の形質転換ベクター：植物組織が植物
組織の中に先在しないDNA を含有しかつそれを発現する
ように、植物組織を形質転換することができるプラスミ
ドまたはウイルスのベクター。先在するDNA 配列 ：本発明による産生物または方法にお
いて、使用の前に、全体であるいは一部分で、存在する
DNA 配列。このような存在は典型的には自然の由来を反
映するが、先在配列は合成または他の由来であることが
できる。

【００７０】分泌免疫応答：ヒトおよび他の動物の粘膜
表面のうるおす分泌における、および分泌腺からの分泌
における分泌IgA 抗体の形成および産生。このような抗
体の形成および産生を引き起こす因子は、分泌の免疫性
を刺激するか、あるいは分泌免疫応答を引き出すと考え
られる。分泌の免疫性は、また、特には粘膜の免疫性と
呼ぶ。実質的な配列の相同性 ：ヌクレオチドまたはアミノ酸の
配列の間の実質的な機能的および／または構造的同等
性。実質的な配列の相同性を有する機能的および／また
は構造的な差は、非常に小さいであろう。トランスジェニック植物 ：植物の中へのDNA の導入の前
に、植物の中に先在しなかったDNA を含有しかつそれを
発現する植物。

【００７１】大腸菌（Escherichia coli) のコロニナイ
ゼイション抗原および／またはビルレンス抗原 ブタ、仔ウシおよびヒトにコロニナイゼイションするエ
ンテロトキシンE.coliに対して有効な免疫性は、ブタの
飼料のためのＫ88線毛コロニナイゼイション抗原、仔ウ
シの飼料のためのＫ99線毛コロニナイゼイション抗原、
およびヒトのためのCFA 線毛コロニナイゼイション抗原
を発現する植物物質を含めることによって達成すること
ができる。E.coliエンテロトキシンのＢサブユニットを
含有する植物物質は、ヒト、仔ウシおよびブタのための
食料の中に添加して、線毛のコロニナイゼイション抗原
に対する免疫応答を増強するアジュバントとして働かせ
ることができるばかりでなく、かつまたブタ、仔ウシお
よびヒトを感染するE.coliのほとんどの腸毒性の菌株に
より産生されるエンテロトキシンに対する保護的免疫性
を誘発することができる。

【００７２】種々の配合物を調製することができるの
で、多数の病原体に対して同時に免疫化することができ
るであろう。適当な時間に食物を連続的に供給して、若
い動物において保護的免疫性を誘発することができるば
かりでなく、かつまた種々の成体の雌を免疫化して、有
効な免疫性を卵を通して、胎盤の転移、または初乳およ
び乳において子孫に伝達することができる。

【００７３】熱不安定性毒素Ｂサブユニット E.coliの熱不安定性エンテロトキシンのための遺伝子の
ヌクレオチド配列は決定された。ヤマモト、T.およびヨ
コタ、T.、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
ctriol.)155 、728(1983) 。全体のＢサブユニット遺伝
子を含有するEcoRI-Hind IIIのDNA 断片は、この分野に
おいて標準の方法により、植物の形質転換ベクターpSUN
387(参照、図７）の中に挿入し、そしてさらにオリゴヌ
クレオチド合成または制限酵素NspbIIまたはMaeIを使用
して修飾することができ、ここで制限酵素NspbIIまたは
MaeIはヌクレオチド配列をＣ末端から７アミノ酸または
０アミノ酸を切断して、多数のクローニング部位の挿入
を可能として、非常に多数の融合遺伝子産生物の産生を
促進して、Ｎ末端配列として熱不安定性毒素のＢサブユ
ニット（LT-B）をもつ融合タンパク質の産生に導く。

【００７４】こうして、LT-B配列を植物の形質転換ベク
ターの中に挿入することができ、そしてそれを適当な植
物種の中で発現させることができる。LT-Bに対するsIgA
の誘発は、完全なLT毒素の取込みをブロッキングし、こ
れによりエンテロトキシン発生のE.coliの感染に関連す
る下痢の苛酷さを減少するであろう。植物が、また、Ｋ
99またはＫ88または他の線毛の付着性抗原を産生する場
合、sIgA応答の誘発は、また、エンテロトキシン発生の
E.coliによるコロニナイゼイションを阻害し、こうして
下痢を大きく減少するであろう。

【００７５】E.coliのPap 線毛遺伝子 線毛の付着のための遺伝子を包含する尿路病原性E.coli
はクローニングされ、ランド（Lund) 、B.ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bactriol.)162 、1293
(1985)、引き続いて配列決定された。尿路病原性E.coli
はいくつかの異なる線毛付着を発現することができ、そ
していくつかの異なる線毛の型を発現するクローニング
された遺伝子は入手可能である、クレッグ（Clegg)、
S.、インフェクション・アンド・イミュニイー（Infec
t.Immun.)38、739(1982) ；バン・ダイ（Van Die)、I.
ら、FEMSマイクロバイロジカル・レターズ（Microbiol.
Lett.)19、77(1983)；ノーマーク（Normark)、S.ら、イ
ンフェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Immu
n.)41、942(1983) 。

【００７６】E.coliＫ99の線毛の抗原 Ｋ99の線毛抗原は、仔ウシにおける下痢を引き起こすエ
ンテロトキシン発生E.coli菌株により発現される。Ｋ99
線毛抗原のための遺伝子はクローニングされ、そして発
現され、バン・エンブデン（van Embden) 、J.D.A.ら、
インフェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Imm
un.)29、508(1984) そして配列決定された、ルーゼンダ
ール（Roosendhal) 、E.ら、FEMSマイクロバイロジカル
・レターズ（Microbiol.Lett.)22、253(1984) 。したが
って、それを植物の形質転換ベクターの中に挿入するこ
とは簡単である。Ｋ99線毛に対するsIgAの誘発は、仔ウ
シの腸中のコロニナイゼイションをブロッキングし、こ
れにより下痢を防止する。

【００７７】E.coliＫ88の線毛抗原 Ｋ88線毛抗原は、ブタにおける重い下痢の病気を引き起
こすエンテロトキシン発生E.coli菌株により発現され
る。腸のコロニナイゼイションに必要なＫ88線毛抗原の
ための遺伝子はクローニングされ、ムーイ（Mooi) 、F.
R.、ELら、核酸の研究（Nuc.Acids Res.) ６、849(197
9) 、ケホエ（Kehoe)、M.ら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（J.Bactriol.)155 、1071(1983)そして配
列決定された、ガストラ（Gastra) 、W.ら、FEMSマイク
ロバイロジカル・レターズ（Microbiol.Lett.)12、41(1
981)。したがって、この配列を植物の形質転換ベクター
の中に挿入し、こうしてそれを植物中で合成することが
できる。

【００７８】ヒトおよび他の動物の宿主においてエンテ
ロトキシン発生および腸病原性E.coliのコロニナイゼイ
ションを可能とする他の線毛付着体のための遺伝子は同
定され、そしてある場合においてクローニングおよび配
列決定された、参照、F.R.およびデグラーフ（deGraa
f)、F.K.、カレント・トピックス・オブ・マイクロバイ
オロジカル・イムノロジー（Curr.Top.Microbiol.Immno
l.)118、119(1985) ；ケイパー（Kaper)、J.B.およびM.
M.レビン（Levine) 、ワクチン（Vaccine)６、197(198
8) 。

【００７９】ストレプトコッカス・ムタンス（Streptoc
occus mutans) のコロニナイゼイション抗原および／ま
たはビルレンス抗原 ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) の表面に関
連するタンパク質は、次のものを包含する：表面タンパ
ク質抗原Ａ（SpaA) 、グルコシルトランスフェラーゼＢ
（GtfB) 、デキストラナーゼ（GtfC) 、およびブルカン
結合タンパク質。

【００８０】ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutan
s) 血清型抗原Ａ（SpaA) ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) 血清型ｇ菌
株UAB90 からのspaA遺伝子は、E.coli中のコスミドベク
ター上でクローニングされた、ホルト（Holt)ら、198
3、前掲。このタンパク質は、歯の表面の初期のコロニ
ナイゼイションに必須であり、そしてその不存在は胚芽
不含ラットのコロニナイゼイションを排除する〔カーチ
ス（Curtiss)ら、1987a supra ；1987b 前掲〕。spaA遺
伝子はサブクローニングされ、このタンパク質の主要な
抗原決定基は決定され、そして遺伝子のこれらの領域は
配列決定された。

【００８１】ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutan
s) のグルコシルトランスフェラーゼＢ ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) のグルコシ
ルトランスフェラーゼＢは、gtgB遺伝子によりエンコー
ドされ、そして水不溶性グルカンポリマーおよび遊離の
フルクトースをスクロースから合成する。遺伝子はクロ
ーニングされ、そして配列決定された、シロザ（Shiroz
a)、T.ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
ctriol.)169 、4263(1987)。プラスミドUS20(9.3kb)
は、165,800 キロダルトン（kDa)のGtfBタンパク質をエ
ンコードする6.5kb のPstI断片を含有する。既知のヌク
レオチド配列およびATG 開始コドンの位置に基づいて、
解読配列は普通の技術を使用して植物の形質転換ベクタ
ーの中に挿入される。

【００８２】ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobr
inus) 〔ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans) 血
清型ｇ〕のデキストラナーゼ遺伝子 pYA902コスミドのクローンは、ストレプトコッカス・ソ
ブリヌス（S.sobrinus) デキストラナーゼを発現する。
J.F.ら、インフェクション・アンド・イミュニイー（In
fect.Immun.)55、792-802(1987) 、およびジャコブス
（Jacobs) 、W.R.ら、インフェクション・アンド・イミ
ュニイー（Infect.Immun.)52、101(1986)。

【００８３】pYA902のDNA の部分的PvuII 消化物は、デ
キストラナーゼ遺伝子のすべてまたは一部分をもつ１系
列のプラスミドを発生した。pYA993は、110kDaのわずか
に切頭のデキストラナーゼを発現する5.45kbのプラスミ
ドである。pYA993中のデキストラナーゼ解読配列のすべ
てを含有する2.6kb のPvuII 断片は、正しい向きでpUC8
のSmaI部位の中に平滑末端の結合によりクローニングさ
れた。この断片はデキストラナーゼATG 開始コドンであ
るが、デキストラナーゼのプロモーターを欠く。こうし
て、それは容易に植物の形質転換ベクターの中に挿入し
て、植物のプロモーターの制御下に直接発現されるか、
あるいは、例えば、spaA解読配列のＣ末端に融合した直
列の融合構成体として発現されることがある。

【００８４】植物の形質転換ベクター 本発明のベクターは、コロニナイゼイション抗原および
／またはビルレンス抗原の遺伝情報を指定するDNA を含
有し、そして植物を形質転換することができるベクター
である。外来DNA は、形質転換すべき有機体に対して外
因性であるか、あるいはその中に自然に存在しないDNA
である。それはクローニングベクターの中に挿入して植
物を形質転換することができる。本発明の外来DNA は、
病原性の微生物およびウイルスのDNA から誘導される
か、あるいはそれに対する実質的な配列の相同性を有す
る。

【００８５】本発明のベクターは標準の技術により産生
される。しかしながら、産生されるベクターは、どのタ
イプの形質転換であるかおよび形質転換される植物がど
の種であるかに依存するであろう。例えば、植物の原形
質体が形質転換されるとき、ベクターはTiプラスミド誘
導ベクターであるか、あるいは直接的遺伝子転移手段に
より原形質体の中に導入することができるベクターであ
ることができる。植物または植物の器官またはその一部
分が形質転換される場合、ベクターはこのタイプの組織
を形質転換することができなくてはならない。この場合
において、新規な植物の形質転換ベクターはTiプラスミ
ド誘導ベクターに基づくようであるが、微小投射体の形
質転換に有用なベクターは、また、使用することができ
る。

【００８６】出発物質として利用することができる適当
なベクターは、この分野において知られている。植物組
織の形質転換に適当なベクターは記載され、デフラモン
ド（deFramond)、A.ら、バイオ／テクノロジー(Bio／Te
chnology) １、263(1983) ；アン（an) 、G.ら、EMBOジ
ャーナル（J.) ４、277(1985) ；ポトリクス（Potryku
s) 、I.ら、前掲；ロスステイン（Rothstein)S.J.ら、
遺伝子（Gene)53 、153(1987) 、ならびに他のベクター
は前述の参考文献に記載されている。これらのベクター
に加えて、本発明における使用に適当な多数の他のベク
ターはこの分野において産生されてきている。

【００８７】ベクターの構成は適当な宿主、例えば、E.
coli中で実施することができる。適当なE.coli菌株は次
のものを包含するが、これらに限定されない：HB101, J
M83,DH1, DH5 α, LE392 など。ベクターを直接の遺伝
子転移またはマイクロインジェクション技術において使
用する場合、それらは直接使用することができる。ある
場合において、ベクターは使用前に直線化することが好
ましい。ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（A.tumefaciens)宿主中で使用するとき、ベクター
をまず適当な菌株に転移しなくてはならない。

【００８８】この転移は普通の技術、例えば、バイペア
レンタル・メイティング（biparental mating)、シモン
（Simon)、R.ら、バイオ／テクノロジー(Bio／Technolo
gy)１、74(1983)、トリペアレンタル（triparental)メ
イティング、ディッタ（Ditta)、G.ら、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 、77、7347(1980)また
は形質転換；ホルスターズ（Holsters) 、M.ら、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
c.Gen.Genet.)163、181(1978) ／アグロバクテリウム・
ツメファシエンス（A.tumefaciens)の適当な菌株は、次
のものを包含するが、これらに限定されない：LBA4404
。

【００８９】本発明のベクターは、ヒトおよび他の動物
における病気を引き起こすことが知られている種々の病
原体からのコロニナイゼイション抗原またはビルレンス
抗原をコードするDNA 配列を含有する。次の説明および
実施例の多くは病原性バクテリアの中に自然に存在する
DNA 配列に向けられるが、この説明はウイルス、菌・か
び類および寄生体の病原体中に存在しかつそれらからク
ローニングすることができる、このような配列に等しく
適用される。もちろん、コロニナイゼイション抗原およ
び／またはビルレンス抗原またはそれらの一部分をコー
ドするように合成により誘導されたDNA 配列は、同様
に、包含される。

【００９０】病原体のコロニナイゼイション抗原および
／またはビルレンス抗原またはそれらの一部分の遺伝情
報を指定するDNA 配列は、普通の手段により得られ、そ
して植物の形質転換のために適当なベクターの中に挿入
される。例えば、DNA 配列はゲノムのクローンの遺伝子
バンクから分離することができる。あるいは、DNA 配列
は逆転写により調製することができる。次いで、ベクタ
ーは、形質転換された細胞、組織および植物を生じさせ
る、種々の既知の技術により植物細胞の中に導入され
る。

【００９１】コロニナイゼイション抗原および／または
ビルレンス抗原またはそれらの一部分のアミノ酸配列が
既知である場合、DNA 配列は化学的に合成することがで
きる。いくつかの先行技術の方法を利用して、コロニナ
イゼイション抗原またはビルレンス抗原のアミノ酸配列
を決定することができる。アミノ酸配列の一部分を決定
し、そして逆転写のためのプローブを調製することがで
きる。DNA 配列はコロニナイゼイション抗原またはビル
レンス抗原の特定のアミノ酸配列のための、あるいはそ
の抗原決定基の１または２以上のための解読配列を含有
することができる。DNA 配列は、また、コロニナイゼイ
ション抗原またはビルレンス抗原を含有するタンパク質
のすべてまたは一部分の遺伝情報を指定する、追加の解
読配列を含有することができる。

【００９２】病原性微生物のコロニナイゼイション抗原
またはビルレンス抗原またはその一部分をコードするDN
A 配列を、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス
抗原が正しく発現されるような方法で、適当なベクター
の中に挿入される。換言すると、DNA 配列は、正しいア
ミノ酸配列が植物組織中でDNA 配列されるときに産生さ
れるように、適切な向きおよびリーディングフレームで
位置する。普通の技術に従い、植物組織中で操作可能な
プロモーターおよびコロニナイゼイション抗原またはビ
ルレンス抗原の遺伝情報を指定するDNA 配列を含有す
る、キメラDNA 配列が一般に構成される。キメラDNA 配
列は、さらに、植物組織中で操作可能な３′非解読配列
を含有することができる。

【００９３】キメラDNA 配列は、さらに、融合タンパク
質が発現のときに産生されるように、コロニナイゼイシ
ョン抗原またはビルレンス抗原を含有するタンパク質以
外のポリペプチドのための解読配列を含有することがで
きる。キメラDNA 配列は、適当なベクター内で、コロニ
ナイゼイション抗原またはビルレンス抗原の遺伝情報を
指定するDNA 配列を既知の植物の形質転換ベクターの制
限部位の中に挿入することによって調製することができ
る。あるいは、キメラ遺伝子を、まず、構成し、そして
ベクターの中に挿入して、植物の形質転換ベクターを産
生することができる。

【００９４】コロニナイゼイション抗原またはビルレン
ス抗原またはその一部分を修飾して、タンパク質分解に
対する抵抗性を増加することができる。これを実施する
ために、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗
原と、腸のプロテアーゼに対して完全に抵抗性でありか
つ経口的に投与した抗原のアジュバントとして作用する
ペプチドとの間の融合構成体を遺伝子操作することがで
きる。LT-Bはこれらの特性の両者を有する。他のペプチ
ドは、前述のコレラトキシンのＢサブユニット（CT-B)
、PaoGタンパク質のアドヘシン（adhesin)などを包含
する。融合構成体は普通の技術により調製される。

【００９５】植物の形質転換 植物の細胞を前述のベクターでこの分野において知られ
ている技術、例えば、前述の参考文献に記載されている
技術、および下の実施例に詳細に記載されている技術に
より形質転換する。これらの技術は、次のものを包含す
るが、これらに限定されない：植物または植物組織のア
グロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)
による直接感染または同時培養。非常に適当な技術は、
葉のディスクの形質転換である、ホーシュ（Horsch) 、
R.B.ら、サイエンス（Science)225 、1229(1985)。

【００９６】あるいは、ベクターは直接、例えば、エレ
クトロポレイション、マイクロインジェクション、微小
投射体、あるいはポリエチレングリコール（PEG)、塩化
カルシウムの存在下または電場中の原形質体の形質転換
により転移することができる。形質転換後、形質転換さ
れた細胞または植物組織を普通の技術により選択または
スクリーニングする。次いで、前述のキメラDNA 配列を
含有する形質転換された植物または植物組織を既知の手
順、例えば、前述の参考文献および下の実施例において
単子葉植物および双子葉植物の両者について記載されて
いる技術により再生する。

【００９７】これらの技術により再生することができる
種は、次のものを包含するが、これらに限定されない：
トウモロコシ、ヒマワリ、菜種、クローバー、タバコ、
アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリお
よびダイズ。再生された植物を標準の方法により形質転
換についてスクリーニングする。再生された植物の子孫
を組み込まれたDNA 配列の連続的存在についてスクリー
ニングおよび選択して、改良された植物および種子の系
統を発育させる。DNA 配列は他の遺伝子系統の中に種々
の技術、例えば、古典的育成、原形質体の融合、核の転
移および染色体の転移により動かすことができる。

【００９８】免疫性を誘導するための組成物 抗原の発現のレベルは、しばしば、ベクター中の挿入の
部位により影響を受けることがある。トランスジェニッ
ク植物中で発現されたコロニナイゼイション抗原または
ビルレンス抗原の量は、また、適当なベクターで形質転
換してコロニナイゼイション抗原および／またはビルレ
ンス抗原のコピーの数を増加することによって最適化す
ることができる。SpaAタンパク質の産生は、少なくとも
３つの異なる方法で再形質転換することによって最大に
することができる。前述のベクター、増強したプロモー
ターの効率をもつベクターの構成体、あるいはspaA遺伝
子配列またはspaA抗原決定基の配列の多数のコピーを有
するベクターは、既にspaA遺伝子物質を有する植物の中
に挿入することができる。

【００９９】多数の再生した植物は、コロニナイゼイシ
ョン抗原またはビルレンス抗原について検査すべきであ
る。最高のレベルのコロニナイゼイション抗原またはビ
ルレンス抗原の安定な産生を生ずる植物を選択する。コ
ロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原のターン
オバー速度は許容されえないほど高い場合、タンパク質
は種々の手順により修飾して植物中の植物の安定性を高
めることができる（すなわち、抗原をコードするDNA 配
列の部位特異的突然変異によるプロテアーゼ切断部位の
除去または変更）。タンパク質を特定する遺伝子は操作
して、タンパク質を種子の中に貯蔵タンパク質として導
入し、これにより高いレベルの安定な産生を確実にする
ことができる。これは、例えば、ダイズおよび穀粒にお
いて最も実際的である。

【０１００】有効な免疫原であるために、植物により発
現されたコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗
原は食物処理および消化に耐えることができるために十
分な安定性をもたなくてはならない。植物物質はヒトま
たは他の動物に直接供給することができるか、あるいは
タンパク質を変性しない手段により食物に処理すること
ができる。例えば、所望のコロニナイゼイション抗原ま
たはビルレンス抗原を含有するトランスジェニック植
物、例えば、アルファルファまたはトウモロコシは、ヒ
トまたは他の動物、例えば、畜牛に直接供給することが
できるであろう。

【０１０１】コロニナイゼイション抗原またはビルレン
ス抗原が腸病原性またはエンテロトキシン発生性E.coli
からのものであった場合、下痢に対する分泌免疫性を畜
牛において産生することができる。同様に、病原性微生
物のコロニナイゼイション因子またはビルレンス因子を
発現する種々のトランスジェニック植物の種子を直接ヒ
トは摂取して、それに対する分泌免疫応答を引き出すこ
とができるであろう。あるいは、トランスジェニック植
物は普通の技術により処理してヒトおよび他の動物のた
めの食物を産生することができる。例えば、トランスジ
ェニックトウモロコシを処理して、動物に供給するか、
あるいはヒトのための食物の調製に使用することができ
るコーンミールを産生することができる。

【０１０２】ある場合において、コロニナイゼイション
抗原またはビルレンス抗原は容易に変性することができ
ず、したがって、ある場合において、食物の料理は免疫
原性を破壊しないことがあることが考えられる。これ
は、沸騰またはイオン性洗浄剤を使用する処理による変
性後、その免疫活性を保持するSpaAタンパク質に関して
真実である。他方において、他のコロニナイゼイション
抗原またはビルレンス抗原は変性に対してそのように抵
抗性でないことがある。ある場合において、変性に対す
るコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原の増
加した安定性は、変性を阻止するか、あるいは自発的再
生を促進するポリペプチドに抗原を適当な条件下に融合
することによって達成することができる。

【０１０３】コロニナイゼイション抗原およびビルレン
ス抗原の安定性 形質転換された植物中の病原性微生物の主要なコロニナ
イゼイション抗原および／またはビルレンス抗原の量、
安定性および免疫原性は、よく知られている手段、とく
に免疫学的手段により評価することができる。これらの
変数は形質転換された原形質体およびカルスにおいて、
および成熟した植物の根、茎、葉および種子において測
定することができる。

【０１０４】植物ベクター中でストレプトコッカス・ム
タンス（S.mutans) またはE.coliのDNA により特定され
そして組み換えE.coliおよび他の適当な微生物中で発現
されたコロニナイゼイション抗原および／またはビルレ
ンス抗原は、摂取後、安定性について試験することがで
きる。既知のコロニナイゼイション抗原および／または
ビルレンス抗原を発現する微生物の培養物は、既知の方
法、例えば、熱または放射能により殺す。次いで、それ
を既知の動物の食物、例えば、商業的に入手可能なマウ
スの飼料に添加し、そして食物の処理にかける。

【０１０５】増強しそして処理したマウスの飼料からの
タンパク質は、摂取の前におよび摂取の後の消化の種々
の段階において、コロニナイゼイション抗原および／ま
たはビルレンス抗原の量について分析することができ
る。分析は種々の既知の方法により実施することがで
き、このような方法は次のものを包含するが、これらに
限定されない：ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)のポリア
クリルアミドゲルの電気泳動に従うウェスタン・ブロッ
ト分析、免疫沈澱および酵素結合免疫吸収アッセイ（EL
ISA)。消化の種々の段階における抗原の量は、摂取前の
量と比較することができる。

【０１０６】コロニナイゼイション抗原およびビルレン
ス抗原の経口的摂取後の免疫応答 抗原の免疫原性は同様によく分析される。ビルレンス抗
原は摂取のとき分泌免疫応答を引き出すそれらの能力に
ついて評価し、そして分泌免疫応答はコロニナイゼイシ
ョン抗原およびビルレンス抗原が腸の酵素によりそれら
の免疫原性を破壊しないで胃腸管を通して生き残る能力
に依存する。熱または放射能により殺されたストレプト
コッカス・ムタンス（S.mutans) 、組み換えE.coliまた
は他の適当な微生物で増強された植物物質を食物処理に
かける。次いで、それを乾燥または凍結して貯蔵するこ
とができる。トランスジェニック植物は、また、処理
し、そして動物に供給するか、あるいは動物飼料と混合
し、そして酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA)を使用し
て、唾液または腸洗浄液中のコロニナイゼイション抗原
またはビルレンス抗原に対するsIgAを定量することによ
って、免疫原性決定する。

【０１０７】実施例 下の実施例において使用した組み換えDNA および方法 DNA の操作は、特記しない限り、製造業者が推奨する手
順に従い酵素を使用して実施した。すべての酵素はニュ
ー・イングランド・バイオラブス（New England Biolab
s)またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethes
da Research Laboratories)(BRL) から入手した。すべ
てのベクター構成は、特記しない限り、E.coli DH1, JM
83またはDH5 α中で実施した。ベクターは、普通の技術
を使用して、構成の菌株と異なるE.coliの菌株の中に導
入した。

【０１０８】DNA の分離およびE.coliの形質転換は、ハ
ナハン（Hanahan)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（J.Mol.Biol.)166 、557(1983) に従い
実施した。15％のポリエチレングリコール（PEG)中の平
滑末端の結合は、リバック（Livak)、アナリティカル・
バイオケミストリー（Anal.Biochem.)152 、66(1986)に
従い実施した。

【０１０９】追加の技術は、次の参考文献に記載されて
いる：マニアチス（Maniatis) 、T.ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labora
toryManual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spring Harbor L
aboratory)、コールド・スプリング・ハーバー（ColdSp
ring Harbor) 、第２版、ニューヨーク（1988）、メソ
ッズ・イン・エンジモロジー（Methods in Enzymology)
Vol.68(1979)、Vol.100(1983) 、Vol.101(1983) 、Vol.
118(1986) およびVol.152-154(1987) ；およびプラント
・モレキュラー・バイオロジー（Plant Molecular Biol
ogy)：マニュアル、ゲルビン（Gelvin)、SBおよびシル
ロールト（Schilperoort) 、RA編、クルワー・アカデミ
ック・パブリッシャーズ（Kluwer Academic Publisher
s) 、ドドレヒト（Dodrecht)(1988) 。

【０１１０】実施例１ Ｉ．ベクターの構成 コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原をエン
コードするDNA 配列で植物を表現的に形質転換するため
に有用なベクターは、pSUN341 およびpSUN343である。
広範な情報を実施例１に含めて、広く知られそして一般
に入手可能である出発物質から、これらのベクターを構
成できるようにした。ここで入手可能である広範な情報
は、他の出発物質からの同様なベクターの構成を可能と
するであろう。

【０１１１】Ａ．プラスミドベクターpSUN341 およびpS
UN343 の構成 １．pSUN450 の構成 プラスミドpSUN214(ATCC 67470) をPstIおよびHindIII
で消化した。真核生物の遺伝子の発現に要求されるPoly
A 付加のための部位を提供するために、クロランフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)の遺伝子およ
び３′-NOPS(ヘパリンシンターゼ）を含有する、1.6kb
の断片を分離した。プラスミドpUC18 をPstIおよびHind
III で消化し、そして分離した断片で結合した。生ずる
プラスミドpSUN218 を分離した。

【０１１２】プラスミドpSUN218 をSmaIで消化し、そし
て仔ウシ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理した。プ
ラスミドpCE101、グイレイ（Guilley)、H.ら、細胞（Ce
ll)30 、763(1982) 、をK.リチャーズ（Richards) から
入手し、そしてHphIで消化した。カリフラファーのモザ
イクウイルスの35Ｓプロモーターを含有する断片、植物
細胞中の転写を可能とする配列を分離し、そしてT4 DNA
ポリメラーゼで処理した。この断片は15％のPEG 中で処
理したpSUN218 に平滑末端結合してプラスミドpSUN444
を産生した。

【０１１３】プラスミドpSUN204(ATCC 67469) をHindII
I で消化し、次いで部分的にPstIで消化した。より大き
い1.6kg のAPTII-３′-NOPS を含有する断片を分離し
た。APTII 遺伝子は抗生物質のカナマイシン、ネオマイ
シンおよびG418に対する抵抗性を与え、そしてそれ自体
植物における有用な形質転換、選択決定基を提供する。
プラスミドpUC18 をPstIおよびHindIII で消化し、そし
てAPTII-３′-NOPS 断片に結合した。生ずるプラスミド
をpSUN219 と識別した。

【０１１４】pSUN219 をSalIで消化し、そしてDNA ポリ
メラーゼＩのクレノー断片で処理した。次いで、DNA を
HindIII で消化し、そしてAPT II-3′-NOPS 配列を含有
する断片を分離した。プラスミドpSUN444 をBamHI で消
化し、そしてDNA ポリメラーゼＩのクレノー断片で処理
した。次いで、処理したベクターをHindIII で消化し
た。3.5kb のより大きい断片をpSUN219 からのAPT II-
3′-NOPS を含有する断片に結合した。生ずるプラスミ
ドをpSUN450 と表示した。pSUN450 の構成および部分的
地図を図１に示す。

【０１１５】２．pSUN470 の構成 プラスミドpSUN450 をHindIII で消化し、そしてDNA ポ
リメラーゼＩのクレノー断片で処理した。次いで、処理
したベクターをKpnIで消化し、そして35Ｓプロモータ
ー、APT IIおよび37-NOPS 配列を含有する2.5kb の断片
を分離した。プラスミドpSUN470(G.Anから入手した）を
SalIおよびEcoRI で消化した。左の境界（Ｂ₁ ）を含有
する500bp の断片を分離し、そしてpUC18 のEcoRI 部位
中に結合した。

【０１１６】pSUN402 をEcoRI で消化し、そしてDNA ポ
リメラーゼＩのクレノー断片で処理した。次いで、処理
したベクターをKpnIで消化し、そしてpSUN450 から分離
した断片に結合した。プラスミドpSUN470 が同定され
る。pSUN340 の構成および部分的地図を図２に示す。pS
UN470 はKpnI〜HindIII からの制限部位を包含するpSUN
218 の多数のクローニング部位（MCS)を含有する。

【０１１７】３．pSUN221 の構成 E.coli中の増幅可能な複製のためのプラスミドpBR322の
複製の由来（ori)およびアグロバクテリウム（Agrobact
erium)中の複製を可能とする広い宿主範囲のプラスミド
pSa727の由来〔タイト（Tait) 、R.C.ら、バイオテクノ
ロジー（Biotech)１、269(1982) 〕ならびにバクテリオ
ファージラムの粘着末端（COS)からなる配列をHindIII
で消化し、そして仔ウシ腸のアルカリ性ホスファターゼ
で処理した。T-DNA の右の境界およびアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium)プラスミドpTi337からのノパリンシ
ンターゼ遺伝子を含有するHindIII 断片No.23(H23)、ベ
バン（Bevan)、M.ら、supura、をMWB2341 ：Ｈ23〔W.バ
ルネス（Barnes) から入手した〕のHindIII の消化後分
離した。Ｈ23断片をHindIII 消化プラスミドpSUN220 に
結合してプラスミドpSUN221 を産生した。pSUN221 の構
成を図３に示す。

【０１１８】４．pSUN473 の構成 プラスミドpSUN221 をPstIおよびEcoRI で消化し、そし
てヤエナリヌクレアーゼで処理した。プラスミドpSUN47
0 をPvuIで消化し、そしてヤエナリヌクレアーゼで処理
した。35Ｓプロモーター、APT II, ３′NOPSおよびＢ_L
配列を含有する3.1kb のPvuI断片を分離し、そして15％
のPEG 中で処理したpSUN221 に平滑末端結合した。pSUN
221 のアンピシリン抵抗性決定基（Amp ^R ) はこの方法
において破壊された。生ずるプラスミドをpSUN473 と識
別した。pSUN473 の構成および部分的地図を図４に示
す。pSUN473 は、複製のpSa 由来のために、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)中で維持
することができ、そして遺伝子操作したT-DNA 配列の植
物への転移のためのバイナリーベクターとして使用する
ために適する。

【０１１９】５．pSUN474 の構成 植物中の形質転換選択決定基として有用な抗生物質のハ
グロマイシン（hph)に対する抵抗性を与える遺伝子の源
として、プラスミドpSV2-hphをC.カド（kado)、カリフ
ォルニア大学、カリフォルニア州デイビス、から入手し
た。pSV2-hphはHindIII およびBgl IIで消化し、そして
hph 遺伝子を含有する1.4kb の断片を分離し、そして精
製した。

【０１２０】プラスミドpBSMをベクター・クローニング
・システム（Vector Cloning System)、現在ストラテジ
ーン・クローニング・システム（Stratgene Cloning Sy
stem) として知られている、カリフォルニア州ラジョ
ラ、から入手し、そしてHindIII およびBamHI で消化
し、次いで仔ウシ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理
した。次いで、pSV2-hphからの1.4kb のhph 断片を消化
したpBSMに結合してpSUN474 を産生した。

【０１２１】６．pSUN475 の構成 プラスミドpSUN474 をHindIII およびAvaIで消化し、そ
してこの消化により産生したDNA 断片の「粘着末端」を
dNTPの存在下にE.coli DNA PolI のクレノー断片で処理
することによって平滑末端とした。hph 遺伝子を含有す
る1.3kb の断片を分離し、そして精製した。プラスミド
pSUN473 をEcoRI で消化し、dNTPの存在下にE.coli DNA
PolI noのクレノー断片で処理し、次いで仔ウシ腸のア
ルカリ性ホスファターゼで処理した。ほぼ13kbの断片を
分離し、そして精製した。この13kbの断片および1.3kb
のhph 断片を15％のPEG 中で平滑末端結合してpSUN475
を産生した。hph 断片のフィル−インしたAvaI末端に結
合したとき、pSUN473 のフィル−インしたEcoRI 末端は
EcoRI 部位を再生した。pSUN475 の構成および部分的地
図を図５に示す。

【０１２２】７．pSUN480 の構成 プラスミドpSUN214(ATCC 6740)（図１参照）をBamHI で
消化し、次いでdNTPの存在下にE.coli DNA PolI のクレ
ノー断片で処理して末端をフィルインした。さらにEcoR
I で消化し、次いで仔ウシ腸のアルカリ性ホスファター
ゼで処理すると、３′NOPS配列およびpSUN214 の中に存
在する複製およびアンピシリン抵抗性決定基の配列のpU
C 由来を含有する3.4kb の断片の分離および精製が可能
となった。

【０１２３】pSUN475 をXbaI（これは多数のクローニン
グ部位MCS において切断する）で消化し、次いでdNTPの
存在下にE.coli DNA PolI のクレノー断片で処理して末
端をフィルインした。次いで、生ずる直線化したpSUN47
5 をEcoRI で部分的に消化し、そしてCaMV、35Ｓプロモ
ーターおよびhph 解読配列を含有する2.15kgの断片を分
離し、そして精製した。この断片をpSUN214 からの3.4k
b の断片に結合し、そして生ずるプラスミドpSUN480 で
あり、これを図６に示す。

【０１２４】８．pSUN339 およびpSUN340 の構成 pSUN208(図６参照）をCfoIで消化し、そしてdNTPの存在
下にＴ₄ ポリメラーゼで処理して平滑末端を発生させ
た。spaA配列への発現可能なlac 融合を含有する約2280
塩基対の断片を分離した。プラスミドpYA208は、spaA遺
伝子を正しい向きで含有するBamHI 断片を含有する。ベ
クターpSUN480 をPstIおよびEcoRI で消化して、ハイグ
ロマイシン抵抗性を除去し、そしてＴ４ポリメラーゼお
よびdNTPで処理して、平滑末端を発生した。より大きい
4170塩基対の断片を分離した。lac-spaA断片を、hph 断
片の代わりに正しい向きで35Ｓおよび３′NOPS配列の間
に結合してプラスミドpSUN339 を産生した。ベクター配
列に関して反対の向きにlacZ-spaA インサートを有する
pSUN340 もまた分離した（図６〜図７参照）。

【０１２５】９．pSUN341, pSUN342およびpSUN343 の構
成 プラスミドpSUN339 をScaIおよびAsuII で消化し、そし
て約3263塩基対の35S-lacZ-spaA-３′NOPS断片を分離し
た。断片のAsuII 末端をE.coli DNA PolI のクレノー断
片を使用してdNTPをフィルインした。プラスミドpSUN47
3(図４）をXbaIで消化し（これは多数の切断部位の配列
の中に単一の部位を有する）そして５′末端をE.coliの
DNA ポリメラーゼＩのクレノー断片を使用してdNTPで処
理した。pSUN339 からの35S-lacZ-3′NOPS発現カセット
を、ベクターの35S-APTII-３′NOPS配列に関して異なる
向きにおいて、消化したプラスミドpSUN473 に結合し
た。プラスミドpSUN341 はこれらの配列の組を頭対頭の
向きで含有する。プラスミドpSUN343 はこれらの配列の
組を頭尾の向きで含有する。

【０１２６】プラスミドpSUN342 は、ScaI-AsuII消化の
ための出発物質としてpSUN340 を使用して同様に方法で
構成した。プラスミドpSUN344 およびpSUN345 はpSUN34
3 と同一の独立の分離物である。プラスミドpSUN346 は
pSUN341 と同一の独立の分離物である。pSUN341, pSUN3
42およびpSUN343 の構成は図８に示す。pSUN341 および
pSUN343 はベクターに関してインサートの反対の向きを
有するが、CaMV 35Sおよびlac プロモーターを同一の向
きでもち、E.coliおよび植物の両者におけるspaAの発現
を可能とする。

【０１２７】E.coli DH5α中のpSUN341 およびE.coli D
H5α中のpSUN343 は、ブダベスト条約に基き1988年８月
31日にATCCに受託されそして、それぞれ、番号67,787お
よび67,785を付された。pSUN342 は、XbaI切断pSUN473
中のpSUN340 のScaI-AsuII断片を使用して対照として構
成した。この構成において、SpaAは植物中ではなくlac
プロモーターの制御下にE.coli中で合成すべきである。
なぜなら、CaMV 35Sプロモーターは誤った向きにあるか
らである（図８参照）。

【０１２８】Ｂ．pSUN387 の構成 プラスミドpSUN387 は、プラスミドpUC18, pSUN335およ
びpSUN491 の成分を含有する。pSUN491(ATCC No.67786)
はブダベスト条約の規定に従い受託された。pUC の成分
は、多数のクローニング領域のEcoRI およびHindIII 部
位より外側のすべての配列を包含する。これは複製の由
来およびアンピシリン抵抗性の遺伝子を含有する。pSUN
491 からの配列は、CaMV35Ｓプロモーターを含み、327b
p のHincII-EcoRV断片の直列の重複をもち、この断片は
35Ｓプロモーターおよび植物系中の他の異種プロモータ
ーに転写増強を与えることが示された配列を含有する。
カイ（Kay)ら、サイエンス（Science) 236、199(198
7）。

【０１２９】また、NcoI, BamHI, XbaI, SalI, PstI お
よびEcoRI のための部位および引き続く約681 塩基対の
３′NOPS配列を含有する多数のクローニング領域は、35
Ｓプロモーターより下流に含められている。pSUN335
は、35Ｓプロモーターと３′NOPSとの間に挿入されたと
き、バクテリア中の遺伝子の発現を可能とする２つの配
列を提供する。これらは合成の17bpのKpnI-NcoI 断片を
包含し、この断片は、タンパク質の合成の開始のために
要求されるNcoI部位内に含有されたATG から最適に間隔
を置いて位置する、完全なシャイン−ダルガルノ配列を
含有する。シャイン（Shine)およびダルガルノ（Dalgrn
o)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 、
71、1342(1987)。

【０１３０】また、35Ｓプロモーターより上流に、E.co
li中の転写の強いプロモーターであることが示されたス
トレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）
のasd 遺伝子からのプロモーターを含む。カルジネウ
（Caedineau)およびカーチス（Curtiss)、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.)2
62、3344(1987)。pSUN387 の地図は図９に示されてい
る。プラスミドの配列は、また、図10〜図12に与えられ
ている。pSUN387 はブダベスト条約に基き受託されそし
て番号 を付された。

【０１３１】Ｃ．pSUN390, pSUN491, pSUN392, pSUN393
およびpSUN394 の構成 プラスミドpYA177, pYA178, pYA179およびpYA180〔カー
チス（Curtiss)ら、ワクチン（Vaccine)、1988、supra
〕は、それぞれ、SpaAの主要な抗原決定基／免疫原性
決定基、および引き続くほぼ1204塩基対により特定され
たspaAタンパク質のＣ末端の抗原決定基／免疫原性決定
基を特定する、483 塩基対のSstI-SstI 断片の１，２，
３または４コピーを有する。クローニングは多数のクロ
ーニング部位を切断するXbaIでpSUN387 を消化し、DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片を使用して平滑末端を発
生し、次いでNcoIで消化した。SpaA決定基を特定する断
片をpYA177, pYA178, pYA179およびpYA180の中から、ま
ずHindIII で消化し、クレノーで処理し、次いでNcoIで
切断することによって切断し、次いで断片を調製したpS
UN387 DNA の中に結合した。

【０１３２】pSUN387 の完全なヌクレオチド配列（図10
〜図12参照）の分析により明らかにされるように、E.co
li中のSpaAの発現はストレプトコッカス・ムタンス（S.
mutans)asdプロモーターの制御下にあり、そして植物に
おいてCaMV 35Sプロモーターの制御下にある。この構成
において、pSUN390, pSUN491, pSUN392, pSUN393および
pSUN394 中のSpaAインサートのすべてについてのリーデ
ィングフレームを開始するNcoI部位において、ATG 開始
コドンの前に、CaMV 35Sプロモーターの後にATG 開始コ
ドンは存在しない。SpaAインサートをもつE.coli HB101
は、ATCC No.31985 で受託された。この受託物は、米国
特許出願第773,894 号が登録されたとき、要求により一
般に入手可能となる。

【０１３３】II．SpaAタンパク質の発現および安定性 図13は、pSUN341, pSUN342, pSUN343, pSUN344, pSUN34
5 およびpSUN346 の存在のために、SpaAタンパク質を発
現する、形質転換されたE.coli DH5αのウェスタン・ブ
ロット分析を示す。SpaAは約116kDaで起こる。E.coli中
のSpaAの発現はCaMVプロモーターの向きに対して独立で
あるが、lac プロモーターの正しい向きに依存する。Sp
aA分解産生物は、主として、約60kDa 〜約115kDaの領域
において起こる。この分析から明らかであるように、Sp
aAに対する抗体は自然ならびに分解産生物の、すべての
形態のタンパク質を認識する。これは有利である。なぜ
なら、分解産生物は植物中でならびに腸中で起こること
ができるであろうからである。

【０１３４】図14は、SpaA抗原決定基／免疫原決定基を
特定する組み換えプラスミドを含有するE.coliによるSp
aAタンパク質の合成のウェスタン・ブロット分析を示
す。組み換えプラスミドpYA177−pSUN480 はE.coli X29
91中に含有されるが、pSUN390-pSUN394 組み換えベクタ
ーのすべてはE.coli DH5α中に含有される。pSUN390 お
よびpSUN491 の各々はpYA177により特定される２つの主
要なバンドの１つを特定する。この理由は知られていな
い。明らかなように、pSUN393 はSpaAの産生に関して期
待する方法で挙動しない。初期の分離のとき、それは非
常に高いレベルのSpaAの合成を引き起こす。

【０１３５】pSUNのプラスミドの構成体のすべては、pY
A 構成体より少ないSpaAの合成を引き起こす。これが最
も起こり得る。なぜなら、ストレプトコッカス・ムタン
ス（S.mutans)asdプロモーターはpSUNベクター中のSpaA
の合成のためのATG 開始コドンから約1250塩基対離れて
いるが、pYA ベクター中のtrc プロモーターとATG 開始
コドンとの間の距離はわずかに45塩基対であるからであ
る。pYA177, pYA178,79pypSUN480 により特定されるSpa
Aのポリペプチドは、それぞれ、94，116, 145および164
kDaの分子量を有する。再び、SpaAの分解はE.coli中で
起こるが、これらの分解産生物はSpaAの自然タンパク質
に対する抗体により認識される。

【０１３６】SpaAを発現するE.coliが、マウスへの経口
的供給後、免疫応答を引き出すことができるかどうかを
見る研究を実施する前に、E.coli中で発現されたSpaAタ
ンパク質の種々の食物の処理の方法に対する安定性を研
究した。pYA210（図６に描写するpYA208に類似するが、
pYA208を特定するSpaA中に2.0kb のBamHI 断片の３つの
直列の反復を、すべて同一リーディングフレームにおい
て、含有する組み換えベクター）を有するE.coli _x2846
を80℃またはそれ以上の温度に10分間加熱すると、SpaA
は室温または低温における貯蔵の間の分解に対して完全
に安定化された。

【０１３７】精製したSpaAまたはpYA210を含有するE.co
li _x2846の溶菌細胞により解放されたSpaAの、マウスの
飼料と混合したときの、安定性を検査する試みは、マウ
スの飼料中の成分がSDS ゲル電気泳動およびウェスタン
・ブロット分析を妨害するという事実により妨げられ
た。こうして、マウスの飼料中のSpaAの抗原性を摂取の
前または後に正確に定量することは不可能であった。そ
れにもかかわらず、免疫原性は食物の処理および消化の
間の安定性のきわめてすぐれたインジケーターである。
なぜなら、抗原は生き残って小腸に到達して、腸に関連
するリンパ系組織の上に横たわるＭ細胞により取り上げ
られるからである。

【０１３８】III. SpaAタンパク質の免疫原性 熱で殺したおよび溶菌したE.coli _x2846／pYA210を含有
する植物物質を凍結乾燥し、そして粉砕して飼料にし
た。次いで、それを乾燥した状態で貯蔵した。前述した
ように、合計のタンパク質に関するSpaAタンパク質の量
の分析に基づいて、マウスの飼料を25〜500 ナノグラム
のSpaA／ｇの飼料を有するように調製した。この規定食
を雌のBALB／ｃマウス、９〜10の週齢、に任意に与え
た。マウスの体重を毎週測定して、マウスの成長および
発育を追跡した。マウスは健康な状態であることが視的
に観察された。

【０１３９】唾液の試料を毎週集めた。唾液の産生をピ
ロカルピンで刺激した。血清を２週毎に眼窩の採血によ
り集めた。血清の抗SpaAのIgG および唾液のIgA をELIS
A により検出した。ダイナテク・ラボラトリーズ（Dyna
teck Laboratories)イムノロン−１フラット−ボトムの
ポリスチレンのプレートを、一夜41℃において、100 μ
ｌ（4.25μｇのタンパク質）の准精製SpaA〔ストレプト
コッカス・ムタンス（S.mutans）からの上澄み液を沈殿
し、濾過し、次いで透析および凍結乾燥した70％の硫酸
アンモニウムから得た〕または組み換えE.coliから精製
したSpaAの１：５希釈物(0.1モルのNH₄HCO₃緩衝液、pH
9.6)で被覆した。

【０１４０】次いで、プレートを0.05％のツイーン−20
を含有するリン酸塩緩衝液(PBS；pH7.2)で３回洗浄し、
次いでPBS ＋0.05％のツイーン−20および１％のウシ血
清アルブミンで90分間ブロッキングした。洗浄後、血清
試料(100μｌの各希釈物）を添加し、そして４℃におい
て一夜インキュベーションした。プレートを再び洗浄
し、そしてアルカリ性ホスファターゼと接合した親和精
製したヤギ抗マウスIgG(鎖特異的）またはヤギ抗マウス
IgA(γ−鎖特異的）である第２抗体（１：1000の希釈
物）を添加し、そして室温において４時間インキュベー
ションした。

【０１４１】洗浄後、ジエチルアラニン緩衝液pH9.8 中
に溶解したニトロフェニルホスフェートの基質を添加
し、そしてプレートを室温において1.5 時間インキュベ
ーションした。次いで、それらを405nm においてバイオ
−テク（Bio-Tek)自動化EIA プレート・リーダーで読ん
だ。合計の血清のIgA およびIgG に比較した抗SpaA血清
IgG および血清IgA の標準化は、ELISA における標準と
して精製したIgG 骨髄腫タンパク質または精製した骨髄
腫タンパク質を使用して達成した。

【０１４２】唾液の抗SpaAのIgA は、同様な方法におい
て、第２抗体として、アフイニティー精製したウサギ抗
マウス（α−鎖特異的）アルカリ性ホスファターゼ接合
体を使用して定量した。ピロカルピンの刺激は唾液の変
動する希釈を引き起こすので、標準としてマウス骨髄腫
を使用して決定した合計のsIgAに比較して唾液中の抗Sp
aA sIgA の特異的量を定量することが必須であった。適
当な陽性および陰性の対照を使用した。

【０１４３】血清の抗体について、組み換えE.coliから
得られた精製したSpaAタンパク質で免疫化したマウスか
ら得られたマウスの血清を使用した。唾液の分泌IgA に
ついての陽性の対照について、マウスを分泌腺中で直接
免疫化した（免疫化抗原に対して特異的なsIgAを高いレ
ベルで誘発することが知られている免疫化のルート）。
唾液中の抗体の力価の測定は、組み換えE.coliから精製
したSpaAタンパク質を使用することに注意すべきであ
る。

【０１４４】なぜなら、使用する普通のマウスは、リポ
テイコ酸（lipoteichoic acid)を包含する、普通の連鎖
球菌の抗原を有し、そしてこれらの汚染性抗原はストレ
プトコッカス・ムタンス（S.mutans）培養物の上澄み液
から得られたSpaAタンパク質から分離することが困難で
あるからである。表１は、SpaAタンパク質を発現する微
生物をマウスに長期間与えたときの実験の結果を示す。
表１は、SpaAタンパク質を発現する、マウスに与えたE.
coliの唾液中のsIgAの力価を示す。

【０１４５】

【表１】

【０１４６】実施例２．アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefacien s)介在形質転換 Ｉ．ベクターの構成 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefacien
s)への転移が容易であるベクター、例えばpSUN341 およ
びpSUN343 の構成は、実施例１に記載されている。CaMV
調製−spaA−NOPS−polyA 配列、ベクター、例えばpSUN
390, pSUN392、およびpSUN394 からの発現カセット（参
照、図９）をこれらのベクターから切除し、そしてアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)へ
の転移の前に、バイナリーベクター、例えばpSUN473(図
４）の中に導入した。各場合において、バイナリーベク
ター、例えば、pSUN341 は、トリペアレンタル・メイテ
ィングによりディスアームド（disarmed）Tiプラスミド
を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tu
mefaciens)菌株に転移されるであろう、フラレイ（Fral
ey）ら、前掲。

【０１４７】これはディスアームドプラスミド、例え
ば、pAL4404 またはpAL1050 を有するアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)菌株、例えば、
LAB4404 またはLAB1050 を使用して達成することができ
た。pSUN341 およびpSUN343 を含有するアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)菌株は、ウェ
スタン・ブロット分析により明らかにされるように、こ
れらのベクターをもつE.coli菌株がなしたのと同程度に
多いSpaAタンパク質を産生した（データは示されていな
い）。

【０１４８】II．形質転換 ニコチアナ・タバクム（N.tabacum)、別種Havanaおよび
Xanthi、を、pSUN341およびpAL4404 またはpSUN343 お
よびpAL4404 を含有するアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（A.tumefaciens)により、葉のディスクの形質
転換法を使用して形質転換した〔ホーシュ（horsch)
ら、supra 〕。簡単に述べると、ディスクとして調製し
た純粋な葉の組織を約10⁸ 細胞／mlの濃度でアグロバク
テリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens)の液体培
養物の中に浸漬した。十分な時間（５〜30秒）の間感染
を起こらせた後、組織を絞って乾燥させ、そして組織再
生培地上で平板培養した。

【０１４９】２または３日後、移植の組織を新鮮な培地
に移し、この培地はアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（A.tumefaciens)を殺すための抗生物質のカルベニ
シリンまたはセフォタキシムおよび形質転換された植物
細胞を選択するためのカナマイシンを含有した。タバコ
において、発芽は容易に発生し、これは全トランスジェ
ニック植物を形成することができる。形質転換されたタ
バコの組織を選択し、そして全植物を次の文献に記載さ
れている手順により再生した、ロウジャーズ（Rogers）
ら、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzymo
l.)118、627(1986) 。カルスの組織を次の文献に記載さ
れている手順に従いノパリンシンターゼ活性についてア
ッセイした、オッテン（Otten)ら、バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta)52
7、497(1978) 。

【０１５０】330 μｇのカナマイシン／mlを有する選択
培地上で成長するカルスの組織から再生した５つの別々
の実験から誘導された、合計64のトランスジェニック植
物を、SpaAタンパク質の産生についてドットブロットお
よびウェスタン・ブロット分析により、そしてノパリン
の産生についてノパリンの標準および陰性の対照植物を
使用するペーパー電気泳動により試験した。64の植物の
わずかに１つがノパリンを産生したが、46の試験した植
物の33はノパリンを産生した。DNA をある数の植物から
サザンブロット技術により分離した、サザン（Souther
n）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.)98、503(1978) 。

【０１５１】2.0kb のSpaAプローブを使用することによ
って、試験した６つの植物はそれらがノパリンの産生ま
たはSpaAの合成について陽性または陰性であるかどうか
にかかわらず、SpaA遺伝子を含有することが実証され
る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのためのDN
A プローブを使用して、９つの植物から制限されたDNA
を分析すると、それらのすべてはネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子を含有し、そしてフランキング
配列がすべての９つの場合において異なるので、すべて
はタバコのゲノムの異なる領域にDNA インサートを有す
ることが実証された。SpaAタンパク質をつくる１つの植
物は、ノパリン陽性であり、そしてpSUN343 からのSpaA
遺伝子配列を含有する。

【０１５２】III. トランスジェニック植物中のSpaAの
産生および安定性 pYA177を含有するE.coliにより産生されるSpaAタンパク
質を、従来開発された方法〔ホルト（Holt）ら、supra
〕および最高の分子量のSpaAバンドの電気溶離によりS
DS ポリアクリルアミドゲルの連続する分離に従い、精
製した。SpaAタンパク質を産生するトランスジェニック
タバコ植物からの葉のディスクを、20mmのトリスpH7.4
、350 ミリモルのNaClおよび0.1 ％のβ−メルカプト
エタノール中で均質化した〔マイクロフーグ・ペスル
（microfuge pestle）を含有するウエトン・インストル
メンツ（Weathon Instruments)のオーバーヘッドの撹拌
機を使用する〕。上澄み液を破片に遠心沈殿後に回収し
た。

【０１５３】タンパク質のアッセイは精製したSpaAタン
パク質およびタバコの細胞抽出物について実施した。タ
バコの細胞の抽出物の種々の希釈物および対照として種
々の系統の変化する量の精製したSpaAタンパク質をSDS
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。次いで、ゲル
をウサギ抗SpaA血清を使用してウェスタン・ブロット分
析にかけた。この分析の結果を図15に描写する。トラン
スジェニックタバコにより産生されたSpaAタンパク質は
105kDaの分子量を有し、これはpYA208（図６）およびpS
UN343(図８）によりつくられたSpaAタンパク質の大きさ
よりわずかに小さい。タンパク質の大きさの差は、多
分、植物中のプロセシングのためである。

【０１５４】トランスジェニック植物により産生された
SpaAタンパク質は二重であり、そして認識することがで
きる破壊した物質は殆どあるいはまったく存在しない。
破壊は起こらなかったといわないが、起こった場合、そ
れは植物により劣化される。ウェスタン・ブロットのバ
ンドの強度は、モレキュラー・ダイナミクス（Molecula
r Dynamics）デンシトメーターを使用して定量した。標
準の曲線の誘導に使用したデータを表２に含める。これ
に基づいて、トランスジェニックタバコ植物により合成
されたSpaAタンパク質は合計の植物のタンパク質の0.02
％を表すことが計算された。

【０１５５】

【表２】

【０１５６】IV．SpaAタンパク質を産生する能力のヘリ
タビリティー SpaAを産生するタバコ植物は種子を形成させた。種子の
収集および治癒後、Ｆ２発生を表す50の実生が種子の発
芽後に得られ、そして植物を成長させてSpaAをエンコー
ドする配列のヘリタビリティーについて試験した。ドッ
トブロットおよびウェスタン・ブロット分析を使用し
て、SpaAの産生を検出および定量した。18の植物はSpaA
タンパク質をつくらなかったが、32はつくった。これら
のすべては、親のトランスジェニックタバコ植物により
産生されたSpaAタンパク質と同一の分子量を有するSpaA
タンパク質を産生した。Ｘ² 値は3.23であり、これは0.
05の確立のためのＸ² 値より下に入り、これはSpaA産生
対非産生植物の32：18比は単一の遺伝子（Mendelian fa
ctor）として分離されるという特性についてヘトロ接合
の植物の期待する３：１比に適合することが実証する。

【０１５７】32のSpaA陽性の植物を、さらに、ウェスタ
ン・ブロットの定量的のデンシトメーターの測定により
分析して、SpaAを産生する能力についてホモ接合性の植
物がその特性についてヘテロ接合性である植物から分化
することができるかどうかを決定した。表３のデータが
明らかにするように、12の植物はホモ接合性を示しうる
量のSpaAを産生した。これらの植物のうちの６ならびに
ヘテロ接合性であると判定された６つは、種子の産生の
ために成長させて、発芽した子孫の分析により、デンシ
トメーターの定量がホモ接合性対ヘテロ接合性を示すこ
とに頼ることができるかどうかを決定する。安定性およ
び免疫原性の分析は、上の実施例１に記載するようにし
て行った。

【０１５８】

【表３】

【０１５９】動物の飼料としてのトランスジェニック植
物物質の処理 SpaAを産生する植物からの葉の組織を取り出し、小さい
（ほぼ３cm² ）の片に切断し、そしてほぼ２日間37℃で
乾燥した。また、SpaAを産生する植物からの葉の組織を
取り出し、液体窒素中で急速凍結し、そしてベルチス
（Vertis）フリーズモービII凍結乾燥装置で凍結乾燥し
た。ウェスタン・ブロット分析において、両者の方法か
らの、合計のタンパク質の百分率としてのSpaAタンパク
質の量は、SpaAタンパク質の損失がわずかであるか、あ
るいはまったくないことを明らかにした。

【０１６０】SpaAを産生するトランスジェニックタバコ
植物からの凍結乾燥した葉組織を、−20℃および室温に
おいて13日間貯蔵した。室温において13日間貯蔵した凍
結乾燥した組織を、また、マウスの飼料と11の比で混合
した。すべての試料を、マイクロフーグ・ペスルを含有
するウエトン・インストルメンツのオーバーヘッドの撹
拌機を使用して、20ミリモルのトリスpH7.4 、350 ミリ
モルのNaClおよび0.1％のメルカプトエタノール中の均
質化した。破片の遠心沈降後、上澄み液を回収し、次い
でタンパク質をアッセイした。ウェスタン・ブロット分
析は、すべての場合においてSpaAタンパク質の損失をほ
とんどあるいはまったく示さなかった（図16）。

【０１６１】レーン２，４，６および８における植物の
試料は、SpaA配列を含有するが、SpaA抗血清との反応の
不存在により明らかなように、SpaAタンパク質を発現し
ない、トランスジェニック植物からのものであった。参
照、レーン２および４。しかしながら、室温において13
日間貯蔵したとき、凍結乾燥した植物組織中のあるもの
は、レーン６および８において見られるように、SpaA抗
体と弱く反応する。これは完全には理解されない。

【０１６２】植物中で発現したSpaAタンパク質の免疫原
性 前述したように処理したタバコ植物物質を産生するSpaA
をマウスの飼料と異なる投与量で混合して、摂取したSp
aAタンパク質に対する分泌免疫応答の引き出しを研究す
ることができる。ミカレク（Michalekら、1976、前掲）
により従来の結果は、飲料水の１ml当たり10⁸ の殺した
ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans）細胞を与え
たラットにおいて、有意のsIgAの産生を観測した。スト
レプトコッカス・ムタンス（S.mutans）におけるSpaAタ
ンパク質は合計のタンパク質のほぼ0.2 ％を表し、そし
て各ストレプトコッカス・ムタンス（S.mutans）細胞は
ほぼ２×10^-10 mgを含有する。こうして、10⁸ のストレ
プトコッカス・ムタンス（S.mutans）細胞毎に40ナノグ
ラムのSpaAが存在する。

【０１６３】ヘトロ接合性のSpaAを産生するトランスジ
ェニック植物の前の分析に基づいて、２mgの乾燥したト
ランスジェニックタバコは40ナノグラムのSpaAタンパク
質を含有する。マウスの飼料にその１ｇ当たり200 μ
ｇ、２mg、および20mgの乾燥したタバコ飼料を補充する
ことができる。これらの濃縮物は、飼料の１ｇ当たり10
⁷ ，10⁸ および10⁹ のストレプトコッカス・ムタンス
（S.mutans）細胞の投与に匹敵する、経口的免疫化投与
量を提供する。この実験のプロトコルのために、タバコ
飼料の最大の投与量はマウスの飼料の規定食の２％を構
成するであろう。２％は、認め得る悪い生理学的作用な
しに、マウスの連続的に消費により許容されうる、タバ
コ飼料の投与量より５倍少ない。

【０１６４】Ｖ．植物中で発現したSpaAタンパク質の免
疫原性 この規定食を雌のBALB／ｃマウス、９〜10週齢、に任意
に与えた。マウスの体重を毎週測定して、マウスの成長
および発育を追跡した。マウスは健康な状態であること
が視的に観察された。唾液の試料を毎週集めた。唾液の
産生をピロカルピンで刺激した。血清を２週毎に眼窩の
採血により集めた。

【０１６５】血清の抗SpaAのIgG および唾液のIgA をEL
ISA により検出した。ダイナテク・ラボラトリーズ（Dy
nateck Laboratories)イムノロン−１フラット−ボトム
のポリスチレンのプレートを、一夜41℃において、100
μｌ（4.25μｇのタンパク質）の准精製SpaA〔ストレプ
トコッカス・ムタンス（S.mutans）からの上澄み液を沈
澱し、濾過し、次いで透析および凍結乾燥した70％の硫
酸アンモニウムから得た〕または組み換えE.coliから精
製したSpaAの１：５希釈物(0.1モルのNH₄HCO₃緩衝液、p
H9.6)で被覆する。次いで、プレートを0.05％のツイー
ン−20を含有するリン酸塩緩衝液(PBS；pH7.2)で３回洗
浄し、次いでPBS ＋0.05％のツイーン−20および１％の
ウシ血清アルブミンで90分間ブロッキングする。洗浄
後、血清試料(100μｌの各希釈物）を添加し、そして４
℃において一夜インキュベーションした。

【０１６６】プレートを再び洗浄し、そして親和精製し
たヤギ抗マウスIgA(γ−鎖特異的）またはアルカリ性ホ
スファターゼと接合した親和精製したヤギ抗マウスIgG
(鎖特異的）である第２抗体（１：1000の希釈物）を添
加し、そして室温において４時間インキュベーションし
た。洗浄後、ジエチルアラニン緩衝液pH9.8 中に溶解し
たニトロフェニルホスフェートの基質を添加し、そして
プレートを室温において1.5 時間インキュベーションす
る。次いで、それらを405nm においてバイオ−テク（Bi
o-Tek)自動化EIA プレート・リーダーで読んだ。合計の
血清のIgA およびIgG に比較した抗SpaA血清IgG および
血清IgA の標準化は、ELISA における標準として精製し
たIgG 骨髄腫タンパク質または精製した骨髄腫タンパク
質を使用して達成する。

【０１６７】唾液の抗SpaAのIgA は、同様な方法におい
て、第２抗体として、親和精製したウサギ抗マウス（α
−鎖特異的）アルカリ性ホスファターゼ接合体を使用し
て定量する。ピロカルピンの刺激は唾液の変動する希釈
を引き起こすので、標準としてマウス骨髄腫を使用して
決定した合計のsIgAに比較して唾液中の抗SpaA sIgAの
特異的量を定量することが必須である。適当な陽性およ
び陰性の対照を使用した。血清の抗体について、組み換
えE.coliから得られた精製したSpaAタンパク質で免疫化
したマウスから得られたマウスの血清を使用する。

【０１６８】実施例３．植物の形質転換 Ｉ．ベクターの構成 SpaA配列を含有する実施例１に記載するベクターpSUN34
3 を使用する。 II. エレクトロポレイションによる植物の形質転換 タバコの原形質体をエレクトロポレイションするために
使用する手順は、デイビッド・チェング（David Cheng)
および共同研究者、ヘファー・サイエンティフィック・
インスツルメンツ・テクニカル・ブレチン（Hoefer Sci
entific Instruments Technical Bulletin) #118に本質
的に記載されている手順である。生体外で増殖した植物
から３または４cmの長さのとき分離したタバコの葉〔ニ
コチアナ・タバクム（N.tabacum)c.v.Havana〕の上の表
皮を、次の文献に記載されている方法により、320 グリ
ットの酸化アルミニウム粉末でブラッシングして、原形
質体の調製に使用する細胞壁分解酵素を浸透させる、マ
グニエン（Mgnien）、E.ら、アクタ・ゲネチカ・シニカ
（Acta Genetica Sinica）７、231(1980）。

【０１６９】酵素的に解放された原形質体を17.5％のス
クロースで洗浄し、浮遊させ、そして５分間300 ×ｇに
おいて60mlのバブコックびん中で遠心により収穫する。
直線化したまたはスーパーコロイドのDNA(pSUN343)を原
形質体と、0.5ml の最終体積で、それぞれ、0.1mg ／ml
および７×10⁵ 細胞／mlの濃度において16mmの直径のヌ
ンク・マルチディッツ（Nunc Multidish）ウェル中で混
合する。単一のパルスを、室温（23℃）においてヘファ
ー（Hoefer)PG101プロゲネター（ProGenetor）ユニット
でPG120-2.5 電極を使用して200 Ｖで10マイクロ秒間投
与する。

【０１７０】エレクトロポレイションした原形質体を、
１mlの培地の添加前に、10分間静止して保持する。引き
続いて、細胞を10⁵ 細胞／mlの最終濃度に希釈した。次
いで、これらの細胞を40〜48時間後spaAの一時的発現に
ついてアッセイするか、あるいは、使用するDNA 構成体
に依存して、カナマイシンの選択下に平板培養してカル
スの組織を発生させ、次いで全植物に再生することがで
きる。

【０１７１】III ．再生 形質転換後の植物を、選択圧力としてカナマイシンを有
するカルスの成長培地上で平板培養し、そして24℃にお
いて16時間拡散の光／８時間の暗所のサイクルで２〜３
週間培養する。カルスを２〜３週毎に二次培養物して、
再生で進行するために十分な組織を産生する。十分な組
織が得られた後、カルスを、選択圧力の存在または不存
在で、再生培地に移し、そして発芽した芽が形成するま
で、24℃において16時間拡散の光／８時間の暗所のサイ
クルで３〜４週間培養する。この時において、物質を選
択圧力の存在または不存在で、植物確立培地に移し、そ
して３〜４枚の葉が形成するまで、24℃において16時間
拡散の光／８時間の暗所のサイクルで３〜４週間培養す
る。カルスの組織および再生した植物は、合計のタンパ
ク質に関して、ELISA またはウェスタン・ブロットおよ
び定量的デンシトメーターの分析により、SpaAタンパク
質のレベルについて評価することができる。（表２およ
び３参照）。

【０１７２】IV．植物中で発現したSpaAタンパク質の安
定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性 形質転換された植物中のSpaAタンパク質の安定性、ヘリ
タビリティーおよび免疫原性を、実施例１および２の方
法により分析する。

【０１７３】実施例４ 実施例２を反復するが、工程Ｉにおいて、gtfBを含有す
る適当な植物形質転換ベクターを構成する。例えば、pS
UN387(gtfB）を調製し、これはSpaA遺伝子の代わりにpS
U20 〔シロザ（Shiroza)、T.ら、前掲〕から分離したgt
fB遺伝子を含有する。gtfBをエンコードする配列ならび
びCaMV355 プロモーターおよびNOPS３′polyA 配列を適
当なバイナリーベクター、例えば、pSUN473 またはpSUN
475 の中に導入する。トランスジェニックタバコ植物の
発生後、GtfBタンパク質についての安定性、ヘリタビリ
ティーおよび免疫原性の分析を、実施例１および２に記
載するように実施する。

【０１７４】実施例５ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、spaAおよびgt
fBの両者を含有する適当な植物形質転換ベクターを構成
する。例えば、GtfBをpSUN394 中のspaA配列の次に挿入
する。このようにして、２つのコロニナイゼイション抗
原を発現する構成体が形成する。トランスジェニック植
物を原形質体誘導カルスから発生させた後、SpaAおよび
GtfBタンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫
原性を、実施例１および２に記載するように分析する。

【０１７５】実施例６ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、デキストラナ
ーゼを含有する適当な植物形質転換ベクターを構成す
る。例えば、yYA993から分離したデキストラナーゼ（de
x)遺伝子を含有するpSUN387 を調製する。トランスジェ
ニック植物を原形質体誘導カルスから発生させた後、Sp
aAおよびGtfBタンパク質の安定性、ヘリタビリティーお
よび免疫原性を、実施例１および２に記載するように分
析する。

【０１７６】実施例７ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、spaAおよびde
x の両者を含有する適当な植物形質転換ベクターを構成
する。例えばdex をpSUN394 中のspaA配列の次に挿入す
る。このようにして、２つのコロニナイゼイション抗原
を発現する構成体が形成する。トランスジェニック植物
を原形質体誘導カルスから発生させた後、SpaAおよびデ
キストラナーゼタンパク質の安定性、ヘリタビリティー
および免疫原性を、実施例１および２に記載するように
分析する。

【０１７７】実施例８ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、Ｋ88線毛コロ
ニナイゼイション抗原遺伝子を含有する適当な植物の形
質転換ベクターを構成する。例えば、pSUN387を調製
し、これはケヘ（Kehoe)ら、ネイチャー（Neture)291、
122(1981）により開発された、プラスミドpMK005から分
離したＫ88線毛コロニナイゼイション抗原を含有する。
トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから発生
させた後、Ｋ88抗原の安定性、ヘリタビリティーおよび
免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するように
実施する。

【０１７８】実施例９ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、Ｋ99線毛コロ
ニナイゼイション抗原を含有する適当な植物形質転換ベ
クターを構成する。例えば、pSUN387 を調製し、これは
プラスミドpRI9906 から分離したＫ99線毛コロニナイゼ
イション抗原を含有する。トランスジェニック植物を原
形質体誘導カルスから発生させた後、Ｋ99抗原の安定
性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例
１および２に記載するように実施する。

【０１７９】実施例10 実施例３を反復するが、植物の形質転換ベクターは、Sp
aAタンパク質およびLT-Bタンパク質からなる融合タンパ
ク質の遺伝情報を指定するDNA 配列を含有する、プラス
ミドpSUN387(spaA／LT-B）である。LT-B配列は融合タン
パク質のＮ末端である。LT-Bタンパク質の遺伝情報を指
定するDNA 配列をE.coliから分離する〔ヤマモト，Ｔお
よびヨコト，T.、前掲〕。トランスジェニック植物を原
形質体誘導カルスから発生させた後、spaAおよびLT-Bタ
ンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の
分析を、実施例１および２に記載するように実施する。

【０１８０】実施例11 実施例２を反復するが、pSUN473(gtfB）を使用する植物
の形質転換ベクターは、フィラッチ（Fillatti）、J.
ら、(1987)、前掲に従い、トマトについて実施する。選
択した移植組織から全植物が発生した後、gtfBの安定
性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例
１および２に記載するように実施する。

【０１８１】実施例12 実施例２を反復するが、pSUN475(LT-B）を使用する植物
の形質転換ベクターは、エベレット（Everett)、N.P.ら
(1987)、前掲に従い、トマトについて実施する。選択し
た移植組織から全植物が発生した後、LT-Bタンパク質の
安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実
施例１および２に記載するように実施する。

【０１８２】実施例13 実施例２を反復するが、pSUN473(K99)を使用する植物の
形質転換ベクターは、ヒンチェー（Hinchee)、M.A.ら(1
987)、前掲に従い、トマトについて実施する。選択した
移植組織から全植物が発生した後、Ｋ99タンパク質の安
定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施
例１および２に記載するように実施する。

【０１８３】実施例14 実施例２を反復するが、pSUN473(K88)を使用する植物の
形質転換ベクターは、ファシオッチ（Facciotti). 、D.
ら(1985)、前掲に従い、トマトについて実施する。選択
した移植組織から全植物が発生した後、Ｋ88タンパク質
の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、
実施例１および２に記載するように実施する。

【０１８４】実施例15 植物の形質転換はアルファルファについてマイクロイン
ジェクションにより実施する。植物細胞中のpSUN387(K9
9)の転移は、プラスミドDNA の溶液を微細に引いたガラ
スの針で、分離した原形質体、培養した細胞および組織
の中に直接注入すること、レイチ（Reich)、T.J.ら、バ
イオ／テクノロジー(Bio／Technology）４、1001(198
6)；カナディアン・ジャーナル・ボタニー（Can.J.Bo
t.)64 、1259(1986)および実生および植物の分裂組織中
に注入すること、デ・ラ・ペナ（Da La Pena）、A.ら、
ネイチャー（Nature)325、274(1987）、グレイブス（Gr
aves）、A.C.ら、プラント・モレキュラー・バイオロジ
ー（Plant Mol.Biol.)７、763(1987)よって達成され
る。Ｋ99タンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび
免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するように
実施する。

【０１８５】実施例16 植物の形質転換は、ネグルチウ（Negrutiu）、R.ら(198
7)、前掲に従い、タバコについてポリエチレングリコー
ルの適用により実施する。原形質体を15ミリモルのMgCl
₂ を含有する0.5 モル中に約２×10⁶ ／mlの密度で懸濁
する。原形質体の懸濁液を10mlのプラスチックの遠心管
の中に分配する。DNA を添加し、次いでPEG 溶液を添加
する〔40％（ｗ／ｖ）分子量4000、0.4 モルのマンニト
ール、0.1 モルのCa(NO₃)₂、（pH7.0)〕。

【０１８６】この溶液をおだやかに混合し、そして室温
（24℃）において30分間時々震盪しながらインキュベー
ションする。次いで、洗浄液を添加し、そして管の内容
物をおだやかに混合する。洗浄液を87ナノモルのマンニ
トール、CaCl₂, MgCl₂, KCl,トリス／HCl およびｍ−イ
ノシトールから成る（pH9.0)。洗浄液の４つのそれ以上
のアリコートを４分の間隔で添加し、各添加後混合す
る。次いで、この管を約60ｇにおいて約10分間遠心し、
そして上澄み液を廃棄する。沈降した原形質体を培地の
中に取り、そして10cmのペトリ皿に入れる。SpaAタンパ
ク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析
を、実施例１および２に記載するように実施する。

【０１８７】実施例17 実施例16を反復するが、工程IIにおいて、植物の形質転
換pSUN387(K88)をネグルチウ（Negrutiu）、R.ら(198
7)、前掲に従いロリウム・ムルチフロルム（Lolium mul
tiflorum）について実施する。Ｋ88タンパク質の安定
性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例
１および２に記載するように実施する。

【０１８８】実施例18．エレクトロポレイションによる
イネの形質転換 DNA の転移および形質転換体の選択。原形質体をイネ
（Oryza sativa）の葯誘導細胞の懸濁液から分離し、そ
してフロム（Fromm)らに従い、多少の変更を加えて、次
のようにしてエレクトロポレイションする。原形質体
（２×10⁵ ）および円形の形態のプラスミド、pSUN390,
pSUN391, pSUN392 およびpSUN394(各10μｇ）をプラス
チックのクベット（内部の電極の距離は0.4cm であっ
た）中の0.6mlの0.5 ミリモルの２−〔Ｎ−モルホリ
ノ〕エタンスルホン酸（pH5.8)、７ミリモルのKCl 、４
ミリモルのCaCl₂-2H₂Oおよび6.5 ％のマンニトールから
成る緩衝液の中に懸濁させる。

【０１８９】電気パルスを500 Ｖ／cmで充電した125 μ
Ｆのコンデンサー〔ジーン−パルサー（Gene-Pulser)、
バイオ−ラド（Bio-Rad)、カリフォルニア州、米国〕か
ら放出する。抵抗−キャパシタンス（RC）時間−定数
は、それぞれ、４マイクロ秒および20マイクロ秒であ
る。４℃において10分、次いで室温において10分後、エ
レクトロポレイションした原形質体を２mg／ｌの２，４
−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）および５％の
マンニトールを補充した2.5ml の培地を含有するペトリ
皿（直径５cm）に移す。２週後、２mg／ｌの２，４−Ｄ
および３％のグルコースを補充した１mlのNO₃ 培地（硫
酸アンモニウムを含まないＢ５培地）を添加する。

【０１９０】３週後、培地をグルコースを欠如し、２μ
ｇ／mlのG418サルフェート〔シェリング・カンパニー
（Schering Co.) 、ニュージャージイ州〕を含有するNO
₃ 培地と置換する。１月エレクトロポレイションした
後、生き残りのマイクロカルスを20μｇのG418／mlおよ
び１％のアガロース〔シグマ（Sigma)１型〕を含有する
NO ₃ 培地に移す。さらに２週後、成長するカルスを0.2m
g ／ｌのインドール−３−アミノ酸、１mg／ｌのカイネ
チンおよび１％のアガロースを含有するＮ６培地（再生
培地）上に移す。カルスの組織をオッテン（Otten)ら、
前掲に従いノパリンシンターゼ活性についてアッセイす
る。SpaAタンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび
免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するように
実施する。

【０１９１】実施例19．粒子の加速によるダイズの安定
な形質転換 植物細胞の中にDNA 配列を導入する他の方法は、前記DN
A をタングステン粒子に付着し、次いでこれらの粒子を
クレイン（Klein)、T.N.ら、前掲に記載されている発射
装置によるか、あるいはマクケイブ（mcCabe）、E.T.
ら、前掲に記載されているように微細に変調した放電を
使用する粒子を加速してDNA で被覆した金の粒子を加速
することによって、植物細胞の中に強制的に進行させる
ことからなる。

【０１９２】任意の植物組織および植物器官をこの手順
のために標的として使用することができ、このような組
織および器官は次のものを包含するが、これらに限定さ
れない：生体内および生体外の胚、頂芽および他の分裂
組織、蕾、体および性組織。トランスジェニックの細胞
およびカルスをこの分野において知られている確立され
た手順に従い選択する。この分野において知られている
確立された手順に従い、標的組織を誘発して体の胚を形
成するか、あるいはシュートを発生させてトランスジェ
ニック植物にする。適当な手順は使用する植物の種に従
い選択することができる。

【０１９３】再生した植物は組み込まれた外来DNA に関
してキメラであることができる。外来DNA を含有する細
胞が小／巨大胞子に発育する場合、組み込まれたDNA は
性の子孫に伝達される。外来DNA を含有する細胞が植物
の体細胞である場合、非キメラのトランスジェニック植
物は植物の増殖の慣用方法により、生体内で、すなわ
ち、芽または茎の切断物からか、あるいは生体外でこの
分野において知られている確立された手順に従い産生さ
れる。このような手順は使用する植物の種に従い選択す
ることができる。

【０１９４】形質転換はマクケイブ（McCabe）、D.E.ら
(1988)、前掲に従いダイズについて実施する。DNA の調
製。DNA で被覆した当社体を1.5 〜３μｍの金の球〔ア
ルファ・ケミカル・カンパニー（Alfa Chemical Co.)〕
をpSUN387(gtfB)DNAの溶液と１mgの金のビーズ／１μｇ
のDNA の割合で混合することによって調製する。このス
ラリーをＮ₂ の流れ下に乾燥し、そして乾燥したペレッ
トを100 ％のエタノール中に２mgのビーズ／mlの濃度で
再懸濁する。162 μｌのこの金の懸濁液をピペットで18
mm² のアルミニウム化プラスチックフィルム上に配置す
る。ここで薄い層のビーズを支持するシートを空気乾燥
する。

【０１９５】粒子の加速。一次の葉を除去して分裂組織
を暴露した胚軸（embryonic axe)を粒子の加速にさら
す。ビーズを有するシートを粒子加速機上に装填し、こ
の機械は運動力として小さい水滴を通して高い電圧のコ
ンデンサの放電を使用する。100 メッシュの保持スクリ
ーンをシートと機械より上に懸垂した標的組織との間に
配置する。次いで、このアセンブリーを約500mmHg に排
気して空気力学的抵抗を減少する。２μＦのコンデンサ
ーからの14kVをポリ塩化ビニルの膨張室内で１μｌの水
滴を通して放電する。シートを保持スクリーンに対して
吹き付けて、ビーズを外側に推進させて、スクリーンよ
り上に懸垂された組織を衝撃する。標的の軸を水寒天平
板上に配置し、こうして平板をスクリーンの上に倒立さ
せて、分裂組織の領域を加速されたビーズの通路の中に
位置させる。

【０１９６】植物の再生。粒子の加速により処理した植
物組織を、13.3μモルのベンジルアミノプリン、0.2 μ
モルのナフタレン酢酸、５ミリモルのチアミンおよび12
ミリモルのプロリンを補充した変性MS培地上に配置し、
そして暗所で１〜２週間室温においてインキュベーショ
ンする。次いで、軸を1.7 μモルのベンジルアミノプロ
リンおよび0.2 μモルのインドリル−３−酢酸を補充し
たMS培地に移す。植物の再生を16時間の光期間の下に軸
の連続的インキュベーションにより進行させる。多数の
シュートを一次およびわきの分裂組織の両者から形成す
る。

【０１９７】切除したシュートをそれ以上の成長のため
に植物再生培地上で平板培養することによって根付かせ
る。GtfBタンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび
免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するように
実施する。本発明を好ましい実施態様の細部を参照して
開示したが、本発明の精神および添付した請求の範囲の
範囲内で、変更は当業者にとって容易であると考えられ
るので、この開示は限定よりむしろ例示を意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドpSUN450 の構成を示す図で
ある。

【図２】図２は、プラスミドpSUN470 の構成を示す図で
ある。

【図３】図３は、プラスミドpSUN221 の構成を示す図で
ある。

【図４】図４は、プラスミドpSUN473 の構成を示す図で
ある。

【図５】図５は、プラスミドpSUN475 の構成を示す図で
ある。

【図６】図６は、プラスミドpSUN339, pSUN340, pSUN34
1, pSUN342及びpSUN343 の構成の過程を示す図である。

【図７】図７は、プラスミドpSUN339, pSUN340, pSUN34
1, pSUN342及びpSUN343 の構成の過程を示す図である。

【図８】図８は、プラスミドpSUN339, pSUN340, pSUN34
1, pSUN342及びpSUN343 の構成の過程を示す図である。

【図９】図９は、プラスミドpSUN387, pSUN390, pSUN39
1, pSUN392及びpSUN393 およびpSUN394 の構成を示す図
である。

【図１０】図10は、pSUN387 の全体の4,643 塩基対のヌ
クレオチドの前半を描写する図である。

【図１１】図11は、pSUN387 の全体の4,643 塩基対のヌ
クレオチドの中間部を描写する図である。

【図１２】図12は、pSUN387 の全体の4,643 塩基対のヌ
クレオチドの後半を描写する図である。

【図１３】図13は、E.coli DH5α（レーン２）およびプ
ラスミドpSUN341(レーン３）、pSUN342(レーン４）、pS
UN343(レーン５）、pSUN344(pSUN343 に類似するか、あ
るいはそれと同一である；レーン６）、pSUN345(pSUN34
3)に類似するか、あるいはそれと同一である；レーン
７）およびpSUN346(pSUN341 に類似するか、あるいはそ
れと同一である；レーン８）を含有するE.coli DH5αに
おいて、ウサギ抗SpaA血清により検出された、SpaAタン
パク質の合成のウェスタン・ブロット分析の結果を示
す。前以て染色した分子量マーカーをレーン１に含め
る。電気泳動の結果を示す図面代用写真である。

【図１４】図14、pYA177, pYA178, pYA179およびpYA180
を含有するE.coli X2991およびpSUN390, pSUN391, pSUN
392, pSUN393およびpSUN394 を含有するE.coli DH5αに
おいて、ウサギ抗SpaA血清との反応により明らかにされ
た、SpaAタンパク質の合成のウェスタン・ブロット分析
の結果を示す。前以て染色した分子量標準を含有する電
気泳動の結果を示す図面代用写真である。

【図１５】図15は、トランスジェニックタバコ植物によ
り合成されたSpaAタンパク質の量のデンシトメーターの
定量を示す。電気泳動の結果を示す図面代用写真であ
る。

【図１６】図16はSDS ポリアクリルアミドゲルのウェス
タン・ブロット分析の結果を示し、この結果はSpaAタン
パク質を産生するタバコの試料をSpaAタンパク質を産生
しないタバコの試料と比較しそして、また新鮮な試料、
凍結乾燥しそして−20℃において貯蔵した試料、室温に
おいて貯蔵した試料、および商業的マウスの飼料と混合
した試料を比較する。電気泳動の結果を示す図面代用写
真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｄ Ｅ Ｆ Ｈ Ｊ Ｌ Ｚ Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/00 15/00 Ａ (72)発明者 ガーディナウ，ガイ エー. アメリカ合衆国，ウィスコンシン 53716, マディソン，イースト バッケイ ロード 5649

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 病原性微生物の抗原の遺伝情報を指定す
   るDNA 配列を含んでなりかつそれを発現するトランスジ
   ェニック植物であって、前記抗原は、 ａ）コロナイゼイション抗原、 ｂ）ビルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、または ｄ）いずれかの抗原またはその抗原決定基からなる融合
   タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原または
   その抗原決定基は経口投与の後ヒトまたは他の動物にお
   いて分泌免疫応答を引き出すことができる、トランスジ
   ェニック植物。
2. 【請求項２】 DNA 配列が、前記抗原の遺伝情報を指定
   する遺伝子、遺伝子の組み合わせ、遺伝子断片、または
   遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第１項記載の植
   物。
3. 【請求項３】 DNA 配列が前記抗原の遺伝情報を指定す
   る合成配列である、上記第１記載の植物。
4. 【請求項４】 病原性の微生物が、アクチノミセス属
   （Actinomyces)、アエロモナス属（Aeromonas)、バチル
   ス属（Bacillus）、バクテリオデス属（Bacteriodes)、
   ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucell
   a）、カンピロバクテル属（Campylobacter)、カプノイ
   シトファガ属（Capnocytophaga）、クラミジア属（Clam
   ydia）、クロストリジウム属（Clostridium)コリネバク
   テリウム（Corynebakuterium）、エイケネラ属（Eikene
   lla)、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、エ
   シェリキア属（Escherichia)、ヘモフィルス属（Hemoph
   ilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジュネラ属
   （Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、リス
   テリア（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycobact
   erium)、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ネイセリア
   属（Neisseria)、ノカルジア属（Nocardia）、パスツレ
   ラ属（Pasteurella)、プロテウス属（Proteus)、シュー
   ドモナス属（Pseudomonas)、リケッチア属（Rickettsi
   a）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigell
   a）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、連鎖球菌属（S
   treptococcus)、セレノモナス属（Selenomonas)、トレ
   ポネーマ属（Trepnonema）、ビブリオ属（Vibrio）、エ
   ルジニア属（Yersinia）アデノウイルス、コロナウイル
   ス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、ピコル
   ナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロ
   ウイルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Aspergil
   lus)、ブラストミセス属（Blastomyces)、カンジダ属
   （Candida)、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ク
   リプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属
   （Histoplasma)、フィコミセス属（Phycomyces）、アイ
   メリア属（Eimeria)、アメーバ属（Entamoebe)、ジアル
   ジア属（Giardia)、およびトリコモナス属（Tricomona
   s）から成る群より選択される、上記第１項記載の植
   物。
5. 【請求項５】 前記コロニナイゼイション抗原またはビ
   ルレンス抗原がストレプトコッカス・ムタンス（Strept
   ococcus mutans）または大腸菌（Escherichia coli）か
   らのものである、上記第１項記載の植物。
6. 【請求項６】 抗原がSpaA, GtfB, デキストラナーゼ、
   Ｋ88，Ｋ99，CFA, LT-B またはそれらの抗原決定基から
   成る群より選択される、上記第１項記載の植物。
7. 【請求項７】 同一であるか、あるいは異なる２または
   それ以上の抗原の遺伝情報を指定する２またはそれ以上
   のDNA 配列をさらに含む、上記第１項記載の植物。
8. 【請求項８】 前記融合タンパク質が２またはそれ以上
   の前記抗原からなる、上記第１項記載の植物。
9. 【請求項９】 前記融合タンパク質が前記抗原の安定性
   を増大するポリペプチドからなる、上記第１項記載の植
   物。
10. 【請求項１０】 前記融合タンパク質が前記抗原の取込
    みを増大するポリペプチドからなる、上記第１項記載の
    植物。
11. 【請求項１１】 双子葉植物である、上記第１項記載の
    植物。
12. 【請求項１２】 単子葉植物である、上記第１項記載の
    植物。
13. 【請求項１３】 トランスジェニック植物またはトラン
    スジェニック植物から得られた物質からなり、前記トラ
    ンスジェニック植物は病原性微生物の抗原の遺伝情報を
    指定するDNA 配列を含有しかつそれを発現し、前記抗原
    は、 ａ）コロナイゼイション抗原、 ｂ）ビルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、または ｄ）いずれかの抗原またはその抗原決定基からなる融合
    タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原または
    その抗原決定基は経口投与の後ヒトまたは他の動物にお
    いて分泌免疫応答を引き出すことができる、ヒトおよび
    他の動物において分泌免疫応答を引き出すために適当な
    組成物。
14. 【請求項１４】 DNA 配列が、前記抗原の遺伝情報を指
    定する遺伝子、遺伝子の組み合わせ、遺伝子断片、また
    は遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第13項記載の
    組成物。
15. 【請求項１５】 DNA 配列が前記抗原の遺伝情報を指定
    する合成配列である、上記第13項記載の組成物。
16. 【請求項１６】 病原性の微生物が、アクチノミセス属
    （Actinomyces)、アエロモナス属（Aeromonas)、バチル
    ス属（Bacillus）、バクテリオデス属（Bacteriodes)、
    ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucell
    a）、カンピロバクテル属（Campylobacter)、カプノイ
    シトファガ属（Capnocytophaga）、クラミジア属（Clam
    ydia）、クロストリジウム属（Clostridium)、コリネバ
    クテリウム（Corynebakuterium）、エイケネラ属（Eike
    nella)、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、
    エシェリキア属（Escherichia)、ヘモフィルス属（Hemo
    philus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジュネラ
    属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、リ
    ステリア（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycoba
    cterium)、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ネイセリ
    ア属（Neisseria)、ノカルジア属（Nocardia）、パスツ
    レラ属（Pasteurella)、プロテウス属（Proteus)、シュ
    ードモナス属（Pseudomonas)、リケッチア属（Ricketts
    ia）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigel
    la）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、連鎖球菌属
    （Streptococcus)、セレノモナス属（Selenomonas)、ト
    レポネーマ属（Trepnonema）、ビブリオ属（Vibrio）、
    エルジニア属（Yersinia）、アデノウイルス、コロナウ
    イルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、ピ
    コルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レ
    トロウイルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Aspe
    rgillus)、ブラストミセス属（Blastomyces)、カンジダ
    属（Candida)、コクシジオイデス属（Coccidioides）、
    クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ
    属（Histoplasma)、フィコミセス属（Phycomyces）、ア
    イメリア属（Eimeria)、アメーバ属（Entamoebe)、ジア
    ルジア属（Giardia)、およびトリコモナス属（Tricomon
    as）から成る群より選択される、上記第13項記載の組成
    物。
17. 【請求項１７】 前記コロナイゼイション抗原またはビ
    ルレンス抗原がストレプトコッカス・ムタンス（Strept
    ococcus mutans）または大腸菌（Escherichia coli）か
    らのものである、上記第13項記載の組成物。
18. 【請求項１８】 抗原がSpaA, GtfB, デキストラナー
    ゼ、Ｋ88，Ｋ99，CFA,LT-B またはそれらの抗原決定基
    から成る群より選択される、上記第13項記載の組成物。
19. 【請求項１９】 同一であるか、あるいは異なる２また
    はそれ以上の抗原の遺伝情報を指定する２またはそれ以
    上のDNA 配列を含んでなる、上記第13項記載の組成物。
20. 【請求項２０】 前記融合タンパク質が２またはそれ以
    上の前記抗原を含んでなる、上記第13項記載の組成物。
21. 【請求項２１】 前記融合タンパク質が前記抗原の安定
    性を増大するポリペプチドを含んでなる、上記第13項記
    載の組成物。
22. 【請求項２２】 前記融合タンパク質が前記抗原の取込
    みを増大するポリペプチドの遺伝情報を指定する第２DN
    A 配列由来である、上記第13項記載の組成物。
23. 【請求項２３】 トランスジェニック植物は双子葉植物
    である、上記第13項記載の組成物。
24. 【請求項２４】 トランスジェニック植物は単子葉植物
    である、上記第13項記載の組成物。
25. 【請求項２５】 免疫学的に許容されうるアジュバント
    をさらに含む、上記第13項記載の組成物。
26. 【請求項２６】 請求項１〜25のいずれか１項に記載の
    トランスジェニック植物材料を食物と混合することを含
    んでなる、上記第13項記載の組成物の製造方法。
27. 【請求項２７】 DNA 配列が、前記抗原の遺伝情報を指
    定する遺伝子、遺伝子の組み合わせ、遺伝子断片、また
    は遺伝子断片の組み合わせを含んでなる、上記第26項記
    載の方法。
28. 【請求項２８】 DNA 配列が前記抗原の遺伝情報を指定
    する合成配列を含んでなる、上記第26項記載の方法。
29. 【請求項２９】 病原性の微生物が、アクチノミセス属
    （Actinomyces)、アエロモナス属（Aeromonas)、バチル
    ス属（Bacillus）、バクテリオデス属（Bacteriodes)、
    ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucell
    a）、カンピロバクテル属（Campylobacter)、カプノイ
    シトファガ属（Capnocytophaga）、クラミジア属（Clam
    ydia）、クロストリジウム属（Clostridium)コリネバク
    テリウム（Corynebakuterium）、エイケネラ属（Eikene
    lla)、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、エ
    シェリキア属（Escherichia)、ヘモフィルス属（Hemoph
    ilus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジュネラ属
    （Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、リス
    テリア（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycobact
    erium)、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ネイセリア
    属（Neisseria)、ノカルジア属（Nocardia）、パスツレ
    ラ属（Pasteurella)、プロテウス属（Proteus)、シュー
    ドモナス属（Pseudomonas)、リケッチア属（Rickettsi
    a）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigell
    a）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、連鎖球菌属（S
    treptococcus)、セレノモナス属（Selenomonas)、トレ
    ポネーマ属（Trepnonema）、ビブリオ属（Vibrio）、エ
    ルジニア属（Yersinia）アデノウイルス、コロナウイル
    ス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、ピコル
    ナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロ
    ウイルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Aspergil
    lus)、ブラストミセス属（Blastomyces)、カンジダ属
    （Candida)、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ク
    リプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属
    （Histoplasma)フィコミセス属（Phycomyces）、アイメ
    リア属（Eimeria)、アメーバ属（Entamoebe)、ジアルジ
    ア属（Giardia)、およびトリコモナス属（Tricomonas）
    から成る群より選択される、上記第26項記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記コロニナイゼイション抗原または
    ビルレンス抗原がストレプトコッカス・ムタンス（Stre
    ptococcus mutans）または大腸菌（Escherichia coli）
    からのものである、上記第26項記載の方法。
31. 【請求項３１】 抗原がSpaA, GtfB, デキストラナー
    ゼ、Ｋ88，Ｋ99，CFA,LT-B またはそれらの抗原決定基
    から成る群より選択される、上記第26項記載の方法。
32. 【請求項３２】 同一であるか、あるいは異なる２また
    はそれ以上の抗原の遺伝情報を指定する２またはそれ以
    上のDNA 配列さらに含む、上記第26項記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記融合タンパク質が２またはそれ以
    上の前記抗原を含んでなる、上記第26項記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記融合タンパク質が前記抗原の安定
    性を増大するポリペプチドを含んでなる、上記第26項記
    載の方法。
35. 【請求項３５】 前記融合タンパク質が前記抗原の取込
    みを増大するポリペプチドの遺伝情報を指定する第２DN
    A 配列からのものである、上記第26項記載の方法。
36. 【請求項３６】 トランスジェニック植物が双子葉植物
    である、上記第26項記載の方法。
37. 【請求項３７】 トランスジェニック植物が単子葉植物
    である、上記第26項記載の方法。
38. 【請求項３８】 トランスジェニック植物またはトラン
    スジェニック植物から得られた物質からなる組成物の有
    効量を経口的に投与することを含んでなり、前記トラン
    スジェニック植物が病原性微生物の抗原の遺伝情報を指
    定するDNA 配列を含有しかつそれを発現することができ
    る、前記抗原は、 ａ）コロナイゼイション抗原、 ｂ）ビルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、または ｄ）いずれかの抗原またはその抗原決定基からなる融合
    タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原または
    その抗原決定基は経口的摂取のときヒト以外の動物にお
    いて分泌免疫応答を引き出すことができる、ヒト以外の
    動物において分泌免疫応答を引き出す方法。
39. 【請求項３９】 DNA 配列が、前記抗原の遺伝情報を指
    定する遺伝子、遺伝子の組み合わせ、遺伝子断片、また
    は遺伝子断片の組み合わせを含んでなる、上記第38項記
    載の方法。
40. 【請求項４０】 DNA 配列が前記抗原の遺伝情報を指定
    する合成配列である、上記第38項記載の方法。
41. 【請求項４１】 病原性の微生物が、アクチノミセス属
    （Actinomyces)、アエロモナス属（Aeromonas)、バチル
    ス属（Bacillus）、バクテリオデス属（Bacteriodes)、
    ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucell
    a）、カンピロバクテル属（Campylobacter)、カプノイ
    シトファガ属（Capnocytophaga）、クラミジア属（Clam
    ydia）、クロストリジウム属（Clostridium)、コリネバ
    クテリウム（Corynebakuterium）、エイケネラ属（Eike
    nella)、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、
    エシェリキア属（Escherichia)、ヘモフィルス属（Hemo
    philus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジュネラ
    属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、リ
    ステリア（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycoba
    cterium)、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ネイセリ
    ア属（Neisseria)、ノカルジア属（Nocardia）、パスツ
    レラ属（Pasteurella)、プロテウス属（Proteus)、シュ
    ードモナス属（Pseudomonas)、リケッチア属（Ricketts
    ia）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigel
    la）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、連鎖球菌属
    （Streptococcus)、セレノモナス属（Selenomonas)、ト
    レポネーマ属（Trepnonema）、ビブリオ属（Vibrio）、
    エルジニア属（Yersinia）、アデノウイルス、コロナウ
    イルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、ピ
    コルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レ
    トロウイルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Aspe
    rgillus)、ブラストミセス属（Blastomyces)、カンジダ
    属（Candida)、コクシジオイデス属（Coccidioides）、
    クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ
    属（Histoplasma)、フィコミセス属（Phycomyces）、ア
    イメリア属（Eimeria)、アメーバ属（Entamoebe)、ジア
    ルジア属（Giardia)、およびトリコモナス属（Tricomon
    as）から成る群より選択される、上記第38項記載の方
    法。
42. 【請求項４２】 前記コロナイゼイション抗原またはビ
    ルレンス抗原がストレプトコッカス・ムタンス（Strept
    ococcus mutans）または大腸菌（Escherichia coli）か
    らのものである、上記第38項記載の方法。
43. 【請求項４３】 抗原がSpaA, GtfB, デキストラナー
    ゼ、Ｋ88，Ｋ99，CFA,LT-B またはそれらの抗原決定基
    から成る群より選択される、上記第38項記載の方法。
44. 【請求項４４】 同一であるか、あるいは異なる２また
    はそれ以上の抗原の遺伝情報を指定する２またはそれ以
    上のDNA 配列さらに含む、上記第38項記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記融合タンパク質が２またはそれ以
    上の前記抗原を含んでなる、上記第38項記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記融合タンパク質が前記抗原の安定
    性を増大するポリペプチドを含んでなる、上記第38項記
    載の方法。
47. 【請求項４７】 前記融合タンパク質が前記抗原の取込
    みを増大するポリペプチドの遺伝情報を指定する第２DN
    A 配列由来である、上記第38項記載の方法。
48. 【請求項４８】 トランスジェニック植物が双子葉植物
    である、上記第38項記載の方法。
49. 【請求項４９】 トランスジェニック植物が単子葉植物
    である、上記第38項記載の方法。