JP2000069996A - 糖化アミノ酸の同定または定量方法 - Google Patents
糖化アミノ酸の同定または定量方法Info
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- JP2000069996A JP2000069996A JP10245409A JP24540998A JP2000069996A JP 2000069996 A JP2000069996 A JP 2000069996A JP 10245409 A JP10245409 A JP 10245409A JP 24540998 A JP24540998 A JP 24540998A JP 2000069996 A JP2000069996 A JP 2000069996A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遊離の糖化アミノ酸または糖化タンパク質に
おける糖化アミノ酸を同定または定量する方法を提供す
る。 【解決手段】 (1) 糖化アミノ酸を含む試料の一部にフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、糖を遊離
させるステップと、(2) 前記ステップ(1)で得られたフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼ処理試料、及び、前記
試料の別の一部をそれぞれアミノ酸分析に付すステップ
と、(3) 前記ステップ(2)で得られたアミノ酸分析の結
果を比較するステップと、により、糖化アミノ酸を同定
または定量する。糖化アミノ酸を含む試料は、糖化タン
パク質を加水分解して得られるアミノ酸を含む試料でも
よい。
おける糖化アミノ酸を同定または定量する方法を提供す
る。 【解決手段】 (1) 糖化アミノ酸を含む試料の一部にフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、糖を遊離
させるステップと、(2) 前記ステップ(1)で得られたフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼ処理試料、及び、前記
試料の別の一部をそれぞれアミノ酸分析に付すステップ
と、(3) 前記ステップ(2)で得られたアミノ酸分析の結
果を比較するステップと、により、糖化アミノ酸を同定
または定量する。糖化アミノ酸を含む試料は、糖化タン
パク質を加水分解して得られるアミノ酸を含む試料でも
よい。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖化アミノ酸を同
定または定量する方法に関する。
定または定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】醤油などの食品や血液などの生物学的試
料中には、遊離のアミノ酸やタンパク質のアミノ基とグ
ルコースのアルデヒド基とが結合し、アマドリ転移する
ことにより生成した糖化アミノ酸や糖化タンパク質が存
在することが知られている。例えば、血液中には、ヘモ
グロビンが糖化された糖化ヘモグロビンなどが含まれる
ことが知られている。
料中には、遊離のアミノ酸やタンパク質のアミノ基とグ
ルコースのアルデヒド基とが結合し、アマドリ転移する
ことにより生成した糖化アミノ酸や糖化タンパク質が存
在することが知られている。例えば、血液中には、ヘモ
グロビンが糖化された糖化ヘモグロビンなどが含まれる
ことが知られている。
【０００３】このような糖化アミノ酸や糖化タンパク質
の定量分析は、食品工業および医学を含む広範な分野で
応用されているが、なお研究を要する点も少なくなく、
試料中の糖化アミノ酸の同定および定量は、これらの応
用に寄与するところが大きい。
の定量分析は、食品工業および医学を含む広範な分野で
応用されているが、なお研究を要する点も少なくなく、
試料中の糖化アミノ酸の同定および定量は、これらの応
用に寄与するところが大きい。
【０００４】しかしながら、遊離の糖化アミノ酸や糖化
タンパク質中の糖化アミノ酸の同定および定量は容易で
はない。例えば、イソチオシアン酸フェニル（ＰＩＴ
Ｃ）をアミノ酸のα−アミノ基にカップリングさせ、生
成したフェニルチオカルバモイルアミノ酸（ＰＴＣ−ア
ミノ酸）を、ＨＰＬＣを用いて分離定量するＰＴＣ−ア
ミノ酸分析法が知られているが、糖化タンパク質の加水
分解物等の糖化アミノ酸含有試料を、ＰＴＣ−アミノ酸
分析法により分析すると、アミノ基にグルコースが結合
したアミノ酸はＰＩＴＣとカップリングできないため、
糖化アミノ酸を同定することができない。
タンパク質中の糖化アミノ酸の同定および定量は容易で
はない。例えば、イソチオシアン酸フェニル（ＰＩＴ
Ｃ）をアミノ酸のα−アミノ基にカップリングさせ、生
成したフェニルチオカルバモイルアミノ酸（ＰＴＣ−ア
ミノ酸）を、ＨＰＬＣを用いて分離定量するＰＴＣ−ア
ミノ酸分析法が知られているが、糖化タンパク質の加水
分解物等の糖化アミノ酸含有試料を、ＰＴＣ−アミノ酸
分析法により分析すると、アミノ基にグルコースが結合
したアミノ酸はＰＩＴＣとカップリングできないため、
糖化アミノ酸を同定することができない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、精度がよく
且つ容易に実施できる糖化アミノ酸の同定および定量方
法を提供することを課題とする。
且つ容易に実施できる糖化アミノ酸の同定および定量方
法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、糖化アミ
ノ酸を含む試料をアミノ酸分析に付する前に、フルクト
シルアミノ酸オキシアーゼで処理することにより、アミ
ノ酸の定量性を損なうことなく、糖をアミノ酸から遊離
させることができることを見い出し、本発明を完成し
た。
ノ酸を含む試料をアミノ酸分析に付する前に、フルクト
シルアミノ酸オキシアーゼで処理することにより、アミ
ノ酸の定量性を損なうことなく、糖をアミノ酸から遊離
させることができることを見い出し、本発明を完成し
た。
【０００７】かくして、本発明は、(1) 糖化アミノ酸を
含む試料の一部にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを
作用させるステップと、(2) 前記ステップ(1)で得られ
たフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ処理試料、及び、
前記試料の別の一部をそれぞれアミノ酸分析に付すステ
ップと、(3) 前記ステップ(2)で得られたアミノ酸分析
の結果を比較するステップと、を含む、糖化アミノ酸を
同定または定量する方法（以下、本発明方法ともいう）
を提供する。
含む試料の一部にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを
作用させるステップと、(2) 前記ステップ(1)で得られ
たフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ処理試料、及び、
前記試料の別の一部をそれぞれアミノ酸分析に付すステ
ップと、(3) 前記ステップ(2)で得られたアミノ酸分析
の結果を比較するステップと、を含む、糖化アミノ酸を
同定または定量する方法（以下、本発明方法ともいう）
を提供する。
【０００８】糖化アミノ酸を含む試料としては、糖化タ
ンパク質を加水分解して得られるアミノ酸を含む試料が
挙げられる。
ンパク質を加水分解して得られるアミノ酸を含む試料が
挙げられる。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳
細に説明する。糖化アミノ酸を含む試料の一部に、フル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、試料中に含
まれる糖化アミノ酸からアミノ酸を生じさせる。
細に説明する。糖化アミノ酸を含む試料の一部に、フル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、試料中に含
まれる糖化アミノ酸からアミノ酸を生じさせる。
【００１０】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、特
に限定されず、試料中に存在することが予想される糖化
アミノ酸または定量対象の糖化アミノ酸からアミノ酸を
生じるものが適宜選択される。例えば、糖化ヘモグロビ
ンの糖化アミノ酸を定量する場合には、ヘモグロビンの
Ｎ末端のバリンのα−アミノ基およびリジンのε−アミ
ノ基が糖化されるので、フルクトシルバリンおよびフル
クトシルリジンの両方に対して活性を有するもの（例え
ば、ペニシリウム属に属する微生物由来のフルクトシル
アミノ酸オキシダーゼ（特開平８−３３６３８６号公
報））を使用することが好ましい。
に限定されず、試料中に存在することが予想される糖化
アミノ酸または定量対象の糖化アミノ酸からアミノ酸を
生じるものが適宜選択される。例えば、糖化ヘモグロビ
ンの糖化アミノ酸を定量する場合には、ヘモグロビンの
Ｎ末端のバリンのα−アミノ基およびリジンのε−アミ
ノ基が糖化されるので、フルクトシルバリンおよびフル
クトシルリジンの両方に対して活性を有するもの（例え
ば、ペニシリウム属に属する微生物由来のフルクトシル
アミノ酸オキシダーゼ（特開平８−３３６３８６号公
報））を使用することが好ましい。
【００１１】アミノ酸分析は、公知の方法、例えば、ア
ミノ酸を含む試料をイオン交換樹脂のカラムで分離し、
ニンヒドリンまたはｏ−フタルアルデヒドと反応させて
検出する方法や、アミノ酸を検出が容易な種々の誘導体
（例えば、ＰＴＣ−アミノ酸）に変換した後、逆相のＨ
ＰＬＣで分離して検出する方法などによって行うことが
できる。
ミノ酸を含む試料をイオン交換樹脂のカラムで分離し、
ニンヒドリンまたはｏ−フタルアルデヒドと反応させて
検出する方法や、アミノ酸を検出が容易な種々の誘導体
（例えば、ＰＴＣ−アミノ酸）に変換した後、逆相のＨ
ＰＬＣで分離して検出する方法などによって行うことが
できる。
【００１２】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用
させた試料のアミノ酸分析では、糖化されていたアミノ
酸も検出または定量される。一方、フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼを作用させない試料のアミノ酸分析で
は、糖化アミノ酸は検出されない。従って、フルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼを作用させた試料のアミノ酸分
析の結果と、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用
させない試料のアミノ酸分析の結果とを比較することに
よって、試料中の糖化アミノ酸が検出または定量され
る。
させた試料のアミノ酸分析では、糖化されていたアミノ
酸も検出または定量される。一方、フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼを作用させない試料のアミノ酸分析で
は、糖化アミノ酸は検出されない。従って、フルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼを作用させた試料のアミノ酸分
析の結果と、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用
させない試料のアミノ酸分析の結果とを比較することに
よって、試料中の糖化アミノ酸が検出または定量され
る。
【００１３】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、定
量的に糖化アミノ酸からアミノ酸を生じるので、糖化ア
ミノ酸を正確に同定または定量できる。また、アミノ酸
分析前の試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作
用させる他は、従来のアミノ酸分析と同様の手順によっ
て容易に実施することが可能である。
量的に糖化アミノ酸からアミノ酸を生じるので、糖化ア
ミノ酸を正確に同定または定量できる。また、アミノ酸
分析前の試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作
用させる他は、従来のアミノ酸分析と同様の手順によっ
て容易に実施することが可能である。
【００１４】使用するフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼの溶液にアミノ酸が混合している場合には、フルクト
シルアミノ酸オキシダーゼの溶液についてもアミノ酸分
析を行い、この結果も含めて、試料中の糖化アミノ酸を
検出または定量すればよい。
ゼの溶液にアミノ酸が混合している場合には、フルクト
シルアミノ酸オキシダーゼの溶液についてもアミノ酸分
析を行い、この結果も含めて、試料中の糖化アミノ酸を
検出または定量すればよい。
【００１５】糖化タンパク質中の糖化アミノ酸を対象と
する場合には、加水分解して糖化しているアミノ酸を遊
離させることにより、同様の手法を用いて試料中の糖化
アミノ酸を検出または定量することができる。
する場合には、加水分解して糖化しているアミノ酸を遊
離させることにより、同様の手法を用いて試料中の糖化
アミノ酸を検出または定量することができる。
【００１６】糖化タンパク質の加水分解は、必要により
糖化タンパク質の単離および／または精製を行った後、
公知の加水分解法によって行うことができる。例として
は、酸（例えば、塩酸、メタンスルホン酸）による加水
分解、酵素（例えば、プロナーゼ）による加水分解が挙
げられる。糖化タンパク質中の糖化アミノ酸の定量を行
う場合には定量的な加水分解法が使用される。
糖化タンパク質の単離および／または精製を行った後、
公知の加水分解法によって行うことができる。例として
は、酸（例えば、塩酸、メタンスルホン酸）による加水
分解、酵素（例えば、プロナーゼ）による加水分解が挙
げられる。糖化タンパク質中の糖化アミノ酸の定量を行
う場合には定量的な加水分解法が使用される。
【００１７】定量対象の糖化アミノ酸が特定されている
場合には、糖化タンパク質は必ずしも完全にアミノ酸に
加水分解される必要はなく、目的の糖化アミノ酸が遊離
する条件で加水分解を行えばよい。このような部分的な
加水分解法としては、糖化タンパク質のＮ末端のアミノ
酸を酵素的に切断する方法が挙げられる。
場合には、糖化タンパク質は必ずしも完全にアミノ酸に
加水分解される必要はなく、目的の糖化アミノ酸が遊離
する条件で加水分解を行えばよい。このような部分的な
加水分解法としては、糖化タンパク質のＮ末端のアミノ
酸を酵素的に切断する方法が挙げられる。
【００１８】試料は、そのままの加水分解物でもよい
し、加水分解後、ゲル濾過などにより糖化アミノ酸を含
む画分を分取したものでもよい。
し、加水分解後、ゲル濾過などにより糖化アミノ酸を含
む画分を分取したものでもよい。
【００１９】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。
する。
【００２０】
【実施例１】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡ
ＯＤ）処理の有無による、糖化アミノ酸のアミノ酸分析
における挙動の相違を検討した。
ＯＤ）処理の有無による、糖化アミノ酸のアミノ酸分析
における挙動の相違を検討した。
【００２１】試料として、4 mMフルクトシルＬ−バリン
（ＦＶ）を用いた。アミノ酸分析はPTC-アミノ酸分析法
を用い、誘導体化は通常の方法で行った。
（ＦＶ）を用いた。アミノ酸分析はPTC-アミノ酸分析法
を用い、誘導体化は通常の方法で行った。
【００２２】試料のうち２０μｌは、アスペルギルス属
微生物由来のＦＡＯＤ（WO97/20039号公報）の溶液と混
合することによりＦＡＯＤと反応させた後、誘導体化を
行った。さらに別の２０μｌはそのまま誘導体化した。
また、ＦＡＯＤ溶液の持ち込むアミノ酸の測定のため、
ＦＡＯＤ溶液も誘導体化した。
微生物由来のＦＡＯＤ（WO97/20039号公報）の溶液と混
合することによりＦＡＯＤと反応させた後、誘導体化を
行った。さらに別の２０μｌはそのまま誘導体化した。
また、ＦＡＯＤ溶液の持ち込むアミノ酸の測定のため、
ＦＡＯＤ溶液も誘導体化した。
【００２３】PTC-アミノ酸の分析は次の条件で行った。
【００２４】
【表１】 表１ PTC-アミノ酸分析条件 ─────────────────────────────── カラム：YMC-Pack ODS-AM (250×4.6 mm I.D.) 溶出液：A)60 mM CH3COONa-CH3COOH (pH 6.0)/ACN (90/6) B)60 mM CH3COONa-CH3COOH (pH 6.0)/ACN (40/60) グラジエント：0-55% B (0-30 min,リニア), 100% B (30-40 min) 流速：1.0 ml/min 温度：37℃ 検出：紫外吸収(250 nm) ───────────────────────────────
【００２５】PTC-アミノ酸分析法により、ＦＡＯＤ処理
試料、未処理試料およびＦＡＯＤ溶液に関しそれぞれ得
られたクロマトグラムを図１に示す。
試料、未処理試料およびＦＡＯＤ溶液に関しそれぞれ得
られたクロマトグラムを図１に示す。
【００２６】図１に示されるとおり、ＦＶはそのままで
はPTC誘導体化されず、PTC-バリンとは全く異なる時間
（8.8分）に溶出された（なお、10.3分のピークは緩衝
液に由来するものである）。しかし、ＦＡＯＤ処理によ
り、ＦＶの糖が除かれ、誘導体化されたPTC-バリンが2
0.0分に溶出した。また、ＦＡＯＤ溶液自体にも複数の
アミノ酸が検出され、ＦＡＯＤ処理試料のアミノ酸分析
結果から、ＦＡＯＤ溶液が持ち込んだアミノ酸の量を引
くことにより、バリンと同定されるピークのみが確認で
きることが分かった。また、アミノ酸混合標準液を用い
て作成した検量線から、本法による定量性も確認でき
た。
はPTC誘導体化されず、PTC-バリンとは全く異なる時間
（8.8分）に溶出された（なお、10.3分のピークは緩衝
液に由来するものである）。しかし、ＦＡＯＤ処理によ
り、ＦＶの糖が除かれ、誘導体化されたPTC-バリンが2
0.0分に溶出した。また、ＦＡＯＤ溶液自体にも複数の
アミノ酸が検出され、ＦＡＯＤ処理試料のアミノ酸分析
結果から、ＦＡＯＤ溶液が持ち込んだアミノ酸の量を引
くことにより、バリンと同定されるピークのみが確認で
きることが分かった。また、アミノ酸混合標準液を用い
て作成した検量線から、本法による定量性も確認でき
た。
【００２７】以上より、糖化アミノ酸の同定・定量は、
ＦＡＯＤ処理した試料中に存在する各アミノ酸の量か
ら、未処理の試料およびＦＡＯＤ溶液中に存在する各ア
ミノ酸（それぞれ、試料に由来する糖化していないアミ
ノ酸および反応系に持ち込まれたＦＡＯＤ溶液由来のア
ミノ酸に相当する）の量を引くことによって行うことが
できることが明らかである。
ＦＡＯＤ処理した試料中に存在する各アミノ酸の量か
ら、未処理の試料およびＦＡＯＤ溶液中に存在する各ア
ミノ酸（それぞれ、試料に由来する糖化していないアミ
ノ酸および反応系に持ち込まれたＦＡＯＤ溶液由来のア
ミノ酸に相当する）の量を引くことによって行うことが
できることが明らかである。
【００２８】
【実施例２】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの糖化
アミノ酸に対する作用を検討した。糖化アミノ酸として
フルクトシルＬ−バリン（ＦＶ）を種々の濃度で含む試
料を調製し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡ
ＯＤ）の作用を検討した。ＦＡＯＤとしては、ペニシリ
ウム属に属する微生物由来のもの（特開平８−３３６３
８６号公報）を用いた。表２に示す組成の反応液を調製
し、３７℃で３０分間インキュベートし、５５５ｎｍで
の吸光度（Ｏ．Ｄ．５５５）を測定した。
アミノ酸に対する作用を検討した。糖化アミノ酸として
フルクトシルＬ−バリン（ＦＶ）を種々の濃度で含む試
料を調製し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡ
ＯＤ）の作用を検討した。ＦＡＯＤとしては、ペニシリ
ウム属に属する微生物由来のもの（特開平８−３３６３
８６号公報）を用いた。表２に示す組成の反応液を調製
し、３７℃で３０分間インキュベートし、５５５ｎｍで
の吸光度（Ｏ．Ｄ．５５５）を測定した。
【００２９】
【表２】表２ 反応液組成 ───────────────────────── 試料 ４００μｌ ３ｍＭ ４−アミノアンチピリン ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ1) ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ ＦＡＯＤ溶液 １０μｌ ０．１Ｍ Tris-HCl緩衝液(pH 8.0) ５００μｌ ───────────────────────── １）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン
ロピル）−ｍ−トルイジン
【００３０】ＦＶ最終濃度（ｍＭ）に対してＯ．Ｄ．５
５５をプロットしたグラフを図２に示す。広い濃度範囲
で直線性のよい結果が得られ、本発明方法において使用
するのに好適なものであることが分かった。
５５をプロットしたグラフを図２に示す。広い濃度範囲
で直線性のよい結果が得られ、本発明方法において使用
するのに好適なものであることが分かった。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、生物学的試料中や食品
中の遊離の糖化されているアミノ酸または糖化タンパク
質における糖化されているアミノ酸の同定および定量が
できる。
中の遊離の糖化されているアミノ酸または糖化タンパク
質における糖化されているアミノ酸の同定および定量が
できる。
【図１】 PTC-アミノ酸分析法により、ＦＡＯＤ処理試
料、未処理試料およびＦＡＯＤ溶液に関しそれぞれ得ら
れたクロマトグラムを示す。
料、未処理試料およびＦＡＯＤ溶液に関しそれぞれ得ら
れたクロマトグラムを示す。
【図２】 ＦＡＯＤの糖化アミノ酸に対する作用を示
す。
す。
Claims (2)
- 【請求項１】 (1) 糖化アミノ酸を含む試料の一部にフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させるステップ
と、 (2) 前記ステップ(1)で得られたフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ処理試料、及び、前記試料の別の一部をそ
れぞれアミノ酸分析に付すステップと、 (3) 前記ステップ(2)で得られたアミノ酸分析の結果を
比較するステップと、を含む、糖化アミノ酸を同定また
は定量する方法。 - 【請求項２】 前記試料が、糖化タンパク質を加水分解
して得られるアミノ酸を含む試料である請求項１記載の
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10245409A JP2000069996A (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 糖化アミノ酸の同定または定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10245409A JP2000069996A (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 糖化アミノ酸の同定または定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000069996A true JP2000069996A (ja) | 2000-03-07 |
Family
ID=17133233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10245409A Ceased JP2000069996A (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 糖化アミノ酸の同定または定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000069996A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002315600A (ja) * | 2001-04-20 | 2002-10-29 | Asahi Kasei Corp | Ｎ末端糖化蛋白質の定量方法 |
| JP2010263921A (ja) * | 2001-10-11 | 2010-11-25 | Arkray Inc | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 |
-
1998
- 1998-08-31 JP JP10245409A patent/JP2000069996A/ja not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002315600A (ja) * | 2001-04-20 | 2002-10-29 | Asahi Kasei Corp | Ｎ末端糖化蛋白質の定量方法 |
| JP2010263921A (ja) * | 2001-10-11 | 2010-11-25 | Arkray Inc | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 |
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