JP2000069973A - 新規酵素及びその製造方法 - Google Patents
新規酵素及びその製造方法Info
- Publication number
- JP2000069973A JP2000069973A JP10246217A JP24621798A JP2000069973A JP 2000069973 A JP2000069973 A JP 2000069973A JP 10246217 A JP10246217 A JP 10246217A JP 24621798 A JP24621798 A JP 24621798A JP 2000069973 A JP2000069973 A JP 2000069973A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- amino acid
- activity
- present
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 abstract 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 4
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108090000131 Metalloendopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003843 Metalloendopeptidases Human genes 0.000 description 2
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 2
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031293 Thimet oligopeptidase Human genes 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 108010032563 oligopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108010073106 thimet oligopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100325793 Arabidopsis thaliana BCA2 gene Proteins 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 101710158332 Diuretic hormone Proteins 0.000 description 1
- 101710204261 Diuretic hormone class 2 Proteins 0.000 description 1
- 102400000242 Dynorphin A(1-17) Human genes 0.000 description 1
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 description 1
- CSMHMEATMDCQNY-DZKIICNBSA-N Gln-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CSMHMEATMDCQNY-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- NKSGKPWXSWBRRX-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NKSGKPWXSWBRRX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- YHYDTTUSJXGTQK-UWVGGRQHSA-N Gly-Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YHYDTTUSJXGTQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001095266 Homo sapiens Prolyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- AUIYHFRUOOKTGX-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N AUIYHFRUOOKTGX-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000812 Neurolysin Proteins 0.000 description 1
- 102100023072 Neurolysin, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 description 1
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N Thr-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CCCN=C(N)N WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- JMNJYGMAUMANNW-FIXZTSJVSA-N dynorphin a Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JMNJYGMAUMANNW-FIXZTSJVSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005577 local transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規酵素及びその製造方法の提供。
【解決手段】 新規な酵素及びその製造方法。詳しく
は、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜５．２、至適ｐＨ
７．４〜７．７であり、高分子のタンパク質に作用せ
ず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異
的に加水分解する活性を有する新規なヒト型酵素。ヒト
大腸癌由来培養細胞Caco2 の細胞質溶液を、硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、該
酵素の製造方法。 【効果】 脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究
用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神経系
疾患の治療薬として有用。
は、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜５．２、至適ｐＨ
７．４〜７．７であり、高分子のタンパク質に作用せ
ず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異
的に加水分解する活性を有する新規なヒト型酵素。ヒト
大腸癌由来培養細胞Caco2 の細胞質溶液を、硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、該
酵素の製造方法。 【効果】 脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究
用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神経系
疾患の治療薬として有用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な酵素及びそ
の製造方法に関する。詳しくは、還元条件下におけるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点
４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分
子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残
基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する
新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2
の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製
することを特徴とする、該酵素の製造方法に関する。本
発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝
研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神
経系疾患の治療薬として有用である。
の製造方法に関する。詳しくは、還元条件下におけるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点
４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分
子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残
基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する
新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2
の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製
することを特徴とする、該酵素の製造方法に関する。本
発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝
研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神
経系疾患の治療薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】種々の生理活性ペプチドは、細胞間のシ
グナル伝達物質として作用していることが明らかにされ
つつあり、ペプチドホルモンとして、内分泌型のシグナ
ル伝達に関与するものや、局所的なケミカルメディエー
ターとして機能するもの、そして神経伝達物質として神
経細胞間の伝達物質として機能するものもある。いずれ
のタイプのペプチドも、ターゲットとする細胞の機能発
現と密接に関わっていることから、ペプチドの代謝回転
も厳密に制御されていると考えられている。特に神経系
など局所での伝達の場合、伝達物質の代謝回転は迅速
で、それに関わる分解酵素の機能を整理することは重要
な課題である。ペプチドホルモンや脳腸ペプチドの分解
酵素として、プロリルオリゴペプチダーゼ (EC 3.4.21.
26) 、ネプリリシン（neprilysin：EC 3.4.24.11）、サ
イメットオリゴペプチダーゼ（thimetoligopeptidase
：EC 3.4.24.15）、ニューロリシン（neurolysin：EC
3.4.24.16）などが知られているが、体内に広く分布す
るものや、細胞内に局在するものもあり、それらの機能
についての明確な結論は出ていない。
グナル伝達物質として作用していることが明らかにされ
つつあり、ペプチドホルモンとして、内分泌型のシグナ
ル伝達に関与するものや、局所的なケミカルメディエー
ターとして機能するもの、そして神経伝達物質として神
経細胞間の伝達物質として機能するものもある。いずれ
のタイプのペプチドも、ターゲットとする細胞の機能発
現と密接に関わっていることから、ペプチドの代謝回転
も厳密に制御されていると考えられている。特に神経系
など局所での伝達の場合、伝達物質の代謝回転は迅速
で、それに関わる分解酵素の機能を整理することは重要
な課題である。ペプチドホルモンや脳腸ペプチドの分解
酵素として、プロリルオリゴペプチダーゼ (EC 3.4.21.
26) 、ネプリリシン（neprilysin：EC 3.4.24.11）、サ
イメットオリゴペプチダーゼ（thimetoligopeptidase
：EC 3.4.24.15）、ニューロリシン（neurolysin：EC
3.4.24.16）などが知られているが、体内に広く分布す
るものや、細胞内に局在するものもあり、それらの機能
についての明確な結論は出ていない。
【０００３】高齢人口の増加に伴い、神経系の疾患とし
て痴呆症に関心が寄せられている。中でもアルツハイマ
ー症は最も解析の進んだ疾患の一つで、この疾患を誘引
する物質と考えられているβ−アミロイド蛋白質の産生
に、ペプチダーゼが関与している可能性が示唆されてい
る。サイメットオリゴペプチダーゼはその候補の一つで
もあり、広く体内に分布していて、主に細胞質に存在す
るメタロエンドペプチダーゼとして発見されたものであ
る。
て痴呆症に関心が寄せられている。中でもアルツハイマ
ー症は最も解析の進んだ疾患の一つで、この疾患を誘引
する物質と考えられているβ−アミロイド蛋白質の産生
に、ペプチダーゼが関与している可能性が示唆されてい
る。サイメットオリゴペプチダーゼはその候補の一つで
もあり、広く体内に分布していて、主に細胞質に存在す
るメタロエンドペプチダーゼとして発見されたものであ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
酵素と同様の活性を有する新規な酵素を求めて鋭意探索
した結果、ヒト大腸癌由来培養細胞であるCaco2 の細胞
質に、同様の活性を有する新規な酵素を見出した。従っ
て本発明は、新規なヒト型酵素及びその製造方法を提供
することを課題とする。
酵素と同様の活性を有する新規な酵素を求めて鋭意探索
した結果、ヒト大腸癌由来培養細胞であるCaco2 の細胞
質に、同様の活性を有する新規な酵素を見出した。従っ
て本発明は、新規なヒト型酵素及びその製造方法を提供
することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規な酵素及
びその製造方法に関する。本発明の新規酵素は、ヒト大
腸癌由来培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得
ることができる。即ち、培養したCaco2 を培養フラスコ
から常法により剥離、回収し、ホモジナイズしたものを
遠心分離する。さらに得られた上清を超遠心分離にか
け、これを細胞質溶液とする。この細胞質溶液を硫安分
画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画分を得、これを
透析する。透析後の粗画分を陰イオン交換樹脂で分画
し、活性画分を得る。さらに、得られた活性画分につい
て、ハイドロキシアパタイトカラム、セファクリルカラ
ム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラムを組
み合わせて精製することにより、精製された本発明の酵
素を得ることができる。このようにして得られた本発明
の酵素はヒト型であり、還元条件下におけるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜
５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分子のタン
パク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の
ペプチドを特異的に加水分解する活性を有するものであ
る。本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプ
チドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはアルツ
ハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
びその製造方法に関する。本発明の新規酵素は、ヒト大
腸癌由来培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得
ることができる。即ち、培養したCaco2 を培養フラスコ
から常法により剥離、回収し、ホモジナイズしたものを
遠心分離する。さらに得られた上清を超遠心分離にか
け、これを細胞質溶液とする。この細胞質溶液を硫安分
画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画分を得、これを
透析する。透析後の粗画分を陰イオン交換樹脂で分画
し、活性画分を得る。さらに、得られた活性画分につい
て、ハイドロキシアパタイトカラム、セファクリルカラ
ム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラムを組
み合わせて精製することにより、精製された本発明の酵
素を得ることができる。このようにして得られた本発明
の酵素はヒト型であり、還元条件下におけるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜
５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分子のタン
パク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の
ペプチドを特異的に加水分解する活性を有するものであ
る。本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプ
チドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはアルツ
ハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の酵素は、ヒト大腸癌由来
培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得ることが
できる。即ち、サブコンフルエント状態まで培養したCa
co2 を培養フラスコから常法により剥離、回収し、ホモ
ジナイズしたものを遠心分離する。得られた上清を、さ
らに超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液とする。細胞
質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画
分を得、これを透析する。透析後の粗画分を陰イオン交
換樹脂で分画し、活性画分を得る。この時用いる陰イオ
ン交換樹脂としては特に限定されないが、好ましくは弱
塩基性陰イオン交換樹脂であるDEAE-Sephadex 、DEAE-T
oyopearl、DEAE- セルロファインなど、特に好ましくは
DEAE- セルロースが用いられる。さらに、得られた活性
画分について、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、調製用電気泳動など通常用いられる手法を適宜組み
合わせて精製することにより、精製された本発明酵素を
得ることができる。この時、特にハイドロキシアパタイ
トカラム、セファクリルカラム、ブルーセファロースカ
ラム、ＭｏｎｏＱカラムを組み合わせて精製することが
好ましい。このようにして精製された画分を回収するこ
とにより、精製された本発明の酵素を得ることができ
る。本発明の酵素は、以下の物理化学的性質により特定
される。 (1)活性１：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸
６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解
する。 (2)活性２：キレート剤の存在下で失活する。 (3)分子量：７６±５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元
条件下） (4)ＰＡＳ染色：陰性 (5)等電点：４．６〜５．２ (6)至適ｐＨ：７．４〜７．７ (7)内部アミノ酸配列：配列表配列番号１及び２に示す
配列を有する。 本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプチド
ホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはペプチダー
ゼが関与していると考えられている疾患、例えばアルツ
ハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得ることが
できる。即ち、サブコンフルエント状態まで培養したCa
co2 を培養フラスコから常法により剥離、回収し、ホモ
ジナイズしたものを遠心分離する。得られた上清を、さ
らに超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液とする。細胞
質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画
分を得、これを透析する。透析後の粗画分を陰イオン交
換樹脂で分画し、活性画分を得る。この時用いる陰イオ
ン交換樹脂としては特に限定されないが、好ましくは弱
塩基性陰イオン交換樹脂であるDEAE-Sephadex 、DEAE-T
oyopearl、DEAE- セルロファインなど、特に好ましくは
DEAE- セルロースが用いられる。さらに、得られた活性
画分について、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、調製用電気泳動など通常用いられる手法を適宜組み
合わせて精製することにより、精製された本発明酵素を
得ることができる。この時、特にハイドロキシアパタイ
トカラム、セファクリルカラム、ブルーセファロースカ
ラム、ＭｏｎｏＱカラムを組み合わせて精製することが
好ましい。このようにして精製された画分を回収するこ
とにより、精製された本発明の酵素を得ることができ
る。本発明の酵素は、以下の物理化学的性質により特定
される。 (1)活性１：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸
６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解
する。 (2)活性２：キレート剤の存在下で失活する。 (3)分子量：７６±５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元
条件下） (4)ＰＡＳ染色：陰性 (5)等電点：４．６〜５．２ (6)至適ｐＨ：７．４〜７．７ (7)内部アミノ酸配列：配列表配列番号１及び２に示す
配列を有する。 本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプチド
ホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはペプチダー
ゼが関与していると考えられている疾患、例えばアルツ
ハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
【０００７】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説
明する。
明する。
【０００８】
【実施例１】本発明酵素の製造 (1）酵素活性測定 目的酵素の加水分解活性は、 Barrett等の方法 (Method
s in Enzymol., Vol.248, p529, 1995 ）に準じて測定
した。即ち、0.01mMの7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3
-phenylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババ
イオケム社）を基質として分解、生成される7-methoxyc
oumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-OHの時間
変化を測定した。生成物を１分当たりに１μmol 産生さ
せうる酵素量を１Ｕと定義した。
s in Enzymol., Vol.248, p529, 1995 ）に準じて測定
した。即ち、0.01mMの7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3
-phenylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババ
イオケム社）を基質として分解、生成される7-methoxyc
oumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-OHの時間
変化を測定した。生成物を１分当たりに１μmol 産生さ
せうる酵素量を１Ｕと定義した。
【０００９】(2) 細胞培養 Caco2 細胞をT-120 フラスコに、10%FCSを含むコスメデ
ィウム（コスモバイオ社）で37℃、5% CO 2 下、コンフ
ルエント状態に達するまで培養し、1010個の細胞を出発
材料とした。(3) 細胞分画と硫安分画 コンフルエントに達した細胞表面をPBS(-)ですすいだ
後、セルスクレイパーでかき取って，少量の生理食塩水
を加え剥離細胞を集めた。次いで、細胞懸濁液に対して
４倍量の20mM Tris/HCl(pH7.8)、 250mMショ糖、 5mM
２−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF（Phenyl methy
l sulfonyl fluoride ；和光純薬社）を加え、ポッター
型ホモジナイザーでホモジナイズした。次いで、10,000
×ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収
した上清を更に100,000 ×ｇ、１時間の超遠心分離を行
い、その上清を回収して細胞質溶液とした。細胞質溶液
を硫安分画に付し、硫安飽和度３５〜６０％沈殿画分を
回収した。次に、少量の 10mM Tris-HCl(pH 7.8)、 0.1
mM ZnCl2、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0.1mMPM
SF に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。
ィウム（コスモバイオ社）で37℃、5% CO 2 下、コンフ
ルエント状態に達するまで培養し、1010個の細胞を出発
材料とした。(3) 細胞分画と硫安分画 コンフルエントに達した細胞表面をPBS(-)ですすいだ
後、セルスクレイパーでかき取って，少量の生理食塩水
を加え剥離細胞を集めた。次いで、細胞懸濁液に対して
４倍量の20mM Tris/HCl(pH7.8)、 250mMショ糖、 5mM
２−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF（Phenyl methy
l sulfonyl fluoride ；和光純薬社）を加え、ポッター
型ホモジナイザーでホモジナイズした。次いで、10,000
×ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収
した上清を更に100,000 ×ｇ、１時間の超遠心分離を行
い、その上清を回収して細胞質溶液とした。細胞質溶液
を硫安分画に付し、硫安飽和度３５〜６０％沈殿画分を
回収した。次に、少量の 10mM Tris-HCl(pH 7.8)、 0.1
mM ZnCl2、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0.1mMPM
SF に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。
【００１０】(4）DEAE- セルロースクロマトグラフィー 透析後の粗画分を、予め10mM Tris-HCl(pH7.8)、 5mM
２−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0. 05% Br
ij-35 （和光純薬社）で平衡化したDEAE- セルロース
(ワットマン社) カラム（内径16mm、高さ35cm) にロー
ドし、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した後、流
量0.4ml/min 、NaCl濃度０〜０．３Ｍ／７００mlのグラ
ディエント溶出で分画し、活性画分を回収してＤＥプー
ルとした。ＤＥプールは、10mMリン酸ナトリウム(pH 6.
8)、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0. 05% Brij-3
5 、0.1mM ZnCl2 に対してダイアフィルトレーション
し、最終的に１０ｍｌに濃縮して次の精製ステップに供
した。
２−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0. 05% Br
ij-35 （和光純薬社）で平衡化したDEAE- セルロース
(ワットマン社) カラム（内径16mm、高さ35cm) にロー
ドし、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した後、流
量0.4ml/min 、NaCl濃度０〜０．３Ｍ／７００mlのグラ
ディエント溶出で分画し、活性画分を回収してＤＥプー
ルとした。ＤＥプールは、10mMリン酸ナトリウム(pH 6.
8)、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0. 05% Brij-3
5 、0.1mM ZnCl2 に対してダイアフィルトレーション
し、最終的に１０ｍｌに濃縮して次の精製ステップに供
した。
【００１１】(5) ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー ＤＥプールをハイドロキシアパタイトカラム（内径10m
m、高さ40mm、バイオラッド社）にロードして、流量0.1
ml/min 、分画量0.5ml で、リン酸濃度０．０１〜０．
３Ｍ／８０mlのグラディエント溶出で分画した。得られ
た画分の加水分解活性を測定し、活性画分をまとめてＨ
Ａプールとした。
フィー ＤＥプールをハイドロキシアパタイトカラム（内径10m
m、高さ40mm、バイオラッド社）にロードして、流量0.1
ml/min 、分画量0.5ml で、リン酸濃度０．０１〜０．
３Ｍ／８０mlのグラディエント溶出で分画した。得られ
た画分の加水分解活性を測定し、活性画分をまとめてＨ
Ａプールとした。
【００１２】(6) セファクリルＳ−２００ゲルフィルト
レーション ＨＡプールを限外濾過で２mlまで濃縮し、予め10mM Tri
s-HCl(pH7.8)、 5mM 2−メルカプトエタノール、 0.1mM
ZnCl2、 0.15M NaCl 、0.05% Brij-35 で平衡化したセ
ファクリルＳ−２００カラム (ファルマシア社) にアプ
ライして、流量0.2ml/min、分画量２mlで分離、分取し
た。各画分の分解活性を測定し、活性画分を合わせてＧ
Ｆプールとした。
レーション ＨＡプールを限外濾過で２mlまで濃縮し、予め10mM Tri
s-HCl(pH7.8)、 5mM 2−メルカプトエタノール、 0.1mM
ZnCl2、 0.15M NaCl 、0.05% Brij-35 で平衡化したセ
ファクリルＳ−２００カラム (ファルマシア社) にアプ
ライして、流量0.2ml/min、分画量２mlで分離、分取し
た。各画分の分解活性を測定し、活性画分を合わせてＧ
Ｆプールとした。
【００１３】(7) ブルーセファロースクロマトグラフィ
ー ＧＦプールを、 10mM Tris-HCl(pH7. 8)、 5mM ２−メ
ルカプトエタノール、0.1mM ZnCl2 、0.05% Brij-35 、
0.1M NaCl で平衡化した HiTrap Blueカラム (５ml、フ
ァルマシア社) にアプライして、非吸着画分を回収し
た。
ー ＧＦプールを、 10mM Tris-HCl(pH7. 8)、 5mM ２−メ
ルカプトエタノール、0.1mM ZnCl2 、0.05% Brij-35 、
0.1M NaCl で平衡化した HiTrap Blueカラム (５ml、フ
ァルマシア社) にアプライして、非吸着画分を回収し
た。
【００１４】(8) ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣ ブルーカラムの非吸着画分をＭｏｎｏＱカラム (ファル
マシア社) でさらに分画した。分離条件は、流量0.5ml/
min 、NaCl濃度０．１〜０．２Ｍ／３０分のグラディエ
ント溶出で、分画量0.5ml とした。活性画分をあわせ、
精製酵素とした。精製過程の収率を表１に示す。この結
果、最終的に比活性5.6U/mg の精製酵素が39μg 回収さ
れた。
マシア社) でさらに分画した。分離条件は、流量0.5ml/
min 、NaCl濃度０．１〜０．２Ｍ／３０分のグラディエ
ント溶出で、分画量0.5ml とした。活性画分をあわせ、
精製酵素とした。精製過程の収率を表１に示す。この結
果、最終的に比活性5.6U/mg の精製酵素が39μg 回収さ
れた。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【実施例２】本発明酵素の特性 (1) 分子量と等電点 本発明酵素の最終精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件
下）の結果を、図１に示す。最終的にＭｏｎｏＱで分画
して回収した画分は単一バンドを示し、実施例１記載の
方法により、本発明酵素を単離出来ることが確認され
た。単離した酵素の分子量は、７６±５ｋＤａであっ
た。又、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、精製酵
素はほぼ同一の移動度で単一バンドを示したことから、
本酵素は単一のペプチド鎖であることが確認された。さ
らに、等電点をファーストシステム（ファルマシア社）
を用いて分析した結果、本酵素の等電点は４．６〜５．
２であった。
下）の結果を、図１に示す。最終的にＭｏｎｏＱで分画
して回収した画分は単一バンドを示し、実施例１記載の
方法により、本発明酵素を単離出来ることが確認され
た。単離した酵素の分子量は、７６±５ｋＤａであっ
た。又、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、精製酵
素はほぼ同一の移動度で単一バンドを示したことから、
本酵素は単一のペプチド鎖であることが確認された。さ
らに、等電点をファーストシステム（ファルマシア社）
を用いて分析した結果、本酵素の等電点は４．６〜５．
２であった。
【００１７】(2) 至適ｐＨ 10mM Tris-HCl 緩衝液及び10mMリン酸緩衝液を、ｐＨ
７．０〜８．２まで適宜調整し、本発明酵素の各ｐＨに
おける活性を測定した。結果を図２に示す。この結果、
両緩衝液中とも至適ｐＨは７．４〜７．７を示した。
７．０〜８．２まで適宜調整し、本発明酵素の各ｐＨに
おける活性を測定した。結果を図２に示す。この結果、
両緩衝液中とも至適ｐＨは７．４〜７．７を示した。
【００１８】(3) 阻害剤 本酵素に対する各種プロテアーゼ阻害剤の影響を調べ
た。即ち、実施例１−(1) に記載の方法に従って１mUの
酵素量で阻害剤無添加時の比活性を測定し、次いで同一
酵素量に対し、表２に記載の濃度で各々の阻害剤を添加
し、阻害剤添加時の比活性を測定して、阻害率[%] ＝
（阻害剤無添加時比活性[mU/ml] ／阻害剤添加後比活性
[mU/ml] ）×100 を求めた。尚、プロテアーゼ阻害剤と
してＥ−64（ペプチド研究所社）、ＰＭＳＦ、ペプスタ
チン（Pepstatin ）、Ｏ−フェナントロリン（O-Phenan
throlin ）、ＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミド（N-ethy
lmaleimid ）（全て和光純薬社）を用いた。ＥＤＴＡの
み添加後１時間インキュベートした後、測定した。結果
を表２に示す。
た。即ち、実施例１−(1) に記載の方法に従って１mUの
酵素量で阻害剤無添加時の比活性を測定し、次いで同一
酵素量に対し、表２に記載の濃度で各々の阻害剤を添加
し、阻害剤添加時の比活性を測定して、阻害率[%] ＝
（阻害剤無添加時比活性[mU/ml] ／阻害剤添加後比活性
[mU/ml] ）×100 を求めた。尚、プロテアーゼ阻害剤と
してＥ−64（ペプチド研究所社）、ＰＭＳＦ、ペプスタ
チン（Pepstatin ）、Ｏ−フェナントロリン（O-Phenan
throlin ）、ＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミド（N-ethy
lmaleimid ）（全て和光純薬社）を用いた。ＥＤＴＡの
み添加後１時間インキュベートした後、測定した。結果
を表２に示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】この結果、単離した本発明酵素はＰＭＳ
Ｆ、ペプスタチンには全く阻害されなかったことから、
セリンプロテアーゼやアスパラギン酸プロテアーゼでは
ないことが確認された。一方、ＥＤＴＡやＯ−フェナン
トロリン等のキレート試薬で阻害されたことから、本発
明酵素は金属プロテアーゼであることが確認された。但
し、Ｅ−６４に阻害されず、Ｎ−エチルマレイミドに阻
害されたことから、本酵素に含まれるシステイン残基が
活性発現に何らかの関与をしていることが示唆された。
Ｆ、ペプスタチンには全く阻害されなかったことから、
セリンプロテアーゼやアスパラギン酸プロテアーゼでは
ないことが確認された。一方、ＥＤＴＡやＯ−フェナン
トロリン等のキレート試薬で阻害されたことから、本発
明酵素は金属プロテアーゼであることが確認された。但
し、Ｅ−６４に阻害されず、Ｎ−エチルマレイミドに阻
害されたことから、本酵素に含まれるシステイン残基が
活性発現に何らかの関与をしていることが示唆された。
【００２１】(4) 合成ペプチドに対するKm値とKi値 単離した本発明酵素の特性として、合成基質である 7-m
ethoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-G
ly-Pro-Lys(DNP)NH2（ノババイオケム社）に対するKm値
を、Serizawaらの方法（J.Biol.Chem., Vol.270, p2092
(1995) ）により測定した。その結果、Km値は22.2μＭ
を示した。又、同じ合成ペプチドを、ダイノルフィンＡ
(1-13) 及び N-[1-(RS)-carboxyl-3-phenylpropyl]-Al
a-Ala-Phe-pAb に対するKi値を測定した。その結果、Ki
値はそれぞれ 0.419μＭ及び 3.85 μＭを示した。
ethoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-G
ly-Pro-Lys(DNP)NH2（ノババイオケム社）に対するKm値
を、Serizawaらの方法（J.Biol.Chem., Vol.270, p2092
(1995) ）により測定した。その結果、Km値は22.2μＭ
を示した。又、同じ合成ペプチドを、ダイノルフィンＡ
(1-13) 及び N-[1-(RS)-carboxyl-3-phenylpropyl]-Al
a-Ala-Phe-pAb に対するKi値を測定した。その結果、Ki
値はそれぞれ 0.419μＭ及び 3.85 μＭを示した。
【００２２】(5) 基質特異性 本酵素の合成あるいは天然ペプチドに対する基質特異性
を測定した。即ち、合成あるいは天然ペプチドを基質と
し、その分解物をＨＰＬＣで分析した。尚、基質として
Dnp-Pro-Leu-Gly-Pro-Trp-D-Lys （ＱＦ０１；ノババイ
オケム社）、7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylp
ropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ＱＦ０２；ノバ
バイオケム社）、ブラジキニン、ニューロテンシン、黄
体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、アンジオテ
ンシンＩ、アンジオテンシンII、ダイノルフィンＡ、心
房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン
（全てシグマ社）を用いた。分離、分取後、アミノ酸分
析により切断位置を同定した。結果を表３に示す。
を測定した。即ち、合成あるいは天然ペプチドを基質と
し、その分解物をＨＰＬＣで分析した。尚、基質として
Dnp-Pro-Leu-Gly-Pro-Trp-D-Lys （ＱＦ０１；ノババイ
オケム社）、7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylp
ropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ＱＦ０２；ノバ
バイオケム社）、ブラジキニン、ニューロテンシン、黄
体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、アンジオテ
ンシンＩ、アンジオテンシンII、ダイノルフィンＡ、心
房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン
（全てシグマ社）を用いた。分離、分取後、アミノ酸分
析により切断位置を同定した。結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
【００２４】この結果、本発明酵素はコラーゲン、ウシ
血清アルブミン、カゼイン、ヒツジＩｇＧ、ミオグロビ
ン、トランスフェリン、オボアルブミン等の高分子タン
パク質を、全く分解しなかった。これに対し、合成の低
分子ペプチド類や脳腸ペプチドは、本発明酵素により分
解された。これを解析した結果、基質と成り得るペプチ
ド鎖は６残基から１７残基であったことから、本酵素は
オリゴエンドペプチダーゼ活性を有することが確認され
た。
血清アルブミン、カゼイン、ヒツジＩｇＧ、ミオグロビ
ン、トランスフェリン、オボアルブミン等の高分子タン
パク質を、全く分解しなかった。これに対し、合成の低
分子ペプチド類や脳腸ペプチドは、本発明酵素により分
解された。これを解析した結果、基質と成り得るペプチ
ド鎖は６残基から１７残基であったことから、本酵素は
オリゴエンドペプチダーゼ活性を有することが確認され
た。
【００２５】(6) アミノ酸配列 単離した本発明酵素のＮ末端アミノ酸配列分析を、自動
アミノ酸配列分析装置(４７６Ａ型、アプライドバイオ
システムズ社）を用いて実施したが、シグナルは検出さ
れず、Ｎ末端がブロックされている可能性が示された。
次に、精製した酵素の内部アミノ酸配列の分析を行っ
た。精製酵素約40μg(約500pmol 相当）を還元ピリジル
エチル化し、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）
で加水分解し、ついで逆相クロマトグラフィーで分解さ
れたペプチドを分離し、２ピークを分取し、自動アミノ
酸配列分析装置を用いて、目的酵素の内部アミノ酸配列
を解析した。得られた配列を、配列表配列番号１及び２
に示す。 各アミノ酸配列について、GeneBank、EMBL、及
びSwiss-Protデータベースに対して同一配列の検索を行
った結果、完全に一致するものは認められず、本発明で
得たヒト由来メタロエンドペプチダーゼが新規な物質で
あることが確認された。
アミノ酸配列分析装置(４７６Ａ型、アプライドバイオ
システムズ社）を用いて実施したが、シグナルは検出さ
れず、Ｎ末端がブロックされている可能性が示された。
次に、精製した酵素の内部アミノ酸配列の分析を行っ
た。精製酵素約40μg(約500pmol 相当）を還元ピリジル
エチル化し、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）
で加水分解し、ついで逆相クロマトグラフィーで分解さ
れたペプチドを分離し、２ピークを分取し、自動アミノ
酸配列分析装置を用いて、目的酵素の内部アミノ酸配列
を解析した。得られた配列を、配列表配列番号１及び２
に示す。 各アミノ酸配列について、GeneBank、EMBL、及
びSwiss-Protデータベースに対して同一配列の検索を行
った結果、完全に一致するものは認められず、本発明で
得たヒト由来メタロエンドペプチダーゼが新規な物質で
あることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、新規な酵素及びその製造
方法が提供される。詳しくは、還元条件下におけるＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点
４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分
子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残
基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する
新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2
の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製
することを特徴とする、該酵素の製造方法が提供され
る。本発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモン
の代謝研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病な
どの神経系疾患の治療薬として有用である。
方法が提供される。詳しくは、還元条件下におけるＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点
４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分
子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残
基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する
新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2
の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製
することを特徴とする、該酵素の製造方法が提供され
る。本発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモン
の代謝研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病な
どの神経系疾患の治療薬として有用である。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 雪印乳業株式会社 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. <120> 新規酵素及びその製造方法 <130> YTP98012 <160> 2 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 1 Thr Arg Thr Glu Glu Leu Ile Val Gln Thr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Human <400> 2 Gln Val Tyr Asp Ala Val Gly Met Leu Gly Ile Glu Glu Val Thr Tyr 1 5 10 15 Glu Asn Cys Leu Gln Ala Leu Ala Asp Val Glu Val Lys 20 25
【図１】 本発明酵素の還元条件下におけるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる泳動パターンを示す。
ＡＧＥによる泳動パターンを示す。
レーン１：分子量マーカー蛋白質 ９７ｋＤａ：ホスホリラーゼ ７８ｋＤａ：トランスフェリン ６８ｋＤａ：ウシ血清アルブミン ５５ｋＤａ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ３５ｋＤａ：グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ ２９ｋＤａ：カルボニックアンヒドラーゼ ２２ｋＤａ：大豆トリプシンインヒビター １２．５ｋＤａ：シトクロムＣ レーン２：本発明酵素
【図２】 本発明酵素の各緩衝液における至適ｐＨを示
す。
す。
●：10mM リン酸緩衝液 ○：10mM Tris-HCl緩衝液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA14 HA03 4B050 CC01 DD07 FF04C FF11C FF14C LL01 LL10 4C084 AA06 AA07 BA01 BA05 BA18 BA19 BA44 CA18 DC01 ZA162 ZC192
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の特性を有するヒト型酵素。 (1)活性１：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸
６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解
する。 (2)活性２：キレート剤の存在下で失活する。 (3)分子量：７６±５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元
条件下） (4)ＰＡＳ染色：陰性 (5)等電点：４．６〜５．２ (6)至適ｐＨ：７．４〜７．７ - 【請求項２】 配列表配列番号１及び２に示されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１記載の酵素。 - 【請求項３】 ヒト大腸癌由来培養細胞Caco2 (ATCC HT
B-37) の細胞質溶液を、硫安分画、イオン交換クロマト
グラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーに
より精製することを特徴とする、請求項１又は２記載の
酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24621798A JP3539476B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 新規酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24621798A JP3539476B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 新規酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000069973A true JP2000069973A (ja) | 2000-03-07 |
| JP3539476B2 JP3539476B2 (ja) | 2004-07-07 |
Family
ID=17145263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24621798A Expired - Fee Related JP3539476B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 新規酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3539476B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042940A1 (ja) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 送信装置及び自動利得制御方法 |
-
1998
- 1998-08-31 JP JP24621798A patent/JP3539476B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042940A1 (ja) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 送信装置及び自動利得制御方法 |
| US7206597B2 (en) | 2002-11-08 | 2007-04-17 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Transmission apparatus and auto gain control method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3539476B2 (ja) | 2004-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ogata et al. | Primary structure of rat liver dipeptidyl peptidase IV deduced from its cDNA and identification of the NH2-terminal signal sequence as the membrane-anchoring domain | |
| Foltmann | Chymosin: a short review on foetal and neonatal gastric proteases | |
| US5270176A (en) | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin | |
| Ashall | Characterisation of an alkaline peptidase of Trypanosoma cruzi and other trypanosomatids | |
| OLSEN et al. | Identification and characterization of Saccharomyces cerevisiae yapsin 3, a new member of the yapsin family of aspartic proteases encoded by the YPS3 gene | |
| Halila et al. | Purification of human procollagen type III N-proteinase from placenta and preparation of antiserum | |
| Ookawara et al. | Purification and subunit structure of extracellular superoxide dismutase from mouse lung tissue | |
| Lebherz et al. | Specific proteolytic modification of creatine kinase isoenzymes. Implication of C-terminal involvement in enzymic activity but not in subunit-subunit recognition | |
| Zolfaghari et al. | A high-molecular-mass neutral endopeptidase-24.5 from human lung | |
| Danley et al. | Structure and mechanism of formation of recombinant-derived chymosin C. | |
| Sakharov et al. | Purification and some properties of elastase from hepatopancreas of king crab Paralithodes camtschatica | |
| JP2000069973A (ja) | 新規酵素及びその製造方法 | |
| Savart et al. | Association of calpains 1 and 2 with protein kinase C activities | |
| Gupta et al. | Isolation and characterization of human liver guanine deaminase | |
| Green et al. | The purification and properties of a single chicken pepsinogen fraction and the pepsin derived from it | |
| AU618035B2 (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
| Mezina et al. | Isolation of milk-clotting enzyme from transgenic sheep milk and its comparison with calf chymosin | |
| US5082775A (en) | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents | |
| US5661000A (en) | Serine protease and serine protease gene | |
| JPH03501685A (ja) | ウロキナーゼ誘導体の製造方法 | |
| JPH09262085A (ja) | 新規酵素及びその製造方法 | |
| Foltmann et al. | Comparative investigations on pig gastric proteases and their zymogens | |
| EP0307478B1 (en) | Serine protease and serine protease gene | |
| Chongcharoen et al. | Characterization of trypsin-modified bovine lens acylpeptide hydrolase | |
| US6312935B1 (en) | Cathepsin-L, the pre-proform thereof and the corresponding propeptide from ciliates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040316 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040316 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |