ITVI20110166A1 - Metodo per ottenere una superficie metallica o prodotto, superficie metallica o prodotto ottenuto con detto metodo e supporto per la rigenerazione di tessuti ad elevata attrazione cellulare - Google Patents
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Description
METODO PER OTTENERE UNA SUPERFICIE O PRODOTTO METALLICO, SUPERFICIE O PRODOTTO METALLICO OTTENUTI TRAMITE DETTO METODO E PONTE DI TIPO STENT CORONARICO
AVENTE DETTA SUPERFICIE METALLICA
La presente invenzione riguarda un metodo per ottenere una superficie metallica, una superficie metallica ottenuta tramite detto metodo ed un ponte di collegamento a celle elevate, quale un ponte di tipo stent coronarico realizzato con detta superficie metallica.
In particolare, l’invenzione concerne un metodo del tipo suddetto, che permette di ottenere un metallo migliore e, più in dettaglio, un metallo del tipo predetto quale un titanio anodizzato con strutture di nanotubi che viene usato nell’impianto di cellule progenitrici endoteliali (EPC) come ponte di collegamento a cella elevata. Le EPC sono un insieme di cellule circolanti che possiedono la capacità di differenziarsi in cellule endoteliali. Queste cellule sono utilizzate per la scoperta di farmaci e la ricerca sul cancro e le malattie cardiovascolari e le loro applicazioni cliniche stanno per essere incrementate dalla conoscenza approfondita del loro ruolo nelle varie malattie normali e fisiopatologiche. Le EPC sono potenzialmente applicabili nei trattamenti di malattie cardiovascolari che comprendono malattie ischemiche coronariche dell’arteria, malattie ischemiche coronariche croniche dell’arteria e malattie vascolari periferiche per aumentare la neovascolarizzazione.
Questi grandi vantaggi delle EPC nel trattamento di malattie considerate prima causa di morte, in tutto il mondo, necessitano di tecniche migliorate per il loro isolamento, diffusione in vitro ed appropriata applicazione clinica. Uno dei passi più importanti dal laboratorio all’applicazione a bordo letto delle EPC e la traslazione clinica sostenuta à ̈ adeguata nell’impianto di cellula in vitro adatto per pazienti in termini di utilità clinica e costi economici. E’ quindi critico disporre di sufficienti cellule vitali da impiantare in vitro.
Chiaramente, le cellule hanno bisogno di ponti per la corretta adesione ad essi e la successiva diffusione e proliferazione in vitro. Il campo della tecnologia dei ponti sta migliorando rapidamente al fine di soddisfare le necessità degli scienziati che lavorano nel campo della terapia cellulare e della medicina rigenerativa. Il ponte adatto dovrebbe soddisfare il criterio di essere bio-inerte, atossico (biocompatibile), permettere alle cellule di aderire e proliferare su di esso allo stato vitale. Infatti, il basso costo del ponte e la sua disponibilità sono di fondamentale importanza. Sino ad ora, sono già stati ricercati ponti diversi, ma la ricerca per trovare il migliore non à ̈ mai terminata. Questo obiettivo finale dovrebbe fornire una superficie che permette un accresciuto attacco della cellula e la ritenzione della cellula, mantenendo vitale la cellula. Pertanto, si rivendica a questo scopo l’utilizzo del ponte metallico chiamato Corotanio, dal momento che questa superficie à ̈ poco costosa, atossica e sembra razionalmente migliorare l'attacco e la ritenzione della cellula.
E' quindi scopo della presente invenzione raggiungere gli obiettivi sopra menzionati, fornendo un metodo per ottenere una nuova superficie metallica con migliorata cellula EPC su di essa.
Per la prima volta, nei nostri studi, il titanio anodizzato con strutture di nanotubi ha dimostrato un impatto positivo in questo contesto. Studi precedenti hanno dimostrato aumentate funzioni dell’osteoblasto (cellule di formazione delle ossa), tra cui l'adesione, la sintesi del collagene intracellulare, l'attività di fosfatasi alcalina e la deposizione di calcio contenente minerali, sul titanio anodizzato affinché quest’ultimo mostri caratteristiche nanometriche come nuovo nanotubo, ma questa à ̈ la prima volta che il titanio anodizzato nanotubolare à ̈ usato per l’attacco migliorato delle EPC.
Ulteriore scopo della presente invenzione à ̈ fornire una nuova superficie metallica che possa potenzialmente essere usata come ponte stent. Gli stent coronarici di arteria con la loro natura non invasiva sono diventati un’esigenza diffusa tra i pazienti che soffrono di malattia coronarica dell’arteria che rimane la principale causa di morte, in tutto il mondo, e che sono sottoposti ad un intervento coronarico percutaneo. Gli stent con migliorato attacco EPC presentano costi più vantaggiosi. Per questo scopo il titanio necessita di una costruzione in 3D della superficie ed indagini in-vitro e in-vivo.
Altro scopo della presente invenzione à ̈ realizzare una riduzione dei costi di produzione del titanio anodizzato. Negli studi precedenti à ̈ stato utilizzato platino per anodizzazione la superficie del titanio, ciò rende costoso il processo ma per la prima volta noi utilizziamo acciaio inossidabile per ridurre i costi del processo e rendere commerciale questa tecnologia. Questi e altri scopi sono raggiunti per mezzo di un metodo per ottenere una superficie metallica ed una superficie metallica ottenuta con tale metodo, secondo l’allegata rivendicazione 1; altre caratteristiche di dettaglio dell'invenzione sono esposte nelle relative rivendicazioni dipendenti.
E’ quindi specifico oggetto della presente invenzione un metodo per ottenere una superficie metallica, che prevede le seguenti operazioni:
- tagliare un foglio di titanio commerciale puro in pezzi da 8 x 5 cm con uno spessore di circa 1 mm utilizzando una macchina automatica per taglio di metallo, detti pezzi fornendo una serie di substrati di titanio;
- pulire tutti i substrati con sapone liquido ed il 70% di etanolo per circa 10 minuti in un sonicatore ad acqua;
- asciugare i substrati in un forno a circa 600/700°C (preferibilmente 658°C) per circa 30 minuti;
- immergere i substrati di titanio in una miscela di acidi (2 ml 48% di HF, 3 ml 70% di HNO3e 100 ml di acqua deionizzata) per circa 5 minuti;
- trattare immediatamente alcuni di detti substrati tramite anodizzazione, ottenendo titanio anodizzato nanotubolare;
- lavare ad ultrasuoni tutti i substrati in un sonicatore ad acqua con acetone per circa 20 minuti e con il 70% di etanolo per circa 20 minuti;
- tagliare detto titanio anodizzato nanotubolare in piccoli pezzi di 1 x 1 cm tramite una macchina automatica per il taglio di metallo;
- pulire i pezzi in un bagno ad ultrasuoni di tetra cloro-etilene per circa 20 minuti, di acetone per circa 20 minuti e di etanolo al 70% per circa 20 minuti;
- sterilizzare i pezzi in titanio anodizzato nanotubolare mediante raggi UV per circa 4 ore.
Secondo l’invenzione, i substrati di titanio servono come anodo durante la fase di anodizzazione, mentre una lamina di acciaio inossidabile à ̈ utilizzata come catodo.
Inoltre, secondo l'invenzione, l'anodo ed il catodo sono collegati da cavi di rame e sono connessi con un polo positivo e negativo rispettivamente di alimentazione di energia a 30 V/3 A.
Preferibilmente, secondo l'invenzione, l'anodo ed il catodo sono mantenuti paralleli con una distanza di separazione di circa 2 cm.
Ancora, secondo l'invenzione, l'anodo ed il catodo sono immersi in una soluzione elettrolitica in un bicchiere in Teflon®.
Sempre secondo l'invenzione, HF diluito 17,21 (1,5% in peso) Ã ̈ utilizzato come elettrolita.
Secondo l'invenzione, inoltre, il potenziale tra anodo e catodo à ̈ mantenuto costante a 20 V.
Inoltre, secondo l'invenzione, la fase di anodizzazione dura circa 20 minuti.
Preferibilmente, secondo l'invenzione, dopo la fase di anodizzazione, tutti detti substrati vengono sciacquati accuratamente con H2O deionizzata, asciugati in forno a circa 658°C per circa 30 minuti.
E’ un ulteriore oggetto della presente invenzione una superficie metallica, chiamata Corotanio, ottenuta mediante tale metodo.
E’ un altro oggetto dell'invenzione un ponte di tipo stent coronarico avente detta superficie metallica o prodotto metallico.
Vantaggiosamente, lo spessore dello strato di ossido di Corotanio à ̈ circa 10 volte maggiore dello spessore dello strato di ossido di titanio naturale (che à ̈ di circa 50 Angstrom) e per questo motivo la resistenza alla corrosione del Corotanio così come la sua biocompatibilità à ̈ molto più elevata. Anche la durezza del Corotanio à ̈ circa 3 volte maggiore di quella del titanio naturale che à ̈ 122 HV.
La vitalità della cellula e l’attacco della cellula a questi substrati anodizzati nanotubolari sono stati esaminati usando coloritura MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromuro, un tetrazolo giallo) e DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo).
La morfologia della superficie del substrato à ̈ stata caratterizzata da SEM (Scanning Electron Microscope) e la rugosità della superficie à ̈ stata caratterizzata da uno strumento rugosimetro.
Ancora vantaggiosamente, le prove di attacco della cellula mostrano un sostanziale miglioramento nell’attacco della cellula al Corotanio come un substrato nano-anodizzato avanzato in cui il rapporto di attacco delle cellule ai substrati, rispetto ad elementi di controllo, si aggira intorno al 92%.
Inoltre vantaggiosamente, il Corotanio à ̈ il primo titanio anodizzato nanotubolare usato per l’attacco migliorato in vitro delle cellule di EPC.
Sempre vantaggiosamente, il Corotanio à ̈ potenzialmente applicabile nel trattamento delle malattie coronariche dell’arteria.
Altrettanto vantaggiosamente, il Corotanio à ̈ il primo prodotto di titanio anodizzato nanotubolare realizzato attraverso una tecnica economica e commerciale.
Inoltre, il Corotanio ha un ottimo rapporto di attacco delle cellule.
Ancora vantaggiosamente, non solo il Corotanio può essere utilizzato per un migliorato attacco delle EPC e potenzialmente applicabile per il trattamento di malattia coronarica dell’arteria ma à ̈ anche utilizzabile per la crescita in vitro degli osteoblasti e condrociti nel trattamento dei problemi ortopedici e dei danni della cartilagine legati all'età .
Il Corotanio può essere applicato vantaggiosamente per un migliorato attacco di altre cellule staminali.
Ancora vantaggiosamente, il Corotanio fornisce una nicchia per una migliorata proliferazione cellulare mentre mantiene la vitalità delle cellule.
L’attacco e la proliferazione migliorati della cellula con mantenimento della vitalità della cellula offrono un ponte vantaggioso per le attività dinamiche della cellula.
L’attacco migliorato della cellula raggiunto dal Corotanio à ̈ vantaggiosamente diretto, bypassando la necessità di attacco con polimero o mediato con anticorpo che à ̈ costoso e causa reazioni immunitarie infiammatorie.
Sempre vantaggiosamente, per effetto dell'applicazione di titanio puro, il Corotanio rimuove gli effetti tossici legati alla presenza di metalli pesanti come nichel nelle leghe NiTi.
I vantaggi del Corotanio avente specialmente uno strato di ossido molto spesso causa una maggiore resistenza alla corrosione, così come l’elevata durezza mostra che possiamo usare questo titanio anodizzato per produrre una nuova generazione di impianti con una durata più lunga rispetto agli attuali impianti sul mercato.
Gli impianti costituiti da Corotanio, grazie al loro innovativo processo di produzione, saranno vantaggiosamente molto più economici rispetto a quelli attuali anodizzati del mercato.
Altri scopi e vantaggi della presente invenzione saranno maggiormente evidenti dalla descrizione che segue, relativa ad una forma di realizzazione preferita e illustrativa, ma non limitativa.
Con riferimento alla presente invenzione, i prodotti metallici sono stati testati come segue.
MTT (vitalità e cito-tossicità della cellula): 2×10<4>cellule vengono coltivate sulla superficie del substrato in piastre a 12-pozzetti per 48 ore. Poi viene aggiunto MTT (5 mg/ml) alla cultura e le piastre sono tenute in un incubatore. Dopo 4 ore, i mezzi di coltura vengono rimossi e viene aggiunto isopropanolo acido (100 ml) (per 10 minuti a 37°C). Le cellule vengono centrifugate per circa 5 minuti a 14.000 giri al minuto e viene utilizzato surnatante per le analisi condotte dal lettore ELISA a 570 nm. La lunghezza d'onda di riferimento era di 630 nm.
DAPI (allegato): 5×10<4>cellule/ml vengono tenute in incubatore in piastre a 12-pozzetti con substrati. Dopo 4 ore i mezzi di coltura vengono rimossi e le cellule vengono lavate due volte con PBS. Quindi le cellule vengono trattate con paraformaldeide al 4% per circa 30 minuti a 40°C. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule vengono trattate con DAPI in una stanza buia per circa 15 minuti. Successivamente le cellule vengono lavate due volte con PBS e le cellule attaccate ai substrati vengono contate tramite un microscopio a fluorescenza. E’ stato utilizzato polistirolo di coltura di tessuto non trattate come controllo negativo.
SEM: 5×104 cellule/ml vengono tenute in incubatore in piastre a 12-pozzetti con substrati. Dopo 4 ore, i mezzi di coltura vengono rimossi e le cellule vengono lavate due volte con PBS. Le cellule, poi, vengono trattate con GTA per circa 2 ore a temperatura ambiente.
Viene quindi eseguita la fase di disidratazione mediante alcoli in accelerate concentrazioni come segue:
50, 60, 70, 80, 90 e 100.
I substrati vengono quindi asciugati a temperatura ambiente. I substrati non trattati vengono usati come controllo negativo.
Risultati:
MTT (570 nm):
Pozzetti di controllo: 0,04933
Substrato: 0,072
Substrato pozzetto: 0.042
Risultati DAPI: numero di cellule attaccate ai substrati/numero di cellule attaccate ai pozzetti di controllo = 91,8%.
Un foglio di titano commercialmente puro grado 1 ASTM B 265 con spessore di 1 mm viene tagliato in pezzi da 8 x 5 cm mediante una macchina automatica per taglio di metallo. Tutti i substrati vengono poi lavati con sapone liquido ed etanolo al 70% per circa 10 minuti in un sonicatore ad acqua. I substrati vengono poi asciugati in un forno a circa 658°C per circa 30 minuti al fine di preparali per l’anodizzazione. Dopo l’anodizzazione, tutti i substrati vengono lavati ad ultrasuoni in un sonicatore ad acqua con acetone per circa 20 minuti e con etanolo al 70% per circa 20 minuti.
Prima dell’anodizzazione, i substrati di titanio vengono immersi in una miscela acida (2 ml di HF al 48%, 3 ml di HNO3al 70% e 100 ml di acqua deionizzata) per circa 5 minuti per rimuovere lo strato di ossido che si forma in maniera naturale. Alcuni dei substrati lucidati ad acido vengono poi immediatamente trattati tramite anodizzazione. I substrati di titanio fungono da anodo nel processo di anodizzazione, mentre una lamiera di acciaio inossidabile funge da catodo. Anodo e catodo sono collegati da cavi di rame e sono connessi ad un polo di positivo e negativo rispettivamente di alimentazione di energia a 30 V/3 A (SP-2711; Schlumberger). Durante il processo, l'anodo e il catodo vengono mantenuti paralleli ad una distanza di separazione di circa 2 cm, e vengono sommersi in una soluzione elettrolitica in un bicchiere in Teflon. Viene usato HF diluito 17,21 (1,5% in peso) come elettrolita. Il potenziale tra anodo e catodo viene mantenuto costante a 20 V. Tutte le anodizzazioni vengono completate in circa 20 min. Dopo l’anodizzazione, tutti i substrati vengono sciacquati accuratamente con H2O deionizzata, asciugati in un forno a circa 658°C per circa 30 minuti. Successivamente il titanio anodizzato nanotubolare viene tagliato in piccoli pezzi di 1 x 1 cm mediante una macchina automatica di taglio. I fogli vengono quindi nuovamente puliti in un bagno ad ultrasuoni di tetra cloro-etilene per circa 20 minuti, di acetone per 20 minuti e in etanolo al 70% per 20 minuti e vengono poi asciugati. Infine utilizziamo raggi UV per circa 4 ore per sterilizzare i pezzi di titanio anodizzato nanotubolare.
Le caratteristiche del metodo per ottenere una superficie metallica e la superficie metallica, che sono oggetto della presente invenzione, così come i vantaggi sono evidenti dalla descrizione fatta.
E’ chiaro, infine, che numerose altre varianti possono essere apportate al metodo per ottenere una superficie metallica e la superficie metallica in questione, senza per questo allontanarsi dal principio di novità insito nell'idea inventiva qui espressa, così come à ̈ chiaro che, nella pratica attuazione dell'invenzione, i materiali, le forme e le dimensioni dei dettagli illustrati potranno essere modificati, in base alle esigenze, e sostituiti con altri tecnicamente equivalenti.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per ottenere una superficie metallica o un prodotto, che prevede le seguenti operazioni: - tagliare un foglio di titanio commercialmente puro con spessore di circa 1 mm in un pezzo utilizzando una macchina per il taglio del metallo, detto pezzo fornendo una serie di substrati di titanio; - pulire tutti detti substrati con sapone liquido ed etanolo in un sonificatore ad acqua; - asciugare detti substrati in un forno a circa 600/700°C per circa 30 min; - immergere detti substrati di titanio in una miscela di acido per circa 5 minuti; - trattare immediatamente alcuni di detti substrati tramite anodizzazione, ottenendo un titanio nanotubolare anodizzato; - lavare ad ultrasuoni tutti detti substrati in un sonificatore ad acqua con acetone per circa 20 minuti e con etanolo per circa 20 min; - tagliare detto titanio anodizzato nanotubolare in piccoli pezzi con una macchina di taglio; - pulire detti pezzi in un bagno di tetra cloro-etilene per circa 20 minuti; - pulire detti pezzi in un bagno di acetone per circa 20 minuti; - pulire detti pezzi in etanolo per circa 20 minuti; - sterilizzare detti pezzi di titanio anodizzato nanotubolare utilizzando raggi UV per circa 30 minuti.
- 2. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti substrati di titanio servono come anodo nella fase di trattamento dei substrati tramite anodizzazione, mentre una lamiera di acciaio inossidabile à ̈ usata come catodo, detti anodo e catodo essendo connessi rispettivamente ad un polo positivo e negativo di alimentazione dell’energia a 30 Volt/3 Ampere.
- 3. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detti anodo e catodo sono mantenuti paralleli con una distanza di separazione di circa 2 cm.
- 4. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come una qualsiasi delle rivendicazioni 2-3, caratterizzato dal fatto che detti anodo e catodo sono immersi in una soluzione elettrolitica in un bicchiere in Teflon®.
- 5. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che HF diluito 17,21 (1,5% in peso) Ã ̈ impiegato come elettrolita.
- 6. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come una qualsiasi delle rivendicazioni 2-5, caratterizzato dal fatto che il potenziale tra detti anodo e catodo à ̈ mantenuto costante a 20 V.
- 7. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, caratterizzato dal fatto che detta fase di trattamento dei substrati tramite anodizzazione dura 20 minuti.
- 8. Metodo per ottenere una superficie o prodotto metallico come una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che dopo detta fase di trattamento dei substrati tramite anodizzazione tutti detti substrati sono sciacquati accuratamente con H2O deionizzata, asciugati in un forno a circa 658°C per 30 minuti.
- 9. Superficie metallica o prodotto metallico ottenuto con un metodo come una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8.
- 10. Ponte di collegamento a celle elevate o stent coronarico avente una superficie metallica o un prodotto metallico come alla rivendicazione 9.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| IT000166A ITVI20110166A1 (it) | 2011-06-24 | 2011-06-24 | Metodo per ottenere una superficie metallica o prodotto, superficie metallica o prodotto ottenuto con detto metodo e supporto per la rigenerazione di tessuti ad elevata attrazione cellulare |
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| Country | Link |
|---|---|
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Citations (5)
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| WO2008066965A2 (en) * | 2006-06-23 | 2008-06-05 | The Regents Of The University Of California | Articles comprising large-surface-area bio-compatible materials and methods for making and using them |
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-
2011
- 2011-06-24 IT IT000166A patent/ITVI20110166A1/it unknown
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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