ITUD950066A1 - Procedimento per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, allo stato pronto per dosaggi biologici - Google Patents
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Description
Descrizione del trovato avente per titolo:
CONSERVAZIONE DI COLTURE CELLULARI, O DI PARTI DI CELLULE, ALLO STATO PRONTO PER DOSAGGI BIOLOGICI"
CAMPO DI APPLICAZIONE
Forma oggetto del presente trovato un procedimento per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, allo stato pronto per dosaggi biologici come espresso nella rivendicazione principale.
Il procedimento secondo il trovato viene utilizzato nel campo biologico, medico e della ricerca per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, che vengono successivamente utilizzate come tali per l'esecuzione di dosaggi biologici in cui le cellule devono essere preventivamente ulteriormente sensibilizzate nei confronti di un particolare ormone, o di un particolare effettore biologico o patologico .
Le colture cellulari o le parti di cellule preparate con il procedimento secondo il trovato possono essere utilizzate anche in centri non attrezzati al mantenimento di colture cellulari per la realizzazione di test biologici, cosiddetti "bio-assay" .
In particolare, il procedimento secondo il trovato viene utilizzato per preparare colture di cellule "FRTL5", cioè cellule di tiroide di ratto, utilizzabili per la successiva rilevazione e quantificazione della bioattività del TSH (ormone della crescita) o degli auto-ant icorpi tireostimolanti (TSab).
STATO DELLA TECNICA
Attualmente i dosaggi biologici vengono utilizzati nel campo medico, sia clinico che della ricerca, per rilevare e quantizzare l'attività biologica di fattori attivanti o inibenti che non possono venire altrettanto fedelmente identificati e quantificati con altre tecniche di laboratorio.
Per eseguire detti test biologici è necessario usare animali, ovvero colture cellulari, sottoponendo a volte, in quest'ultimo caso, le cellule ad una fase di preparazione preliminare, detta "starvation" o "privazione", in cui vengono allevate in completa assenza di un ormone, che viene poi utilizzato come stimolatore, per aumentarne la sensibilità nei confronti di detto ormone.
Le cellule che hanno subito la fase di "starvation" , o "privazione", vengono chiamate "cellule allo stato pronto".
La sensibilizzazione è efficace anche, e nello stesso modo, nei riguardi di stimolatori patologici quali gli auto-anticorpi tireostimolanti (TSab). Detta fase di privazione ha una durata variabile a seconda del tipo di dosaggi, dell'ordine di almeno qualche giorno, generalmente fra 5 e 10 giorni circa.
Un primo procedimento prevede di tenere continuamente in incubazione le colonie di cellule, fino al momento della realizzazione del test.
Questo procedimento presenta una pluralità di inconvenienti quali il costo elevato derivante dal consumo del terreno di coltura necessario a mantenere cellule sempre pronte per eventuali saggi, il pericolo di contaminazione del terreno di coltura con conseguente invalidità dei dosaggi eseguiti, la necessità di garantire il mantenimento della sterilità durante tutto il periodo di "starvation", la necessità dei ricambi di terreno, il mantenimento delle condizioni standard durante tutto il periodo, la difficoltà di trasferimento a distanza delle colture.
Inoltre, detto procedimento di produzione estemporanea delle colture al momento del fabbisogno non assicura una produzione di colture omogenee e riproducibili, con la conseguenza che i risultati ottenuti da colture prodotte in periodi diversi e/o in luoghi diversi non sono sempre ed interamente confrontabili fra loro.
Per ovviare ad alcuni di detti problemi è a volte utilizzato un procedimento in cui le colture vengono congelate prima della fase di starvation. Questo secondo procedimento, da una parte, riduce i costi relativi agli additivi necessari durante la coltivazione delle colture ma, dall'altra parte, non risolve i problemi legati ai lunghi tempi del periodo di starvation ed alla standardizzazione del prodotto finale.
In particolare, questo procedimento consiste nel congelare ad almeno -80 °C, ma tipicamente a temperature dell'ordine di -196 °C in azoto liquido, le cellule che devono essere utilizzate. Per la loro utilizzazione, dette cellule congelate devono essere sottoposte a scongelamento e ad un successivo periodo di ripresa durante il quale si depositano ed eventualmente aderiscono sul fondo in plastica del contenitore per poi venire sottoposte alla fase di starvation.
Detto periodo di ripresa può avere una durata anche di qualche giorno che deve essere sommato al tempo della fase di starvation e che porta i tempi di preparazione delle colture cellulari ad allungarsi ulteriormente.
Inoltre, detto procedimento non consente di ottenere una standardizzazione dei campioni che assicuri la completa riproducibilità degli esperimenti e limita quindi la validità degli stessi.
Ancora, un altro problema molto importante e finora non risolto, deriva dal fatto che finora solo i laboratori attrezzati ed esperti in colture cellulari sono in grado di eseguire test biologici su cellule in vitro, detti bio-assay, in quanto solo detti laboratori sono in grado di produrre e di mantenere in vita le colture cellulari necessarie per eseguire detti test.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere altri ed ulteriori vantaggi il proponente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
II presente trovato è espresso e caratterizzato nella rivendicazione principale.
Le rivendicazioni secondarie espongono varianti all’idea di soluzione principale.
Scopo del presente trovato è quello di fornire un procedimento per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, allo stato pronto per dosaggi biologici eseguibili in tempi molto ridotti.
Ulteriore scopo del trovato è quello di consentire per la prima volta di eseguire detti dosaggi biologici anche soprattutto da parte di utenti che non sono attrezzati e/o non sono capaci di assicurare il mantenimento di colture cellulari o la produzione di parte di esse.
II procedimento secondo il trovato consente quindi di fornire del materiale biologico preparato per la realizzazione di bio-assay in formato equivalente ai kit oggi normalmente e diffusamente usati per biochimica clinica e per radioimmunologia della tecnica tradizionale.
Ulteriore scopo del trovato è quello di fornire un procedimento per la preparazione di colture cellulari, o di parti di cellule, che siano state standardizzate e che consentano dei controlli di qualità atti a garantire la sterilità e la qualità delle colture prodotte.
Inoltre, il procedimento secondo il trovato consente la produzione di elevati quantitativi di colture cellulari o di parti di cellule aventi le stesse caratteristiche e che quindi possono essere utilizzate per eseguire esperimenti in tempi e/o luoghi diversi e per confrontare i risultati ottenuti .
Il procedimento secondo il trovato consente inoltre la produzione anche su larga scala di colture cellulari o di parti di cellule aventi le volute caratteristiche a costi notevolmente inferiori sia per le ridotte quantità di manipolazioni e di contenitori necessari per unità di prodotto, sia per i ridotti tempi di realizzazione del procedimento.
Nel procedimento secondo il trovato, più popolazioni cellulari vengono sottoposte tutte insieme alla fase di starvation per la durata richiesta per aumentarne la sensibilizzazione.
Indi, le varie popolazioni cellulari, o di parti di cellule, dopo la loro purificazione vengono sottoposte ad una fase di conservazione per poi essere fornite allo stato pronto per dosaggi biologici senza significativa perdita di vitalità, o di funzione.
A seconda della durata di tempo per cui dette colture cellulari o parti di cellule devono essere conservate, la fase di conservazione può essere eseguita con diversi procedimenti.
Per verificare che le fasi di starvation e di conservazione siano state correttamente eseguite e che le colture cellulari, o parti di cellule, sottoposte al procedimento di conservazione siano rispondenti alle caratteristiche volute, è possibile eseguire un'analisi su aliquota di dette colture cellulari o parti di cellule.
In questo modo viene garantito che tutte le colture cellulari, o parti di cellule, ottenute da uno stesso trattamento di starvation e da uno stesso procedimento di conservazione presentino le stesse caratteristiche.
In particolare, ciò consente di avere a disposizione una pluralità di colture cellulari o di parti di cellule aventi le stesse identiche caratteristiche e quindi utilizzabili da più laboratori, anche non equipaggiati per le colture cellulari, per eseguire le prove biologiche e per confrontare in seguito i risultati ottenuti.
Un primo procedimento di conservazione prevede il congelamento nell'intorno di -80 °C, o anche a temperature inferiori, e l'immagazzinamento in attesa dell'utilizzo in loco, ovvero della loro spedizione e successivo utilizzo altrove dal ricevente.
Detto ricevente è tipicamente un laboratorio di analisi, o un laboratorio di ricerca o uno studio medico anche non particolarmente attrezzato per, e/o non particolarmente esperto in, colture cellulari.
Al momento dell 'utilizzo, le dette colture cellulari, o parti di cellule, vengono scongelate e dopo un tempo di ripresa, preferibilmente dell'ordine di qualche ora al massimo, vengono utilizzate per il dosaggio biologico.
Il proponente ha scoperto che la fase di congelamento/ scongelamento delle colture dopo la starvation non influenza in alcun modo la sensibilità e la riproducibilità delle dette colture se preferibilmente utilizzate entro qualche ora dallo scongelamento.
Un secondo procedimento di conservazione prevede l’aggiunta di opportuni additivi al terreno di coltura.
Le colture cellulari così ottenute vengono quindi sigillate e stoccate per diverse settimane in uno stato di apparente "stasi" biologica a temperature uguali a quelle di incubazione, generalmente comprese fra 0 °C e 37 °C, vantaggiosamente a 4°C circa, secondo le tecniche tradizionali delle colture cellulari e in condizioni adatte ad ottenere una ottimale vitalità delle cellule "statiche".
Dette cellule "statiche", ovvero in uno stato di apparente "stasi" biologica, sono successivamente rivitalizzate effettuando, al momento opportuno, un cambio di terreno e riesponendole quindi al classico e noto terreno di coltura fresco ed incubate in attesa del dosaggio biologico da effettuarsi subito ovvero entro un lasso di tempo prestabilito.
Durante il periodo di stasi le colture cellulari possono essere sigillate e quindi preservate al buio ed in condizioni di temperatura, pressione e atmosfera controllate e costanti.
La costanza della composizione atmosferica viene eventualmente garantita dalla chiusura ermetica dei contenitori contenenti le colture cellulari.
Durante il detto stoccaggio, le colture cellulari allo stato pronto e "statiche" possono essere trasferite a distanza presso l'utente finale per potere realizzare esperimenti in tempi e/o luoghi diversi e confrontare i risultati ottenuti.
Secondo una variante, le colture cellulari o parti di cellule allo stato pronto, dopo la fase di starvation, vengono sottoposte ad una fase di frazionamento cellulare e di purificazione parziale per ottenere parti residue di cellule allo stato pronto .
Dette parti residue di cellule allo stato pronto hanno il vantaggio di facilitare la loro conservazione e la loro utilizzazione.
In particolare, dette parti residue di cellule allo stato pronto possono essere sottoposte ad un trattamento di liofilizzazione e quindi stoccate a temperatura ambiente, ovvero essere congelate e conservate a temperature nell'intorno di -20 °C, o a temperature inferiori.
ILLUSTRAZIONE DEL DISEGNO
La figura allegata è fornita a titolo esemplificativo non limitativo ed illustra con uno schema a blocchi alcune soluzioni preferenziali del trovato .
DESCRIZIONE DEL DISEGNO
Con riferimento alla figura allegata, il numero di riferimento 10 indica generalmente un procedimento per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, allo stato pronto per dosaggi biologici secondo il trovato.
Nel caso di specie, il procedimento 10 si riferisce alla preparazione di cellule della tiroide di ratto FRTL5 che vengono sensibilizzate contemporaneamente all'ormone TSH e agli autoanticorpi tireostimolanti TSab.
Le colture cellulari 11 vengono sottoposte ad una fase di starvation, o privazione, 12 in cui vengono allevate in un terreno privo di TSH per un periodo di un tempo compreso fra 7 e 10 giorni in modo da sensibilizzarle ulteriormente nei confronti del detto ormone TSH e dei detti TSab.
Indi, le colture cellulari, o parti di cellule, allo stato pronto Ila vengono sottoposte ad un procedimento di conservazione 24 che, a seconda della durata del tempo di conservazione desiderato, può essere realizzato secondo diverse tecniche.
In una prima formulazione del trovato, la conservazione 24 viene realizzata sottoponendo le colture cellulari, o parti di cellule, allo stato pronto Ila ad una fase di congelamento 13 nell'intorno di -80 °C, che non ne cambia in alcun modo le caratteristiche, per ottenere colture cellulari, o parti di cellule, allo stato pronto e congelate llb.
Indi, le colture cellulari o parti di cellule allo stato pronto e congelate llb vengono immagazzinate e stoccate 14 fino al momento del loro utilizzo.
Le colture cellulari o parti di cellule allo stato pronto e congelate llb possono anche essere spedite e stoccate, sempre allo stato pronte, presso l 'utilizzatore finale.
Per controllare la corretta esecuzione delle fasi di starvation 12 e di congelamento 13, e per controllare la qualità e le caratteristiche delle colture cellulari o di parti di cellule allo stato pronto e congelate llb, è possibile eseguire eventuali analisi 15 su un campione delle dette colture cellulari o di parti di cellule allo stato pronto e congelate llb.
In questo modo, è disponibile una quantità notevole di colture cellulari o di parti di cellule allo stato pronto e congelate llb aventi le stesse caratteristiche e pronte per l'uso.
Per l'esecuzione dei dosaggi biologici 18 è sufficiente sottoporre le colture cellulari o parti di cellule allo stato pronto e congelate llb ad una fase di scongelamento 16 e ad una successiva fase di ripresa 17, che è dell’ordine delle due ore, ottenendo colture cellulari, o parti di cellule, allo stato pronto e scongelate Ile.
In questo modo, le colture cellulari, o parti di cellule, allo stato pronto e scongelate Ile aventi le stesse caratteristiche possono essere utilizzate sia per eseguire dosaggi 18 uguali in laboratori differenti ovvero dosaggi 18 diversi su colture cellulari, o su parti di cellule, allo stato pronto e scongelate Ile equivalenti.
Prima dell’esecuzione del dosaggio biologico 18, o contemporaneamente ad esso 18, le colture cellulari o le parti di cellule allo stato pronto e scongelate Ile possono essere sottoposte ad un'ulteriore fase di analisi di qualità 115 per garantire l'attendibilità dei risultati del dosaggio biologico 18.
Secondo una variante, dopo la fase di starvation 12, le colture cellulari o parti di cellule allo stato pronto Ila possono essere sottoposte ad una procedura di frazionamento cellulare e di parziale purificazione 19 di alcuni dei loro componenti allo scopo di ottenere parti residue di cellule 20 che vengono utilizzate nelle successive manipolazioni e dosaggi.
In particolare, le parti residue di cellule 20 ottenute a valle della procedura di frazionamento cellulare e di parziale purificazione 19 sono più facilmente stoccabili.
In particolare, dette parti residue di cellule 20 possono essere sottoposte ad una fase di conservazione 24 mediante liofilizzazione 21 e successivo mantenimento a temperatura ambiente oppure mediante congelamento 113 ad una temperatura nell'intorno di -20 °C.
Secondo un'altra variante, la conservazione 24 delle colture cellulari allo stato pronto Ila viene realizzata sottoponendole ad una fase di "stasi" 22 dopo essere state anche eventualmente trattate con opportuni additivi.
Dette colture "statiche" lld vengono quindi sigillate, immagazzinate e stoccate 14, in ambienti a temperatura, pressione e composizione costanti fino al momento del loro utilizzo.
Prima del loro utilizzo, dette colture cellulari statiche" lld vengono sottoposte ad un trattamento di "rivitalizzazione" 23 riesponendole al classico terreno di coltura fresco.
Con il procedimento secondo il trovato è quindi ora possibile rifornire di materiali biologici, pronti per l'utilizzo e di qualità controllata e costante, anche utilizzatori finali quali laboratori di analisi o di ricerca e/o studi medici non attrezzati e/o non esperti in colture cellulari.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1 - Procedimento per la preparazione e la conservazione di colture cellulari, o di parti di cellule, caratterizzato dal fatto che dopo essere state sottoposte ad una fase di starvation (12), vengono sottoposte ad un procedimento di conservazione (24), senza significativa perdita di vitalità o di funzione e quindi fornibili allo stato pronto per dosaggi biologici. 2 - Procedimento come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il procedimento di conservazione (24) viene realizzato mediante congelamento (13) nell'intorno di -80 °C. 3 - Procedimento come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il procedimento di conservazione (24) viene realizzato mediante mantenimento delle cellule allo stato pronto (Ila) in uno stato di apparente "stasi" biologica (22) a temperature comprese fra 0°C e 37°C. 4 - Procedimento come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che il procedimento di conservazione (24) viene realizzato mediante mantenimento delle cellule allo stato pronto (Ila) in uno stato di apparente "stasi" biologica ad una temperatura di 4°C. 5 Procedimento come alla rivendicazione caratterizzato dal fatto che il procedimento conservazione (24) comprende una fase frazionamento cellulare e purificazione parziale (19) per ottenere parti residue di cellule (20). 6 - Procedimento come alla rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il procedimento di conservazione (24) comprende la liofilizzazione (21) ed il mantenimento a temperatura ambiente. 7 - Procedimento come alla rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il procedimento di conservazione (24) comprende il congelamento nell'intorno di -20°C. 8 - Procedimento come alla rivendicazione 3 o 4, caratterizzato dal fatto che le colture cellulari allo stato pronto e "statiche" (lld) vengono conservate al buio ed in condizioni di temperatura, pressione ed atmosfera costanti e vengono successivamente "rivitalizzate" (23) e/o "riattivate" e quindi usate subito, ovvero entro poche ore. 9 - Procedimento come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che le colture cellulari allo stato pronto, ovvero le parti residue di cellule (20), a valle del procedimento di conservazione (24), vengono sottoposte ad un'analisi di qualità (15) prima di venire immagazzinate e stoccate (14). 10 - Procedimento come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che le colture cellulari allo stato pronto, ovvero le parti residue di cellule (20), vengono sottoposte ad un'analisi di qualità (115) prima o contemporaneamente alla fase di dosaggio biologico (18) . 11 - Procedimento caratterizzato dal fatto che adotta i contenuti di cui alla descrizione . 12 - Procedimento caratterizzato dal fatto che adotta i contenuti di cui alla figura.
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