ITTS20080012A1

ITTS20080012A1 - Biosensori elettrochimici basati sui nanobiocompositi

Info

Publication number: ITTS20080012A1
Application number: IT000012A
Authority: IT
Inventors: Silvia Stredanska; Miroslav Stredansky; Pavol Szomolanyi; Jan Tkac
Original assignee: Eurosen S R L
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2008-11-19
Publication date: 2010-05-20

Description

DESCRIZIONE

Stato della tecnica

La presente invenzione riguarda biosensori elettrochimici basati sii nanobiocompositi contenenti elementi di riconoscimento biologico, nanoparticelle dei metalli nobili e polisaccaridi acidi. Il biosensore è uno strumento analitico consistente in un materiale biologicamente attivo usato in stretta relazione ad un trasduttore tìsicochimico, il quale è in grado di convertire il segnale biochimico in un quantificabile segnale elettrico. Dal punto di vista analitico, i biosensori presentano numerosi vantaggi, quali specificità, sensibilità, manipolazione semplice, risposta rapida, e di conseguenza un basso costo dell’analisi. Possono essere impiegati nella diagnostica umana, nel monitoraggio di qualità e di freschezza degli alimenti, nel monitoraggio delfambiente, nel controllo delle fermentazioni, ecc. Dal punto di vista commerciale, il tipico problema dei biosensori è una limitata stabilità termica o quella d’immagazzinamento (Chaniotakis, Anal. Bioanal. Chem. 378, pp.89-95, 2004) che si conta in giorni o in settimane, spesso anche in mesi, ma raramente in anni. Ciò dipende dalla durata, come anche dalla velocità della denaturazione o inattivazione dell’elemento biologico impiegato (enzimi, strutture cellulari o subcellulari, anticorpi, antigeni, recettori, acidi nucleici, ecc.). Queste considerazioni confermano che la stabilità dell’elemento del riconoscimento biologico è di cruciale importanza e per risolverla sono state adottate varie strategie. Le più frequenti sono riportate in seguito:

a) aggiunta di stabilizzatori (EP 0523130; U.S. Pat. No. 6656702; Stredansky et al., Anal. Biochem. 285, pp.

225-229, 2000; Chaniotakis, Anal. Bioanal. Chem. 378, pp.89-95, 2004). I stabilizzatori più efficienti sono zuccheri e altri polioli (per esempio trealosio, saccarosio, glicerolo, sorbitolo, lactitolo), aminoacidi ed alcuni altri osmoliti (L-prolina, L-alanina, glieina, sarcosina, taurina, betaina), polielettroliti (DEAE-deslrano, polietilene glicol, polietilenimina);

b) legame covalente o/e cross-linking con agenti bifunzionali come glutaraldeide (DeSantis & Jones, Curr. Opin. Biotechnol. 10, pp. 324-330, 1999; House et al., J. Diabetes Sci. Technol. 1, pp. 18-27, 2007);

c) assorbimento fisico sulla superfìcie solida e nelle cavità di micro- e nanomateriali porosi (Simon et al., J. Electroanal. Chem. 538-539, pp. 253-259, 2002; Sotiropoulou, Biosens. Bioelectron. 20, pp. 1674-1679, 2005); d) intrappolamento nelle matrici polimeriche di polimeri naturali, sintetici ed elettrodepositati (Krajewska. F.nzyme Microb. Technol. 35, pp. 126-134, 2004; Crumbliss et al., Biosens. Bioelectron. 8, pp. 331-337; Lukachova et al., Sens, Actuators B 44, pp. 356-360; U.S. Pat. No, 6814845);

e) incorporazione nelle matrici idrofobiche (Wang et al, Anal. Chem. 69, pp. 3124-3127, 1997; U.S. Pat. No.

6340597).

Nell’ultimo periodo, la nanotecnologia ha svolto un ruolo importante nello sviluppo dei biosensori, perché le prestazioni e la robustezza dei biosensori si possono migliorare impiegando i nanomateriali (Wang, Analyst 130, pp. 421-426, 2005; Welch and Compton, Anal. Bioanal. Chem. 384, pp. 601-619, 2006). In particolare, nanoparticelle di metalli nobili come Au, Pt, Pd, possono positivamente influenzare la sensibilità, la selettività e le altre importanti proprietà del biosensore elettrochimico in maniera significante. Questi biosensori sono prevalentemente preparati immobilizzando componenti biologiche con la semplice tecnica di assorbimento fisico sulla superficie di nanoparticelle (modificazione di nanoparticelle). Per completare la preparazione del biosensore, le nanoparticelle vengono fissate sulla superficie dell’elettrodo o modificate con un biocomponente o non modificate. Sebbene l’assorbimento è forte e in molti casi specifico, i biosensori come sistema risultano fragili, il che può negativamente influenzare il successo commerciale dei biosensori basati su nanoparticelle per via della loro stabilità limitata e più complicata maneggevolezza e manipolazione. Questa problematica presenta il punto debole dei biosensori dello stato dell’arte contenenti nanoparticelle di metalli nobili. In conseguenza di ciò è fortemente necessario trovare delle soluzioni per diminuire la fragilità dei biosensori e migliorare la loro stabilità. Finora sono stati descritti più metodi di preparazione delle nanoparticelle dei metalli nobili, ma il metodo usato più frequentemente è la riduzione chimica dei cationi di metallo a condizioni controllate che porta alla formazione di una soluzione colloidale delle nanoparticelle del metallo (Welch and Compton, Anal. Bioanal. Chem. 384, pp. 601-619, 2006; Daniel and Astruc, Chem. Rev. 104, pp. 293-346, 2004). Molto intensamente è stata studiata la sintesi dell’oro colloidale e le nanoparticelle degli altri metalli nobili sono state poi preparate in maniera analoga (Lu et al., Advances Technol. Mater. Mater. Processing 7, pp.111-118, 2005). Vari agenti riducenti a basso peso molecolare, tra i quali boroidride di sodio, idrossilammina, ìdrazina, etanolo, metanolo, etilene glicol, dimetilformamide, citrato, sono stati usati per la riduzione di metalli nobili a condizioni specifiche per la formazione di nanoparticelle con le dimensioni e la dispersità desiderate. Tuttavia, le particelle colloidali hanno la tendenza di aggregarsi formando un precipitato metallico. Per evitare questo inconveniente è necessaria l’aggiunta di un agente protettivo che avvolge la nanoparticella con uno strato protettivo. Esistono due modi per ottenere tutto ciò: la stabilizzazione elettrostatica introducendo nella soluzione degli ioni oppure stabilizzazione sierica aggiungendo alla soluzione dei gruppi chimici voluminosi.

Tioli, agenti stabilizzanti usati più frequentemente, sono stati introdotti da Brusi et al. (.1. Chem. Soc., Chem. Commuti. 1994, pp. 801-802, 1994), citrato invece è stato utilizzato da Turkevich et al. (Disc. Faraday Soc. 1 I, pp. 55-75, 1951). Citrato svolge simultaneamente due ruoli: quello dell’agente riducente e quello dello stabilizzatore. I polisaccaridi, conosciuti come stabilizzatori di colloidi, sono stati descritti come agenti protettivi delle dispersioni delle nanoparticelle dei metalli nobili. Arabinogalattano è stato impiegato come stabilizzante sferico in soluzione delle nanoparticelle colloidali di platino, di palladio, di argento (Mucalo et al., J. Mater. Sci. 37, pp. 493-504, 2002). L’alginato di calcio ha funto da portatore nel processo della formazione delle nanoparticelle d’oro. (Huang et al., Lab Chip 6, pp. 954-957, 2006). li chitosano e l’eparina sono stati usati come agenti riducenti e stabilizzanti nella sintesi di nanoparticelle d’oro e d’argento (Huang and Yang, Carbohydrate Res. 339, pp. 2627-2631, 2004). La gomma arabica è stata impiegata nella stabilizzazione di nanoparticelle d’oro (Kattumuri et al., Small 3, pp. 333-341, 2007). U.S. Application No. 20060188772 descrive il metodo della preparazione di nanoparticelle dei metalli nobili con l’uso di vari polisaccaridi con un effetto stabilizzante temporaneo c che più avanti vengono eliminati tramite pirolisi o idrolisi. Tuttavia, finora non è stato descritto l’incorporamento di nessun elemento biologicamente riconoscibile in polisaccaridi sopra menzionati usati per la stabilizzazione di nanoparticelle di metalli nobili.

Sommario

La presente invenzione riguarda una possibile soluzione dei problemi sopra riportati che si sono riscontrati nei nuovi biosensori. La soluzione consiste nella simultanea stabilizzazione degli elementi biologicamente riconoscibili insieme alle soluzioni/dispersioni acquose delle nanoparticelle dei metalli nobili impiegando dei polisaccaridi acidi. In più, depositando nanobiocompositi sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico viene eseguita una semplice immobilizzazione di nanoparticelle (modificate) con la quale si preparano i biosensori. Biosensori preparati secondo questo metodo presentano prestazioni migliorate, in particolare quelle di sensibilità e di stabilità.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione riguarda il metodo di preparazione di biosensori con migliorate proprietà ottenute mediante una appropriata combinazione di elementi del riconoscimento biologico, di nanoparticelle di metalli di pisaccarde acido presente nello strato di bioriconoscimento. Secondo la presente invenzione il metodojìì-preparazione dei biosensori consiste nei seguenti passaggi:

a) preparazione della dispersione acquosa delle nanoparticelle dei metalli nobili, che vengono simultaneamente oppure successivamente stabilizzate con aggiunta di un polisaccaride acido solubile in acqua;

b) aggiunta di almeno un elemento del riconoscimento biologico alla dispersione di nanoparticelle;

c) aggiunta facoltativa di cofattori biologici, di mediatori elettrochimici, di detergenti, di sostanze miglioranti la tluidità della soluzione/dispersione acquosa e di additivi a basso peso molecolare;

d) deposizione della miscela finale sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico;

e) essiccazione della miscela finale applicata sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico;

f) facoltativamente almeno una ripetizione dei passaggi d) ed e)

g) trattamento facoltativo dello strato ottenuto con reagenti chimici miglioranti la robustezza del biosensore, come agenti di cross- linking, sali di cationi mono- o bivalenti.

Detti elementi del riconoscimento biologico sono stati scelti nel gruppo costituito da: enzimi, strutture cellulari e subcellulari, anticorpi, antigeni e loro coniugati, ricettori, acidi nucleici.

Gli enzimi preferibilmente usati sono: glucosio ossidasi, ascorbatu ossidasi, alcool ossidasi, sorbitolo ossidasi, polifenolo ossidasi, piruvato ossidasi, colesterolo ossidasi, L-lattato ossidasi, bilirubina ossidasi, xantina ossidasi, sarcosina ossidasi, galattosio ossidasi, glicerolo-3-fosfato ossidasi, piranosio ossidasi, L-lisina ossidasi, L-glutamato ossidasi, 1, -aminoacido ossidasi, D-aminoacido ossidasi, amino ossidasi, lipossidasi, citocromo-C ossidasi, solfito ossidasi, NADH ossidasi, uricasi, perossidasi, catalasi, diaforasi, glucosio deidrogenasi, fruttosio deidrogenasi, glicerolo deidrogenasi, alcool deidrogenasi, colesterolo deidrogenasi, gluconato deidrogenasi, aldeide deidrogenasi, formaldeide deidrogenasi, formato deidrogenasi, L-lattato deidrogenasi, D-lattato deidrogenasi, L-malato deidrogenasi, D-malato deidrogenasi, isocitrato deidrogenasi, succinato deidrogenasi, L-glutamato deidrogenasi, L-alanina deidrogenasi, glucosio-6-fosfato deidrogenasi, piruvato deidrogenasi, β-idrossibut irato deidrogenasi, acil-CoA deidrogenasi, trimetilamina deidrogenasi, nitrato reduttasi, colesterolo esterasi, colina esterasi, lipasi, fosfolipasi, fosfatasi alcalina, fosfatasi acida, saccarosio fosforilasi, invertasi, β-galattossidasi, maltasi, amilasi, mutarorasi, ureasi, ossalacetato decarbossilasi, creatinasi, creatininasi, transferasi, aconitasi, citrato basi, esochinasi, glucochinasi, glicerolo chinasi, acetato chinasi, piruvato chinasi, creatina chinasi, miochinasi, urea chinasi.

Se viene usato come elemento del riconoscimento biologico un antigene, s’intende una proteina, una glicoproteina, una lipoproteina, delle pareti cellulari e i suoi frammenti, un virus e i suoi frammenti. Se viene usato come elemento del riconoscimento biologico un coniugato, s’intende un coniugato di un enzima con un anticorpo o con un antigene. Se viene come elemento del riconoscimento biologico usato un acido nucleico, s’intendono le varie forme e frammenti di DNA e RNA.

Dette nanoparticelle dei metalli nobili sono preparate da oro, argento, platino, palladio, rodio, rutenio, iridio e le loro leghe. Dette nanoparticelle possono essere di varia forma, per esempio di forma sferica, cubica, a corno, tubulare, a fibra. Almeno una loro dimensione dovrebbe cadere nell’ intervallo tra 1 e 100 nm. Le nanoparticelle preferite sono quelle di oro, di platino o di palladio con la forma sferica di diametro da 1 a 30 nm. La concentrazione delle nanoparticelle dei metalli nobili in dispersione acquosa è compresa tra 0.01 e 50.00 g/I, solitamente tra 0.05 e 5.00 g/1.

Detto polisaccaride acido può essere un polisaccaride naturale o modificato. Di solito viene scelto dal gruppo di polisaccaridi acidi di origine vegetale, animale o microbica tra cui alginato, pectato, carragenano, gomma arabica, acido ialuronico, condroilina solfato, eparina, succinoglicano, xantano. Il peso molecolare dei detti polisaccaridi acidi è compreso nell’intervallo fra 3 a 3,000 kDa. Detti polisaccaridi come aiginato pectalo, xantano o succinoglicano a peso molecolare relativamente basso fra 10 e 200 kDa vengono scelti con certa preferenza a causa della loro ridotta viscosità nell’acqua. Tra loro lo xantano e il succinoglicano prodotti a condizioni specifiche da opportuni ceppi microbici mediante un processo di fermentazione su substrato solido, conosciuto per la produzione di polisaccaridi che non portano ad un significativo aumento della viscosità di soluzioni acquose.

Per polisaccaride naturale modificato che viene usato si intende un polisaccaride modificato mediante un procedimento fìsico, chimico o biochimico. Le modifiche più interessanti sono la riduzione del peso molecolare e l’aumento del numero di gruppi di acidi liberi nella struttura del polimero. La concentrazione del detto polisaccaride in dispersione di nanoparticelle di metalli nobili è da 0.01 a 100.00 g/1, tipicamente da 0.10 a 10.00 g/1.

Detti cofattori biologici sono stati scelti nel gruppo costituito dalla forma ridotta ed ossidata di NAD, forma ridotta ed ossidata di NADP, PQQ, FAD, FMN, ATP, ADP, AMP, c-AMP, creatina fosfato, fosfoenolpiruvato, glìcerolo-3-fosfato.

Detto mediatore elettrochimico è uno dei mediatori naturali e sintetici generalmente usati per la preparazione dei biosensori; è preferibilmente scelto dal gruppo costituito da citocromi, chinoni, amminofenoli, composti aromatici accettori di elettroni (per esempio tetratiafulvalene, N-metilfenazina), composti aromatici donatori di elettroni (tetraciano-p-ehinodimetano), coloranti organici, metallocenì, complessi organometallici di osmio, rutenio e vanadio, complessi inorganici di ferro. Preferibilmente, detto mediatore elettrochimico appartiene al gruppo di esacianoferrato (II), esaciano ferrato (III), ferracene con i suoi derivati, blu di toluidina, Meldola blu, tionina, fenazina metosolfato, blu di metilene e rosso neutro.

Dette sostanze miglioranti la fluidità di soluzioni/dispersioni acquose sono sostanze che influiscono sulla viscosità, sulla densità oppure sulla tensione superficiale delle soluzioni/dispersioni acquose e vengono preferibilmente scelte nel gruppo costituito da detergenti e da solventi organici. Come detergente può essere considerato ogni composto naturale o sintetico avente proprietà detersive, preferibilmente appartenente al gruppo di detergenti biologicamente compatibili neutri, per esempio Triton® X-100, Tween®, Tergitol®, Brij®, Span ®, polietilene glicol, polietilene ossido, polipropilene ossido), di detergenti anionici (per esempio sodio dodecile solfato, colato, taurocolato, deossicolato, fosfolipidi) e di detergenti catiotiici (per esempio cetiltrimetil-ammonio-bromuro) con la loro concentrazione compresa tra 10 mg/l e 10 g/1.

Detto solvente organico si intende ogni solvente organico miscibile con acqua e le loro miscele, con la preferenza per gli alcoli a basso peso molecolare (metanolo, etanolo, propanolo, butanolo, isoamilalcol), etilene glicol, propilene glicol, acetone, etilmetilchetone, dimctilformamide, tetraidrofurano, dimetilsulfosside.

Detti componenti conosciuti per la loro capacità di migliorare le prestazioni di elementi del riconoscimento biologico sono gli additivi a basso peso molecolare come sali inorganici, attivatori di enzimi, zuccheri e polioli. Preferibilmente si scelgono nel gruppo consistente da fosfato di sodio, fosfato di potassio, borato di sodio, borato di potassio, carbonato di sodio, carbonato di potassio, sali di ammonio, sali di magnesio, acetato, tartrato, succinato, citrato, gliossalato, ditiotreitol, trealosio, saccarosio, glicerolo, sorbitolo.

Detto elettrodo elettrochimico è qualsiasi elettrodo elettrochimico da lavoro capace di convertire il segnale biochimico in un quantificabile segnale elettrico. Può avere svariate forme bi- e tridimensionali di varie dimensioni. Comunque, la forma preferita è quella planare.

elettrodo elettrochimico è preferibilmente un eletrodo metallico preparato l da un materiale elettroconducibile (oro, platino, palladio, argento) oppure un elettrodo di carbonio oppure un elettrodo di grafite.

Detta deposizione della miscela finale (nanoparticelle di metalli nobili, componenti del riconoscimento biologico e polisaccaride acido solubile in acqua) sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico è eseguita manualmente oppure utilizzando varie tecniche di deposizione conosciute in stato dell’arte con la particolare attenzione alla tecnica per spostamento positivo, tecniche litografiche, stampa ink-jet, stampa spray, stampa micro-contact, spin-coating.

Detta essiccazione della miscela finale (le nanoparticelle dei metalli nobili, i componenti del riconoscimento biologico ed il polisaccaride acido solubile in acqua) applicata sulla superfìcie dell’elettrodo elettrochimico viene eseguita con metodi e tecniche descritte in precedenza, preferibilmente con essiccazione all'aria aperta, essiccazione forzata, essiccazione sottovuoto o a bassa pressione, essiccazione in atmosfera modificata (sotto azoto), o per liofilizzazione.

Detto trattamento dello strato ottenuto con reagenti chimici può migliorare la sua robustezza, il che aumenta la permeabilità dello strato durante la misura e migliora anche la stabilità del biosensore. Viene eseguito impiegando i componenti con capacità conosciute in precedenza, come agenti di cross-linking che rafforzano covalentemente la struttura dei elementi del riconoscimento biologico; sali dei cationi mono- o bivalenti che irrobustiscono la struttura dei polisaccaridi acidi. Gli agenti di cross-linking preferiti sono scelti nel gruppo costituito da: glutaraldeide, carboimidi (p.e. N-idrossisuccinimide), 2-iminotioiano. I sali solitamente usati sono quelli inorganici di calcio o di magnesio (per esempio cloruro di calcio, solfato di magnesio). In caso di carragenano sono preferiti i sali di potassio (per esempio cloruro, bromuro, nitrato, solfato).

In una parte di questa invenzione è preparata la dispersione acquosa delle nanoparticelle dei metalli nobili con la sua successiva stabilizzazione per aggiunta di un polisaccaride acido solubile in acqua. Detta dispersione è preparata mediante la riduzione chimica di appropriati composti di metalli nobili con agenti riducenti. Composti di metalli nobili sono scelti dal gruppo costituito da: esacloroplatinato(lV), acido cloroplatinico(IV) csaidrato, nitrato di platino(IV), acido esaidrossiplatinico(IV), esaidrossiplatinato(lV) di etilammonio, nitrato di tetramminoplatino(II), palladio(ll) 2,4, pentadionato, dicloruro di palladio(Il), nitrato di palladio(ll) idrato, solfato di palladio(II) idrato, acido tetracloroaurico(III), cloruro di rutenio(Ill) triidrato, ossalato di rutenio(lll) idrato, cloruro di rodio(IIi) idrato, nitrato di rodio(III) idrato, cloruro di iridio(III), nitrato di argento(I), acetato di argento(I),

Detti agenti riducenti sono quelli preferibilmente scelti nel gruppo costituito da: citrato, zuccheri riducenti (p.e. glucosio, fruttosio, lattosio), sodio boroidruro, idrossilammina, idrazina. etanolo, metanolo, etilene glicol, dimetilformamide. 1 residui dei reagenti ed i prodotti intermedi della reazione si possono eliminare dopo raggiunta di un polisaccaride acido solubile in acqua, il quale stabilizza la dispersione di nanoparticelle con doppio effetto: elettrostatico e sterico. Questa eliminazione serve per la purificazione della dispersione e per evitare i possibili effetti negativi dei reagenti e dei prodotti intermedi della reazione sulla funzionalità e stabilità di elementi del riconoscimento biologico. 1 metodi preferibili di purificazione della dispersione delle nanoparticelle dei metalli nobili sono dialisi, ultrafiltrazione e centrifugazione. Se si ritiene opportuno per il passaggio successivo, la dispersione di nanoparticelle di metalli nobili può essere sottoposta alla concentrazione, che potrebbe avvenire per evaporazione d’acqua (per esempio evaporazione a pressione ridotta), osmosi inversa, centrifugazione e dialisi contro polietilene glicol ad alto peso molecolare. A questo punto la dispersione nanoparticelle dei metalli nobili è pronta per

riconoscimento bio

In un’altra parte di questa invenzione i polisaccaridi acidi solubili in acqua sono stati aggiunti prima della riduzione di detti composti di metalli nobili con detto agente riducente. In altre parole, la dispersione acquosa delle nanoparticelle dei metalli nobili è preparata in presenza del polisaccaride acido solubile in acqua. È possibile eseguire anche purificazione e prc-concentrazione della dispersione descritta sopra.

In un’altra parte ancora di questa invenzione il polisaccaride acido solubile in acqua è usato simultaneamente sia come agente riducente sia come stabilizzatore colloidale e quindi non è stato necessario aggiungere un altro agente riducente. La dispersione acquosa delle nanoparticelle dei metalli nobili è preparata dal detto composto del metallo nobile in presenza del polisaccaride acido solubile in acqua. In questo caso la purificazione non è sempre indispensabile.

I biosensori secondo la presente invenzione dimostrano un’alta sensibilità, una lunga stabilità e possono essere vantaggiosamente utilizzati nella diagnostica umana e quella veterinaria, nel monitoraggio dei processi industriali, nel controllo della qualità degli alimenti a delle bevande, in biotecnologia, nell'industria farmaceutica, nel monitoraggio dell’ambiente, ecc. La procedura per il rilevamento e la quantificazione degli analiti presenti nei campioni sotto forma di soluzione o sospensione impiegando i biosensori di questa invenzione è stata selezionata tra le procedure elettrochimiche note nello stato dell’arte (per esempio potenziometria, amperometria, condurti metria, coulometria), con la preferenza per l’amperometria.

Detta procedura amperometrica include l’applicazione del potenziale adeguato, contatto del biosensore secondo la presente invenzione con detto campione (soluzione, sospensione) contenente un’analita d<’>interesse e infine misurazione dei cambiamenti della corrente, i quali sono proporzionali alla concentrazione dell’analita.

In seguito sono riportati alcuni esempi a scopo illustrativo ma non limitativo.

Esempio 1

II polisaccaride xantano di bassa viscosità è stato ottenuto mediante una fermentazione batterica utilizzando il ceppo Xanlhomonas campestre DSM 1706 (Collezione DSMZ di microorganismi, Braunschweig, Germania). È stato preparato il terreno di base con la seguente composizione [g/l]: saccarosio 75.0; glutammato di sodio 4.0; estratto di lievito 0.5; KH2P041.0; K2HP041.0; MgS04.7H,0 0.2; CaCI2.2H20 0.04; FeCI3.ÓH20 0.003 MnCI2.4H20 0.001 ; Na2Mo04.2H20 0.0001 ; ZnS04.4FI20 0.0001 ; CuS04.4H20 0.0001; H3B030.0001 ; CoCI;0.0001. 40 g di trebbia di malto secca sono stati posti in beuta Erlenmayer da 1 litro e sono stati quindi impregnati con 120 mi del terreno di base. 11 substrato solido così ottenuto è stato sterilizzato in autoclave a temperatura di 121 °C, per 15 minuti, ed inoculato con 5 mi di pre-coltura. La fermentazione è stata condotta alla temperatura di 30°C in atmosfera umidificata, per 6 giorni. Al termine della coltivazione, il xantano prodotto è stato estratto dalla massa di fermentazione con 7 volumi d’acqua deionizzata sotto agitazione (250 rpm), per 2 ore. Il liquido di estrazione è stato separato dalle particelle di substrato più grosse per filtrazione tramite tessuto nylon, e da quelle più fini per centrifugazione a 25,000xg per 20 minuti. Successivamente, lo xantano è stato precipitato dal surnatante mediante faggiunta di 2 volumi di acetone freddo. Il precipitato crudo di xantano è stalo quindi sciolto nella soluzione di cloruro di potassio (20g/l), di nuovo precipitato con 2 volumi di acetone freddo e è stato infine essiccato in stufa a 70°C. Con la procedura sopra riportata è stala ottenuta una resa di xantano puro di bassa viscosità pari a 5.5 g idoneo per le dispersioni delle nanoparticelle dei metalli nobili.

Esempio

di bassa iscosità, è stato ottenuto mediante fermentazione batterica utilizzando il ceppo Agrobacterium tumefaciens IO 95-748 (Collezione DSMZ di microorganismi, Braunschweig, Germania). È stato preparato il terreno di base con la seguente composizione [g/1]: mannitolo 50.0; glutammato di sodio 1.5; estrato di lievito 0.2; KH2P040,2; K2HP040.1; MgS04.7H20 0.2; CaCL.2H20 0.04; FeCI,.6H,0 0.003; MnCL.4H20 0.001; Na2Mo04.2H20 0.0001; ZnS04.41L0 0.0001 ; CuS04.4H20 0.0001; H,B<3⁄4 0.0001; CoCl20.0001. 40 g di trebbia di malto secca sono stati posti in beuta Erlenmayer da I litro e sono stati quindi impregnati con 120 mi del terreno di coltura. Il substrato solido così ottenuto è stato sterilizzato in autoclave a temperatura di 121°C, per 15 minuti, ed inoculato con 5 mi di pre-coltura. La fermentazione è stata condotta alla temperatura di 30°C in atmosfera umidificata, per 4 giorni. Al termine della coltivazione, il succinoglicano prodotto è stato estratto dalla massa di fermentazione con 7 volumi d'acqua deionizzata sotto agitazione (250 rpm), per 2 ore. Il liquido di estrazione è stato separato dalle particelle di substrato più grosse per filtrazione tramite tessuto nylon, e da quelle più fini per centrifugazione a 25,000xg per 20 minuti. Successivamente, il succinoglicano è stato precipitato dal sumatante mediante l’aggiunta di 3 volumi di etanolo freddo. Il precipitato crudo di succinoglicano è stato quindi sciolto nella soluzione di cloruro di potassio (5g/l), di nuovo precipitato con etanolo freddo ed è stato infine essiccato in stufa a 70°C. Con la procedura sopra riportata è stata ottenuta una resa in succinoglicano puro di bassa viscosità pari a 3.8 g idoneo per le dispersioni delle nanoparticelle dei metalli nobili.

Esempio 3

3 g dell’acido alginico dall’alga bruna (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. A 7003) sono stati sciolti in 100 mi della soluzione all’ 1% (p/p) di NaOH. Successivamente sono stati aggiunti 3 mi dell’acido acetico glaciale e la miscela è stata portata alla temperatura di 90°C nel bagno termostatico, quindi mantenendo questa temperatura per 1 ora è stata eseguita l’idrolisi. La viscosità della soluzione prima e dopo l’aggiunta dell’acido acetico glaciale è notevolmente diminuita dal 7,550 cP (25°C) iniziali al 540 cP (25°C). 11 risultante alginato è stato quindi precipitato con l’aggiunta di 4 volumi di isopropanolo freddo ed essiccato in stufa a 70°C. Con la procedura sopra riportata è stata ottenuta una resa in alginato di bassa viscosità pari a 2.63 g idoneo per le dispersioni delle nanoparticelle dei metalli nobili.

Esempio 4

2.5 g di pectina di mela, ossia di metilestere dell’acido D-poligalatturonico, (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. P 8471 ) sono stati sciolti in 100 mi dell’acqua deionizzata calda. Quando la soluzione è stata portata a 40°C, sono stati quindi aggiunti 200 Unità di pectina esterasi (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. P 0764) e la soluzione è stata lasciata sotto lenta agitazione per 2 ore fino a completa deesterificazione delia pectina. La miscela reattiva è stata poi portata ad ebollizione per provocare la precipitazione della proteina enzimatica seguita dalla sua eliminazione per centrifugazione a 6,000 g, per 20 minuti. 11 pectato solido (2.1 1 g) è stato ottenuto per liofilizzazione della miscela reattiva chiarificata. Il pectato così preparato ha il numero di gruppi earbossilici liberi sostanzialmente più elevato, il che avvantaggia la stabilizzazione di colloidi delle nanoparticelle dei metalli nobili.

Esem pio 5

Le nanoparticelle d’oro colloidale sono state preparate con l’aggiunta di 7 mi di citrato di sodio (10 g/1) a 100 mi della soluzione bollente dell’acido tetracloroaurico (0. 1 g/1). La soluzione colloidale d’oro è stata raffreddata e in seguito sono stati aggiunti e lasciati dissolvere 20 mg di succinoglicano (preparato come riportato nell’esempio 2). La miscela finale è stata trasferita in un tubo da dialisi (cut off di 2.000 Da, Stigma, St. Louis USA, Cat.' No. D 2272) è lasciata dializzare per 72 ore contro l’acqua deionizzata fino all’eliminazione del citrato e degli altri prodotti intermedi della reazione a basso peso molecolare. Successivamente la dispersione pura di nanoparticelle d’oro nella soluzione di succinoglicano è stata concentrata 20 volte con un evaporatore sottovuoto. 50 pi della dispersione sono stati mescolati con 5 pi della soluzione di lattato ossidasi (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. L 0638) al 5% (v/v). 3 pi della dispersione finale sono stati applicati sulla superficie dell’elettrodo di carbonio vetroso (diametro di 2 mm) e lasciati asciugare a temperatura ambiente per 30 minuti. Sopra questo strato biocatalitico è stato quindi applicato 1 pi della soluzione di glutaraldeide (0.1 g/1) e lasciato asciugare a temperatura ambiente, per 30 minuti. Il biosensore così ottenuto è stato immerso in 10 mi di 0. 1 M tampone fosfato (pH 6.5) contenente 3 mM di ferricianuro, il mediatore elettrochimico. Dopo raggiunta della 0.1 M soluzione di acido lattico, è stata misurata la corrente in modo cronoamperomelrico (applicando un potenziale costante di 300mV contro l’elettrodo di riferimento al calomelano). Il biosensore ha esibito una eccellente sensibilità (4,48 μΑ/mM), Dopo 9 mesi di immagazzinamento allo stato secco a temperatura ambiente il biosensore ha preservato il 93% della sua sensibilità iniziale. Invece il biosensore dì controllo (senza nanoparticelle d’oro) con la sensibilità iniziale di 0.81 pA/mM, dopo lo stesso periodo d’ immagazzinamento ha esibito solamente il 27% della sua sensibilità iniziale.

Esempio 6

Le nanoparticelle colloidali di palladio sono state preparate mediante la riduzione di ioni metallici con etanolo. A 50 mi della soluzione calda (80°C, pH 8.0) di cloruro di palladio (0.4 g/I) posti in una bottiglia con tre colli sono stati aggiunti 50 mi di etanolo. La soluzione è stata mantenuta sotto agitazione impiegando frattanto la tecnica dì refluo a 80°C, per 15 min nel bagno termostatico fino alla formazione di nanoparticelle. Nella soluzione colloidale di palladio sono stati successivamente versati 5 mi della 1% (p/p) soluzione di alginato a bassa viscosità (come descritto nell 'Esempio 3). La miscela ottenuta è stata immediatamente concentrata 10 volte eliminando etanolo per evaporazione sottovuoto. 30 pi di questa dispersione sono stati poi mescolati con 30 pi della soluzione contenente [g/1]: sorbitolo 20.0; coenz.ima NAD 4.0; malato deidrogenasi 10.0 (Sigma, St. Luis, USA, cat. No. M7032) e diaforasi 30.0 (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. D 5540). Sulla superficie di un elettrodo planare d’oro (diametro di 1 ,6 mm, preparato con la tecnica di deposizione per vaporizzazione chimica) sono stati applicati 2 pi della dispersione finale e lasciati asciugare a temperatura ambiente, per 30 min. Sopra questo strato biocatalitìco è stato applicato 1 pi di cloruro di calcio (0.5 g/1) e lasciato asciugare a temperatura ambiente, per 30 min. 11 bìosensore ottenuto è stato immerso in 10 mi di 0.1 M tampone Tris (pH 9.0) contenente 1 uiM di tionina, il mediatore elettrochimico. I cambiamenti della corrente proporzionali alle aggiunte della soluzione standard di acido malico 0.1 M sono stati misurati in modo cronoamperometrico (applicando un potenziale costante di -50mV contro l’elettrodo di riferimento al calomelano). Il biosensore ha esibito una eccellente sensibilità (3.52 pAhnM). Dopo 12 mesi di immagazzinamento allo stato secco ha preservato il 95% della sua sensibilità iniziale. Invece il biosensore di controllo (senza le nanoparticelle di palladio) con la sensibilità iniziale di 0.53 μΑ/mM, dopo lo stesso periodo d’immagazzinamento ha esibito solamente il 34% della sua sensibilità iniziale.

Esempio 7

Le nanoparticelle colloidali di platino sono state preparate mediante una riduzione con idrazina in soluzione di un polisaccaride acido che ha funto da agente stabilizzante. 150 mg di esacIoroplatinato(IV) e 250 mg di xantano (ottenuto come descritto nell’Esempio 1) sono stati sciolti in 100 mi d’acqua deionizzata. In seguito sono stati aggiunti goccia a goccia sotto agitazione 10 mi di soluzione di idrazina all’ 11% (p/p) e la miscela finale è stata portata all’ebollizione, mantenuta così per 20 min fino alla formazione di nanoparticclle. Dopo averla raffreddata, le nanoparticelle di platino sono state concentrate per ultracentrifugazione a 20,000 g, per 15 minuti fino ad ottenere il volume di 10 mi, che è stato in seguito diluito in 90 mi d’acqua deionizzata. Ripetendo la concentrazione per ultracentrifugazione si ottengono 10 mi di dispersione di nanoparticelle di platino purificata e stabilizzata con lo xantano a bassa viscosità. 20 μΐ della dispersione sono stati mescolati con 40 μΐ della soluzione contenente [g/l]: trealosio 10.0; coenzima ATP 2.0; DL-ditiotreitolo 2.0; esochinasi 5.0 (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. H 4502); glucosio-6-fosfato deidrogenasi 5.0 (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. G 5885); glucosio-fosfato isomerasi 7.5 (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. M 7032); diaforasi 20.0 (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. D 5540). Sulla superficie di un elettrodo planare di grafite (diametro di 1.6 mm, preparato con la tecnica di screen-printing utilizzando un inchiostro da stampa a base di carbonio; Gwent Electronic Materials, Ltd., UK, Cat. No. C2000802D2) sono stati applicati 2 μΙ della dispersione finale e lasciati asciugare a temperatura ambiente, per 30 min. Il biosensore cosi ottenuto è stato immerso in 10 mi di 0. I M tampone fosfato (pii 7.0) contenente 1 tnM tionina, il mediatore elettrochimico. I cambiamenti della corrente proporzionali alle aggiunte della soluzione 0.1 M di zuccheri riducenti (glucosio e fruttosio in rapporto 1 : 1) sono stati misurati in modo cronoamperometrico (applicando un potenziale costante di -50mV contro l’elettrodo di riferimento al calomelano). Il biosensore ha esibito una eccellente sensibilità (2.93 μΑ/mM). Dopo 9 mesi di immagazzinamento allo stato secco ha preservato il 87% della sua sensibilità iniziale. Invece il biosensore di controllo (senza le nanoparticelle di platino) con la sensibilità iniziale di 0.48 μΑ/mM, dopo lo stesso periodo d’immagazzinamento ha esibito solamente il 23% della sua sensibilità iniziale.

Esempio 8

Le nanoparticelle colloidali d’oro sono state preparate direttamente nella soluzione di un polisaccaride acido che ha funto sia da agente riducente sia da quello stabilizzante. 10 mi di soluzione dell’acido tetracloroaurico (8.0 gd) sono stati mescolati con 100 mi della soluzione di pectato (5.0 g'I; ottenuto come descritto nell’Esempio 4) e portati alla temperatura di 90°C e lasciati per 30 minuti sotto agitazione fino alla formazione di nanoparticelle d’oro. 50 μΐ della soluzione colloidale d’oro raffreddata sono stati mescolati con 5 μΐ della 2% (p/p) soluzione standard di perossidasi (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. P 8415). Sulla superficie di un elettrodo planare d’oro (diametro di 1.6 mm, preparato per placcatura galvanica dì oro) sono stati applicati 2μ1 della dispersione finale e lasciati asciugare a temperatura ambiente, per 30 min. Sopra questo strato biocatalitico sono stali poi applicati 2 μΙ di glucosio ossidasi all’ 1% (Sigma, St. Louis, USA, Cat. No. G 6641) con glutaraldeide (0.1 g/l) e lasciati asciugare a temperatura ambiente, per 30 min. il biosensore così ottenuto è stato immerso in 10 mi di 0. 1 M tampone fosfato (pH 6.0) senza alcun mediatore elettrochimico per via de! diretto trasporto di elettroni della perossidasi immobilizzata sulle nanoparticelle d’oro in presenza di perossido di idrogeno prodotto durante la reazione della glucosio ossidasi con glucosio e ossigeno. I cambiamenti della corrente sono stati misurati dopo ogni aggiunta della soluzione 0.1 M di glucosio in modo cronoamperometrico (applicando un potenziale costante di -lOOmV contro l’elettrodo di riferimento al calomelano). Il biosensore ha esibito una eccellente sensibilità (1 .97 μΑ/mM). Dopo 6 mesi di immagazzinamento allo stato secco il biosensore ha preservato il 98% della sua sensibilità iniziale. Dall’altra parte, il biosensore di controllo (senza le nanoparticelle d’oro) non ha funzionato affatto con applicato soprannom potenziale per via della mancanza del trasporto diretto di elettroni

Claims

RIVENDICAZIONI I .
Il metodo della prepara i seguenti passaggi: a) preparazione di una di delle dei metalli nobili, che viene simultaneamente o successivamente stabilizzata con aggiunta di un polisaccaride acido solubile in acqua, naturale o modificato, preferibilmente scelto dal gruppo costituito da: pectato, alginato, carragenano, fucogalattano, fucoidano, gomma arabica, agar, gomma di tragacanth, gomma di karaya, acido ialuronico, condroitina solfato, eparina, xantano, succinoglicano, welano, gellano con il suo peso molecolare compreso tra 3 e 3,000 kDaltons b) aggiunta alla dispersione di almeno un elemento del riconoscimento biologico c) aggiunta facoltativa di cofattori biologici, mediatori elettrochimici, sostanze miglioranti la fluidità della dispersione acquosa, attivatori a basso peso molecolare e stabilizzatori dei componenti biologici d) deposizione della miscela finale sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico e) essiccazione della miscela finale applicata sulla superficie dell’elettrodo elettrochimico f) trattamento facoltativo delio strato ottenuto con degli agenti di cross-linking e con dei sali dei cationi mono- e bivalenti 2. 11 metodo secondo la rivendicazione 1. caratterizzato dal fatto che detto polisaccaride acido è scelto dal gruppo costituito da: pectato, alginato, xantano, succinoglicano e il suo peso molecolare è compreso tra 10 e 300 kDalton.
3. Il metodo secondo le rivendicazioni 1 ,-2. caratterizzato dal fatto che dette nanoparticelle di metallo nobile sono scelte dal gruppo costituito da: nanoparticelle d’oro, platino, palladio, argento, rodio, rutenio, iridio, preferibilmente nanoparticelle d'oro, platino e palladio che hanno la forma sferica con il diametro tra 1 e 50 nm.
4. Il metodo secondo le rivendicazioni 1.-2. caratterizzato dal fatto che detto elemento del riconoscimento biologico è scelto dal gruppo costituito da: enzimi, strutture cellulari o subcellulari, anticorpi, antigeni, i loro coniugati, recettori, acidi nucleici.
5. Il metodo secondo le rivendicazioni 1.-2. caratterizzato dal fatto che detto mediatore elettrochimico è scelto dal gruppo costituito da: citocromi, chinoni, amminofenoli, composti aromatici accettori di elettroni (tetratiafulvalene, N-metilfenazinio), composti aromatici donatori di elettroni (tetraciano-p-chinodimetano), coloranti organici, metalloceni, complessi organometallici di osmio, rutenio e vanadio, complessi inorganici di ferro, preferibilmente esacianoferrato (li), esacianoferrato (III), ferrocene e suoi derivati, blu di toluidina, Meldola blu, tionina, fenazina metasolfato e rosso neutro.
6. Il metodo secondo le rivendicazioni 1.-2. caratterizzato dal fatto che dette sostanze miglioranti la fluidità sono scelte dal gruppo costituito da agenti regolatori di viscosità oppure di densità oppure di tensione superficiale, preferibilmente detergenti e solventi organici miscibili con acqua.
7. Il metodo secondo le rivendicazioni 1.-2. caratterizzato dal fatto che detto elettrodo elettrochimico è un elettrodo elettrochimico che è in grado di convertire il segnale biochimico in un quantificabile segnale elettrico, preferibilmente un elettrodo preparato dal materiale elettroconducibile scelto dal gruppo costituito da: oro, platino, palladio, argento, carbonio o grafite.
8. Un biosensore elettrochimico preparato secondo il metodo descritto nelle rivendicazioni 1.-7.
9. La procedura per la determinazione della concentrazione degli analiti nella diagnostica umana e veterinaria, nei processi industriali, nel controllo della qualità degli alimenti e delle bevande, in biotecnologia, nella industria farmaceutica, e ne! monitoraggio dell’ambiente, comprendente un contatto del biosensore descritto nella rivendicazne 8. con soluzioni oppure sospensioni dei detti analiti e misura proprietà elettrica proporzionali alla concentrazione dei detti analiti.
10. La procedura secondo la rivendicazione 9. caratterizzata da fatto che dette proprietà elettriche sono scelte dal gruppo costituito da: corrente, potenziale, conducibilità, carico, impedanza, preferibilmente la corrente misurata al potenziale costante.