ITTO20110559A1 - Procedimento di funzionalizzazione di un substrato per saggio biologico mediante polimerizzazione plasma-assistita in fase vapore, substrato funzionalizzato e dispositivo di saggio biologico cosi' ottenuti - Google Patents

Description

“Procedimento di funzionalizzazione di un substrato per saggio biologico mediante polimerizzazione plasmaassistita in fase vapore, substrato funzionalizzato e dispositivo di saggio biologico così ottenutiâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento di funzionalizzazione di un substrato per saggio biologico mediante polimerizzazione plasmaassistita, nonché un substrato funzionalizzato ed un dispositivo di saggio biologico, in particolare un dispositivo microarray, ottenibili mediante il procedimento dell’invenzione.

La polimerizzazione via plasma o plasmaassistita appartiene alla classe dei metodi di trattamento di superficie che hanno lo scopo di alterare le proprietà chimico-fisiche dei materiali polimerici senza influenzare le loro proprietà di bulk e quindi di attribuire alle superfici di materiali diversi, che possiedono caratteristiche meccaniche di bulk, proprietà allettanti per una gran quantità di applicazioni.

Secondo la tecnica nota, i supporti vetrosi, di silicio o polimerici comunemente usati per la realizzazione di dispositivi per saggio biologici, come ad esempio microarray per applicazioni diagnostiche, sono attivati in superficie con materiali che consentono il legame degli elementi di cattura (recettori), destinati a legare la molecola biologica che costituisce l’analita di interesse. Nei dispositivi microarray per l’esecuzione di saggi molecolari ad esempio per applicazioni diagnostiche, il substrato può ad esempio essere attivato in superficie con materiali, quali ad esempio Poli-L-lisina, che si limitano a promuovere l’ancoraggio chimicamente aspecifico e reversibile (fisisorbimento basato su interazioni deboli, elettrostatiche) delle sonde oligonucleotidiche; in alternativa, la superficie può essere attivata con polimeri o copolimeri, ottenuti mediante tecniche classiche di polimerizzazione in fase liquida, che consentono un’interazione chimicamente stabile (formazione di legami covalenti) tra le sonde da immobilizzare e la superficie, e che risultano già commercializzati su substrati vetrosi in kit specifici per la diagnostica microarray (ad esempio, e-Surf di Life Line Lab – LLL).

Quest’ultimo tipo di attivazione superficiale à ̈ nota per essere la più efficiente ed affidabile. Per un esperimento diagnostico di successo, deve infatti formarsi un legame irreversibile tra il biorecettore e la superficie, per permettere l’immobilizzazione del ligando sul recettore selettivo e la conservazione dell’interazione nel corso di tutti i passaggi in soluzione fino alla rivelazione finale, generalmente eseguita mediante spettroscopia di fluorescenza.

La presenza di gruppi funzionali dello stesso tipo (superfici omofunzionali) in alto numero (alta densità superficiale) costituisce un obiettivo cruciale da raggiungere con le note tecniche di funzionalizzazione per substrati microarray.

Rispetto a questo obiettivo, i processi di polimerizzazione plasma-assistita risultano particolarmente vantaggiosi per l’immobilizzazione di molecole biologiche, ad esempio sonde oligonucleotidiche, su superfici di dispositivi per saggi biologici, come ad esempio biochip o microarray o dispositivi di altro genere.

In generale, i processi di polimerizzazione plasma-assistita sono considerati interessanti trattamenti di superficie perché il loro effetto à ̈ limitato solo ai primi strati superficiali senza nessuna dipendenza dalla chimica del substrato. Grazie ai notevoli vantaggi offerti da questa tecnica, le modificazioni di superficie via plasma hanno ottenuto una grande popolarità per esempio in campo tessile, nel settore dei biomateriali, in ottica ed elettronica.

Il processo di polimerizzazione plasmaassistita, essendo una procedura a singolo stadio e avvenendo in fase vapore e in condizioni di bassa pressione (sotto vuoto) offre, rispetto alla tecnica di polimerizzazione in fase liquida sopra citata, il vantaggio di ridurre drasticamente la quantità di reagenti utilizzati (basso impatto ambientale) non prevedendo immersione in bagni in cui i precursori di polimerizzazione dovrebbero essere presenti in grande eccesso, nonché di evitare contaminazioni da agenti esterni indesiderati, il che determina un incremento della riproducibilità del processo e l’esaltazione delle prestazioni del dispositivo. Questi processi operano inoltre con un solo tipo di reagente, a differenza di quanto avviene nella formulazione complessa iniziale tipica delle reazioni classiche di copolimerizzazione. Un ulteriore vantaggio consiste nella possibilità di fornire superfici caratterizzate da diverse densità di gruppi funzionali dello stesso tipo, mediante piccole variazioni dei parametri di processo, senza quindi dover modificare drasticamente la formulazione della miscela di reagenti di partenza. Inoltre, semplicemente cambiando la natura del precursore, si può cambiare il tipo di gruppo funzionale da esporre alla superficie del dispositivo. Ad esempio, substrati funzionalizzati con film sottili polimerici esponenti alla superficie dei gruppi carbossilici sono idonei all’impiego per l’immobilizzazione di sonde di acido nucleico e per la produzione di microarray per applicazioni in campo diagnostico, genomico e proteomico.

La domanda di brevetto europea EP 1 612 557 A2 descrive un procedimento di polimerizzazione plasma-assistita di molecole organiche per la funzionalizzazione di superfici di supporti per l’esecuzione di saggi biologici, quali ad esempio saggi immunologici di tipo enzimatico. Negli esempi di EP 1 612 557 A2 à ̈ descritta la deposizione di allil alcool, acido acrilico, alchilammina e otta-1,7-diene su un foglio di alluminio, mediante polimerizzazione via plasma in modalità continua applicando una potenza di 5W, ad una pressione di circa 1,5 x 10<-1>mbar, una velocità di flusso del monomero di circa 1,5cm<3>

(stp)/min e per un tempo di deposizione di circa 15 minuti. La deposizione viene effettuata su piastre multi-pozzetto allo scopo di aumentare la stabilità di interazione con la superficie delle specie biologiche coinvolte nel saggio immunologico.

Per la realizzazione di dispositivi di saggio da impiegare in campo diagnostico sarebbe estremamente desiderabile disporre di un procedimento di polimerizzazione plasma-assistita estremamente versatile, che consenta la regolazione delle principali proprietà del rivestimento polimerico depositato, in particolare lo spessore, l’idrofilia/idrofobia, la densità di gruppi funzionali e la stabilità, e che renda quindi possibile ottenere un rivestimento polimerico sempre ottimale in funzione della specifica applicazione diagnostica prevista.

Questi ed altri scopi sono raggiunti tramite il procedimento di funzionalizzazione di un substrato per saggio biologico come definito nelle annesse rivendicazioni.

Nella portata dell’invenzione sono altresì inclusi un substrato e un dispositivo come definiti nelle annesse rivendicazioni.

Le rivendicazioni costituiscono parte integrale della presente descrizione.

Grazie alla versatilità del procedimento oggetto dell’invenzione, le prestazioni dei dispostivi di saggio biologico ottenuti risultano nettamente superiori rispetto a quelle dei dispostivi noti, dal momento che diventa possibile modulare le caratteristiche chimiche e fisiche della superficie in funzione della specifica applicazione diagnostica prevista.

Secondo una forma di realizzazione preferita del procedimento secondo l’invenzione, il monomero precursore di un poli acido carbossilico à ̈ l’acido acrilico (CH2=CHCOOH), che attraverso un processo di polimerizzazione plasma-assistita, realizzato preferibilmente a pressione ridotta e in condizioni di bassa potenza di radiofrequenza di input, viene convertito in un rivestimento sottile di poli-acido acrilico esponente in superficie dei gruppi carbossilici (-COOH) che sono in grado di legare covalentemente i gruppi amminici (-NH2) delle biomolecole.

Preferibilmente, il monomero di acido acrilico à ̈ trasportato in fase vapore e miscelato ad un gas carrier (preferibilmente argon o elio, più preferibilmente argon) nella camera di processo dove viene attivato via plasma per la reazione di polimerizzazione. I vapori organici, miscelati al gas, forniscono infatti i radicali attivi provenienti dalla frammentazione delle molecole per effetto delle collisioni anelastiche con gli elettroni energetici presenti nel plasma. I frammenti molecolari metastabili, ottenuti per attivazione delle molecole di acido acrilico da parte del plasma, bombardano la superficie del substrato, portando alla rottura dei legami di superficie, all’attacco (etching) del substrato stesso e alla conseguente reazione chimica tra i siti attivi in superficie e le specie reattive di monomero contenute nella miscela di plasma.

La dissociazione del materiale iniziale e la riorganizzazione dei frammenti molecolari a livello della superficie, secondo un meccanismo di propagazione di catena, permettono l’ottenimento di un rivestimento (coating) funzionale usato per la modifica superficiale del substrato. In dipendenza del tempo di attivazione del plasma in presenza del precursore e del gas di trasporto, può essere regolato lo spessore del rivestimento depositato.

Le sperimentazioni condotte dai presenti inventori, che sono illustrate in dettaglio nella sezione sperimentale della presente descrizione, dimostrano che variando la potenza applicata e impulsando la scarica di plasma, quindi variando la frequenza di impulso e il ciclo di lavoro (duty cycle), à ̈ possibile conseguire un notevole controllo dei parametri del processo plasma, a differenza dei processi eseguiti in modalità di scarica continua, il che consente di regolare finemente le proprietà del rivestimento ottenuto.

Attraverso varie tecniche di caratterizzazione, ossia analisi dell’angolo di contatto (OCA), spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier in modalità di riflessione totale attenuata (FTIR/ATR), spettroscopia a fotoelettroni indotta da raggi X (XPS) e titolazione colorimetrica, i presenti inventori hanno identificato un procedimento di polimerizzazione plasma-assistita che permette l’ottenimento di un rivestimento ottimale per l’implementazione in biochip per diagnostica microarray.

Il procedimento dell’invenzione risolve inoltre il problema di fornire un rivestimento di poliacido carbossilico il più stabile possibile ed esponente in superficie un numero gruppi carbossilici funzionali per un’altra efficienza di legame dei gruppi amminici degli oligonucleotidi senza la necessità di ulteriori attivazioni (ad esempio à ̈ noto l’uso dei reagenti N-idrossisuccinimmide- NHS e 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimmide) ma al contempo non eccessivamente idrofilico onde evitare una diluizione del numero di sonde per unità di superficie legate. Il passaggio di immersione in acqua deionizzata che rimuove le catene instabili e solubili di polimero che si formano alla superficie al termine del processo di polimerizzazione, permette inoltre l’ottenimento di caratteristiche ottimali di stabilità e idrofilia.

Come sarà mostrato nella parte sperimentale che segue, il rivestimento ottenuto con il procedimento dell’invenzione à ̈ particolarmente idoneo per la funzionalizzazione di chip microarray biodiagnostici, che nell’esempio sperimentale fornito à ̈ stato impiegato per la rivelazione di infezioni da enterobatteri o altri batteri responsabili di affezioni gastroenteriche. L’esperimento descritto si riferisce all’individuazione di monocitogeni di Listeria.

Le enteriti, infatti sono di solito causate da cibi e bevande contaminate da virus o batteri. I germi si fermano nell’intestino tenue causando infiammazioni e rigonfiamenti che posso portare a dolori addominali, crampi, diarrea, febbre e disidratazione. Le infezioni enteriche sono tra i disturbi medici più diffusi solo seconde alle infezioni del tratto respiratorio rendendo quindi cruciale lo sviluppo di strumenti diagnostici robusti e poco costosi per determinare le cause delle patologie.

La parte sperimentale che segue e le relative figure sono fornite a puro titolo di esempio illustrativo, senza alcun intento limitativo della portata dell’invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.

SEZIONE SPERIMENTALE

Materiali e protocolli biologici

Per lo studio degli effetti dei parametri di processo e per rispondere alle esigenze delle tecniche di caratterizzazione sono stati scelti come substrati di deposizione Silicio cristallino (CZ/1-0-0 dopato Boro, di tipo p), Polietilene ( GoodFellow PE-Bassa densità, 2 e 3 mm di spessore) e vetro (Danville corning).

Come monomero liquido à ̈ stato utilizzato acido acrilico anidro, purezza 99% (Sigma Aldrich).

Per gli esperimenti biodiagnostici, la deposizione del film à ̈ stata eseguita su substrati di UPVC (Unplasticised PolyvinylChloride, 0,5 mm di spessore) tagliati in rettangoli di 70x25 mm, compatibili con i supporti utilizzati negli spottatori manuali e automatici di tipo commerciale.

Il prodotto PCR dei monocitogeni di Listeria à ̈ stato ottenuto con una miscela per PCR (Polymerase Chain Reaction) composta da 5 µL di MasterMix 10X (BioAtlas), 2 µL di primer forward (5’-ACT ATC TAG TAA CAC GAT TAG TGA-3’, SEQ ID NO:1) di concentrazione 10 µM e 2 µL di primer reverse 5’ biotinilato (5’-CAA ATT TGT TAA AAT CCC AAG TGG-3’, SEQ ID NO:2). In seguito, 2 µL di DNA plasmidico stampo (ng/µL) e d-H2O sono stati aggiunti per ottenere un volume finale di 25 µL. I cicli termici per l’amplificazione sono stati programmati come segue: 15 min per la pre-denaturazione a 95°C, 20 s per la denaturazione a 95°C, 30 s per l’annealing e l’estensione a 63°C, e infine 5 min a 72°C per la post-estensione. I prodotti PCR sono stati caricati su un gel d’agarosio 3% in peso (Sigma Aldrich) colorato con Gel Red (Biotium), usando come marcatore un ladder di DNA di 100 bp (Fermentas, Gene Ruler) per la valutazione della dimensione degli ampliconi e per l’analisi semi-quantitativa con il software GelAnalyzer (http://www.gelanalyzer.com/).

Le sonde di DNA sono state “spottate†sull’array da CRIBI (Padova, IT), secondo lo schema descritto in Figura 4. Le sonde biotinilate sono state usate come controllo di riferimento per la rivelazione colorimetrica. La sequenza della sonda, CGC TTT CAG GTT TAA CTA GTC TAC AGC A (SEQ ID NO:3), à ̈ stata disegnata specificatamente per l’ibridazione di monocitogeni di Listeria, mentre la sonda di DNA con sequenza CTA CCG CTT CAG GCA AGT TAG ACC ACA G (SEQ ID NO:4) à ̈ stata usata come controllo negativo. Inoltre, una sonda biotinilata con sequenza arbitraria à ̈ stata usata come controllo positivo. Le sonde di DNA sono state spottate sui supporti di UPVC precedentemente funzionalizzati con poli acido acrilico e su substrati commerciali (DR. Chip Biotech Inc.) per confrontare i risultati.

Per la procedura di ibridazione tra le sonde immobilizzate e le sequenze target da rilevare, i prodotti della PCR (25µl) sono stati mescolati con un volume comparabile di tampone di ibridazione (50% formammide, 5X SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg/ml BSA), quindi denaturati a 95°C per 10 min in un termociclatore (Techne, TC-312) e infine messi in contatto con la superficie del biochip recante le sonde immobilizzate. Quindi il microarray à ̈ stato incubato per 2 ore a 62°C allo scopo di ottenere un’elevata efficienza di ibridazione. La rivelazione colorimetrica à ̈ basata sull’uso di un kit commerciale denominato Silver Quant (Eppendorf). La rivelazione si manifesta con la comparsa di spot grigio-neri (dovuti ad un precipitato di argento metallico) associati all’avvenuto bioriconoscimento.

Trattamenti plasma

La deposizione del rivestimento di polimero di acido acrilico à ̈ stata realizzata mediante polimerizzazione plasma-assistita a temperatura ambiente utilizzando un reattore del tipo PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition). La reazione à ̈ stata effettuata in una camera da vuoto, realizzata in acciaio inox a geometria cilindrica (diametro 320mm; altezza 200mm) corredata di una finestra d’ispezione laterale, collegata ad una pompa rotativa monostadio che permette l’ottenimento di un vuoto base di circa 23 mTorr. Gli elettrodi erano costituiti da due piatti paralleli di 15 cm di diametro, distanti 4 cm l’uno dall’altro.

La miscela gassosa costituita dal vapore di acido acrilico (monomero) e argon (gas inerte) à ̈ stata uniformemente distribuita nel reattore attraverso i fori (diametro 2mm) presenti nell’elettrodo superiore (elettrodo a doccia). Questo elettrodo era connesso esternamente, tramite un sistema semiautomatico per equilibrare l’impedenza del carico della potenza emessa, ad un generatore di radiofrequenze (R.F. = 13,56 MHz) che produce una differenza di potenziale con l’elettrodo inferiore messo a massa ed usato come supporto per i substrati di deposizione.

Il sistema includeva 4 linee per gas/vapori, di cui una connessa direttamente alla camera mentre le altre attraversavano ciascuna un contenitore cilindrico di acciaio inox (reservoir) in grado di ospitare il monomero liquido. Il reservoir contenete l’acido acrilico à ̈ stato mantenuto a temperatura ambiente.

Come gas di trasporto, à ̈ stato scelto l’argon. Quest’ultimo à ̈ stato fatto attraversare il reservoir contenente l’acido acrilico liquido, con un flusso di 20 sccm, e gorgogliare all’interno del liquido, trasportando all’esterno del contenitore il vapore del reagente. Il flusso di vapore calcolato senza l’uso del gas di trasporto era di 3 sccm. Il flusso della miscela in uscita à ̈ stato regolato tramite una valvola metrica manuale. Dei Mass Flow Controller (MFC) sono stati utilizzati per regolare il flusso dei gas di trasporto. Le linee erano corredate valvole di shut-off di tipo pneumatico per l’accesso dei gas in camera di processo. La pressione di base in presenza della miscela Ar/AAc era di 220 mTorr.

Il procedimento realizzato consisteva in tre fasi: (i) un passaggio di attivazione del substrato, consistente in un pretrattamento di etching con solo argon, allo scopo di attivare la superficie del substrato e aumentarne le proprietà di adesione per la successiva fase di deposizione; (ii) segue poi il passaggio di polimerizzazione vera e propria con acido acrilico; ed infine (iii) una fase di stabilizzazione del rivestimento mediante lavaggio in acqua deionizzata.

Il sistema impiegato dai presenti inventori e descritto sopra permette di lavorare in due modalità di scarica diverse: continua (Continous Wave, CW) o pulsata (Modulated Wave, MW).

Un generatore di funzioni, permette di ottenere un segnale RF emesso dal generatore impulsato con tempi di ON e OFF ((Ton= durata dell’impulso e Toffdurata della pausa tra 2 impulsi) regolabili indipendentemente tra 1 ms e 999 ms.

Lavorando in questa modalità i parametri critici sono:

• Duty Cycle (ciclo di lavoro), definito come: DC%= 100 x (Ton/ Ton+ Toff) definito come il rapporto tra il tempo in cui la scarica à ̈ accesa e il periodo totale dell’onda;

• Potenza Media, definita come: PAVE= PRFx DC dove PRFà ̈ la potenza applicata durante il Tone PAVEà ̈ la potenza media risultante che viene inviata sul campione.

Lavorando in modalità pulsata i vantaggi che ne derivano sono notevoli: innanzitutto applicando un DC basso à ̈ possibile lavorare ad alti valori di potenza in ingresso, mantenendo una potenza media bassa. In questo modo si ha una maggiore stabilità operativa, riducendo i radicali intrappolati nel rivestimento. Inoltre, un minor bombardamento di ioni ad alta energia ed un minor irraggiamento della superficie da parte dei raggi UV permettono di mantenere bassa la temperatura a livello della superficie del substrato.

Sono stati utilizzati differenti percentuali di DC e differenti periodi (Ton+Toff) mantenendo costante il DC %.

Il tempo di deposizione à ̈ stato variato per ogni processo in modo da modificare opportunamente lo spessore del rivestimento in funzione delle esigenze di caratterizzazione o di applicazione.

Tecniche di caratterizzazione di superficie

Le proprietà chimiche degli strati di PPAA ottenuti nelle condizioni descritte sono stati investigati usando diverse tecniche di caratterizzazione.

Per ragioni di semplicità, i dati di caratterizzazione OCA e FTIR-ATR riportati sono relativi ai rivestimenti ottenuti solo sui campioni di PE mentre i dati di analisi riportati sono relativi a film depositati su Silicio cristallino.

Misure di Angolo di Contatto

Questa tecnica fornisce un’indicazione sulla bagnabilità del rivestimento ottenuto, valutandone il comportamento idrofilico/idrofobico e, mediante la misura dell’energia superficiale, la reattività.

Queste misure sono state eseguite con il metodo della “goccia sessile†in modalità statica.

Due diversi liquidi, acqua deionizzata (d-H2O) e diiodometano (CH2I2) sono stati utilizzati per bagnare la superficie di PPAA (volume della goccia =1,5 microlitri) allo scopo di misurare l’energia superficiale dello strato funzionale (σ) nelle sue due componenti polare (σ<p>) associata alle interazioni di tipo legame idrogeno e elettrostatiche e dispersa (σ<d>) associata alle forze di interazione deboli di Van der Waals, tipo forze di dispersione di London, mediante l’applicazione del metodo di determinazione dell’Energia Superficiale di Owens-Wendt-Kealble (OWK).

Lo strumento, OCAH200 (Dataphysics, Instruments GmbH), usato per l’analisi à ̈ provvisto di una telecamera mobile connessa ad un computer che consente di registrar l’immagine della goccia in contatto con la superficie e di definire mediante il software SCA20 il profilo della goccia mediante il metodo di Laplace-Young e quindi calcolare l’angolo di contatto corrispondente.

Spettroscopia InfraRossa a Trasformata di Fourier (FTIR)

Queste caratterizzazioni sono state condotte a temperature ambiente con uno Spettrofotometro FTIR Nicolet 5700 equipaggiato con un modulo ATR dotato di cristallo di diamante. Gli spettri sono stati acquisiti con una risoluzione di 4 cm<−1>con 64 accumulazioni per ogni spettro nell’intervallo di numeri d’onda 400-4000 cm<−1>, mediante il software OMNIC.

Sono stati utilizzati come substrati di deposizione vetro corning e PE, entrambi compatibili in termini di indice di rifrazione con la tipologia di cristallo a disposizione, allo scopo di apprezzare le informazioni relative ai modi vibrazionali di assorbimento relativi allo strato di poli acido acrilico da investigare in tutto l’intervallo di numeri d’onda del medio infrarosso e quindi avere informazioni di tipo qualitativo sulla composizione chimica del polimero.

Analisi XPS

Allo scopo di comprendere la tipologia di gruppi chimici presenti alla superficie del film e per determinare dal punto di vista quantitativo i legami chimici che si instaurano all’interno del rivestimento à ̈ stata eseguita l’analisi XPS con uno spettrometro PHI 5000 VersaProbe. L’emissione dei fotoelettroni à ̈ stata eccitata mediante la radiazione monocromatica Al-Kα e gli spettri sono stati acquisiti con una risoluzione strumentale di 0,85eV. Gli spettri di “survey†sono stati acquisiti a 187,85 eV; gli spettri ad alta risoluzione dei picchi C1s e O1s evidenziati nello spettro di “survey†sono stati acquisiti a 23,50eV. Tutti gli spettri sono stati calibrati utilizzando il picco relativo al carbonio avventizio accumulato alla superficie (C1s, a 285eV).

Titolazione Colorimetrica

Allo scopo di determinare il numero di gruppi carbossilici alla superficie in grado di reagire con degli ammino gruppi contenuti nelle biomolecole da immobilizzare, Ã ̈ stata eseguita una titolazione colorimetrica con Toluidine blu O (TBO, Sigma-Technical Grade) colorante in grado di formare un legame amidico in presenza di gruppi carbossilici in rapporto 1:1.

I campioni di PE, ricoperti dal rivestimento di poli acido acrilico, sono stati fatti reagire con 2ml di una soluzione acquosa 0,5 mM di TBO (pH=10) a 30°C per 5 ore. Per rimuovere il colorante che non si à ̈ legato alla superficie, i substrati sono stati sciacquati con un gran quantitativo di soluzione acquosa di NaOH a concentrazione 0,1 mM. Il rilascio della molecola di colorante legata alla superficie del film à ̈ stato ottenuto mettendo in contatto il campione con un 1ml di soluzione acquosa di acido acetico di concentrazione 50%(v/v). La concentrazione del colorante nelle soluzioni recuperate à ̈ stata misurata a 633 nm con uno Spettrofotometro UV-Vis-Nir a doppio raggio (Varian Cary 500) in modalità di trasmissione utilizzando cuvette di quarzo con cammino ottico di 5mm. Il vantaggio dell’utilizzo di un sistema a doppio raggio consiste nella possibilità di compensare automaticamente le minime fluttuazioni legate all’emissioni della sorgente nel corso delle misure. Gli spettri sono stati acquisiti nell’intervallo delle lunghezze d’onda, 200-600 nm, con una risoluzione di 2nm.

Risultati e Discussione

Il passaggio di polimerizzazione plasmaassistita à ̈ stato eseguito impiegando diversi parametri di processo, come riportato sotto in TABELLA 1 e TABELLA 2.

TABELLA 1. Parametri dei Processi Plasma per le deposizioni in scarica continua CW

Parametri dei Processi Valore misurato

  

Flusso Ar 20 sccm

Flusso AA 3 sccm

Pressione di lavoro<206-248 mTorr>

Tempo di Deposizione 20 min

Potenza (Pfwd) 5W, 25W, 50W, 60W, 70W, 100W

TABELLA 2. Parametri dei Processi Plasma per le deposizioni in scarica impulsata MW

Parametri dei

Processi Valore misurato    

Flusso Ar 20 sccm

Flusso AA 3 sccm

Pressione di lavoro 206-248 mTorr

Tempo di Deposizione 5, 10, 20 min

Potenza (Pfwd) 100W, 200W

Duty Cycle (DC) 5%, 10%, 20%, 50 %

(5;95) ms (20;80) ms (10;90)

(Ton; Toff) ms (50;50) ms (50;450) ms (20;180) ms

Ogni processo di deposizione di poli acido a-

crilico à ̈ stato preceduto da uno stadio di pulizia

e attivazione del substrato per promuovere

l’adesione dello strato di rivestimento successiva-

mente deposto, eccitando la scarica di plasma in

argon oppure in ossigeno. L’effetto che si ottiene

in questo passaggio à ̈ differente in funzione del gas utilizzato. L’attivazione in argon conduce ad una modifica della morfologia superficiale dovuta all’effetto erosione superficiale di tipo fisico prodotto dal plasma in argon. La dissociazione dell’ossigeno in presenza della scarica produce la formazione di specie altamente reattive in grado modificare chimicamente la superficie del substrato e di influenzare come dimostrato successivamente la chimica del polimero depositato.

Risultati di angolo di contatto

In FIGURA 1 sono riportate le misure di angolo di contatto eseguite su substrati di polietilene ricoperti con diversi film di PAA ottenuti in scarica continua (Continous Wave - CW) con d-H2O. Si osserva un progressivo aumento dei valori di angolo di contatto (OCAH2O) all’aumentare del potenza applicata per generare la scarica di processo. Questo fenomeno à ̈ spiegabile con l’aumento dell’idrofobicità del poli acido acrilico.

Per potenze di radiofrequenza (PRF) minori di 50W, i valori di OCAH2Osono molto bassi a causa dell’elevata idrofilicità del film di poli acido acrilico dovuta alla scarsa frammentazione del monomero nel corso del processo, risultante quindi in una scarsa reticolazione delle specie interagenti e in un’elevata ritenzione dei gruppi funzionali car-

bossilici nel film funzionale risultante.

Per i processi eseguiti in scarica impulsata

(Modulated Wave – MW), i valori di OCAH2Odecrescono

(vedi TABELLA 3) in funzione della diminuzione del-

ON

la potenza media (PAVE =P RF<t>), indipendentementON t OFF

te dalla PRF.

TABELLA 3. Misure OCAH2O eseguite su substrati di Polietilene dopo deposizione di strati di PAA ottenuti in processi plasma con condizioni di scarica

PfwdDC tontoffPaveTempo CAH₂O                     Wat

t % ms ms Watt Min Gradi ° 100 5 5<)>95 5 20 14±2 100 20 20 80 20 20 14±1 100 50 50 50 50 20 55±2 200 5 5 95 10 20 11±1,5 200 10 10 90 20 20 18±3 200 10 50 450 20 20 55±2 200 10 20 180 20 20 28±2 200 10 10 90 20 10 24±2 Inoltre per bassi DC %, i film mostrano una

più alta idrofilicità dovuta alla più alta densità di gruppi funzionali correlati alla maggior ritenzione della struttura del monomero.

Questi risultati mostrano che impiegando processi a scarica continua eseguiti ad alta potenza, i film di rivestimento ottenuti sono troppo idrofobici mentre, se il processo a scarica continua à ̈ eseguito a bassa potenza, il film risultante, benché sia idrofilico e ricco di gruppi funzionali, à ̈ troppo instabile e solubili in contatto con liquidi. Sorprendentemente, i processi a scarica impulsata forniscono invece risultati molto più interessanti ed utili, poiché regolando i parametri di processo à ̈ risultato possibile ottenere film stabili e con idrofilicità variabile, che indica una buona variabilità della densità dei gruppi funzionali.

Risultati Spettroscopia ATR-FTIR

La caratterizzazione mediante spettroscopia FTIR-ATR Ã ̈ in grado di dare informazioni di tipo qualitativo sulla composizione chimica dei vari rivestimenti polimerici processati.

Per quanto riguarda i processi a scarica impulsata risultano evidenti le differenze tra gli assorbimenti “impronta digitale†relativi ai modi vibrazionali dei legami delle specie monomero acido acrilico (AA)/poli acido acrilico (PAA).

Gli spettri relativi ai processi CW a PRF> 50W presentano segnali relativi a specie – OH isolate rispetto a quelli ottenuti a PRF≤ 50W dove ci sono segnali relativi a specie –OH in grado di dare interazioni intermolecolari, che aumentano al diminuire della PRFapplicata. Si conferma quindi che ad alte potenze, il fenomeno di frammentazione delle specie oligomeriche in via di formazione risulta dominante nel corso del processo, mentre a basse potenze i gruppi OH si conservano intatti nelle specie carbossiliche e sono in grado di interagire fra loro per legame idrogeno.

Il segnale associato allo stiramento del legame C=O, presente sia in funzionalità di tipo carbossilico sia in funzionalità di tipo estere à ̈ più intenso per i film di PAA ottenuti per PRF≤ 50W rispetto a quello dei film prodotti a PRF> 50W, confermando quindi la teoria sulla minore o maggiore frammentazione dovuta alla minore o maggiore PRF.Se non vi fosse il problema dell’instabilità in acqua dei rivestimenti ottenuti a basse potenze, i processi CW a PRF≤ 50W sarebbero dei buoni candidati per la sperimentazione.

Anche per i processi ottenuti in MW, gli assorbimenti “impronta digitale†osservabili dagli spettri FTIR-ATR sono più intensi a basse PAVEe bassi DC %, confermando quindi la generazione di rivestimenti polimerici di buona qualità a causa della ridotta frammentazione bilanciata dall’elevata propagazione di catena , favorita dal lungo tempo di Toff. I rivestimenti risultano quindi ben reticolati e contemporaneamente presentano un alto numero di gruppi funzionali e un’elevata ritenzione del gruppo funzionale monomerico.

Quindi, i processi in scarica impulsata con basso valore di D.C. non solo sono ideali per l’attivazione di semplici molecole organiche senza distruggere la funzionalità chimica caratteristica, ma consentono anche di realizzare un polimero, partendo dal vapore del reagente secondo un meccanismo molto simile a quello di una tradizionale polimerizzazione radicalica, ma con un più basso grado di ordine.

Risultati Spettroscopia ATR-FTIR dopo trattamento in acqua

La verifica della stabilità dei film ottenuti via plasma in acqua costituisce un passo fondamentale se questi devono essere applicati come polimeri funzionali in saggi biologici e quindi essere messi in contatto con soluzioni acquose e/o fluidi biologici. Dopo immersione in soluzioni appropriate il polimero non solo deve mostrare un elevata stabilità chimica ma anche un’ottima resistenza alla delaminazione e alla dissoluzione.

Per questa ragione i rivestimenti di PAA ottenuti a bassi DC % sono stati immersi per 1 ora in d-H2O e nuovamente caratterizzati mediante spettroscopia ATR-FTIR.

Da queste prove e dall’osservazione degli assorbimenti dei modi vibrazionali tipici dopo il trattamento in acqua, risulta che pur essendo le intensità più basse se confrontate con quelle degli spettri registrati prima dell’immersione in H2O, il rivestimento che perde di meno materiale à ̈ quello associato al processo ottenuto con bassi PAVE, con un DC% = 10% (Ton= 10 ms and Toff= 90 ms) e una PRFapplicata di 200W. Questo processo, infatti, pur generando un minor grado di reticolazione (cross— linking) all’interno del polimero risultante rispetto ai processi a più alti DC%, produce il polimero con le migliori caratteristiche di compromesso tra densità di gruppi funzionali, idrofilicità e stabilità chimica.

Effetto del trattamento pre-deposizione: spettroscopia FTIR e Analisi XPS

Il pre-trattamento di etching del substrato ha lo scopo di aumentare l’adesione del film al substrato. Se questo viene eseguito in un gas reattivo come l’ossigeno, il tipo di adesione à ̈ noto essere maggiore a causa della presenza di specie O, per lo più radicaliche e quindi reattive, che trovandosi all’interfaccia tra il film e il substrato aumentano la coesione. Invece il pre-trattamento in argon che a causa della scarica dissocia principalmente in ioni ed elettroni produce un aumento della rugosità della superficie con un limitato effetto sulla coesione.

Con la spettroscopia FTIR-ATR, gli inventori hanno dimostrato che in realtà le specie ossigeno vengono inglobate nel rivestimento nel corso della deposizione, combinandosi infatti con i vapori di monomero AA. Infatti le specie radicaliche risiedono a lungo in camera per il basso vuoto tipico del sistema di deposizione utilizzato per i processi e vanno quindi ad arricchire in ossigeno la composizione del rivestimento. Questo potrebbe essere quindi considerato un vantaggio.

Il confronto degli spettri relativi al processo PRF= 200W, DC = 10%, PAVE=20W preceduto da pretrattamento in plasma d’argon e in plasma d’ossigeno, rispettivamente, conferma la presenza di più specie contenenti ossigeno quindi più specie –COOH nel polimero ottenuto con il pre-trattamento in ossigeno.

Lo spettro relativo al processo sopra descritto, presenta bande di assorbimento associate ai legami dei gruppi carbossilici più intense rispetto a quelle osservate nello spettro del film deposto dopo il pretrattamento di superficie in plasma d’argon, suggerendo che le specie ossigeno residenti in camera sono state inglobate nel film di PPAA depositato.

Questo comportamento à ̈ stato confermato anche dai risultati dell’analisi XPS. Le energie di legame assegnate ad ognuno dei picchi individuati negli spettri di FIGURA 2 sono in accordo con i valori riconosciuti in letteratura per questo tipo di funzionalità. Si assume che il picco rappresentativo del carbonio di tipo α (ossia carbonio del gruppo carbossilico), posizionato a 285,5 eV includa i contributi associati alle specie C-C, C-O, C=O, O-C=O e che quindi la maggior larghezza di banda osservata negli spettri riportati sia giustificata.

Dal confronto degli spettri ad alta risoluzione relativi al C1s, si ricava che per il processo con trattamento in Ar si ottiene una percentuale di specie C-C del 79,41% (FIGURA 2a) mentre per il processo con pretrattamento in O2si ottiene una percentuale corrispondente a 72,72% (FIGURA 2c) per questa specie. Invece, per quanto riguarda il gruppo O-C=O, la componente del picco C1s ad esso associata aumenta notevolmente dopo il trattamento in O2. Rimangono invece inalterati i contributi legati ai legami di tipo C-O e C=O.

Per quanto riguarda il picco ad alta risoluzione relativo all’O1s, dopo il trattamento in ossigeno, l’analisi sul film depositato, rivela che la componente associata al gruppo carbossilico (O=C-OH) aumenta (25,53% - FIGURA 2d) rispetto allo stesso contributo osservato nello spettro relativo al film depositato dopo il pre-trattamento in Ar (22,10% - FIGURA 2b).

Per quanto riguarda le altre componenti, quella relativa a CH-OH Ã ̈ presente in percentuale elevata dopo il pretrattamento in Ar, mentre quella relativa al O=C-OH risulta indipendente dal gas usato per il pretrattamento.

Dopo l’immersione dei due tipi di film depositati in d-H2O, i risultati dell’analisi XPS mostrano delle differenze (FIGURA 3). Per lo spettro del C1s le varie componenti relative ai due film sembrano essere simili suggerendo che il trattamento in H2O abbia l’effetto di uniformare le caratteristiche chimiche del film (FIGURA 3a e 3c). Infatti l’immersione in H2O ha l’effetto di eliminare gli oligomeri di superficie, instabili e facilmente solubili in acqua.

Per quanto riguarda lo spettro dell’O1s, dopo l’immersione in d-H2O, i film ottenuti con pretrattamento in Ar mostrano un maggior contenuto di specie O rispetto al film ottenuto dopo pretrattamento in O2(FIGURA 3b 3d).

Questo comportamento si spiega con una maggiore instabilità degli strati superiori del film dovuti al pretrattamento in O2che risulta dopo l’immersione in acqua in una diminuzione, nello spettro, delle componenti contenenti un legame C-O.

In conclusione, pur essendo interessante l’inglobamento di specie ossigeno grazie al pretrattamento del substrato, non à ̈ un effetto che resiste all’immersione in acqua e il film risultante ha caratteristiche comparabili al suo omologo ottenuto dopo pre-trattamento in Argon.

Quantificazione dei gruppi carbossilici mediante titolazione colorimetrica con Toluidina Blu O (TBO) Per avere informazioni di tipo quantitativo sulla densità superficiale dei gruppi carbossilici –COOH, sono state eseguite prove di titolazione colorimetrica su film di PPAA ottenuti in diverse condizioni di processo.

Dall’intensità di assorbanza, a 633 nm, delle soluzioni ricuperate contenti le specie TBO che si erano legate ai gruppi carbossilici della superficie di PPAA, attraverso la legge di Lambert-Beer (A=εbC) à ̈ stato possibile calcolare la concentrazione in soluzione del colorante e quindi, sapendo che il numero di molecole era in rapporto 1:1 con il numero di specie carbossiliche di superficie, la densità di superficie dei gruppi funzionali di interesse.

I risultati sono in accordo con le precedenti caratterizzazioni: all’aumentare di PRFo PAVE, la densità dei gruppi carbossilici dei film ottenuti decresce (TABELLA 4).

TABELLA 4. Densità dei gruppi carbossilici for differenti tipi di Processi Plasma

Parametri dei Processi N°COOH/cm<2>

  

CW 60W Ar Pre-tratt 2,06*10<16>MW DC%= 10% Ton+Toff=500ms O2Pre-tratt 7,52*10<15>MW DC%= 10% Ton+Toff=500ms O2Pre-tratt 2,13*10<16>MW DC%=10% Ton+Toff=100ms Ar Pre-tratt 9,65*10<15>Pertanto, il film ottimale risulta essere quello ottenuto con PRF= 200W, DC = 10%, PAVE=20W, periodo 10/90 ms.

Saggio Biodiagnostico per applicazioni DNA Microarray Il film di PAA che ha mostrato le migliori proprietà in termini di stabilità e densità dei gruppi funzionali à ̈ stato infine utilizzato per la funzionalizzazione dei substrati di PVC, per ottenere un DNA Microarray in grado di rivelare la presenza dei monocitogeni di Listeria mediante un esperimento di ibridazione.

I test di ibridazione sono stati eseguiti su substrati di PAA-PVC e replicati sul substrati commerciali allo scopo di confrontare l’efficienza dei risultati.

La FIGURA 4 mostra l’immagine di un supporto di PVC funzionalizzato con il PAA sul quale sono state depositate le gocce di soluzione contenenti le sonde destinate all’esperimento di ibridazione, secondo lo schema a griglia in basso a destra, “C1†corrisponde alla posizione in cui sono state messe le sonde di controllo biotinilate; “1†alla zona con le sonde dei monocito geni di Listeria; “2†alle sonde non specifiche per la Listeria e “N†a gocce del tampone di ibridazione usate come controllo di contaminazione nel corso della deposizione delle gocce nanolitriche. Nell’immagine a sinistra sono osservabili i pallini neri corrispondenti alle posizioni in cui à ̈ avvenuta l’ibridazione, rivelata col metodo colorimetrico SilverQuant®, con il target complementare di Listeria. Le zone 1 2 e 3 corrispondono alle diverse concentrazioni di soluzione di target utilizzate: In 1. il contenuto di ampliconi di Listeria à ̈ di 300 ng, in 2. di 600 ng e in 3. di 6 µg. L’immagine in alto a destra 1.b corrisponde all’ingrandimento della zona 1 dopo la rivelazione colorimetrica. E’ evidente come gli spot ottenuti con la soluzione di ampliconi a concentrazione più bassa (330ng) sono comparabili in termini di intensità con quelli ottenuti utilizzando soluzione a più alta concentrazione e con quelli prodotti dalle sonde di controllo biotinilate.

Dal confronto dei risultati di ibridazione ottenuti sui substrati di PAA-PVC con quelli ottenuti sui substrati commerciali non si notano differenze in termini di segnale. Quest’osservazione fornisce evidenza della robustezza e biocompatibilità dei rivestimenti di poli acido acrilico ottenuti con il procedimento dell’invenzione, indicando la loro idoneità per l’impiego nello sviluppo di DNA microarray capaci di portare a termine un completo esperimento di ibridazione.

In conclusione, il procedimento descritto nella presente sezione sperimentale, caratterizzato dall’impiego delle seguenti condizioni di processo: PRF= 200W, DC = 10%, PAVE=20W, Periodo 10/90 ms, à ̈ particolarmente vantaggioso poiché consente non solo di ottenere superfici con gruppi funzionali carbossilici in grado di legare le funzionalità amminiche delle sonde oligonucleotidiche in quantità controllata grazie alla modulazione dei parametri di processo, ma anche di gestire le proprietà macroscopiche del rivestimento, agendo facilmente sul grado di reticolazione. In questo modo si ottiene una densità di gruppi carbossilici alla superficie che conferisce proprietà idrofiliche al rivestimento ma che al contempo à ̈ ottimale per il tipo di immobilizzazione effettuata. Infatti, un numero eccessivo di gruppi funzionali esposti, con conseguente diminuzione dell’angolo di contatto tra la superficie e le soluzioni acquose contenenti le sonde di DNA, determinerebbe una diluzione per unità di superficie del numero di molecole di sonde spottate, comportando un “allargamento†della goccia deposta (che à ̈ di volume nanolitrico) e quindi un’inefficiente risoluzione degli spot determinati dal riconoscimento degli analiti. Tale condizione costituisce un elemento cruciale nella diagnostica a microarray.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di funzionalizzazione di un substrato per saggio biologico, comprendente i seguenti passaggi: (i) un passaggio di attivazione del substrato, consistente nell’attivare la superficie di un substrato per saggio biologico realizzato in un materiale scelto dal gruppo che consiste di vetro, silicio e materiali polimerici, mediante pretrattamento di plasma etching con un gas inerte; (ii) un passaggio di deposizione di un rivestimento di un poli acido carbossilico, consistente nel polimerizzare un monomero precursore di un poli acido carbossilico sulla superficie attivata del substrato, detta polimerizzazione essendo effettuata mediante polimerizzazione plasma-assistita in fase vapore operando in modalità pulsata; e (iii) un passaggio di stabilizzazione del rivestimento di poli acido carbossilico, consistente nel sottoporre il rivestimento di poli acido carbossilico depositato sulla superficie del substrato a lavaggio in acqua deionizzata.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti materiali polimerici sono scelti dal gruppo che consiste di poliammidi, polivinilcloruro (PVC), acrilobutadienestirene (ABS), copolimero di cicloolefina (COC), polietilene ad alta densità (HDPE), polipropilene (PP), polistirene (PS), policarbonato (PC)e loro combinazioni.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il gas inerte à ̈ argon o elio.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il monomero precursore di poli acido carbossilico à ̈ scelto dal gruppo che consiste di acido acrilico, acido metacrilico, acido vinil acetico, acido allil acetico, acido crotonico e anidride maleica.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il passaggio di deposizione del rivestimento di poli acido carbossilico à ̈ realizzato operando in modalità pulsata applicando una potenza compresa fra 100 e 250 W con un ciclo di lavoro compreso fra 0,1 e 0,5.
6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui la durata del passaggio di deposizione à ̈ compresa fra 5 e 30 minuti, preferibilmente fra 10 e 20 minuti.
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui la polimerizzazione plasmaassistita in fase vapore à ̈ effettuata a pressione ridotta, preferibilmente compresa fra 200 e 250 mTorr.
8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui la polimerizzazione plasmaassistita in fase vapore à ̈ effettuata utilizzando argon o elio come gas inerte, più preferibilmente argon.
9. 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, in cui il lavaggio in acqua deionizzata del rivestimento di poli acido carbossilico depositato sulla superficie del substrato à ̈ realizzato mediante immersione in acqua deionizzata per un tempo compreso fra 30 e 120 minuti.
10. 10. Substrato per saggio biologico funzionalizzato con un rivestimento stabilizzato di poli acido carbossilico di spessore compreso fra 30 e 120 nm ottenibile mediante il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9.
11. 11. Dispositivo di saggio biologico comprendente un substrato per saggio biologico funzionalizzato secondo la rivendicazione 10.
12. 12. Dispositivo di saggio biologico secondo la rivendicazione 11 che à ̈ un dispositivo microarray.