ITTO20110169A1 - Modulatori allosterici positivi di mglur5 per l'impiego come medicamento nel trattamento terapeutico della sindrome di phelan-mcdermid - Google Patents

Description

“Modulatori allosterici positivi di mGluR5 per l’impiego come medicamento nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermidâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda una nuova applicazione terapeutica di molecole aventi attività di modulatori allosterici positivi del recettore metabotropico del glutammato mGluR5.

La sindrome di Phelan-McDermid, altresì indicata come sindrome da delezione 22q13, à ̈ una malattia genetica finora priva di cura, che determina una grave forma di ritardo mentale ed autismo. La sindrome à ̈ anche caratterizzata da ipotonia neonatale, ritardo globale dello sviluppo, capacità di parola gravemente ritardata e caratteristiche dismorfiche minori.

Come indicato sopra, la sindrome di Phelan-McDermid à ̈ causata dalla delezione cromosomica 22q13. Si ritiene che l’assenza di una copia del gene Shank3 (anche chiamato PROSAP2) codificante per la proteina strutturale Shank3 - che à ̈ localizzata nella densità postsinaptica (PSD) ed à ̈ coinvolta nel mantenimento delle spine dendritiche dei neuroni ippocampali - rappresenti una delle cause essenziali delle principali caratteristiche neurologiche associate alla delezione 22q13.

Shank à ̈ una grossa proteina multidominio dell’impalcatura strutturale della densità post sinaptica (PSD), costituita da una ripetizione di ankyrin in prossimità dell’N-terminale, seguita da SH3, un dominio PDZ, una regione lunga ricca in prolina e un dominio SAM (motivo alfa sterile) al C-terminale.

A livello molecolare, le proteine Shank (che sono codificate da tre geni, Shank1-3) si legano a due recettori del glutammato: i recettori NMDA e i recettori metabotropici del glutammato (mGluRs) di tipo-I. Il dominio PDZ di Shank si lega al C-terminale di GKAP. L’interazione di Homer con il dominio ricco in prolina assicura l’associazione di Shank con i recettori metabotropici del glutammato (mGluRs) di tipo-I, ossia mGluR1 e mGluR5.

Negli ultimi anni il ruolo delle proteine Shank à ̈ stato studiato da molti ricercatori, i quali hanno riportato che l’overespressione di Shank1 nei neuroni ippocampali accelera la maturazione di protrusioni tipo filopodiali nelle spine mature e promuove l’ingrandimento delle spine mature. Al contrario, in topi privi di Shank1 sono state osservate spine dendritiche più piccole, una più debole trasmissione sinaptica e un alterato apprendimento spaziale. Shank1 e Shank3 potrebbero formare un’intelaiatura strutturale nella PSD utilizzando diversi meccanismi molecolari.

L’associazione fra la distruzione del gene Shank3 e il deficit neurologico correlato con la sindrome di Phelan-McDermid à ̈ stata riportata per la prima volta nel 2001. Tale associazione à ̈ fortemente supportata dall’osservazione che tutte le delezioni 22q13 analizzate eccetto una determinano la delezione di Shank3, sia per l’esistenza di un punto di rottura ricorrente all’interno del gene Shank3 sia per la recente osservazione che le mutazioni di Shank3 possono risultare in un deficit del linguaggio e/o delle interazioni sociali.

Più recentemente, altre piccole mutazioni missenso o piccole delezioni interstiziali di Shank3 sono state fortemente associate con il ritardo men tale e i disturbi dello spettro autistico.

Roussignol et al., The Journal of Neuroscience, 6 aprile 2005, 25(14):3560-3570, hanno mostrato che l’overespressione di Shank3 nei granuli del cervelletto induce la formazione di spine dendritiche e sinapsi mediante reclutamento di recettori del glutammato, mentre l’inibizione dell’espressione di Shank3 nei neuroni ippocampali riduce il numero di spine dendritiche. Questa pubblicazione tuttavia non indica né suggerisce che la riduzione della proteina Shank3 possa ridurre lo specifico recettore metabotropico del glutammato mGluR5 nelle sinapsi. Inoltre questa pubblicazione suggerisce che l’overespressione di Shank3 incrementi differenti sottotipi di recettori del glutammato, suggerendo che Shank3 in generale regoli la localizzazione sinaptica di tutti i recettori del glutammato.

La presente invenzione à ̈ basata sulle osservazioni effettuate dai presenti inventori in relazione a colture di cellule ippocampali e corticali di ratto e di topo, in base alle quali à ̈ stato scoperto che, contrariamente a quanto descritto nello stato della tecnica (vedasi in particolare Roussignol et al., 2005 sopra citato), l’inibizione dell’espressione di Shank3 induce una specifica riduzione dell’espressione dei recettori metabotropici del glutammato mGluR5, ma non di altre proteine sinaptiche, nonché una riduzione della fosforilazione di ERK1/2 e CREB indotta da DHPG (un agonista dei recettori metabotropici del glutammato di tipo I) e della plasticità sinaptica dipendente da mGluR5, nonché una modulazione dell’attività della rete neurale.

Le ricerche condotte dai presenti inventori hanno altresì mostrato che l’incremento farmacologico dell’attività di mGluR5 tramite un modulatore allosterico positivo di mGluR5, quale preferibilmente CDPPB (3-ciano-N-(1,3-difenil-1-H-pirazol-5-il)benzamide), determina un recupero della funzionalità sinaptica in neuroni knock-down per Shank3.

In base a queste osservazioni, un modulatore allosterico positivo di mGluR5 à ̈ efficace nel compensare il deficit di attività dei recettori mGluR5 associato con la sindrome di Phelan-McDermid.

La presente invenzione riguarda quindi un modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermid.

In una forma di realizzazione preferita, il modulatore allosterico positivo di mGluR5 Ã ̈ la molecola CDPPB (3-ciano-N-(1,3-difenil-1-H-pirazol-5-il)benzamide).

In un’altra forma di realizzazione preferita, il modulatore allosterico positivo di mGluR5, (preferibilmente CDPPB), à ̈ impiegato nel trattamento terapeutico delle disfunzioni cognitive della sindrome di Phelan-McDermid.

La molecola CDPPB à ̈ preferita poiché si tratta di un farmaco antipsicotico già disponibile in commercio e, dal punto di vista farmacologico, di una molecola con capacità di penetrazione nel cervello.

Ulteriori molecole con attività di modulatori allosterici positivi di mGluR5 di per sé note adatte all’impiego nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermid secondo la presente invenzione sono ADX-47273, CPPHA, VU-29, VU-36, VU-1545, DFB (1-(3-fluorofenil)-N-((3-fluorofenil)metilidenamino)metanimina).

Per l’impiego come medicamento nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermid secondo la presente invenzione, il modulatore allosterico positivo di mGluR5 può essere formulato in qualsiasi forma di dosaggio di per sé nota, ad esempio una forma di dosaggio adatta per le applicazioni terapeutiche già note dei modulatori allosterici positivi di mGluR5, particolarmente di CDPPB. Il tecnico medio del settore à ̈ comunque in grado di modificare le caratteristiche della forma di dosag gio a seconda delle necessità, senza che ciò comporti un’eccessiva sperimentazione né l’esercizio di alcuna attività inventiva.

Anche la determinazione della quantità di principio attivo da somministrare al paziente, che dipende da svariati fattori relativi sia alla patologia sia alle caratteristiche del paziente, rientra nelle capacità del tecnico medio (come sopra) del settore. Come indicazione generale non limitativa, una dose terapeuticamente efficace di CDPPB può essere compresa fra 0,1 a 100 mg/kg di peso corporeo per un paziente umano affetto dalla sindrome di Phelan-McDermid.

Una concentrazione efficace di CDPPB negli esperimenti condotti in vitro à ̈ compresa fra circa 0,1 a 200 µM.

La parte sperimentale che segue à ̈ fornita a puro titolo illustrativo e non limitativo della portata della presente invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni, il cui oggetto forma altresì parte integrante della descrizione brevettuale.

Nella parte sperimentale sono infatti descritte le sperimentazioni effettuate e i dati ottenuti dai presenti inventori su quali si basa la nuova applicazione terapeutica che forma oggetto della presente invenzione.

In sintesi, gli inventori hanno adoperato la tecnica dell’RNA interference (RNAi) per ridurre (knock-down) l’espressione di Shank3 in colture cellulari ippocampali e corticali ed hanno mostrato che questo trattamento riduce specificamente l’espressione sinaptica del recettore metabotropico del glutammato mGluR5 ma non influisce sull’espressione di altre importanti proteine sinaptiche. Come conseguenza funzionale del knockdown dell’espressione di Shank3 mediante RNAi, gli inventori hanno osservato una riduzione del signalling via mGluR5 (riduzione della fosforilazione di ERK1/2 e CREB indotta da stimolazione con DHPG come agonista di mGluR5), una riduzione della plasticità sinaptica dipendente da mGluR5 e una riduzione della modulazione dipendente da mGluR5 dell’attività della rete neurale. Gli inventori hanno anche trovato anomalie morfologiche nella struttura delle sinapsi (numero, lunghezza e larghezza delle spine) e una riduzione della trasmissione sinaptica glutamatergica (riduzione della frequenza delle correnti post-sinaptiche eccitatorie in miniatura, mEPSC). Particolarmente, l’aumento farmacologico dell’attività di mGluR5 mediante l’uso di CDPPB (3-ciano-N-(1,3-difenil-1-H-pirazol-5-il)benzamide) come modulatore allosterico positivo di questi re cettori, ripristina il signalling dipendente da mGluR5 (fosforilazione di ERK1/2 indotta da DHPG) e normalizza la frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura in neuroni knock-down per Shank3.

I risultati degli esperimenti effettuati dagli inventori, sopra riassunti sinteticamente ma descritti in maggiore dettaglio nella sezione relativa alla parte sperimentale che segue, dimostrano che un deficit nel signalling intracellulare mediato da mGluR5 in neuroni knock-down per Shank3 può essere compensato da un trattamento con CDPPB e formano quindi la base sperimentale a supporto dell’applicazione terapeutica formante oggetto della presente invenzione.

Nella parte sperimentale che segue i risultati degli esperimenti condotti sono descritti facendo riferimento alle annesse figure, il cui contenuto tecnico à ̈ descritto in breve qui di seguito.

Figura 1. La riduzione dell’espressione (knockdown) di Shank3 riduce l’espressione di mGluR5. (A) Neuroni ippocampali a DIV 7 sono stati infettati con un lentivirus esprimente shShank3 oppure con shCtrl, come indicato sopra i riquadri. Dopo una settimana i neuroni sono stati solubilizzati ed analizzati mediante Western blotting con gli anticorpi indicati sul lato sinistro dei riquadri. (B) Livelli medi (± SEM) delle proteine (normalizzati rispetto ai neuroni non infettati) nei neuroni ippocampali infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shCtrl; sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendenti. Per ogni proteina indicata sul lato sinistro del riquadro (B), l’istogramma superiore si riferisce ai risultati ottenuti relativamente al controllo non infettato, l’istogramma centrale si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl e l’istogramma inferiore si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3. I livelli di espressione di Shank3 e mGluR5 erano significativamente minori nei neuroni infettati con shShan3 rispetto a quelli non infettati o a quelli infettati con shCtrl; *p<0,01, test t di Student. Sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendenti. (C) Dai neuroni ippocampali infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shCtrl sono stati ottenuti i sinaptosomi e sono stati analizzati mediante Western blotting con gli anticorpi indicati sul lato sinistro dei riquadri. (D) Livelli medi (± SEM) delle proteine (normalizzati rispetti ai neuroni infettati con shCtrl) in sinaptosomi ottenuti da neuroni ippocampali infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shCtrl; sono stati effettuati almeno tre esperimenti indipendenti. Per ogni proteina indicata sul lato sinistro del riquadro (D), l’istogramma superiore si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl e l’istogramma inferiore si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3. I livelli di espressione di Shank3 e mGluR5 erano significativamente minori nei neuroni infettati con shShan3 rispetto a quelli infettati con shCtrl; *p<0,01, test t di Student.

Figura 2. La riduzione dell’espressione (knockdown) di Shank3 altera la via di mGluR5. (A) Neuroni ippocampali a DIV 7 sono stati infettati con un lentivirus esprimente shShank3 oppure shCtrl. Dopo una settimana i neuroni sono stati trattati con DHPG 100 µM, NMDA 100 µM o KCl 50 mM per 30 minuti, come indicato sopra i riquadri, e poi solubilizzati ed analizzati mediante Western blotting per l’espressione di Shank3, pERK1/2, ERK1/2, pCREB e CREB, come indicato sul lato sinistro dei riquadri. (B) Livelli medi (± SEM) di pERK1/2 e pCREB (normalizzati rispetto a ERK e CREB totali e rispetto ai controlli non trattati, NT, valori); sono stati effettuati almeno cinque esperimenti indipendenti. I livelli di pERK1/2 e pCREB erano significativamente minori nei neuroni infettati con shShank3 rispetto ai neuroni infettati con shCtrl dopo trattamento con DHPG, *p<0,01, test t di Student. (C) I riquadri mostrano le immagini al microscopio confocale di neuroni ippocampali trasfettati a DIV 7 con shCtrl, shShank3 o shShank3 più shShank3r (forma resistente a shShank3), come indicato sul lato sinistro dei pannelli, e trattati a DIV 14 con DHPG 100 µM o KCl 50 mM, come indicato sopra i riquadri. I neuroni sono stati fissati e colorati per GFP e pERK1/2. (D) I segnali di pERK1/2 in ciascuna condizione di trasfezione e di trattamento sono stati quantificati come descritto in Materiali e Metodi; i valori medi sono mostrati come barre (± SEM). Per ciascuna condizione di trattamento (NT, DHPG e KCl), l’istogramma a sinistra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl, l’istogramma centrale si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3 e l’istogramma a destra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3 Shank3r. Il livello di pERK1/2 dopo trattamento con DHPG era significativamente minore nei neuroni trasfettati con shShank3 rispetto ai neuroni trasfettati con shCtrl e con shShank3 più shShank3r, *p<0,05, test t di Student. Barra di scala = 20 µm.

Figura 3. La riduzione dell’espressione (knockdown) di Shank3 riduce la frequenza ma non l’ampiezza o l’andamento temporale delle mEPSC in neuroni ippocampali in coltura. (Aa) mEPSC rappresentative registrate a DIV 7 da neuroni di controllo (shCtrl, sinistra) e dopo knock-down di Shank3 (shShank3, destra) ad un potenziale di partenza di -60 mV in presenza di TTX 0,5 µM e picrotossina 50 µM. (Ab) Sono mostrati con una maggiore risoluzione temporale alcuni intervalli di tempo selezionati. (Ac) mEPSC mediate ottenute da un neurone di controllo (sinistra) e da un neurone trattato con shShank3 (destra). (B, C, D, E) Grafici riassuntivi dei parametri delle mEPSC nei controlli (n=16 cellule) e nei neuroni trattati con shShank3 (n=19 cellule). I dati sono stati ottenuti da sette preparazioni indipendenti. Non vi sono differenze nell’ampiezza, nel tempo di crescita o di decadimento delle mEPSC nei neuroni trattati con shShank3 rispetto ai neuroni di controllo (**p<0,005; test t di Student). I dati sono forniti come media ± SEM.

Figura 4. Indebolimento della depressione a lungo termine (LTD) indotta da DHPG e riduzione dell’espressione della subunità GluR1 dei recettori AMPA nei neuroni ippocampali trattati con shShank3. (A) Esempi di mEPSC registrate immediatamente prima (sinistra) e 30 minuti dopo (destra) l’inizio dell’applicazione di DHPG. mEPSC sono state registrate ad un potenziale di partenza di -60 mV in presenza di TTX 0,5 µM e picrotossina 50 µM. Per isolare il potenziamento a lungo termine (LTP) mediato da mGluR, acido amminofosfovalerico (APV) 50 µM à ̈ stato applicato insieme a DHPG 100 µM o applicato da solo come controllo. (A, in alto) In colture trattate con shCtrl, DHPG 100 µM determinava un decremento persistente della frequenza delle mEPSC. (A, in basso) In neuroni trattati con shShank3, DHPG 100 µM non induceva un decremento della frequenza delle mEPSC. (B) Dati mediati che mostrano l’effetto di DHPG sulla frequenza delle mEPSC in neuroni trattati con shCtrl (pallini neri, n=7 neuroni) e in neuroni trattati con shShank3 (pallini grigi, n= 7 neuroni). I dati sono ottenuti da tre preparazioni indipendenti. La frequenza delle mEPSC durante i primi 5 minuti di registrazione (cioà ̈ prima dell’applicazione di DHPG) à ̈ stata fissata come il 100%. (C) Il grafico riassuntivo mostra le variazioni della frequenza media delle mEPSC dopo 30-35 minuti dall’applicazione di DHPG. La differenza fra la frequenza delle mEPSC dei neuroni trattati con shCtrl e i neuroni trattati con shShank3 à ̈ significativa (*p<0,05, test t di Student). (D) L’ampiezza delle mEPSC non veniva influenzata da DHPG né nei neuroni trattati con shCtrl né in quelli trattati con shShank3. (E) E-sempi di immunocolorazione di GluR1 sulla superficie cellulare in neuroni ippocampali a DIV 14. I neuroni sono stati trattati con DHPG 100 µM (+DHPG) per 10 minuti, oppure non sono stati trattati (-DHPG). Dopodiché, i neuroni vivi sono stati colorati con anticorpi contro GluR1 per 15 minuti (E, in alto). Vi à ̈ una riduzione dell’espressione di GluR1 sulla superficie cellulare dei neuroni di controllo (shCtrl) dopo trattamento con DHPG. (E, in basso) Nei neuroni trattati con shShank3 il numero di aggregati di GluR1 immunoreattivi sulla superficie dei dendriti era ridotto ed il trattamento con DHPG non influiva sull’espressione di GluR1 sulla superficie cellulare. (F) Sintesi della distribuzione di GluR1 sulla superficie cellulare in neuroni trattati con shCtrl e con shShank3 dopo trattamento con DHPG. Il diagramma sintetizza i dati ottenuti da cinque preparazioni. #p<0,05, test t di Student; *p<0,05 test t per dati appaiati. I dati sono presentati come media ± SEM.

Figura 5. Ripristino mediante l’uso di CDPPB della frequenza delle mEPSC e della fosforilazione di ERK1/2 indotta da DHPG in colture di neuroni ippocampali trattati con shShank3, un modulatore allosterico positivo di mGluR5. (A) I neuroni sono stati infettati con lentivirus a DIV 8 e trattati overnight con CDPPB 1 µM a DIV 13. A DIV 14 sono state registrate le mEPSC ad un potenziale di partenza di – 60mV in presenza di TTX 0,5 µM e picrotossina 50 µM. (A,B) Grafici riassuntivi dell’ampiezza (A) e della frequenza (B) delle mEPSC nei gruppi di trattamento con shCtrl veicolo (n= 11 cellule), shShank3 veicolo (n= 14 cellule) e shShank3 CDPPB (n= 14 cellule). I dati sono stati ottenuti da quattro preparazioni indipendenti. L’analisi ANOVA ha messo in evidenza una differenza fra le frequenze nei tre gruppi (p<0,001). (B) La frequenza delle mEPSC à ̈ significativamente ridotta nel gruppo shShank3 veicolo rispetto al gruppo shCtrl veicolo (*p<0,05, test di Dunn) e vi à ̈ un recupero significativo nel gruppo shShank3 CDPPB (*p=0,05, test di Dunn). I dati sono presentati come media ± SEM. (C) A DIV 7 i neuroni ippocampali sono stati infettati con shCtrl o shShank3. Dopo una settimana i neuroni sono stati trattati per 30 minuti come indicato sopra ai riquadri, poi sono stati solubilizzati ed analizzati mediante Western blotting per l’espressione di Shank3, pERK1/2 e ERK1/2, come indicato a sinistra dei riquadri. (C) Media (± SEM) pERK1/2, normalizzato rispetto ai valori di ERK totale e rispetto ai valori di non trattato (NT); sono stati quantificati almeno cinque esperimenti indipendenti. Il livello di pERK1/2 dopo trattamento con DHPG era significativamente minore nei neuroni infettati con shShank3 rispetto ai neuroni infettati con shCtrl, *p<0,01, test t di Student.

Figura 6. Caratterizzazione di shRNA specifico per Shank3. (A) Neuroni ippocampali a DIV 7 sono stati infettati o non sono stati infettati con un lentivirus esprimente Shank3 shRNA (shShank3); dopo una settimana i neuroni sono stati analizzati mediante Western blotting con anticorpi (come indicato sulla sinistra dei riquadri) specifici per Shank1, Shank2 e Shank3 o con anticorpi che riconoscono tutte e tre le proteine Shank (PanShank). (B) Livelli medi (± SEM) di proteina Shank (normalizzati rispetto ai livelli in neuroni non infettati) in neuroni ippocampali infettati o non infettati con un lentivirus esprimente shShank3; sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendenti. I livelli di Shank3 e PanShank erano significativamente minori nei neuroni infettati con shShank3 rispetto ai neuroni non infettati, *p<0,01, test t di Student. (C) Livelli medi (± SEM) di Shank mRNA (normalizzati rispetto ai livelli in neuroni non infettati) in neuroni ippocampali infettati o non infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shRNA controllo (shCtrl); sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendenti. Per ciascun mRNA analizzato (Shank1, Shank2 e Shank3), l’istogramma a sinistra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente al controllo non infettato, l’istogramma centrale si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl e l’istogramma a destra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3. Il livello di Shank3 mRNA era significativamente minore nei neuroni infettati con shShank3 rispetto ai neuroni non infettati o infettati con shCtrl, *p<0,01, test t di Student. (D) I neuroni ippocampali a DIV 7 sono stati infettati o non infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shCtrl e colorati dopo una settimana con anticorpi (come indicato sul lato destro dei riquadri) specifici per Shank3, sinaptofisina e aggregati di PSD-95 in neuroni ippocampali infettati con lentivirus esprimente shShank3 e shCtrl; sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendenti e sono stati considerati almeno cinque neuroni per esperimento. Per ciascuna proteina (sinaptofisina, Shank3 e PSD-95), l’istogramma a sinistra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente al controllo non infettato, l’istogramma centrale si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl e l’istogramma a destra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3. Il numero di aggregati (clusters) di Shank3 era significativamente minore nei neuroni infettati con shShank3 rispetto ai neuroni non infettati o infettati con shCtrl, *p<0,01 test t di Student.

Figura 7. (A) Cellule COS sono state trasfettate con HA-Shank3, GFP-Shank3r, GFP-Shank3R87Cr o GFP-Shank3InsGr più o meno shShank3, come indicato sopra i riquadri, poi solubilizzate ed analizzate mediante Western blotting con anticorpi anti-HA, anti-GFP o anti-tubulina. (B) Livelli medi (±SEM) di mRNA di PSD-95, GluR1 e GluR2 (normalizzati rispetto a quelli di neuroni non infettati) in neuroni ippocampali infettati o non infettati con un lentivirus esprimente shShank3 o shRNA controllo (shCtrl); sono stati effettuati almeno quattro esperimenti indipendeni. Per ciascun mRNA analizzato (PSD-95, GluR1, GluR2 e mGluR5), l’istogramma a sinistra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente al controllo non infettato, l’istogramma centrale si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shCtrl e l’istogramma a destra si riferisce ai risultati ottenuti relativamente all’infezione con shShank3.

Figura 8. Morfologia delle spine dendritiche in neuroni ippocampali infettati con shShank3. (A) Neuroni ippocampali a DIV 7 sono stati trasfettati con shCtrl e più cDNA esprimenti DsRed, come indicato sul lato destro dei riquadri. Dopo una settimana, i neuroni sono stati fissati e colorati per GFP e DsRed. (B) Quantificazione del numero (per 10 µm), della lunghezza e della larghezza delle spine dendritiche (±SEM). Oltre 14 neuroni trasfettati da quattro esperimenti indipendenti sono stati misurati per ciascuna trasfezione. Il numero, la lunghezza e la larghezza delle spine dendritiche erano significativamente differenti nei neuroni trasfettati con shShank3 rispetto ai neuroni trasfettati con shCtrl, **p<0,05, *p<0,01, test t di Student. Barra di scala = 10 µm.

Figura 9. Mutazioni di Shank3 osservate in pazienti autistici non ripristinano i difetti nella via di mGluR5 indotti da siShank3. (A) I riquadri mostrano immagini confocali di neuroni ippocampali trasfettati a DIV 7 con siShank3+Shank3R87Cr o si-Shank3+Shank3InsGr, come indicato sul lato sinistro dei riquadri; le cellule sono state fissate e colorate per GFP e pERK1/2. (B) I segnali ottenuti per pERK1/2 in ciascuna condizione di trasfezione e di trattamento sono stati quantificati come descritto in Materiali e Metodi; i valori medi sono mostrati come barre (±SEM). Per ciascuna condizione di trattamento (NT, DHPG e KCl), l’istogramma a sinistra si riferisce ai valori ottenuti dall’infezione con shCtrl, l’istogramma al centro (sinistra) si riferisce ai valori ottenuti dall’infezione con shShank3, l’istogramma al centro (destra) corrisponde ai valori ottenuti dall’infezione con shShank3+Shank3R87Cr e l’istogramma a destra si riferisce ai valori ottenuti dall’infezione con shShank3+Shank3InsGr. Il livello di pERK1/2 era significativamente minore dopo trattamento con DHPG nei neuroni trasfettati con shShank3, shShank3+shShank3R87Cr e shShank3+shShank3InsGr rispetto ai neuroni trasfettati con shCtrl, *p<0,05, test t di Student. Barra di scala = 20 µm.

Figura 10. La reintroduzione di Shank3 resistente a shShank3 in neuroni ippocampali trattati con shShank3 ha l’effetto di ripristinare la frequenza delle mEPSC. I neuroni sono stati infettati con i lentivirus a DIV 8 e trasfettati a DIV 11 con un vettore vuoto (mock) o con un plasmide codificante per Shank3 resistente a shShank3 (Shank3r). A DIV 14, le mEPSC sono state registrate ad un potenziale di partenza di -60mV in presenza di TTX 0,5 µM e picrotossina 50 µM. (A,B) Grafici riassuntivi dell’ampiezza (A) e della frequenza (B) delle mEPSC nei gruppi trattati con shCtrl mock (n= 12 cellule), shShank3 mock (n= 11 cellule) e shShank3 shShank3r (n= 14 cellule). I dati sono ottenuti da quattro esperimenti indipendenti. L’analisi ANOVA ha messo in evidenza una differenza nella frequenza fra i tre gruppi (p<0,01). (B) La frequenza delle mEPSC à ̈ ridotta nei neuroni trattati con shShank3 mock (*p<0,05 test di Dunn) e viene ripristinata nelle cellule trattate con shShank3 Shank3r (*p<0,05 test di Dunn). I dati sono presentati come media ± SEM.

Figura 11. La riduzione dell’espressione (knock-down) di Shank3 riduce la modulazione indotta da DHPG dell’attività della rete corticale. (A) Registrazioni rappresentative con 60 elettrodi dell’attività di neuroni corticali di topo in coltura, prima e 5 minuti dopo l’applicazione di DHPG 100 µM. Ciascuna linea orizzontale corrisponde ad un elettrodo; i corti intervalli verticali corrispondono ai potenziali d’azione rilevati. La durata di ciascuna registrazione à ̈ di 30 secondi. Dopo l’applicazione di DHPG 100 µM, si verifica un maggiore incremento nel numero dei bursts nelle colture trattate con shCtrl in confronto alle colture trattate con shShank3. (B-E) Variazioni della firing rate media (B), bursting rate media (C), intra-burst firing rate (D) e della percentuale di impulsi out-burst (E) per elettrodi attivi dopo l’applicazione di DHPG a colture trattate con shCtrl e shShank3. In ciascuno dei riquadri B-E, la curva contrassegnata con a si riferisce a shCtrl e quella contrassegnata con b si riferisce a shShank3. Non vi erano differenze nell’attività di base fra i gruppi trattati con shCtrl e con shShank3. Pertanto, i valori dei parametri stimati nella condizione della linea di base sono stati fissati come il 100% per ciascuna coltura. L’analisi ANOVA a due vie con misure ripetute (concentrazioni di DHPG di 1 µM, 10 µM e 100 µM) ha messo in evidenza un effetto significativo di DHPG (p<0,01) ma non di shShank3 (p>0,1) o di shShank3 x DHPG (p>0,8) sulla firing rate media (B). Effetti significativi di DHPG (p<0,01) e shShank3 (p=0,05) sulla bursting rate media sono stati osservati in (C), e sono stati osservati effetti significativi di RNAi x DHPG (p<0,05) sulla intra-burst firing rate (D) e sulla % di impulsi out-burst (E). *p<0,05, **p<0,01, test t post hoc di Holm-Sidak, differenze significative fra colture trattate con shCtrl (n=10 colture) e con shShank3 (n= 7 colture). PARTE SPERIMENTALE

Materiali e Metodi

Coltura di neuroni ippocampali e reagenti chimici per gli esperimenti biochimici

Colture di neuroni ippocampali sono state preparate da embrioni di ratto di 18 o 19 giorni ottenuti da Charles River Laboratories. Neuroni ad alta densità (750-1000 cellule/mm<2>) e a media densità (150-200 cellule/mm<2>) sono stati piastrati e fatti crescere come descritto in Romorini et al., J Neurosci 2004; 24(42):9391-9404 impiegando B27 preparato in laboratorio. I neuroni sono stati piastrati su piastre da coltura tissutale a 6 pozzetti (Iwaki, Bibby Sterilin) o su vetrini coprioggetto da 18 mm e fatti crescere su piastre da coltura tissutale a 12 pozzetti (Iwaki, Bibby Sterilin). Le colture sono state infettate con lentivirus esprimente shRNA specifico per la luciferasi (shCtrl) o per Shank3 (shShank3) a 7 giorni in vitro (“giorni in vitro†abbreviato nel seguito come “DIV†) o sono state trasfettate usando un protocollo di precipitazione con fosfato di calcio secondo il protocollo descritto in Sala C et al., Neuron 2001; 31(1):115-130. Le cellule sono state trattate con DHPG (agonista dei recettori metabotropici del glutammato del del gruppo I) 100 µM, NMDA 100 µM, o KCl 50 mM a 15 DIV per 30 minuti. Per ridurre l’attività sinaptica endogena, à ̈ stata aggiunta alle colture tetrodotossina 2 µM 12 ore prima della stimolazione. Per gli esperimenti con CDPPB, i neuroni sono stati trattati per 12 ore con CDPPB 100 nM o 1 µM prima della stimolazione con DHPG.

Western blotting e anticorpi

I neuroni o le cellule COS-7 sono stati solubilizzati in tampone di Laemmli e caricati su gel SDS-PAGE al 6–12%. Le proteine sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa (BioRad) a 80 V per 120 minuti a 4°C. Gli anticorpi primari sono stati applicati overnight in tampone bloccante (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1% e polvere di latte scremato 3% o BSA). Gli anticorpi secondari (anti-topo, anti-coniglio o anti-capra o anti-porcellino d’india coniugati con HRP, GE Healthcare) sono stati usati alla diluizione 1:2000. Il segnale à ̈ stato rilevato utilizzando un sistema di rivelazione ECL (PerkinElmer Life Sciences). Per la quantificazione dei segnali dell’immunoblot, l’intensità totale della banda à ̈ stata misurata con il software ImageJ. Le intensità dei segnali delle proteine sono state normalizzate ad un segnale di actina o tubulina; l’intensità dell’immunoreattività ERK1/2 fosfospecifica à ̈ stata normalizzata al segnale ERK1/2 totale nella stessa corsa. Le variazioni dei livelli di proteine e della fosforilazione di ERK1/2 sono state confrontate con i livelli non trattati e sono state espresse come incremento o decremento di n-volte. I risultati sono espressi come media ± SEM.

Sono stati impiegati i seguenti anticorpi e le seguenti diluzioni (fonti in parentesi): anti-Shank3 di coniglio 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology); anti-Shank3 di porcellino d’india; anti-ERK 1/2 di coniglio 1:500, anti-pERK 1/2 di coniglio 1:500, anti-eEF2 di coniglio 1:1000 e anti-GFP di coniglio 1:500 (Cell Signaling Technology); antimGluR5 di coniglio 1:600 e anti-GluR2/3 di coniglio 1:250 (Millipore Bioscience Research Reagents); anti-GluR2 di coniglio 1:400, anti-Shank1 di topo 1:600, anti-Shank2 di topo 1:600, anti-Pan Shank di topo 1:600, anti-PSD95 di topo 1:10000 (NeuroMab, UC Davis/NIH NeuroMab Facility); anti-GKAP di coniglio 1:500 (donato da Morgan Sheng, Genentech); anti-sinaptofisina di topo 1:1000, anti-β-actina di topo 1:1000, e anti-α-tubulina di topo 1:1000 (Sigma-Aldrich).

Immunocitochimica

Per l’immunocolorazione, i neuroni sono stati fissati in paraformaldeide al 4% e saccarosio al 4% a temperatura ambiente, oppure in metanolo al 100% a –20°C. Gli anticorpi primari e secondari sono stati applicati in tampone GDB (tampone fosfato 30 mM, pH 7,4 contenente gelatina 0,2%, Triton X-100 0,5%, e NaCl 0,8 M) per 2 ore a temperatura ambiente oppure overnight a 4°C. I seguenti anticorpi e le seguenti diluizioni sono stati utilizzanti (origini in parentesi): anti-pERK di coniglio 1:100 (Cell Signaling Technology); anti-Pan Shank di topo 1:200 (NeuroMab, UC Davis/NIH NeuroMab Facility); anti-Shank3 di porcellino d’india; anti-GFP di topo 1:500 (Roche); e anticorpi secondari coniugati con FITC, Cy3 e Cy5 (Jackson ImmunoResearch).

RNA interference e plasmidi

Per l’inibizione del RNA basata su plasmide, oligonucelotidi Shank3 sono stati fatti appaiare e sono stati inseriti nei siti HindIII/BglII del vettore pLVTHM per la produzione del lentivirus. Sono state usate sequenze di siRNA dirette contro l’mRNA di Shank3 di ratto (GenBank numero di accesso NM_021676): 5’GGAAGTCACCAGAGGACAAGA3’. I costrutti Shank3 rescue (Shank3r), R87C (Shank3R87Cr) e InsG (Shank3InsGr) resistenti all’interferenza da parte dell’siRNA sono stati generati cambiando sei nucleotidi nel sito bersaglio del siRNA, senza modificare la sequenza aminoacidica della proteina. I mutanti Shank3 R87C e InsG sono stati descritti in Durand CM et al., Nat Genet 2007; 39(1): 25-27.

Misurazione della morfologia delle spine dendritiche e della fosforilazione di ERK1/2

I neuroni sono stati cotrasfettati con un vettore di siRNA e DsRed ad un rapporto di 2:1 (7,5 µg di DNA totale/pozzetto in piastre da 12 pozzetti) a DIV 7 e sono stati fissati a DIV 18. Alcuni neuroni trasfettati marcati sono stati scelti a caso per la quantificazione in almeno quattro esperimenti indipendenti per ciascun costrutto.

Immagini con focali di 1024 × 1024 pixels sono state ottenute con un microscopio confocale LSM 510 Meta (Carl Zeiss, donato dalla Fondazione Monzino) e con un obiettivo 63× (apertura numerica 1,4) con acquisizione sequenziale. Ciascuna immagine era una proiezione di una serie Z di 7–15 immagini, ciascuna mediata 2 a 4 volte e presa ad intervalli di profondità di 0,4–0,7 µm. Le misurazioni morfometriche sono state realizzate usando il software di analisi delle immagini MetaMorph (Universal Imaging). Alcuni singoli dendriti sono stati selezionati a caso e le loro spine sono state tracciate manualmente. La lunghezza massima e la larghezza della testa di ciascuna spina sono state misurate ed archiviate automaticamente.

Per studiare la fosforilazione di ERK1/2, i neuroni sono stati trasfettati con i vettori pEGFP, Shank3r, Shank3R87Cr, oppure Shank3InsGr da soli o in combinazione con Shank3 shRNA ad un rapporto di 1:2. I corpi cellulari sono stati tracciati manualmente utilizzando il software MetaMorph sul canale GFP. L’intensità media del segnale fluorescente ottenuto con anticorpi contro pERK1/2 nei neuroni trasfettati à ̈ stata divisa per l’intensità media del segnale di pERK1/2 in neuroni adiacenti non trasfettati.

Colture cellulari per registrazioni patch clamp Colture primarie di neuroni ipocampali murini sono state preparate come descritto Dityatev, A. et al., 2000, Neuron, 26:207–217. Ippocampi ottenuti da topi C57BL6/J di 1 a 3 giorni sono stati dissezionati a 4°C ed i neuroni sono stati recuperati mediante digestione enzimatica con tripsina e dissociazione meccanica. Le cellule sono poi state piastrate ad una densità di 300/mm<2>in terreno neurobasale-A arricchito con gentamicina 5 µg/ml, supplemento B27 2%, FGF2 25 µg/ml e L-glutammina 0,5 mM (tutti da Invitrogen) su vetrini copri oggetto di vetro rotondi di 18 mm di diametro (Menzel-Glaser) rivestiti overnight con poli-L-lisina 100 µg/ml (Sigma-Aldrich) e laminina 40 µg/ml (Sigma-Aldrich). Le colture sono state mantenute a 37°C in un incubatore umidificato con 95% O2e 5% CO2. A partire dal terzo giorno in coltura, il terreno à ̈ stato arricchito con AraC 0,5 µM (Sigma-Aldrich) per impedire la proliferazione delle cellule gliali. Il terreno à ̈ stato cambiato due volte la settimana.

Infezione e trasfezione di neuroni

I neuroni ippocampali primari sono stati infettati a DIV 6–8 con lentivirus esprimenti GFP (shCtrl) oppure GFP più shRNA per ridurre (knockdown) l’espressione di Shank3 (shShank3) e sono stati utilizzati per esperimenti effettuati a DIV 13-15. Per gli esperimenti di ripristino (rescue), i neuroni infettati sono stati trasfettati a DIV 11 con pcDNA3 (Mock) oppure Shank3 resistente a shShank3 (Shank3r). Un vettore esprimente una proteina fluorescente rossa tdTomato,à ̈ stato cotrasfettato in questi esperimenti per permettere l’identificazione dei neuroni trasfettati. Una modificazione del metodo di precipitazione con fosfato di calcio à ̈ stata utilizzata per la trasfezione (Jiang M et al., Nat Protoc 2006; 1(2):695-700). In breve, le colture neuronali sono state incubate con il precipitato DNA-fosfato di calcio per circa 1,5 ore. Dopo l’incubazione, il precipitato à ̈ stato dissolto mediante incubazione per 15 minuti in un terreno che era stato preventivamente equilibrato in un incubatore con il 10% di CO2. Le piastre sono poi state riportate nel loro terreno condizionato originale e il giorno successivo à ̈ stata controllata l’espressione della proteina tdTomato. Le cellule sono state utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche 3-4 giorni dopo la trasfezione. Per il ripristino farmacologico della frequenza delle mEPSC, il modulatore allosterico di mGluR5 (CDPPB, 1 µM, disciolto in DMSO allo 0,1%) à ̈ stato applicato overnight a DIV 13 e durante le registrazioni delle mEPSC a DIV 14. Come veicolo di controllo à ̈ stato utilizzato DMSO allo 0,1%.

Registrazioni su cellule intere da colture ippocampali La registrazione su cellule intere da neuroni di tipo piramidale sono state ottenute come descritto in Moult PR, et al., J Neurosci 2006; 26(9): 2544-2554. Elettrodi con una resistenza nel campo fra 3-6 MOhm sono stati riempiti con una soluzione che conteneva CsMeSO4130 mM, NaCl 8 mM, Mg-ATP 4 mM, Na-GTP 0,3 mM, EGTA 0,5 mM, e HEPES 10 mM, pH 7,25. Le cellule sono state perfuse in modo continuo con soluzione salina tamponata con HEPES (HBS) con la seguente composizione in mM: 119 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 25 HEPES, 33 D-glucosio, 0,0005 tetrodotossina citrato (Tocris) e 0,05 picrotossina (Tocris), pH 7,35. L’osmolarità di HBS à ̈ stata regolata a quella del terreno di coltura nel giorno della registrazione. L’osmolarità della soluzione dell’elettrodo era di 10 mOsm meno quella di HBS. DHPG (100 µM, Tocris) à ̈ stato applicato mediante aggiunta ad HBS. Per impedire qualsiasi contributo di LTD dipendente da recettore NMDA e quindi suscitare una LTD dipendente da mGluR pura, APV 50 µM (Sigma) à ̈ stato applicato insieme a DHPG o applicato da solo come controllo. I dati sono stati digitalizzati a 10 kHz. La registrazione continua delle EPSC à ̈ stata realizzata utilizzando un amplificatore patch clamp EPC10 USB ed il software PA-TCHMASTER (HEKA Elektronik). La rilevazione e le misurazioni delle mEPSCs, che sono state raccolte nell’arco di un periodo di 3 minuti, sono state effettuate utilizzando il software MiniAnalysis (Synaptosoft, Leonia, NJ) dopo aver filtrato le tracce a 1 kHz e utilizzando una soglia di rivelazione di 6 pA (cioà ̈ oltre quattro volte la deviazione standard del rumore di fondo) e verifica visiva di tutti gli eventi rilevati. Sono state analizzate solo le cellule con una corrente di perdita minore di -100 pA.

Colorazione immunofluorescente e imaging di neuroni ippocampali

Per stimare l’espressione sulla superficie cellulare della subunità GluR1 dei recettori AMPA e la sua downregolazione da parte di DHPG, colture non trattate oppure trattate con DHPG sono state brevemente lavate con PBS e incubate con un anticorpo contro un epitopo extracellulare della subunità GluR1 (Alomone Labs,agc-004, 16 µg/ml) per 15 minuti a 37°C. Per il trattamento, à ̈ stato aggiunto al mezzo di coltura o DHPG 100 µM APV 50 µM oppure APV 50 µM da solo, per 10 minuti a 37°C. Dopo l’applicazione dell’anticorpo contro GluR1, le colture sono state fissate con formaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente (RT, 20– 22°C). Anticorpo anti-coniglio coniugato con Alexa 546 (Invitrogen) à ̈ stato applicato in condizioni non permeabilizzanti per 1 ora a RT. Gli esperimenti e le analisi successive sono stati effettuati in cieco dal momento che lo sperimentatore non sapeva quale coltura fosse stata trattata con DHPG oppure con veicolo. Per le misurazioni della superficie sinaptica, tutte le immagini sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale Leica TCS SP5 e un obiettivo ad immersione in olio x60 a una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. L’analisi quantitativa à ̈ stata effettuata utilizzando una proiezione di una serie Z di cinque immagini prese a intervalli di profondità di 0,8 µm. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando il software NIH ImageJ. La soglia di rivelazione di aggregati fluorescenti positivi per GluR1 à ̈ stata fissata a due volte il livello della fluorescenza di fondo ottenuto da una regione con fluorescenza diffusa all’interno dell’albero dendritico. Sono stati contati solo gli aggregati che si trovavano lungo ramificazioni dendritiche secondarie; le regioni in cui l’identificazione dei processi neuronali era ambigua sono state escluse dalla quantificazione. Per la quantificazione, à ̈ stato usato il numero di aggregati immunoreattivi per GluR1 per una lunghezza dendritica di 100 µm all’interno di un certo campo. Le misurazioni ottenute da 15-25 dendriti corrispondenti ad una condizione (cioà ̈ shCtrl oppure shShank3, prima o dopo DHPG) da ciascuna preparazione di coltura sono state mediate ed i valori di quattro preparazioni indipendenti sono stati utilizzati per il confronto statistico fra i gruppi effettuato con l’analisi ANOVA a due vie ed il test t per dati appaiati.

Registrazioni e analisi con array di microelettrodi Gli array di microelettrodi (Multichannel Systems, MCS, Reutlingen, Germania) consistevano di 60 elettrodi planari circolari di TiN/SiN (diametro 30 µm, distanza interelettrodo misurata fra i centri 200 µm) disposti in una griglia quadrata 8×8 escludendo gli angoli). Neuroni corticali dissociati da topi P1 C57BL6/J sono stati preparati e piastrati. Le colture sono state infettate a DIV 8-10, come descritto sopra. L’attività di tutte le colture à ̈ stata registrata utilizzando il sistema MEA60 (MCS). Dopo amplificazione 1200x, i segnali sono stati campionati a 10 kHz ed acquisiti attraverso la scheda di acquisizione dati e il software MC_Rack (MCS). Per ridurre lo stress termico sulle cellule durante l’esperimento, i MEA sono stati tenuti a 37°C tramite un termostato controllato (MCS) e coperti con coperchi di polidimetilsilossano flessibili, per evitare l’evaporazione ed impedire le variazioni di osomolarità. E’ stata effettuata una sessione di registrazione per coltura. La sessione includeva 30 minuti di registrazione della linea di base in assenza di DHPG e tre registrazioni consecutive di 30 minuti in presenza di DHPG 1 µM, 10 µM e 100 µM. Gli ultimi 20 minuti di ciascun episodio sono stati analizzati per escludere la parte iniziale delle registrazioni, durante la quale l’attività neuronale poteva essere stata influenzata da disturbi meccanici causati dall’iniezione del farmaco. Solo le colture in cui più del 70% di espressione di Shank3 veniva eliminata sono state incluse nelle analisi.

L’analisi dei dati à ̈ stata effettuata offline utilizzando un software personalizzato, SPYCODE, sviluppato in MATLAB© (The Mathworks, Natick, MA, USA) (Bologna LL et al., Neuroscience 2010; 165(3):692-704); questo software comprende una serie di strumenti per l’elaborazione di registrazioni neurali multicanale. I dati sono stati importati in MATLAB da file .mcd (formato MCS), e gli impulsi (spikes) sono stati rilevati utilizzando l’algoritmo Precise Timing Spike Detection (PTSD) (Maccione A et al., J Neurosci Methods 2009; 177(1):241-249). I treni di impulsi sono stati analizzati utilizzando un metodo personalizzato di rivelazione di burst di impulsi (Pasquale V et al., J Comput Neurosci 2010; 29(1-2):213-219), i cui parametri sono stimati direttamente dalla distribuzione degli intervalli tra gli impulsi di ciascun canale. Dopo la procedura di rivelazione dei burst di impulsi, sono state estratte parecchie misure che descrivono le statistiche degli impulsi e dei burst di impulsi; queste includevano la firing rate media, la bursting rate media, la durata media del burst, la frequenza media intraburst (impulsi/secondo) e la percentuale e la frequenza degli impulsi out-burst, cioà ̈ gli impulsi non inclusi nei burst rispetto al totale). Per la valutazione statistica degli effetti di DHPG e di shShank3 à ̈ stato usata l’analisi ANOVA a due vie, con misure ripetute, seguita dal confronto fra gruppi a due a due con il test di Holm-Sidak.

Risultati

Per comprendere il ruolo di Shank3 nella formazione e nella funzione delle sinapsi, l’espressione di Shank3 à ̈ stata ridotta (knockdown) utilizzando la RNA interference. Espresso attraverso un vettore lentivirale, l’shRNA di Shank3 (shShank3) riduceva fortemente i livelli di proteina Shank3 endogena e di mRNA di Shank3 endogeno, ma non quelli di altri membri della famiglia Shank in colture ippocampali in confronto ad un shRNA di controllo (shCtrl) (Figure 6A-C). La colorazione immunocitochimica con anticorpo Pan-Shank mostrava una riduzione di circa il 40% nella immunoreattività totale per Shank in lisato (Figure 6A-B) totale ottenuto da neuroni infettati con shShank3. E’ interessante notare che le bande specifiche per Shank3 hanno un peso molecolare minore di quello della banda superiore a 240 kD, che à ̈ probabilmente Shank1. Il numero di aggregati di sinaptofisina e PSD-95 non veniva modificato dal trattamento con shShank3 (Figure 1D-E). Un esperimento di rescue con uno Shank3 resistente all’shRNA (Shank3r) ha confermato la specificità di shShank3 (Figure 2, 7A e 10).

E’ stato proposto che Shank3 giochi un ruolo importante nell’assemblaggio del PSD e nella formazione delle sinapsi eccitatorie tramite le sue interazioni multiple proteina-proteina. Conseguentemente, i presenti inventori hanno analizzato l’effetto dell’eliminazione dell’espressione di Shank3 sulla composizione proteica delle sinapsi eccitatorie utilizzando lisati totali di sinaptosomi ottenuti da colture ippocampali infettate con shShank3 o shCtrl.

Tramite immunoblotting con un anticorpo specifico per Shank3, gli inventori hanno confermato una forte riduzione della proteina Shank3 nel lisato totale e nella frazione sinaptosomiale dei neuroni infettati con shShank3 (Figure 1A, C). L’espressione di svariati recettori del glutammato, proteine dello scaffold e molecole di segnalazione à ̈ stata misurata mediante immunoblotting (Figura 1B). Nei neuroni infettati con shShank3 c’era una riduzione significativa di mGluR5 sia nel lisato totale sia nella frazione sinaptosomiale (media ± SEM per l’intensità normalizzata nel lisato totale: 0,58±0,03; nella frazione sinaptosomiale: 0,37±0,05, p>0,01, test t di Student). Pertanto, il livello di recettore mGluR5, che si lega direttamente a Shank3, era ridotto nei neuroni infettati.

Nelle stesse preparazioni, gli inventori non hanno osservato alcuna differenza significativa nei livelli di molte altre proteine che sono note per essere associate con le sinapsi e/o il PSD, ivi inclusi i recettori NMDA e AMPA, PSD-95 e IRSp53 (Figure 1A e B). Era invariato anche il livello totale di proteine GKAP e Homer, che possono interagire direttamente con Shank3. La riduzione di mGluR5 non era dipendente dal decremento dell’espressione dell’mRNA misurata mediante RT-PCR (Figura 7B).

Era stato precedentemente mostrato che l’inibizione dell’espressione di Shank3 da parte del shRNA in neuroni ippocampali riduce il numero di spine dendritiche (Roussignol et al., 2005 citato in precedenza). La riduzione del numero di spine viene confermata. Il numero di spine viene ridotto da 4,9 ± 1,0 per dendriti di 10 µm in neuroni infettati con GFP a 3,1 ± 0,2 per dendriti di 10 µm in neuroni infettati con shShank3 (Figura 8A). In neuroni infettati con shShank3 la larghezza delle spine viene significativamente ridotta e la lunghezza significativamente incrementata, il che suggerisce che le spine rimanenti sono più piccole e più immature (Figura 8B).

L’attivazione dei recettori mGluRs del gruppo I può portare ad una forma di LTD (mGluR-LTD) che richiede una rapida traduzione del mRNA dendritico preesistente e che coinvolge molte molecole di segnalazione, incluse ERK1/2 e CREB. Pertanto, gli inventori hanno misurato la fosforilazione di ERK1/2 e CREB in risposta all’applicazione di DHPG, un agonista specifico dei recettori metabotropici del glutammato di gruppo I. La stimolazione con DHPG 100 µM induceva una riduzione specifica della fosforilazione di ERK1/2 e CREB, mentre la stimolazione con NMDA o la depolarizzazione tramite KCl non induceva una riduzione (Figure 2A-B). La riduzione della fosforilazione di ERK1/2 indotta da DHPG nei neuroni trasfettati con shShank3 veniva controbilanciata dalla overespressione di Shank3 resistente a shShank3 (Figure 2C-D). Gi inventori hanno anche osservato che la riduzione della fosforilazione di ERK1/2 indotta da DHPG in questi neuroni poteva essere controbilanciata dall’overespressione di mGluR5 completo ma non dall’overespressione di due mutanti Shank3 resistenti a shShank3, denominati Shank3R87Cr e Shank3InsGr, che sono stati trovati in pazienti con autismo (Figure 9A-B.

Per studiare ulteriormente se la carenza di Shank3 influisca sulla trasmissione sinaptica a livello delle sinapsi glutamatergiche, sono state registrate le mEPSC in neuroni di tipo piramidale esperimenti GFP in colture trattate con shShank3 e shCtrl. La riduzione dell’espressione (knock-down) di Shank3 riduceva fortemente la frequenza delle mEPSC, ma non vi era un’influenza né sulla loro ampiezza né sul loro andamento nel tempo (Figure 3A-E). La riduzione osservata della frequenza delle mEPSC nelle colture trattate con shShank3 à ̈ coerente con l’incremento osservato della frequenza delle mEPSC quando Shank3 à ̈ overespresso in neuroni del cervelletto privi di spine. La riduzione della frequenza delle mEPSC nelle colture oggetto di studio poteva essere impedita mediante trasfezione di neuroni trattati con shShank3 con la forma resistente a shShank3 di Shank3, confermando la specificità del trattamento con shShank3 (Figure 10A-B).

L’attivazione di mGluR5 poteva portare a una LTD postsinaptica che à ̈ mediata da una ridotta espressione sinaptica di recettori AMPA. Per studiare le conseguenze funzionali della carenza di Shank3 per la plasticità sinaptica dipendente da mGluR5, gli inventori hanno stimolato colture trattate con shShank3 e shCtrl con DHPG 100 µM. Come riportato precedentemente con riferimento ai neuroni coltivati non infettati, DHPG induceva LTD (depressione a lungo termine) nella frequenza delle mEPSC in neuroni infettati con il lentivirus di controllo. Tuttavia, la riduzione (knock-down) dell’espressione di Shank3 indeboliva la depressione a lungo termine (LTD). Gli inventori hanno anche trovato che il trattamento con shShank3 indeboliva la downregolazione indotta da DHPG del numero di aggregati immunoreattivi per GluR1 sulle membrane plasmatiche dei dendriti (Figure 4E-F); una simile sottoregolazione à ̈ stata riportata in relazione ai neuroni coltivati non infettati. In aggiunta, la densità degli aggregati immunoreattivi per GluR1 in condizioni basali, cioà ̈ in neuroni senza trattamento con DHPG, era minore nelle colture trattate con shShank3 rispetto ai controlli. Questa osservazione corrobora la riduzione osservata della frequenza delle mEPSC in colture trattate con shShank3 in condizioni basali.

Per studiare gli effetti funzionali della carenza di Shank3 a livello della rete neurale, gli inventori hanno effettuato delle registrazioni multisito dell’attività neuronale utilizzando degli array multielettrodo (Figura 11A). Non à ̈ stata osservata alcuna differenza tra le colture trattate con shShank3 e con shCtrl in condizioni basali (Figura 11B). Tuttavia, la modulazione dell’attività della rete indotta da DHPG era più pronunciata nelle colture trattate con shCtrl che in quelle trattate con shShank3. In termini di spiking rate totale in tutti i canali attivi, c’era solo una tendenza verso una minore attività nelle colture trattate con shShank3 (Figura 11B). Tuttavia, il numero di burst e impulsi out burst era aumentato maggiormente da DHPG nei controlli rispetto alle colture trattate con shShank3 (Figure 11C, E). Inoltre, dopo l’eliminazione dell’espressione di Shank3 non era presente una riduzione indotta da DHPG nella frequenza di spiking all’interno dei burst. Presi nel loro complesso, questi dati suggeriscono che la segnalazione dei recettori metabotropici del glutammato di tipo I viene indebolita dalla riduzione (knock-down) dell’espressione di Shank3, come conseguenza di una riduzione della proteina mGluR5 a livello delle sinapsi.

Per studiare se le riduzioni indotte da DHPG nella fosforilazione di ERK1/2 e nella frequenza delle mEPSC fossero dovute ad una diminuzione del’attività di mGluR5 nelle colture trattate con shShank3, gli inventori hanno aumentato farmacologicamente l’attività di mGluR5 utilizzando CDPPB come modulatore positivo di questo recettore. Un trattamento overnight con CDPPB ripristinava la frequenza delle mEPSC (Figure 5A, B). Segnatamente, à ̈ anche stato trovato che la fosforilazione indotta da DHPG delle ERK1/2 nei neuroni infettati con shShank3 veniva ripristinata tramite un trattamento overnight con CDPPB (Figure 5C, D). Questi dati suggeriscono che la segnalazione dei recettori metabotropici del glutammato di tipo I che viene alterata dall’eliminazione dell’espressione di Shank3 può essere ripristinata tramite trattamento con un modulatore allosterico positivo del recettore, quale CDPPB.

Discussione

Gli inventori hanno studiato il ruolo di Shank3 nella funzione sinaptica per comprendere meglio la patogenesi dei sintomi neurologici di pazienti affetti dalla sindrome di Phelan-McDermid. A questo scopo, gli inventori hanno specificamente ridotto (knock-down) l’espressione di Shank3 nei neuroni, utilizzando shRNA. Shank3 à ̈ una grossa proteina multidominio dell’impalcatura strutturale della densità postsinaptica che appartiene ad una famiglia di proteine codificate da tre geni, SHANK1, SHANK2, and SHANK3. Anche se le proteine codificate da questi tre geni sono strutturalmente simili, diverse evidenze suggeriscono che la loro funzione sia differente, sia per quanto riguarda le proprietà di targeting alle sinapsi, sia per quanto riguarda i partner di legame. Per esempio, la sovraespressione di Shank1 induce la maturazione delle spine dendritiche senza incrementare il numero di spine, mentre la sovraespressione di Shank3 induce la formazione di nuove sinapsi e nuove spine dendritiche. Il targeting di Shank1 alle sinapsi dipende dal dominio PDZ mentre il targeting di Shank2 e Shank3 dipende dal dominio C-terminale che include il dominio SAM. Shank2 e Shank3 multimerizzano a formare una struttura nella densità postinaptica (PSD) che dipende dal legame di ioni Zn<2+>al dominio SAM. Al contrario, Shank1 non lega ioni Zn<2+>ma forma un grosso complesso strutturale con Homer nella densità postsinaptica (PSD).

La funzione specifica delle proteine Shank nelle spine dendritiche à ̈ probabilmente correlata al fatto che queste proteine si legano direttamente o indirettamente, attraverso il legame con Homer, a numerose proteine che sono coinvolte nel rimodellamento dell’actina, quale la cortactina, Abp1, IRsP53 e SPIN90 oligofrenina e CdC42. I dati disponibili suggeriscono che le proteine Shank leghino funzionalmente i recettori del glutammato al citoscheletro, regolando così le dimensioni e la forma delle sinapsi eccitatorie e delle spine dendritiche. Shank2 e Shank3 possono anche legarsi a Ab1 e LAPSER1, due proteine che si muovono dalla densità postsinaptica al nucleo in maniera dipendente dall’attività e inducono la trascrizione e la traduzione dei geni. Infine, il fatto che semplici delezioni di SHANK3 o SHANK2, ma non di SHANK1, siano state chiaramente dimostrate essere implicate nella patogenesi del ritardo mentale, dell’autismo e, più recentemente, della schizofrenia, suggerisce che le tre proteine possano svolgere differenti funzioni che non possono compensare reciprocamente.

I presenti inventori hanno trovato che la riduzione (knock-down) dell’espressione di Shank3 indebolisce specificamente la segnalazione attraverso mGluR5 a livello delle sinapsi. Nei neuroni in cui vi à ̈ knock-down di Shank3, la quantità di proteina mGluR5 - ma non del suo mRNA - à ̈ specificamente ridotta nel lisato totale e nei sinaptosomi, suggerendo che Shank3 sia in qualche modo coinvolta nella stabilizzazione della proteina mGluR5. Lavori precedenti avevano mostrato che mGluR5 si lega a Shank3 o direttamente o indirettamente attraverso Homer. Tuttavia, poiché i presenti inventori non hanno osservato alcuna variazione nell’espressione di Homer, à ̈ possibile che in questo fenomeno sia coinvolto il legame diretto di Shank3 a mGluR5. Sia Shank3 sia mGluR5 possono essere degradati dai proteosomi dopo ubiquitinazione, il che suggerisce che la loro interazione può modulare reciprocamente la loro ubiquitinazione e stabilizzazione. Tuttavia gli inventori non hanno osservato alcun cambiamento nell’espressione della proteina Shank3 nei topi knock-out in cui era stata eliminata l’espressione di mGluR5. Pertanto Shank3 potrebbe agire come piattaforma di stabilizzazione per mGluR5. E’ stato recentemente riportato che in topi knock-out in cui era stata eliminata l’espressione di Densina-180, la proteina mGluR5 e la segnalazione sono danneggiati a livello delle sinapsi. In particolare, Densina-180 si lega a Shank3 e potrebbe legare Shank3 a mGluR5 stabilizzando il complesso a livello delle sinapsi.

Gli inventori hanno anche osservato una riduzione nell’espressione di GluR1 alla superficie cellulare in neuroni trattati con shShank3 senza una riduzione della sua espressione proteica. La riduzione dell’espressione di GluR1 alla superficie cellulare correla con la ridotta frequenza delle mEPSC. La ridotta LTD dipendente da DHPG osservata in neuroni trattati con shShank3 correla con la mancanza di variazioni nell’espressione di GluR1 alla superficie cellulare, che viene ridotta da DHPG nel controllo. Poiché gli inventori hanno trovato che CDPPB, un agonista allosterico di mGluR5, à ̈ capace di ripristinare la frequenza delle mEPSC in neuroni in cui l’espressione di Shank3 era stata ridotta (knock-down), questi dati suggeriscono che Shank3 regoli il traffico a livello del recettore AMPA in maniera dipendente da mGluR5. Una riduzione dell’espressione di GluR1 alla superficie cellulare e una riduzione della frequenza di mEPSC dopo knock-down di Shank3 può riflettere un indebolimento del reclutamento sinaptico dipendente dall’attività dei recettori AMPA tramite l’attività basale.

Nonostante la riduzione osservata nella frequenza delle mEPSC e nell’espressione di aggregati positivi per GluR1 alla superficie cellulare in neuroni trattati con shShank3, le registrazioni multielettrodo non hanno rivelato alcun cambiamento significativo nei pattern di impulsi dei neuroni in condizioni basali. Ciò non à ̈ sorprendente, poiché la connettività tra i neuroni in coltura à ̈ altamente ridondante. Pertanto, nonostante le differenze di attività sinaptica osservate tra il controllo e i neuroni knock-down per Shank3 in colture trattate con tetrodotossina, i potenziali post sinaptici compositi potrebbero ben eccedere la soglia per la generazione di impulsi in queste cellule in assenza di tetrodotossina. L’applicazione di DHPG a neuroni coltivati porta a un forte incremento della bursting rate, come precedentemente riportato per le sezioni ippocampali. E’ importante l’osservazione che l’incremento indotto da DHPG del bursting viene ridotto nei neuroni knock-down per Shank3. Questo risultato conferma l’importanza di Shank3 nella regolazione della segnalazione dipendente da mGluR5 in condizioni fisiologiche, cioà ̈ in assenza di tetrodotossina. Questo risultato dimostra inoltre la potenziale importanza di Shank3 nella formazione dell’attività della rete neurale indotta dall’attività di mGluR5.

Nel loro complesso, i dati ottenuti dai presenti inventori suggeriscono che la perdita di Shank3 a livello delle sinapsi compromette specificamente la segnalazione di mGluR5. Inoltre, l’espressione di forme mutate di Shank3 che mimano le mutazioni osservate in pazienti autistici non à ̈ in grado di ripristinare la fosforilazione di ERK1/2 dipendente da DHPG. Pertanto, sia la riduzione dell’espressione di Shank3 (che si verifica nella sindrome 22q13/Phelan-McDermid), sia le mutazioni Shank3 (che si ritrovano in alcuni pazienti autistici), potrebbero indurre alterazioni nella segnalazione di mGluR5 a livello delle sinapsi.

E’ stato trovato che il recettore mGluR5 svolge un ruolo importante nella plasticità sinaptica. E’ stato chiaramente dimostrato che l’antagonismo o la delezione genetica di mGluR5 danneggiano sia l’acquisizione sia l’estinzione dei compiti di apprendimento dipendenti dall’ippocampo, quali il labirinto a bracci radiali e il labirinto acquatico di Morris, danneggiando sia la fase tardiva del potenziamento a lungo termine ippocampale, sia la depressione a lungo termine dipendente da mGluR. Il verificarsi di una depressione a lungo termine dipendente da mGluR in CA1 dipende sia dalle vie di ERK sia dalla via di PI3K mTOR. E’ stato dimostrato che mGluR-LTD svolge un ruolo nella formazione della memoria di riconoscimento degli oggetti.

L’esistenza di un legame tra mGluR-LTD e disturbi cognitivi à ̈ suggerita dall’osservazione, nel modello murino dell’X fragile, che mGluR-LTD à ̈ alterata sia nell’ippocampo che nel cervelletto. Questi risultati hanno portato allo sviluppo di nuove terapie per questa sindrome che agiscono su mGluR5. Contrariamente alle osservazioni effettuate dai presenti inventori nei neuroni knock-down per Shank3, mGluR5-LTD à ̈ aumentata nel modello murino della sindrome dell’X-fragile. Questo incremento si verifica perché in assenza di FMRP, come nella sindrome dell’X fragile, vi à ̈ una perdita della repressione traduzionale allo stato stazionario, che porta ad un aumento degli mRNA bersaglio di FMRP ed a un conseguente incremento dei livelli di espessione di proteine, come la proteina associata al citoscheletro regolata dall’attività (ARC) che può aumentare l’entità di LTD.

E’ interessante il fatto che l’uso di antagonisti di mGluR5 o di una riduzione genetica di mGluR5 (in topi che sono eterozigoti per mGluR5) può revertire fenotipi multipli in topi con una deficienza di FMR1, un gene codificante per FMRP. Questi fenotipi includono una aumentata densità delle spine dendritiche e deficit nella plasticità esperienza dipendente e apprendimento dipendente nell’ ippocampo e nella corteccia visiva.

In base a questi risultati, gli inventori hanno condotto esperimenti per verificare se l’attività ridotta di mGluR5 in neuroni knock-down per Shank3 potesse essere ripristinata con un agonista allosterico di mGluR5, quale CDPPB, ed hanno trovato che sia la fosforilazione di ERK1/2 sia la frequenze delle mEPSC veniva ripristinata con un trattamento overnight con CDPPB. CDPPB ha la capacità di penetrare nel cervello e di revertire i deficit di attività locomotoria e i deficit di inibizione di prepulse indotti dalle anfetamine in ratti, due modelli che sono sensibili al trattamento con farmaci antipsicotici. Questi risultati dimostrano che la modulazione allosterica di mGluR5 produce effetti comportamentali e suggeriscono che tale modulazione costituisca un approccio perseguibile all’incremento dell’attività di mGluR5 in vivo.

In conclusione, questi risultati aprono nuove possibilità di trattamento farmacologico di pazienti affetti da delezioni e mutazioni del gene Shank3, in particolare la delezione 22q13 che causa la sindrome di Phelan-McDermid.

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Modulatore allosterico positivo di mGluR5, per l’impiego nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermid.
2. 2. Modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego secondo la rivendicazione 1, per il trattamento terapeutico delle disfunzioni cognitive della sindrome di Phelan-McDermid.
3. 3. Modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego secondo la rivendicazione 1 o 2, che à ̈ scelto dal gruppo che consiste di ADX-47273, CPPHA, VU-29, VU-36, VU-1545, DFB (1-(3-fluorofenil)-N-((3-fluorofenil)metilideneamino)metanimina) e CDPPB (3-ciano-N-(1,3-difenil-1-H-pirazol-5-il)benzamide) e qualsiasi loro combinazione.
4. 4. Modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego secondo la rivendicazione 3, che à ̈ CDPPB (3-ciano-N-(1,3-difenil-1-H-pirazol-5-il)benzamide).
5. 5. Modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il trattamento terapeutico comprende somministrare ad un paziente affetto da sindrome di Phelan-McDermid una quantità terapeuticamente efficace di modulatore allosterico positivo di mGluR5, che à ̈ compresa nell’intervallo di 0,1 a 100 mg/kg di peso corporeo. 6. Modulatore allosterico positivo di mGluR5 per l’impiego secondo la rivendicazione 5, in cui il paziente à ̈ un essere umano.
6. 6. Composizione farmaceutica comprendente un modulatore allosterico positivo di mGluR5 ed eventuali eccipienti, veicoli e/o diluenti farmaceuticamente accettabili, per l’impiego nel trattamento terapeutico della sindrome di Phelan-McDermid secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.