ITTO20100486A1 - Procedimento di detossificazione di tessuto biologico - Google Patents

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ITTO20100486A1
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Marina Strasly
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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“Procedimento di detossificazione di tessuto biologicoâ€
TESTO DELLA DESCRIZIONE
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente descrizione concerne un procedimento per la detossificazione di un tessuto biologico destinato alla realizzazione di protesi biologiche, quali ad esempio protesi valvolari, preferibilmente protesi valvolari cardiache.
SFONDO TECNOLOGICO
Le protesi biologiche sono dispositivi medici la cui realizzazione si basa sull’impiego di tessuti animali di specie diverse, ad esempio, bovina, suina, ovina, o equina. Il tessuto biologico – in funzione dei diversi usi medici – può essere costituito da valvole cardiache, pericardio, tendini, legamenti, dura mater, pelle, vene, ecc.
I tessuti destinati alla realizzazione di protesi biologiche sono costituiti principalmente da collagene, una proteina la cui unità strutturale à ̈ rappresentata da tre catene polipeptidiche che si associano a formare una tripla elica. Le molecole di collagene si assemblano a formare microfibrille che a loro volta si assemblano a formare fibrille che, disposte in fasci ondulati o paralleli, danno origine alle vere e proprie fibre di collagene. Tali tessuti presentano una buona resistenza alla trazione, sono flessibili, ma sostanzialmente inestensibili.
Il tessuto destinato alla realizzazione di protesi biologiche viene preventivamente sottoposto a numerosi lavaggi per eliminare tracce di sangue e ad una accurata rimozione delle parti di grasso e delle parti legamentose. Cellule o residui di cellule dell’animale donatore possono tuttavia rimanere intrappolate nella struttura del tessuto stesso. In una situazione di questo genere à ̈, quindi, possibile che il sistema immunitario del ricevente dia origine ad un fenomeno di rigetto che può addirittura condurre alla distruzione del tessuto costituente la protesi biologica.
Ulteriore problema da affrontare nella realizzazione di protesi biologiche, à ̈ la degradazione a cui può andare incontro il tessuto biologico costituito da collagene una volta impiantato nell’organismo ricevente. I tessuti biologici vengono, pertanto, sottoposti ad un trattamento di fissazione che ha lo scopo di preservare il tessuto da tale fenomeno di degradazione e contribuire a evitare il fenomeno di rigetto sopra descritto.
Tra le sostanze utilizzate per fissare i tessuti biologici la più diffusa à ̈ la glutaraldeide. Questa molecola bifunzionale, recante due gruppi aldeidici, à ̈ in grado di legare stabilmente i gruppi amminici liberi degli amminoacidi che costituiscono le catene polipeptidiche del collagene sia all’interno di una molecola di collagene sia tra molecole di collagene adiacenti. In questo modo la glutaraldeide realizza strutture a ponte sia all’interno delle catene sia fra catene adiacenti dando origine ad un fenomeno di reticolazione del tessuto biologico. Tale reticolazione preserva il tessuto dalla degradazione da parte dell’ospite e conferisce buone proprietà meccaniche quale ad esempio una migliore resistenza alla trazione rispetto al tessuto non trattato.
La glutaraldeide à ̈ una sostanza ad elevato potere battericida e virucida; la fase di fissazione quindi oltre a originare la reticolazione del tessuto ne determina anche almeno una parziale sterilizzazione.
La glutaraldeide à ̈, inoltre, in grado di legarsi ai residui amminici liberi delle proteine di membrana delle componenti cellulari ancora presenti mascherandone il potenziale antigenico ed impedendo fenomeni di attivazione immunitaria e di rigetto da parte dell’ospite.
Nonostante l’uso ampiamente diffuso, la glutaraldeide presenta lo svantaggio di essere uno dei fattori che favoriscono il processo di calcificazione patologica dei tessuti impiantati. Il calcio, presente nei liquidi corporei dell’organismo ospite, si accumula sul tessuto protesico dando origine ad un processo che può rappresentare, per esempio nel caso delle valvole cardiache biologiche, una delle principali cause di rottura della valvola. I depositi di calcio possono, infatti, determinare una ridotta flessibilità delle porzioni di tessuto biologico costituenti la valvola (ovvero i cosiddetti lembi o cuspidi valvolari) e portare ad una lacerazione del tessuto stesso causando una parziale o totale riduzione della funzionalità della valvola.
Il meccanismo responsabile della calcificazione non à ̈ ancora completamente chiarito ed à ̈ imputabile a numerosi fattori ma à ̈ noto che, a seguito del processo di fissazione con glutaraldeide, gruppi aldeidici rimasti liberi sul tessuto possono creare siti di legame per il calcio.
Inoltre, la tossicità di tali residui aldeidici può determinare fenomeni infiammatori locali che sfociano nella necrosi delle cellule dell’ospite. La distruzione delle cellule conseguente alla loro morte dà origine alla formazione di detriti cellulari che, a loro volta, possono costituire siti di legame per il calcio.
Per limitare il processo di calcificazione dei tessuti sono state impiegate molecole di diverso tipo in grado di neutralizzare i residui aldeidici rimasti liberi dopo il procedimento di fissazione. Ad esempio, l’utilizzo di amminoacidi si à ̈ dimostrato avere un effetto anticalcificante; in particolare, US-A-5 873 812 descrive l’impiego di acidi ammino carbossilici, come ad esempio l’acido omocisteico, nella preparazione di tessuti biologici fissati con aldeidi.
Tale procedimento non à ̈, tuttavia, risolutivo poiché la neutralizzazione dei gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato à ̈ solamente parziale.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Tenendo in considerazione queste premesse, à ̈ quindi sentita la necessità di soluzioni migliorative, più efficaci che consentano di limitare la calcificazione del tessuto biologico dopo l’impianto nell’ospite.
In accordo con l’invenzione, il suddetto scopo à ̈ ottenuto grazie alla soluzione specificatamente richiamata nelle rivendicazioni allegate, che costituiscono parte integrale della presente descrizione.
La presente invenzione concerne un procedimento per il trattamento di un tessuto biologico destinato alla realizzazione di protesi biologiche, che comprende una fase di fissazione del tessuto ed una fase di detossificazione. In una forma di attuazione, il procedimento di trattamento di un tessuto biologico prevede le seguenti operazioni:
i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione contenente glutaraldeide, e
ii) detossificazione del tessuto biologico precedentemente fissato mediante trattamento con una soluzione contenente taurina.
I risultati riportati nel seguito mostrano che il procedimento qui descritto riduce fortemente il numero di gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato portando un evidente vantaggio rispetto al procedimento che prevede la detossificazione del tessuto mediante immersione in una soluzione contenente acido omocisteico.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L’invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato, a titolo di esempio non limitativo, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- Figura 1: Colorazione con fucsina di tessuti biologici detossificati secondo una forma di attuazione del procedimento qui descritto. Campione di controllo fissato e non detossificato (A); campione fissato e detossificato con una soluzione secondo la tecnica nota contenente acido omocisteico (B); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente taurina (C).
- Figura 2: Colorazione con fucsina di tessuti biologici detossificati con taurina secondo una diversa forma di attuazione del procedimento qui descritto.
Campione di controllo fissato e non detossificato (A); campione fissato e detossificato a temperatura ambiente (B); campione fissato e detossificato a 40°C (C); campione fissato e detossificato a 50°C (D).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE
L’invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato, a titolo di esempio non limitativo, con riferimento alla realizzazione di protesi biologiche valvolari cardiache. È evidente che il procedimento qui descritto può essere utilizzato per la detossificazione di qualsiasi altro tessuto biologico destinato alla realizzazione di altre protesi biologiche che impieghino ad esempio tendini, legamenti, dura mater, pelle, vene, ecc.
Nella seguente descrizione, sono presentati numerosi dettagli specifici per fornire una comprensione completa delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere attuate in pratica senza uno o più dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di oscurare certi aspetti delle forme di realizzazione.
In tutta la presente specificazione, il riferimento ad “una forma di realizzazione†o “forma di realizzazione†significa che una particolare configurazione, struttura, o caratteristica descritta in connessione con la forma di realizzazione à ̈ inclusa in almeno una forma di realizzazione. Quindi, la comparsa delle frasi “in una forma di realizzazione†o “in una certa forma di realizzazione†in vari siti nell’intera presente specificazione non fa necessariamente riferimento alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, le particolari configurazioni, strutture, o caratteristiche possono essere combinate in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione.
Le intestazioni qui presentate servono semplicemente per convenienza e non interpretano lo scopo o il significato delle forme di realizzazione.
La presente invenzione concerne un procedimento di trattamento di un tessuto biologico che consta di due fasi:
i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione contenente glutaraldeide, e
ii) detossificazione del tessuto biologico precedentemente fissato mediante trattamento con una soluzione contenente taurina.
La fase di fissazione prevede l’immersione del tessuto in una soluzione contenente glutaraldeide per un periodo variabile tra un minimo di 3 giorni e un massimo di 13 giorni. Con la fissazione viene realizzata la reticolazione del tessuto, che conferisce al tessuto resistenza alla degradazione e buone proprietà meccaniche.
La fase di detossificazione prevede l’immersione del tessuto precedentemente fissato in una soluzione contenente taurina per un periodo variabile tra un minimo di poche ore e un massimo di qualche giorno.
La taurina (anche nota come acido aminoetansolfonico) reca, infatti, un gruppo amminico (NH2) disponibile al legame con i gruppi aldeidici della glutaraldeide rimasti liberi dopo la fase di fissazione del tessuto. In particolare, à ̈ stato scoperto dai presenti inventori che l’impiego della taurina nella fase di detossificazione in luogo dell’acido omocisteico permette una maggiore efficacia nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici rimasti liberi dopo la fissazione con glutaraldeide, riducendo, quindi, in modo altamente efficace il numero dei siti di legame e accumulo di calcio presenti sul tessuto biologico.
I tessuti biologici destinati alla realizzazione di protesi biologiche valvolari cardiache, ovvero pericardio bovino, equino o eventualmente pericardio di altre specie animali o valvola porcina sono raccolti da macelli autorizzati e - trasportati in laboratorio - immersi in soluzione salina mantenuta in ghiaccio per evitare il danneggiamento del tessuto prima dell’impiego.
I tessuti vengono lavati con soluzione salina per eliminare eventuali tracce di sangue, separati dalle parti legamentose e adipose eventualmente adese, e poi accuratamente selezionati in base allo spessore e in base all’assenza di difetti evidenti quali disomogeneità di spessore, presenza di tagli, abrasioni, ecc.
I tessuti vengono inizialmente prefissati in una soluzione di glutaraldeide ad una concentrazione compresa tra 0,05% e 0,30%, preferibilmente pari a 0.20% v/v in tampone fosfato pH=7,4, per un intervallo di tempo variabile tra 3 e 13 ore a temperatura ambiente.
Alla prefissazione segue la fase di taglio e foggiatura del tessuto - secondo tecniche note nel settore - per la realizzazione, ad esempio, di valvole cardiache. Tale fase di lavorazione del tessuto à ̈ ininfluente ai fini della attuazione del procedimento oggetto della presente descrizione.
Segue il procedimento di fissazione realizzato immergendo il tessuto in una soluzione contenente glutaraldeide in concentrazione tra 0,10% v/v e 2,00%, preferibilmente tra 0,30% e 1,00%, più preferibilmente pari allo 0,50%.
La soluzione contenente glutaraldeide à ̈ preferibilmente costituita da una soluzione acquosa contenente un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, Hepes, borato, più preferibilmente di tipo fosfato.
Il pH della soluzione a base di glutaraldeide à ̈ compreso tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7,4.
Il procedimento di fissazione à ̈ condotto ad una temperatura compresa tra 4°C e 30°C, più preferibilmente a temperatura ambiente (20°C). Il periodo di esposizione del tessuto alla soluzione contenente glutaraldeide può variare tra 1 e 20 giorni, preferibilmente tra 3 e 13 giorni.
Dopo la fase di fissazione, il tessuto viene lavato al fine di rimuovere residui di glutaraldeide non coniugati al tessuto stesso. La soluzione di lavaggio à ̈ costituita da una soluzione salina o tampone fosfato pH=7-7,4 e viene sostituita tre volte. Il lavaggio viene effettuato per un periodo compreso tra 30 minuti e 6 ore, in blanda agitazione, a temperatura ambiente.
Il tessuto fissato viene quindi detossificato utilizzando una soluzione acquosa contenente taurina in una concentrazione compresa tra 0,10% p/v fino a saturazione della soluzione, preferibilmente tra 0,20% e 1,00%, più preferibilmente pari allo 0,70% p/v.
La soluzione acquosa di taurina contiene un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, Hepes, borato, più preferibilmente di tipo fosfato. Il pH della soluzione à ̈ compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7.
La fase di detossificazione viene condotta ad una temperatura compresa tra temperatura ambiente (20°C) e 50°C, preferibilmente tra 30°C e 45°C, più preferibilmente pari a 40°C. Il periodo di immersione del tessuto nella soluzione contenente taurina può variare tra 2 e 96 ore, preferibilmente tra 12 e 48 ore, più preferibilmente à ̈ pari a 24 ore.
Al termine della fase di detossificazione, il tessuto detossificato à ̈ sottoposto ad un lavaggio a temperatura ambiente, in tampone fosfato a pH=7, per circa tre ore, sostituendo tre volte la soluzione di lavaggio.
Il tessuto detossificato viene, infine, trasferito in una soluzione di conservazione priva di aldeidi in tampone fosfato pH=7 contenente conservanti, preferibilmente parabeni.
L’efficacia del procedimento qui descritto, e quindi l’avvenuta reazione tra i gruppi amminici della molecola detossificante e i gruppi aldeidici presenti sul tessuto fissato, viene valutata tramite colorazione dei gruppi aldeidici rimasti liberi. Maggiore à ̈ l’intensità della colorazione più numerosi sono i gruppi aldeidici liberi e, al contrario, più à ̈ debole o assente la colorazione meno numerosi o assenti sono i gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto detossificato. Un esempio di colorante vantaggiosamente utilizzabile per tale determinazione à ̈ la fucsina.
I risultati riportati nel seguito mostrano che la taurina lega più efficacemente rispetto all’acido omocisteico i gruppi aldeidici liberi presenti nel tessuto fissato. I presenti inventori hanno, inoltre, osservato che operando la fase di detossificazione ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente si ottengono risultati migliori, ovvero si riduce fortemente il numero di gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato.
Nel seguito verranno descritte in dettaglio diverse forme di attuazione preferite della presente invenzione.
Materiali e Metodi
Raccolta e fissazione del tessuto biologico
Il tessuto biologico, costituito da pezzi di pericardio bovino raccolti da macelli autorizzati, viene posto in una soluzione salina mantenuta in ghiaccio e trasportato in laboratorio.
I tessuti vengono lavati con soluzione salina per eliminare eventuali tracce di sangue, separati dalle parti legamentose e adipose eventualmente adese e selezionati in base al corretto spessore e all’assenza di difetti evidenti, come disomogeneità di spessore, presenza di vascolarizzazioni, tagli, abrasioni, ecc.
I tessuti vengono prefissati in una soluzione di glutaraldeide allo 0,20% v/v in tampone fosfato pH=7,4, per un tempo variabile tra 3 e 13 ore a temperatura ambiente.
Alla prefissazione segue la fase di taglio e foggiatura del tessuto - secondo tecniche note nel settore - per la realizzazione, ad esempio, di valvole cardiache. Successivamente i tessuti vengono fissati per un periodo compreso tra 3 e 13 giorni a temperatura ambiente, in una soluzione acquosa di glutaraldeide allo 0,50% v/v in tampone fosfato pH=7,4.
Detossificazione del tessuto
Il tessuto da detossificare viene lavato, per rimuovere i residui di soluzione di glutaraldeide, in soluzione salina o in tampone fosfato a pH=7,4 o pH=7, per circa tre ore, in blanda agitazione, a temperatura ambiente. Tale soluzione di lavaggio viene sostituita tre volte, utilizzando circa 300 ml di soluzione per ogni pezza di tessuto delle dimensioni di circa 10 x 5 cm ad ogni sostituzione.
Il tessuto fissato viene quindi detossificato utilizzando una soluzione acquosa contenente taurina in una concentrazione pari a circa 0,70% (p/v) in tampone fosfato a pH=7.
La fase di detossificazione viene condotta a temperatura ambiente (20°C), 40°C e 50°C, per un periodo di tempo pari a 24 ore, utilizzando circa 200 ml di soluzione per ogni tessuto.
Al termine della fase di detossificazione, il tessuto detossificato à ̈ sottoposto ad un lavaggio a temperatura ambiente, in tampone fosfato a pH=7, per circa tre ore, sostituendo tre volte la soluzione di lavaggio.
Il tessuto detossificato viene, infine, trasferito in una soluzione di conservazione priva di aldeidi in tampone fosfato pH=7 contenente conservanti, preferibilmente parabeni.
Al fine di dimostrare la migliore efficacia del trattamento di detossificazione con taurina rispetto alla tecnica nota, i presenti inventori hanno determinato semiquantitativamente il numero di gruppi aldeidici liberi di tre campioni di tessuto biologico trattati come segue:
- un primo campione di controllo (figura 1A) costituito da tessuto biologico fissato con glutaraldeide ma non detossificato;
- un secondo campione (figura 1B) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico in concentrazione pari a 1,00% (p/v) in tampone fosfato a pH=7;
- un terzo campione (figura 1C) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente taurina in concentrazione pari a 0,70% (p/v) in tampone fosfato a pH=7.
I campioni di tessuto sono stati immersi nelle soluzioni detossificanti per circa 24 ore a temperatura ambiente in blanda agitazione.
Per verificare l’efficacia del trattamento di detossificazione con taurina al variare della temperatura della soluzione detossificante, i presenti inventori hanno determinato semiquantitativamente il numero di gruppi aldeidici liberi di quattro campioni di tessuto biologico trattati come segue:
- un primo campione di controllo (figura 2A) costituito da tessuto biologico fissato con glutaraldeide ma non detossificato;
- un secondo campione (figura 2B) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente taurina ad una temperatura di 20°C;
- un terzo campione (figura 2C) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente taurina ad una temperatura di 40°C; e
- un quarto campione (figura 2D) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente taurina ad una temperatura di 50°C.
Il periodo di immersione dei campioni nella soluzione detossificante à ̈ di circa 24 ore in blanda agitazione sia a temperatura ambiente sia a 40°C; il quarto campione detossificato a 50°C à ̈ stato mantenuto in immersione per 7-8 ore, in blanda agitazione.
Vengono utilizzati circa 200 ml di soluzione detossificante per ogni campione.
Al termine del trattamento tutti i campioni vengono lavati a temperatura ambiente in tampone fosfato a pH=7, per circa tre ore, sostituendo tre volte la soluzione di lavaggio ed utilizzando circa 300 ml di soluzione per ogni campione ad ogni cambio.
Tutti i campioni vengono poi trasferiti in una soluzione tampone fosfato pH=7 contenente conservanti, preferibilmente parabeni.
Colorazione del tessuto con fucsina
La colorazione del tessuto, per rivelare i gruppi aldeidici liberi, utilizza una soluzione acida di pararosa anilina (fucsina). La colorazione sfrutta la formazione di legami tra i gruppi NH2del colorante e i gruppi aldeidici liberi sul tessuto.
La soluzione di trattamento di partenza à ̈ incolore e in presenza di gruppi aldeidici liberi sul tessuto sviluppa un colore violetto. Si tratta di una valutazione qualitativa della disponibilità di gruppi aldeidici liberi, dopo i diversi trattamenti.
I campioni da colorare vengono tagliati per ottenere tessere di dimensioni pari a circa 1,5 x 1,5 cm e successivamente immersi nella soluzione colorante, circa 10 ml, ciascuna tessera in una provetta separata.
La soluzione colorante à ̈ pararosaanilina idrocloruro al 1,00%, sodio metabisolfito al 4,00% in acido cloridrico 0,25 M. I campioni rimangono immersi nel colorante per 5 minuti a temperatura ambiente, in blanda agitazione.
Ciascun campione viene poi trasferito in una soluzione ottenuta miscelando 8 gr di Na2SO3e 30 ml di acido cloridrico al 37%, da portare ad un litro con acqua demineralizzata. I campioni rimangono immersi per 10 minuti in questa soluzione di lavaggio, in leggera agitazione.
Poi si procede a 2 successivi lavaggi da 10 minuti, in leggera agitazione in soluzione di lavaggio comprendente 700 ml di etanolo e 30 ml di acido cloridrico al 37%, da portare a un litro con acqua demineralizzata.
I lavaggi rimuovono il colorante legato in maniera aspecifica al tessuto. Si utilizzano circa 20 ml di soluzione di lavaggio ad ogni cambio.
Al termine i campioni sono trasferiti in tampone fosfato pH=7 e fotografati per documentarne la differente colorazione.
Spettroscopia in riflettanza
I campioni colorati vengono sottoposti a spettroscopia in riflettanza per valutare quantitativamente le differenti caratteristiche cromatiche della colorazione con fucsina.
La spettroscopia in riflettanza à ̈ una tecnica di indagine ottica basata sulla misura del fattore di riflettanza spettrale della superficie di un campione in funzione della lunghezza d’onda della radiazione incidente. Il parametro riflettanza à ̈ espresso come rapporto di intensità fra radiazione riflessa e radiazione incidente, in funzione dalla lunghezza d'onda.
Sono state effettuate misure di riflettanza alla lunghezza d’onda di 570 nm mediante uno spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 35 con sfera integratrice.
In una scala di valori, un valore di riflettanza più basso indica una colorazione del campione più intensa e al contrario un valore di riflettanza maggiore indica una debole intensità di colorazione.
Determinazione della temperatura di contrazione
La temperatura di contrazione à ̈ un indice del livello di reticolazione del tessuto fissato e viene determinata su rondelline di pericardio di circa 5 mm di diametro, utilizzando un calorimetro a scansione differenziale (DSC)Q100 TA Instruments con i seguenti parametri:
- flusso di azoto di 50 ml/min,
- rampa di riscaldamento di 5°C/min,
- intervallo di temperature tra 65°C e 95°C.
Risultati
Detossificazione
L’efficacia del procedimento qui descritto, e quindi l’avvenuta reazione tra i gruppi amminici della molecola detossificante e i gruppi aldeidici presenti sul tessuto fissato, viene dimostrata colorando con fucsina i gruppi aldeidici rimasti liberi. Una colorazione più intensa indica numerosi gruppi aldeidici liberi, al contrario, una colorazione debole o assente indica pochi o assenti gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto detossificato.
La figura 1 mostra una diversa intensità di colorazione di un campione detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico, campione B, e di un campione detossificato con una soluzione contenente taurina, campione C. Un campione non detossificato, campione A, presenta un colore viola intenso. L’intensità di colorazione del campione B à ̈ inferiore a quella del campione di controllo, ma la colorazione del campione C risulta essere molto debole se non assente.
Il numero di gruppi aldeidici liberi presenti sul campione esposto ad una soluzione contenente taurina à ̈ quindi decisamente inferiore rispetto a quello del campione non detossificato dopo la fissazione. Inoltre, il trattamento con taurina risulta significativamente più efficace di quello effettuato con acido omocisteico.
Queste osservazioni sono confermate dall’analisi di spettroscopia in riflettanza dei campioni. La riflettanza di ciascun campione dipende dall’intensità della colorazione e mediante un’analisi effettuata con uno spettrofotometro à ̈ possibile associare un valore percentuale di riflettanza a ciascun campione.
Un valore di riflettanza maggiore à ̈ associato a una debole intensità di colorazione e viceversa un valore di riflettanza minore à ̈ relativo ad una maggiore intensità di colorazione.
Come si può osservare dai risultati riportati in tabella 1, la riflettanza, analizzata alla lunghezze d’onda di 570 nm ed espressa in percentuale, presenta un valore pari a 6,5 per il campione non detossificato mostrato in figura 1A, un valore intermedio per il campione detossificato con acido omocisteico mostrato in figura 1B ed un valore decisamente più alto per il campione detossificato con la soluzione contenente taurina mostrato in figura 1C.
Tabella 1.
Campione<Colorazione>Riflettanza %
osservataa 570 nm
A - non detossificato<Viola molto>
intenso6,5
B - omocisteico
temperatura ambiente<Violetto 9,2>
C - taurina Violetto
temperatura ambiente pallido<13>
Questi risultati confermano che il trattamento con taurina ha una efficacia maggiore rispetto il trattamento con l’acido omocisteico nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato.
Con riferimento alla Figura 2, si può osservare come modificando le condizioni di temperatura a cui viene condotta la detossificazione dei campioni con la soluzione contenente taurina aumenti l’efficacia del trattamento. L’intensità di colorazione del campione detossificato a 40°C, campione C, à ̈ più debole rispetto a quella del campione detossificato a temperatura ambiente, campione B. Risultati ancora più evidenti sono ottenuti effettuando il trattamento detossificante ad una temperatura di 50°C; il campione D presenta, infatti, una colorazione decisamente meno intensa ad indicazione di un minor numero di gruppi aldeidici rimasti liberi, e quindi siti di legame e accumulo di calcio, rispetto agli altri trattamenti.
I risultati dell’analisi della spettroscopia in riflettanza per i campioni mostrati in figura 2 sono mostrati nella tabella 2. Il valore di riflettanza più alto, pari a 22, à ̈ relativo al campione caratterizzato da una intensità di colorazione quasi assente, ovvero il campione trattato con taurina a 50°C. Il campione non detossificato, che presenta una colorazione molto intensa, ha il valore di riflettanza minore. Il campione trattato con taurina a temperatura ambiente ha un valore più alto rispetto al controllo non detossificato ma più basso rispetto al campione trattato con taurina a 40°C.
Tabella 2.
Riflettanza % Campione<Colorazione>
osservataa 570 nm
A - non detossificato<Violetto>
molto inteso6,5
B - taurina Violetto
temperatura ambiente pallido<12>
C - taurina 40°C Rosa 17
D - taurina 50°C<Completamente>
decolorato22
Anche in questo caso i risultati della spettroscopia in riflettanza confermano che il trattamento con taurina presenta una maggiore capacità detossificante quando condotto ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente.
Temperature di contrazione
Per verificare che il trattamento detossificante non alteri la reticolazione del tessuto biologico ottenuta mediante immersione dello stesso in una soluzione contenente glutaraldeide, viene confrontata la temperatura di contrazione dei tessuti detossificati mediante trattamento con la soluzione contenente taurina con la temperatura di contrazione di un tessuto di controllo fissato e non detossificato.
La temperatura di contrazione dei tessuti immersi nella soluzione contenente taurina a temperatura ambiente o a 40°C non si discosta dalla temperatura di contrazione del tessuto non detossificato, essendo tali temperature pari a 85-86°C. Entrambi i trattamenti quindi non presentano effetti significativi sul livello di reticolazione del tessuto.
La temperatura di contrazione del tessuto immerso nella soluzione contenente taurina a 50°C rimane pari a quella del tessuto non detossificato (85-86°C) limitatamente a periodi di trattamento non superiori a 7-8 ore.
Fermo restando il principio dell'invenzione, i particolari e le forme di attuazione possono variare, anche in modo significativo, rispetto a quanto qui descritto ed illustrato a titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione, così come definito dalle rivendicazioni annesse.

Claims (7)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di trattamento di un tessuto biologico per protesi biologiche, detto procedimento comprendendo le fasi di: i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione contenente glutaraldeide, e ii) detossificazione del tessuto biologico fissato mediante trattamento con una soluzione contenente taurina.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta soluzione contenente taurina contiene taurina in una concentrazione compresa tra 0,10% p/v fino a saturazione, preferibilmente tra 0,20% e 1,00%, più preferibilmente pari a 0,70%.
  3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui detta soluzione contenente taurina contiene un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, Hepes, borato, più preferibilmente fosfato.
  4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta soluzione contenente taurina ha un pH compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7.
  5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di detossificazione à ̈ condotta a temperatura ambiente.
  6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui detta fase di detossificazione à ̈ condotta ad una temperatura compresa tra 20°C e 50°C, preferibilmente tra 30°C e 45°C, più preferibilmente pari a 40°C.
  7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di detossificazione à ̈ condotta per un tempo compreso tra 2 e 96 ore, preferibilmente tra 12 e 48 ore, più preferibilmente pari a 24 ore.
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